WO2014125955A1 - 抗体のリフォールディング方法、リフォールディングされた抗体の製造方法、リフォールディングされた抗体、及びこれらの利用 - Google Patents

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陽一 熊田
泰行 石川
勇佐 藤原
通雅 岸本
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    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin

Definitions

  • the present invention relates to a method for antibody refolding, a method for producing a refolded antibody, a refolded antibody, and use thereof.
  • antibodies have been widely used in various fields including biotechnology, medicine and food. Since each antibody has a specific activity, an antibody corresponding to the purpose is selected and used based on the activity. Various methods for producing antibodies are also known, and it is possible to mass-produce desired antibodies.
  • Patent Document 1 a method for refolding a denatured protein including a step of dropping the denatured protein in a refolding buffer containing arginine, reduced glutathione and oxidized glutathione has been reported ( Patent Document 1). Moreover, a method including a step of refolding a membrane protein in the presence of a surfactant has been reported (Patent Document 2). In addition, after a peptide having an anchoring portion for binding to an active solid phase containing a metal ion coordinated to a metal chelate ligand is adsorbed to the solid phase surface by chelate bonding, the peptide is immobilized on the solid phase surface.
  • Patent Document 3 has been reported to be refoldable. It has also been reported that the three-dimensional structure of the peptide can be repaired on the solid phase surface after adsorbing the specific peptide on the solid phase surface (Patent Documents 4 and 5).
  • an object of the present invention is to provide a means that can efficiently refold an antibody having a desired activity. More specifically, an object of the present invention is to provide a method for refolding an antibody in a liquid phase, which can efficiently refold a desired antibody. Another object of the present invention is to provide a method for efficiently producing a refolded antibody in a liquid phase, and a refolded antibody obtained by the method. Another object of the present invention is to provide a method for immobilizing an antibody refolded by the above-described method onto a substrate, and a substrate on which the antibody refolded by the method is immobilized.
  • the present invention relates to a composition for antibody refolding in a liquid phase, an auxiliary agent for antibody refolding in a liquid phase, a peptide expression vector for antibody refolding in a liquid phase, It is an object of the present invention to provide a peptide-linked antibody expression vector for antibody refolding, a transformant obtained by using the vector, an antibody to which a peptide obtained from the transformant is linked, and the like.
  • the inventors of the present invention performed refolding of a denatured inactive antibody in an isoelectric point lower than that of the inactive antibody in the liquid phase. It has been found that the refolding can be efficiently carried out by using a peptide having the above, and thus the desired antibody can be efficiently obtained.
  • the present invention has been completed by further studies based on this finding.
  • Item 1 (1-1) a step of denaturing an inactive antibody in which a peptide is linked directly or via a linker, wherein the peptide has an isoelectric point lower than the isoelectric point of the inactive antibody; as well as, (1-2) Dispersing the inactive antibody denatured in the step (1-1) to which the peptide is linked in a liquid phase; A method for refolding an antibody in a liquid phase.
  • the antibody is at least one selected from the group consisting of a single chain antibody, Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, single domain antibody, multivalent single chain antibody, constant region fusion single chain antibody and full length antibody.
  • the refolding method according to Item 1 which is a seed.
  • Item 3. Item 3. The refolding method according to Item 1 or 2, wherein the peptide has an isoelectric point of 8.5 or less.
  • Item 4. Item 4. The refolding method according to any one of Items 1 to 3, wherein the peptide is a peptide having affinity for a substrate.
  • Item 5. Item 5. The refolding method according to any one of Items 1 to 4, wherein the linker is a peptide having affinity for a substrate.
  • (2-1) a step of denaturing an inactive antibody in which a peptide is linked directly or via a linker, wherein the peptide has an isoelectric point lower than the isoelectric point of the inactive antibody; as well as, (2-2) A step of dispersing the inactive antibody modified with the peptide linked in the step (2-1) in a liquid phase, A method for producing a refolded antibody, comprising: Item 7.
  • the antibody is at least one selected from the group consisting of a single chain antibody, Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, single domain antibody, multivalent single chain antibody, constant region fusion single chain antibody and full length antibody.
  • Item 7. The production method according to Item 6, which is a seed.
  • Item 6 or 7 wherein the peptide has an isoelectric point of 8.5 or less.
  • Item 9. The production method according to any one of Items 6 to 8, wherein the peptide is a peptide having affinity for a substrate.
  • Item 10. The production method according to any one of Items 6 to 9, wherein the linker is a peptide having an affinity for a substrate.
  • Item 11. Item 11.
  • Item 12. Item 10. For antibody refolding in a liquid phase, comprising a peptide having an isoelectric point lower than that of the inactive antibody according to any one of Items 1, 3, 4, 6, 8, and 9. Auxiliary agent.
  • a method for immobilizing a refolded antibody on a substrate comprising the step of: Item 14.
  • Item 14. The immobilization method according to Item 13, wherein the antibody is immobilized on the substrate via a peptide linked to the antibody.
  • Item 15. The peptide having an isoelectric point lower than the isoelectric point of the inactive antibody is a peptide shown in the following (a) or (b), and the substrate is selected from the group consisting of polycarbonate and polymethyl methacrylate Item 15.
  • A a peptide comprising the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4,
  • B at least one selected from the group consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of (a), and consisting of polycarbonate and polymethyl methacrylate A peptide having an affinity for.
  • Item 16. A substrate on which an antibody refolded by the immobilization method according to any one of Items 13 to 15 is immobilized.
  • Item 18. The composition according to Item 17, further comprising a solution having a pH of 0.5 or more higher than the isoelectric point of an inactive antibody to which the peptide is linked directly or via a linker.
  • a polynucleotide encoding an antibody and a polynucleotide encoding a peptide having an isoelectric point lower than the isoelectric point of the antibody are linked directly or via a linker Peptide-linked antibody expression vector.
  • Item 20. Item 20. A transformant obtained by introducing the vector according to Item 19 into a host cell for transformation.
  • Item 21. Item 21. An antibody obtained by linking peptides obtained from the transformant of Item 20.
  • the present invention it is possible to efficiently refold an inactive antibody to an antibody having a desired activity. As described above, since the present invention can efficiently obtain an antibody having a desired activity, the production cost of the antibody can be reduced. Therefore, according to the present invention, the antibody can be provided at a lower cost. It becomes.
  • a peptide having an isoelectric point lower than the isoelectric point of the inactive antibody used in the present invention has the ability to adsorb to the substrate, the desired activity obtained by refolding can be obtained.
  • the antibody provided can be immobilized on the substrate via the peptide in a state in which the activity is retained, more easily, efficiently, at a higher density, and more uniformly in the orientation. .
  • another peptide having an adsorption ability to the substrate is further linked to the antibody targeted by the present invention. be able to. From this, even if the peptide having an isoelectric point lower than the isoelectric point of the inactive antibody used in the present invention does not have the ability to adsorb to the substrate, the ability to adsorb to the substrate An antibody having a desired activity obtained by refolding can be more easily, efficiently, and denser, and more orientated in a state where the activity is retained through the another peptide having It can be controlled to be uniform and fixed to the substrate.
  • an antibody having a desired activity can be efficiently obtained, and a highly accurate substrate on which an antibody having a desired activity is immobilized can be obtained more simply and efficiently. it can.
  • Such the present invention contributes to further spread of antibody utilization technology in various fields including biotechnology, medicine and food.
  • FIG. 1 shows the results of refolding using an anti-CEA antibody.
  • FIG. 2 shows the results of refolding using an anti-CEA antibody.
  • FIG. 3 shows the results of refolding using an anti-RNase antibody.
  • FIG. 4 shows the results of refolding using an anti-RNase antibody.
  • FIG. 5 shows the results of refolding using an anti-CRP antibody.
  • FIG. 6 shows the results of refolding using an anti-CRP antibody.
  • FIG. 7 shows the refolding results for each antibody (anti-TSH antibody, anti-IgA antibody, anti-IgG antibody, anti-TF189 antibody).
  • FIG. 8 shows the results of immobilizing the refolded antibody to the substrate (PM).
  • FIG. 9 shows the result of refolding in an antibody in which a low isoelectric point peptide and an affinity peptide are linked (PS).
  • FIG. 10 shows the refolding result in an antibody in which a low isoelectric point peptide and an affinity peptide are linked (SiN).
  • FIG. 11 shows the result of immobilizing the refolded antibody to the substrate (PM).
  • FIG. 12 shows the result of immobilizing the refolded antibody to the substrate (PS).
  • FIG. 13 shows the results of refolding heavy chain Fab and light chain Fab (anti-CEA antibody).
  • FIG. 14 shows the results of refolding heavy chain Fab and light chain Fab (anti-RNase antibody).
  • FIG. 15 shows the results of refolding heavy chain Fab and light chain Fab (anti-TF189 antibody).
  • FIG. 16 shows the results of refolding heavy chain Fab and light chain Fab (anti-AFP antibody).
  • FIG. 17 shows the results of activity evaluation of the refolded heavy chain Fab and light chain Fab (anti-CEA antibody).
  • FIG. 18 shows the results of activity evaluation of the refolded heavy chain Fab and light chain Fab (anti-RNase antibody).
  • FIG. 19 shows the results of activity evaluation of the refolded heavy chain Fab and light chain Fab (anti-TF189 antibody).
  • FIG. 20 shows the results of refolding camel antibody VHH.
  • FIG. 21 shows the results of immobilization of the refolded VHH on a substrate and evaluation of activity.
  • the present invention will be described below.
  • Method for refolding antibody in liquid phase The method for refolding an antibody in the liquid phase of the present invention comprises (1-1) an inactive antibody in which peptides are linked directly or via a linker. And (1-2) dispersing the inactive antibody to which the peptide is linked, which has been modified in the step (1-1), in a liquid phase.
  • the peptide has an isoelectric point lower than that of the inactive antibody.
  • the step (1-1) in the present invention is a step of denaturing an inactive antibody in which the peptide is linked directly or via a linker.
  • the antibody refers to any antibody, and is not particularly limited.
