WO2019050318A2 - 재조합 단백질의 분비를 증가시키는 방법 - Google Patents

재조합 단백질의 분비를 증가시키는 방법 Download PDF

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WO2019050318A2
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변현종
박지연
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention uses a Type 1 Secretion System (TlSS) of bacteria and lowers the pI of the target protein in the extracellular secretion of the target protein to produce a Lipase ABC transporter recognition domain 3 the method and the target protein to increase secretion of a target protein associated with the LARD3) relates to a process for producing efficiently ⁇ .
  • TlSS Type 1 Secretion System
  • Mass production of recombinant proteins has become an important issue in various industries.
  • Conventional methods for mass production of recombinant proteins include a method of synthesizing recombinant proteins in prokaryotic cells such as Escherichia coli, dissolving the cells, purifying cell extracts obtained by biochemical methods, Mass production of protein.
  • a protein production system capable of simultaneously expressing and secreting a recombinant protein in a cell is a more efficient and economical method because costly extraction and purification processes are reduced in necessity.
  • Some of the methods for mass production of proteins include the process of refolding the proteins produced by manipulating the microorganisms and the purification of the proteins in the culture medium to eliminate the need for intensive protein purification in order to separate the target protein from the proteins extracted from the cells Produce the target protein and secrete it out of the cell.
  • the desired protein can be obtained without destroying the microorganism by allowing the protein to be produced by manipulating the microorganism to be produced to be secreted in the culture solution, compared with the currently commercialized protein production system using the genetically modified microorganism, this method does not destroy the microorganism, Of native proteins Can minimize the contamination of the protein product caused by the purification process, thereby drastically reducing the cost of the purification process.
  • the present invention newly discloses a factor determining the secretion of a protein using a Type 1 Secretion System (TlSS) of bacteria, thereby controlling extracellular secretion of the target protein by controlling the pi and total charge of the recombinant LARD3 and the target protein And a method for efficiently producing a target protein.
  • TlSS Type 1 Secretion System
  • the inventors of the present invention have disclosed a novel method for secretion and mass production of proteins that can secrete proteins that have not been secreted outside the cell through the TlSS (Type 1 Secretion System) of bacteria, And the present invention has been completed on the basis thereof. Further, the inventors of the present invention have found that the difference between the secretible protein and the secreted protein among the secretory proteins that bind the lipase ABC transporter recognition domain (LARD3) to the desired protein to be secreted outside the cell Experiments were carried out to reveal.
  • TlSS Type 1 Secretion System
  • Pseudomonas fluorescens living on the surface of most plants have been shown to have biological stability since they have been consumed by humans for a long time.
  • Pseudomonas fluorescens can withstand various fermentation conditions under high concentration of cell culture conditions, Proteins can be produced.
  • Pseudomonas fluorosis naturally has a number of secretion systems ranging from type I secretion system (T1SS) to type 6 secretion system (T6SS), and in particular, Pseudomonas fluorescens has ATP-binding cassette cassette cassette, ABC) has a secretory system type 1 that transports heat-resistant lipase ( ⁇ ) through the transporter Tl iDEF.
  • P. fluorescens ⁇ ] was introduced into various protein genes bound to LARD3, and the concentrations of corresponding proteins were analyzed in the supernatants and cell pellets of the respective cultures in which various proteins were cultured.
  • the PI of the protein plays an important role in the secretion of TliDEF, the T1SS transport of P. fluorescens, and the secretion of a protein having a specific PI in various T1SS transporters derived from other microorganisms other than P. fluorescens Thereby completing the present invention.
  • the present inventors utilized a pDART plasmid vector developed in a previous study to conveniently attach LARD3 to proteins (Ryu, J., Lee, U., Park, J., Yoo, DH, and Ahn, JH (2015) A vector system for ABC transporter-mediated secretion and purification of recombinant proteins in Pseudomonas species. Appl Environ Microbiol 81, 1744-1753).
  • the pDART plasmid has a multiple cloning site (MCS) directly followed by an in-frame LARD3 gene, and the gene inserted at the multiple cloning site of pDART is expressed in the carboxyl terminus with LARD3 specificity.
  • MCS multiple cloning site
  • LARD3 - ⁇ Pseudomonas fluorescens TI iDEF, Pseudomonas aeruginosa AprDEF (PaAprDEF), Dickeya dadantii PrWEFiMPrtOEF), and Escherichia coli HlyBD + TolC were introduced into the ABC transporter of Type 1 Secretion System And the protein is secreted by the ABC transporter of T1SS.
  • pDART contains a kanamycin resistance gene for clone selection, and a broad range of Escherichia coi P. Vi / o esce ⁇ It contains the tliD, tliE, and tliF genes, which have host origin replication origin and express the THDEF complex gene.
  • oligopeptide sequence was attached to these proteins to artificially lower the pi value and add a negative charge.
  • the inventors created two plasmids that attach the aspartic acid polypeptide (oligo-aspartate) sequence to the cargo protein.
  • the present inventors made plasmids adhering arginine polypeptides to investigate the effect of addition of positively charged amino acids to the target protein.
  • GFP GFP secretion of the supercharged variant to determine whether the overtransfected variant of the protein exhibits a different secretion pattern from the original protein.
  • Type I secretion system is a chaperone-dependent secretion system using the Hly and Tol gene clusters, which means a polypeptide secretion system using an ABC transporter present in bacteria.
  • the secretion process begins by recognizing the HlyA leader sequence and binding HlyB to the membrane. This signal sequence is very specific to ABC transporters.
  • the HlyAB complex stimulates HlyD to begin releasing the coil and TolC arrives at the outer membrane, which recognizes the terminal molecule or signal of HlyD.
  • HlyD attracts TolC to the inner membrane and HlyA exits the outer membrane through a long-tunneled protein channel.
  • Bacterial T1SS carries a variety of molecules, ranging from ions, drugs, and proteins of various sizes (20 to 900 kDa).
  • the secreted molecules range in size from the small Escherichia coli peptide colimV (lOkDa) to the 520 kDa Pseudomonas fluorescens cell attachment protein.
  • the most well-characterized is the RTX toxin and lipases.
  • Type 1 secretion is also involved in the secretion of non-proteinaceous substrates such as cyclin ⁇ -glucans and polysaccharides.
  • T1SS is mainly present in Gram-negative bacteria, and bacteria having T1SS include Pseudomonas spp., Dicke spp., Or Escherichia coli, and more Preferably, Pseudomonas fluorescens (/ 3 ⁇ 4 / 03 ⁇ 4 / 735 fluorescent, Dadantii or Erwinia chrysanthemi), E. coli G3 ⁇ 4cAer / cA / a coli, aeruginosa).
  • Pseudomonas fluorescens a gram-negative bacterium, is resistant to high cell concentrations caused by fermentation conditions because it does not accumulate acetic acid. Generally, it is non-pathogenic to humans and is a candidate for production of protein through secretion.
  • Pseudomonas fluorescens is a psychrotrophic c bacter ium and has many excellent features for the production of recombinant proteins.
  • the present inventors carried out a study to secrete a target protein into a culture medium by ABC transporter of microorganism by fusing a target sequence with a signal sequence recognized by a polypeptide ABC transporter belonging to the type I secretion system (T1SS) As a result, it was revealed that polypeptide ABC transporters belonging to the type I secretion system (T1SS) exhibit recombinant protein secretion efficiency proportional to the charge property at the isoelectric point (pi) of the transport protein, That is, in the case of the over-expressed recombinant protein prepared to lower the pi of the target protein to be produced, the efficiency of secretion using the ABC transporter of the type I secretion system could be enhanced. Experimentally, pi was found to be close to the charge amount of the protein (See FIG. 6).
  • the present invention relates to a THDEF transporter other than Pseudomonas fluorescens THDEF transporter
  • T1SS means a polypeptide secretion system using an ABC transporter, and the Tl iDEF transporter is also a typical T1SS.
  • the present invention separates genes of various T1SS transporters from other microorganisms other than Pseudomonas ⁇ uorescens, specifically Pseudomonas aeruginosa Apr DEF (PaAp / EF), Dickeya dadantii (also called Erwinia chrysan themi ⁇ L), PrtDEF Z.PrtDEF), Escherichia co // HlyBD + TolC (Escherichia coli originally expresses the TolC protein).
  • the three T1SS transporters were Pseudomonas And 60%, 59%, and 27%, respectively, of the THDEF transporter.
  • the LARD3 signal It was confirmed that the recombinant protein for the sequence-attached recombinant protein was secreted through the three kinds of transporter (see Fig. 19). Thus, it has been confirmed that the technology for enhancing the secretion of protein-rich water and electrons can be applied not only to Pseuck onas fluorescens microorganism THDEF transporter but also to T1SS transporters having a nucleotide sequence identity of 27% with TliDEF 2 (see Fig. 21, Fig. 22, Fig. 23).
  • the present invention includes a nucleic acid sequence encoding a lipase ATP-binding cassette (ABC) transporter recognition domain (LARD) and an expression cassette operably linked to a nucleic acid sequence encoding a target protein, Wherein the target protein has an acidic pi value and is expressed as a fusion protein secreted extracellularly.
  • ABSC lipase ATP-binding cassette
  • LARD transporter recognition domain
  • the expression vector may further comprise a nucleic acid sequence encoding an ABC transporter of T1SS of a bacterium.
  • target protein means a target protein produced biologically from bacteria and secreted outside the cell to be mass-produced.
  • the target protein is not particularly limited and may be, for example, an enzyme for cytokine, growth hormone, an immune-related protein, a binding protein, etc.
  • an enzyme for cytokine for example, Mannanase, MBP NKC-TliA, Eg IV, GFP, thioredoxin, , alkaline phosphatase, EGF, TliA.
  • MAP Caps id, Hsp40, M37 lipase, Cutinase, Chitinase, and CTP-TliA.
  • Various methods can be used to have the LARD and pi of the target protein have an acid pi of less than 7.
  • an acidic amino acid may be added to the target protein, or a basic amino acid may be removed from the target protein or may be substituted with another amino acid.
  • an amino acid protruding outward from the three- we investigated the relationship between the number of amino acids and the number of amino acid residues in the amino acid sequence. , Liu DR. Supercharging Proteins Can Impart Unusual Resilience. Journal of Chem. Soc et al 2007; 129: 10110-10112. ) Algorithm can be used to dial the protein. However, in this case, it is preferable to recombine the protein so as not to affect the structure and function of the protein.
  • fusion protein refers to a protein secreted outside the cell having an acidic pi value, the protein being expressed by linking the base sequence encoding LARD and the base sequence encoding the target protein.
  • the pi value of the fusion protein may be less than 7, preferably 1 to 6, more preferably 2 to 5.5, most preferably 3.0 to 5.5, such as 4.0 to 5.5 .
  • a protein having a pi value of less than 1 of the fusion protein is highly unstable and preferably has a pi value within the above range.
  • the T1SS transporter having 20% or more of the nucleotide sequence identity may be, for example, Serratia marcescens ex HasDEF, Bordetella a pertussis CyaBDE, Escherichia co // CvaBA + TolC, Caulobacter crescentus ⁇ RsaDEF But is not limited thereto.
  • Pseudomonas aeruginosa AprDEF PaAprDEF
  • Dickeya dadantiii / ⁇ DdPrtDEF Dickeya dadantiii / ⁇ DdPrtDEF
  • Escherichia coli HlyBD + To lC Pseudomonas fluoresces Tl iDEF itself.
  • the Tl iDEF consists of three protein complexes: ATP-binding cassette (ABC), membrane fusion proteins (MFP), Tl iD, THE, and Tl iF, which are outer membrane elements (0MF).
  • the ABC protein selectively recognizes the secretory domain of the C-terminal part of the target protein and hydrolyzes ATP to secrete the desired protein.
  • the membrane fusion protein is embedded in the cytoplasmic membrane, Link protein to outer membrane protein.
  • the outer membrane protein is located on the outer membrane and spans most of the periplasm that forms the channel through which the protein of interest is secreted.
  • ABC proteins, membrane forming proteins and outer membrane proteins are each encoded by tliD, tliE, and tliF located upstream of tliA in the heat-resistant lipase operon.
  • the secretion / chaperone domain at the end of UiA is defined as the Lipase ABC transporter Recognition Domain (LARD).
  • LARD3 contains four RTX (repeats-in-toxin) motifs, has been identified as the most effective C-terminal signal in secretion through the ABC carrier.
  • Pseudomonas fluorescens including the tliDEF and LARD3 fusion protein constructs efficiently secrete the LARD3 fusion protein and secreted LARD3 fusion protein can be obtained directly from the culture broth.
  • the nucleic acid sequence encoding the target protein of the expression vector may further include a nucleic acid sequence encoding the acidic peptide.
  • the number of the added acidic peptides is not particularly limited, but according to one embodiment of the present invention, the number of amino acids constituting the acidic peptide may be 6 to 20, preferably 7 to 15, for example, 10. When the number of amino acids constituting the peptide is less than 6, the pH of the fusion protein does not exhibit the superficial acidity, and secretion through the type I secretion system (T1SS) may not occur smoothly.
  • T1SS type I secretion system
  • the acidic peptide may be at least one amino acid selected from the group consisting of aspartic acid and glutamic acid.
  • the nucleic acid sequence encoding the acidic peptide is at least one selected from the group consisting of Asparatic acid 10 D10), which encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid sequence encoding the acidic peptide may be located at the 3'-end or the 5'-end of the nucleic acid sequence encoding the target protein, preferably at the 3'-end .
  • the vector may further comprise a nucleic acid sequence encoding a linker.
  • the linker may be one to three peptides consisting of a Gly-Gly-Gly-Gly-Ser amino acid sequence.
  • the nucleic acid sequence encoding the target protein may be obtained by removing one or more basic amino acids contained in the target protein.
  • the basic amino acid is lysine or arginine.
  • the target protein may be a supercharged target protein, preferably a target protein negatably supercharged.
  • the present invention can increase the extracellular secretion of a target protein by overcharging a charge of a target protein that has not been secreted outside the Gram-negative cell.
  • the target protein can be overcharged by substituting aspartic acid with glutamic acid, and if the amino acid is an acidic amino acid, replacing with lysine and arginine.
  • the protein of interest may be prepared by remodeling a protein surface using AvNAPSA (Average Neighbor Atoms per Sidechain Atom) algorithm. The protocol of AvNAPSA is known (W02007 / 143574 A1).
  • the algorithm is an algorithm for quantifying how close each amino acid of a protein is to other atoms of the protein.
  • amino acids having an AvNAPSA score of 100 or less that is, amino acids that are relatively present on the outer surface of a protein and do not significantly affect the structure even when the functional groups are protruded in the solvent direction
  • Proteins that were replaced by aspartic acid and glutamic acid in batches according to published protocols nonegat ively supercharged Protein sequences were synthesized and the resulting DNA sequences were synthesized and the synthesized DNA sequence was inserted into pDART plasmid to express the protein at low molecular weight.As a result, The efficiency of the extracellular secretion of the protein was significantly increased.
  • the lipase ABC transporter recognition domain may be LARD 1, LARD 2, or LARD 3.
  • the LARD may refer to the secretion / chaperon domain at the C-terminus of t l iA in the thermostable lipase activity of Pseudomonas fluorescens.
  • the LARD peptide may be divided into LARD 1 to LARD 5 peptides according to the sequence.
  • the LARD used in the present invention may be LARD 3, preferably LARD-3 peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 .
  • LARD ⁇ tide contains a purification sequence capable of functionally purifying using hydrophobic interaction chromatography, and this purification sequence is VLSFGADSVTLVGVGLG WSEGVLIS (SEQ ID NO: 29), which was previously described in our previous patent K 10-1677090 . Proteins containing the purification sequences can be readily purified using hydrophobic interaction chromatography. Therefore, the LARD 3 peptide containing the above purification sequence can be used for purifying the target protein.
  • the LARD peptide also functionally includes a signal sequence which induces the secretion into the cell in the cell, and this secretory signal sequence is GSDGNDLIQGGKGADFIEGGKGNDTIRDNSGHNTFLFSGHF ⁇ D ⁇ 30), which was also disclosed in the previous Patent R10-1677090 have.
  • the protein containing the secretory signal sequence can be secreted into the cell in the extracellular environment.
  • the LARD 1 to LARD 3 peptides include both the secretory signal sequence and the purification sequence of the present invention. Therefore, they can be used for the secretion and purification of the desired protein in cells.
  • the secretory signal sequence can use the LARD 3 peptide (SEQ ID NO: 22).
  • the nucleotide sequence encoding the LARD is located at the 3'-end of the nucleotide sequence encoding the recombinant target protein, and may be a form encoding a protein fused to the C-terminal of the recombinant target protein.
  • the recombination purpose When fused to the C-terminus of a protein, in contrast to the N-terminal signal sequence hydrolyzed by extracellular secretion, the C-terminal signal sequence may have the advantage of not being hydrolyzed.
  • a cell comprising the above-described expression vector.
  • the expression vector contained in the cell includes a nucleic acid sequence encoding a recombinant target protein, and an expression cassette in which a nucleic acid sequence encoding a lipase ABC transporter recognition domain (LARD) is operably linked, And expressing the protein of interest in the bacterium.
  • the cells may be gram-negative and include, for example, strains of the genus Pseudomonas, strains of the genus Escherichia, strains of the genus Xanthomonas or strains of the genus Burkholder ia), but is not limited thereto.
  • the extracellular secretion of the target protein is made by the function of the ABC transporter. Since the ABC transporter operates in the gram-negative bacteria having the double membrane, .
  • the Pseudomonas sp. Strain may be any strain belonging to the genus Pseudomonas, but may be, for example, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. Or Pseudomonas eruginosa, It may be Fluorescence Sphacitumonas eruginosa.
  • the target proteins introduced into Pseudomonas fluorescens can be bound to the C-terminal signal transduction site of T? A and secreted outside the cell in the form of a fusion protein.
  • the intrinsic lipase of Pseudomonas fluorescens Proteases are also secreted outside the cells via the ABC carrier.
  • the Pseudomonas sp. Strain is partially deleted from a region of at least one gene selected from the group consisting of the lipase gene of Pseudomonas fluorescens /) and the protease gene (r), and a partial deletion of the gene is deleted at least at one end of the gene Deletion of the gene region so as to leave a fragment of at least 100bp in size, and functional lipase And a functional proteinase, which do not produce at least one functional protein selected from the group consisting of a functional proteinase and a functional protease.
  • mutant strain UiA lipase single deletion
  • mutant strain ⁇ P ⁇ protease single deletion
  • mutant strain ⁇ / protease double deletion mutant strain mutant strain ⁇ / ⁇ AprtA
  • the Pseudomonas fluorosis variant strain does not produce a functional protease protein may be obtained by deletion of all or part of the protease gene or deletion of all or part of the protease inhibitor gene (inh).
  • the Pseudomonas fluorosis variant may be, but is not limited to, a Pseudomonas fluorosis variant strain having, for example, the accession numbers KCTC 12276BP, KCTC 12277BP, or KCTC 12278BP.
  • the present invention provides a method for producing a recombinant vector, comprising the steps of: preparing the above-described vector-transformed cells; culturing the cells to produce a protein having a molecular weight; The method comprising the steps of:
  • the cells may be Gram-negative, and in the method for producing a desired protein in the cells, a method for producing Gram-negative bacteria cells transformed with the expression vector may be a conventional gene introduction method. For example, May be introduced into a Gram negative organism, or a gene encoding a target protein inserted into the introduced vector may be inserted into the genome by homologous recombination into the genome.
  • the vector includes all common vectors including plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, virus vectors, and the like, and is not particularly limited thereto.
  • the vector introduced into the Gram-negative bacteria was carried out by electric cheunggyeok gene transfer method (electroporat ion), calcium phosphate (CaP0 4) precipitation, chloride kalseum (CaCl 2) precipitation, a known method such as PEG, dextran sulfate, lipofectamine can do.
  • the conditions such as the culture medium, the culture medium and the culture time can be appropriately controlled.
  • the culture medium contains all nutrients essential for growth and survival of microorganisms such as carbon source, nitrogen source and trace elements .
  • the pH of the culture medium can be adjusted appropriately, and antibiotics and the like can be included.
  • inducers can be induced to induce the expression of proteins, the kind of the inducing agent to be treated can be determined according to the vector system, and conditions such as the inducer administration time and dosage can be appropriately controlled.
  • the 2 ⁇ LB medium In order to effectively express the target protein in the wild-type strain and the mutant ⁇ /, the 2 ⁇ LB medium should be used, but the LB medium can be used in the mutant ⁇ / and the mutant ⁇ / 4 ⁇ ,
  • the mutant ⁇ / ⁇ ⁇ ⁇ produces the desired protein without the interference of ⁇ extracellularly and from PrtA hydrolysis and has the advantage of using LB medium without competing with lipase or protease-derived signal sequences and ABC carriers Therefore, it is easy to produce, secrete and purify the foreign mutant strains and can increase the protein production, so that it can be useful for mass production of the target protein.
  • the target protein can be recovered and purified in a conventional manner except that hydrophobic interaction chromatography is performed using LARD containing the purification sequence.
  • LARD hydrophobic interaction chromatography
  • cells recovered by the centrifugation method can be disrupted by using a French press or an ultrasonic disintegrator.
  • the culture supernatant can be collected.
  • solubilized by overexpression by dissolving and denaturing the protein in a suitable solution and refolding. Glutathione, dithiothreit, ⁇ -mercaptoethanol, cystine and cystamine, and a refolding agent such as urea, guanidine, arginine, etc. may be used, and a part of the salt may be used together with the refolding agent .
  • a protease recognition site such as Factor Xa or Tobacco Etch Virus (TEV) protease or Enterokinase (EK) is inserted after the step of isolating or purifying the target protein And the acidic peptide and LARD bound to the target protein
  • TSV Tobacco Etch Virus
  • EK Enterokinase
  • the purification of the target protein can utilize a hydrophobic interaction.
  • the purification sequence of the present invention can be used as a purification tag.
  • the hydrophobic interaction chromatography is a hydrophobic interaction chromatography method using an alkyl sepharose, and the alkyl group may be a methyl, ethyl, propyl or butyl group.
  • the alkyl group may be a methyl group.
  • the protein containing the purification sequence can be purified more than when other alkyl groups are used.
  • a column for performing His-tag purification and a column for His-tag purification are expensive, and there are some cases where a large capacity is not suitable for purifying the protein .
  • NTA column is used a lot, but when reused Ni 2+ black has a problem that the NTA is dropped and the repeated use is restricted.
  • the hydrophobic column used in hydrophobic interaction chromatography is a low cost column, which is economical, suitable for use in mass separation, and has a high reuse ratio.
  • Another example of the present invention provides a method for increasing the extracellular secretion of a protein in a gram-negative bacterium, which comprises the step of inserting the above-described vector of the present invention into cells.
  • the cell may further comprise an expression vector comprising a nucleic acid sequence encoding an ABC transporter of a Type 1 Secretion System (TlSS) of bacteria.
  • TlSS Type 1 Secretion System
  • Gram-negative bacteria maintain the membrane potential of the inner membrane at about 150 mV, and the cytoplasmic side is more negatively charged than the interplacental space (peripartum). This polarized charge distribution is maintained by various cellular mechanisms including active proton transport across the membrane.
  • the electric potential of the outer membrane also has a negative value, and the interplanar space is more negatively charged than the extracellular space due to the negatively charged membrane-derived oligosaccharide distributed therein.
  • the size of the outer membrane membrane is relatively small, generally less than 30 mV.
  • the secretion of negatively charged proteins is generally favorable in terms of energy, which affects the equilibrium of the secretion antagonist.
