KR101677090B1 - 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 슈도모나스속 균주에서 목적 단백질의 세포외 분비와 정제를 위한 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게, 슈도모나스 플루오레슨스의 LARD 3 펩타이드를 포함하는, 슈도모나스속 균주에서 목적 단백질의 세포외 분비와 정제를 위한 조성물 및 슈도모나스속 균주에, 슈도모나스 플루오레슨스의 LARD 3 펩타이드의 암호화 폴리뉴클레오타이드와 목적 단백질의 유전자를 포함하는 발현 카세트를 도입하고, 상기 균주를 배양하여 목적 단백질을 세포외로 분비시키고, 상기 분비된 단백질을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 분리 또는 정제하는 단계를 포함하는, 슈도모나스속 균주에서 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 목적 단백질의 정제를 위한 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 조성물, 그람음성균에서 목적 단백질의 세포외 분비 및 정제를 위한 조성물, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 정제하기 위한 발현 카세트, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 세포외로 분비 및 정제하기 위한 발현 카세트, 상기 발현 카세트로 형질전환된 그람음성균 세포, 및 그람 음성균에서 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질의 대량 생산은 다양한 산업에 있어서 중요한 이슈로 계속되고 있다. 통상적인 방법으로, 재조합 단백질은 대장균(Escherichia coli)과 같은 원핵세포(prokaryotic cell)에서 합성되었고, 세포 용해 후 생화학적인 방법으로 얻은 세포 추출물로부터 정제되었다. 이러한 통상적인 방법에 비하여 동시에 재조합 단백질을 발현 및 분비할 수 있는 단백질 생산 시스템은 고비용의 추출 및 정제 과정의 필요성이 감소되어 훨씬 효율적이다.
한편, 그람-음성 저온 박테리아(psychrotrophic bacterium)인 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescence)는 재조합 단백질 생산을 위한 여러가지 좋은 특징을 가지고 있다. 대부분의 식물의 표면에 살고 있는 슈도모나스 플루오레슨스는 오랫동안 인간에 의하여 소비되어 왔기 때문에 일반적으로 안전하게 받아들여진다. 슈도모나스 플루오레슨스를 이용하여 생산된 α-아밀라아제(α-amylase) 효소의 안전성은 마우스 및 쥐에 대한 약학적 및 독성학적 연구를 통하여 증명되어왔다. 생물학적 안정성에 더하여, 슈도모나스 플루오레슨스는 고농도의 세포 배양에서의 다양한 발효 조건을 견딜 수 있고, 많은 양의 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 슈도모나스 플루오레슨스에는 타입 1 분비 시스템 (type I secretion system, T1SS)부터 타입 6 분비 시스템(T6SS)까지 몇몇의 분비 시스템이 자연적으로 존재한다. 특히, 슈도모나스 플루오레슨스는 ATP-결합 카세트(ATP-binding cassette, ABC) 운반체인 TliDEF를 통하여 내열성 리파아제(TliA)를 수송하는 분비 시스템 유형 1을 갖고 있다. 재조합 단백질 분비의 응용 가능성 때문에 몇몇의 다른 재조합 단백질을 수송하는 능력은 증명되었고 분비 신호는 잘 연구되었다.
ABC 운반체는 세 가지 서브유닛으로 구성되어 있다: ABC 단백질, 막 융합 단백질(membrane fusion proteins, MFPs) 및 외막 단백질(outer membrane proteins, OMPs). ABC 단백질은 선택적으로 목적 단백질의 C-말단 부분의 분비 도메인을 인식하고 ATP를 가수분해하여 목적 단백질을 분비한다. 막 융합 단백질은 세포 막(cytoplasmic membrane)에 박혀있고 ABC 단백질과 외막 단백질을 연결한다. 외막 단백질은 외막(outer membrane)에 위치하고 목적 단백질이 분비되는 채널을 형성하는 대부분의 세포 간극(periplasm)에 걸쳐있다. 슈도모나스 플루오레슨스에서, ABC 단백질, 막 형성 단백질 및 외막 단백질은 내열성 리파아제 오페론 내 tliA의 업스트림(upstream)에 위치한 tliD, tliE, 및 tliF에 의하여 각각 코딩된다. tliA 의 C-말단에 있는 분비/샤페론(secretion/chaperone) 도메인은 리파아제 ABC 운반체 인식 도메인(Lipase ABC transporter Recognition Domain, LARD)으로 정의되었다. 길이에서 다른 LARD의 다섯개의 단편들이 기능적으로 비교되어왔고, 모든 4개의 RTX(repeats-in-toxin) 모티프를 포함하고 있는 LARD3는 ABC 운반체를 통한 분비에서 가장 효과적인 C-말단 신호로 확인되어 왔다. tliDEF 및 LARD3 융합 단백질 컨스트럭트를 포함하는 슈도모나스 플루오레슨스는 LARD3 융합 단백질을 효율적으로 분비하고, 분비된 LARD3 융합 단백질은 배양액(culture broth)에서 얻을 수 있다.
그러나, ABC 운반체를 통하여 분비된 목적 단백질은 배양액으로부터 정제를 위하여 별도의 처리 및 분리 과정이 필요하고, 목적 단백질의 C-말단에 결합되어 있는 LARD는 단백질 분비 이후에 필요가 없다는 단점을 가지고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 슈도모나스속 균주의 리파제 ABC 트랜스포터 인식 도메인(lipase ABC transporter recognition domain, LARD)에서 유래된 폴리펩타이드를 정제 태그로 이용한 용도로서, 그람 음성균에서 목적 단백질의 정제용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 LARD 유래 폴리펩타이드를 포함하는, 그람 음성균에서 목적 단백질의 정제뿐만 아니라 세포외 분비를 추가로 달성하는 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자, 제한효소 절단부위 및 선별 마커를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 정제하기 위한 발현 카세트를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 그람 음성균에서 목적 단백질의 세포외 분비 및 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자, 제한효소 절단부위 및 선별 마커를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 세포외로 분비 및 정제하기 위한 발현 카세트를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자, 제한효소 절단부위 및 선별 마커를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 정제하기 위한 발현 카세트로 형질전환된 그람음성균 세포를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 따른 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자, 제한효소 절단부위 및 선별 마커를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 정제하기 위한 발현 카세트로 형질전환된 그람음성균 세포를 제조하고, 상기 세포를 배양하여 정제용 폴리펩타이드가 결합된 목적 단백질을 발현하고, 상기 목적 단백질에 결합된 정제용 폴리펩타이드를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography, HIC)를 이용하여, 목적 단백질을 분리 또는 정제하는 단계를 포함하는, 그람 음성균에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 148번째 아미노산 내지 174번째 아미노산을 포함하는 27개 아미노산으로 이루어지는 제1 펩타이드를 필수적으로 포함하거나, 상기 정제 펩타이드를 필수적으로 포함하고, 제1 펩타이드의 N-말단에 더하여, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 1번 내지 147번째의 아미노산 잔기로부터 선택되는 연속하는 1 개 내지 147개 아미노산으로 이루어지는 펩타이드를 추가로 포함하는, 27개 내지 174개 아미노산 크기의 폴리펩타이드를 포함하는, 그람 음성균에서 목적 단백질의 정제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 예는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 148번째 아미노산 내지 174번째 아미노산을 포함하는 27개 아미노산으로 이루어지는 제1 펩타이드와, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 71번째 아미노산 내지 114번째 아미노산으로 이루어지는 제2 펩타이드를 필수적으로 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질의 정제뿐만 아니라 세포외 분비를 추가로 달성하는, 조성물을 제공한다.
상기 제1 펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 제1 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드일 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 목적 단백질의 C-말단에 융합된 단백질 형태일 수 있다.
상기 목적 단백질의 정제는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 정제법일 수 있다.
상기 제1 펩타이드와 제2 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열과 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 상기 제1 펩타이드와 제2 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예는 본 발명에 따른 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자, 제한효소 절단부위 및 선별 마커를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 정제하기 위한 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 예는 본 발명에 따른 그람 음성균에서 목적 단백질의 세포외 분비 및 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자, 제한효소 절단부위 및 선별 마커를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 세포외로 분비 및 정제하기 위한 발현 카세트를 제공한다.
상기 발현 카세트는 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴크레오타이드를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 예는 본 발명에 따른 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자, 제한효소 절단부위 및 선별 마커를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 정제하기 위한 발현 카세트로 형질전환된 그람음성균 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 예는 본 발명에 따른 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자, 제한효소 절단부위 및 선별 마커를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 정제하기 위한 발현 카세트로 형질전환된 그람음성균 세포를 제조하고, 상기 세포를 배양하여 정제용 폴리펩타이드가 결합된 목적 단백질을 발현하고, 상기 목적 단백질에 결합된 정제용 폴리펩타이드를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여, 목적 단백질을 분리 또는 정제하는 단계를 포함하는, 그람 음성균에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 그람 음성균은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주, 크산토모나스(Xanthomonas) 속 균주 및 버크홀데리아(Burkholderia) 속 균주로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 슈도모나스속 균주는 슈도모나스 플루오레슨스, 슈도모나스 프라기, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 시린게 또는 슈도모나스 에루기노사일 수 있다.
상기 슈도모나스속 균주는 슈도모나스 플루오레슨스의 리파아제 유전자(tliA) 및 프로테아제 유전자(prtA)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 일부 영역이 결실되며, 상기 유전자의 일부 결실은 유전자의 적어도 하나의 말단에 적어도 100bp 이상 크기의 단편을 남기도록 유전자 영역을 결실시킨 것이며, 기능적 리파아제 및 기능적 프로테아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기능적 단백질을 생성하지 않는 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주일 수 있다.
상기 변이 균주가 기능적 프로테아제 단백질을 생성하지 않는 것은, 프로테아제 유전자의 전부 또는 일부 결실, 또는 프로테아제 저해제 유전자(inh)의 전부 또는 일부 결실에 의해 이루어진 것일 수 있다.
상기 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주는 기탁번호 KCTC 12276BP, KCTC 12277BP, 또는 KCTC 12278BP을 갖는 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주일 수 있다.
상기 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드는 상기 제1 펩타이드와 제2 펩타이드를 포함하는 목적 단백질의 세포외 분비 및 정제용 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 알킬 세파로스를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피법이며, 상기 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸기일 수 있다.
상기 목적 단백질을 분리 또는 정제하는 단계 이후에, 상기 목적 단백질에 결합된 정제용 폴리펩타이드를 절단하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일예는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 148번째 아미노산 내지 174번째 아미노산을 포함하는 27개 아미노산으로 이루어지는 제1 펩타이드를 필수적으로 포함하거나, 상기 정제 펩타이드를 필수적으로 포함하고, 제1 펩타이드의 N-말단에 더하여, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 1번 내지 147번째의 아미노산 잔기로부터 선택되는 연속하는 1 개 내지 147개 아미노산으로 이루어지는 펩타이드를 추가로 포함하는, 27개 내지 174개 아미노산 크기의 폴리펩타이드를 포함하는, 그람 음성균에서 목적 단백질의 정제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "정제 폴리펩타이드 또는 정제 펩타이드" 또는 "목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드"는, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 148번째 아미노산 내지 174번째 아미노산을 포함하는 27개 아미노산으로 이루어지는 제1 펩타이드를 필수적으로 포함하는 폴리펩타이드일 수 있고, 상기 제1 펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드는 제1 펩타이드를 필수적으로 포함하고, 제1 펩타이드의 N-말단에 더하여, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 1번 내지 147번째의 아미노산 잔기로부터 선택되는 연속하는 1 개 내지 147개 아미노산으로 이루어지는 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 그에 따라, 상기 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드는 27개 내지 174개의 아미노산 크기를 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 148번째 아미노산 내지 174번째 아미노산을 포함하는 27개 아미노산으로 이루어지는 제1 펩타이드와, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 71번째 아미노산 내지 114번째 아미노산으로 이루어지는 제2 펩타이드를 필수적으로 포함하는, 그람 음성균에서 목적 단백질의 정제뿐만 아니라, 세포 외 분비를 추가로 달성하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "목적 단백질의 세포외 분비 및 정제용 폴리펩타이드"는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 148번째 아미노산 내지 174번째 아미노산을 포함하는 27개 아미노산으로 이루어지는 제1 펩타이드와, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 71번째 아미노산 내지 114번째 아미노산으로 이루어지는 제2 펩타이드를 필수적으로 포함하는 폴리펩타이드 일 수 있다. 상기 제1 펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 제2 펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 목적 단백질의 세포외 분비 및 정제용 폴리펩타이드는 제1 펩타이드와 제2 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드로서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드일 수 있다.