  • a single-chain antibody Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, single domain antibody (nanobody, variable domain domain of heavy chain chain of molecular chain antibody (VHH) Etc.), multivalent single chain antibodies, constant region fusion single chain antibodies, full-length antibodies (including inks etc.) and the like.
  • the peptide used in the step (1-1), that is, a peptide having an isoelectric point lower than that of the inactive antibody is higher than the isoelectric point (pI) of the inactive antibody.
  • pI isoelectric point
  • the isoelectric point of the peptide is not limited as long as it is lower than the isoelectric point of the inactive antibody as described above, but a preferable isoelectric point of the peptide is 8.5 or less, more preferably 8 or less, still more preferably. Is 7.5 or less, more preferably 7 or less.
  • the peptide is not limited as long as the above explanation is satisfied, but is preferably a peptide having 5 to 50 amino acid residues, more preferably 5 to 41 amino acid residues, still more preferably 10 to 31 amino acids. What is a residue is illustrated.
  • Examples of the peptide having such an isoelectric point and the number of amino acid residues preferably include those containing 2 or more acidic amino acid residues, more preferably 3 to 20, more preferably acidic amino acid residues. Examples include those containing 4 to 15 residues.
  • the peptide satisfying the number of acidic amino acid residues is preferably exemplified by those having more acidic amino acid residues than basic amino acid residues, more preferably one or more, more preferably acidic amino acid residues. Examples thereof include those having 2 to 25, more preferably 4 to 20 more acidic amino acids than the number of basic amino acid residues.
  • acidic amino acid refers to aspartic acid and glutamic acid
  • basic amino acid refers to lysine, arginine, and histidine.
  • the isoelectric point of “the inactive antibody and the peptide are directly linked” is preferably lower than the isoelectric point of “inactive antibody” by 0.3 or more. More preferably, the isoelectric point can be lowered by about 0.3 to 5, more preferably about 0.3 to 4. Further, as such a peptide, the isoelectric point of “the inactive antibody and the peptide are linked via a linker” is more preferable than the isoelectric point of “inactive antibody”. Examples are those that can be lowered by 0.3 or more, more preferably those that can lower the isoelectric point by about 0.3 to 5, and even more preferably those that can lower by about 0.3 to 4.
  • the peptide preferably has an isoelectric point of 3.5 to 7 as a whole, wherein the inactive antibody and the peptide are linked directly or via a linker. More preferably, the total isoelectric point can be about 3.5 to 7, more preferably the total isoelectric point can be about 4 to 6.5. What can be mentioned.
  • the peptide having an isoelectric point lower than that of the inactive antibody used in the present invention is selected in consideration of the isoelectric point of the inactive antibody to which it is linked. Those skilled in the art can easily select the inactive antibody and the peptide to be used.
  • the isoelectric point is a value calculated using commercially available software Genetyx ver6 (manufactured by GENETICS Co., Ltd.). The isoelectric point is calculated according to the program based on the above. For example, the isoelectric point of an antibody calculated in the present invention is calculated as the same value regardless of its activity or inactivity as long as the amino acid sequence of the antibody is the same. That is, in the present invention, the isoelectric point of “inactive antibody” and the isoelectric point of “antibody” are the same.
  • the peptide is not limited as long as it has an isoelectric point lower than that of the inactive antibody as described above.
  • a peptide composed of aspartic acid and / or glutamic acid, the residue of aspartic acid and / or glutamic acid A peptide having a number of radicals greater than the number of residues of basic amino acids, a peptide comprising an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4, and two or more amino acid sequences represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4 Peptides and peptides consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequences of these peptides.
  • the peptide includes those called oligopeptides, polypeptides, and proteins depending on the number of amino acid residues.
  • the range of “one or more” is not limited as long as the effect of the present invention is exerted. For example, 1 to 15, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and further preferably 1 To 4, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1 or 2.
  • a technique for deleting, substituting and / or adding one or more amino acids in a specific amino acid sequence is known.
  • the peptide thus deleted, substituted and / or added include, for example, a peptide composed of aspartic acid and / or glutamic acid, a peptide in which the number of residues of aspartic acid and / or glutamic acid is larger than the number of residues of basic amino acids, 50% or more of the peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4 or the amino acid sequence of a peptide having two or more amino acid sequences represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4
  • Peptides that consist of amino acid sequences having identity and exhibit the effects of the present invention are exemplified.
  • the amino acid identity of the peptide is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, and still more preferably 98%. That'
  • the peptide is not limited as long as it has the above-mentioned characteristics.
  • the refolded antibody when it is immobilized on any substrate, it can be directly or directly attached to the inactive antibody from the viewpoint of simply immobilizing the antibody on the substrate.
  • a peptide having an isoelectric point lower than the isoelectric point of the inactive antibody, which is linked via a linker hereinafter sometimes referred to as a low isoelectric point peptide
  • the peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4 has an affinity for polycarbonate and / or polymethyl methacrylate.
  • the peptide which has is illustrated.
  • the affinity, the base material, and the binding conditions thereof are explained in the same manner as described later.
  • the inactive antibody obtained by linking the peptide directly or via a linker is not limited as long as the peptide and the inactive antibody are linked directly or via a linker, and the linking site is also limited.
  • an inactive antibody may be linked to one or more of the above-mentioned peptides directly or via a linker, or may be linked to multiple types of said peptides directly or via a linker. Good.
  • linking sites are not limited as long as the effects of the present invention can be obtained, but examples include sites that do not hinder the desired activity in the refolded antibody.
  • the peptide is preferably linked in addition to the variable region of the antibody, more preferably the C-terminal side and / or the N-terminal side of the antibody variable region, The C-terminal side is more preferable than the variable part of the antibody.
  • linkers are not limited as long as the effects of the present invention are obtained, and those skilled in the art may determine appropriately using conventionally known techniques within a normal examination range.
  • the peptide has an affinity for the substrate, from the viewpoint of easily fixing the antibody refolded as described above to the substrate, it has an affinity for the substrate as a linker. (Hereinafter sometimes referred to as affinity peptide) may be used.
  • Such an affinity peptide is not limited as long as the effect of the present invention is not limited and has an affinity for the substrate, but as an example, the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 5-52 , A peptide comprising histidine, a TAT peptide, and the like.
  • the peptides represented by SEQ ID NOs: 5 to 8 have affinity for polycarbonate and / or polymethyl methacrylate
  • the peptides represented by SEQ ID NOs: 9 to 28 have hydrophilic properties such as hydrophilic polystyrene.
  • the peptide represented by SEQ ID NOs: 29 to 52 has affinity for silicon, and the peptide composed of histidine is divalent such as nickel, zinc, copper, cobalt, and iron.
  • the TAT peptide has an affinity for phospholipid bilayers represented by cell membranes and the like.
  • these peptides are each made of a polycarbonate and / or polymethyl methacrylate substrate, a hydrophilic resin substrate, a silicon nitride substrate, a metal substrate, or a phospholipid bilayer membrane. It has affinity for the base material to which is attached. The details of the substrate will be described as described later.
  • the affinity peptide includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 5 to 52, and the predetermined peptide Peptides having affinity for the base material are exemplified.
  • the deletion, substitution and / or addition of one or more amino acids in these amino acid sequences is also explained in the same manner as described above, and is not limited as long as it has an affinity for a substrate.
  • the peptide applicable to the said low isoelectric point peptide is used preferably as a low isoelectric point peptide which has affinity to the base material mentioned above.
  • affinity peptide may be linked to a portion other than between the inactive antibody and the low isoelectric point peptide.
  • the affinity peptide may be further linked to another arbitrary linker such as the flexible linker.
  • the lower isoelectric point peptide and the inactive antibody further between the low isoelectric point peptide, the affinity peptide, and the inactive antibody, the lower
  • the cleavage site may be linked so that the electric point peptide, affinity peptide and / or antibody can be cleaved.
  • the cutting method is not limited, and may be appropriately determined by a person skilled in the art using a conventionally known technique within a normal examination range.
  • a cleavage is exemplified by a conventionally known restriction enzyme.
  • a restriction enzyme-cleavable site may be linked as necessary, and an inactive antibody is refolded. After that, it is exemplified that it can be cleaved with a conventionally known restriction enzyme.
  • an example in which an affinity peptide is further linked includes, but is not limited to, inactive antibody-low isoelectric point peptide, inactive Antibody-affinity peptide-low isoelectric point peptide, inactive antibody-low isoelectric point peptide-affinity peptide, inactive antibody-affinity peptide-low isoelectric point peptide-affinity peptide, affinity peptide -Inactive antibody-Low isoelectric point peptide and the like.
  • the refolded antibody can be easily fixed to the base material via the low isoelectric point peptide.
  • the low isoelectric point peptide does not have an affinity for the base material, for example, by linking the above-described affinity peptide, the refolded antibody is used as the base material via the affinity peptide.
  • the refolded antibody is used as the base material via the affinity peptide.
  • the low isoelectric point peptide after refolding the antibody, the low isoelectric point peptide is cleaved and the remaining affinity peptide is removed.
  • the refolded antibody can be easily fixed to the substrate.
  • having affinity in the present invention may be determined based on whether or not a peptide can be directly bound to a substrate, and it can be said that it has affinity if directly bound.
  • affinity since the affinity differs depending on the peptide, when the antibody is immobilized on the substrate via the peptide having affinity, the antibody can be more easily selected by appropriately selecting the peptide having affinity and the substrate. Can be fixed to a substrate.
  • affinity peptide examples include those described above, and suitable base materials for these peptides include the aforementioned polymethyl methacrylate base material, polycarbonate base material, hydrophilic resin base material, and silicon nitride base material, respectively. Examples are base materials.
  • a substrate made of polymethyl methacrylate has a polymethyl methacrylate whose surface is not modified in part and / or the entire surface of the substrate, and There is no limitation as long as the peptide having affinity for the polymethyl methacrylate can bind to the polymethyl methacrylate surface.
  • a base made of polymethyl methacrylate is a base made of polymethyl methacrylate, or a base made by laminating and / or coating polymethyl methacrylate on a part or the whole of one composed of other components. Etc.