  • the membrane potential is very strong at the biochemical level and has a significant effect on the change in free energy during transport through the ABC transporter. Moving the polypeptide across the lining with the -150mV potential requires an energy of about 3.5 kcal / irol per charge carried by the polypeptide. Calculation at constant pressure, temperature and concentration is as follows.
  • n is the total charge of the polypeptide and F is the Faraday constant.
  • N +10
  • w 35 kcal / m
  • the general value of the free energy change ( ⁇ G) of ATP hydrolysis under the concentration of the living body is 11.4 kcal / nl.
  • the proposed model for the mechanism of ABC transporters analyzes that the ABC protein acts through a continuous transition between "inward” and “outward” forms combined with ATP hydrolysis. According to this model, one of the main power sources for the ABC transporter is the "power stroke" force that occurs during this process.
  • the negatively charged membrane potentials apply an electrostatic force to the charged polypeptide to counteract or even reverse the force exerted by this drive striking eventually affecting the secretory equilibrium give.
  • Tl iD is an ABC protein that is a component of the inner membrane portion of the Tl iDEF carrier. This protein has a nucleotide binding domain (NBD) and transmembrane domain (TMD) linked by short interdomain sequences.
  • NBD nucleotide binding domain
  • TMD transmembrane domain
  • the theoretical pi is very high around the Tl iD ABC protein, especially around TMD (pi 9.43) and inter-domain sequence (pi 8.14).
  • the folded alpha helix forming the substrate entry entrance of Tl iD also has a positively charged residue that protrudes into the hole at the entrance and blocks the substrate entry entrance in the ADP binding state of Tl iD,
  • the presence of arginine or lysine at this position in all the analogues of the dog confirmed that the positivity of this residue was conserved (Figure 9C, black arrow).
  • Figure 9E We hypothesize that the internal surface of this positively charged channel interacts with the negatively charged residues of the cargo protein during protein transport to promote secretion (Figure 9E). '
  • the present inventors newly discovered that only highly acidic proteins can be transported through the ABC transporter, and that basic or weakly acidic proteins can not be secreted through the ABC carrier, and the aspartic acid polypeptide By attaching or negatively charging the cells to the cell, thereby artificially lowering pi, thereby improving the secretion of the desired protein to the outside of the cell.
  • a simple pi confirmation can provide a way to determine whether an ABC transporter can secrete a protein of interest, and ultimately, the range of protein species that can be efficiently produced through ABC transducer- .
  • the present invention relates to a method for producing a protein having an acidic pi value
  • TlSS 1 secretion system ABC transporter to provide a way to effectively secrete the target protein into the cell. It is possible to mass-produce proteins in a simple and efficient manner without performing any purification process using the above method.
  • Figures la and lb show the secretion of the protein selected according to Example 6 and show Western blot images showing the expression and secretion of the target protein.
  • Figures 2a and 2b show the correlation between the fraction of target protein and their isoelectric point according to Example 6.
  • the pi value of the target protein was calculated from the sequence containing the attached LARD3.
  • Figures 3a and 3b show the lengths of Lunasin and oligo-aspart ic acid tail lengths to determine the optimal length of the oligo-aspart ic acid sequence in the P. vresce / ⁇ expression and secretion system according to Example 7 Expression of different Lunasin derivatives via LARD3 attachment and confirmation of secretion.
  • Fig. 4 shows the structure of the plasmid used in the present invention according to Example 8, and shows the structure of pDART plasmid containing MCS.
  • Fig. The proteins fused with t l iD, t l iE, t l iF and LARD3 are controlled by a single operon.
  • A since the LARD3 gene is located immediately after the MCS, the inserted target gene is expressed together with LARD3 attached to the C-terminus.
  • B shows the structure of pFDIO, which is a plasmid in which the D10 sequence is attached to the N-terminus. The D10 gene follows the initiation codon directly and precedes the MCS and LARD3.
  • C shows the structure of the pBDIO plasmid which is located at the C-terminus but attaches the D10 sequence before LA D3. The D10 gene is located between MCS and LARD3.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of comparing the activity of aspartic acid 10 (NKC-Tl iA, CTP-T? A) at the N-terminal portion (FD10) and the C- terminal portion (BD10) of two kinds of Tl iA hepatocytes (D10) was added thereto and expressed through a pDART plasmid, followed by detection of Western blot and Leiface activity using a measurement medium.
  • aspartic acid 10 N-terminal portion
  • BD10 C- terminal portion
  • FIG. 6 is a graph showing the fluorescence intensity of green fluorescent protein (GFP), mannanase, maltose binding protein (MBP), thioredoxin (FD10) and C-terminal portion (BD10) 10 aspartic acid (D10) was added and expressed through pDART plasmid, followed by Western blotting.
  • GFP green fluorescent protein
  • MBP maltose binding protein
  • FD10 thioredoxin
  • BD10 C-terminal portion 10 aspartic acid
  • FIG. 8 shows the result of detection of the green fluorescent protein (GFP) super-charged by AvNAPSA according to Example 12 in pDART expression and Western blotting.
  • GFP green fluorescent protein
  • Figure 9 shows the charge distribution of the Tl iD structure, the ABC protein of the Tl iDEF complex, according to Example 5.
  • a portion indicated by a circle in FIG. 9A represents a positive positive portion
  • a portion indicated by a circle in FIG. 9D represents a negative inner cavity of the carrier
  • a white arrow inside the circle represents a negative negative charge
  • a banded atom and a black arrow indicates a relatively positively charged atom.
  • Fig. 10 shows the secretion comparison of Tl iA, CTP-Tl iA and NKC-Tl iA according to Example 9, Fig. 10a shows the results of enzyme plate analysis of Tl iA, CTP-Tl iA and NKO Trypto, Western blot results of CTP-Tl iA and NKC-Tl iA.
  • FIG. 11 shows the relationship between protein pi and charge at pH 7.0 according to Example 5.
  • FIG. 13 shows the predicted results of transmembrane helices of Tl iD modeled according to Example 5.
  • Fig. The square box portion corresponds to the film passage portion predicted by the server.
  • Fig. 14 shows the ConSurf homology preservation analysis result of Tl iD modeled according to Example 5. Fig. The areas marked dark black are well preserved, and the more open the colors are the less conserved.
  • Fig. 15 shows the secretion of proteins from pDAR-Tl iA, -NKC (-), NKC-L1, -NKC-L2, NKC-L3 and -NKC-Tl iA according to Example 13.
  • A Western blot of ⁇ .
  • B shows the results of the enzyme plate analysis of the ⁇ in other plasmids.
  • FIG. 16 shows the results of analysis of secretion of 0SAV, wtSAV, + 13SAV and 2-10GST, wtGST and + 19GST according to Example 14 (SAV: streptoavidin I GST: glutathione S-transf erase).
  • FIG. 17 is a graph showing changes in glutathione S-lysine in which the protruded amino acid is replaced with an aspartic acid or arginine to observe the structure without using the AvNAPSA (Averaging Number of Neighboring Atoms Per Chain Atom) (GST) and streptavidin (SAv) were expressed in pDART and detected by Western blotting.
  • AvNAPSA Average Number of Neighboring Atoms Per Chain Atom
  • SAv streptavidin
  • FIG. 19 is a graph showing the results of simultaneous expression of T.noteq. Protein (original substrate of Tl iDEF transporter) and three different strains of T1SS transporter in E. coli according to Example 16, The results of the experiment are shown through the color change of the medium.
  • FIG. 20 is a graph showing the results of the LAD3 signal sequence of the Cut inase protein (Cut i) and the over-charged Cutine protein (Cut i (-)) The results are shown in the results of experiments in which the degree of secretion in the enzyme activity measurement medium was expressed through the color change of the colony periphery medium.
  • FIG. 21 shows the results of attaching the LARD3 signal sequence to a cutinase protein (Cut inase, Cut i) and a transiently charged cutinase protein (Cut i (-)) according to Example 18, And then incubated in E. coli and cultured in a liquid medium, followed by Western blotting to detect the concentration of the corresponding protein in the cell and the extracellular space.
  • a cutinase protein Cut inase, Cut i
  • Cut i (-) transiently charged cutinase protein
  • FIG. 22 shows the results obtained by attaching the LARD3 signal sequence to the M37 lyase protein (m37 lipase, M37) and the over-phosphorylated M37 lypha protein (M37 (-)) according to Example 19, And then incubated with E. coli in a liquid culture, followed by Western blotting to detect the concentration of the corresponding protein in the cell and extracellular space.
  • 23 shows the sequence identity between the TliDEF transporter and the various T1SS transporters and the proportion occupied by the sequence-like portion in the entire base sequence.
  • the microorganisms were cultured in LB medium (lysogeny broth) containing 30 yg / mL of kanamycin.
  • An enzyme plate assay for the target genes with lipase activity contained 0.5% colloidal glyceryl tributylate mixed with a blender Lt; / RTI > agar medium.
  • E. coli and P. fluorescent were cultured at 37 ° C and 25 ° C, respectively. Were performed according to a standard heat-shock method and were made using a standard electroporation protocol with P.
  • Plasmid pDART used a plasmid previously used for secretory production of other proteins (Ryu, J., Lee, U., Park, J., Yoo, DH, and Ahn, JH for ABC transporter-mediated secretion and purification of recombinant proteins in Pseudomonas species. Appl Environ Microbiol 81, 1744-1753).
  • the plasmid vectors pFDIO and pBDIO are derivatives of pDART prepared by adding 10 aspartic acid codons to the target protein upstream or downstream of the MCS of the pDART.
  • the DNA sequence of the ten aspartic acids was synthesized using the synthesized 67yc // je z?
  • a lunasin gene (Galvez, AF Chen, N., Macasieb, J., and Lumen, was used as a template and amplified by PCR. The results are shown in Table 1. < tb > _______________________________________ < tb > ______________________________________ < tb > Two different PCR products were obtained for pFDIO and pBDIO, respectively, wherein one or two optional bases were inserted upstream or downstream of the primer to retain the translation frame and the pFDIO- and pBDIO- inserted proteins There is a slight difference in size and pi.
  • pFDIO and pBDIO were prepared by recombining the PCR products into pDART using an In-Fusion cloning kit (Clontech In-Fusion HD cloning lus CE). To linearize the pDART, it was digested with Xbal (pFDIO construct) or Sacl (pBDIO). Subsequently, the PCR product with the linearized pDART was digested with In-Fusion 3'-5 'exodeoxyribonuclease
  • the pFDIO and pBDIO plasmids capable of inserting the desired gene were constructed by ligating complementary 15 base 5 'protrusions with these DNA fragments. Sequences near the MCS of pDART, pFDIO, and pBDIO are listed in Table 2.
  • the underlined amino acid sequence represents the LARD3 signal sequence
  • the bold "IEGR” is a residue that connects the target protein with the LARD3 signal sequence, which is the part of which Factor Xa recognizes and cleaves.
  • the target protein can be further purified from Factor Xa and LARD3 by a purification tag such as Hi s-tag.
  • Figures 19A-19F show the entire sequence of the target proteins in the FASTA format
  • Figure 19G shows the color code for indicating the enzyme site and polypeptide characteristics.
  • Target genes Thirteen target genes were selected for insertion into pDART. Extracted Genomic DNA samples ( ⁇ , ⁇ , Trx and Hsp40), whole cDNA (EglV), synthesized DNA products (NKC-TliA, CTP-TliA, MAP, lunasin, lunasin derivatives, GFP and superposed GFP) Other proteins) were amplified by PCR.
  • N-terminal signal peptides are described in SignalP 4.1 web based prediction 5 (http: // www. Cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (Peter sen, TN, Brunak, S., von Heijne, G. , and Nielsen, H. (2011) SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature methods 8, 785-786) and excluded from the cloning and expression process. The codons of the synthetic genes were optimized for expression in E. coli (over-charged GFPs) or P. fluorescens (TliA derivatives).
  • the lunasin gene was synthesized and amplified by PCR for pDART insertion.
  • Different length derivatives of the Asp polypeptide tail at the ⁇ end such as lunasin-D, lunasin-D5, lunasin-D15 and lunasin-D20 were amplified with various primers and recombined with pDART for secretion production (Fig. 3B).
  • NKC-TliA and CTP-T? A are derivatives of T?
  • NKC is a previously developed antibiotic polypeptide and CTP is a cytoplasmic delivery peptide previously developed with a cellular import tag.
  • the primers used for PCR had the restriction enzyme sites used to insert the desired gene into the plasmids MCS (pDART, pFDIO and pBDIO).
  • PCR products and plasmid vectors were double-digested with two restriction enzymes: Xbal, Kpnl, Sad or Spel (which is compatible with Xbal).
  • Specific pairs of enzymes used in each gene can be found directly from the full sequence provided in Table 2. < tb >< TABLE > Then, T4 ligase was used to ligate the restriction enzyme-treated plasmid with the gene.
  • the constructed plasmid was introduced into E. coli for cloning, and the cloned plasmid was transformed using standard plasmid purification methods . Purified plasmids were introduced into P. fluorescens for analysis of expression and secretion.
  • the liquid culture solution 400 was taken and centrifuged at 18,000 rcf for 10 minutes to separate the supernatant and the cell pellet.
  • cell pellet extract and supernatant 16 ii L-culture were loaded on a 10% polyacrylamide gel, respectively. SDS-PAGE was used to separate proteins according to size.
  • the nitrocells were then transferred to the Rhôse membrane (Amersham) for western blotting of the proteins.
  • the primary antibodies were diluted 1: 3000 and 1: 500, respectively, and anti-rabbit recombinant goat IgG-1, anti-rabbit IgG- peroxidase r lgG goat IgG-peroxidase) was diluted 1: 1000 and used as a secondary antibody.
  • the band was detected using a chemiluminescent preparation (Advansta WesternBright Chemical Co.) and finally a Western blot image was obtained using an Azure C600 autosensing system. All included western blot images are the result of a stringent result from at least three different repeat experiments from cell culture with independent P. fluorescens colonies.
  • S is the normalized signal strength of each band of the western blot image and the subscript indicates the sample type of the lane.
  • Figure 11 shows the relationship between protein pi and charge at pH 7.0.
  • the charge per 100 residues of the isoelectric point and the LARD3-adhered recombinant protein show a high linear correlation.
  • the wild-type ⁇ was labeled in blue, and the protein with no secretion in the extracellular culture was marked in red. As a result, a clear linear correlation was observed, and unfolded protein charge measured at pH 7.0 was calculated using Protein Calculator v3.4
  • SWISS-MODEL workspace a web-based environment for protein structure homology modeling. Bioinformat ics 22, 195 ⁇ 201) was used to study ABC transport protein structures.
  • the present inventors used a template of PrtD (PDB ID 5122) of Aquifexaeolicus (Morgan, JLW Acheson, JF, and Zimmer, J. (2017) Structure 1 a Secretion System ABC Transporter Structure 25 and 522-529) , And the sequence identity of the template and TliD reached 40.98%.
  • the structural prediction result of TliD is shown in Fig.
  • Fig. 12 shows the structural prediction result of TliD on the basis of template and alignment (al ignment) colored according to QMEAN4 score.
  • the residues that are of low quality (according to the QMEAN4 score) in the predicted (bright colored part in FIG. 12) are mainly located on the outer surface, and are generally located in random coils and protrusions.
  • the QMEAN4 score and staining were calculated using SWISS-MODEL.
  • Figure 13 shows the predicted results of the transmembrane helices of the modeled TliD. The prediction was performed using a DAS-TMfilter web server.
  • A Represents the predicted structure of the TliD dimer, with transmembrane helices displayed in a different color.
  • B Represents a TliD signal highlighted with the same color code as (A).
  • Fig. 14 shows the ConSur f phase con- tent analysis result of the modeled TliD.
  • TliD dimer was stained according to Bayesian conservation score. Fig. 14 shows that the preservation score was high when it was high, and lightly when the preservation score was low.
  • the transmembrane helices of TliD are conserved between homologs. Specifically, the residues facing the inside of the central channel of TliD were highly conserved, and residues (toward phospholipids or cytoplasm) outside the central channel were highly variable.
  • Aquifex aeolicus PrtD (PDB ID 5122) as a template.
  • ConSurf homologous conservatism analysis on TliD also showed that this positive charge distribution in the middle of the channel was indeed evolutionarily conserved (Fig. 9, C and D).
  • the deflected alpha helix forming the substrate entry entrance of TliD has a positively charged residue that protrudes into the opening of the inlet and blocks the substrate entry entrance in the ADP binding state of TliD, The positive charge of this residue was confirmed to be conserved at this position in the analogue (Fig. 9 ( black arrows).)
  • the present inventors have found that the positive surface of the inner surface of the cotton channel, during protein transport, And promote secretion (FIG. 9E).
  • FIG. 9 shows the charge distribution of the THD structure, the ABC protein of the TliDEF complex.
  • A Electron repulsion surf ace of TliD monomer is shown and color is assigned from blue (+ 7kBT / e) to red (_7kBT / e) according to surface potential.
  • the inner surface of the central channel which is highly positively charged, is marked by a circle at the top.
  • B a TliD homodimer, one of the monomers presented in the ribbon model.
  • the positively charged inner surface of the central channel is indicated by the upper circle, and the Substrate entry window is indicated by the lower circle.
  • C Tlid, a conserved positive charge cluster at the midpoint of the inner surface of the channel is indicated by a circle.
  • the C-terminal LARD3 signal sequence was attached to P. fluorescens ⁇ tliA ⁇ / ⁇ via pDART to the genes of 13 target proteins with various sizes, flexibility, volume, and weight (Table 4).
  • Table 4 shows the list of genes and their sources, and the genes marked with * indicate the genes that were not used in this experiment but were secreted in previous studies. After the cells were cultured in liquid, the supernatant and cell pellet were analyzed by Western blotting (FIGS. La and lb).
  • Figures la and lb show the secretion of the selected protein and show a Western blot image showing the expression and secretion of the target protein.
  • the cell sample represents the amount of protein that is localized to the extracellular space by the amount of protein remaining in the cytoplasm and supernatant sample.
  • the equivalent of the cell extract and culture supernatant (16 ml) was loaded onto the gel and analyzed via western blot. 50 NG ⁇ was loaded as a reference in the middle of the gel.
  • the other two different western blots were obtained from different culture samples. Other All of the results showed a similar pattern.
  • the following image shows the Western blot results of the same sample with the primary antibody against cytosol ic Neo, the neomycin / kanamyc in phosphotransferase 2 protein. Minimization of nonspecific dissolution or leakage within all samples except capsids was minimized.
  • the secreted proteins had a relatively high theoretical pi. All of them (with one exception, CTP- ⁇ ) had a pi greater than ⁇ 5.5 and were positively charged or had a slight negative charge. On the other hand, the secreted protein had a relatively strong acid pi and its pi did not exceed 5.5 ( Figures 2a and 2b).
  • Figures 2a and 2b show the correlation between the fraction of target proteins and their rounding points.
  • the pi value of the target protein was calculated from the sequence containing the attached LARD3. Unreleased proteins appeared as red bars.
  • Figure 2b adds the secret ion percentage to pi. Percentage values were calculated by dividing the supernatant signal by the sum of the supernatant and the cell signal.
  • NKC-Tl iA and CTP-Tl iA were dramatically reduced when compared to the secretion of native T? A.
  • These are derivatives of ⁇ , with a very short positively charged sequence at the N-terminus (Table 2).
  • CTP-TI iA was not secreted at all. It is important to note that the CTP has a very positively short sequence (RRARRRRRR) consisting solely of arginine, except that one contains alanine in the middle as shown in Table 2.
  • lunasin is an anticancer peptide isolated from soybean Glycine max. This protein has a unique feature that it has nine consecutive aspartic acid (Asp) sequences at the carboxyl end. The present inventors have inspired to produce several derivatives of lunasin having different aspartic acid polypeptide tail lengths.
  • Figures 3a and 3b show the expression of Lunasin derivatives with different lengths of Lunasin and oligo-aspartic acid tail via LARD3 attachment in order to determine the optimal length of the oligo-aspartic acid sequence in the expression system of. Fluorescens and secretory system It is the result of confirming the secretion.
  • FIG. 3A shows the expression of Lunasin and its derivatives in cells and supernatants by Western blotting. Specifically, cell extracts and supernatants of 36 iiL equivalent were loaded onto gels and analyzed by Western blot.
  • Figure 3b shows the protein sequence and domain structure of the modified lunasin and derivatives thereof with the length of the aspartate tail. Each designated lunasin-D0, lunasin-D5, original lunasin (D9), lunasin-D15 and lunasin-D20.
  • aspartic acid has the lowest pKa value (Mathews, C. K. (2013) Biochemistry, 4th ed., Pearson, Toronto).
  • lunasin protein sequence in Example 7 above, we have developed two plasmids that also attach the LARD3 signal sequence as well as the aspartic acid polypeptide sequence.
  • Figure 4 shows the structure of the plasmid used and shows the structure of the pDART plasmid containing MCS.
  • the proteins fused with t l iD, t l iE, t l iF and LARD3 are controlled by a single operon.
  • A since the LARD3 gene is located immediately after the MCS, the inserted target gene is expressed together with LARD3 attached to the C-terminus.
  • B shows the structure of pFDIO, which is a plasmid in which the D10 sequence is attached to the N-terminus. The D10 gene follows the initiation codon directly and precedes the MCS and LARD3.
  • C shows the structure of the pBDIO plasmid which is located at the C-terminus but attaches the D10 sequence before LARD3. The D10 gene is located between MCS and LARD3.
  • the selected proteins were inserted into newly prepared plasmids pFDIO and pBDIO.
  • the genes inserted into pFDIO or pBDIO were introduced into P. fuorescens along with the version inserted into pDART and their secretion efficiencies were analyzed together by western blotting.
  • Both NKC- ⁇ and CTP-TI iA are derivatives of ⁇ , with a basic peptide attached at the N-terminus of each.
  • the secretion efficiency through Tl iDEF is higher than wild type Tl iA lb and Figures 10a, b).
  • FIG 10a shows the results of enzyme plate analysis of T? A, CTP-Tl iA and NKC-Tl iA, and T? A was secreted as expected (T? A is a natural substrate for the Tl iDEF transporter). However, the secretion of CTP- ⁇ was blocked and the secretion of NKC-Tl iA was somewhat weaker than ⁇ .
  • Figure 10b shows Western blot results of Tl iA, CTP-Tl iA, and NKC-Tl iA.
  • T01A strongly secreted T01A
  • NKC-Tl iA weakly secreted NKC-Tl iA
  • CTP- It was not.
  • NKC has a very large positive charge
  • CTP has a much larger positive charge.
  • CTP has nine consecutive residues consisting of only arginine, with alanine as the only exception in the middle.
  • FIG. 5 shows that 10 aspartic acids were added to the N-terminal portion (FD10) and the C-terminal portion (BD10) of the two kinds of T.A. lyophages (NKC-Tl iA and CTP-Tl iA) Plasmid, followed by Western blot and Leiface activity.
  • Fig. 5 (A), secretion was significantly improved in both pFDIO and pBDIO as compared to pDART.
  • B shows the results of NKC-Tl iA enzyme plate analysis on other plasmids
  • (C) shows the result of Western blotting of CTP-Tl iA in pFDIO and pBDIO, confirming a significant increase in secretion in pBDIO.
  • (D) shows the results of CTP-Tl iA enzyme plate analysis on other plasmids.
  • the secretion of pBDIO is greatly increased.
  • Two different Western blotting results showed similar patterns to those obtained from different culture samples.
  • Two different enzyme plate assays were obtained from different colonies, all of which exhibited a similar pattern.
