JP7016552B2 - 組換えタンパク質の分泌を増加させる方法 - Google Patents
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Description
本発明の一例によれば、前記発現ベクターは、細菌のT1SSのABC輸送体をコードする核酸配列を追加的に含むことができる。
前記細胞は、追加的に細菌のT1SSのABC輸送体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
前記細胞は、追加的に細菌のT1SSのABC輸送体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
w=-nFV=14.47n kJ/mol=3.5n kcal/mol
プラスミド製作および遺伝子クローニングは、E.coli XL1-BLUEで行った。タンパク質発現および分泌は、P.fluorescens SIK-W1(Son、M.、Moon、Y.、Oh、M.J.、Han、S.B.、Park、K.H.、Kim、J.G.、and Ahn、J.H.(2012) Lipase and protease double-deletion mutant of Pseudomonas fluorescens suitable for extracellular protein production.Appl Environ Microbiol 78、8454-8462)の二重遺伝子削除誘導体(double-deletion derivative)であるΔtliAΔprtA菌株で観察された。微生物は、30μg/mLのカナマイシン(kanamycin)を含んでいるLB培地(lysogeny broth)で培養した。リパーゼ活性を有する目的遺伝子(TliA、NKC-TliA、CTP-TliA)に対する酵素プレートアッセイ(enzyme plate assay)はミキサーで混合された0.5%コロイド性グリセリルトリブチレート(glyceryl tributylate)を含有するLB寒天培地で製造した。E.coliとP.fluorescensは、それぞれ37℃と25℃で培養した。E.coliの形質転換は標準熱ショック(heat-shock)方法に沿って行い、P.fluorescensは電気穿孔互換性(electrocompetent)細胞を作って標準電気穿孔(electroporation)プロトコルを使用し、2.5kVの125Ω、50μFで(Ausubel、M.F.(2014)Escherichia coli、Plasmids、and Bacteriphages.in Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、Inc.pp)電気穿孔で変換した。形質転換されたP.fluorescensは60μg/mLのカナマイシンを含むLB液体培地5mlを含む試験管で静止期(stationary phase)に到達するまで25℃180rpmの振盪培養機で培養した。上記条件で形質転換された細胞を液体LBに播種するか、または固体プレート活性アッセイにストリーキング(streaking)することによって、目標タンパク質の発現および分泌の両方に対して分析した。
プラスミドpDARTは、本発明者らの以前に他のタンパク質の分泌生産に使用したプラスミドを使用した(Ryu、J.、Lee、U.、Park、J.、Yoo、D.H.、and Ahn、J.H.(2015)A vector system for ABC transporter-mediated secretion and purification of recombinant proteins in Pseudomonas species.Appl Environ Microbiol 81、1744-1753)。プラスミドベクターpFD10およびpBD10は、前記pDARTのMCSの上流または下流位置に目的タンパク質に10個のアスパラギン酸コドンを付加して製造した、pDARTの誘導体である。十個のアスパラギン酸のDNA配列は合成されたGlycine max lunasin遺伝子(Galvez、A.F.、Chen、N.、Macasieb、J.、and de Lumen、B.O.(2001)Chemopreventive Property of a Soybean Peptide(Lunasin)That Binds to Deacetylated Histones and Inhibits Acetylation.Cancer Research 61、7473-7478)を鋳型として使用してPCRを通じて増幅した。pFD10およびpBD10に対してそれぞれ2個の異なるPCR産物を収得し、この時、それぞれ一つまたは二つの任意の塩基がプライマーの上流または下流に挿入されて翻訳フレームを維持させたためpFD10-とpBD10-に挿入されたタンパク質間に若干の大きさおよびpI差が存在する。
目的タンパク質は、His-tagのような精製tagによってFactor XaおよびLARD3から追加的に精製できる。