본 발명에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 슈도모나스 플루오레슨스의 LARD 펩타이드 일 수 있는데, 상기 LARD 펩타이드는 슈도모나스 플루오레슨스의 내열성 리파아제 오페론 내 tliA의 C-말단에 있는 분비/샤페론(secretion/chaperone) 도메인을 의미할 수 있다.
구체적으로, LARD 펩타이드는 그 서열에 따라 LARD 1 내지 LARD 5 펩타이드로 나뉘어 질 수 있는데, 본 발명에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 LARD 1 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 LARD 2 펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 LARD 3 펩타이드, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 LARD 4 펩타이드, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 LARD 5 펩타이드일 수 있다.
또한, LARD 펩타이드는 LARD 1 펩타이드가 가장 큰 서열로, LARD 2 내지 LARD 5 펩타이드를 모두 포함하고 있고; LARD 2는 LARD 3 내지 LARD 5 펩타이드를 모두 포함하고 있고; LARD 3는 LARD 4 및 LARD 5 펩타이드를 모두 포함하고 있고; LARD 4는 LARD 5 펩타이드를 포함하고 있다. LARD 2 펩타이드는 LARD 1 펩타이드의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 35번째 내지 174번째 아미노산에 해당할 수 있고, LARD 3 펩타이드는 LARD 1 펩타이드의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 71번째 내지 174번째 아미노산에 해당할 수 있고, LARD 4 펩타이드는 LARD 1 펩타이드의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 105번째 내지 174번째 아미노산에 해당할 수 있고, LARD 5 펩타이드는 LARD 1 펩타이드의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 140번째 내지 174번째 아미노산에 해당할 수 있다.
LARD 펩타이드는 기능적으로 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 정제를 수행할 수 있는 정제 서열을 포함하고 있는데, 이 정제서열은 VLSFGADSVTLVGVGLGGLWSEGVLIS 로서, 서열번호 7의 아미노산 서열에 해당하며, 본 발명에서 최초로 밝힌 것이다.
상기 정제서열은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 148번째 아미노산 내지 174번째 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 일 수 있는데, 상기 정제서열을 포함하는 단백질은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 용이하게 정제될 수 있다.
또한, 상기 정제서열은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 148번째 아미노산 내지 174번째 아미노산으로 이루어지기 때문에, LARD 1 내지 LARD 5 펩타이드 모두 상기 정제서열을 포함하고 있다. 따라서, LARD 1 내지 LARD 5 펩타이드 모두 목적 단백질의 정제 용도로 사용될 수 있다. 바람직하게, 정제서열은 LARD 3 펩타이드일 수 있다.
또한, LARD 펩타이드는 기능적으로 세포 내에서 세포 외로 분비를 유도하는 신호서열도 포함하고 있는데, 이 분비 신호서열은 GSDGNDLIQGGKGADFIEGGKGNDTIRDNSGHNTFLFSGHFGQD 로서, 서열번호 6의 아미노산 서열에 해당한다.
상기 분비 신호서열은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 71번째 아미노산 내지 114번째 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 일 수 있는데, 상기 분비 신호서열을 포함하는 단백질은 세포 내에서 세포 외로의 분비가 이루어 질 수 있다.
또한, 상기 분비 신호서열은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 71번째 아미노산 내지 114번째 아미노산으로 이루어지기 때문에, LARD 4 및 LARD 5 펩타이드에는 포함되어 있지 않으며, LARD 1 내지 LARD 3 펩타이드는 상기 분비 신호서열을 포함하고 있다. 따라서, LARD 4 및 LARD 5 펩타이드는 목적 단백질의 세포 내에서 세포 외로의 분비 용도로 사용될 수 없으나, LARD 1 내지 LARD 3 펩타이드는 목적 단백질의 세포 내에서 세포 외로의 분비 용도로 사용될 수 있다. 바람직하게, 분비 신호서열은 LARD 3 펩타이드 일 수 있다.
따라서, LARD 1 내지 LARD 3 펩타이드는 본 발명의 분비 신호서열 및 정제서열을 모두 포함하고 있으므로, 목적 단백질의 세포 외로의 분비 및 정제의 용도에 사용될 수 있으나, LARD 4 및 LARD 5 펩타이드는 본 발명의 분비 신호서열을 포함하고 있지 않고 정제 서열만 포함하고 있으므로, 목적 단백질의 정제 용도로만 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "목적 단백질"은 그람음성균을 이용하여 생물학적으로 생산하고자 하는 단백질을 의미한다. 상기 목적 단백질은 그람음성균의 목적 단백질일 수 있다. 예를 들어, 인체 혈청 알부민, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩타이드, 인체 엘라핀 전구체, 곤충 이뇨 호르몬, 인간 부갑상선 호르몬(hPTH), 및 인간 리포코틴 I(hLCI)으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일예로, 상기 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드 또는 목적 단백질의 세포외 분비 및 정제용 폴리펩타이드는 목적 단백질의 C-말단에 융합된 단백질 형태일 수 있다. 상기 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드 또는 목적 단백질의 세포외 분비 및 정제용 폴리펩타이드가 목적 단백질의 C-말단에 융합되는 경우, 세포 외 분비에 의하여 가수분해되는 N-말단의 신호 서열과 대조적으로, C-말단 신호 서열은 가수분해되지 않는 장점을 가질 수 있다.
상기 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드 또는 목적 단백질의 세포외 분비 및 정제용 폴리펩타이드와 목적 단백질이 융합 단백질 형태로 분비되는 경우, 정제 서열을 정제 태그로 사용하여 목적 단백질을 함께 정제할 수 있다. 이후, 적절한 단백질 분해 효소를 처리하여 목적 단백질의 C-말단에 융합된 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드 또는 목적 단백질의 세포외 분비 및 정제용 폴리펩타이드를 제거할 수 있다.
일예로, 본 발명에서 목적 단백질의 정제는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용할 수 있는데, 이때 본 발명의 정제 서열은 정제 태그로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 알킬 세파로스를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피법이며, 상기 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸기일 수 있다. 바람직하게, 상기 알킬기는 메틸기 일 수 있다. 알킬기로 메틸기를 사용하는 경우 다른 알킬기를 사용하는 경우에 비하여 정제 서열을 포함하는 단백질을 우수하게 정제할 수 있다.
일반적으로, 컬럼을 이용한 단백질의 정제에 있어서는 His-tag을 이용한 정제를 많이 수행하는데, His-tag 정제를 위한 컬럼(column)은 고가일 뿐만 아니라, 대용량을 정제를 수행하기 위해서는 부적합한 면이 있다. 또한, NTA 컬럼을 많이 사용하는데, 재사용하다 보면 Ni2 + 혹은 NTA가 떨어져 나와 반복적인 사용에 제한이 발생하는 문제점이 있다. 이에 반해, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 사용되는 소수성 컬럼(hydrophobic column)은 저거의 컬럼으로 경제성이 높고 대용량 분리에 사용하기에 적합하며, 재사용율이 높은 장점이 있다.
본 발명에 따라 그람음성균에서 목적 단배질의 정제 또는 목적 단백질의 세포외 분비와 정제를 수행하기 위해서, 상기 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드 또는 목적 단백질의 세포외 분비 및 정제용 폴리펩타이드는 그람음성균용 발현 벡터에 삽입하여 사용될 수 있다.
예를 들면, 상기 발현 벡터는 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자, 제한효소 절단부위 및 선별 마커를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 정제하기 위한 발현 카세트를 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 상기 발현 벡터는 목적 단백질의 세포외 분비 및 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자, 제한효소 절단부위 및 선별 마커를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 세포 외로 분비 및 정제하기 위한 발현 카세트를 포함할 수 있다.
상기 발현 카세트는 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴크레오타이드를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 그람음성균인 슈도모나스 플루오레슨스 내 목적 단백질의 세포외 분비를 위한 발현 벡터를 제작하였다. ABC 운반체 및 이에 상응하는 C-말단 신호 서열에 대한 컨스트럭트를 포함하는 벡터는 ABC 운반체 연관 타입 I 분비 메커니즘(도 8a)에 의해 재조합 단백질의 분비를 가능케 한다. 게다가, 정제 태그로써 LARD를 이용한 정제 단계는 배양 배지(broth)로부터의 단백질의 간단한 정제를 가능하게 한다(도 8b). LARD 제거를 위한 공정을 수행할 경우 소수성 상호작용 크로마토그래피를 통하여 큰 부피의 배양 배지(broth)로부터 융합단백질을 분리한 후 적은 volumne으로 만들어 LARD를 제거하는 공정을 효율적으로 수행하고 원하는 최종 단백질을 분리하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예에서, pDART의 재조합 단백질을 발현시키고 분비하는 능력을 다양한 그람음성균에서 pDART-AP(pDART-Alkaline phosphatase)로 시험하였다. pDART-AP는 고체 및 액체 배지 둘 다에서 Pseudomonas 종 안에서 높은 수준의 활성을 나타내었다.
ABC 운반체의 적절한 기능을 위하여, pDART 시스템으로 재조합 단백질을 적절히 생산 및 분비하는데 있어서 몇몇 요구사항이 있다: i) 플라스미드를 효과적으로 숙주 내로 도입하여야 한다; ii) ABC 운반체 및 LARD3-융합 단백질은 lac 프로모터의 조절 하에서 발현시켜야만 한다; iii) ABC 운반체를 LARD3-융합 단백질의 분비를 위한 막 내에 적절히 위치시켜야만 한다; iv) 분비된 단백질을 그것의 활성을 위해 적절히 폴딩(folded)하여야만 하고, 프로테아제 활성 또는 변성으로부터 보호해야만 한다. 슈도모나스 종은 tliDEF 가 초기에 분리된 원래의 종인 관련된 슈도모나스 종 및 슈도모나스 플루오레슨스 사이에 짧은 계통발생론적 거리 때문에 상층액에서 목적 단백질의 활성을 나타내기 위한 이러한 요구조건을 성공적으로 만족시킨다. ABC 운반체의 동종 유전자 발현이 다른 슈도모나스 종 보다 슈도모나스 플루오레슨스에서 더 효과적이고, 또한 상기 균주가 내재적 세포 외 프로테아제 PrtA가 결핍되어 세포외 단백질 분해를 막기 때문에, 슈도모나스 플루오레슨스 ΔtliA ΔprtA 에서 가장 높은 분비가 나타났다. 그러나, tliDEF가 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)에서 기능하여, 많은 양의 리파아제가 ABC 수송체에 의해 분비하는 것으로 보고된 바 있고(Proc Natl Acad Sci U S A 87:1278-1282.), 적은 양의 AP가 E. coli 및 다른 그람-음성 박테리아를 함유하는 pDART-AP에서 분비되므로(실시예 4 및 도 4), 슈도모나스를 제외한 미생물에서 tliDEF 는 비-기능적이라고 볼 수 없다.