  • NKC-Tl iA has a dramatic increase in secretion after D10 is attached either upstream or downstream, as shown in FIGS. 5 (A) Respectively.
  • CTP-T [alpha] as shown in Fig. 5 (C) and (D)
  • pBDIO when the D10 sequence was added downstream by pBDIO, rapid increase in secretion was observed in both the Western blot and the activity assay plate.
  • the halo sizes of NKC-T? A and CTP-T? Inserted into pDART or pBDIO generally correspond to the band intensity of the supernatant sample in each Western blotting result.
  • pFDIO has a halo that is slightly smaller than expected from their band intensities, indicating a potential reduction in enzyme activity.
  • the recombinant plasmids obtained by introducing green fluorescent protein (GFP), mannanase, maltose binding protein (MBP), and thioredoxin gene into pDART, pFDIO and pBDIO were introduced into P. fluorescens ⁇
  • the converted protein was prepared.
  • the resulting protein was secreted by the Tl iDEF transporter, and the results of the experiment are shown in Fig.
  • Figure 6 shows secretion in pFDIO and pBDIO of negatively charged proteins.
  • A shows Western blotting results of GFP, and both pFDIO and pBDIO show an increase in protein secretion in the supernatant.
  • B Western blot analysis of Mannanase showing a slight increase in both pFDIO and pBDIO in Mannase secretion.
  • C Western blot results of MBP, and an increase in the fraction was observed in both pFDIO and pBDIO.
  • D Western blot results of thioredoxin, indicating that the signal was overall weak but increased in both pFDIO and pBDIO. Overall, the band of the more negatively charged protein in pBDIO was slightly shifted upwards.
  • Three different Western blot results for pDART and pBDIO were obtained from different culture samples while two different Western blot results for pDART and pFDIO. All of them showed a similar pattern.
  • GFP showed the greatest increase in secretion.
  • Comparison of the band intensities of GFP inserted in pDART and pBDIO showed a significant change in the supernatant versus expression ratio.
  • pFDIO-GFP was slightly improved in secretion from the viewpoint of the ratio of supernatant to cell pellet (Fig. 6 (A)).
  • the secretion of MBP was also improved in both pFDIO and pBDIO in terms of supernatant / cell ratio compared to pDART (Fig. 6C).
  • Trx thioredoxin
  • This plasmid has introduced R10, a DNA sequence encoding an arginine polypeptide, instead of D10 encoding MCS followed by aspartic acid polypeptide.
  • the present inventors inserted the T? A and GFP genes into the pDART, pBDIO, and pBRlO plasmids and examined the secretion through an enzyme-activated medium (TI iA only) and Western blot. The results are shown in FIG.
  • FIG. 7 shows the results of detection by Western blot and lypha active medium after addition of 10 aspartic acid (D) or 10 arginine (R) at the C-terminus of the T. lyophila and green fluorescent protein (GFP) .
  • D aspartic acid
  • R arginine
  • FIG. 7A shows the Western blot results of Tl iA in the plasmid.
  • Tl iA of pDART and pBDIO show good secretion. However, when R10 was attached, secretion was blocked.
  • FIG. 7B shows the result of Tl iA enzyme plate analysis in the above plasmid. Tl iA secretion was blocked when pBRlO was inserted.
  • Figure 7C shows the western blot results of GFP in the plasmid . Similarly, pDART and pBDIO exhibited good secretion, while secretion when R10 was attached was blocked.
  • Green Fluorescent Protein GFP
  • GFP derivatives obtained by supercharging the proteins by Sidechain Atom (AvNAPSA) (Lawrence MS, Phillips KJ, Liu DR. Supercharging Proteins Can Impart Unusual Resilience. Journal of the American Chemical Society 2007; 129: 10110-10112) And GFP (+30) and GFP (+36) were ligated to LARD3 via pDART and introduced into P. fluorescens AtliA AprtA to express the protein. The samples were analyzed by Western blotting and the results are shown in FIG.
  • AvNAPSA Sidechain Atom
  • Fig. 8 shows the secretion of GFP and the superposed GFPs.
  • Over-charged GFP markedly increased the percentage of protein concentration in the supernatant versus cell, indicating a significantly higher fraction of the original GFP.
  • GFP and GFP-30 were detected in both cell pellets and supernatant, indicating that these proteins were effectively secreted into the extracellular space after their expression.
  • GFP-30 was more strongly expressed in the supernatant than the original GFP.
  • GFP (+36) is strongly expressed in cell pellets, It was not secreted into space.
  • the pi values of these recombinant proteins were 4.64 for GFP (-30), 5.36 for untreated GFP, and 10.42 for GFP (+36).
  • NKC-Tl iA was selected as the model protein.
  • pl 5.34 and protein secretion is reduced.
  • the present inventors confirmed the degree of secretion by substituting aspartate (NKC (-)) for all of the Lysines of the NKC protein and linking NKC (-) and Tl iA to various lengths of l inker to obtain NKC -) secretion efficiency was compared between the western blot and the active assay plate, and the results are shown in Fig.
  • the length of the linker is represented by NKC (-) without L1, L1 with two GGGGS, L2 with two, and L3 with three.
  • Figure 15 shows protein secretion in Tl iA, NKC (-), Nc-L1, NKC-L2, NKC-L3 and NKC-Tl iA.
  • A) of Figure 15 is the Western blot result iA Tl
  • 15 of (B) shows the analysis results of the enzyme plate Tl iA in other plasmids'.
  • the secretion of NKC (-) protein is increased and the secretion is increased when the linker is introduced. Especially, when three linkers are attached, the secretion is increased And it was confirmed that it increased remarkably. This is the NKC ttuin a negative charge through i a result it was found to increase the secretion of the protein.
  • the present inventors observed the secretion tendency of proteins by replacing the amino acid of the protein with the negatively charged amino acid in order to change the charge of the protein and change the secretion efficiency.
  • a supercharged super charge of -10 and a positive supercharge of +13 were generated from the straptavidin (SAV) wi ld type protein and similarly, the glutathione S-transferase (GST) 20 and a positive charge supercharge formed a supercharge protein with +19 charge, and the secretion of the protein was analyzed. The results are shown in FIG.
  • FIG. 16 shows the results of analysis of secretion of -10 SAV, wt SAV, + 13 SAV and -20 GST, wt GST, + 19 GST (SAV: streptoavidin I GST glutathione S-transf erase).
  • SAV (135aa) makes a tetramer and GST (215aa) makes a dimer.
  • the charge of the monomer in the gene synthesis was calculated (-10 SAV: pI 4.96 I wt SAV: pI 6.76 I + 13 SAV: pi 10.29 I -20 GST: pI 4.73 I wt GST:
  • the negative charge supercharged proteins were found in the cells and secreted well. However, it was found that the wi ld type protein and the positive charge supercharge protein were not expressed and secreted, and the negative supercharged protein secreted .
  • Glutathion S-transferase GST
  • SAv streptavidin
  • the overtoned proteins (marked with red) show a marked increase in the protein concentration ratio of supernatant to cell lil (Cel 1).
  • the positively charged proteins were detected at a very high concentration in the cells but not at the supernatant or only at a low concentration.
  • the method of overcharge using AvNAPSA is as follows. First, the aspartic acid and glutamic acid were substituted at appropriate positions by the AvNAPSA algorithm (1. Lawrence MS, Phillips KJ, Liu DR. Supercharging Proteins Can Impart Unusual Resilience. Journal of the American Chemical Society 2007; 129: 10110-10112) The resulting protein sequence was angered. Then, a DNA sequence corresponding to the corresponding protein sequence was synthesized, and the synthesized DNA sequence was inserted into a pDART plasmid to prepare a hypertonic protein.
  • extracellular proteins can be observed at a very high concentration in the cell (C) as well as extracellular (S), and the secretion is markedly enhanced.
  • C the cell
  • S extracellular
  • the secretion is markedly enhanced.
  • the MelC2 tyrosinase protein there is a slight difference in size between the protein and the natural protein that has been over-transformed due to a slight sequence difference including the His-tag.
  • the inventors of the present invention found that the proteins secreted by tyrosinase and cutinase, which were not applicable to the secretion production method, And can secrete extraordinary proteins with high efficiency.
  • telomere sequence (SEQ ID NO: 34: GGGGAGCTCGGATOTTGTCATAAAATTGA) and hlyBD-a (SEQ ID NO: 35: GGGGGATCCTTMCGCTCATGTAAACTTTCT) from the isolated genome of the Escherichia coli CFT073 strain (Genbank AE014075) containing the HlyB and HlyD genes PCR was performed using primers, and the transgene genes were transferred from the genome of each strain into pSTV plasmid (one of the derivatives of pACYC plasmid) by PCR
  • the plasmid pSTV-HlyBD was sequentially inserted with the start codon and the Kozak sequence to generate a plasmid pSTV-HlyBD.
  • TolC which forms a transporter with HlyB and HlyC, was not included separately because E. coli produced it by itself.
  • the present inventors also found that a plasmid pEcPrtDEF (Delepelaire P, Wander sman C. Protein secretion in gram-negative bacteria, the extracellular metal loprotease B from Erwinia chrysanthemi contains a C-terminal secretion of PrtD, PrtE, PrtF, Sucia C, Lazdunski A, Murgier (1986)), which expresses three genes of Pseudomonas aeruginosa ⁇ AprD, AprE, and AprF, and Escherichia coli alpha- hemolysin M. the Pseudomonas fluorescens lipase has a C-terminal secretion signal and is secreted by a three-component bacterial ABC-exporter system. Mol Microbiol 1994; 11: 1117-1126).
  • the present inventors constructed plasmids expressing one of the plasmids in which the gene of the T.PI.E protein (the original substrate of the TliDEF transporter) was inserted into the PQE184 plasmid and one of the T1SS transporters separated from the three kinds of different bacteria prepared above (that is, Escherichia (pSTV-HlyBD expressing E. coli HlyBD, pEcPrtDEF expressing Dickeya dadantii PrtDEF, pAGS8 expressing Pseudomonas aeruginosa AprDEF) was introduced into E.
  • Escherichia pSTV-HlyBD expressing E. coli HlyBD
  • pEcPrtDEF expressing Dickeya dadantii PrtDEF
  • pAGS8 expressing Pseudomonas aeruginosa AprDEF
  • Escherichia co // HlyBD + TolC Escherichia coli originally expressing the TolC protein
  • Dickeya dadantii PrtDEF and Pseudomonas aeruginosa AprDEF were successfully secreted.
  • Lt; RTI ID 0.0 > E. coli < / RTI > pACYC plasmid instead). It can be deduced from the fact that halo is not observed in the strain expressing only the ⁇ protein ( ⁇ only).
  • Escherichia co ⁇ and Dickeya dadantii Pseudomonas aeruginosa TISS proteins other than Pseudomonas fluorescens can recognize the LARD3 signal sequence of Tl iA.
  • Cutinase protein (Cut i) was transiently transfected using the AvNAPSA method to produce a cutinase protein (Cut i (-)).
  • the cutinase protein and the overtreated cutinase protein were ligated to the pLARD3 plasmid inserted with the gene of the LARD3 signal sequence immediately after the multiple restriction enzyme site (Mul t iple Cloning Si te) (Escherichia coli HlyBD + TolC, Di ckeya dadant ii PrtDEF, and Pseudomonas aeruginosa AprDEF) obtained by the method of Example 16 were added to the LARD3 signal sequence in the same manner as in Example 16, Two plasmids were simultaneously introduced into Escherichia coli cells and simultaneously expressed in the same manner as in Example 16 with the plasmids expressing them. After incubation at 37 ° C for 3 days in a culture medium for measuring the activity of a cutinase enzyme, The degree of secretion was measured by color change of the colony periphery medium, and the results are shown in FIG.
  • Example 18 Confirmation of extracellular secretion of a cutinase protein using Western blot After attaching the LARD3 signal sequence to the cutinase protein (Cuti) and the over-charged cutinase protein (Cuti (-)), the three different T1SS transporter proteins obtained by the method of Example 16 The cells were expressed in Escherichia coli and cultured in liquid. Western blot was used to detect the concentration of the corresponding protein in the cell and the cell. The results are shown in FIG.
  • the degree of secretion of over-charged acetonide is significantly higher in all three types of T1SS transporter proteins than in the case of not being overtonated.
  • the secretion could be inferred from a comparison with a control (Cut i (-) only, Cut i only) with empty plasmid instead of transporter plasmid.
  • the displayed nucleotide sequence consistency was determined by omitting a part of the nucleotide sequences that differed greatly from each other according to the normal calculation method of the algorithm, .
  • the abbreviated sequence part was less than 1 in any case, indicating that the reliability of the sequence matching calculation was very high.
  • Tl iDEF of Tl iDEF transporter and sequence identity of various T1SS ABC transporters varied from relatively high to relatively low. Sequence agreement of the three T1SS transporters AprD, PrtD, and HlyB in Examples 16, 17, 18, and 19 was 60%, 59%, and 27%, respectively.
  • T1SS transporters having a nucleic acid sequence similarity (identity) of 27% with Tl iDEF, not limited to the Pseudomonas fluorescens microorganism Tl iDEF transporter, Respectively.

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Abstract

본 발명은 목적 단백질의 전체적인 전하를 조절해 pI를 낮춘 목적단백질과 LARD3가 연결된 융합 단백질을 제조하여， 세균의 타입 1 분비 시스템 (Type 1 Secretion System, T1SS)의 ABC수송체를 이용해 목적 단백질을 효과적으로 세포 외 분비시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법을 사용해 별다른 정제과정을 거치지 않고서도 간단하고 효율적으로 단백질을 대량생산할 수 있다.

Description

【명세서】
[발명의 명칭]
재조합 단백질의 분비를 증가시키는 방법
【기술분야】
본 발명은 세균의 Type 1 Secret ion system(TlSS)을 이용하고， 목적 단백질의 세포 외 분비에서 목적 단백질의 pi 둥전점을 낮춤으로써, 리파제 ABC트랜스포터 인식 도메인 3 (Lipase ABC transporter recogni t ion domain, LARD3)와 연결된 목적 단백질의 분비를 증가시키는 방법 및 목적 단백질을 ■ 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
재조합 단백질의 대량 생산은 다양한 산업에 있어서 중요한 이슈가 되고 있다. 통상적인 재조합 단백질의 대량 생산방법은 대장균 (Escher i chia col i )과 같은 원핵세포 (prokaryot i c cel l )에서 재조합 단백질을 합성한 후， 세포를 용해하고 생화학적인 방법으로 얻은 세포 추출물을 정제하여 재조합 단백질을 대량생산하였다.
이러한 통상적인 방법에 비하여， 세포 내에서 재조합 단백질의 발현과 분비를 동시에 할 수 있는 단백질 생산 시스템의 경우， 비용이 많이 드는 추출과 정제 과정의 필요성이 감소되기에 훨씬 효율적이고 경제적인 방법이다.
임상， 산업 및 학술 분야에서 단백질 제품에 대한 수요가 증가함에 따라 미생물로부터 단백질을 효율적으로 대량 생산하는 방법이 개발되고 있다. 단백질 대량생산방법 중 일부는 미생물을 조작하여 생산된 단백질을 다시 접는 (refold) 과정과 세포에서 추출된 단백질로부터 목적 단백질을 분리하기 위해 집중적으로 단백질을 정제할 필요가 없도록 하기 위해, 미생물이 배양액에서 목적 단백질을 생산하고 세포 외로 분비하도록 한다. 미생물을 조작하여 생산하고자 하는 단백질을 배양액으로 분비하도록 하면 원하는 단백질을 미생물을 파괴하지 않고도 얻을 수 있기에， 유전자 조작 미생물을 이용한 현재 상용화된 단백질 생산 시스템과 비교하해 이러한 방법은 미생물을 파괴하지 않기 때문에 미생물의 고유 단백질들에 의한 단백질 생산품 오염을 최소화할 수 있으며， 이에 따라 정제 과정에서 소모되는 비용을 획기적으로 줄일 수 있다.
【발명의 상세한설명】
【기술적 과제】
본 발명은 세균의 Type 1 Secret ion system(TlSS)을 이용한 단백질의 분비여부를 결정하는 요소를 새로이 밝힘으로써， LARD3와 재조합된 목적 단백질의 pi 및 전체적인 전하를 조절해 목적 단백질의의 세포 외 분비를 향상시키는 방법 및 목적 단백질을 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다. 【기술적 해결방법】
본 발명자들은 단백질을 효율적으로 대량 생산하는 방법에서 더 나아가， 세균의 TlSS(Type 1 Secret ion system)를 통해 세포 외부로 분비되지 않았던 단백질까지 세포 외로 분비시킬 수 있는 새로운 단백질 분비 및 대량생산 방법을 밝혔으며， 이를 기초로 본 발명을 완성하였다. 또한， 본 발명자들은 세포 외로 분비하고자하는 목적 단백질에 리파제 ABC트랜스포터 인식 도메인 (Lipase ABC transporter recogni t ion domain; LARD3)를 결합시킨 분비용 단백질 중, 분비가 가능한 단백질과 분비되지 않는 단백질 간의 차이점을 밝히기 위한 실험을 진행하였다.
구체적으로， 대부분 식물의 표면에 살고 있는 슈도모나스 플루오레슨스는 오랫동안 인간에 의하여 소비되어 왔기 때문에 생물학적 안정성이 입증되었으며， 슈도모나스 플루오레슨스는 고농도의 세포 배양 조건에서 다양한 발효 조건을 견딜 수 있고， 많은 양의 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 또한， 슈도모나스 플루오레슨스는 자연적으로 타입 1 분비 시스템 (type I secret ion system, T1SS)부터 타입 6분비 시스템 (T6SS)까지 다수의 분비 시스템을 가지며， 특히 슈도모나스 플루오레슨스는 ATP-결합 카세트 (ATP-binding cassette , ABC) 운반체인 Tl iDEF를 통하여 내열성 리파아제 (ΤΠΑ)를 수송하는 분비 시스템 유형 1을 갖고 있다. 슈도모나스 플루오레슨스는 이러한 재조합 단백질 분비의 웅용 가능성 때문에， 몇몇 다른 재조합 단백질의 수송능력이 증명되었고 분비 신호도 연구되어왔다. 이전 P. fluorescent 이용한 단백질 대량생산 연구결과 다수의 단백질의 경우， 리파제 ABC 트랜스포터 인식 도메인 3(Lipase-ABC-transporter 3； LARD3)를 접합시켜 재조합 단백질을 제조했을 때, TliDEF 수송체를 통해 세포밖 분비가 향상됨을 확인하였다. 하지만， 일부 단백질의 경우， LARD3를 부착하더라도 세포외부로 대부분 단백질이 분비되지 않았으며, 세포질에만국한되어 존재하였다.
이에， LARD3 를 부착한 단백질이 ABC 트랜스포터에 의해 분비될 수 있는지 여부를 결정하는 기준을 밝히고， LARD3를 부착하더라도 단백질의 분비가 증가하지 않던 단백질의 ABC 트랜스포터를 통한 세포 외 분비를 가능하게 하는 방법에 관한 연구가 필요한 실정이다.
이를 위해， LARD3와 결합된 다양한 단백질 유전자를 P. fluorescens^] 도입했으며， 다양한 단백질을 배양한 각각의 배양액의 상층액과 세포 펠렛에서 각각의 해당.단백질의 농도를 분석했다. 그 결과， 단백질의 PI가 P. fluorescens 의 T1SS수송체인 TliDEF를 이용한 분비에 중요한 역할을 가짐을 확인하였으며， P. fluorescens 외의 다른 미생물들로부터 유래된 다양한 T1SS 수송체에서도 특정 PI를 갖는 단백질이 분비가 촉진됨을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.
구체적으로， 본 발명자들은 단백질에 LARD3를 편리하게 부착하기 위해 이전 연구에서 개발한 pDART플라스미드 백터를 활용했다 (Ryu, J., Lee, U. , Park, J. , Yoo, D. H. , and Ahn, J. H. (2015) A vector system for ABC transporter-mediated secretion and purification of recombinant proteins in Pseudomonas species. Appl Environ Microbiol 81, 1744-1753) . pDART 플라스미드는 in-frame LARD3 유전자가 직접 뒤따르는 다중 클로닝 부위 (MCS)를 가지며， pDART의 다중 클로닝 부위에 삽입된 유전자는 그 카복실 말단에 LARD3특부착한 채로 발현된다.
}7] LARD3 -^ Pseudomonas fluorescens Tl iDEF, Pseudomonas aeruginosa AprDEF(PaAprDEF) , Dickeya dadantii PrWEFiMPrtOEF) , 및 Escherichia coli HlyBD+TolC등의 세균의 Type 1 Secretion System(TlSS)의 ABC 수송체에 와해 인식되어, 재조합 단백질이 T1SS의 ABC 수송체에 의해 분비되도록 하는 서열이다.
또한， pDART는 클론선택을 위한 카나마이신 내성 유전자를 포함하며 , Escherichia coi P. Vi/o esce^사이 셔를 백터로 기능하기 위한 광범위 숙주 대상 복제 원점을 가지고 있고, THDEF 복합체의 유전자를 발현하는 tliD, tliE, tliF유전자를 포함하고 있다.
다음으로, 본 발명자들은 인위적으로 pi 값을 낮추고 음전하를 추가하기 위해 올리고펩타이드 (oligopeptide) 서열을 이들 단백질에 부착하였다. 이 작업을 수행하기 위해 본 발명자들은 아스파르트산 폴리펩타이드 (oligo-aspartate) 서열을 화물 단백질에 부착시키는 두 개의 플라스미드를 만들었다. 실험 후, 본 발명자들은 목적 단백질에 양전하를 띤 아미노산을 첨가했을 때의 효과를 조사하기 위해 아르기닌 폴리펩타이드를 부착시키는 플라스미드를 만들었다.
마지막으로， 본 발명자들은 이전 연구에서 개발 된 녹색 형광 단백질
(GFP)의 과전하된 (supercharged) 변종의 분비를 실험하여 단백질의 과전하된 변종이 원래 단백질과 다른 분비 양상을 나타내는지 여부를 확인했다.
타입 1 분비 시스템 (Type I secretion system, T1SS)는 세균에 존재하는 ABC transporter를사용한 폴리펩타이드 분비체계를 의미하며， Hly 및 Tol 유전자 클러스터를 사용하는 샤페론 (chaperone) 의존성 분비 시스템이다. 상기 분비과정은 HlyA 리더서열이 인식되고， 막에 HlyB가 결합함으로써 시작된다. 이 신호 서열은 ABC 트랜스포터 (transporter)에 매우 특이적이다. 구체적으로， HlyAB 복합체는 HlyD를 자극해 코일을 풀기 시작하고 TolC가 HlyD의 말단 분자 또는 신호를 인식하는 외부막에 도착한다. HlyD는 내부막으로 TolC를 끌어들이고 HlyA는 긴 -터널 단백질 채널을 통해 외부막의 바깥으로 배출된다.
세균의 T1SS는 이온， 약물， 다양한 크기 (20 내지 900 kDa)의 단백질까지 다양한 분자들을 운반한다. 분비되는 분자는 small Escherichia coli peptide col icimV(lOkDa) 부터 520kDa의 슈도모나스 플루오레슨스 (/¾«/o½w?as fluorescens) 세포 부착 단백질에 이르기까지 그 크기가 다양하다. 가장 특징이 잘 분석된 것은 RTX 독소와 리파제 (lipases)이다. Type 1 분비는 또한 cyclin β-glucans 및 polysaccharides와 같은 비-단백질성 기질의 분비에도 관여한다.