  • a hydrophilic resin base material means that a hydrophilic resin whose surface is not modified is partly and / or entirely on the surface of the base material, and the hydrophilic resin surface is The peptide is not limited as long as the peptide having affinity for the hydrophilic resin can bind thereto.
  • a hydrophilic resin base material is a base material made of a hydrophilic resin, or a base material in which a hydrophilic resin is laminated and / or coated on a part or the whole surface of another component. And a substrate having a hydrophilic resin surface.
  • hydrophilic resin examples include hydrophilic resins such as polystyrene, polymethyl methacrylate, polycarbonate, polypropylene, polyethylene, and polydimethylsiloxane.
  • hydrophilic resins such as polystyrene, polymethyl methacrylate, polycarbonate, polypropylene, polyethylene, and polydimethylsiloxane.
  • polystyrene, polypropylene, polyethylene and the like are hydrophobic, but when these resins are used on the surface of the base material, the surface is made hydrophilic by making it hydrophilic.
  • the hydrophilization treatment may be appropriately performed by a conventionally known method such as chemical treatment, electron beam irradiation treatment, ozone oxidation treatment, plasma treatment, corona treatment, and ultraviolet irradiation treatment.
  • the “silicon nitride substrate” means that silicon nitride whose surface is not modified is partly and / or entirely on the surface of the substrate, and the silicon nitride affinity peptide can bind to the silicon nitride surface.
  • the silicon nitride base material includes a base material made of silicon nitride, and a base material in which silicon nitride is laminated and / or coated on a part or the whole surface of another component.
  • the above-mentioned “polycarbonate substrate”, “metal substrate”, and “substrate having a phospholipid bilayer membrane” can be explained in the same manner, and those skilled in the art can easily explain these substrates. Can be obtained.
  • Inactive antibodies low isoelectric point peptides, affinity peptides and the like can be prepared by a conventionally known genetic engineering method or chemical synthesis method.
  • inactive antibodies and these peptides may be obtained by isolation and purification from antibodies and / or microorganisms capable of producing the peptides.
  • the peptide may be obtained by synthesis by a conventionally known chemical synthesis method in accordance with information on the amino acid sequence of the peptide or the nucleotide sequence encoding the peptide.
  • Chemical synthesis methods include peptide synthesis methods using liquid phase methods and solid phase methods. Whether or not the acquired peptide has an affinity for the substrate may be determined based on whether or not the acquired peptide can directly bind to the substrate.
  • the binding conditions may be appropriately determined according to the type of peptide to be used and the substrate, or according to the antibody to be immobilized on the substrate.
  • the peptide is used as a substrate in an arbitrary buffer such as PBS. It is only necessary to determine whether or not the obtained peptide can be directly bound to the substrate by contacting with.
  • An inactive antibody to which a low isoelectric point peptide is linked, or an inactive antibody to which an affinity peptide is further linked can be prepared using, for example, a cross-linking agent.
  • a polynucleotide encoding a low isoelectric point peptide, a polynucleotide encoding an antibody, and a polynucleotide encoding an affinity peptide as necessary are inserted into a vector or the like, and then the vector is incorporated. After culturing the transformant, a desired peptide may be obtained.
  • the overall isoelectric point of the “inactive antibody in which the peptide is linked directly or via a linker” used in the present invention varies depending on the isoelectric point of the antibody to be used.
  • the isoelectric point as a whole is preferably 3.5 to 7.5, more preferably about 3.5 to 7, and still more preferably about 4 to 6.5. .
  • the step (1-1) of the present invention is a step of denaturing an inactive antibody in which the peptide is linked directly or via a linker.
  • denaturation as used herein means solubilization of the aforementioned inactive antibody.
  • the inactive antibody has a protein-modifying performance such as a denaturing agent, a reducing agent, a chaotropic agent, and a surfactant.
  • a denaturing agent such as a denaturing agent, a reducing agent, a chaotropic agent, and a surfactant.
  • An example is that an inactive antibody is denatured and solubilized by the action of a drug.
  • drugs include urea (eg, 8M), guanidine hydrochloride (eg, 6M), SDS (sodium lauryl sulfate, eg, 1%), sodium thiocyanate (eg, 4M), potassium thiocyanate (eg, 4M), ⁇ -Mercaptoethanol, dithiothreitol and the like can be mentioned.
  • urea eg, 8M
  • guanidine hydrochloride eg, 6M
  • SDS sodium lauryl sulfate, eg, 1%
  • sodium thiocyanate eg, 4M
  • potassium thiocyanate eg, 4M
  • ⁇ -Mercaptoethanol dithiothreitol and the like
  • an inactive antibody refers to an antibody that does not fully exhibit the specific activity of the antibody.
  • an antibody when an antibody is produced using recombinant Escherichia coli as a host, most of the antibody may be recovered as an insoluble and inactive aggregate (inclusion body).
  • inclusion body An antibody in the state of body) is exemplified.
  • the inactive antibody denatured in the step (1-1) to which the peptide is linked is refolded into an antibody having a desired activity by dispersing it in a liquid phase. It is a process to do. More specifically, in the step (1-2), an inactive antibody to which the peptide is linked is dispersed in a liquid phase in a state where it is not fixed to a solid phase such as a base material, thereby obtaining a desired This is a step of refolding into an antibody having activity.
  • examples thereof include a base material, a gel and the like to which a double membrane is attached.
  • examples of dispersion in the liquid phase include denatured, inactive antibodies to which the peptide is linked, dispersion in the liquid phase by dilution, dispersion in the liquid phase by dialysis, and dispersion in the liquid phase using gel chromatography. There is a restriction such as dispersion, and there is no limitation as long as the modified inactive antibody in which the peptide is linked directly or via a linker is further dispersed in the liquid phase.
  • Such dispersion is not limited as long as the denatured inactive antibody to which the peptide is linked is refolded.
  • the peptide just before being dispersed in the liquid phase in the step (1-2) is used.
  • the inactive antibody to which the denatured peptide is linked is put into a liquid phase so that the concentration of the drug in contact with the inactive antibody to which the denatured peptide is linked is reduced to, for example, 1/10 to 1/100. It is exemplified that it is distributed.
  • Those skilled in the art can also set the temperature and time for dispersion in the liquid phase as appropriate, and can be carried out, for example, according to examples described later.
  • the solution that can be used for dispersion in the liquid phase can disperse the above-mentioned modified, inactive antibody to which the peptide is linked, in the liquid phase, and can refold the inactive antibody. If it is a solution, it will not restrict
  • examples of such a solution include a solution such as a buffer solution described in Examples described later, and the ionic strength, composition, and the like of the solution may be appropriately set as necessary.
  • a solution whose pH is 0.5 or more higher than the isoelectric point of the whole inactive antibody in which the peptide is linked directly or via a linker is exemplified, preferably a pH higher than the isoelectric point.
  • the ionic strength of the solution that can be used for dispersing the antibody in such a liquid phase is preferably exemplified by a NaCl concentration of 0 to 500 mM, and the ionic strength is low.
  • an NaCl concentration of 0 to 300 mM is more preferable
  • an NaCl concentration of 0 to 150 mM is more preferable.
  • the present invention can also be said to provide a composition for antibody refolding, which composition contains an inactive antibody in which the peptide is linked directly or via a linker, more preferably , Containing an inactive antibody denatured as described above and linked to the peptide.
  • the composition further contains a solution capable of refolding an inactive antibody to which the peptide is linked, if necessary, and preferably the peptide is linked directly or via a linker.
  • a solution having a pH of 0.5 or more higher than the isoelectric point of the whole inactive antibody more preferably a solution having a pH of 0.5 to 4.5 higher than the isoelectric point, and more preferably A solution having a pH 1 to 4 higher than the electric point may be contained, and a solution having a pH 1.5 to 4 higher than the isoelectric point may be particularly preferably contained.
  • Inactive antibodies can be more easily refolded by using the composition, and the refolded antibody may be contained in the composition from the viewpoint of the progress of refolding in the composition.
  • refolding has the meaning usually used in the field of the present invention, and the antibody is non-aggregated (non-inclusion body) from an inactive state such as an aggregate or inclusion body, and is characteristic of the antibody It will be in a state where the activity of can be demonstrated. If an antibody in such a non-aggregate (non-inclusion body) state is present in the liquid phase, it can be said that the inactive antibody has been refolded. Alternatively, if an antibody having such a desired activity is present in the liquid phase, it can be said that the inactive antibody has been refolded.
  • the present invention can efficiently perform refolding, and the refolding efficiency is determined by the amount of antibody in an aggregate (inclusion body) state in the liquid phase and the non-aggregate (non-inclusion body). The amount of antibody in the non-aggregate (non-inclusion body) state is judged to be higher in refolding efficiency.
  • the absorbance of the obtained liquid phase or comparing the antibody concentration in the liquid phase before centrifugation and the antibody concentration in the supernatant obtained after centrifugation, It is judged that the refolding efficiency is higher as the absorbance is lower in the former and as the antibody concentration in the supernatant obtained after centrifugation is higher than the antibody concentration in the liquid phase before centrifugation in the latter. More specifically, for example, based on the examples using dialysis described below, the absorbance of the solution containing the antibody obtained after refolding is measured, or the solution containing the antibody obtained after refolding is centrifuged.
  • Judgment can be made by comparing the antibody concentration in the previous solution with the antibody concentration in the supernatant obtained after centrifugation.
  • the former the lower the absorbance, the latter in the liquid phase prior to centrifugation against the antibody concentration in the liquid phase.
  • the higher the antibody concentration in the supernatant obtained later the higher the refolding efficiency.
  • the antibody concentration (or weight) in the solution immediately before loading on the column is compared with the antibody concentration (or weight) eluted from the column. It can be said that the higher the ratio of the latter to the former, the more efficiently the antibody was refolded.
  • antibody refolding in the liquid phase means that the inactive antibody denatured in the step (1-1) and linked with the peptide is the step (1).
  • this method the refolding efficiency of an inactive antibody can be improved, and thus an antibody having a desired activity can be obtained with high efficiency. From this, it can be said that this method is also a method of increasing the refolding efficiency of an inactive antibody.