본 발명의 일예는, 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드 또는 목적 단백질의 세포 외 분비 및 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자, 제한효소 절단부위 및 선별 마커를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 정제하기 위한 발현 카세트로 형질전환된 그람음성균 세포에 관한 것이다.
상기 그람음성균은 그람염색이 되지 않는 세균의 분류군으로, 세포벽에 얇은 펩티도글리칸 층과 지질단백질 및 지질당으로 구성된 외부막(outer membrane)이 존재한다. 본 발명에서 그람음성균은 예를 들어, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주, 크산토모나스(Xanthomonas) 속 균주 또는 버크홀데리아(Burkholderia) 속 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에서 목적 단백질의 세포 외 분비는 ABC 수송체의 기능에 의해서 이루어지는데, ABC 수송체는 이중막이 있는 그람음성균에서 작동하기 때문에, 그람음성균에 해당하는 경우 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
상기 슈도모나스 속 균주는, 슈도모나스 속에 해당하는 균주라면 모두 포함될 수 있으나, 예를 들어, 슈도모나스 플루오레슨스, 슈도모나스 프라기, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 시린게 또는 슈도모나스 에루기노사일 수 있다.
슈도모나스 플루오레슨스는 생물반응기에서 높은 농도로 배양될 수 있으며, 다양한 발효 조건이 가능하며, E. coli에 의해 생산된 단백질보다 용해성이 높은 단백질을 생산할 수 있어 바람직하다.
상기 슈도모나스속 균주가 슈도모나스 플루오레슨스일 경우, 슈도모나스 플루오레슨스에 도입된 목적 단백질들은 TliA의 C-말단 신호전달부위에 결합하여 융합단백질 형태로 세포외부로 분비될 수 있는데, 슈도모나스 플루오레슨스의 내재적 리파아제 및 프로테아제 또한 ABC 운반체의 매개로 세포외부로 분비된다. 그에 따라, 야생형 슈도모나스 플루오레슨스, 또는 완전한 리파아제 또는 프로테아제를 생산하는 균주를 이용하여 목적 단백질을 발현하는 경우, 상기 목적 단백질이 세포외부로 분비되더라도 리파아제 및 프로테아제가 불순물로 혼입되어 이후 정제공정을 복잡하게 할 뿐 아니라, 프로테아제는 생산된 목적 단백질을 가수분해하게 되는 문제점이 있다.
따라서, 상기 슈도모나스속 균주는 슈도모나스 플루오레슨스의 리파아제 유전자(tliA) 및 프로테아제 유전자(prtA)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 일부 영역이 결실되며, 상기 유전자의 일부 결실은 유전자의 적어도 하나의 말단에 적어도 100bp 이상 크기의 단편을 남기도록 유전자 영역을 결실시킨 것이며, 기능적 리파아제 및 기능적 프로테아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기능적 단백질을 생성하지 않는 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주일 수 있다. 상기 변이 균주의 예로는 리파아제 단독 결실(변이 균주ΔtliA), 프로테아제 단독 결실(변이 균주ΔprtA) 및 리파아제/프로테아제 이중 결실 변이 균주(변이 균주ΔtliAΔprtA)일 수 있다. 이들 변이균주에 관한 내용은 한국특허공개 10-2014-0041159에 상세히 기술되어 있다.
상기 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주가 기능적 프로테아제 단백질을 생성하지 않는 것은, 프로테아제 유전자의 전부 또는 일부 결실, 또는 프로테아제 저해제 유전자(inh)의 전부 또는 일부 결실에 의해 이루어진 것일 수 있다.
상기 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주는 예를 들어, 기탁번호 KCTC 12276BP, KCTC 12277BP, 또는 KCTC 12278BP을 갖는 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일예는, 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드 또는 목적 단백질의 세포 외 분비 및 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자, 제한효소 절단부위 및 선별 마커를 포함하는, 그람음성균에서 목적 단백질을 발현하고 정제하기 위한 발현 카세트로 형질전환된 그람음성균 세포를 제조하고; 상기 세포를 배양하여 정제용 폴리펩타이드가 결합된 목적 단백질을 발현하고; 상기 목적 단백질에 결합된 정제용 폴리펩타이드를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여, 목적 단백질을 분리 또는 정제하는 단계를 포함하는; 그람 음성균에서 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기 그람 음성균에서 목적 단백질을 생산하는 방법에서, 상기 발현 카세트로 형질전환된 그람음성균 세포를 제조하는 방법은 통상의 유전자 도입방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 벡터에 도입한 재조합 벡터를 그람음성균 내부로 도입하거나, 도입된 벡터에 삽입된 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 게놈 내부로 상동 재조합에 의해 게놈내로 삽입될 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함하며, 특별히 이에 한정되지는 않는다. 상기 그람음성균으로의 벡터 도입은 전기충격 유전자 전달법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, PEG, 텍스트란 설페이트, 리포펙타민 등의 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
상기 세포의 배양에 있어서, 배지성분, 배양온도 및 배양시간 등의 조건은 적절히 조절될 수 있으며, 구체적으로 배양 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분 등과 같은 미생물의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 포함할 수 있다. 또한 배지의 pH를 적절히 조정할 수 있고, 항생제 등의 성분을 포함할 수 있다. 또한, 유도제 (inducer)를 처리하여 단백질의 발현을 유도할 수 있으며, 처리되는 유도제의 종류는 벡터 시스템에 따라 결정될 수 있으며, 유도제 투여시간 및 투여량 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다.
야생형 균주 및 변이주ΔtliA에서 목적 단백질을 효과적으로 발현하기 위해서는 2x LB 배지를 사용하여야 하지만, 변이주ΔprtA 및 변이주ΔtliA ΔprtA에서 LB 배지를 사용할 수 있어 배지 농도를 완화할 수 있다. 또한 상기 변이주ΔtliAΔprtA는 세포 외에서 TliA의 방해가 없고 PrtA 가수분해로부터 보호되는 목적 단백질의 생산을 보이며, 리파아제 또는 프로테아제-유래 신호서열과 ABC 운반체와 경쟁을 하지 않으며, LB 배지를 사용할 수 있는 장점이 있어, 외래 단잭질의 생산, 분비 및 정제를 간편하게 할 수 있으며 단백질 생산량을 더 높일 수 있어, 목적 단백질 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 목적 단백질은 정제 서열을 포함하는 목적 단백질의 정제용 펩타이드를 이용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 것을 제외하고는 통상의 방법으로 회수 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 원심분리 방법으로 회수한 세포를, 프렌치 프레스, 초음파 파쇄기 등을 이용하여 파쇄할 수 있다. 배양액으로 단백질이 분비되는 경우에는 배양 상등액을 수집할 수 있다. 과발현에 의해 응집되는 경우, 적절한 용액에서 단백질을 용해시키고 및 변성시키고 재폴딩시켜서 얻을 수 있다. 글루타티온, 디티오트레이톨, β-머캅토에탄올, 시스틴 및 시스타민의 산화 및 환원 시스템을 사용하고 요소, 구아니딘, 아르기닌 등의 재폴딩제 등을 이용할 수 도 있으며, 재폴딩제와 함께 염의 일부를 사용할 수 있다.
일예로, 상기 그람 음성균에서 목적 단백질을 생산하는 방법에서, 목적 단백질을 분리 또는 정제하는 단계 이후에, 상기 목적 단백질에 결합된 정제용 폴리펩타이드를 절단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일예에서는, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 정제에 뒤이어, LARD를 제거하기 위하여 Factor Xa를 처리하였다. HIC에 의한 정제 및 농축은 큰 부피의 배양 배지(broth)가 Factor Xa 처리에 적합하지 않으므로 효과적인 Factor Xa 절단을 촉진한다. His(6)-태그와 같은 정제 태그를 이용한 추후의 정제가 목적 단백질 유전자를 pDART 안으로 삽입할 때, PCR 프라이머 내에 정제 태그 유전자를 삽입함으로써 단백질을 추가로 정제하기 위하여 수행할 수 있다(도 8b). pDART 안으로의 목적 단백질 유전자의 단순 삽입으로, 목적 단백질을 ABC 수송체 시스템을 통해 분비하였고, HIC를 이용한 간단한 정제로 얻을 수 있었다.
본 발명은 슈도모나스 플루오레슨스의 LARD 펩타이드의 일부 서열의 기능을 새롭게 밝혀낸 것으로, 이를 이용하여 그람음성균에서 목적 단백질의 정제를 간편하게 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 그람음성균에서 목적 단백질의 세포외 분비와 정제를 동시에 간편하게 수행할 수 있는 것으로, 다양한 목적 단백질의 생물학적 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 pDART 벡터의 제작과정과 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 2는 융합 단백질의 수치요법 플롯을 나타내며, LARD3의 구조를 SWISS-MODEL로 예측하였고 동일한 색 코드로 나타내고 GFP 구조는 대표적인 융합 단백질로서 녹색으로 나타내었다.
도 3은 pDART를 이용한 AP 및GFP의 발현 및 분비를 나타내는 SDS-PAGE 결과 사진으로서, 도 3a는 세포 내 재조합 단백질의 발현을 나타내고 도 3b는 상층액에서 재조합 단백질의 분비를 나타내고, 도 3c는 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내며, 융합 단백질의 대응하는 위치는 화살표로 표시하였다.
도 4는 MG/PDP agar에서 AP 활성을 나타내는 결과 사진이다.
도 5는 pNPP(p-nitrophenylphosphate)를 이용한 액체 배지에서 AP 활성 분석결과를 보여주는 그래프이며, 오차 막대(Error bar)는 두 번의 반복 실험의 표준 편차로 나타내었다.
도 6은 LB/M9 배양 배지(broth)로부터 AP-LARD3의 정제결과와 AP 활성을 보여주는 결과를 나타낸다.
도 7은 융합 단백질의 정제 및 Factor Xa 처리를 나타내는 것으로서, 도 7a는 M9 및 LB에서 생산되고 메틸-세파로스를 이용하여 정제된 AP-LARD3를 나타내고, 도 7b는 M9 및 LB에서 생산되고 메틸-세파로스를 이용하여 정제된 TliA를 나타내고, 도 7c는 M9에서 생산되고 메틸 세파로스를 이용하여 정제된 GFP-LARD3를 나타낸다.
도 8은 LARD에 의한 단백질 분비 및 정제를 확인한 결과를 나타내는 것으로서, 도 8a는 ABC 운반체 매개 분비의 General scheme을 나타내며, 도 8b는 단백질 정제의 General scheme을 나타낸다.
도 9는 ABC 운반체의 존재 하에 GFP와 GFP-LARD3의 분비를 분석한 결과를 나타내는 것으로서, '1'은 분비서열이 없는 GFP를 발현하는 pDAR-GFP를 포함하는 세포, '2'는 분비서열 LARD3가 융합된 GFP를 발현하는 pDART-GFP를 포함하는 세포를 나타낸다.
도 10은 메틸 세파로스 컬럼과 Ni-NTA 컬럼으로 AP-LARD3를 정제한 결과를 나타내는 것으로서, "HIC"는 메틸 세파로스 컬럼, "His-tag"은 Ni-NTA 컬럼을 나타낸다.