T1SS는 주로 그람음성균에 존재하며， T1SS를 갖는 세균으로는 슈도모나스속 균주， 딕케야속 균주， 또는 대장균 등을 포함하며， 더욱 바람직하게는 슈도모나스 플루오레슨스 (/¾«/0¾ /735 fluorescent , 딕케야 다단티 dadantii 또는 Erwinia chrysanthemi) , 대장균 G¾cAer/cA/a coli) , 슈도모나스
Figure imgf000007_0001
aeruginosa) 등이 있다 .
그람 음성 세균인 슈도모나스 플루오레슨스는 아세트산을 축적하지 않기 때문에 발효 조건으로 야기되는 높은 세포 농도에 내성을 지니며， 일반적으로 인간 상대로 비병원성을 띠기에 분비를 통한 단백질의 생산 기술에 적합한 후보이다. 또한 슈도모나스 플루오레슨스는 그람 -음성 저온 박테리아 (psychrotrophi c bacter ium)이며， 재조합 단백질 생산을 위한 여러 가지 우수한 특징들을 가지고 있다.
본 발명자들은 타입 I 분비 시스템 (T1SS)에 속하는 폴리펩타이드 ABC 수송체가 인식하는 신호 서열 (Signal Sequence)과 목적 단백질을 융합하여 미생물의 ABC수송체가목적 단백질을 배양액상으로 분비하도록 하는 연구를 수행하였으며， 그 결과 타입 I 분비 시스템 (T1SS)에 속하는 폴리펩타이드 ABC 수송체들이 수송 단백질의 등전점 (pi ) , 즉 pH 7에서의 전하 속성에 비례하는 재조합 단백질 분비 효율을 보인다는 사실을 밝혔다. 즉, 생산하고자 하는 목적 단백질의 pi를 낮추도록 제조한 과음전하화된 재조합 단백질의 경우, 타입 I 분비 시스템의 ABC 수송체를 이용한 분비의 효율을 높일 수 있었으며, 실험적으로 pi는 단백질의 전하량과 밀접한 관계를 가짐을 확인하였다 (도 6 참조) .
또한，본 발명은 슈도모나스 플루오레슨스의 THDEF수송체 외의 타입
1 분비 시스템에서도 과음전하화의 효과가 있음을 확인하였다. (도 19， 20， 21 참조) T1SS는 ABC 수송체를 사용한 폴리펩타이드 분비 체계를 의미하며， Tl iDEF수송체 역시 전형적인 T1SS이다.
본 발명은 Pseudomonas Ω uorescens ^뜰 외의 다른 미생물들로부터 여러가지 T1SS 수송체의 유전자를 분리했으며， 구체적으로 Pseudomonas aeruginosa Apr DEF ( PaAp/ EF )， Dickeya dadantii {Erwinia chrysan themi^\ L 부르기도 함) PrtDEF(Z¾PrtDEF) , Escherichia co// HlyBD+TolC (대장균이 본래 TolC단백질을 발현시킴)세 가지 T1SS수송체를 추가로 분리하였다. 상기 세 가지 T1SS수송체는 Pseudomonas
Figure imgf000007_0002
THDEF수송체와 각각 60 , 59 %, 27 의 염기서열 동일성을 지니고 있다. 본 실시예를 통해 LARD3신호 서열이 부착된 분비용 재조합 단백질이 상기 세 종류의 수송체를 통해 각각 분비되는 것을 확인했다 (도 19참조). 이에, 단백질 과음、전하화의 분비 증진 기술이 Pseuck onas fluorescens 미생물 THDEF 수송체에 국한되지 않고, TliDEF 와 염기서열 동일성이 27% 정도에 이르는 T1SS 수송체들에서도 광범위하게 적용될 수 있음을 확인하였다 (도 2()ᅳ 도 21， 도 22, 도 23 참조).
본 발명은 리파제 ATP 결합 카세트 (ABC) 트랜스포터 인식 도메인 (Lipase ABC transporter recognition domain, LARD)을 암호화하는 핵산서열 및 목적 단백질을 암호화하는 핵산서열이 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하며, 상기 LARD와 목적 단백질은 산성 pi 값을 가지며 세포외로 분비되는 융합 단백질로 발현되는 것인, 세균에서 목적 단백질의 발현 및 세포외 분비용 발현 백터를 제공한다.
본 발명의 일 예에 따르면， 상기 발현 백터는 세균의 T1SS의 ABC 수송체를 암호화하는 핵산서열을 추가로 포함할수 있다.
상기 용어 "목적 단백질 "은 생물학적으로 세균에서 생산하고 세포 외부로 분비시켜 대량생산하고자 하는 목적 단백질을 의미한다. 상기 목적 단백질은 그 종류를 특별히 한정하지 않으며 사이토카인, 성장호르몬 산업용 효소,면역관련 단백질，결합단백질 등일 수 있고, 예를 들어, Mannanase, MBP NKC-TliA, Eg IV, GFP, thioredoxin, phosphol ipase Al, alkaline phosphatase, EGF, TliA.MAP, Caps id, Hsp40, M37 lipase, Cutinase, Chitinase, 및 CTP-TliA 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 LARD와 목적 단백질의 pi를 7 미만의 산성 pi를 갖도록하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어， 목적 단백질에 산성 아미노산을 추가하거나， 목적 단백질로부터 염기성 아미노산을 제거하거나 다른 아미노산으로 치환하는 방법을사용할 수 있으며， 단백질 아미노산서열 중 단백질의 3차원 구조에서 외부로 돌출된 아미노산으로 단백질의 구조에 영향을 주지 않는 아미노산을 선별해 산성아미노산으로 치환하여 과전하하여 수동 과전하화 (Manual Supercharging)하거나， Average Number of Neighboring Atoms Per S i decha i n At om ( AvNAPSA ) ( 1. Lawrence MS, Phillips J, Liu DR. Supercharging Proteins Can Impart Unusual Resilience. Journal of the Amer i can Chemi cal Soci ety 2007； 129： 10110-10112. ) 알고리즘을 이용해 단백질을 과전화하는 방법을 사용할 수 있다. 단， 이 경우 단백질의 구조와 기능에 영향을 주지 않도록 재조합하는 것이 바람직하다.
상기 용어 "융합 단백질 "은 LARD를 암호화하는 염기서열과 목적 단백질을 암호화하는 염기서열이 연결되어 발현되는 단백질로서, 산성 pi값을 갖는 세포 외로 분비되는 단백질을 의미한다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 융합 단백질의 pi 값은 7미만일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 6， 더욱 바람직하게는 2 내지 5.5， 가장 바람직하게는 3.0 내지 5.5， 예를 들어 4.0 내지 5.5 일 수 있다.
상기 융합 단백질의 pi 값이 7을 초과할 경우 LARD를 부착한 단백질이라도 T1SS ABC 수송체를 통해 세포 외부로 분비되는 단백질의 양이 현저히 적으며， 대부분 세포 내부에 존재하게 된다. 상기 융합 단백질의 pi값이 1 미만인 단백질은 그 구조가 매우 불안정한 바， 상기 범위의 pi값을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따르면， 상기 T1SS의 ABC 수송체는， 통상적인 염기서열 일치도 계산법에 따라 Pseudomonas //i/oresce Tl iDEF와 염기서열이 유사한 부분에 한하여 계산했을 시 20% 이상의 염기서열 일치도 또는 동일성을 갖는 T1SS 수송체에 속하는 단백질 복합체일 수 있다 (도 23 참조) . 일 예에 따르면， 상기 20% 이상의 염기서열 동일성을 갖는 T1SS 수송체는， 예를 들어 Serratia marcescens엑 HasDEF , Bordetell a pertussis CyaBDE , Escherichia co//의 CvaBA+TolC , Caulobacter crescentus^ RsaDEF 등이 있을 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 Pseudomonas aeruginosa AprDEF(PaAprDEF) , Dickeya dadantii ^ i/^ DdPrtDEF) , 및 Escherichia coli HlyBD+To lC일 수 있으며， 더욱 바람직하게는 Pseudomonas fluoresces Tl iDEF자체일 수 있다.
상기 Tl iDEF는 ATP 결합 카세트 (ABC) , 막 융합 단백질 (membrane fus ion proteins , MFP) ,외막요소 (0MF)인 Tl iD , THE , Tl iF의 세 가지 단백질 다합체로 구성되어 있다. ABC 단백질은 선택적으로 목적 단백질의 C-말단 부분의 분비 도메인을 인식하고 ATP를 가수분해하여 목적 단백질을 분비한다. 막융합 단백질은 세포 막 ( cytopl asmi c membrane)에 박혀있고 ABC 단백질과 외막 단백질을 연결한다. 외막 단백질은 외막 (outer membrane)에 위치하고 목적 단백질이 분비되는 채널을 형성하는 대부분의 세포 간극 (periplasm)에 걸쳐있다.
슈도모나스 플루오레슨스에서 ABC 단백질， 막 형성 단백질 및 외막 단백질은 내열성 리파아제 오페론 내 tliA의 업스트림 (upstream)에 위치한 tliD, tliE, 및 tliF에 의하여 각각 코딩된다. UiA 의 Ο말단에 있는 분비 /샤페론 (secret ion/chaperone) 도메인은 리파아제 ABC 운반체 인식 도메인 (Lipase ABC transporter Recognition Domain, LARD)으로 정의되어있다. 이제까지 길이가 다른 LARD의 다섯개의 단편들이 기능적으로 비교되어왔고， 4개의 RTX(repeats-in-toxin) 모티프를 포함하고 있는 LARD3가 ABC운반체를 통한 분비에서 가장 효과적인 C-말단 신호로 확인되어 왔다. tliDEF와 LARD3 융합 단백질 컨스트럭트를 포함하는 슈도모나스 플루오레슨스는 LARD3 융합 단백질을 효율적으로 분비하고, 분비된 LARD3융합 단백질을 배양액 (culture broth)으로부터 바로 얻을 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면， 상기 발현 백터의 목적 단백질을 암호화하는 핵산서열은 산성 펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 추가되는 산성 펩타이드의 개수는 특별히 한정하지 않으나， 본 발명의 일 예에 따르면， 상기 산성 펩타이드를 이루는 아미노산의 개수는 6 내지 20, 바람직하게는 7내지 15개， 예를 들어 10개일 수 있다. 펩타이드를 이루는 아미노산의 개수가 6개 미만일 경우 융합 단백질의 pH가 층분한 산성을 나타내지 않아 타입 1분비 시스템 (type I secretion system, T1SS)을 통한 분비가 원활히 일어나지 않을 수 있다.
상기 산성 펩타이드는 아스파라트산 (aspartic acid) 및 글루탐산 (glutamic acid)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산일 수 있으며， 바람직하게는 상기 산성 펩타이드를 암호화하는 핵산서열은， 서열번호 33(Asparatic acid 10개; D10)의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 산성 펩타이드를 암호화하는 핵산서열은, 목적 단백질을 암호화하는 핵산서열의 3'-말단 또는 5'-말단에 위치하는 것일 수 있으며， 바람직하게는 3'-말단에 부착하는 것일 수 있다.
또한， 상기 백터는 링커를 암호화하는 핵산서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 링커는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 1개 내지 3개 연결된 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면， 상기 목적 단백질을 암호화하는 핵산서열은 목적 단백질에 포함된 염기성 아미노산을 1개 이상을 제거한 것일 수 있다. 상기 염기성 아미노산은 리신 ( lys ine) 또는 아르기닌 (Arginine)이다.
또 다른 본 발명의 일 예에 따르면， 상기 목적 단백질은 과전하화 (supercharge)된 목적 단백질， 바람직하게는 과음전하화 (negat ively supercharged)된 목적 단백질일 수 있다. 본 발명은 기존에 그람 음성균 세포 외로 분비되지 않던 목적 단백질의 전하 (charge)를 과음전하화함으로써 목적 단백질의 세포 외 분비를 증가시킬 수 있다.
예를 들면， 소프트웨어 렌더링을 사용해 목적 단백질들의 삼차원 구조를 육안으로 관측하고, 이를 통해 상대적으로 단백질의 외곽에 존재하며 작용기가 용매 방향으로 돌출해 있어 변화되어도 구조에 큰 영향을 주지 않는 아미노산들을 선별한 후， 상기 아미노산이 염기성 아미노산인 경우 아스파르트산과 글루탐산으로 치환하고 상기 아미노산이 산성 아미노산인 경우 라이신과 아르기닌으로 치환하는 수동 과전하화 (Manual Supercharging) 기법을 사용해 목적 단백질을 과음전하화할 수 있다. 또 다른 예시로 상기 과음전화한된 목적 단백질은 AvNAPSA(Average Neighbor Atoms per Sidechain Atom) 알고리즘을 이용해 단백질 표면을 리모델링하여 제조한 것일 수 있다. AvNAPSA의 프로토콜은 알려져 있으며 (W02007/ 143574 A1) , 구체적으로 상기 알고리즘은 단백질의 각 아미노산들이 해당 단백질의 다른 원자들과 얼마나 가까운지 정도를 수치화하여 보여주는 알고리즘이다. 본 발명자들은 아래 실험예에 나타난 바와 같이, AvNAPSA 점수가 100점 이하인 아미노산들 (즉 상대적으로 단백질의 외곽에 존재하며， 작용기가 용매 방향으로 돌출해 있어 변화되어도 구조에 큰 영향을 주지 않는 아미노산)을 공개된 프로토콜에 따라 일괄적으로 아스파르트산과 글루탐산으로 교체한 단백질 (과음전하화 (negat ively supercharged)된 단백질)서열을 얻었으며， 해당 단백질 서열에 대웅되는 DNA서열을 합성하고 합성된 DNA서열을 pDART플라스미드에 넣어 분비용 단백질을 발현시켰다.그 결과， 과음전하화되지 않은 단백질과 비교해 과음전하화한 단백질의 세포 외 분비의 효율이 상당히 증가됨을 확인했다.
본 발명의 일 예에 따르면， 상기 리파제 ABC 트랜스포터 인식 도메인은 LARD 1 , LARD 2 , 또는 LARD 3 일 수 있다. 상기 LARD는 슈도모나스 플로오레슨스의 내열성 리파아제 오페론 내 t l iA의 C-말단에 있는 분비 /샤페론 ( secret i on/chaperon)도메인을 의미할 수 있다. 구체적으로, LARD펩타이드는 그 서열에 따라 LARD 1내지 LARD 5펩타이드로 나뉘어질 수 있는데 본 발명에서 사용하는 LARD는 LARD 3일 수 있으며， 바람직하게는 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 LARD-3 펩타이드 일 수 있다.
LARD ¾타이드는 기능적으로 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 정제를 수행할 수 있는 정제 서열을 포함하고 있으며， 이 정제서열은 VLSFGADSVTLVGVGLG WSEGVLIS (서열번호 29)로서， 본 발명자들의 이전 등록특허 K 10-1677090 에서 밝힌바 있다. 상기 정제서열을 포함하는 단백질은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 용이하게 정제될 수 있다. 따라서, 상기 정제서열을 포함하고 있는 LARD 3 펩타이드는 목적 단백질의 정제 용도로사용될 수 있다.
또한， LARD 펩타이드는 기능적으로 세포 내에서 세포 외로 분비를 유도하는 신호서열도 포함하고 있으며， 이 분비 신호서열은 GSDGNDLIQGGKGADFIEGGKGNDTIRDNSGHNTFLFSGHF^D^ 30)로서， 이 역시 본 발명자들의 이전 등록특허 R10-1677090 에서 밝힌 바 있다. 상기 분비 신호서열을 포함하는 단백질은 세포 내에서 세포 외로의 분비가 이루어 질 수 있다. LARD 중에서도 LARD 1 내지 LARD 3 펩타이드는 본 발명의 분비 신호서열 및 정제서열을 모두 포함하고 있으므로， 목적 단백질의 세포 내에서 세포 외로의 분비 및 정제의 용도로 사용될 수 있다. 바람직하게는 분비 신호 서열은 LARD 3 펩타이드 (서열번호 22) 를 사용할 수 있다.
상기 LARD를 암호화하는 염기서열은 재조합 목적 단백질을 암호화하는 염기서열의 3 ' -말단에 위치하는 것으로서， 재조합 목적 단백질의 C-말단에 융합된 단백질을 암호화하는 형태일 수 있다. 상기 재조합 목적 단백질의 C-말단에 융합되는 경우， 세포 외 분비에 의해 가수분해되는 N-말단의 신호 서열과 대조적으로， C-말단 신호 서열은 가수분해되지 않는 장점을 가질 수 있다.
[표 1]
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본 발명의 구체적 일 예에 따르면， 상술한 발현 백터를 포함하는 세포를 제공한다.
구체적으로, 상기 세포에 포함된 발현 백터는 재조합 목적 단백질을 암호화하는 핵산서열， 및 리파제 ABC 트랜스포터 인식 도메인 (LARD)을 암호화하는 핵산서열이 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하며， 산성 pi 값을 갖는 분비용 단백질을 발현함을 특징으로 하는， 세균에서 목적 단백질을 발현하고 분비하기 위한 발현 백터일 수 있다. 상기 세포는 추가로 세균의 T1SS의 ABC 수송체를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 발현 백터를 포함할수 있다.
상기 세포는 그람음성균일 수 있으며， 예를 들어， 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 균주， 딕케야 ( ·α Φ 균주， ^ ^균 Escherichia)속 균주, 크산토모나스 (Xanthomonas) 속 균주 또는 버크홀데리아 (Burkholder i a) 속 균주일 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에서 목적 단백질의 세포 외 분비는 ABC수송체의 기능에 의해서 이루어지는데 ABC수송체는 이중막이 있는 그람음성균에서 작동하기 때문에， 그람음성균에 해당하는 경우 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
상기 슈도모나스 속 균주는， 슈도모나스 속에 해당하는 균주라면 모두 포함될 수 있으나， 예를 들어， 슈도모나스 플루오레슨스， 슈도모나스 프라기, 슈도모나스 푸티다， 슈도모나스 시린게 또는 슈도모나스 에루기노사일 수 있으며， 바람직하게는 슈도모나스 플루오레슨스ᅳ 슈도모나스 에루기노사일 수 있다.
상기 세포가 슈도모나스 플루오레슨스일 경우， 슈도모나스 플루오레슨스에 도입된 목적 단백질들은 ΤΠΑ의 C-말단 신호전달부위에 결합하여 융합단백질 형태로 세포외부로 분비될 수 있는데, 슈도모나스 플루오레슨스의 내재적 리파아제 및 프로테아제 또한 ABC 운반체의 매개로 세포외부로 분비된다. 그에 따라， 야생형 슈도모나스 플루오레슨스， 또는 완전한 리파아제 또는 프로테아제를 생산하는 균주를 아용하여 목적 단백질을 발현하는 경우， 상기 목적 단백질이 세포외부로 분비되더라도 리파아제 및 프로테아제가 불순물로 흔입되어 이후 정제공정을 복잡하게 할 뿐 아니라， 프로테아제는 생산된 목적 단백질을 가수분해하게 되는 문제점이 있다.
따라서， 상기 슈도모나스속 균주는 슈도모나스 플루오레슨스의 리파아제 유전자 / ) 및 프로테아제 유전자 ?r )로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 일부 영역이 결실되며， 상기 유전자의 일부 결실은 유전자의 적어도 하나의 말단에 적어도 100bp 이상 크기의 단편을 남기도록 유전자 영역을 결실시킨 것이며， 기능적 리파아제 및 기능적 프로테아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기능적 단백질을 생성하지 않는 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주일 수 있다. 상기 변이 균주의 예로는 리파아제 단독 결실 (변이 균주 ^ UiA , 프로테아제 단독 결실 (변이 균주 Δ ΡΓ ) 및 리파아제 /프로테아제 이중 결실 변이 균주 (변이 균주 Δ / ^ AprtA)일 수 있다. 이들 변이균주에 관한 내용은 한국특허공개 10-2014-0041159에 상세히 기술되어 있다.
상기 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주가 기능적 프로테아제 단백질을 생성하지 않는 것은， 프로테아제 유전자의 전부 또는 일부 결실, 또는 프로테아제 저해제 유전자 ( inh)의 전부 또는 일부 결실에 의해 이루어진 것일 수 있다.
상기 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주는 예를 들어， 기탁번호 KCTC 12276BP, KCTC 12277BP, 또는 KCTC12278BP을 갖는 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적 일 예에 따르면, 본 발명은 상기 상술한 백터로 형질전환된 세포를 제조하는 단계， 상기 세포를 배양하여 분비용 단백질을 생산하는 단계, 및 상기 생산된 분비용 단백질을 분리 또는 정제하는 단계를 포함하는, 세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 세포는 추가로 세균의 T1SS의 ABC 수송체를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 발현 백터를 포함할수 있다.
상기 세포는 그람음성균일 수 있으며, 상기 세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법에서， 상기 발현 백터로 형질전환된 그람음성균 세포를 제조하는 방법은 통상의 유전자 도입방법을 사용할 수 있으며， 예를 들면 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 백터에 도입한 재조합 백터를 그람음성균 내부로 도입하거나， 도입된 백터에 삽입된 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 게놈 내부로 상동 재조합에 의해 게놈내로 삽입될 수 있다.
상기 백터는 플라스미드 백터， 코스미드 백터， 박테리오파지 백터 및 바이러스 백터 등을 포함한 통상의 모든 백터를 포함하며， 특별히 이에 한정되지는 않는다. 상기 그람음성균으로의 백터 도입은 전기층격 유전자 전달법 (electroporat ion) , 인산칼슘 (CaP04) 침전， 염화칼슴 (CaCl2) 침전， PEG, 텍스트란 설페이트， 리포펙타민 등의 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 상기 세포의 배양에 있어서, 배지성분, 배양은도 및 배양시간 등의 조건은 적절히 조절될 수 있으며， 구체적으로 배양 배지는 탄소원, 질소원， 미량원소 성분 등과 같은 미생물의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 포함할 수 있다. 또한 배지의 pH를 적절히 조정할 수 있고， 항생제 등의 성분을 포함할수 있다. 또한， 유도제 ( inducer)를 처리하여 단백질의 발현을 유도할수 있으몌 처리되는 유도제의 종류는 백터 시스템에 따라 결정될 수 있으며, 유도제 투여시간 및 투여량 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 야생형 균주 및 변이주 Δ / 에서 목적 단백질을 효과적으로 발현하기 위해서는 2x LB 배지를 사용하여야 하지만， 변이주 Δ/ 및 변이주 Δ / 4 Δ " 에서 LB 배지를 사용할 수 있어 배지 농도를 완화할 수 있다. 또한, 상기 변이주 Δ /^Δ ^는 세포 외에서 ΤΠΑ의 방해가 없고 PrtA 가수분해로부터 보호되는 목적 단백질을 생산하며， 리파아제 또는 프로테아제 -유래 신호서열과 ABC 운반체와 경쟁을 하지 않고， LB 배지를 사용할 수 있는 장점이 있어， 외래 단잭질의 생산, 분비 및 정제를 간편하게 할 수 있고 단백질 생산량을 더 높일 수 있으므로 목적 단백질 대량 생산에 유용하게 사용할수 있다.
상기 목적 단백질은 정제 서열을 포함하는 LARD를 이용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 것을 제외하고는 통상의 방법으로 회수 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 원심분리 방법으로 회수한 세포를， 프렌치 프레스， 초음파 파쇄기 둥을 이용하여 파쇄할 수 있다. 배양액으로 단백질이 분비되는 경우에는 배양 상등액을 수집할 수 있다. 과발현에 의해 웅집되는 경우， 적절한 용액에서 단백질을 용해시키고 및 변성시키고 재폴딩시켜서 얻을 수 있다. 글루타티온， 디티오트레이를， β -머캅토에탄올， 시스틴 및 시스타민의 산화 및 환원 시스템을 사용하고 요소， 구아니딘， 아르기닌 등의 재폴딩제 등을 이용할 수도 있으며, 재폴딩제와 함께 염의 일부를사용할수 있다.