  • the inactive antibody used here is linked to a peptide having affinity
  • the peptide having affinity after refolding of the antibody as described in the immobilization method described later.
  • the desired antibody can be immobilized on the base material simply, with high accuracy and high efficiency, which contributes to the provision of the base material on which the desired antibody is fixed with higher accuracy and high efficiency. To do.
  • the inactive antibody can be efficiently refolded by linking the low isoelectric point peptide to the inactive antibody in this way, the low isoelectric point peptide can be refolded in the liquid phase.
  • It can be called an auxiliary agent. Therefore, the present invention provides an antibody refolding aid in the liquid phase, which comprises a peptide having an isoelectric point lower than that of the antibody.
  • the auxiliary agent is used to improve antibody refolding efficiency.
  • the auxiliary that is, the low isoelectric point peptide, is explained in the same manner as described above.
  • the present invention provides the low isoelectric point peptide directly or via a linker. It can also be said to provide an inactive antibody or a refolded antibody that is linked.
  • the method for producing a refolded antibody of the present invention comprises (2-1) a step of denaturing an inactive antibody in which a peptide is linked directly or via a linker, and ( 2-2) Dispersing the inactive antibody modified with the peptide linked in the step (2-1) in a liquid phase.
  • the peptide has an isoelectric point lower than that of the inactive antibody.
  • a peptide having an isoelectric point lower than that of an inactive antibody, an antibody, an inactive antibody, an inactive antibody in which the peptide is linked directly or via a linker, a linker, a denaturation, a solution Phase, dispersion, denaturation and dispersion conditions, antibody refolding, and the like are described in the same manner as described above.
  • an affinity peptide as a linker, the base material etc. are demonstrated similarly to the above-mentioned.
  • a refolded antibody is produced, and in particular, the refolded antibody can be produced efficiently.
  • an unnecessary peptide can be cleaved as necessary. What is necessary is just to make it connect, and to cleave an unnecessary peptide using a restriction enzyme etc. after refolding.
  • an antibody in which the peptide is linked can be efficiently obtained.
  • the production method of the present invention is a method for increasing the production efficiency of the refolded antibody.
  • the refolded antibody thus obtained is linked to a peptide having affinity for the substrate, it can be obtained via the peptide having affinity if necessary. Therefore, the present invention contributes to the provision of a highly accurate substrate in various analyzes and the like.
  • a method for immobilizing a refolded antibody on a substrate, and a substrate on which an antibody refolded by the immobilization method is immobilized includes: A step of contacting a substrate with the antibody refolded by the above-described antibody refolding method in the liquid phase and / or the refolded antibody obtained by the above-described method for producing a refolded antibody It is characterized by doing.
  • the method for refolding the antibody in the liquid phase the method for producing the refolded antibody, and the refolded antibody are as described above.
  • the method for immobilizing a refolded antibody to a substrate of the present invention comprises a step of bringing the refolded antibody obtained as described above into contact with the substrate, whereby the refolded antibody Is fixed to the substrate.
  • the immobilization method of the present invention is not limited as long as the above-mentioned refolded antibody is immobilized on a substrate, but from the viewpoint of more easily immobilizing the antibody, a low isoelectric point preferably linked to the above-mentioned antibody is preferred.
  • the refolded antibody with the peptide linked is immobilized on the substrate, and more preferably has an affinity for the substrate linked to the aforementioned antibody.
  • the above-mentioned refolded antibody is immobilized through the peptide while the peptide is linked.
  • the peptides unnecessary for immobilization are as described above. It is preferable to cleave using a restriction enzyme or the like. As a specific example of this, if the aforementioned low isoelectric point peptide itself has affinity for the substrate, the antibody refolded via the low isoelectric point peptide is immobilized on the substrate. That's fine.
  • the low isoelectric point peptide itself does not have an affinity for the substrate, for example, a refolded antibody linked like an antibody-affinity peptide-low isoelectric point peptide is used. After acquisition, the antibody-affinity peptide and the low isoelectric point peptide are cleaved, and the former is brought into contact with the substrate to fix the refolded antibody to the substrate via the affinity peptide. That's fine.
  • the affinity differs depending on the peptide, when the antibody is immobilized on the substrate via the peptide having affinity, the antibody can be more easily selected by appropriately selecting the peptide having affinity and the substrate. Can be fixed to a substrate.
  • suitable substrates for these include a polymethyl methacrylate substrate, a polycarbonate substrate, a hydrophilic resin substrate, and a silicon nitride substrate.
  • the above-mentioned base materials such as materials are exemplified. These substrates are also described in the same manner as described above.
  • the shape of the substrate is not limited as long as the peptide can be bound.
  • any shape such as a plate shape, a film shape (sheet shape), a spherical shape, a granular shape (bead shape), a fibrous shape, a microplate shape, a cylindrical shape, etc.
  • shape when the substrate of the present invention is used as a biochip such as a protein chip, the silicon nitride substrate is preferably exemplified by a plate shape, a film shape (sheet shape) and the like.
  • the contact conditions are also described in the same manner as described above.
  • the contact conditions described in the examples described later may be adopted, and if those skilled in the art appropriately determine with reference to the conditions shown in the examples.
  • Good for example, an arbitrary solution such as a buffer containing an antibody to which the peptide having affinity is linked, such as a PBS solution, is brought into contact with the substrate for a certain period of time to bind the peptide to the substrate.
  • the solution can be diluted as necessary, or the pH and the like can be changed and bonded to the substrate.
  • the immobilization method of the present invention since the refolded antibody recovered efficiently can be simply immobilized on the base material, the base material on which the refolded antibody is immobilized can be efficiently obtained. .
  • the refolded antibody when the refolded antibody is linked to a peptide having affinity for the base material, the antibody is simply and densely fixed to the base material through the peptide while maintaining the activity. Furthermore, it can be controlled and fixed so that the orientation of the antibody becomes more uniform. From this, the present invention can immobilize the desired antibody more simply, with high accuracy and with high efficiency.
  • the present invention since the base material on which the refolded desired antibody is immobilized with higher accuracy and efficiency can be easily produced, the present invention provides a biochip such as a protein chip. First, it also facilitates the manufacture of column packing materials that utilize antigen-antibody reactions, enzyme reactions, and the like, and microplates in the ELISA method. From this, the immobilization method and substrate of the present invention are useful in all fields such as clinical examination, drug discovery research, environmental monitoring, biochemistry and the like.
  • a peptide-linked antibody expression vector for antibody refolding in the liquid phase of the present invention comprises a polynucleotide encoding an antibody, A polynucleotide encoding a peptide having an isoelectric point lower than that of the antibody is linked directly or via a linker.
  • the peptide-linked antibody expression vector is not particularly limited as long as it contains a polynucleotide described later and can express the peptide-linked antibody in the host cell based on the base sequence of the polynucleotide.
  • the peptide-linked antibody expression vector is used for the purpose of efficiently performing refolding in a liquid phase of an antibody that is expressed using this vector and in which the peptide is linked directly or via a linker.
  • the liquid phase, the antibody, the refolding, the antibody, the peptide having an isoelectric point lower than the isoelectric point of the antibody, the linker, and the like are described in the same manner as described above.
  • the polynucleotide is described as follows.
  • the polynucleotide encoding a peptide having an isoelectric point lower than that of the antibody used in the present invention is an antibody in which the isoelectric point of the expressed peptide is linked to the peptide directly or via a linker. Any polynucleotide that encodes a low isoelectric point peptide described in the above-mentioned “1. Refolding method of antibody in liquid phase” is exemplified.
  • the polynucleotide is not limited as long as it is a polynucleotide encoding the low isoelectric point peptide.
  • the polynucleotide encoding a peptide comprising aspartic acid and / or glutamic acid, the number of residues of aspartic acid and / or glutamic acid is a basic amino acid
  • a polynucleotide encoding a peptide having more than the number of residues a polynucleotide encoding a peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4, for example, a nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 53 to 56
  • polynucleotides having two or more base sequences of these polynucleotides are exemplified.
  • hybridize under stringent conditions means that two polynucleotide fragments can hybridize with each other under standard hybridization conditions. This condition is defined as Sambrook et al., Molecular Cloning. : A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. More specifically, “stringent conditions” means performing hybridization at about 45 ° C. in 6.0 ⁇ SSC and washing at 50 ° C. with 2.0 ⁇ SSC.
  • the polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand usually has a certain identity or more with the aforementioned nucleotide sequence, and the identity is exemplified by 70% or more, preferably It is 85% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, still more preferably 99% or more.
  • Nucleotide sequence identity can be determined using commercially available or analytical tools available through telecommunications lines such as the Internet, and can be calculated using software such as FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH.
  • polynucleotides can be prepared by using a conventionally known genetic engineering technique or chemical synthesis method (Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983). ); Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); For example, a cDNA library may be prepared from a suitable source including a microorganism having a desired polynucleotide according to a conventional method, and the desired polynucleotide may be obtained from the library using an appropriate probe or the like. Those skilled in the art can easily analyze and obtain the peptide based on the amino acid sequence of the peptide based on a conventionally known method.
  • amino acid sequences encoded by the polynucleotides represented by any of SEQ ID NOs: 53 to 56 correspond to the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4, respectively. For example, they are represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4. Based on the amino acid sequence information, nucleotide sequence information represented by any of SEQ ID NOs: 53 to 56, or based on the above-mentioned peptide sequence information, etc. Can be prepared and acquired.
  • the polynucleotide encoding the antibody is linked upstream or downstream of the polynucleotide encoding the low isoelectric point peptide, and the polynucleotide encoding the peptide is linked inside the antibody molecule. This can be determined by those skilled in the art as appropriate. In any case, it is preferable to link at a position where the physiological activity and three-dimensional structure of the antibody are not impaired.
  • the above-mentioned linker or cleavage site may be further connected to the peptide-linked antibody expression vector of the present invention as necessary.