도 2는 융합 단백질의 수치요법 플롯을 나타내며, LARD3의 구조를 SWISS-MODEL로 예측하였고 동일한 색 코드로 나타내고 GFP 구조는 대표적인 융합 단백질로서 녹색으로 나타내었다.
도 3은 pDART를 이용한 AP 및GFP의 발현 및 분비를 나타내는 SDS-PAGE 결과 사진으로서, 도 3a는 세포 내 재조합 단백질의 발현을 나타내고 도 3b는 상층액에서 재조합 단백질의 분비를 나타내고, 도 3c는 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내며, 융합 단백질의 대응하는 위치는 화살표로 표시하였다.
도 4는 MG/PDP agar에서 AP 활성을 나타내는 결과 사진이다.
도 5는 pNPP(p-nitrophenylphosphate)를 이용한 액체 배지에서 AP 활성 분석결과를 보여주는 그래프이며, 오차 막대(Error bar)는 두 번의 반복 실험의 표준 편차로 나타내었다.
도 6은 LB/M9 배양 배지(broth)로부터 AP-LARD3의 정제결과와 AP 활성을 보여주는 결과를 나타낸다.
도 7은 융합 단백질의 정제 및 Factor Xa 처리를 나타내는 것으로서, 도 7a는 M9 및 LB에서 생산되고 메틸-세파로스를 이용하여 정제된 AP-LARD3를 나타내고, 도 7b는 M9 및 LB에서 생산되고 메틸-세파로스를 이용하여 정제된 TliA를 나타내고, 도 7c는 M9에서 생산되고 메틸 세파로스를 이용하여 정제된 GFP-LARD3를 나타낸다.
도 8은 LARD에 의한 단백질 분비 및 정제를 확인한 결과를 나타내는 것으로서, 도 8a는 ABC 운반체 매개 분비의 General scheme을 나타내며, 도 8b는 단백질 정제의 General scheme을 나타낸다.
도 9는 ABC 운반체의 존재 하에 GFP와 GFP-LARD3의 분비를 분석한 결과를 나타내는 것으로서, '1'은 분비서열이 없는 GFP를 발현하는 pDAR-GFP를 포함하는 세포, '2'는 분비서열 LARD3가 융합된 GFP를 발현하는 pDART-GFP를 포함하는 세포를 나타낸다.
도 10은 메틸 세파로스 컬럼과 Ni-NTA 컬럼으로 AP-LARD3를 정제한 결과를 나타내는 것으로서, "HIC"는 메틸 세파로스 컬럼, "His-tag"은 Ni-NTA 컬럼을 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 박테리아 균주, 성장 조건 및 형질전환
모든 유전적 조작은 E. coli XL1-Blue를 이용하였다. 슈도모나스 플루오레슨스 ΔtliA ΔprtA는 pDART의 발현을 위한 기주 균주(host strain)로 사용하였다. E. coli S17-1는 슈도모나스 플루오레슨스로의 플라스미드의 전달을 위한 공여체(donor)로 사용하였다. pDART-AP 의 발현을 위하여 KCTC(Korean Collection of Type Culture) 및 KACC(Korean Agricultural Culture Collection)로부터 다양한 미생물을 얻었다.
슈도모나스 플루오레슨스는 60 ?g/m 카나마이신이 첨가된 LB 배지(lysogeny broth), 2×LB (2× concentrated LB), Studier's 배지(medium), M9 배지(medium) 및 M9 요소 배지(urea medium)에서 25℃로 배양하였다. M9 배지는 M9 염, 2 mM 황산마그네슘(MgSO4), 5% 글리세롤(glycerol), 미량 원소(trace elements, TE), 및 0.1 mM 염화칼슘(CaCl2)을 포함하도록 살짝 변경하였다. 미량원소는 다음과 같은 방법으로 준비된 100 TE를 희석하여 첨가하였다: 13.4 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 3.1 mM 염화제이철 (FeCl3), 0.62 mM 염화아연 (ZnCl2), 76 uM 염화구리(CuCl2), 42 uM 염화코발트(CoCl2), 162 uM 올트붕산(H3BO3), 및 8.1 uM 염화망간(MnCl2). M9 요소 배지는 M9 배지에 1% 요소를 더 포함하고 있다.
슈도모나스 플루오레슨스 및 다른 미생물의 형질전환은 플라스미드를 삽입하기 위하여 접합(conjugation)과 전기천공법(electroporation) 모두 사용하여 수행하였다. E. coli S17-1로부터 다른 미생물로의 접합 이동(conjugal transfer)은 이전에 보고된 통상적인 방법으로 수행하였다(Applied and environmental microbiology 67:5506-5511). 전기천공법은 2.5 kV, 125 Ω, 및 50 F 조건하에 표준 프로토콜에 따라 준비된 electro-competent cell을 이용하여 수행하였다(2014. Escherichia coli, Plasmids, and Bacteriphages, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc).
실시예
2.
pDART
의 제조 및 확인
2-1:
pDART
의 제조에 사용된 유전자, 플라스미드 및 균주
슈도모나스 플루오레슨스 내 단백질 발현에 있어서, E. coli 용으로 설계된 플라스미드는 상이한 복제 기원 때문에 슈도모나스 플루오레슨스에서 사용할 수 없으므로, 새로운 플라스미드가 필요하였고, 이를 위해, 셔틀 벡터로 널리 사용되는 pDSK519(22)를 ABC 운반체와 목적 유전자의 발현을 위해 선택하였다.
하나의 벡터에 ABC 운반체 컨스트럭트 및 다른 하나에 목적 유전자를 가지는 투-벡터 시스템은 두 개의 다른 항생제-내성 유전자를 발현시켜 스트레스를 유발하고 슈도모나스 플루오레슨스의 성장을 지연시켜 적절하지 않으므로, 하나의 벡터에 ABC 운반체 및 목적 유전자를 가지는 원-벡터 시스템을 설계하였다.
본 발명에서 사용된 플라스미드와 박테리아 균주는 하기 표 1 및 표 2에 정리하였다. 플라스미드 제조를 위한 프라이머는 특성과 함께 표 3(S1)에 정리하였다. tliDEF는 프라이머 tliDEF-sense와 tliDEF-XS-RBS를 이용한 PCR에 의한 pTOTAL (GenBank AF083061)로부터 증폭하였다.
| 균주( Strain ) | 특징 | 출처 |
| E. coli XL1-Blue | recA1 hsdR17 ( r k - , m k + ) supE44 lac [F'proAB + bd q bcZ Δ15 :: Tn10(Tet)] | Stratagene |
| E. coli DH10β | Source of AP gene | Stratagene, |
| E. coli S17-1 | Conjugal transfer of plasmids to 슈도모나스 플루오레슨스 | Journal of bacteriology 171:3583-3585 |
| 슈도모나스 플루오레슨스 DtliA DprtA | Host cells for extracellular protein production | Applied and environmental microbiology 78:8454-8462 |
| 플라스미드 | 특징 | 출처 |
| pDSK519 | Kmr, shuttle vector, lacZa with MCS | Gene 70:191-197 |
| pTOTAL | tliDEF and tliA, Ampr in pUC19 | Journal of bacteriology 181:1847-1852. |
| pAJH10 | tliDEF and tliA , Kmr pDSK519 | Applied and environmental microbiology 67:5506-5511. |
| pDAR pDAR-GFP |
tliDEF and RBS of tliA in pDSK519 GFP gene in pDAR |
본 발명에서 제작 |
| pDART | tliDEF , RBS followed by MCS and LARD3 | 본 발명에서 제작 |
| pDART-AP | AP gene in pDART | 본 발명에서 제작 |
| pDART-GFP | GFP gene in pDART | 본 발명에서 제작 |
| pDSK519 | Kmr, shuttle vector, lacZa with MCS | Gene 70:191-197 |
** Km, kanamycin; Amp, ampicillin; MCS, multiple cloning site; RBS, ribosomal binding site
tliDEF-XS-RBS 프라이머는 삽인된 유전자의 적절한 번역(translation)을 위한 리보솜 결합 부위(ribosomal binding site, RBS)를 포함하고 있다. pDSK519의 XbaI 자리(XbaI site) 주변의 상보적인 서열은 제작사의 매뉴얼(TaKaRa)에 따라 In-Fusion cloning을 위하여 tliDEF-sense의 업스트림과 tliDEF-XS-RBS 프라이머의 다운스트림(downstream)에 추가하였다. pDSK519는 In-Fusion에 의한 유전자 삽입을 위하여 직선 플라스미드로 되기 위하여 XbaI로 절단하였다. PCR 산물(tliDEF with complementary sequences) 및 pDSK519는 In-Fusion enzyme (3'→5' 핵산말단가수분해효소(exonuclease))로 처리하였다. In-Fusion 효소는 pDSK519의 말단에 15-bp의 상보적인 서열을 만들고 PCR 산물도 pDSK519에 상보적으로 결합하는 단일-가닥 부분(single-stranded regions)을 만들어 서로 결합한 후 세포에 들어가 인산결합이 연결되어 pDAR이 만들어 진다 (도 1).
LARD3 컨스트럭트는 목적 유전자와 용이한 융합을 위하여 pDAR에 삽입하였다. LARD3 서열(GenBank AAD09856)는 프라이머 enzymes-LARD3 및 LARD3-BstXI-SacI를 이용한 PCR에 의한 pLARD3-MCS로부터 얻었다.
다중 클로닝 자리(multiple cloning site) 및 Factor Xa 절단 부위(cleavage site)는 LARD3의 유전자 삽임 및 이후 절단(subsequent cleavage)을 위하여 LARD3의 업스트림에 추가하였다. BstXI 자리는 이전에 있던 pDAR의 SacI 제한효소 자리를 제거하여 다중 클로닝 자리 내 SacI 제한효소 자리를 추후에 사용하기 위하여 프라이머 LARD3-BstXI-SacI에 삽입하였다.
| Name | 서열a,b | 특징 |
| tliDEF-sense | GCCTGCAGGTCGACTCTAGGGgtgtcgtttggttcaaggaag (서열번호 1) |
Upstream of XbaI site on pDSK519, the first part of tliDEF 도 1의 파란색 부분에 해당하는 서열(GCCTGCAGGTCGACTCTAG) |
| tliDEF-XS-RBS | TACCCGGGGATCC TCTAGA/cattgtcttgtctctcttgttgttg (서열번호 2) |
Downstream of XbaI site on pDSK519, XbaI site, start codon, RBS(tctctt) 도 1의 녹색 부분에 해당하는 서열(TACCCGGGGATCCTCTAGA) |
| Sp-AP | ACTAGTacaccagaaatgcctgttct (서열번호 3) |
SpeI site, AP sense primer |
| AP-Sc | GAGCTCtttcagccccagagcggc (서열번호 4) |
SacI site, AP antisense primer |
| Xb-GFP | TCTAGA/atgagtaaaggagaagaacttt (서열번호 5) |
XbaI site, GFP sense primer |
| GFP-Nh | GCTAGCtttgtagagctcatccatgcc (서열번호 6) |
NheI site, GFP antisense primer |
| enzymes-LARD3 | TCTAGACATATGGGTACCGCTAGCGAG CTCattgaaggacgaggcagcg (서열번호 7) |
XbaI(TCTAGA), NdeI(CATATG), KpnI(GGTACC), NheI(GCTAGC), SacI(GAGCTC) site, the first part of LARD3 after Factor Xa site(attgaaggacga) |
| LARD3-BstXI-SacI | CCATAGCTATGG/tcaactgatcagcacaccct (서열번호 8) |
BstXI site, part of LARD3 stop codon |
** 개시 및 종료 코돈은 사선(slash)와 함께 이탤릭체로 표시하고, MSC는 밑줄을 그어 표시하였다. In-fusion을 위한 서열은 굵은 글씨체로 표시하였다. 소문자는 코딩 부분(coding region)을 나타내고, 대문자는 플라스미드 내 제한 효소 자리 또는 서열을 나타낸다.