일예로， 상기 그람 음성균에서 목적 단백질을 생산하는 방법에서， 목적 단백질을 분리 또는 정제하는 단계 이후에， Factor Xa 혹은 Tobacco Etch Virus (TEV) protease, Enterokinase(EK) 등의 단백질 분해효소 인식부위를 삽입하여 상기 목적 단백질에 결합된 산성 펩타이드와 LARD를 절단하는 단계를 추가로 포함할수 있다.
본 발명의 일 예로 목적 단백질의 정제는 소수성 상호작용 이용할 수 있다. 이때 본 발명의 정제 서열은 정제 태그로사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 알킬 세파로스를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피법이며, 상기 알킬기는 메틸， 에틸， 프로필 또는 부틸기일 수 있다. 바람직하게， 상기 알킬기는 메틸기 일 수 있다. 알킬기로 메틸기를 사용하는 경우 다른 알킬기를 사용하는 경우에 비하여 정제 서열을 포함하는 단백질을 우수하게 정제할 수 있다.
일반적으로， 컬럼을 이용한 단백질의 정제에 있어서는 His-tag을 이용한 정제를 많이 수행하는테， His-tag 정제를 위한 컬럼 (column)은 고가일 뿐만 아니라， 대용량을 정제를 수행하기 위해서는 부적합한 면이 있다. 또한 NTA 컬럼을 많이 사용하는데， 재사용하다 보면 Ni2+ 흑은 NTA가 떨어져 나와 반복적인 사용에 제한이 발생하는 문제점이 있다. 이에 반해， 소수성 상호작용 크로마토그래피에 사용되는 소수성 컬럼 (hydrophobic column)은 저가의 컬럼으로 경제성이 높고 대용량 분리에 사용하기에 적합하며， 재사용율이 높은 장점이 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는， 상기 상술한 본 발명의 백터를 세포에 삽입하는 단계를 포함하는 그람 음성균에서 분비용 단백질의 세포 외 분비를 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 세포는 추가로 세균의 Type 1 Secret ion System(TlSS)의 ABC 수송체를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 발현 백터를 포함할수 있다. 본 발명자들은 세균의 Type 1 Secret ion System(TlSS)의 ABC수송체를 통한 목적 단백질의 분비율은 음전하로 하전된 목적 단백질에서 상승하며， 이에 단백질의 pi와 TISS ABC 수송체에 의한 분비가능 여부 사이에는 질적 상관관계가 있음을 확인하였다.
즉， 강한산성 pi 및 강한 음전하를 띠는 단백질은 TISS ABC수송체에 의해 분비된 반면， 음전하가 적고 pi가높은 단백질은 거의 분비되지 않았다. 일 예로 유전자들이 pFDIO에 도입되었을 때 일부 단백질은 분비가 증가되었으몌 pBDIO의 경우， 발현 감소 없이 분비가 증가하였다.
본 발명에서 하기 실시예 및 실험예에서 수행한 pFDIO, pBDIO실험 및 과전하화된 단백질의 분비 패턴 비교의 결과를 종합하여 보았을 때， 결국 보다 많은 음전하를 운반하도록 조작된 단백질의 분비 효율이 증가되었음을 확인하였다. 이는 세포질과 세포 외 공간 사이의 전위 에너지 장벽을 극복하는데 필요한 에너지를 감소시키기 때문이다.
일반적으로 그람 음성 박테리아는 내막의 막전위를 약 150 mV 정도로 유지하며 세포질 측은 막간공간 (per ipl asm)보다 더 음으로 대전된다. 이 분극된 전하 분포는 막을 가로지르는 능동적 양성자 수송을 포함하여 다양한 세포 메커니즘에 의해 유지된다. 외막의 전위 역시 음의 값을 가지며， 막간공간 (per ipl asm)은 그곳에 분포하는 음으로 하전된 막 유래 올리고당으로 인해 세포 외 공간보다 더 음으로 대전된다. 그러나 외부 막의 다소 구멍이 많은 특성으로 인해 외막의 막전하는 그 크기가 상대적으로 작아서 일반적으로 30mV 미만이다.
이러한 모든 사실을 고려할 때， 음으로 하전된 단백질을 분비하는 것이 에너지적인 면에서 보았을 때 일반적으로 유리하며， 이는 분비 반웅의 평형에 영향을 미친다. 막전위는 생화학적 수준에서 매우 강력하며 ABC 수송체를 통해 수송되는 동안의 자유에너지의 변화에 증요한 영향을 미친다. -150mV 전위를 띤 내막을 가로 질러 폴리펩타이드를 이동시키는 것은 폴리펩타이드가 운반하는 전하 당 약 3.5 kcal /irol의 에너지를 필요로 한다. 일정한 압력, 온도 및 농도에서의 계산은 아래와 같다.
w = -nFV = 14.47 n kJ/mo l = 3.5 n kcal /mo l
여기서 n은 폴리펩타이드의 총 전하이고， F는 패러데이 상수이다. 총 전하가 +10인 단백질 (N = +10)을 분비시키는 상황에서는 w = 35 kcal /m 이며 분비는 그만큼 더 불리해진다. 생체의 농도 하에서 ATP 가수분해의 자유 에너지 변화 (ᅀ G)의 일반적인 값은 11.4 kcal /n l이다. ABC 수송체의 메커니즘에 관해 제안된 모델은 ABC 단백질이 ATP 가수 분해와 결합된 "내향'' 형태와 "외향'' 형태 간의 연속적인 전환을 통해 작용한다고 분석한다. 이 모델에 따르면， ABC 수송체의 주요 동력원 중 하나는 이 과정에서 일어나는 "구동 타격 (power stroke) "의 힘이다. 음전하를 띤 막전위는 대전된 폴리펩타이드에 정전기력을 가해 이 구동 타격에 의해 가해지는 힘을 상쇄시키거나 심지어는 역전해버려 궁극적으로 분비 평형에 영향을 준다.
이 "막전위" 가설은 다양한 분비 유형에 걸친 많은 이전 연구에 의해 뒷받침되었다. E. col i지질단백질 ( l ipoprotein)에 돌연변이를 유발하는 양의 전하를 추가하는 변이가 원핵 생물 및 진핵 생물 모두에서 막 근처의 단백질 접힘을 방해함으로써 분비를 감소하는 것으로 보고었으며， 또한 E. col i autotransporter (유형 Va 수송 시스템)의 승객 도메인의 순 음전하를 중화 또는 역전시킬 시, 마찬가지로 안쪽이 더 음전하를 띠는 외막을 통과하는 과정이 중단됨이 밝혀졌다.
T1SS 수송체의 일 예 중 Tl iDEF의 경우, 고려해야 할 다른 요소는 Tl iD의 하전 상태다. Tl iD는 Tl iDEF 운반체의 내막 부분의 구성 요소인 ABC 단백질이다. 이 단백질은 짧은 도메인 간 서열에 의해 연결된 뉴클레오타이드 결합 도메인 (NBD) 및 막 횡단 도메인 (TMD)을 가지고 있다. 특히, Tl iD ABC 단백질이 특히 TMD (pi 9.43)와 도메인 간 서열 (pi 8.14) 주위에서 이론적인 pi가 매우 높다.
이어서 진행한 Tl iD의 상동성 기반 구조 예측 모델에서 이 단백질의 이합체 (dimer)는 그 통로 내부 면에 양전하 분포를 갖는 것으로 나타났다 (도 9A 및 B) . 이 예측 모델은 서열 동일성이 40.98%에 달하는 Aqui fex aeol icus PrtD (PDB ID 5122)를 주형으로 하여 제작되었다. 또한， Tl iD에 ConSurf 동족체 보존성 분석은 채널의 중간 부분에 있는 이 양전하 분포가 실제로 진화적으로 보존된 것임을 보여주었다 (도 9C 및 D, 노란색 동그라미) . 또한， Tl iD의 기질 진입 입구를 형성하는 꺾인 알파나선에는， 입구의 구멍 쪽으로 튀어나와 Tl iD의 ADP 결합 상태에서 기질 진입 입구를 차단하는 양으로 대전된 잔기가 있으며， ConSurf 결과에서 볼 때 역시 50개의 모든 동족체에서 이 위치에 아르기닌 또는 라이신이 있었기에 이 잔기의 양전하가 보존됨을 확인할 수 있었다 (그림 9C, 검은 화살표) . 본 발명자들은 이 양전하를 띤 통로의 내부 표면이 단백질 수송 중에 화물 단백질의 음전하 잔기와 상호작용하여 분비를 촉진하는 것으로 추정한다 (도 9E) . '
또한, 채널의 내부 표면 및 기질 진입 입구 상의 양전하는 (아르기닌 폴리펩타이드 부착한 하기 실험의 결과로부터 알 수 있는 것과 같이) 폴리펩타이드의 양전하 섹션을 밀어내어 통로로 들어가는 것을 막고 궁극적으로 분비'되는 것을 차단할 수 있다. 여기에서 본 발명자들은 단백질이 수송 과정에서 (최소한 부분적으로라도) 접힘 ( folding) 상태가 풀린다고 가정했으며， 이는 E. coli TolC (PDB ID의 ltqq)와 매우 유사한 구조를 가질 것으로 예상되는 Tl iF의 구멍이 19.8 A의 평균 내부 직경을 가지기 때문이다. 이는 분명히 24A의 GFP 배럴을 포함한 대부분의 구형 단백질의 평균 직경인 20-30 A보다 작다. Tl iF는 비교적 단단한 β -배럴 형태의 막 관통 구조를 가지고 있어서 수송 중에 구멍이 확대되는 일이 거의 불가능하다고 추정된다.
또 다른 T1SS의 ABC 수송체들도 마찬가지로 이들의 ABC 단ᅳ백질들이 양전하를 띠는 TMD를 가지고 있다. E. coli haemolys in 수송 복합체인 HlyB-HlyD-TolC도 Tl iD의 상동체인 ABC 단백질 HlyB의 TMD에 있어 상당한 양전하 분포를 갖고있다. Dickeya dadantii PrtD도 마찬가지다. 이 사실은 TISS ABC수송체 분비 기전의 전하 의존성을 강력하게 뒷받침한다.
결론적으로， 본 발명자들은 고도로 산성인 단백질만이 ABC 수송체를 통해 수송 될 수 있으며， 염기성이거나 약한 산성인 단백질은 ABC 운반체를 통해 분비될 수 없음을 새로이 밝혔으며， 목적 단백질에 아스파르트산 폴리펩타이드를 부착하거나 음전하로 과전하함으로써 pi를 인위적으로 낮춤으로써 세포 외부로의 목적단백질의 분비를 향상시키는 방법을 제공한다. 또한， 간단한 pi확인을 통해 ABC수송체가 관심 단백질을 분비 할 수 있는지 여부를 확인하는 방법을 제공할 수 있으며， 궁극적으로 ABC 전달체 의존성 분비를 통해 효율적으로 생산 가능한 단백질 종류의 범위를 해당 단백질의 과전하를 통해 넓힐 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명은 산성 pi값을 갖는 분비용 단백질을 제조하여， 세균의 Type
1 Secret ion System(TlSS)의 ABC 수송체를 통해 목적 단백질을 효과적으로 세포 외로 분비시키는 방법을 제공한다. 상기 방법을 사용해 별다른 정제과정을 거치지 않고서도 간단하고 효율적으로 단백질을 대량생산할 수 있다.
【도면의 간단한설명】 도 la 및 도 lb는 실시예 6에 따라 선택된 단백질의 분비를 확인한 것으로, 목적 단백질의 발현 및 분비를 보여주는 웨스턴 블롯 이미지를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 실시예 6에 따라 목적 단백질의 분비율 및 그들의 등전점 사이의 상관 관계를 나타낸다. 목적 단백질의 pi값은 부착된 LARD3을 포함하는 서열로부터 계산하였다.
도 3a및 도 3b는 실시예 7에 따라 P. V resce/^발현과 분비 시스템 내에서 ol igo-aspart ic acid서열의 최적 길이를 결정하기 위해, Lunasin과 ol igo-aspart ic acid 꼬리의 길이가 서로다른 Lunasin의 유도체를 LARD3 부착을 경유해 발현하고 분비를 확인한 결과이다.
도 4는 실시예 8에 따라 본 발명에 사용한 플라스미드의 구조를 나타내며， MCS를 포함하는 pDART플라스미드의 구조를 나타낸다. t l iD, t l iE, t l iF 및 LARD3가 융합된 단백질은 단일 오페론으로 제어된다. (A)의 경우， MCS바로 뒤에 LARD3유전자가 있기 때문에， 삽입된 목적 유전자는 C-말단에 붙어있는 LARD3와 함께 발현된다. (B) N-말단에 D10 서열이 부착되어 있는 플라스미드인 pFDIO의 구조를 나타낸다. D10 유전자는 개시코돈에 직접 뒤따르며 MCS와 LARD3의 바로 이전에 위치한다. (C) C 말단에 위치하지만 LA D3 이전에 D10 서열을 부착시키는 pBDIO플라스미드의 구조를 나타낸다. D10 유전자는 MCS와 LARD3사이에 위치한다.
도 5는 실시예 9에 따라 NKC와 CTP 서열이 각각 부착된 Tl iA 라이페이스 두 종류 (NKC-Tl iA, CTP-ΤΠΑ)의 N-말단부 (FD10)와 C-말단부 (BD10)에 아스파르트산 10개 (D10)를 추가하여 pDART 플라스미드를 통해 발현시킨 이후 웨스턴 블롯 및 라이페이스 활성도를 측정배지로 검출한 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예 10에 따라 초록 형광 단백질 (GFP) , 만나네이즈 (Mannanase) , 말토스 결합 단백질 (MBP)ᅳ 싸이오레독신 (Thioredoxin)의 N-말단부 (FD10)와 C-말단부 (BD10)에 아스파르트산 10개 (D10)를 추가하여 pDART플라스미드를 통해 발현시킨 이후 웨스턴 블롯으로 검출한 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 11에 따라 ΤΠΑ 라이페이스와 초록 형광 단백질 (GFP)의 C-말단부에 각각 아스파르트산 10개 (D10) 또는 아르기닌 10개 (R10)를 추가한 뒤 웨스턴 블롯과 라이페이스 활성 배지로 검출한 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 12에 따라 AvNAPSA 방식으로 과전하화 (Super charging)시킨 초록 형광 단백질 (GFP)를 pDART에 넣어 발현시키고 웨스턴 블롯으로 검출한 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 5에 따라 Tl iDEF 복합체의 ABC 단백질인 Tl iD 구조의 전하 분포를 나타낸다. 도 9의 A, B, C에서 원형으로 표시된 부분은 양전하를 띠는 부분을 나타내며， 도 9의 D에 원형으로 표시된 부분은 수송체 내부 공동을 나타낸 것이며， 원형 내부의 흰색 화살표는 상대적으로 음전하를 띠는 원자를， 검은색 화살표는 상대적으로 양전하를 띠는 원자를 표시한 것이다.
도 10은 실시예 9에 따라 Tl iA, CTP-Tl iA 및 NKC-Tl iA의 분비 비교를 나타내며, 도 10a는 Tl iA, CTP-Tl iA 및 ΝΚΟΤΠΑ의 효소 플레이트 분석결과이고， 도 10b는 ΤΠΑ, CTP-Tl iA, NKC-Tl iA의 웨스턴 블랏결과를 나타낸다.
도 11은 실시예 5에 따라 pH 7.0에서 단백질 pi와 전하의 관계를 나타낸다.
도 12는 실시예 5에 따라 Tl iD의 구조 예측 결과를 나타낸다.
도 13은 실시예 5에 따라 모델화된 Tl iD의 막 횡단 나선 (transmembrane hel ices)의 예측 결과를 나타낸다. 사각형 상자 부분이 서버를 통해 예측된 막 통과부분에 해당한다.
도 14는 실시예 5에 따라 모델링된 Tl iD의 ConSurf 상동체 보존 분석 결과를 나타낸다. 진한 검은색으로 표시된 부분은 보존이 잘된 부분이며， 색상이 열어질수록 보존이 덜 된 부분이다.
도 15는 실시예 13에 따라 pDAR-Tl iA, -NKC (-)， NKC-L1, -NKC-L2 , NKC-L3, -NKC-Tl iA에서 단백질 분비를 나타낸다. (A) ΤΠΑ의 웨스턴 블랏. (B) 다른 plasmids에서 ΤΠΑ의 효소 플레이트 분석결과를 보여준다.
도 16은 실시예 14에 따라 0SAV, wtSAV, + 13SAV및 2-10GST, wtGST, + 19GST의 분비 여부의 분석결과를 나타낸다 (SAV: streptoavidin I GST: glutathione S-transf erase) .
도 17은 실시예 14에 따라 AvNAPSA( Aver age Number of Neighbor ing Atoms Per Sidechain Atom) 방식을 사용하지 않고 임의로 구조를 보면서 돌출된 아미노산을 아스파르트산 또는 아르기닌으로 교체하여 과전하화시킨 글루타싸이온 S-전달효소 (GST)과 스트렙타비딘 (SAv)를 pDART에 넣어 발현시키고 웨스턴 블롯으로 검출한 결과를 나타낸다.
도 18은 실시예 15에 따라 MelC2 타이로시네이즈, 큐티네이즈 (Cut i ) , 키티네이즈 (Chi ) ,그리고 M37라이페이스를 AvNAPSA방법으로 과음전하화시킨 뒤， 과음전하화가 된 단백질 (붉은색)과 그에 대웅되는 과전하화가 되지 않은 자연 단백질 (검은색)을 각각 pDART 플라스미드에 넣어 발현시키고 웨스턴 블롯으로 검출한 결과를 나타낸다.
도 19는 실시예 16에 따라 ΤΠΑ 단백질 (Tl iDEF 수송체의 본래 기질)과 세 종류의 서로 다른 세균으로부터 분리된 T1SS 수송체들을 대장균에서 동시 발현시킨뒤 효소 활성 측정 배지에서 단백질 분비 정도를 콜로니 주변부 배지의 색변화를 통해 측정한 실험 결과를 나타낸다.
도 20은 실시예 17에 따라 큐티네이즈 (Cut inase) 단백질 (Cut i )과 과음전하화된 큐티네이즈 단백질 (Cut i (-) )에 LARD3 신호 서열을 단 뒤， 세 종류의 서로 다른 T1SS 수송체 단백질들과 함께 대장균에서 발현시켜 효소 활성 측정 배지에서 분비 정도를 콜로니 주변부 배지의 색변화를 통해 측정한 실험결과를 나타낸다.
도 21은 실시예 18에 따라 큐티네이즈 단백질 (Cut inase, Cut i )과 과음전하화된 큐티네이즈 단백질 (Cut i (— ) )에 LARD3 신호 서열을 부착한 후， 세 종류의 서로 다른 T1SS 수송체 단백질들과 함께 대장균에서 발현시켜 액체배양한 뒤 웨스턴 블롯으로 세포 안 및 세포 밖의 해당 단백질 농도를 검출한실험 결과를 나타낸다.
도 22는 실시예 19에 따라 M37라이페이스 단백질 (m37 Lipase, M37)과 과음전하화된 M37 라이페이스 단백질 (M37(-) )에 LARD3 신호 서열을 부착한 뒤, 세 종류의 서로 다른 T1SS수송체 단백질들과 함께 대장균에서 발현시켜 액체배양한 후 웨스턴 블롯으로 세포 안 및 세포 밖의 해당 단백질 농도를 검출한 실험 결과를 나타낸다. 도 23은 TliDEF 수송체와 다양한 T1SS 수송체들간의 염기서열 일치도 (Sequence Identity) 및 전체 염기서열에서 서열 유사 부분이 차지하는 비중을 나타낸다. - 【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 박테리아균주 및 성장배지
플라스미드 제작 및 유전자 클로닝은 E. col/ XL1-BLUE에서 수행하였다. 단백질 발현 및 분비는 P. /i/o e5ce^ SI -WKSon, M. , Moon, Υ. , Oh, Μ. J.， Han, S. B. , Park, K. H.， Kim, J. G. , and Ahn, J. H. (2012) Lipase and protease double-deletion mutant of Pseudomonas f luorescens suitable for extracellular protein production. Appl Environ Microbiol 78, 8454ᅳ 8462)의 이중 유전자 삭제 유도체 (double-delet ion derivative)인 Δ tliA ^prtA 균주에서 관찰되었다. 미생물들은 30yg/mL의 카나마이신 (kanamycin)을 포함하고 있는 LB배지 ( lysogeny broth)에서 배양하였다. 리파아제 활성을 갖는 목적 유전자들 (TliA, N C-THA, CTP-TliA)에 대한 효소 플레이트 어세이 (enzyme plate assay)는 믹서기로 흔합된 0.5% 콜로이드성 글리세릴 트라이뷰틸레이트 (glyceryl tributylate)를 함유하는 LB 한천 배지로 제조하였다. E.coli^ P. fluorescent 각각 37 °C 와 25 °C에서 배양하였다. 의 형질 전환은 표준 열 쇼크 (heat-shock) 방법을 따라 수행했으며 , P. fluorescent 전기 천공 호환성 (electrocompetent) 세포를 만들어 표준 전기 천공 (electroporation) 프로토콜을 사용하였고， 2.5 kV의 125 Ω, 50 에서 (Ausubel, M. F. (2014) Escherichia coli, Plasmids, and Bacteri phages, in Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons, Inc. pp) 전기 천공으로 변환하였다. 형질 전환된 P. f luorescens는 60 //g/mL의 카나마이신을 함유한 LB 액체 배지 5 를 포함하는 시험관에서 정지기 (stationary phase)에 도달할 때까지 25 °C 180 rpm의 진탕 배양기에서 배양하였다. 위의 조건에서 형질 전환된 세포를 액체 LB에 파종하거나 또는 고체 플레이트 활성 어세이에 스트리킹 (streaking)함으로써 목표 단백질들의 발현 및 분비 모두에 대해 분석하였다.
[실시예 2] 플라스미드 백터 제작
플라스미드 pDART는 본 발명자들의 이전에 다른 단백질들의 분비 생산에 사용했던 플라스미드를 사용하였다 (Ryu, J., Lee, U.， Park, J., Yoo, D. H. , and Ahn, J. H. (2015) A vector system for ABC transporter一 mediated secretion and purification of recombinant proteins in Pseudomonas species . Appl Environ Microbiol 81， 1744-1753). 플라스미드 백터 pFDIO 및 pBDIO은 상기 pDART의 MCS의 상류 또는 하류 위치에 목적 단백질에 10 개의 아스파르트산 코돈을 부가하여 제조한， pDART의 유도체이다. 열 개 아스파르트산의 DNA서열은 합성된 67yc//je z?a lunasin유전자 (Galvez, A. F. Chen, N. , Macasieb, J . , and de Lumen , B. 0. (2001) Chemopr event ive Property of a Soybean Peptide (Lunasin) That Binds to Deacetylated Hi stones and Inhibits Acetylation. Cancer Research 61, 7473-7478)를 주형으로서 사용하여 PCR을 통해 증폭하였다. pFDIO 및 pBDIO에 대해 각각 2개의 상이한 PCR 산물을 수득하였으며， 이 때， 각각 하나 또는 두 개의 임의의 염기가 프라이머의 상류 또는 하류에 삽입되어 번역 프레임을 유지시켰기에 pFDIO-과 pBDIO-에 삽입된 단백질 간에 약간의 크기 및 pi 차이가 존재한다. 이후 In-Fusion 클로닝 키트 (Clontech In-Fusion HD cloning lus CE)를 사용해 pDART에 PCR산물을 재조합하여 pFDIO 및 pBDIO을 제작하였다. pDART를 선형화하기 위해서， Xbal (pFDIO 구조) 또는 Sacl (pBDIO)로 소화시켰다. 이어서， 선형화된 pDART와 상웅하는 PCR 산물을 In-Fusion 3'-5'엑소데옥시리보뉴클레이스 (exodeoxyribonuclease)로 분해하고
In-Fusion 키트의 표준 프로토콜에 따라 재조합시켰다. 이들 DNA 단편과 상보적인 ~15 염기 5' 돌출부를 연결하여 목적 유전자 삽입이 가능한 pFDIO 및 pBDIO 플라스미드를 완성하였다. pDART, pFDIO 및 pBDIO의 MCS 근처의 서열은 표 2에 명시되어 있다.