  • the base sequence constituting the linker is not limited as long as the effect of the present invention is obtained, and may be appropriately determined by a person skilled in the art within the normal examination range using a conventionally known technique. Examples of such a linker include the aforementioned flexible linker, and a nucleotide sequence that can suitably express the linker may be appropriately connected to the vector.
  • affinity peptide when used as the linker, the above-mentioned examples are exemplified as the affinity peptide, and the polynucleotide encoding the affinity peptide is also described in the same manner as described above.
  • a polynucleotide encoding an affinity peptide a polynucleotide encoding a peptide containing the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 5-52, for example, a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 57-86 , A polynucleotide encoding a peptide consisting of histidine, a polynucleotide encoding a TAT peptide, and the like.
  • examples include polynucleotides that hybridize under stringent conditions to the complementary strand of any of these polynucleotides, and the stringent conditions and procedures for producing each polynucleotide are the same as described above. Explained.
  • a linker site such as an affinity peptide is not limited in the site of connection to the peptide-linked antibody expression vector, but is preferably placed under the control of the promoter.
  • polynucleotides may be linked in this order in the vector.
  • the other linkers and cleavage sites may be further appropriately connected as necessary.
  • the base sequence constituting the low isoelectric point peptide or the base sequence constituting the linker can be linked to any position such as the 5 ′ end side and / or the 3 ′ end side of the polynucleotide encoding the antibody,
  • the polynucleotide encoding the peptide or the linker is preferably linked to a base sequence other than that constituting the variable part of the antibody.
  • the 5 ′ terminal side and / or the 3 ′ terminal side is more preferable than the base sequence constituting it, and the 3 ′ terminal side is still more preferable than the base sequence constituting the variable part of the antibody.
  • the vector is generally appropriately selected from the relationship with the host cell as conventionally known. More specifically, the vector used in the present invention is not limited as long as it is an expression vector generally used in the field of genetic engineering, and pBR, pUC, pCD, pET, pGEX, pCMV, pMSG, pSVL. And plasmid vectors derived from bacteria such as Escherichia coli and yeasts, retroviruses, adenoviruses, vaccinia viruses, baculoviruses, and phages. These vectors are appropriately selected from the relationship with the host cell as described above.
  • a promoter is connected to these vectors as necessary, and the promoter is not limited as long as it is a promoter suitable for the host cell, and a conventionally known promoter can be used.
  • the promoter include lac promoter, trp promoter, tac promoter, trc promoter, racA promoter, ⁇ PL promoter, lpp promoter, T7 promoter and the like, which are used when, for example, E. coli is used as a host cell.
  • Examples of the promoter include SV40 promoter, CMV promoter, RSV promoter, HSV-TK promoter, LTR promoter, SR ⁇ promoter, EF-1 ⁇ promoter, etc., which are used when, for example, animal cells are used as host cells. .
  • promoters such as a promoter for yeast cells, a promoter for insect cells, and a viral promoter can be used as the promoter.
  • a promoter for yeast cells a promoter for insect cells
  • a viral promoter a promoter for viral promoter
  • an endogenous promoter may be used in a vector in which a promoter is endogenous.
  • connection position of the promoter in the peptide-linked antibody expression vector of the present invention is not limited as long as the peptide-linked antibody is expressed in the host cell.
  • the promoter is connected upstream of the base sequence of the polynucleotide encoding the peptide-linked antibody. That is, in the peptide-linked antibody expression vector of the present invention, the polynucleotide encoding the peptide-linked antibody is under the control of the promoter.
  • prokaryotic cells As the host cell, various conventionally known prokaryotic cells and eukaryotic cells can be used. Bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptococcus, Staphylococcus, Actinomycetes, filamentous fungi, yeast, Aspergillus, Drosophila S2, Spodoptera Sf9 Cells such as insects, L cells, CHO cells, COS cells, Art-20 cells, HeLa cells, C127 cells, myeloma cells, GH3 cells, FL cells, VERO cells, CV-1 cells, Bowes melanoma cells, Examples include cells such as animals and plants such as oocytes such as Xenopus.
  • Bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptococcus, Staphylococcus, Actinomycetes, filamentous fungi, yeast, Aspergillus, Drosophila S2, Spodoptera Sf9 Cells
  • vectors, promoters and host cells may be used in appropriate combinations based on the common general technical knowledge in this field.
  • pET T7 promoter
  • E. Coli BL21 DE3
  • pGEX Tac promoter
  • E. Coli BL21 E. Coli BL21
  • the peptide expression vector of the present invention may further be connected to a base sequence such as an enhancer, splicing signal, poly A addition signal, drug resistance gene, marker gene such as Green Fluorescent Protein (GFP).
  • a base sequence such as an enhancer, splicing signal, poly A addition signal, drug resistance gene, marker gene such as Green Fluorescent Protein (GFP).
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the peptide-linked antibody expression vector of the present invention may be prepared by a method known in the art, including a polynucleotide encoding the peptide and a polynucleotide encoding the antibody using a restriction enzyme or the like. What is necessary is just to arrange and arrange
  • the present invention also provides a transformant obtained by introducing the peptide-linked antibody expression vector into a host cell and transforming it.
  • examples of the host cell include the aforementioned host cells.
  • a method for obtaining a transformant by introducing a peptide-linked antibody expression vector into a host cell is not particularly limited, and may be performed according to a conventionally known general method. For example, it can be performed according to the methods described in many standard laboratory manuals, including specific methods such as calcium chloride method, rubidium chloride method, DEAE-dextran mediated transfection, microinjection, liposomes and other cations. And lipid mediated transfection, electroporation, transduction, infection with phages, and the like.
  • the present invention also provides an antibody obtained by linking the peptide obtained from the transformant.
  • the transformant, peptide, and antibody are as described above.
  • the antibody formed by linking the peptide is a peptide fusion antibody in which the peptide and the antibody are integrated by linking them as described above.
  • the antibody to which the peptide is linked can be produced by culturing the transformant in an appropriate medium and recovering the desired peptide fusion antibody from the transformant and / or culture.
  • the method for culturing and collecting is not particularly limited, and may be performed according to a conventionally known general method.
  • the culture may be performed by subculture or batch culture using any medium suitable for the host cell, and an appropriate amount of peptide fusion antibody can be obtained using the amount of protein produced inside and outside the transformant as an index. You can do it until it is done.
  • various media commonly used according to host cells may be appropriately selected, and culture conditions such as temperature and time may be carried out under conventionally known conditions suitable for host cells.
  • the peptide fusion antibody thus obtained is further separated by various separation operations utilizing its physical properties, chemical properties, etc., for example, operations such as solvent extraction, distillation, various chromatography, etc., if necessary. It may be purified ("Biochemistry Data Book II", pages 1175-1259, 1st edition, 1st edition, 1980, published by Tokyo Chemical Co., Ltd .; Biochemistry, 25 (25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987), etc.).
  • the peptide fusion antibody thus obtained is preferably used for the antibody refolding method in the liquid phase and the production method of the refolded antibody.
  • Test Example 1 Evaluation of anti-CEA scFv refolding efficiency 1.
  • a peptide having a structure having the structure shown in Examples 1-1 to 1-3 and Comparative Example 1 below and having an isoelectric point lower than that of an inactive antibody is linked. Active antibodies were prepared.
  • Example 1-1 a peptide (PM) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and a histidine residue were added to a single-chain antibody (anti-CEA scFv) against carcinoembryonic antigen (CEA). (His) is connected linearly.
  • a peptide (D5) consisting of 5 aspartic acid residues, and the aspartic acid residue, respectively. It has the same structure as in Example 1 except that a peptide consisting of 10 groups (D10) was used.
  • the “isoelectric point” is a value calculated from the amino acid sequence of the antibody in which the peptides of Examples 1-1 to 1-3 are linked or the antibody in which histidine is linked in Comparative Example 1. It is a value calculated by inputting an amino acid sequence according to the procedure using commercially available software Genetyx ver6 (manufactured by Genetics Co., Ltd.).
  • Example 1-1 anti-CEA scFv-PM-His (isoelectric point 4.9)
  • Example 1-2 anti-CEA scFv-D5-His (isoelectric point 4.7)
  • Example 1-3 anti-CEA scFv-D10-His (isoelectric point 4.4)
  • Comparative Example 1 anti-CEA scFv-His (isoelectric point 5.3)
  • SEQ ID NO: 56 a nucleotide sequence in which six histidine residues were linked to the 3 ′ end side of a polynucleotide (SEQ ID NO: 56) encoding a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 was synthesized, and this was synthesized into a pET22 vector (Merck It was introduced into the Not I / Xho I site.
  • anti-CEA scFv was amplified by PCR and introduced into the NdeI / NotI site of the vector.
  • an expression vector for preparing Example 1-1 linked in the order of T7 promoter / Lac operator ⁇ RBS ⁇ start codon (ATG) -anti-CEA scFv ⁇ the peptide-Stop codon ⁇ T7 terminator was prepared. Obtained.
  • Example 1-2 or Example 1-3 a polynucleotide consisting of 5 consecutive aspartic acid residues, or a polynucleotide consisting of 10 consecutive aspartic acid residues
  • An expression vector for producing Example 1-2 or Example 1-3 was obtained in the same manner except that was used.
  • an expression vector for preparing Comparative Example 1 was obtained in the same manner as Example 1-1, except that a polynucleotide encoding a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 was not used.
  • Rosetta registered trademark
  • DE3DECompetentetCells Novagen
  • the cells are collected by centrifugation, and 5 mL of PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na 2 HPO 4 8.1 mM, KH 2 PO 4 1.47 mM (pH 7.4)) is added and sonicated and centrifuged.
  • PBS NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na 2 HPO 4 8.1 mM, KH 2 PO 4 1.47 mM (pH 7.4)
  • the inclusion bodies were collected by, and the inclusion bodies were washed three times with distilled water and then lyophilized. In this way, an inactive antibody in which the peptide was linked was obtained in the form of a powder.
  • the powdered inclusion body thus obtained was solubilized in a 6M guanidine hydrochloride solution (25 ° C., 10 minutes), centrifuged (25 ° C., 10,000 rpm, 15 minutes), and the supernatant was collected.