** 'GGG'는 적절한 효소 절단을 위하여 제한효소의 앞에 추가하였다.
2-2.
pDART 의
제조
하나의 벡터에 ABC 운반체 및 목적 유전자를 가지는 원-벡터 시스템을 설계하였다. 이러한 목적으로, ABC 운반체 유전자 tliDEF 및 C-말단 신호 서열 LADR3를 pDSK519 안으로 삽입하였다. 첫 번째 유전자 tliD는 효과적으로 번역되지 않는 시작 코돈 GTG를 포함한다. 그러므로, tliD는 더 나은 번역을 위해 pDSK519 안에 있는 lacZ와 frame을 맞추어 tliD를 삽입하였다.
목적 유전자의 적절한 발현을 위해, tliDEF 및 tliA사이에 존재하는 리보솜 결합 부위(RBS) 및 시작 코돈을 포함하는 영역을 벡터에 포함시켰다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, tliDEF, RBS 및 시작 코돈을 pDSK519 안으로 삽입하여, pDAR을 생산하였다.
pDAR 안으로 LARD3 및 다중 클로닝 자리(MCS)를 삽입하여 pDART를 제작하였다. ABC 운반체 및 목적 유전자를 나란히(in tendem) 포함하도록 pDART를 설계하였다. PCR-증폭된 목적 유전자를 종결 코돈 없이 시작 코돈의 프레임에 맞추어 목적유전자를 삽입하였다. 또한 필요 시, LARD3를 떼어낼 수 있도록 목적 유전자와 LARD3 사이에 Factor Xa 절단 부위를 포함시켰다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 백본으로서 널리 사용되는 셔틀 벡터인 pDSK519를 이용하여, tliDEF 를 인-퓨전(In-Fusion) 클로닝에 의해 삽입하여, pDAR을 생산하였다. 보다 구체적으로, pDSK519를 XbaI로 자르고, PCR-증폭된 tliDEF 을 삽입하여, tliDEF 의 다운스트림으로 단일의 XbaI가 위치하도록 하였다. MCS 및 Factor Xa 절단 부위를 가지는 LARD3 유전자를 각각 XbaI 및 SacI 부위에서 pDAR로 제한효소 처리하여, pDART를 생산하였다. BstXI 부위를 pDAR의 SacI 부위를 제거하기 위한 pDAR 내 SacI 의 오버행에 상보적으로 만들었다. 목적 유전자는 pDART 안으로의 삽입을 위한 시작 코돈 없이 PCR-증폭될 수 있거나, Factor Xa 절단 후 이후의 정제공정을 위한 His(6)-tagging과 같은 정제 태그와 함께 증폭될 수 있다.
실시예
3.
pDART
를 이용한
AP
및
GFP
의 발현 및 분비 확인
3-1.
pDART
-
AP
및
pDART
-
GFP
제조
pDART는, 목적 유전자의 더 나은 발현을 위하여, 더 나은 재조합 단백질의 분비를 위해 세포 내 리파아제 및 프로테아제가 제거된 슈도모나스 플루오레슨스 ΔtliA ΔprtA 안으로 도입하였다.
모델 단백질로서, 알칼리성 인산가수분해효소(AP) 및 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 pDART 안으로 각각 삽입하여, pDART-AP 및 pDART-GFP를 생산하였다.
도 2는 융합 단백질의 수치요법 플롯을 나타내는데, Kyte와 Doolittle 방법을 이용한 ExPASy 수치요법 플롯으로 윈도우 크기 19로 수치요법 플롯을 그렸다. 플롯의 x-축은 N-말단에서 시작되는 단백질의 위치를 나타낸다. 플롯의 y-축은 단백질의 소수성을 나타내는데, 높은 값이 높은 소수성을 나타낸다. LARD3 부분은 붉은색 점 상자로 강조하였다. 고유한 분비 신호를 가지는 TliA의 수치요법 플롯은 그것의 C-말단이 전체 단백질에 있어서 가장 높은 소수성을 가진다는 것을 나타낸다. GFP-LARD3 및 AP-LARD3 또한 LARD3인 C-말단 끝에서 가장 높은 소수성을 나타내었다. LARD3 서열은 푸른색 RTX 모티프 및 붉은색 C-말단 소수성 서열을 가진다. LARD3의 구조를 SWISS-MODEL로 예측하였고 동일한 색 코드로 나타내었다. GFP 구조는 대표적인 융합 단백질로서 녹색으로 나타내었다.
도 2에서 알 수 있는 바와 같이, TliA 로부터 유래된 LARD3는 C-말단에서 높은 소수성을 나타내었고, 각각 LARD3 융합 단백질 AP-LARD3 및 GFP-LARD3를 생산하도록 AP 및 GFP에 부착되었다.
구체적으로, 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase, AP) 및 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자는 pDART에 삽입하였고 슈도모나스 플루오레슨스 ΔtliA ΔprtA에서 발현되었다. 신호 서열을 제외한 AP유전자는 프라이머 세트 프라이머 세트 Sp-AP 및 AP-Sc를 이용하여 E. coli 게놈(genome)으로부터 증폭하였다. PCR 산물은 SpeI 의 접착 말단(cohesive end)이 XbaI의 접착 말단과 호환이 가능하므로, PCR 산물을 SpeI 및 SacI로 자르고 XbaI과 SacI으로 처리한 pDART에 삽입하였다. 유사하게, GFP 유전자는 프라이머 세트 Xb-GFP 및 GFP-Nh를 이용하여 pGFPuv (Clontech)으로부터 증폭하고, pDART-GFP를 생산하면서 pDART로 삽입을 위해 XbaI 및 NheI로 처리하였다. 제작된 플라스미드는 E. coli S17-1를 통하여 슈도모나스 플루오레슨스 ΔtliA ΔprtA로 접합되거나 또는 슈도모나스 플루오레슨스 ?tliA ?prtA로 직접 전기천공하였다. 콜로니는 30ug/ml의 카나마이신을 포함하는 LB 플레이트에서 선별하고 이후 실험을 위하여 25℃에서 2일 동안 배양하였다.
3-2.
AP
및
GFP
의 발현
pDART-AP의 발현은 액체 및 고체 배지에서 모두 실험하였다. 웨스턴 블랏 분석은 pDART 에 의한 단백질 발현 및 분비를 입증하기 위하여 수행하였다. pDART-AP 또는 pDART-GFP를 포함하는 슈도모나스 플루오레슨스 ?tliA ?prtA은 정지상(stationary phase)에 도달할 때까지 60 ug/ml의 카나마이신을 포함하는 5ml 배지를 포함하는 시험관에서 25℃, 180rpm으로 교반하면서 배양하였다. AP 및 GFP는 다양한 유형의 배지로 슈도모나스 플루오레슨스 ΔtliA ΔprtA에서 발현되었다. 단백질은 슈도모나스 플루오레슨스 가 lacI 유전자를 갖지 않기 때문에 Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)의 첨가 없이 본질적으로 발현되었다. 두 단계의 원심분리 단계를 통하여 배양액은 세포 펠렛과 상층액으로 분리하였다. 세포 펠렛(pellet)으로부터 AP 및 GFP의 세포 내(intracellular) 발현 및 상층액(supernatant )으로의 분비는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 두 단계의 원심분리 단계를 통하여 배양액은 세포 펠렛과 상층액으로 분리하였다. 16 ul 당량의 세포 추출물 및 배양 상층액은 젤(gel)에 로딩하였다. SDS-PAGE는 10% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)에서 수행하였고 단백질은 웨스턴 블랏 분석을 위하여 나이트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane (Amersham))으로 이동시켰다.
3-3.
웨스턴
블롯
분석
슈도모나스 플루오레슨스 ΔtliA ΔprtA 내 AP-LARD3 및 GFP-LARD3 융합 단백질의 발현 및 분비를 조사하기 위하여, 웨스턴 블롯과 SDS-PAGE 분석을 수행하였으며 그 결과를 도 3에 나타냈다. 도 3은 pDART를 이용한 AP 및GFP의 발현 및 분비를 나타낸다.
나이트로셀룰로스 막은 일차항체로 anti-LARD및 이차항체로 anti-rIgG 와 함께 인큐베이션하였다. 그 후 enhanced chemiluminescence SuperSignal West Pico (Pierce)를 이용하여 검출하였다. 웨스턴 블랏 이미지는 ImageQuant 350 instrument (GE)를 이용하여 얻었다.
다양한 배지에서 배양된 슈도모나스 플루오레슨스 세포 내 융합 단백질은 anti-LARD 항체를 이용하여 검출하여 도 3a에 나타내었다: 1 lane은 LB 배지에서 pDART-AP; 2 lane은 LB 배지에서 pDART-GFP; 3 lane은 LB 배지에서 pDART-AP; 4 lane은 2×LB 배지에서 pDART-GFP; 5 lane은 Studier's 배지에서 pDART-AP; 6 lane은 Studier's 배지에서 pDART-GFP; 7 lane은 M9 배지에서 pDART-AP; 8 lane은 M9 배지에서 pDART-GFP를 나타낸다.
도 3a에서 알 수 있는 바와 같이, 58.6kDa(47.9 kDa AP + 10.7 kDa LARD3)에 상응하는 단백질 밴드를 세포 내 및 상층액 안에서 검출하였다. 게다가, 크기가 38.7kDa인 GFP-LARD3(28.0 kDa GFP + 10.7 kDa LARD3)를 세포 내 및 상층액 안에서 검출하였다.
도 3b는 상층액에서 재조합 단백질의 분비를 나타내는데, 세포 밖 배지 내 융합 단백질은 anti-LARD 항체를 이용하여 검출하였다. 비교를 위하여, 동등한 양의 세포 추출물과 배양 상층액(16ul)를 젤에 로딩하였다: Lane은 도 3a와 동일하다.
도 3b에서 알 수 있는 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석은 AP-LARD3가 상이한 배지에 관계없이 잘 분비된다는 것을 나타내었다. 반대로, GFP-LARD3는 세포 발현과 비교할 때, 덜 효과적으로 분비되는 것을 확인하였다. 상층액 안의 적은 양의 GFP-LARD3가 세포 용해로 인한 것인지를 확인하기 위하여, pDAR-GFP를 포함하는 세포와 pDART-GFP를 포함하는 세포를 LB 배지를 포함하는 배양 튜브(5ml)와 플라스크(50ml)에서 배양하였다. 이후, GFP와 GFP-LARD3의 분비를 ABC 운반체 존재 하에서 anti-GFP 항체를 이용하여 비교하였다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 플라스크에서 세포를 배양할 때에는 GFP의 누출이 없으나, 동일한 조건에서 GFP-LARD3는 세포외적으로 생산되었다. LARD3가 융합될 때 세포 용해가 아니라 ABC 운반체에 의해 GFP가 분비된다는 것을 알 수 있었다.
AP-LARD3는 M9 배지에서 가장 효과적으로 분비된다. 따라서, M9 및 세포 성장에 있어서 질소 원천을 제공하는 요소가 보충된 M9를 차후의 분석을 위해 배양 배지로서 사용하였다. M9 또는 M9 요소 배지 내에서 자라는 pDART-AP 또는 pDART-GFP를 포함하는 슈도모나스 플루오레슨스 배양액의 상층액을 SDS-PAGE, 뒤이어 코마시 블루 염색으로 분석하였다.