하기 표 2에서 밑줄로 표시한 아미노산 서열은 LARD3 신호서열을 나타내며， 굵은 글씨로 효시한 "IEGR"은 목적 단백질과 LARD3 신호 서열을 연결하는 잔기로 Factor Xa가 인식해 절단하는 부분이다. 목적 단백질은 Hi s-tag과 같은 정제 tag에 의하여 Factor Xa 및 LARD3로부터 추가로 정제될 수 있다.
하기 표 2의 염기서열의 각 부분에 관한 설명은 도 19a 내지 도 19g에 개시하였다. 도 19a내지 도 19f는 FASTA포맷안에서 타겟 단백질들의 전체 서열을 나타내며， 도 19g은 효소부위 및 폴리펩티드 특징을 표시하기 위한 색상 코드를 나타낸다.
[표 2]
Ful l sequences of the target proteins , in FASTA formats 서열 번호
Tl iA, wi Id type MGVFDYKNLGTEASKTLFADATAITLY™NLDNGFAVGYQQHGLGL 1 (as a GLPATLVGALLGSTDSQGVIPGIPWNPDSEKAALDAVHAAGWTPISA reference) SALGYGGKVDARGTFFGEKAGYTTAQAEVLGKYDDAGKLLEIGIGFR
GTSGPRESLITDSIGDLVSDLLAALGPKDYAKNYAGEAFGGLLKTVA DYAGAHGLSGKDVLVSGHSLGGLAVNSMADLSTSKWAGFYKDANYLA YASPTQSAGDKVLNIGYENDPVFRALDGSTFNLSSLGVHDKAHES DNIVSFNDHYASTLWNVLPFSIANLSTWVSHLPSAYGDGMTRVLESG FYEQMTRDSTL IVANLSDPARANTWVQDLNRNAEPHTGNTFI IGSDG NDLIQGGKGADFIEGGKGNDTIRDNSGHNTFLFSGHFGQDRI IGYQP TDRLVFQGADGSTDLRDHAKAVGADTVLSFGADSVTLVGVGLGGLWS
EGVLIS
Tl iA, expressed MSRMGVFDYKNLGTEAS TLFADATAITLYTYHNLDNGFAVGYQQHG 2 in pDART LGLGLPATLVGALLGSTDSQGVIPGIPWNPDSEKAALDAVHAAGWTP plasmid (thi s ISASALGYGGKVDARGTFFGEKAGYTTAQAEVLGKYDDAGKLLEIGI i s used for GFRGTSGPRESLITDSIGDLVSDLLAALGPKDYAKNYAGEAFGGLL
computat ional TVADYAGAHGLSGKDVLVSGHSLGGLAVNSMADLSTSK AGFYKDAN analysi s) YLAYASPTQSAGDKVLNIGYENDPVFRALDGSTFNLSSLGVHDKAHE
STTDNIVSFNDHYASTLWNVLPFSIANLSTWVSHLPSAYGDGMTRVL ESGFYEQMTRDSTI IVANLSDPARANTWVQDLNRNAEPHTGNTFI IG SDGNDL I QGGKGADF I EGG GNDT I RDNSGHNTFLFSGHFGQDR I IG YQPTDRLVFQGADGSTDLRDHAKAVGADTVLSFGADSVTLVGVGLGG Z
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99^0ΐΟ/8ΐΟΖΗΜ/Χ3<Ι 8TC0S0/610Z OAV //:/ O 99SS8S2M128lsso6szAV
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//:/ O 99SS8S2M128lsso6szAV
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(M37) WKPFQEDDWEWWGPAVYTMPFTIFNDAMMYVIQ KGAEGEYVIAIR GTNPVSISDWLFNDFMVSAMKKWPYASVEGRILKISESTSYGL TLQ KLKP SHIPGENKTILQFLNEKIGPEGKAKICVTGHS GGALSSTLA LWL DIQGVKLSQNIDISTIPFAGPTAGNADFADYFDDCLGDQCTRI ANSLDIVPYA丽 TNSLKKLKSIYISEQASVKPLLYQRALIRAMIAET KGKKYKQIKAETPPLEGNINPILIEYLVQAAYQHWGYPELMGMMDD IPLTDIFEDAIAGLLLEHHHHHHGTASELIEGRGSDGNDLIQGG GA DFIEGGKGNDTIRDNSGHNTFLFSGHFGQDRI IGYQPTDRLVFQGAD
GSTDLRDHAKAVGADTVLSFGADSVTLVGVGLGGLWSEGVL I S
Caps id (Cap) , MSRMARKKSTPRRRKAVKRRRTVRRRQSPKARVRSTTTKAKRRISPS 12
Chaetoceros GSGSQHLTVRKQPFSNATSQPKILDGALTSSLSRRLQNVIGLTNGNG salsugineum GLGTEIMHIFFAPTLGIPLIAMNSAEGVALRPSSSADPFFIGFPGQT nul ear IKFDYVSSGnPPATGNLVTFSNECGFSKWRIVSQGLRMELANSDEE inc lus i on vi rus NDGWFEAVRFNWRNNPADICFTPIDGTLGGAKnDFAVAPSPVGMYA (CsNIV LKDMAMWQPGYTTGLLKDLKNHEFMLHPQSTTHDPI ILEQSYEGTI
GTT編 DMYYSVTSEVFELGNTVRGNTraSLVDN丽 DWIYLRLHCR TNNGTTSNGSKLIVNAIQNLEVSFNPSSDFAAFQTINKMHPQQKKVD DQLNNSAEASNKRQ TGGGELIEGRGSDGNDLIQGG GADFIEGG G
NDTIRDNSGHNTFLFSGHFGQDRI IGYQPTDRLVFQGADGSTDLRDH
AKAVGADTVLSFGADSVTLVGVGLGGLWSEGVL I S
DnaJ (Hsp40) MSRMAKQDYYEILGVSKTAEEREIRKAYKRLAMKYHPDRNQGDKEAE 13
AKF EIKEAYEVLTDSQKRAAYDQYGHAAFEQGGMGGGGFGGGADFS DIFGDVFGDIFGGGRGRQRAARGADLRYNMELTLEEAVRGVT EIRI PTLEECDVCHGSGAKPGTQPQTCPTCHGSGQVQMRQGFFAVQQTCPH CQGRGTLIKDPCNKCHGHGRVERSKTLSVKIPAGVDTGDRIRLAGEG EAGEHGAPAGDLYVQVQVKQHPIFEREGNNLYCEVPINFAMAALGGE IEVPTLDGRVKLKVPGETQTG LFRMRG GVKSVRGGAQGDLLCRW VETPVGLNERQKQLLQELQESFGGPTGEHNSPRSKSFFDGVK FFDD LTRGTASELIEGRGSDGNDLIQGGKGADFIEGG GNDTIRDNSGHNT FLFSGHFGQDRI IGYQPTDRLVFQGADGSTDLRDHAKAVGADTVLSF
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[표 3]
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[실시예 3] 목적 유전자가삽입된 플라스미드의 제작
pDART에 삽입하기 위해 13 개의 목적 유전자를 선택하였다. 추출된 게놈 DNA 샘플 (ΤΠΑ, ΜΒΡ, Trx 및 Hsp40), 전체 cDNA (EglV), 합성된 DNA 생성물 (NKC-TliA, CTP-TliA, MAP, lunasin, lunasin유도체， GFP및 과전하된 GFP), 다른 플라스미드 (이 외의 단백질) 등으로부터 PCR로 유전자를 증폭시켰다.
이들의 N-말단 신호 펩타이드를 SignalP 4.1 웹 기반 예측 al 5 ^(http: //www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (Peter sen, T. N. , Brunak, S. , von Heijne, G. , and Nielsen, H. (2011) SignalP 4.0： discriminating signal peptides from transmembrane regions . Nature methods 8， 785-786)으로 예측한 뒤 클로닝 및 발현 과정으로부터 제외시켰다. 합성 유전자의 코돈은 E. coli (과전하 GFP들) 또는 P. fluorescens (TliA 유도체들)에서의 발현을 위해 최적화시켰다.
lunasin 유전자는 합성된 뒤 pDART 삽입을 위한 PCR로 증폭시켰다. lunasin-DO, lunasin-D5, lunasin-D15 및 lunasin-D20 등 Ο말단의 Asp 폴리펩타이드 꼬리의 길이가 다른 유도체들을 다양한 프라이머로 증폭하고 분비 생산을 위해 pDART와 재조합시켰다 (도 3B). NKC-TliA 및 CTP-ΤΠΑ는 ΤΠΑ의 유도체이다. NKC는 이전에 개발된 항생제 폴리펩타이드이며 CTP는 이전에 세포질 수입 태그로 개발된 세포질 전달 펩타이드다. 이 두 가지 유전자를 P. //i/ores« s에서의 발현에 최적화된 코돈을 가지도록 합성했다. 이전에 GFP의 용매에 노출된 잔기들을 음전하 또는 양전하를 띤 아미노산으로 교체하여 음성으로 과전하된 GFP (-30) 및 양성으로 과전하된 GFP (+36)를 개발한 바 있다. 본 발명자들은 두 과전하 단백질을 코딩하는 유전자를 E. coli발현에 최적화된 코돈을 가지도록 합성하였다.
PCR에 사용된 프라이머는 플라스미드의 MCS (pDART, pFDIO 및 pBDIO)에 목적 유전자를 삽입하기 위해 사용된 제한 효소 부위를 가졌다. PCR 산물 및 플라스미드 백터를 Xbal, Kpnl, Sad 또는 Spel (이는 Xbal와 호환 가능) 증 두 개의 제한 효소로 이중 분해시켰다. 각 유전자에 사용된 효소의 특정 쌍은 표 2에 제공된 전체 서열로부터 직접 확인할 수 있다. 그런 다음 T4 ligase를 이용해 제한효소 처리된 플라스미드와 유전자를 연결하였다. 구축된 플라스미드를 클로닝을 위해 E. 이/에 도입하였고， 클로닝된 플라스미드를 표준 플라스미드 정제 방법을 사용하여 얻었다. 정제된 플라스미드는 발현과 분비를 분석하기 위해, P. fluorescens 에 도입했다.
[실시예 4] 웨스턴 블롯조건
48 시간 동안 세포를 성장 (분비는 성장 과정 전체에서 일어난다)시키면, 액체 배양물이 고정 성장기에 도달하고， 세포 밀도가 약 1.5 X 109세포 A (0D600) = -3) 정도에 도달한다. 이 때， 액체 배양액 400 를 취하여 18 , 000 rcf에서 10 분간 원심분리하여 상층액과 세포 펠렛을 분리하였다. 다음으로 세포 펠렛 추출물과 상층액 16 ii L- 배양액 (- 0.048 0D)을 각각 10 %폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하였다.크기에 따라 단백질을 분리하기위해 SDS-PAGE를사용하였다.
이어서， 단백질을 웨스턴 블롯하기 위해 나이트로셀를로오스 멤브레인 (Amersham)으로 옮겼다. 일차 항체로는 Polyclonal ant i-LARD3 rabbi t immunoglobul in G ( IgG)와 ant i-neomycin phosphotransferase 2 (Abeam, ab33595)를 각각 1 ： 3000과 1 ： 500으로 희석하여 사용했으며， 항 토끼 재조합 염소 IgG-peroxidase r lgG염소 IgG-퍼옥시다제)를 1： 1000희석하여 2차 항체로 사용하였다. 다음으로 밴드를 화학 발광 제제 (Advansta WesternBr ight Pi co)를 사용하여 검출하였고ᅳ 마지막으로 Azure C600 자동 감지 시스템을 사용하여 Western blot 이미지를 획득했다. 모든 포함된 웨스턴블랏 이미지들은 독립적인 P. f luorescens 콜로니들과 함께 세포배양으로부터 적어도 세가지의 서로 다른 반복 실험으로부터 얻어진 대목적인 결과이다.
이미지를 얻은 후， 다음으로 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 실험 1(도 1)의 결과를 정량화했다. 이후 이 실험의 목적 단백질의 % 분비를 계산했다. % 분비량은 다음과 같이 계산하였다.
% secret ion = 5SUpernatant/(5supernatant + 5ceii ) X 100 %
여기서 S는 웨스턴블롯 이미지의 각 대역의 표준화된 신호 세기이고, 아래 첨자는 레인의 샘플 타입을 나타낸다.
[실시예 5] 폴리펩타이드 특성 및 단백질 구조의 분석
목적 단백질의 이론적인 pi값은 ExPASy Compute pi / Mw도구 (Wi lkins : M. R. , Gasteiger , E. , Bai roch, A. , Sanchez , J . C. , Wi l l iams , K. L. , Appel , R. D. , and Hochstrasser , D. F. (1999) Protein identification and analysis tools in the ExPASy server. Methods Mol Biol 112， 531-552)를 사용하여 계산하였다. 전체 서열을 사용하였고， LARD3와 효소 부위로부터 추가된 임의의 잔기들도 포함시켰다. 단백질의 PI 값과 단백질의 잔기 당 전하 밀도의 강한 상관관계를 분석한 상관도를 도 11에 나타냈다.
도 11은 pH 7.0에서 단백질 pi와 전하의 관계를 나타낸다. 등전점 및 LARD3 부착 재조합 단백질의 100 잔기 당 전하가 높은 선형 상관관계를 나타낸다. 야생형 ΤΠΑ는 파란색으로 표시하였으며， 세포 외 배양에 대한 분비가 관찰되지 않은 단백질은 빨간색으로 표시하였다. 그 결과， 명확한 선형 상관관계가 관찰되었으며, pH 7.0에서 측정된 접히지 않은 단백질 전하는 Protein Calculator v3.4
(http://protcalc. sour ceforge. net /cgi-bin/protcalc)A≤- 계산하였다. 다음으로， SWISS-MODEL 구조적 상동성 모델링
(https://swissmodel.expasy.org/KArnold， K.， Bordol i , L. , Kopp, J., and Schwede , T. (2006) The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformat ics 22， 195ᅳ 201)을 이용해 ABC수송 단백질 구조를 연구했다.
본 발명자들은 Aquifexaeolicus의 PrtD(PDB ID 5122) (Morgan, J. L. W. Acheson, J. F. , and Zimmer , J. (2017) Structure of a Typeᅳ 1 Secret ion System ABC Transporter. Structure 25, 522—529)를 주형으로 사용했으며， 주형과 TliD의 서열 동일성은 40.98%에 달하였다. TliD의 구조 예측 결과를 도 12에 나타냈다.
도 12는 QMEAN4 점수에 따라 채색된 템플릿과 정렬 (al ignment)을 기준으로， TliD의 구조 예측 결과와 나타낸다. QMEAN4 점수에 따라 낮은 품질의 예측 (도 12의 밝은색 부분)되는 잔기는 주로 외면에 위치하며， 일반적으로 랜덤 코일 (random coil) 및 돌출부에 위치한다. QMEAN4 점수와 착색의 계산은 SWISS-MODEL을사용했다.
구조 모델의 막 횡단 나선들은 DAS-TMfilter (http://mendel.imp.ac.at/sat/DAS/XCserzo, M.， Eisenhaber , F. , Eisenhaber, B.， and Simon, I. (2002) On filtering false positive transmembrane protein predict ions . Protein Engineering, Design and Selection 15, 745-752)로 검증되었으며， 그결과를 도 13에 나타냈다.
도 13은 모델화된 TliD의 막 횡단 나선 (transmembrane helices)의 예측 결과를 나타낸다. 상기 예측은 DAS-TMfilter 웹 서버를 사용해 수행하였다. (A) TliD 이합체의 예상 구조를 나타내며， transmembrane helices가 다른 색으로 표시되어 있다. (B) (A)와 동일한 색 코드로 강조 표시된 TliD 시뭔스를 나타낸다.
얻어진 3D 모델의 표면을 Swiss PdbViewer (spdbv) (http://spdbv.vital-it.ch/)로 계산한 이후, 전하에 따라 착색하였다. 본 발명자들은 또한， TliD와 그 상동체들을 비교하고 TliD의 구조 (Ashkenazy, H. , Abadi, S. , Martz, Ε. , Chay, 0. , Mayrose, I. , Pupko, Τ·， and Ben-Tal, N. (2016) ConSur f 2016: an improved methodology to estimate and visualize evolutionary conservation in macromolecules. Nucleic Acids Research 44, W344-W350)를 확인하기 위해, ConSur f 웹 서버 (http://consurf.tau. ac.il/2016/)를 사용했다. 도 14가 TliD의 보존된 잔기에 대한 정보를 포함하고 있다.
도 14는 모델링된 TliD의 ConSur f 상동체 보존 분석 결과를 나타낸다. 본 발명자들은 TliD에 대한 ConSurf 상동체 보존 분석을 실시했다. 다중 서열 정렬 (Multiple Sequence Alignment)은 MAFFT를 사용하여 작성했으며， 동족체 (homologues)는 UniProt, 상동 검색 알고리즘 BLAST, PS I -BLAST El- value 0.001, PS I -BLAST 반복 횟수 5， 서열 사이의 ID 25-95 % 순으로 수집하였다. 197 개의 독특한 단백질이 스캔되었고， 그 중 query 에 가장 가까운 50 개의 서열을 사용하였다. 계통 이웃 (Phylogenic neighbors)을 ML 거리로 스캔하고， 보전 점수는 Bayesian 알고리즘으로 계산하였다. (A) TliD 이량체는 Bayesian conservation score에 따라 착색되었다. 도 14는 보전 점수가 높으면 짙게， 보전 점수가 낮으면 옅게 착색되었다. TliD의 transmembrane helices는 동족체간에 보존되어있다. 구체적으로， TliD의 중심 채널 내부에 직면하는 잔기는 고도로 보존되었고， 중앙 채널 외부에 있는 잔기 (인지질 또는 세포질을 향한)는 매우 가변적이었다.
ConSurf 상동성 분석은 또한 횡단 나선의 잔기들 중 통로 내면을 향하고 있는 잔기들이 높은 보존도를 지니고 있다는 것을 보여주며, 이는 우리의 구조 예측의 설득력을 더욱 높여준다. 마지막으로, 본 발명자들은 잠재적으로 중요한 위치들에서 고도로 보존된 아르기닌과 라이신 잔기들의 결가지 (side chain)의 pKa값을 웹 기반 서버 PDB2PQR (http://nbcr-222.ucsd.edu/pdb2pqr_2.0.0/)를 이용하여 예측하고 그들이 실제로 해당 구조 내에서 양전하를 띠고 있다는 사실을 검증하였다 (도 9의 C, D 및 F).
이어서 진행한 TliD의 상동성 기반 구조 예측 모델에서 이 단백질의 이합체 (dimer)는 그 통로 내부 면에 양전하 분포를 갖는 것으로 나타났다 (도 9의 A 및 도 9의 B). 이 예측 모델은 서열 동일성이 40.98%에 달하는
Aquifex aeolicus PrtD (PDB ID 5122)를 주형으로 하여 제작되었다. 또한 TliD에 ConSurf 동족체 보존성 분석은 채널의 중간 부분에 있는 이 양전하 분포가실제로 진화적으로 보존된 것임을 보여주었다 (도 9의 C및 D). 또한， TliD의 기질 진입 입구를 형성하는 꺾인 알파나선에는, 입구의 구멍 쪽으로 튀어 나와 TliD의 ADP 결합 상태에서 기질 진입 입구를 차단하는 양으로 대전된 잔기가 있으며， ConSurf 결과에서 볼 때 역시 50개의 모든 동족체에서 이 위치에 아르기닌 또는 라이신이 있었기에 이 잔기의 양전하가 보존됨을 확인할 수 있었다 (도 9의 (， 검은 화살표). 본 발명자들은 이 양전하를 면 통로의 내부 표면이 단백질 수송 중에 화물 단백질의 음전하 잔기와 상호작용하여 분비를 촉진하는 것으로 추정한다 (도 9의 E).
도 9는 TliDEF 복합체의 ABC 단백질인 THD 구조의 전하 분포를 나타낸다. (A) TliD단량체의 전자 반발표면 (Electron repulsion surf ace)을 보여주며,표면 전위에 따라 파란색 (+7kBT/e)부터 빨간색 (_7kBT/e)까지 색상을 지정하였다. 고도의 양전하를 띠고 있는 중심 통로 (channel)의 내부 표면은 상단의 원으로 표시되었다. (B) 리본 모델 (ribbon model)에서 제시된 단량체 중 하나인， TliD 동종이량체 (homodimer)를 보여준다. 중심 통로의 양전하를 띤 내부 표면은 상단의 원으로， Substrate entry window는 하단의 원으로 표시되었다. (C) Tlid, 채널의 내부 표면의 중간 지점에있는 보존된 양전하 클러스터 (cluster)는 원으로 표시하였다. 또한 Substrate entry window를 형성하는 두개의 α-나선은 타원으로 표시하였다. 해당 나선들에 포함되어있는 두 개의 보존된 양전하 잔기 중에서， Arg316 (검은 화살표)는 기공밖으로 돌출되어 있다. (D) 주변 세포질 쪽에서 본 TliD 이합체를 나타낸다. 음전하가 채널 (channel) 밖에 있는 반면， 양전하는 채널 (노란색 원)의 중간에 위치한다. (E) LARD3가부착된 고도의 음전하로 하전된 재조합 폴리펩타이드를 운반하는 TliD 이합체의 도식 모델을 나타낸다. NBD ( nuc 1 eot i de-b i nd i ng domain) 및 TiD의 transmembrane domain(TMD)를 이에 따라 분류하였다. 내막 (0M)을 관통하는 전위는 -150mV이었고， 세포질 (CP)은 주변세포질 (PP)보다 더욱 음전하를 나타냈다. 이 전위차는 양전하를 띠는 단백질보다 더 바깥쪽으로 운반된 음으로 하전된 단백질을 수송하는 것을 더 유리하게 만든다.
본 발명자들은 파이 몰 소프트웨어로 결과를 시각화했으며， 분석에 사용한 모든 시퀀스는 표 2 및 표 3에 나타냈다.
[실시예 6] 재조합 단백질의 분비 및 pi의 교차분석
다양한 크기， 유연성, 부피， 무게 등을 지닌 13가지 목표 단백질들의 유전자 (표 4)들에 pDART를 통해 C-말단 LARD3 신호서열을 부착하여 P. fluorescens Δ tliA Δ /· 에 도입하였다. 표 4는 유전자들의 리스트와 그들의 출처를 나타내며， * 로 표시한 유전자들은 본 실험에서는 사용하지 않았지만 이전 연구에서 분비되었던 유전자들을 나타낸다. 이후 해당 세포들을 액체 배양한 후， 상층액과 세포 펠릿을 웨스턴 블롯으로 분석 하였다 (도 la 및 도 lb).