  • a His-Trap® HP column manufactured by GE Healthcare
  • the antibody is adsorbed onto the column and eluted with 2xPBS containing 8M urea and 0.4M imidazole.
  • the resulting eluate is dialyzed against PBS containing 8M urea to terminate the inactive antibody to which the peptide is linked.
  • a solution containing a concentration of 500 ⁇ g / mL was obtained.
  • a liquid phase for refolding to be described later is prepared in a BDconFlacon (registered trademark) 96 well microplate well (manufactured by Nippon Becton Dickinson) and denatured as described above.
  • Antibody was dispersed in each well to a final concentration of 200 ⁇ ug / mL (0.5 M Uera) (total volume 200 uL).
  • the liquid phase at pH 6 is 0.05M MES Good Buffer (trade name MES (2- (N-Morpholino) ethanesulfonic Acid), manufactured by Nacalai Tesque), pH 6.5.
  • MES Good Buffer trade name MES (2- (N-Morpholino) ethanesulfonic Acid
  • ADA Good Buffer (trade name ADA (N- (2-Acetamido) iminodiacetic Acid), manufactured by Nacalai Tesque)
  • MOPS Good Buffer (trade name MOPS (3- (N-Morpholino ) propanesulfonic acid (made by Nacalai Tesque)
  • pH 7.5 liquid phase is 0.05M HEPES good buffer (trade name HEPES (2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid), Nacalai Tesque )
  • PH8 liquid phase is 0.05M EPPS good buffer (trade name EPPS (N- (2-Hydroxyethyl) piperazine-N'-3-propanesulfonic acid, manufactured by Nacalai Tesque))
  • pH8.5 liquid phase is 0.05 Using M TAPS good buffer (trade name TAPS (N-Tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic Acid),
  • each liquid phase in the figure is the peptide in the microplate well. Is the value in the liquid phase after dispersing the inactive antibody formed by ligation.
  • the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured with a microplate reader every 30 minutes from the start of the incubation for a total of 6 hours while incubating at room temperature.
  • the obtained absorbance was evaluated as an index of aggregates. The higher the absorbance value, the more aggregates, that is, the more unrefolded antibodies remain.
  • FIGS. Each figure shows the results measured after 6 hours of incubation.
  • the results obtained using Example 1-1 (anti-CEA scFv-PM-His) and Comparative Example 1 (anti-CEA scFv-His) are shown in FIG.
  • FIG. 1 shows that the smaller the OD value, the less insoluble and inactive antibodies are aggregated, that is, the smaller the OD value, the higher the refolding efficiency.
  • pH 6.0-, 0 mM indicates that refolding was performed by dispersing in a liquid phase of pH 6, no NDSB added, NaCl 0 mM, and pH 6.0+, 50 mM. What is shown shows that refolding was carried out by dispersing in a liquid phase of pH 6, NDSB 0.5 M, NaCl 50 mM.
  • pH 6.0 ⁇ and pH 6.0+ each show four bars, which are in order from the left, that is, Comparative Example 1 (anti-CEA in FIG. 1).
  • the inactive antibody to which the peptide having an isoelectric point lower than the isoelectric point of the inactive antibody is denatured is denatured and dispersed in the liquid phase so that the peptide is not linked. It was confirmed that the refolding efficiency of the antibody was remarkably improved as compared with the case of using the antibody.
  • Test Example 2 Evaluation of anti-RNase scFv refolding efficiency 1.
  • a peptide having the structure shown in Examples 2-1 to 2-5 and Comparative Example 2 below and having an isoelectric point lower than that of an inactive antibody is linked. Active antibodies were prepared.
  • Example 2-1 anti-RNase scFv-PM-His (isoelectric point 5.96)
  • Example 2-2 anti-RNase scFv-D5-His (isoelectric point 5.75)
  • Example 2-3 anti-RNase scFv-D10-His (isoelectric point 4.93)
  • Example 2-4 anti-RNase scFv-D15-His (isoelectric point 4.55)
  • Example 2-5 anti-RNase scFv-D20-His (isoelectric point 4.32)
  • Comparative Example 2 anti-RNase scFv-His (isoelectric point 7.26)
  • Examples 2-1 to 2-3 and Comparative Example 2 are the same as Examples 1-1 to 1-3 and Comparative Example 1 of Test Example 1 except that a single-chain antibody against RNase was used as the antibody. Then, an inactive antibody prepared by linking peptides having an isoelectric point lower than that of the inactive antibody was prepared.
  • a single-chain antibody against RNase is used as an antibody, and instead of a peptide consisting of 5 aspartic acid residues, a peptide consisting of 15 aspartic acid residues (D15) or a peptide consisting of 20 aspartic acid residues (D20)
  • the peptide having an isoelectric point lower than that of the inactive antibody shown in Examples 2-4 and 2-5 is linked in the same manner as in Example 1-2 of Test Example 1 except that An inactive antibody was prepared.
  • a polynucleotide comprising 5 consecutive aspartic acid residues used in Example 1-2 instead of the polynucleotide comprising 15 consecutive aspartic acid residues or 20 consecutive aspartic acids.
  • Expression vectors for producing Examples 2-4 and 2-5 were used in the same manner except that a polynucleotide comprising acid residues was used.
  • Example 2-1 was significantly smaller than that in Comparative Example 2.
  • the inactive antibody in which a peptide having an isoelectric point lower than that of the inactive antibody is denatured is denatured and dispersed in the liquid phase to thereby produce the peptide. It was confirmed that the refolding efficiency of the antibody can be remarkably improved as compared with the case of using the antibody not linked to.
  • Test Example 3 Evaluation of anti-CRP scFv refolding efficiency 1.
  • a peptide having the structure shown in Examples 3-1 to 3-5 and Comparative Example 3 and having an isoelectric point lower than that of an inactive antibody is linked. Active antibodies were prepared. The test was conducted in the same manner as in Test Example 2 except that a single-chain antibody against C-reactive protein (CRP, C-reactive protein), which is an antibody different from Test Example 2, was used.
  • CRP C-reactive protein
  • Example 3-1 anti-CRP scFv-PM-His (isoelectric point 5.9)
  • Example 3-2 anti-CRP scFv-D5-His (isoelectric point 5.8)
  • Example 3-3 anti-CRP scFv-D10-His (isoelectric point 5)
  • Example 3-4 anti-CRP scFv-D15-His (isoelectric point 4.6)
  • Example 3-5 anti-CRP scFv-D20-His (isoelectric point 4.4) Comparative Example 3: anti-CRP scFv-His (isoelectric point 6.6)
  • Example 3-1 was significantly smaller than that in Comparative Example 3.
  • the inactive antibody in which the peptide having an isoelectric point lower than that of the inactive antibody is denatured is denatured and dispersed in the liquid phase to thereby produce the peptide. It was confirmed that the refolding efficiency of the antibody can be remarkably improved as compared with the case of using the antibody not linked to.
  • Test Example 4 Evaluation of scFv refolding efficiency of Anti-TSH, Anti-IgA, Anti-IgG or Anti-TF189 1.
  • TSH, IgA, IgG, or TF189 is used as an antibody, it has an isoelectric point lower than that of an inactive antibody having the structure shown in Examples 4 to 7 in the same manner.
  • An inactive antibody having a peptide linked thereto was prepared and tested in the same manner.
  • Example 4 anti-TSH scFv-PM-His (isoelectric point 6.41)
  • Example 5 anti-IgA scFv-PM-His (isoelectric point 6.49)
  • Example 6 anti-IgG scFv-PM-His (isoelectric point 6.14)
  • Example 7 anti-TF189 scFv-PM-His (isoelectric point 5.86)
  • Test Example 5 Calculation of refolding efficiency
  • the inactive antibodies shown in Example 1-1, Example 2-1, Example 3-1, Example 4 and Comparative Example 1 were modified and renatured as follows. The refolding efficiency in these was calculated by performing folding.
  • the inactive antibody to which each of the peptides was linked was diluted in PBS containing 8M urea to a final concentration of 500 ⁇ g / mL.
  • the inactive antibody in which each of the peptides thus modified was linked was dispersed in a liquid phase (0.05 M TAPS good buffer, pH 8.5, NDSB201 added, NaCl concentration 0 mM) by dialysis for 18 hours. (Final concentration 0.5M Uera). Centrifugation was performed at 10,000 g and 25 ° C. for 2 minutes, and the supernatant was collected.
  • Example 1-1 the refolding efficiency in Example 1-1 was 91.2%, which was a recovery rate that exceeded the refolding efficiency of 43.9% in Comparative Example 1 by more than twice. Further, the refolding efficiency was 88% in Example 2-1, 90% in Example 3-1, and 93% in Example 4, all of which were highly efficient.
  • Test Example 6 Immobilization of refolded antibody on substrate 1.
  • the peptide (PM) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 has affinity for a polymethyl methacrylate (PMMA) base material.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • the peptide is a single-chain antibody. It is connected to. From this, by contacting the refolded antibody to which the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 obtained as described above was linked with a base material made of polymethyl methacrylate, It was investigated whether the antibody refolded through the peptide could be immobilized on the substrate well.
  • the one obtained by refolding the comparative example 2 was used.
  • 0.05M TAPS good buffer was used, and a liquid phase adjusted to pH 8.5, no NDSB201 added, and NaCl concentration of 0 mM was used.
  • each antibody obtained after refolding was serially diluted 2 times with PBS, added 100 ⁇ L each in a polymethylmethacrylate microplate, and incubated at 4 ° C. overnight.
  • PBST PBS-0.1% Tween 20
  • 300 ⁇ L of 2% BSA-PBST was added and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • 100 ⁇ L of biotinylated RNase (antigen) diluted to 100 ng / mL with 2% BSA-PBST was added and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • Example 2-1 the activity on the substrate was improved depending on the concentration of the refolded antibody.
  • Comparative Example 2 in which the peptide was not linked the activity based on the refolded antibody was remarkably low. This confirms that the peptide used in Example 2-1 maintains good and specific affinity for polymethyl methacrylate even after antibody denaturation and refolding. It was also confirmed that the antibody refolded as described above sufficiently retains its specific activity.