3-4.
SDS
-
PAGE
분석
두 단계의 원심분리 단계를 통하여 배양액은 세포 펠렛과 상층액으로 분리하였다. 16 ul 당량의 세포 추출물 및 배양 상층액은 젤(gel)에 로딩하였다. SDS-PAGE는 10% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)에서 수행하였고 직접 관찰을 위하여, 폴리아크릴아마이드 젤은 Coomassie brilliant blue를 이용하여 염색하였다.
도 3c는 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과로, M9 또는 M9 요소 배지에서 배양한 슈도모나스 플루오레슨스의 배양 상층액 분석은 SDS-PAGE를 이용하여 수행하였다. 배양 상층액(16ul)는 SDS-PAGE 젤에 로딩하였고 Coomassie brilliant blue로 염색하였다: 1 lane은 M9 배지에서 pDART-AP; 2 lane은 M9 요소 배지에서 pDART-AP; 3 lane은 M9 배지에서 pDART-GFP; 4 lane은 M9 요소 배지에서 pDART-GFP를 나타낸다. 융합 단백질의 대응하는 위치는 화살표로 표시하였다.
도 3c에서 알 수 있는 바와 같이, 두꺼운 밴드는 pDART-AP를 포함하는 배양액에서 검출되었다(도 3c, lane 1 및 2). AP-LARD3 밴드는 58 kDa 크기의 알려지지 않은 단백질의 밴드와 결합되었으나, lane 3 및 4와 비교하여 밴드 강도의 분명한 증가는 배양액 내 AP-LARD3의 세포외 분비를 나타내는 것으로 확인하였다. 게다가, 38kDa 근처의 얇은 밴드가 pDART-GFP를 포함하는 슈도모나스 플루오레슨스 세포의 배양액에서 검출되었다(도 3c, lane 3 및 4). AP-LARD3는 GFP-LARD3와 비교할 때 더 많은 양으로 분비되었다. 게다가, M9와 비교할 때, 향상된 세포 성장을 위한 M9 요소 배지에서는 단백질 발현의 증가를 확인할 수 없었다.
실시예
4. 다양한 미생물에서의
AP
의 발현
4-1.
MG
/
PDP
agar
에서
AP
활성
pDART의 적용성을 평가하기 위하여, pDART-유래 플라스미드를 넓은 범위의 미생물 안으로 도입하였다. pDART-AP에 대하여 다양한 박테리아 숙주 내에서의 발현을 시험하였다.
형질전환된 미생물의 AP 활성 레벨을 MG/PDP 아가에서 스트레킹하고 야생형과 pDART-AP로 형질전환된 콜로니 색을 비교하여 시험하였다(표 4). 크산토모나스 캠페스트리스균(Xanthomonas campestris)를 제외한 모든 야생형 미생물은 흰색/노란색 콜로니를 나타내었다. 크산토모나스 캠페스트리스균 야생형 및 형질전환된 세포 콜로니는 둘 다 진한 녹색이었으나, 콜로니 주변은 아니었는데, 이는 균주가 자연적으로 세포 안에서 AP를 생산하기 때문일 것으로 추정하였다.
| Microorganism | Temp (?C) | Wild type | pDART - AP transformant b | Source |
| Agrobacterium tumefaciens | 25 | W | W | Lab stock |
| P. fluorescens DtliA DprtA | 25 | W | G | Molecular microbiology 21:459-470. |
| Pseudomonas fragi | 25 | W | G | KTCC2345 |
| Xanthomonas campestris | 25 | G | G | KACC10913 |
| Alcaligenes faecalis | 30 | W | W | KACC11612 |
| Burkholderia cepacia | 30 | W | L | KTCC2966 |
| Erwinia rhapontici | 30 | W | W/G | KACC10050 |
| Pseudomonas putida | 30 | W | G | KTCC2406 |
| Pseudomonas syringae | 30 | W | G | KTCC1832 |
| Yersinia rohdei | 30 | W | W | KACC15322 |
| Pseudomonas aeruginosa | 37 | W | L | KCTC1636 |
| Salmonella typhimurium | 37 | W | W/G | Lab stock |
| E. coli S17-1 | 37 | W | W/G | Lab stock |
b콜로니 색은 다음과 같다; G, 진한녹색; W, 흰색 또는 노란색; W/G, 냉장고에서 오랜시간 배양 후 진한 녹색; L, 콜로니 형성 없이 자람(lawn without forming colonies)
도 4는 MG/PDP agar에서 AP 활성을 나타내는데, pDART-AP를 갖거나 가지지 않는 다섯 종의 슈도모나스 종을 MG/PDP agar에 스트레킹하였다. 형질전환된 미생물의 콜로니는 MG/PDP agar 위에 스트레킹하고 25℃에서 4일동안 배양하였다. AP는 스트레킹된 주변의 색깔을 진한 녹색으로 변화시키면서 슈도모나스 종에서 분비되었다.
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, pDART-AP를 함유하는 슈도모나스 종은 슈도모나스 에루기노사(P. aeruginosa)를 제외하고, AP 분비를 나타내는, 콜로니 주변에 진한 녹색을 나타낸 반면, 야생형 종은 콜로니 주변 또는 콜로니 상에 녹색을 나타내지 않았다.
4-2.
pNPP
(p-
nitrophenylphosphate
)를 이용한 액체 배지에서
AP
활성
LB에서 분비된 AP의 활성을 비교하기 위하여, pNPP 이용한 이들의 AP 활성에 대하여 배양 상층액을 분석하였다.
도 5는 pNPP(p-nitrophenylphosphate)를 이용한 액체 배지에서 AP 활성 측정 결과를 나타낸다. pDART-AP를 포함하는 P. aeruginosa, P. syringae, P. putida, P. fragi, P. fluorescens, 및 E. coli는 4ml의 LB와 30ug/m의 카나마이신을 포함하는 시험관에서 25℃로 3일 동안 배양하였다. 배양 상층액의 AP 활성(U)은 pNPP를 이용하여 측정하였고 AP 활성을 상층액의 부피로 나누어 비활성(specific activity)으로 전환하였다. 대조군은 대조군 벡터(pDSK519)를 갖는 슈도모나스 플루오레슨스의 AP활성으로 나타내었다.
도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 슈도모나스 플루오레슨스 가 대략 140 mU/ml 의 높은 수준의 활성을 나타낸 반면, P. fragi, P. putida 및 P. syringae 는 60 및 80 mU/ml 사이의 AP 활성 수준을 나타내었다. E. coli 또한 적은 양의 AP를 분비하였다; 이는 냉장고에서 장기적인 보관하였을 경우 MG/PDP 상에서 활성이 나타났다(표 4). 어위니아 라폰티치(Erwinia rhapontici) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 와 같은 그람-음성 박테리아는 냉장고에서 오랜 보관 후에 녹색 콜로니를 나타내었다(표 4). 슈도모나스 에루기노사 는 배양 상층액에서 최소한의 활성을 나타내었다.
요약하면, pDART-AP로 형질전환된 다양한 박테리아 세포가 고체 및 액체 배지 모두에서 활성 AP를 분비하는 것을 확인하였다. 특히, pDART-AP를 함유하는 Pseudomonas 종은 ABC 운반체를 통해 재조합 단백질을 적절히 발현시키고 분비하는 것을 확인하였다.
실시예
5.
LARD
3 융합 단백질의 정제
도 2에 나타난 바와 같이, LARD3는 HIC에 대한 정제 태그로 사용될 수 있는 소수성 C-말단을 가진다. LB 및 M9에서 슈도모나스 플루오레슨스에 의해 생산된 AP-LARD3를 HIC 이용하여 정제하고, 이것의 활성과 단백질 농도를 SDS-PAGE 결과와 함께 분석하였다.
도 6은 LB/M9 배양 배지(broth)로부터 AP-LARD3의 정제를 나타낸다. LB(A) 및 M9(B)에서 배양한 슈도모나스 플루오레슨스에 의하여 생산된 AP-LARD3는 HIC에 의하여 정제하였다.
배양 배지는 메틸 세파로스에 로딩하고 0.1M의 감소율로 하여 1.0M부터 다른 농도의 황산 암모늄 용액으로 용출하고(E1-E10), 그 이후로는 10mM의 Tris 버퍼로 용출하였다(E11-E14). E1 에서 E4 까지는 SDS-PAGE에서 볼 수 있듯이 아무런 단백질을 포함하고 있지 않았다. 각 용출에서 AP 활성은 AP 버퍼를 이용하여 추정하였고 오렌지색 선으로 그래프에 표시하였다. AP 농도는 Bradford assay에 의한 단백질 정량 및 ImageQuant Densitometer에 따른 밴드 정량으로부터 추정하였다. M9 배지의 E12~E14(later elution)에서의 AP 는 사이즈만 같은 뿐 진짜 AP는 아니다.
도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 0.4 M AS 부근의 용출액(E6-E9)은 단백질 농도와 비례하여 AP 활성을 가지는 것을 확인하였다. 그러나, Tris 버퍼로 용출된, 후면의 용출액(E12-E14)은 활성을 나타내지 않았다. 그러므로, 알려지지 않은 단백질(도 3c)과 같은 크기로 나타나는 AP-LARD3 단백질을 HIC를 통하여 알려지지 않는 단백질로부터 분리하였다.
M9에서 자란 세포의 배양 상층액의 활성과 LB의 그것을 비교하면 M9 배지에서 LB에서 보다 더 많은 AP-LARD3가 생산된다는 것을 확인하였다. 이상하게도, M9에서 생산된 AP는 활성이 없으나(브로스), 활성을 HIC 정제에 의해 부분적으로 복구할 수 있었다. 이는, 소수성 상호작용 크로마토그래피로 분리하는 과정에서 소수성 상호작용에 의해 단백질이 약간 풀렸다가 다시 접히면서 활성을 갖는 것으로 판단하였다. LB 배양 브로스 유래 용출액(E5-E9)은 농축된 AP를 포함하는데, Bradford 방법을 이용하여 단백질 농도를 측정해본 결과 분리전 배양액에 있는 단백질의 양과 분리후에 각 fraction에 있는 단백질 양의 합이 동일하였고, 단백질 활성의 합이 초기 배양 상층액 내 AP 활성과 동일하였다. 이는 단백질 농도와의 관련에 있어서 M9 배양 브로스 유래 용출액에 대해서도 사실이며, 정제의 결합 또는 세정 단계에서 단백질 손실이 일어나지 않는다는 것을 입증하였다.
분비 및 정제의 효율을 증명하기 위하여, AP-LARD3, GFP-LARD3, 및 TliA 을 슈도모나스 플루오레슨스 에서 발현시키고 HIC를 이용하여 정제하였다. pDART-AP를 함유하는 세포는 M9 배지에서 오로지 AP-LARD3를 분비하는 것으로 보이는 반면, 동일한 세포는 LB 배지에서 다른 단백질들과 AP-LARD3를 분비하였다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, E6-E9에 대한 SDS-PAGE에서 AP-LARD3가 풍부한 밴드는 낮은 AP 활성을 나타내었다.
LARD3 융합 단백질 및 슈도모나스 플루오레슨스 내생 리파아제인 TliA는 methyl sepharose (Bio-Rad)를 이용하여 정제하였다.