[표 4]
약칭 다배 χ ¾ 출처 소스
Γ ¾
TliA Thermostable 1 ipase Pseudomonas fluorescens SIK-W1 Genom i c
A DNA
N C-TliA NKC-TliA Yang, . S., Sung, B, H.， Park, M, K.， Synthesi
Lee, J. H. , Lim, . J., Park, S. C. , zed- Kim, S. J. , Kim, H. K., Sohn, J.-H.,
Kim, H. M. , and Kim, S. C. (2015) Recombinant Lipase Engineered with
Amphipathic and Coi ledᅳ Coi 1
Peptides. ACS Catalysis 5， 5016ᅳ 5025
CTP-TliA CTP-TliA Kim, 으， Jeon, Cᅳ， Kim, J . -H . , Kim, Synthesi
M.-S., Yoon, C.-Hᅳ， Choi, I.-S., zed Kim, S.-Hᅳ， and Bae, Y.-S. (2006)
Cyt o 1 asm i c transduct i on pep t i de
(CTP)： New approach for the del ivery of biomolecules into cyto lasm in vitro and in vivo. Experimental Cell
Research 312， 1277-1288
Mann Mannanase Bacillus subtil is Plasmid
MAP Mussel adhesion MAP fp-151 Synthesi protein zed
MBP Maltose binding Escherichia coli XLlᅳ Blue Genomic protein DNA
Trx Thioredoxin Escherichia coli XLl-Blue Genomic
DNA
Cut i Cut inase Nectria haematococca Plasmid
Chi Chit inase Bacillus thuringenesis Plasmid
M37 M37 lipase Phot obacteri urn lipolyticum Plasmid
Cap Caps id protein Chaetoceros salsugineum Plasmid
DNA inclusion virus
Hsp40 DnaJ charperone Escherichia coli XLlᅳ Blue Genomic
DNA
EglV Endo- 1， 4- β-g 1 ucanas Trichoderma reesei QM6a Total e V cDNA
GFP Green fluorescent pGFPuv (Clontech) Plasmid protein GFP (-30) Negatively Lawrence, M. S. , Phi 11 ips, . J . , and Synthesi supercharged GFP Liu, D. R. (2007) Supercharging zed proteins can impart unusual resilience. Journal of the American
Chemical Society 129， 10110-10112
GFP (+36) Positively Lawrence, M. S.， Phillips, K. J.， and Synthesi supercharged GFP Liu, D. R. (2007) Supercharging zed proteins can impart unusual resilience. Journal of the American
Chemical Society 129， 10110-10112
EGF Epidermal growth Homo sapiens Plasmid factor
AP Alkaline phosphatase Escherichia coli XL 1一 Blue Genomic
DNA
PLA1 Phosphol ipase Ai Serracia marescens Plasmid 도 la 및 lb에 나타낸 바와 같이， 이 중 Mannanase, MBP, NKC-TliA, EglV, GFP 및 thioredoxin은 세포 펠렛과 상층액 모두에서 검출 가능하여， 세포 외 배지에서 성공적인 발현 및 분비를 보였다. 그러나 MAP, cutinase, chitinase, caps id, Hsp40 및 CTP-TliA는 세포 펠렛에서는 검출 되었으나， 상층액에서는 검출되지 않았으며， 이는 이들이 분비되지 않았다는 것을 의미한다.
도 la 및 도 lb는 선택된 단백질의 분비를 확인한 것으로, 목적 단백질의 발현 및 분비를 보여주는 웨스턴 블롯 이미지를 나타낸다. 세포 샘플은 세포질과 상층액 샘플에 남아있는 단백질의 양이 세포 외 공간에 국한되는 단백질의 양을 나타낸다. 비교를 위해， 세포 추출물과 배양 상층액의 당량 (16 m L)을 겔에 로딩하고， 웨스턴 블롯을 통해 분석하였다. 50 NG ΤΠΑ는 기준으로서 겔의 중간에 적재 하였다. 다른 두 개의 서로 다른 웨스턴 블랏은 상이한 배양 샘플로부터 수득하였다. 그 외 제시하지 않은 결과들 모두가 유사한 패턴을 나타내었다. 하기 이미지는, cytosol ic Neo, the neomyc i n/kanamyc i n phosphotransferase 2 protein에 대한 일차 항체를 갖는 동일한 셈플의 웨스턴 블랏 결과이다. 캡시드 (capsid)를 제외한 모든 샘플내에서 비 특이적인 용해 또는 누출을 최소화하였다.
상기 분비되지 않은 단백질들은 비교적 높은 이론적 pi를 가졌다. 이들 모두는 (한 가지 예외는 CTP-ΤΠΑ) pi가 ~5.5 이상이었으며, 양전하를 띠고 있거나 미세한 음전하를 띠었다. 한편, 분비 단백질은 상대적으로 매우 강한 산성 pi를 가지고 있었으며 그 pi 역시 5.5 (도 2a 및 2b)를 초과하지 않았다.
도 2a 및 2b는 타켓 단백질의 분비율 및 그들의 둥전점 사이의 상관 관계를 나타낸다. 목적 단백질의 pi값은 부착된 LARD3을 포함하는 서열로부터 계산하였다. 분비되지 않은 단백질들은 붉은색 막대로 나타냈다. AP, EGF 및 PLA1 이전 연구에서 분비되는 것으로 밝혀진 것이다. 도 2b는 Secret ion percentage를 pi에 추가하였다. 백분율 값은 상등액 신호를 상등액과 세포신호의 합으로 나눔으로써 계산했다. 도 1의 실험의 세 가지 서로 다른 생물학적 복제 (독립 배양 샘플)은 정량 분석에 사용하였다. 두개의 분비가되지 않는 두개의 고도로 특이한 특이 단백질인 MAP (PI = 9.61)및 캡시드 (= 9.25)는 플롯에서 제외하였다. 단백질 등전점과 그들의 % 분비 사이에는 음의 상관 관계가 있었다.
도 lb와 도 2b에서 알 수 있는 바와 같이， NKC-Tl iA 및 CTP-Tl iA의 분비는 본래의 ΤΠΑ의 분비와 비교했을 때 극적으로 감소하였다. 이들은 ΤΠΑ의 유도체로서 N-말단에 짧으면서도 매우 강한 양전하를 띤 서열이 부착되어 있다 (표 2) . CTP-Tl iA는 전혀 분비되지 않았다. CTP는 표 2에 나타낸 바와 같이ᅳ 중간에 알라닌 하나가 들어간 것을 제외하면 오로지 아르기닌만으로 구성된 매우 양전하를 띠는 짧은 서열 (RRARRRRRR)을 가지고 있다는사실을 유의해 둘 필요가 있다.
이어서 단백질의 웨스턴 신호 세기들을 정량한 후， 본 발명자들은 단백질의 분비량 대 발현된 단백질의 총량의 백분율을 pi와 대비하여 플롯 (plot )하였으며， 그 결과를 도 2b에 나타냈다.
도 2b에 나타낸 바와 같이， 단백질 pi와 분비 효율 간에는 약한 부정적 상관 관계가 있는 것으로 보이나 몇 가지 예외도 있는 것으로 나타났다.
[실시예 7] lunasin과그유도체 분석
lunasin은 대두 Glycine max로부터 분리된 항암 펩타이드이다. 이 단백질은 카르복실 말단에 9개의 연속된 아스파르트산 (aspartic acid, Asp) 서열이 있다는 독특한 특징을 가지고 있다. 본 발명자들은 이에 영감을 받아 아스파르트산 폴리펩타이드 꼬리의 길이가 서로 다른 lunasin의 유도체를 여러개 제조하였다.
이후 P. fluorescens^] pDART를 사용하여 lunasin 및 그의 유도체를 도입하고, 이들의 발현 및 분비를 웨스턴 블롯을 통해 관찰하였으며， 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타냈다.
도 3a 및 도 3b는 .fluorescens 발현과 분비 시스템 내에서 oligo-aspartic acid 서열의 최적 길이를 결정하기 위해, Lunasin 과 oligo-aspartic acid 꼬리의 길이가 서로다른 Lunasin의 유도체를 LARD3 부착을 경유해 발현하고 분비를 확인한 결과이다.
도 3a는 세포와 상층액에서 Lunasin과 이의 유도체의 발현은 웨스턴 블롯팅을 통해 검출하였으며， 구체적으로 세포 추출물 및 상층액 36 iiL 당량을 겔에 로딩하고， 웨스턴 블롯을 통해 분석 하였다. 도 3b는 아스파르트 산 꼬리의 길이가 변형된 lunasin및 이의 유도체의 단백질 서열 및 도메인 구조를 나타내며. 각각을 lunasin-D0, lunasin-D5, original lunasin (D9), lunasin-D15 및 lunasin-D20으로 명명하였다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 본래의 lunasin이 가장 분비 효율이 높았으며 아스파르트산 폴리펩타이드 꼬리의 길이가 감소함에 따라, 분비된 단백질의 상대적 비율이 감소했다. 본 발명자들은 또한 lunnasin-D15에서 분비 및 발현 수준의 감소됨을 관찰했다. Lunasin-D20은 세포 또는 상층액에서 관찰되지 않았다. lunasin 폴리펩타이드 및 그의 유도체의 정확한서열은 도 3b에 나타냈다.
이 실험에 기초하여, 본 발명자들은 ABC수송체를 통한 분비에 있어 아스파르트산 폴리펩타이드 서열의 최적 길이가 약 9 정도일 것이라고 결정하였고， 하기 추가실험을 진행하였다. [실시예 8] 아스파르트산 폴리펩타이드를 첨가한 pFDIO 및 pBDIO의 제작
20개의 가장 보편적인 아미노산 중에서， 아스파르트산은 최저 pKa 값을 갖는다 (Mathews , C. K. (2013) Biochemi stry, 4th ed. , Pearson, Toronto) . 상기 실시예 7에서의 lunasin 단백질 서열에 의해 영감을 받아， 본 발명자들은 LARD3 신호서열뿐만 아니라 아스파르트산 폴리펩타이드 서열도 같이 부착시키는 두 개의 플라스미드를 개발했다.
본 발명자들은 lunasin 유전자의 아스파르트산 폴리펩타이드 꼬리의 DNA 서열에 기초하여 아스파르트산 10개 중합체 (decamer)를 코딩하는 DNA 서열을 합성한 뒤 DKKDDDDDDDDDD ： 서열번호 33)이라 이름붙였다. 이후 본 발명자들은 이 D10 유전자를 pDART 플라스미드에 삽입하여 각각 MCS에 삽입된 유전자의 N 말단과 C 말단 측에 D10을 부착하는 두 가지 플라스미드 (각각 pFDIO과 pBDIO이라 명명)를 제조하였으며， 이를 도 4에 나타냈다.
도 4는 사용한 플라스미드의 구조를 나타내며， MCS를 포함하는 pDART 플라스미드의 구조를 나타낸다. t l iD ， t l iE ， t l iF 및 LARD3가 융합된 단백질은 단일 오페론으로 제어된다. (A)의 경우, MCS 바로 뒤에 LARD3 유전자가 있기 때문에 삽입된 목적 유전자는 C-말단에 붙어있는 LARD3와 함께 발현된다. (B) N-말단에 D10 서열이 부착되어 있는 플라스미드인 pFDIO의 구조를 나타낸다. D10 유전자는 개시코돈에 직접 뒤따르며 MCS와 LARD3의 바로 이전에 위치한다. (C) C 말단에 위치하지만 LARD3 이전에 D10 서열을 부착시키는 pBDIO플라스미드의 구조를 나타낸다. D10유전자는 MCS와 LARD3사이에 위치한다.
다음으로, 선택된 단백질들을 새로 제조한 플라스미드인 pFDIO와 pBDIO에 삽입하였다. 상기 pFDIO 또는 pBDIO에 삽입된 유전자들을 pDART에 삽입된 버전과 함께 P. f luorescens에 도입하였고 이들의 분비 효율을 웨스턴 블롯을 통해 함께 분석하였다.
[실시예 9] ΤΠΑ유래 재조합 단백질을 pFDIO 및 pBDIO에 삽입
NKC-ΤΠΑ및 CTP-Tl iA는 둘 다 ΤΠΑ의 유도체이며， 각각의 N-말단에는 염기성 펩타이드가부착되어 있다. Tl iDEF통해 분비 효율은 야생형 Tl iA (도 lb 및 도 10a,b)보다 현저히 낮다.
도 10a는 ΤΠΑ, CTP-Tl iA 및 NKC-Tl iA의 효소 플레이트 분석결과를 나타내며, ΤΠΑ는 예상대로 분비되었다 (ΤΠΑ는 Tl iDEF 운반자에 대한 천연 기질이다) . 그러나 CTP-ΤΠΑ의 분비는 차단되었으며 NKC-Tl iA의 분비는 ΤΠΑ보다 다소 약하게 나타났다.
도 10b는 Tl iA, CTP-Tl iA, NKC-Tl iA의 웨스턴 블랏결과를 나타내며 효소 플레이트 분석에서 알 수 있듯이， ΤΠΑ의 강하게 분비되고, NKC-Tl iA는 약하게 분비되며， CTP-Tl iA는 분비되지 않았다. NKC는 매우 큰 양전하를 가지며， CTP는 그보다 더 큰 양전하를 가졌다. CTP는 중간에 단 하나의 예외로 알라닌을 가질 뿐， 아르기닌만으로 구성된 연속적인 9 개의 잔기를 가지고 있다.
그러나 pFDIO 또는 pBDIO에 의한 아스파르트산 폴리펩타이드 부착시 NKC-Tl iA과 CTP-Tl iA의 분비가 다시 증가하였다. 상기 실험결과를 도 5에 나타냈다.
도 5는 NKC와 CTP 서열이 각각 부착된 ΤΠΑ 라이페이스 두 종류 (NKC-Tl iA, CTP-Tl iA)의 N-말단부 (FD10)와 C-말단부 (BD10)에 아스파르트산 10개를 추가하여 pDART 플라스미드를 통해 발현시킨 이후 웨스턴 블롯 및 라이페이스 활성도 측정 배지로 검출한 결과를 나타낸다. 도 5의 (A)에서 분비는 pDART와 비교해 pFDIO및 pBDIO모두에서 크게 향상되었다. (B)는 다른 플라스미드에서 NKC-Tl iA 효소 플레이트 분석 결과를 나타내며， (C)는 pFDIO 및 pBDIO에서 CTP-Tl iA의 웨스턴 블롯결과이고， pBDIO에서 분비가 크게 증가함을 확인하였다. (D)는 다른 플라스미드에서 CTP-Tl iA 효소 플레이트 분석결과를 나타낸다. pBDIO에서 분비가 크게 증가함을 알 수 있다. 두 가지의 서로 다른 웨스턴 블롯 결과들은 서로 다른 배양 샘플에서 얻은 것이나 비슷한 패턴을 나타냈다. 두 개의 다른 효소 플레이트 분석법은 상이한 콜로니로부터 수득하였으며， 이들 모두가유사한 패턴을 나타냈다.
분비 비율 (분비된 단백질 versus 세포 내 단백질)의 관점에서, NKC-Tl iA은 도 5의 (A) 및 (B)에 나타낸 바와 같이， 상류 또는 하류 둘 중 하나에 D10이 부착된 후 분비가 극적으로 증가하였다. CTP-ΤΠΑ의 경우， 도 5의 (C) 및 (D)에 나타낸 바와 같이, pBDIO에 의해 하류에 D10서열이 추가되었을 때， 웨스턴 불롯 및 활성 분석 플레이트 모두에서 급격한 분비증가를 나타냈다. 효소 플레이트 활성 실험에서， pDART 또는 pBDIO에 삽입된 NKC-ΤΠΑ및 CTP-ΤΠΑ의 할로 (halo) 크기는 일반적으로 각각의 웨스턴 블랏팅 결과에서 상층액 샘플의 밴드 강도와 일치한다. 그러나, pFDIO은 그들의 밴드 강도로부터 기대되는 것보다 약간 더 작은 할로를 가지며， 이것은 효소 활성의 감소 가능성을 나타낸다.
[실시예 10] 음전하를 띤 단백질의 pFDIO 및 pBDIO삽입
초록 형광 단백질 (GFP) , 만나네이즈 (Mannanase) , 말토스 결합 단백질 (MBP) , 및 싸이오레독신 (Thioredoxin) 유전자를 pDART, pFDIO 및 pBDIO에 도입하여 얻은 재조합 플라스미드를 P. fluorescens^] 도입하여 형질 전환된 단백질을 제조하였다. 생성된 단백질은 Tl iDEF 수송체에 의해 분비되었으며， 상기 실험결과를 도 6에 나타냈다.
도 6은 음으로 하전된 단백질의 pFDIO 및 pBDIO에서의 분비를 나타낸다. (A) GFP의 웨스턴 블롯결과를 나타내며， pFDIO 및 pBDIO 모두 상층액에서 단백질 분비의 증가를 보여준다. (B) Mannanase의 웨스턴 블롯결과를 나타내며， Mannase분비에 있어 두 pFDIO및 pBDIO모두가 약간씩 증가하였다. (C) MBP의 웨스턴 블롯결과를 나타내며， 분비율의 증가가 pFDIO과 pBDIO 모두에서 관찰되었다. (D) thioredoxin의 웨스턴 블롯결과를 나타내며, 신호는 전체적으로 약했지만 pFDIO과 pBDIO 모두에서 분비가 증가하였다. 전반적으로 pBDIO에서 좀 더 음으로 하전된 단백질의 밴드는 약간 위쪽으로 이동된 위치에서 나타났다. pDART와 pBDIO에 대한 세가지의 서로다른 웨스턴 블랏 결과는 다른 배양 샘플로부터 얻어졌으며， 반면에 pDART와 pFDIO에 대한 두 개의 서로 다른 웨스턴 블랏 결과가 있다. 이 모두는 비슷한 패턴을 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이， 분비의 증가에 있어 GFP에서 가장 큰 증가를 보였다. pDART와 pBDIO에 삽입된 GFP의 밴드 강도의 비교는 상층액 대 발현 비율의 현저한 변화를 보였다. pFDIO-GFP는 상층액과 세포 펠렛의 비율의 관점에서 분비가 약간만 개선되었다 (도 6의 (A) ) .
Mannanase의 경우는 다소 모호했지만， pBDIO-Mannanase는 pDART-Mannanase보다 우수한 분비를 나타낸다는 결론을 얻을 수 있었다. 또한 pFDIO에 의해 상류에 D10 서열이 첨가되었을 때， 절대 발현량 자체는 저하되지만 분비 비율 자체는 향상되었다 (도 6의 (Β) ) ·
MBP의 분비 역시 pDART에 비하여 상층액 /세포 비율의 관점에서 볼 때 pFDIO 및 pBDIO에서 모두 향상되었다 (도 6의 (C) ) .
Trx (싸이오레독신)의 경우, 상층액 /세포 신호 강도 비율이 pFDIO과 pBDIO 모두에서 개선되었다 (도 6의 (D) ) .
결과적으로, 웨스턴 블롯결과 N-말단부나 C-말단부에 아스파르트산이 추가된 단백질들은 세포 밖 (Supernatant ) 대 세포 안 (Cel l ) 의 단백질 농도 비율이 높아졌으며， FD10의 경우 발현량이 대폭 감소하는 패턴을 보임을 확인하였다.
[실시예 11] 양전하를 띤 아미노산 폴리펩타이드의 첨가 -pBRlO의 제작 및 분석
본 발명자들은 추가적으로 pBDIO과 유사하나， 한 가지 차이점을 지니는 플라스미드를 제작하였다. 이 플라스미드는 MCS 다음 아스파르트산 폴리펩타이드를 코딩하는 D10대신에 아르기닌 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 R10이 도입되어 있다.
본 발명자들은 ΤΠΑ와 GFP유전자를 pDART, pBDIO , pBRlO플라스미드에 삽입하고 효소 활성 배지 (이것은 Tl iA만)와 웨스턴 블롯을 통해 분비를 검사하였으며， 그 결과를 도 7에 나타냈다.
도 7은 ΤΠΑ 라이페이스와 초록 형광 단백질 (GFP)의 C-말단부에 각각 아스파르트산 (D) 10개 또는 아르기닌 (R) 10개를 추가한 뒤 웨스턴 블롯과 라이페이스 활성 배지로 검출한 결과를 나타낸다. 두 개의 음전하 단백질， Tl iA와 GF?를 신호서열 (pDART) , ol igo-aspartate(pBDlO) 및 ol igo-arginine(pBRlO) 이외에는아무것도 부착하지 않는 플라스미드에 삽입 하였다. 도 7의 A는 상기 플라스미드에서 Tl iA의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. pDART및 pBDIO의 Tl iA는우수한 분비를 보여준다. 하지만 R10이 부착 된 경우， 분비가 차단되었다. 도 7의 B는 상기 플라스미드에서 Tl iA 효소 플레이트 분석결과를 나타낸다. Tl iA 분비는 pBRlO가 삽입되었을 때 차단되었다. 도 7의 C는 상기 플라스미드에서 GFP의 웨스턴 블롯결과를 나타낸다. 이와 유사하게 pDART와 pBDIO은 우수한 분비성을 나타낸 반면, R10이 부착되었을 때의 분비가차단 되었다.
ΤΠΑ의 웨스턴 블랏에서, pDART 및 pBDIO은 양호한 분비 효율을 나타냈으나， pBRlO은 분비가 감소되었다 (도 7의 A). 유사한 패턴이 플레이트 효소 분석에서도 관찰되었는데， pBRlO은 할로를 나타내지 않쌌지만， 다른 둘은 나타내었다 (도 7의 B). GFP의 웨스턴 블랏에서， pDART 및 pBDIO 모두 분비되는 것으로 나타났으나 pBRlO은 ΤΠΑ에서와 마찬가지로 GFP의 분비가 차단되었다 (도 7의 C).
[실시예 12] 과전하된 단백질의 웨스턴 블랏 분석
초록 형광 단백질 (GFP)과 Average Number of Neighboring Atoms Per
Sidechain Atom (AvNAPSA) (Lawrence MS, Phillips KJ, Liu DR. Supercharging Proteins Can Impart Unusual Resilience. Journal of the American Chemical Society 2007； 129: 10110-10112.) 방식으로 상기 단백질을 과전하화 (Supercharging)시킨 GFP 유도체인 GFP(_30)와 GFP(+36)를 pDART를 통해 LARD3와 결합시키고， P. fluorescens AtliA AprtA에 도입하여 단백질을 발현시킨 후， 샘플을 웨스턴 블랏으로 분석하였으며 그 결과를 도 8에 나타냈다.
도 8은 GFP와 과전하된 GFPs의 분비를 나타낸다. 과음전하화된 GFP (-30)는 세포 밖 (Supernatant) 대 세포 안 (Cell) 의 단백질 농도 비율이 확연히 높아졌으며, 본래의 GFP보다 현저히 높은 분비율을 나타냈다.
반면， 과양전하화된 GFP (+36)는 세포 내에서 고농도로 검출된 반면， 세포 밖 (Supernatant)으로는 전혀 검출되지 않았다. 비록 과전화 GFPs의 밴드는 약간 위쪽으로 이동하였지만, 서로 다른 배양 표본으로부터 서로 다른 두 가지의 웨스턴 블롯 결과가 얻어졌으며， 이들 모두는 유사한 패턴을 나타냈다.
도 8에서 알 수 있는 바와 같이, GFP와 GFP -30)은 세포 펠렛과 상층액에서 모두 검출되었으며， 이는 상기 단백질들이 발현된 뒤 효과적으로 세포 외 공간으로 분비되었음을 의미한다. 여기에서 GFP -30)는 원래의 GFP보다상층액에 보다 강하게 발현되었음을 확인할 수 있었다.