  • Test Example 7 Evaluation of refolding efficiency in an antibody in which a low isoelectric point peptide and an affinity peptide are linked 1.
  • the antibody refolding efficiency was compared in the same manner as in Test Example 2 except that the following affinity peptides were linked in addition to the peptides linked in Example 2-4.
  • the following PS is an affinity peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and has affinity for hydrophilic polystyrene.
  • the following SiN is an affinity peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, and has affinity for silicon nitride.
  • a cleavage site that can be cleaved by an enzyme was linked between PS and D15.
  • Example 8-2 a cleavage site was linked between SiN and D15 in Example 8-2. Further, in place of the low isoelectric point peptide of Example 2-4, those having the affinity peptide linked thereto were designated as Comparative Example 4 (PS) and Comparative Example 5 (SiN).
  • PS Comparative Example 4
  • SiN Comparative Example 5
  • the polynucleotide encoding the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is represented by SEQ ID NO: 61
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence peptide represented by SEQ ID NO: 29 is represented by SEQ ID NO: 63.
  • Example 2-4 anti-RNase scFv-D15-His (isoelectric point 4.55)
  • Example 8-1 anti-RNase scFv-PS-D15-His (isoelectric point 5)
  • Example 8-2 anti-RNase scFv-SiN-D15-His (isoelectric point 4.83)
  • Comparative Example 2 anti-RNase scFv-His (isoelectric point 7.26)
  • Comparative Example 4 anti-RNase scFv-PS-His (isoelectric point 8.97)
  • Comparative Example 5 anti-RNase scFv-SiN-His (isoelectric point 8.14)
  • FIGS. FIG. 9 shows the results using PS
  • FIG. 10 shows the results using SiN.
  • an inactive antibody linked with a peptide having an isoelectric point lower than that of the inactive antibody has a low OD
  • the antibody has a low OD.
  • Refolding efficiency could be increased.
  • the affinity peptide SiN in the case of an inactive antibody to which a peptide having an isoelectric point lower than that of the inactive antibody is linked, the antibody rebound is reduced. Folding efficiency could be increased.
  • Test Example 8 Immobilization of refolded antibody on substrate 1. Using Example 2-1, Example 2-4, and Example 8-1, the refolded antibody is refolded through the peptide by contacting with a polymethyl methacrylate substrate. It was examined whether the prepared antibody could be immobilized on the substrate well.
  • Example 8-1 and Comparative Example 4 in accordance with Test Example 7 respectively (liquid phase 0.05M TAPS good buffer, pH 8.5, no addition of NDSB201, (NaCl concentration 0 mM), and the refolded antibody with each peptide linked is prepared in PBS so that the concentration of the refolded antibody is 50 ug / mL, and this is added to a polymethylmethacrylate substrate (microplate) in 100 uL aliquots. Incubated for 2 hours at 25 ° C.
  • the substrate was washed 5 times with PBST, and then 300 uL of PBST containing 2% BSA (2% BSA-PBST) was added and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • biotin-labeled RNase was diluted with 2% BSA-PBST to be 0 to 1 ug / mL, added 100 uL at a time, and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • HRP-labeled streptavidin was diluted with 2% BSA-PBST to 0.2 ug / mL, 100 uL was added and incubated at 25 ° C.
  • Example 2-4 and Example 8-1 were used in the same manner as described above except that the polymethylmethacrylate base material (microplate) was replaced with a hydrophilic polystyrene base material (microplate). The degree of fixation with respect to a hydrophilic polystyrene substrate was measured.
  • the antibody refolded in 1 the antibody refolded on the polymethylmethacrylate base material is immobilized at a high density by the effect of the PM linked to the refolded antibody.
  • a higher signal was obtained compared to other refolded antibodies not linked to a peptide having affinity for methyl methacrylate.
  • Test Example 9 Evaluation of refolding efficiency of heavy chain Fab and light chain Fab 1.
  • the single chain antibody in Example 1-1 (anti-CEA scFv-PM-His) was replaced with a heavy chain Fab antibody against CEA (Fab H) or a light chain Fab antibody against CEA (Fab L).
  • the inactive peptide obtained by linking peptides having an isoelectric point lower than that of the inactive antibody shown in Example 9-1 and Example 9-2 below Antibody was produced.
  • the single chain antibody in Example 2-1 anti-RNase scFv-PM-His
  • Example 9-1 peptides having an isoelectric point lower than that of the inactive antibody shown in Examples 9-3 and 9-4 below are linked. Inactive antibodies were made. Further, the single chain antibody in Example 7 (anti-TF189 scFv-PM-His) was replaced with a heavy chain Fab antibody (Fab H) against TF189 or a light chain Fab antibody (Fab L) against TF189. In the same manner as in Test Example 4, the inactive peptide consisting of a peptide having an isoelectric point lower than the isoelectric point of the inactive antibody shown in Examples 9-5 and 9-6 below is linked. Antibody was produced. Similarly, in the same manner as in Example 9-1 etc.
  • Example 9-7 anti-CEA Fab H-PM-His (isoelectric point 4.91)
  • Example 9-2 anti-CEA Fab L-PM-His (isoelectric point 5.81)
  • Example 9-3 anti-RNase Fab H-PM-His (isoelectric point 6.32)
  • Example 9-4 anti-RNase Fab L-PM-His (isoelectric point 5.55)
  • Example 9-5 anti-TF189 Fab H-PM-His (isoelectric point 6.54)
  • Example 9-6 anti-TF189 Fab L-PM-His (isoelectric point 5.33)
  • Example 9-7 anti-AFP Fab H-PM-His (isoelectric point 7.29)
  • Example 9-8 anti-AFP Fab L-PM-His (isoelectric point 5.81)
  • the obtained inactive antibodies obtained by linking the peptides having a low isoelectric point was prepared.
  • Example 9-1 anti-CEA Fab H-PM-His (isoelectric point 4.91)
  • Example 9-2 anti-
  • FIGS. 13 to 16 show the results for CEA, RNase, TF189, and AFP, respectively. As is clear from these results, it was confirmed that the OD value was small and refolding was performed efficiently.
  • Test Example 10 Calculation of refolding efficiency In Test Example 9, the conditions of Examples 9-1 and 9-2 coexist (anti-CEA Fab-PM-His (H + L)), and Examples 9-3 and 9 -4 coexisting (anti-RNase Fab-PM-His (H + L)), Example 9-5 and 9-6 coexisting (anti-TF189 Fab-PM-His (H + L) )), The refolding efficiency was calculated by performing denaturation and refolding in the same manner as in Test Example 5.
  • the refolding efficiency was 93% for anti-CEA Fab-PM-His (H + L), 100% for anti-RNase Fab-PM-His (H + L), and anti-TF189 Fab-PM-His. (H + L) was 100%, and both were highly efficient.
  • Test Example 11 Activity evaluation of refolded heavy chain Fab and light chain Fab 1.
  • Each of the refolded antibodies obtained by denaturing and refolding an inactive antibody linked with the following peptides in the same manner as in Test Example 10 was prepared according to the procedure described below. The activity of each immobilized antibody was evaluated by contacting with the material. Further, anti-CEA Fab-PM-His (H + L), anti-RNase Fab-PM-His (H + L), anti-TF189 Fab-PM-His (H + L) used in Test Example 10 were used.
  • Refolding was performed, and in the same manner, the antibody was contacted with a base material made of polymethyl methacrylate, and the activity of each immobilized antibody was evaluated. Refolding was performed using a liquid phase adjusted to a pH of 8.5, no NDSB201 added, and a NaCl concentration of 0 mM using 0.05 M TAPS good buffer.
  • Example 1-1 anti-CEA scFv-PM-His
  • Example 9-1 anti-CEA Fab H-PM-His
  • Example 9-2 anti-CEA Fab L-PM-His
  • Example 9-3 anti-RNase Fab H-PM-His
  • Example 9-4 anti-RNase Fab L-PM-His
  • Example 9-5 anti-TF189 Fab H-PM-His
  • Example 9-6 anti-TF189 Fab L-PM-His
  • a refolded antibody obtained by linking peptides having an isoelectric point lower than that of the inactive antibody obtained as described above.
  • RNase antibody was prepared in PBS so as to have a concentration of 100 ug / mL, and 100 uL of this was added to a polymethylmethacrylate base material (microplate) and incubated at 25 ° C. for 2 hours. Next, the substrate was washed 5 times with PBST, and then 300 uL of PBST containing 2% BSA (2% BSA-PBST) was added and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • biotin-labeled CEA or biotin-labeled RNase was diluted with 2% BSA-PBST so as to be 0 to 1 ug / mL, added 100 uL at a time, and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • HRP-labeled streptavidin was diluted with 2% BSA-PBST to 0.2 ug / mL, 100 uL was added and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • 100 uL of TMB was added in each case and incubated at 25 ° C. for 15 minutes, and 100 uL of 0.3 M sulfuric acid was added to stop the color reaction. Thereafter, the absorbance at 450 nm (subwavelength 650 nm) was measured with a microplate reader.
  • a refolded antibody (anti-TF189 antibody) formed by linking peptides having an isoelectric point lower than that of an inactive antibody
  • the peptide obtained as described above is used.
  • Prepared in PBS so that the refolded antibody with ligated to a concentration of 100ug / mL was added to each 100uL of polymethylmethacrylate substrate (microplate) and incubated at 25 ° C for 2 hours .
  • the substrate was washed 5 times with PBST, and then 300 uL of PBST containing 2% BSA (2% BSA-PBST) was added and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • Transferrin was diluted with 2% BSA-PBST to be 0 to 1 ug / mL, 100 uL was added and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • the biotin-labeled anti-Transferrin antibody was diluted with 2% BSA-PBST to 0.25 ug / mL, 100 uL was added and incubated at 25 ° C. for 1 hour. The subsequent procedure was performed in the same manner as described above, and the absorbance was measured.
  • Test Example 12 Evaluation of refolding efficiency of VHH
  • the isoelectric point of the inactive antibody having the structure shown in Example 10 was lower.