pDARTに挿入するために13個の目的遺伝子を選択した。抽出されたゲノムDNAサンプル(TliA、MBP、TrxおよびHsp40)、全体cDNA(EglV)、合成されたDNA生成物(NKC-TliA、CTP-TliA、MAP、lunasin、lunasin誘導体、GFPおよび過電荷化されたGFP)、他のプラスミド(この他のタンパク質)などからPCRで遺伝子を増幅させた。
48時間細胞を成長(分泌は成長過程全体で起こる)させれば、液体培養物が固定成長期に到達し、細胞密度が約1.5×109細胞/ml(OD600)=~3)程度に到達する。この時、液体培養液400μLを取って18,000rcfで10分間遠心分離して上清と細胞ペレットを分離した。その次に細胞ペレット抽出物と上清16μL-培養液(~0.048OD)をそれぞれ10%ポリアクリルアミドゲルにローディングした。大きさによってタンパク質を分離するためにSDS-PAGEを使用した。
%secretion=Ssupernatant/(Ssupernatant+Scell)×100%
ここで、Sはウェスタンブロットイメージの各帯域の標準化された信号の強度であり、下付き添え字はレーンのサンプルタイプを示す。
目的タンパク質の理論的なpI値は、ExPASy Compute pI/Mwツール(Wilkins、M.R.、Gasteiger、E.、Bairoch、A.、Sanchez、J.C.、Williams、K.L.、Appel、R.D.、and Hochstrasser、D.F.(1999)Protein identification and analysis tools in the ExPASy server.Methods Mol Biol 112、531-552)を使用して計算した。全体配列を使用し、LARD3と酵素部位から追加された任意の残基も含ませた。タンパク質のPI値とタンパク質の残基当り電荷密度の強い相関関係を分析した相関度を図11に示した。
本発明者らはパイモルソフトウェアで結果を視覚化し、分析に使用した全てのシークエンスは表2および表3に示した。
多様な大きさ、柔軟性、体積、重量などを有する13個の目標タンパク質の遺伝子(表4)にpDARTを通じてC-末端LARD3信号配列を付着してP.fluorescensΔtliAΔprtAに導入した。表4は遺伝子のリストとこれらの出所を示し、*で表示した遺伝子は本実験では使用しなかったが、以前の研究で分泌された遺伝子を示す。その後、当該細胞を液体培養した後、上清と細胞ペレットをウェスタンブロットで分析した(図1aおよび図1b)。
図2bに示したように、タンパク質pIと分泌効率間には弱い否定的相関関係があると見られるが、いくつかの例外もあることが確認された。
lunasinは、大豆Glycine maxから分離された抗癌ペプチドである。このタンパク質は、カルボキシル末端に9個の連続したアスパラギン酸(aspartic acid、Asp)配列があるという独特の特徴を有している。本発明者らはこれに霊感を受けて、アスパラギン酸ポリペプチド尾の長さが互いに異なるlunasinの誘導体を複数個製造した。
20個の最も普遍的なアミノ酸の中で、アスパラギン酸は最低pKa値を有する(Mathews、C.K.(2013)Biochemistry、4th ed.、Pearson、Toronto)。前記実施例7でのlunasinタンパク質配列によって霊感を受けて、本発明者らはLARD3信号配列だけでなくアスパラギン酸ポリペプチド配列も共に付着させる二つのプラスミドを開発した。
NKC-TliAおよびCTP-TliAは両方ともTliAの誘導体であり、それぞれのN-末端には塩基性ペプチドが付着されている。TliDEFを通じた分泌効率は野生型TliA(図1bおよび図10a、b)より顕著に低い。
緑蛍光タンパク質(GFP)、マンナナーゼ(Mannanase)、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびチオレドキシン(Thioredoxin)遺伝子をpDART、pFD10およびpBD10に導入して得られた組換えプラスミドをP.fluorescensに導入して形質転換されたタンパク質を製造した。生成されたタンパク質はTliDEF輸送体によって分泌され、前記実験結果を図6に示した。
MBPの分泌もpDARTに比べて上清/細胞比率の観点から見る時、pFD10およびpBD10で全て向上した(図6の(C))。
Trx(チオレドキシン)の場合、上清/細胞信号強度比率がpFD10とpBD10の両方で改善された(図6の(D))。
本発明者らは追加的に、pBD10と類似しているが、一つ差異点を有するプラスミドを製作した。このプラスミドは、MCSの次にアスパラギン酸ポリペプチドをコーディングするD10の代わりにアルギニンポリペプチドをコーディングするDNA配列であるR10が導入されている。