반면에， GFP (+36)는 세포 펠릿에 국한되어 강하게 발현되며， 세포 외 공간으로 분비되지 않았다. 이러한 재조합 단백질의 pi 값은 GFP (-30)의 경우 4.64， 조작되지 않은 GFP의 경우 5.36， GFP(+36)의 경우 10.42 이었다.
[실시예 13] 단백질 분비 효율을높이는 최적 링커길이 확인
Model protein으로 NKC-Tl iA 선정하였다. NKC는 21개꾀 아미노산으로 구성되어 있으며 양친매성 (amphiphi l ic) a—hel ix를 형성하는 pept ide 이다. 21개의 아미노산은 Lysine을 많이 포함하고 있으며ᅤ pl=10.78로서 ρΙ=5·01인 Tl iA l ipase에 fusion되어 NKC-Tl iA를 만들면 pl=5.34가 되며 단백질의 분비가줄아든다.
본 발명자들은 NKC 단백질의 Lysine을 모두 Aspartate로 치환 (NKC(-) )하여 분비정도를 확인하였으며， 이와 함께 NKC (-)와 Tl iA에 여러길이의 l inker를 연결시켜 여러 링커길이를 통해 NKC (-)의 분비 효율을 웨스턴 블랏과 활성 분석 플레이트를 통해 비교하였으며， 그 결과를 도 15에 나타냈다. Linker의 길이는 아무것도 없는 NKC (-)로부터 GGGGS가 하나 들어간 L1 , 2개 들어간 L2, 3개 들어간 L3로 나타냈다.
도 15는 Tl iA, NKC (-) , N C-L1, NKC-L2, NKC-L3, NKC-Tl iA에서 단백질 분비를 나타낸다. 도 15의 (A)는 Tl iA의 웨스턴 블랏결과이며， 도 15의 (B) 다른 plasmids에서 Tl iA의 효소 플레이트 분석결과를 보여준다'.
도 15의 (A)의 웨스턴 블랏 결과， 맨 오른쪽의 NKC—ΤΠΑ 경우 전혀 분비가 되지 않지만， Lysine을 모두 Aspartate로 치환한 NKC (-) 및 음전하 NKC에 l inker를 부착한 단백질은 분비가 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.
도 15의 (B)의 활성 분석 플레이트 결과에 따르면， 기존 NKC 보다 NKC (-)에서 단백질의 분비가 증가하며， 링커가 도입되었을 때 분비가 전반적으로 증가하며, 특히 링커 3개가 부착된 경우 분비가 현저히 증가함을 확인할 수 있었다. 이 결과를 ᅵ통해 음전하를 띈 NKC가 단백질의 분비를 증가시키는 것을 알 수 있었다.
[실시예 14] 음전하 supercharge의 단백질 분비 증가 확인
본 발명자들은 단백질의 전하를 바꿔주어 분비효율이 변하는 것을 확인하기 위해 단백질의 아미노산을 음전하를 띈 아미노산으로 치환하여 단백질의 분비 경향을 관찰하였다. 이를 위해, 스트랩타비딘 (SAV) wi ld type 단백질로부터 음전하 super charge가 -10과 양전하 super charge가 +13을 만들었으며， 이와 유사하게 글루타싸이온 S-전달효소 (GST)도 음전하 supercharge가 -20과 양전하 super charge가 +19 전하를 띈 supercharge단백질을 만들어 단백질의 분비를 분석하였으며， 그 결과를 하기 도 16에 나타냈다.
도 16은 -10SAV, wtSAV, +13SAV 및 -20GST, wtGST, +19GST의 분비 여부의 분석결과를 나타낸다 (SAV: streptoavidin I GST glutathione S-transf erase) . SAV ( 135aa)는 사량체를 만들고 GST (215aa)는 이량체를 만든다. 유전자 합성에서 단량체의 전하를 계산하였다 (-10SAV: pI4.96 I wtSAV: pI6.76 I +13SAV: pi 10.29 I -20GST: pI4.73 I wtGST: pi그 86
/+19GST: pI9.87) .
도 16에 나타낸 바와 같이， 음전하 supercharge 단백질들은 세포에도 많이 존재하고 분비도 잘 되는 것을 확인할수 있었지만 wi ld type단백질과 양전하 supercharge 단백질은 발현 및 분비가 되지 않는 것을 알 수 있었으며, 음전하 supercharge가 단백질의 분비를 높여주는 것을 확인하였다.
이와 유사하게， AvNAPSA 방식을 사용하지 않고 임의로 구조를 보면서 돌출된 아미노산을 아스파르트산 또는 아르기닌으로 교체하여 과전하화시킨 글루타싸이온 S-전달효소 (GST)과 스트렙타비딘 (SAv)를 pDART에 넣어 발현시키고 웨스턴 블롯을 수행했으며， 그 결과를 도 17에 나타냈다.
도 17에서 알 수 있는 바와 같이， 과음전하화된 단백질들 (붉은색으로 표시)은 세포 밖 (Supernatant ) 대 세포 안 (Cel l ) 의 단백질 농도 비율이 확연히 높아진 것을 볼 수 있다. 반면 과양전하화된 단백질들은 세포 안에서 상당히 고농도로 검출된 반면 세포 밖 (Supernatant )에서는 전혀 검출되지 않거나 낮은 농도로만 검출되었다.
[실시예 15] AvNAPSA 방법을 이용한 과음전하화한 단백질의 세포외 분비 증가 확인
MelC2 타이로시네이즈， 큐티네이즈 (Cut i ) , 키티네이즈 (Chi )ᅳ 그리고 M37 라이페이스를 AvNAPSA 방법으로 과음전하화시킨뒤, 과음전하화가된 단백질 (붉은색)과 그에 대웅되는 과전하화가 되지 않은 자연 단백질 (검은색)을 각각 pDART 플라스미드에 넣어 발현시키고 웨스턴 블롯으로 검출하였으며， 그 결과를 도 18에 나타냈다.
구체적으로 AvNAPSA를 이용한 과음전하화 방법^ 다음과 같다. 먼저 AvNAPSA 알고리즘 (1. Lawrence MS, Phillips KJ, Liu DR. Supercharging Proteins Can Impart Unusual Resilience. Journal of the American Chemical Society 2007； 129： 10110-10112. )으로 아스파르트산과 글루탐산이 적정한 위치에 치환되어 들어가 과음전하화가 이루어진 단백질 서열을 얻었다. 이후 해당 단백질 서열에 대응되는 DNA 서열을 합성하였으며, 이 합성된 DNA 서열을 pDART플라스미드에 넣은 후 과음전화된 단백질을 제조하였다.
과음전하화된 단백질들은 세포 밖에서는 전혀 검출되지 않는 자연 단백질들과 달리 세포 내부 (C) 뿐만 아니라 세포 외부 (S)에서도 매우 높은 농도로 관측되어， 분비가 확연하게 증강된 것을 볼 수 있다. MelC2 타이로시네이즈 (Tyrosinase) 단백질의 경우， His-tag을 비롯한 약간의 서열 차이로 인해 과전하화가 된 단백질과 자연 단백질 간에 크기 차이가 소량 존재한다.
즉, 상기 실험을 통해 본 발명자들은 기존의 기술로는 분비 생산법이 적용 불가능했던 타이로시네이즈 (Tyrosinase), 큐티네이즈 (Cutinase) 등의 단백질들을 AvNAPSA 알고리즘을 이용해 과전화화시킴으로써 기존 분비가 되지 않던 단백질들을 상당한 효율로 세포 외 분비시킬 수 있음을 확인했다.
[실시예 16] 세 종류의 서로다른 세균으로부터 분리한 T1SS수송체를 발현한세포에서 ΤΠΑ단백질 분비 확인
16-1. Escherichia coli HlyBD+TolC, Dickeya dadantii PrtDEF, Pseudomonas aeruginosa AprDEF ^r^l
본 발명자들은 Escherichia coli CFT073 균주의 분리된 유전체 (Genbank AE014075)로부터 HlyB, HlyD유전자가 포함된 오페론의 특정 부분을 hlyBD-s (서열번호 34: GGGGAGCTCGGATOTTGTCATAAAATTGA ) , hlyBD-a(서열번호 35: GGGGGATCCTTMCGCTCATGTAAACTTTCT) 두 프라이머를 사용한 PCR를 통해 증폭시켰으며 , 이를 pSTV플라스미드 (pACYC플라스미드의 유도체 중 하나)에 각 균주의 유전체로부터 수송체 유전자들을 각각 PCR로 증폭하여 시작 코돈 (Start Codon) 및 코작 서열 (Kozak Sequence)과 함께 차례로 삽입한 플라스미드 pSTV-HlyBD를 제작하였다. HlyB, HlyC와 함께 수송체를 이루는 TolC는 대장균이 자체적으로 생산하기 때문에 따로 포함하지 않았다.
또한본 발명자들은 Dickeyadadantii PrtD, PrtE, PrtF세 유전자를 발현시키는 플라스미드인 pEcPrtDEF(Delepelaire P, Wander sman C. Protein secret ion in gram-negat ive bacteria. The extracellular metal loprotease B from Erwinia chrysanthemi contains a C-terminal secretion signal analogous to that of Escherichia col i alpha— hemolysin. J Biol Chera. 1990 ;265 :17118-17125)와 Pseudomonas aeruginosa^ AprD, AprE, AprF 세 유전자를 발현시키는 pAGS8(Duong F, Soscia C, Lazdunski A, Murgier M. The Pseudomonas f luorescens lipase has a C-terminal secret ion signal and is secreted by a three-component bacterial ABC-exporter system. Mol Microbiol - 1994; 11: 1117-1126)을 준비하였다.
16-2.세 종류의 서로다른 세균으로부터 분리한 T1SS수송체를 발현한 세포에서 단백질 분비 확인
본 발명자들은 PQE184 플라스미드에 ΤΠΑ 단백질 (TliDEF 수송체의 본래 기질)의 유전자를 삽입한 플라스미드 하나와 위에서 제작한 세 종류의 서로 다른 세균으로부터 분리된 T1SS 수송체 중 한 종류를 발현하는 플라스미드 (즉， Escherichia coli HlyBD를 발현하는 pSTV-HlyBD, Dickeya dadantii PrtDEF를 발현하는 pEcPrtDEF, Pseudomonas aeruginosa AprDEF를 발현하는 pAGS8) 중 하나를 대장균에 동시에 열 층격법 (Heat Shock Method)로 도입하여 ΤΠΑ와 세 수송체 중 하나를 동시 발현시킨 뒤 리파제 효소 활성 측정 배지에서 세포 외부로의 재조합 목적 단백질의 분비 정도를 콜로니 주변부 배지의 색변화를 통해 측정하였으며， 그 결과를 도 19에 나타냈다.
도 19에 나타낸 바와 같이， Escherichia co// HlyBD+TolC (대장균이 본래 TolC 단백질을 발현시킴), Dickeya dadantii PrtDEF, Pseudomonas aeruginosa AprDEF 세 수송체들 모두 ΤΠΑ 단백질을 성공적으로 분비시킴을 확인할 수 있었다. 이는 대장균에서 수송체 단백질의 추가 발현 없이 (빈 pACYC 플라스미드를 대신 넣음) ΤΠΑ 단백질만을 발현시킨 균주 (ΤΠΑ only)에서는 halo가 관측되지 않는다는 사실로부터 유추할 수 있다. 상기 결과로부터 슈도모나스 플루오렌스 외의 Escherichia co Π, Dickeya dadantii Pseudomonas aeruginosa^ TISS단백질들이 Tl iA의 LARD3신호 서열을 인식할 수 있다는 것을 의미한다.
[실시예 17] 세 종류의 서로다른 세균으로부터 분리한 T1SS수송체를 발현한세포에서 큐티네이즈 단백질 분비 확인
17-1. 과음전하화한 큐티네이즈 단백질 제조
큐티네이즈 (Cut inase) 단백질 (Cut i )에 AvNAPSA 방법을 사용해 과음전하화된 큐티네이즈 단백질 (Cut i (-) )을 제조하였다.
17-2.세 종류의 서로다른 세균으로부터 분리한 T1SS수송체를 발현한 세포에서 큐티네이즈 단백질 분비 확인
큐티네이즈 (Cut inase) 단백질과 과음전하화한 큐티네이즈 단백질에 PUC19 플라스미드를 기반으로 다중제한효소자리 (Mul t iple Cloning Si te) 바로 뒤에 LARD3 신호서열의 유전자를 삽입한 pLARD3 플라스미드에 큐티네이즈 유전자들을 삽입하는 방식으로 LARD3 신호 서열을 부착한후， 실시예 16의 방법으로 얻은 세 종류의 서로 다른 T1SS 수송체 단백질들 (Escher i chia col i HlyBD+TolC, Di ckeya dadant i i PrtDEF , Pseudomonas aeruginosa AprDEF)을 발현하는 플라스미드와 함께 실시예 16의 방법과 유사하게 두 플라스미드를 동시에 대장균 세포ᅳ 내에 도입하여 동시에 발현시켰으며, 큐티네이즈 효소 활성 측정 배지에서 37 °C에서 3일간 배양한 후， 대장균 외부로의 단백질 분비 정도를 콜로니 주변부 배지의 색변화를 통해 측정하였으며， 그 결과를 도 20에 나타냈다.
도 20에 나타낸 바와 같이， 세 종류의 T1SS수송체 단백질 모두에서， 과음전하화된 큐티네이즈의 분비 정도가 과음전하화되지 않은 큐티네이즈에 비해 확연히 높음을 관찰할 수 있다. 마찬가지로 빈 플라스미드를 수송체 플라스미드 대신에 넣은 대조군 (Cut i (-) only, Cut i only)들과의 비교를 통해 유추할 수 있었다.
[실시예 18] 웨스턴 블롯을 이용한 큐티네이즈 단백질의 세포 외 분비 확인 큐티네이즈 단백질 (Cut i )과 과음전하화된 큐티네이즈 단백질 (Cut i (-) )에 LARD3 신호 서열을 부착한 후， 실시예 16의 방법으로 얻은 세 종류의 서로 다른 T1SS 수송체 단백질들과 함께 대장균에서 발현시켜 액체배양한 뒤 웨스턴 블롯으로 세포 안 및 세포 밖의 해당 단백질 농도를 검출하였으며， 그 결과를 도 21에 나타냈다.
도 21에 나타낸 바와 같이 세 종류의 T1SS 수송체 단백질 모두에서， 과음전하화된 큐티네이즈의 분비 정도가 과음전하화되지 않은 큐티네이즈에 비해 확연히 높음을 관측할 수 있다. 마찬가지로 분비 사실은 수송체 플라스미드 대신 빈 플라스미드를 넣은 대조군 (Cut i (―) only, Cut i only)들과의 비교를 통해 유추할 수 있었다.
[실시예 19] 웨스턴 블롯을 이용한 M37 라이페이즈 단백질의 세포 외 분비 확인
M37 라이페이스 (Lipase) 단백질과 과음전하화된 M37 라이페이스 (M37(-) ) 에 LARD3 신호 서열을 부착한 후， 실시예 16의 방법으로 얻은 세 종류의 서로 다른 T1SS 수송체 단백질들과 함께 대장균에서 발현시켜 액체배양한 뒤 웨스턴 블롯으로 세포 안 및 세포 밖의 해당 단백질 농도를 검출하였으며， 그 결과를 도 22에 나타냈다.
도 22에 나타낸 바와 같이 세 종류의 T1SS 수송체 단백질 모두에서， 과음전하화된 M37의 분비 정도가 과음전하화되지 않은 M37에 비해 확연히 높음을 관측할수 있다. 마찬가지로 분비 사실은 수송체 플라스미드 대신 빈 플라스미드를 넣은 대조군 (M37(-) only, M37 only)들과의 비교를 통해 유추할 수 있었다.
[실시예 20] TISS ABC수송체의 서열 일치도평가
슈도모나스 플루오레슨스의 THDEF 수송체의 Tl iD 와 Escherichia coli HlyBD+To lC , Dickeya dadantii PrtDEF , Pseudomonas aeruginosa AprDEF 의 TISS ABC 수송체 및 그 외 다른 종류의 TISS 수송체들의 ABC 단백질들과 서열 일치도 (Sequence Ident i ty)를 측정하였으며， 그 결과를 도 23에 나타냈다. 도 23은 Tl iDEF 수송체와 다양한 T1SS 수송체들간의 염기서열 일치도 (Sequence Ident i ty) 및 전체 염기서열에서 서열 유사 부분이 차지하는 비중을 나타낸다. 구체적으로, 수송체 단백질들 간 염기서열 일치도는 NCBI BLASTp 알고리듬을 이용해 계산했으며， 표시된 염기서열 일치도는 상기 알고리듬의 정상적인 계산 방식에 따라 서열이 서로 크게 상이한 일부 서열은 생략하고, 남은 부분 (Query Coverage)내에 한정해 계산했다. 그 결과， 생략된 서열부분은 어떤 경우에도 1 에 미달하여 상기 서열 일치도 계산의 신뢰성이 매우 높았다는 것을 시사했다.
Tl iDEF 수송체의 Tl iD 와 다양한 T1SS ABC수송체와의 서열 일치도는 비교적 높은 것에서부터 비교적 낮은 것까지 다양하게 나타났다. 이 중 실시예 16， 17 , 18， 19에서 예로 든 AprD , PrtD , HlyB의 세 T1SS수송체들의 서열 일치도는 각각 60%， 59% , 27%로 나타났다.
이에， 본 발명자들은 단백질 과음전하화의 분비 증진 기술이 Pseudomonas fluorescens미생물 Tl iDEF수송체에 국한되지 않고， Tl iDEF와 27% 정도의 핵산서열 일치도 (동일성)을 갖는 다양한 T1SS 수송체들에서도 광범위하게 적용될 수 있음을 확인하였다.

Claims

【청구범위】
[청구항 1】
리파제 ATP 결합 카세트 (ABC) 트랜스포터 인식 도메인 (Lipase ABC transporter recogni t ion domain , LARD)을 암호화하는 핵산서열 및 목적 단백질을 암호화하는 핵산서열이 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하며，
상기 LARD와 목적 단백질은 산성 pi 값을 가지며 세포외로 분비되는 융합 단백질로 발현되는 것인， 세균에서 목적 단백질의 발현 및 세포외 분비용 발현 백터.
【청구항 2】
계 1항에 있어서,상기 발현 백터는，세균의 타입 1분비 시스템 (Type 1 Secret ion System, T1SS)의 ABC 수송체를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 것인， 발현 백터.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 세균은 타입 1 분비 시스템 (Type 1 Secret ion
System , T1SS)의 ABC수송체를 포함하는 세균인 것인， 발현 백터.
【청구항 4】
제 1항에 있어서, 상기 세균은 그람음성균인， 발현 백터 .
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상기 세균은 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 균주, 딕케야 Vde ) 속 균주， 대장균 (fe ?e ?/a) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인， 발현 백터.
【청구항 6】
제 2항에 있어서， 상기 세균의 타입 1 분비 시스템의 ABC 수송체는 슈도모나스 플루오레슨스의 Tl iDEF ^쏭^ (Pseudomonas fluorescens Tl iDEF)와 20 % 이상의 염기서열 동일성을 갖는 수송체인 것인， 발현 백터.
【청구항 7】
제 2항에 있어서, 상기 세균의 타입 1 분비 시스템의 ABC 수송체는 Pseudomonas fluorescens Tl iDEF , Pseudomonas aeruginosa의 AprDEF(PaAprDEF) , Dickeya dadantii ^ i/^ DdPrtDEF) , 또는 Escherichia ' coli HlyBD+TolC인， 발현 백터 .
【청구항 8】
겨 U항에 있어서， 상기 목적 단백질을 암호화하는 핵산서열은， 6 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 산성 펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 추가로 포함하는 것인， 발현 백터.
【청구항 9】
제 8항에 있어서， 상기 산성 펩타이드는 아스파라트산 (aspart i c acid) 및 글루탐산 (glutami c acid)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 이루어진 것인， 발현 백터.
【청구항 10】
제 8항에 있어서， 상기 산성 펩타이드는 서열번호 33(Asparat i c aci d 10개; D10) 의 아미노산서열을 포함하는 것인， 발현 백터.
【청구항 111
게 8항에 있어서， 상기 산성 펩타이드를 암호화하는 핵산서열은， 목적 단백질을 암호화하는 핵산서열의 3 ' -말단 또는 5 ' -말단에 위치하는 것인, 발현 백터.
【청구항 12】
제 1항에 있어서， 상기 목적 단백질을 암호화하는 핵산서열은 목적 단백질에 포함된 염기성 아미노산을 1개 이상 제거한 것인， 발현 백터.
【청구항 13】
제 12항에 있어서， 상기 염기성 아미노산은 리신 ( lysine) 및 아르기닌 (arginine)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인， 발현 백터.
【청구항 14]
제 1항에 있어서, 상기 목적 단백질은 과음전하화 (negat ively supercharged)된 목적 단백질인 것인， 발현 백터.
【청구항 15】
제 14항에 있어서， 상기 목적 단백질은 아래 단계를 거쳐 과음전하화된 목적 단백질인 것인， 발현 백터: 목적 단백질의 3차원 구조에서 작용기가 외부로 돌출되어 있어 치환되어도 목적 단백질의 구조에 영향을 미치지 않는 아미노산을 선별하는 단계， 및
상기 선별된 아미노산이 염기성 아미노산인 경우， 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환하거나，
상기 선별된 아미노산이 산성 아미노산인 경우， 라이신 및 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환하는 수동 과전하화 (Manual Supercharging) 기법을 사용해 과음전하화하는 단계 .
【청구항 16]
제 1항에 있어서， 상기 리파제 ABC트랜스포터 인식 도메인은 LARD 1， LARD 2， 또는 LARD 3 인 것인， 발현 백터.
【청구항 17】
제 1항 내지 제 16항 증 어느 한 항에 따른 발현 백터를 포함하는， 세포.
【청구항 18]
제 17항에 있어서 상기 세포는, 세균의 타입 1 분비 시스템 (Type 1 Secret ion System , T1SS)의 ABC 수송체를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 발현 백터를 추가로 포함하는 것인， 세포.
[청구항 19】
제 18에 있어서， 상기 세포는 타입 1 분비 시스템 (Type 1 Secret ion System , T1SS)의 ABC수송체를 포함하는 세균인 것인， 세포.
【청구항 20】
제 19항에 있어서, 상기 세포는 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 균주， 딕케야 ?/c±ej ) 속 균주, ^^균 Escherichia) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인， 세포.
【청구항 21]
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 백터로 형질전환된 세포를 제조하는 단계， 상기 세포를 배양하여 분비용 단백질을 생산하는 단계 및
상기 생산된 분비용 단백질을 분리 또는 정제하는 단계를 포함하는, 세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법 .
【청구항 22]
제 21항에 있어서 상기 세포는， Type 1 Secret ion System(TlSS)의 ABC 수송체를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 발현 백터를 추가로 포함하는 것인， 세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법.
【청구항 23]
상기 청구항 1항 내지 16항 중 어느 한 항의 백터를 세포에 삽입하는 단계를 포함하는， 세포에서 목적 단백질의 세포 외 분비를 증가시키는 방법 . 【청구항 24】
제 23항에 있어서 상기 세포는， Type 1 Secret ion System(TlSS)의 ABC 수송체를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 발현 백터를 추가로 포함하는 것인， 세포에서 목적 단백질의 세포 외 분비를 증가시키는 방법.
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