TliA를 분비하는 pAJH10, pDART-AP, pDART-GFP 를 포함하는 슈도모나스 플루오레슨스 ΔtliA ΔprtA를 50 ml의 M9 또는 LB 배지에서 배양하였다. 정제를 위하여, 1.5ml의 베드 부피(bed volume)를 갖는 컬럼(column)을 이용하였다. 상기 컬럼은 1.6M 황산 암모늄(ammonium sulfate, AS)로 처음 평형화(equilibrate)하였다. 그 후, 목적 단백질을 만드는 9ml의 원심분리된 상층액을 6ml의 4M AS와 혼합하여 15ml의 1.6M AS 배양액을 만들었다. 이러한 샘플을 단백질 결합을 위하여 평형화된 컬럼을 통하여 흘렸다. 결합 후에, 컬럼은 1.3M의 AS로 세척하였고 뒤이어 0.1M의 감소율로 하여 1.0M부터 감소된 농도의 AS 용액 50ul 및 AS에 따른 10mM Tris(pH 7.6) 버퍼를 이용하여 용출하였다.
수집된 용출액은 4 내지 12% gradient polyacrylamide gel을 이용하여 처음 분석하고 효소적 활성 및 단백질 농도를 위해 추가 분석하였다. 전체 단백질 농도는 표준으로 bovine serum albumin를 이용하여 Bradford assay (Bio-Rad)로 결정하였다. 목적 단백질 농도는 Imaging Densitometer (ImageQuant TL 7.0)를 이용하여 목적 단백질의 비율(percentage )로부터 추정하였다. 정제한 후에, 용출 단백질의 약 20ug을 LARD3 신호 서열을 절단하기 위하여 2ug의 Factor Xa (NEB)와 함께 25℃에서 밤새 처리하였다.
도 7a는 M9 및 LB에서 생산되고 메틸-세파로스를 이용하여 정제된 AP-LARD3를 나타내는데, 용출 7(E7, early elution) 및 용출 13(E13, late elution)은 Factor Xa로 처리하였다: 1 lane은 M9에서 생산된 AP, 2 lane은 E7에서 정제된 AP, 3 lane은 Factor Xa에 의하여 처리된 E7에서의 AP, 4 lane은 E13에서 정제된 알 수 없는 단백질(unknown protein), 5 lane은 Factor Xa에 의하여 처리된 E13에서의 단백질, 6 lane은 LB에서 생산된 AP, 7 lane은 E7에서 정제된 AP를 나타낸다.
도 7a에서 알 수 있는 바와 같이, Factor Xa 처리는 AP-LARD3의 이른 용출액(E6-E9)이 AP (47.9 kDa) 및 LARD3 (10.7 kDa)를 절단하는데 성공적인 반면, AP 활성이 없는 늦은 용출액 (E12-E14)은 절단을 나타내지 않아, 늦은 용출액 안의 AP-LARD3 크기의 단백질이 AP-LARD3가 아님을 확인하였다.
도 7b는 M9 및 LB에서 생산되고 메틸-세파로스를 이용하여 정제된 TliA를 나타내는 것으로서, 1 lane은 M9에서 생산된 TliA, 2 lane은 E13에서 정제된 TliA, 3 lane은 Factor Xa에 의하여 처리된 E13, 4 lane은 LB에서 생산된 TliA, 5 lane은 E13에서 정제된 TliA를 나타낸다.
도 7c는 M9에서 생산되고 메틸 세파로스를 이용하여 정제된 GFP-LARD3를 나타내는 것으로서, 1 lane은 M9에서 생산된 GFP-LARD3, 2 lane은 E7에서 정제된 GFP-LARD3, 3 lane은 Factor Xa에 의하여 처리된 E7에서 GFP-LARD3를 나타낸다. 약한 밴드는 빨간색 화살표로 표시하였다. 각 16ul의 샘플을 SDS-PAGE에 로딩하고 Coomassie blue로 염색하였다.
도 7b 및 도 7c의 lane 1에서 알 수 있는 바와 같이, AP-LARD3와 같은 크기의 단백질은 유사하게 pAJH10 및 pDART-GFP를 함유하는 세포의 상층액에도 나타났다. 단백질 정량 및 밀도측정으로부터의 M9 배지에 분비된 AP-LARD3의 농도는 57.1ug/ml이었다. pAJH10을 함유하는 세포는 주로 85.6 ug/ml 의 단백질 농도로 M9 배지에서 TliA(49.9 kDa) 를 분비하였다. 도 7b에서 알 수 있는 바와 같이, 용출액의 Factor Xa의 처리는 온전한 TliA 가 Factor Xa 절단 부위를 가지지 않으므로 절단을 나타내지 않았다.
M9에서 자란 pDART-GFP를 함유하는 세포는 적은 양의 GFP-LARD3 (38.7 kDa)를 생산하였다. 분비된 GFP-LARD3의 농도는 7.2 ug/ml이었다. 도 7c에서 알 수 있는 바와 같이, Factor Xa 를 처리하여 GFP-LARD3에서 GFP (28.0 kDa) 및 LARD3 (10.7kDa)를 절단하였다. 슈도모나스 플루오레슨스는 M9 배지에서 LB보다 재조합 단백질을 더 많은 양 및 더 높은 순도로 생산하였다. 목적 LARD3 융합 단백질은 배양 배지에 관계 없이 동일한 용출액에서 검출되었다. AP-LARD3 및 GFP-LARD3는 대부분 0.4 M AS 정도의 용출액(E7)에서 검출되었는데, 이를 통하여, 단백질이 LARD3와 메틸 세파로스의 소수성 상호작용에 의해 정제된다는 것을 확인하였다. TliA는 전체 단백질의 AP-LARD3 또는 GFP-LARD3와 비교하여 상대적으로 높은 소수성으로 인하여 늦은 용출액에서 Tris 버퍼에 의한 용출액에서 대부분 검출되었다.
실시예
6.
AP
활성 확인
액체 배지 내 다른 미생물에서 분비된 AP의 활성을 평가하기 위하여, pDART-AP를 갖는 미생물은 5ml의 LB 및 30ug/ml의 카나마이신을 포함하는 시험관에서 각 미생물의 적정 온도로 180rpm의 진탕 배양기(shaking incubator)에서 3일 동안 배양하였다. 3일 후, 액체 배지로 분비된 AP의 활성을 검출하였다. AP 활성 확인을 위한 표준 방법으로, 50ul의 AP-포함 용액은100mM Tris(pH 8.0)로 0.5ml까지 희석하였다. 희석된 용액은 0.5ml의 5mM p-nitrophenylphosphate (pNPP)와 혼합하고 37℃에서 10분동안 인큐베이션하였다. 0.5ml의 2N NaOH 를 첨가하여 반응을 정지시키고 OD410을 측정하였다. OD410값은 pNP 표준 곡선을 이용하여 pNP 농도로 전환하였다. 하나의 유닛(one unit)은 37℃에서 1분에 1umol의 pNPP가 pNP로 전환되기 위해 필요한 AP의 양으로 정의하였다. 정제 단계에서 용출된AP는 AP의 적절한 활성을 위해 필수적인 Mg2+가 없기 때문에, 정제된 단백질의 AP 활성을 확인하였다.
정제된 단백질의 AP 활성을 확인하기 위하여, 100mM Tris(pH 8.0)를 NBT/BCIP 검출 방법과 함께 웨스턴 블랏에서 일반적으로 사용되는 AP 버퍼 (100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 100 mM Tris-HCl pH 9.5)로 대체하였다는 것을 제외하고 표준 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 고체 배지에서 AP 활성을 실험하기 위하여, pDART-AP를 갖거나 갖지 않는 미생물을 LB agar 내에서 50 ug/ml 메틸 그린(methyl green, MG) 및 1 mg/ml phenolphthalein diphosphate (PDP)를 포함하는 MG/PDP agar위에서 배양하였다. 인산염(Phosphate)는 콜로니의 색깔을 진한 녹색으로 변화시키면서 AP 활성에 의하여 PDP로부터 제거되었고 MG와 반응하였다.
도 8a는 ABC 운반체 매개 분비의 General scheme을 나타내는 것으로, 정상 조건(normal condition)에서 외막 단백질, ABC 단백질 및 막 융합 단백질 모두 분리되었다. 그러나, LARD-3신호 서열의 C-말단이 ABC 단백질에 결합되어 있는 경우, 전체 타입 1 분비 시스템은 모여있었다. 융합 단백질의 N-말단, 이 경우 GFP는 ABC 운반체를 통하여 세포 밖 공간으로 분비되었다. 세포 바깥의 칼슘 이온은 신호 서열의 어떤 부분과 결합하고 나머지 서열을 세포 바깥으로 당기게 되고, 단백질이 분비된 후, 또 다른 신호 서열이 ABC 단백질에 결합할 때까지 세가지 단백질은 분리되게 된다.
도 8b는 단백질 정제의 General scheme을 나타내는 것으로, 소수성(hydrophobic) C-말단 LARD3 서열은 소수성 상호작용을 통하여 세파로스(sepharose)에 결합되어 있는 메틸 그룹과 상호작용하고, LARD3 융합 단백질은 다른 분비 단백질들로부터 분리되는 것을 확인하였다. LARD3 신호 서열 및 목적 단백질은 목적 단백질과 LARD3를 연결하는 IEGR 잔기(residue)를 절단하는 Factor Xa로 LARD3 융합 단백질을 처리하여 LARD3 융합 단백질로부터 절단될 수 있다. 목적 단백질은 His-tag과 같은 정제 tag에 의하여 Factor Xa 및 LARD3로부터 추가로 정제되는 것을 확인하였다.
실시예
7.
LARD
3 융합 단백질과
His
-
tag
융합 단백질의 정제 실험
소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 융합 단백질을 정제하는 경우와 His-tag을 이용하여 융합 단백질을 정제하는 경우의 효과를 비교하기 위하여, AP-LARD3의 N-말단에 His-tag을 달아주기 위하여 AP 유전자를 PCR 할때 프라이머에 His-tag에 해당하는 염기서열을 추가로 첨가해서 유전자를 증폭하였다. 재조합으로 완성된 플라스미드를 미생물에서 발현하여 단백질을 세포 밖으로 생산한 후 메틸 세파로스 컬럼(소수성 상호작용 크로마토그래피)과 Ni-NTA 컬럼(His-tag 분리)으로 AP-LARD3를 각각 정제하였다.
메틸 세파로스 컬럼을 이용한 정제를 위하여, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로, 배양액을 원심분리하고 9ml의 배양액에 6 ml 4 M AS를 첨가해서 1.6 M AS 배양액을 만들었다. 이러한 샘플을 단백질 결합을 위하여 평형화된 상기 컬럼을 통하여 흘렸다. 결합 후에, 컬럼은 1.3M의 AS로 세척하였고 뒤이어 0.1M의 감소율로 하여 1.0M부터 감소된 농도의 AS 용액을 각각 500ul 사용하며, 다음으로는 10mM Tris(pH 7.6) 버퍼를 이용하여 용출하였다.
Ni-NTA 컬럼을 이용한 정제를 위하여, 상기 메틸 세파로스 컬럼을 이용한 정제와 동일하게 9ml의 배양액을 Ni-NTA 컬럼에 로딩하고 25 mM 이미다졸(imidazole)로 세척(washing)한 후 250 mM 이미다졸로 용출하였다.
도 10은 메틸 세파로스 컬럼과 Ni-NTA 컬럼으로 AP-LARD3를 정제한 결과를 나타내는 것으로, lane 1은 배양중인 단백질, lane 2 내지 lane 8은 메틸 세파로스 컬럼을 이용하여 정제한 경우, lane 9 내지 lane 14는 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 정제한 경우, lane 15는 size marker를 나타낸다.