緑蛍光タンパク質(GFP)とAverage Number of Neighboring Atoms Per Sidechain Atom(AvNAPSA)(Lawrence MS、Phillips KJ、Liu DR.Supercharging Proteins Can Impart Unusual Resilience.Journal of the American Chemical Society 2007;129:10110-10112)方式で前記タンパク質を過電荷化(Supercharging)させたGFP誘導体であるGFP(-30)とGFP(+36)をpDARTを通じてLARD3と結合させ、P.fluorescensΔtliAΔprtAに導入してタンパク質を発現させた後、サンプルをウェスタンブロットで分析し、その結果を図8に示した。
Model proteinとしてNKC-TliA選定した。NKCは21個のアミノ酸から構成されており、両親媒性(amphiphilic)α-helixを形成するpeptideである。21個のアミノ酸はLysineを多く含んでおり、pI=10.78であってpI=5.01のTliA lipaseにfusionされてNKC-TliAを作ればpI=5.34になり、タンパク質の分泌が減る。
本発明者らは、タンパク質の電荷を変えて分泌効率が変わることを確認するためにタンパク質のアミノ酸を負電荷を帯びたアミノ酸で置換してタンパク質の分泌傾向を観察した。
MelC2チロシナーゼ、クチナーゼ(Cuti)、キチナーゼ(Chi)、そしてM37リパーゼをAvNAPSA方法で過負電荷化させた後、過負電荷化されたタンパク質(赤色)とそれに対応する過電荷化されなかった自然タンパク質(黒色)をそれぞれpDARTプラスミドに入れて発現させウェスタンブロットで検出し、その結果を図18に示した。
16-1.Escherichia coli HlyBD+TolC、Dickeya dadantii PrtDEF、Pseudomonas aeruginosa AprDEF分離
本発明者らは、pQE184プラスミドにTliAタンパク質(TliDEF輸送体の本来基質)の遺伝子を挿入したプラスミド一つと前記で製作した三種類の互いに異なる細菌から分離されたT1SS輸送体のうちの一種類を発現するプラスミド(即ち、Escherichia coli HlyBDを発現するpSTV-HlyBD、Dickeya dadantii PrtDEFを発現するpEcPrtDEF、Pseudomonas aeruginosa AprDEFを発現するpAGS8)のうちの一つを大腸菌に同時に熱衝撃法(Heat Shock Method)で導入してTliAと三つの輸送体のうちの一つを同時発現させた後、リパーゼ酵素活性測定培地で細胞外部への組換え目的タンパク質の分泌程度をコロニー周辺部培地の色変化を通じて測定し、その結果を図19に示した。
17-1.過負電荷化したクチナーゼタンパク質製造
クチナーゼ(Cutinase)タンパク質(Cuti)にAvNAPSA方法を使用して過負電荷化されたクチナーゼタンパク質(Cuti(-))を製造した。
クチナーゼ(Cutinase)タンパク質と過負電荷化したクチナーゼタンパク質にpUC19プラスミドを基盤として多重制限酵素部位(Multiple Cloning Site)直後にLARD3信号配列の遺伝子を挿入したpLARD3プラスミドにクチナーゼ遺伝子を挿入する方式でLARD3信号配列を付着した後、
クチナーゼタンパク質(Cuti)と過負電荷化されたクチナーゼタンパク質(Cuti(-))にLARD3信号配列を付着した後、実施例16の方法で得られた三種類の互いに異なるT1SS輸送体タンパク質と共に大腸菌で発現させて液体培養した後、ウェスタンブロットで細胞内および細胞外の該当タンパク質濃度を検出し、その結果を図21に示した。
M37リパーゼ(Lipase)タンパク質と過負電荷化されたM37リパーゼ(M37(-))にLARD3信号配列を付着した後、実施例16の方法で得られた三種類の互いに異なるT1SS輸送体タンパク質と共に大腸菌で発現させて液体培養した後、ウェスタンブロットで細胞内および細胞外の該当タンパク質濃度を検出し、その結果を図22に示した。
シュードモナス・フルオレセンスのTliDEF輸送体のTliDとEscherichia coli HlyBD+TolC、Dickeya dadantii PrtDEF、Pseudomonas aeruginosa AprDEFのT1SSABC輸送体およびその他の種類のT1SS輸送体のABCタンパク質と配列同一性(Sequence Identity)を測定し、その結果を図23に示した。図23は、TliDEF輸送体と多様なT1SS輸送体間の塩基配列同一性(Sequence Identity)および全体塩基配列で配列類似部分が占める比重を示す。
Claims (14)
- (i) 細菌のタイプ1分泌システム(Type 1 Secretion system、T1SS)のATP結合カセット(ABC)輸送体をコードする核酸配列、
(ii) リパーゼABC輸送体認識ドメイン(Lipase ABC transporter recognition domain、LARD)をコードする核酸配列、および
(iii) 目的タンパク質をコードする核酸配列