도 10에서 알 수 있는 바와 같이, 메틸 세파로스 컬럼을 이용한 정제의 경우 6 내지 8번째 용출액에서 가장 많은 단백질이 용출되어 나오는 반면, Ni-NTA 컬럼을 이용한 정제의 경우 첫 번째 용출액에서부터 단백질이 용출되어 나오는 것을 확인하였다.
또한, 도 10에서 알 수 있는 바와 같이, 처음 배양액에 있는 단백질 양과 분리를 거쳐 농축된 단백질의 양을 비교하여 보면, 메틸 세파로스 컬럼을 이용한 정제의 경우 단백질의 손실 없이 모두 분리되는 것을 확인할 수 있으나, Ni-NTA 컬럼을 이용한 정제의 경우 단백질의 명백한 손실이 있으며 메틸 세파로스 컬럼을 이용한 정제의 경우에 비하여 단백질의 농도가 현저히 낮은 것을 확인하였다.
<110> KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
<120> Polypeptide for purification of target protein and use thereof
<130> DPP20147460KR
<160> 7
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 174
<212> PRT
<213> Pseudomonas fluorescens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(174)
<223> Amino acid sequence of LARD1
<400> 1
Ser Ile Ala Asn Leu Ser Thr Trp Val Ser His Leu Pro Ser Ala Tyr
1 5 10 15
Gly Asp Gly Met Thr Arg Val Leu Glu Ser Gly Phe Tyr Glu Gln Met
20 25 30
Thr Arg Asp Ser Thr Ile Ile Val Ala Asn Leu Ser Asp Pro Ala Arg
35 40 45
Ala Asn Thr Trp Val Gln Asp Leu Asn Arg Asn Ala Glu Pro His Thr
50 55 60
Gly Asn Thr Phe Ile Ile Gly Ser Asp Gly Asn Asp Leu Ile Gln Gly
65 70 75 80
Gly Lys Gly Ala Asp Phe Ile Glu Gly Gly Lys Gly Asn Asp Thr Ile
85 90 95
Arg Asp Asn Ser Gly His Asn Thr Phe Leu Phe Ser Gly His Phe Gly
100 105 110
Gln Asp Arg Ile Ile Gly Tyr Gln Pro Thr Asp Arg Leu Val Phe Gln
115 120 125
Gly Ala Asp Gly Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ala Lys Ala Val Gly
130 135 140
Ala Asp Thr Val Leu Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Thr Leu Val Gly
145 150 155 160
Val Gly Leu Gly Gly Leu Trp Ser Glu Gly Val Leu Ile Ser
165 170
<210> 2
<211> 140
<212> PRT
<213> Pseudomonas fluorescens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(140)
<223> Amino acid sequence of LARD2
<400> 2
Asp Ser Thr Ile Ile Val Ala Asn Leu Ser Asp Pro Ala Arg Ala Asn
1 5 10 15
Thr Trp Val Gln Asp Leu Asn Arg Asn Ala Glu Pro His Thr Gly Asn
20 25 30
Thr Phe Ile Ile Gly Ser Asp Gly Asn Asp Leu Ile Gln Gly Gly Lys
35 40 45
Gly Ala Asp Phe Ile Glu Gly Gly Lys Gly Asn Asp Thr Ile Arg Asp
50 55 60
Asn Ser Gly His Asn Thr Phe Leu Phe Ser Gly His Phe Gly Gln Asp
65 70 75 80
Arg Ile Ile Gly Tyr Gln Pro Thr Asp Arg Leu Val Phe Gln Gly Ala
85 90 95
Asp Gly Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ala Lys Ala Val Gly Ala Asp
100 105 110
Thr Val Leu Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Thr Leu Val Gly Val Gly
115 120 125
Leu Gly Gly Leu Trp Ser Glu Gly Val Leu Ile Ser
130 135 140
<210> 3
<211> 104
<212> PRT
<213> Pseudomonas fluorescens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(104)
<223> Amino acid sequence of LARD3
<400> 3
Gly Ser Asp Gly Asn Asp Leu Ile Gln Gly Gly Lys Gly Ala Asp Phe
1 5 10 15
Ile Glu Gly Gly Lys Gly Asn Asp Thr Ile Arg Asp Asn Ser Gly His
20 25 30
Asn Thr Phe Leu Phe Ser Gly His Phe Gly Gln Asp Arg Ile Ile Gly
35 40 45
Tyr Gln Pro Thr Asp Arg Leu Val Phe Gln Gly Ala Asp Gly Ser Thr
50 55 60
Asp Leu Arg Asp His Ala Lys Ala Val Gly Ala Asp Thr Val Leu Ser
65 70 75 80
Phe Gly Ala Asp Ser Val Thr Leu Val Gly Val Gly Leu Gly Gly Leu
85 90 95
Trp Ser Glu Gly Val Leu Ile Ser
100
<210> 4
<211> 70
<212> PRT
<213> Pseudomonas fluorescens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(70)
<223> Amino acid sequence of LARD4
<400> 4
Phe Leu Phe Ser Gly His Phe Gly Gln Asp Arg Ile Ile Gly Tyr Gln
1 5 10 15
Pro Thr Asp Arg Leu Val Phe Gln Gly Ala Asp Gly Ser Thr Asp Leu
20 25 30
Arg Asp His Ala Lys Ala Val Gly Ala Asp Thr Val Leu Ser Phe Gly
35 40 45
Ala Asp Ser Val Thr Leu Val Gly Val Gly Leu Gly Gly Leu Trp Ser
50 55 60
Glu Gly Val Leu Ile Ser
65 70
<210> 5
<211> 35
<212> PRT
<213> Pseudomonas fluorescens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(35)
<223> Amino acid sequence of LARD5
<400> 5
Ala Lys Ala Val Gly Ala Asp Thr Val Leu Ser Phe Gly Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Thr Leu Val Gly Val Gly Leu Gly Gly Leu Trp Ser Glu Gly Val
20 25 30
Leu Ile Ser
35
<210> 6
<211> 44
<212> PRT
<213> Pseudomonas fluorescens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(44)
<223> Signal sequence of secretion
<400> 6
Gly Ser Asp Gly Asn Asp Leu Ile Gln Gly Gly Lys Gly Ala Asp Phe
1 5 10 15
Ile Glu Gly Gly Lys Gly Asn Asp Thr Ile Arg Asp Asn Ser Gly His
20 25 30
Asn Thr Phe Leu Phe Ser Gly His Phe Gly Gln Asp
35 40
<210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> Pseudomonas fluorescens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(27)
<223> Amino acid sequence of polypeptide for purification
<400> 7
Val Leu Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Thr Leu Val Gly Val Gly Leu
1 5 10 15
Gly Gly Leu Trp Ser Glu Gly Val Leu Ile Ser
20 25
Claims (26)
- 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 펩타이드 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 펩타이드를 필수적으로 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 그람 음성균에서 목적 단백질의 세포 외 분비 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 정제용 조성물로서,
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 알킬 세파로스를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피법이며, 상기 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸기인 것인, 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 제1 펩타이드와 제2 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 목적 단백질의 C-말단에 융합된 단백질 형태인 조성물.
- 삭제
- 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 펩타이드 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 펩타이드를 필수적으로 포함하는 목적 단백질의 세포 외 분비 및 정제용 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드;
슈도모나스 플루오레슨스의 tliDEF 유전자;
제한효소 절단부위;
선별 마커;
리보솜 결합 부위(ribosomal binding site, RBS); 및
Factor Xa 절단 부위(cleavage site);를 포함하는,
그람음성균에서 목적 단백질의 발현, 세포 외 분비 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 정제용 발현 카세트로서,
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 알킬 세파로스를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피법이며, 상기 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸기인 것인, 발현 카세트.
- 제9항에 있어서, 상기 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 펩타이드 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 펩타이드를 필수적으로 포함하는 목적 단백질의 세포 외 분비 및 정제용 폴리펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 그람음성균에서 목적 단백질의 발현, 세포 외 분비 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 정제용 발현 카세트.
- 제9항에 있어서, 상기 발현 카세트는 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴크레오타이드를 추가로 포함하는 것인, 그람음성균에서 목적 단백질의 발현, 세포 외 분비 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 정제용 발현 카세트.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 그람음성균에서 목적 단백질의 발현, 세포 외 분비 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 정제용 발현 카세트로 형질전환된 그람음성균 세포.
- 제12항에 있어서, 상기 그람 음성균은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주, 크산토모나스(Xanthomonas) 속 균주 및 버크홀데리아(Burkholderia) 속 균주로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 세포.
- 제13항에 있어서, 상기 슈도모나스속 균주는 슈도모나스 플루오레슨스, 슈도모나스 프라기, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 시린게 또는 슈도모나스 에루기노사인, 세포.
- 제13항에 있어서, 상기 슈도모나스속 균주는 슈도모나스 플루오레슨스의 리파아제 유전자(tliA) 및 프로테아제 유전자(prtA)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 일부 영역이 결실되며, 상기 유전자의 일부 결실은 유전자의 적어도 하나의 말단에 적어도 100bp 이상 크기의 단편을 남기도록 유전자 영역을 결실시킨 것이며, 기능적 리파아제 및 기능적 프로테아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기능적 단백질을 생성하지 않는 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주인, 세포.
- 제15항에 있어서, 상기 변이 균주가 기능적 프로테아제 단백질을 생성하지 않는 것은, 프로테아제 유전자의 전부 또는 일부 결실, 또는 프로테아제 저해제 유전자(inh)의 전부 또는 일부 결실에 의해 이루어진 것인, 세포.
- 삭제
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 그람음성균에서 목적 단백질의 발현, 세포 외 분비 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 정제용 발현 카세트로 형질전환된 그람음성균 세포를 제조하고,
상기 세포를 배양하여 세포 외 분비 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 정제용 폴리펩타이드가 결합된 목적 단백질을 발현하고,
상기 목적 단백질에 결합된 세포 외 분비 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 정제용 폴리펩타이드를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여, 목적 단백질을 분리 또는 정제하는 단계를 포함하고,
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 알킬 세파로스를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피법이며, 상기 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸기인 것인, 그람 음성균에서 목적 단백질을 생산하는 방법.
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- 제18항에 있어서, 상기 목적 단백질을 분리 또는 정제하는 단계 이후에, 상기 목적 단백질에 결합된 정제용 폴리펩타이드를 절단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 그람 음성균은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주, 크산토모나스(Xanthomonas) 속 균주 및 버크홀데리아(Burkholderia) 속 균주로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 슈도모나스속 균주는 슈도모나스 플루오레슨스, 슈도모나스 프라기, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 시린게 또는 슈도모나스 에루기노사인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 슈도모나스속 균주는 슈도모나스 플루오레슨스의 리파아제 유전자(tliA) 및 프로테아제 유전자(prtA)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 일부 영역이 결실되며, 상기 유전자의 일부 결실은 유전자의 적어도 하나의 말단에 적어도 100bp 이상 크기의 단편을 남기도록 유전자 영역을 결실시킨 것이며, 기능적 리파아제 및 기능적 프로테아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기능적 단백질을 생성하지 않는 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주인, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 변이 균주가 기능적 프로테아제 단백질을 생성하지 않는 것은, 프로테아제 유전자의 전부 또는 일부 결실, 또는 프로테아제 저해제 유전자(inh)의 전부 또는 일부 결실에 의해 이루어진 것인, 방법.
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