が作動可能に連結された発現カセットを含む、細菌における目的タンパク質の細胞外分泌用発現ベクターであって、
前記細菌は、グラム陰性菌であり、
前記LARDと目的タンパク質は、1から6のpI値を有する融合タンパク質として発現されるものであり、
前記融合タンパクは、
a)目的タンパク質に6~20個のアミノ酸からなる酸性ペプチドをコードする核酸配列を付加するか、
b)目的タンパク質中の塩基性アミノ酸の少なくとも1つを欠失させるか、または
c)目的タンパク質を過負電荷化(negatively supercharged)することにより、目的タンパク質をコードする核酸配列を得ることにより、細菌から細胞外に分泌される、
細菌における目的タンパク質の細胞外分泌用発現ベクター。 - 前記細菌は、タイプ1分泌システム(Type 1 Secretion system、T1SS)のABC輸送体を含む細菌である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記細菌は、シュードモナス(Pseudomonas)属菌株、ディッケヤ(Dickeya)属菌株、大腸菌(Escherichia)属菌株からなる群より選択された少なくとも1つである、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記T1SSのABC輸送体は、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)のTliDEF、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)のAprDEF(PaAprDEF)、ディッケヤ・ダダンティー(Dickeya dadantii)のPrtDEF(DdPrtDEF)、または大腸菌(Escherichia coli)のHlyBD+TolCである、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記酸性ペプチドは、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択された少なくとも1種のアミノ酸からなるものである、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記酸性ペプチドは、配列番号33(アスパラギン酸 10個;D10)のアミノ酸配列を含むものである、請求項1から5のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 前記酸性ペプチドをコードする核酸配列は、目的タンパク質をコードする核酸配列の3’-末端または5’-末端に位置するものである、請求項1から6のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 前記塩基性アミノ酸は、リシン(lysine)およびアルギニン(arginine)からなる群より選択される、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記目的タンパク質は、下記の工程を実施して得られた過負電荷化された目的タンパク質である、請求項1から8のいずれか一項に記載の発現ベクター:
目的タンパク質の3次元構造で官能基が外部に突出していて置換されても目的タンパク質の構造に影響を与えないアミノ酸を選別する工程、および
前記選別されたアミノ酸が塩基性である場合、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択された少なくとも1つのアミノ酸で置換するか、
前記選別されたアミノ酸が酸性である場合、リシンおよびアルギニンからなる群より選択された少なくとも1つのアミノ酸で置換する手動過電荷化(Manual Supercharging)技法を使用して過負電荷化する工程。 - 前記リパーゼABC輸送体認識ドメイン(LARD)は、LARD1、LARD2、またはLARD3である、請求項1から9のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 請求項1~10のうちのいずれか一項による発現ベクターを含む、細胞。
- 前記細胞は、シュードモナス(Pseudomonas)属菌株、ディッケヤ(Dickeya)属菌株、大腸菌(Escherichia)属菌株からなる群より選択された少なくとも1つである、請求項11に記載の細胞。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の発現ベクターで形質転換された細胞を製造する工程、
前記細胞を培養して分泌タンパク質を生産する工程、および
前記生産された分泌タンパク質を分離または精製する工程を含む、細胞で目的タンパク質を生産する方法。 - 請求項1~10のいずれか一項のベクターを細胞に挿入する工程を含む、細胞で目的タンパク質の細胞外分泌を増加させる方法。
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