  • An inactive antibody comprising a peptide having an isoelectric point linked thereto was prepared and tested in the same manner.
  • an antibody having the structure shown in Comparative Example 6 was prepared and tested in the same manner.
  • Example 10 VHH-PM-His (isoelectric point 6.05)
  • Comparative Example 6 VHH-His (isoelectric point 8.20) As shown in FIG.
  • Test Example 13 Calculation of Refolding Efficiency Using Example 10 and Comparative Example 6 described in Test Example 12, denaturation and refolding were performed by dialysis in the same manner as in Test Example 5, and the refolding efficiency in these was determined. Calculated. Specifically, a solution obtained by diluting Example 10 (VHH-PM-His) dissolved in 8M Urea-PBS to 0.5 mg / mL VHH-PM-His, 0.5M Urea, 50 mM TAPS. 1 mL was placed in a dialysis tube and dialyzed overnight against an external solution of 50 mM TAPS at 4 ° C. The solution in the dialysis tube was then collected and aggregates were removed by centrifugation. The protein concentration before and after centrifugation was quantified by DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories), and the recovery rate was calculated. The recovery rate was similarly calculated for Comparative Example 6 (VHH-His).
  • Example 10 the recovery rate was 95%, while in Comparative Example 6, the recovery rate was 20%. From this, it was found that even when VHH was used as the antibody, the inactive antibody could be efficiently refolded.
  • Test Example 14 Calculation of refolding efficiency Refolding efficiency was calculated for Example 10 using a method different from Test Example 13. Specifically, the refolding efficiency was calculated by gel chromatography. First, two 5 mL gel filtration columns Hi Trap Desalting (manufactured by GE Healthcare) were connected and set to the AKTA Purifier UPC10 chromatography system (manufactured by GE Healthcare), and equilibrated with 50 mM TAPS (pH 8.5). Next, Example 10 (VHH-PM-His) dissolved in 8 M Urea-PBS was diluted to 0.5 mg / mL VHH-PM-His, 0.5 M Urea, 50 mM TAPS, 0.5 M NDSB201.
  • Example 10 the recovery rate was 99%. From this, it was found that even when VHH was used as the antibody, the inactive antibody could be efficiently refolded.
  • Test Example 15 Immobilization of refolded VHH to substrate and evaluation of activity 1. Whether or not the antibody refolded through the peptide can be well immobilized on the substrate by contacting the antibody refolded using Example 10 with a substrate made of polymethyl methacrylate. Was examined. Further, it was examined whether the immobilized antibody maintained its activity. Comparative example 6 was examined in the same manner.
  • Example 10 was refolded according to Test Example 13, the refolded antibody to which the peptide was linked was prepared in PBS so as to have a concentration of 45 ug / mL. 100 uL each was added to a methyl substrate (microplate) and incubated at 25 ° C. for 2 hours. Next, the substrate was washed 5 times with PBST, then 300 uL of 2% BSA-PBST was added and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • biotin-labeled hCG was diluted with 2% BSA-PBST to be 0 to 1 ug / mL, added 100 uL at a time, and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • HRP-labeled streptavidin was diluted with 2% BSA-PBST to 0.2 ug / mL, 100 uL was added and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • 100 ⁇ L of TMB was added and incubated at 25 ° C. for 15 minutes, and 100 ⁇ L of 0.3 M sulfuric acid was added to stop the color reaction (color development reaction). Thereafter, the absorbance at 450 nm (subwavelength 650 nm) was measured with a microplate reader.
  • Example 10 in which a peptide (PM) having affinity for polymethyl methacrylate and having an isoelectric point lower than that of an inactive antibody was introduced.
  • the refolded antibody due to the effect of PM linked to the refolded antibody, the refolded antibody is immobilized on the polymethylmethacrylate base material at a high density.
  • a high signal was obtained as compared with an antibody in which a peptide having affinity for methyl was not linked. From this, it was found that the antibody refolded in Example 10 was immobilized on the substrate at a high density, and the desired activity derived from the antibody was well recovered.

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Abstract

　本発明は、抗体のリフォールディング方法、リフォールディングされた抗体の製造方法、リフォールディングされた抗体、及びこれらの利用を提供する。本発明は、ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する、及び、前記工程において変性した、前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程を含む、液相中での抗体のリフォールディング方法及びリフォールディングされた抗体の製造方法などを提供する。

Description

抗体のリフォールディング方法、リフォールディングされた抗体の製造方法、リフォールディングされた抗体、及びこれらの利用
　本発明は抗体のリフォールディング方法、リフォールディングされた抗体の製造方法、リフォールディングされた抗体、及びこれらの利用に関する。
　従来、バイオ、医薬、食品をはじめとする様々な分野において抗体が広く利用されている。抗体は個々に特有の活性を有していることから、その活性に基づいて目的に応じた抗体が選択され、利用されている。また、抗体を生産する方法も種々知られており、所望の抗体を大量生産することも可能となっている。
　しかしながら、従来の生産方法では十分な活性を備えた抗体が得られるとは限らない。例えば、組換え大腸菌などを宿主として抗体を生産させた場合、その大部分が不活性な抗体として得られることも多い。所望の活性を備えた抗体を獲得するためには、得られた不活性な抗体に対して更にリフォールディング操作を行う必要がある。
　ここでリフォールディングに関して、例えば、アルギニン、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液中に変性したタンパク質を滴下する工程を包含する、変性したタンパク質のリフォールディング方法が報告されている（特許文献１）。また、界面活性剤存在下で膜タンパク質をリフォールディングする工程を包含する方法が報告されている（特許文献２）。また、金属キレート配位子に配位結合する金属イオンを含む活性固相に結合するための固着部分を有するペプチドをキレート結合によって固相表面に吸着させたのちに、固相表面上で該ペプチドをリフォールディングできることが報告されている（特許文献３）。また、特定のペプチドを固相表面に吸着させたのちに、固相表面上で該ペプチドの立体構造を修復できることが報告されている（特許文献４、５）。
　このように、これまでに種々のリフォールディング方法が報告されているが、従来の方法ではリフォールディング効率が低い。
国際公開第２００５／０３３３０７号 特表２００７－５３７１３９号公報 特表２００８－５２０６１６号公報 国際公開第２００９／１０１８０７号 特開２０１１－１６８５０５号
　このことから、本発明は、所望の活性を備えた抗体をより効率良くリフォールディングできる手段を提供することを目的とする。より具体的には、所望の抗体をより効率良くリフォールディングできる、液相中での抗体のリフォールディング方法を提供することを目的とする。また、本発明は、リフォールディングされた抗体を液相中で効率良く製造するための方法、及び該方法により得られるリフォールディングされた抗体を提供することを目的とする。また、本発明は、前記方法によってリフォールディングされた抗体の基材への固定化方法、及び該方法によってリフォールディングされた抗体が固定されてなる基材を提供することを目的とする。更に、本発明は、液相中での抗体のリフォールディング用組成物、液相中での抗体のリフォールディング用助剤、液相中での抗体のリフォールディング用ペプチド発現ベクター、液相中での抗体のリフォールディング用ペプチド連結抗体発現ベクター、該ベクターを用いて得られる形質転換体、及び該形質転換体から得られるペプチドが連結されてなる抗体などを提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、変性された不活性な抗体のリフォールディングを、液相中で、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドを用いて行うことによって、効率良くリフォールディングでき、従って、所望の抗体を効率良く獲得できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成されたものである。
　すなわち、本発明は、下記に掲げる発明を提供する。
項１．（１－１）ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する、及び、
（１－２）前記工程（１－１）において変性した、前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程、
を含む、液相中での抗体のリフォールディング方法。
項２．抗体が１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単ドメイン抗体、多価性１本鎖抗体、定常部融合１本鎖抗体及び完全長抗体からなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載のリフォールディング方法。
項３．前記ペプチドの等電点が８．５以下である、項１または２に記載のリフォールディング方法。
項４．前記ペプチドが、基材に対して親和性を有するペプチドである、項１～３のいずれかに記載のリフォールディング方法。
項５．前記リンカーが、基材に対して親和性を有するペプチドである、項１～４のいずれかに記載のリフォールディング方法。
項６．（２－１）ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する、及び、
（２－２）前記工程（２－１）において変性した、前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程、
を含む、リフォールディングされた抗体の製造方法。
項７．抗体が１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単ドメイン抗体、多価性１本鎖抗体、定常部融合１本鎖抗体及び完全長抗体からなる群より選択される少なくとも１種である、項６に記載の製造方法。
項８．前記ペプチドの等電点が８．５以下である、項６または７に記載の製造方法。
項９．前記ペプチドが、基材に対して親和性を有するペプチドである、項６～８のいずれかに記載の製造方法。
項１０．前記リンカーが、基材に対して親和性を有するペプチドである、項６～９のいずれかに記載の製造方法。
項１１．項６～１０のいずれかに記載の製造方法によって得られる、リフォールディングされた抗体。
項１２．項１、３、４、６、８及び９のいずれかに記載の、前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドからなる、液相中での抗体のリフォールディング用助剤。
項１３．項１～５のいずれかに記載の方法によってリフォールディングされた抗体及び／または項６～１０のいずれかに記載の製造方法によって得られたリフォールディングされた抗体を、基材に接触させる工程を含有する、リフォールディングされた抗体の基材への固定化方法。
項１４．抗体に連結されたペプチドを介して、抗体が基材に固定される、項１３に記載の固定化方法。
項１５．前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが以下の（ａ）または（ｂ）に示すペプチドであり、基材がポリカーボネート及びポリメタクリル酸メチルからなる群より選択される少なくとも１種である、項１３または１４に記載の固定化方法、
（ａ）配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリカーボネート及びポリメタクリル酸メチルからなる群より選択される少なくとも１種に親和性を有するペプチド。
項１６．項１３～１５のいずれかに記載の固定化方法によってリフォールディングされた抗体が固定されてなる、基材。
項１７．ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を含有する、液相中での抗体のリフォールディング用組成物、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する。
項１８．更に、前記ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されなる不活性な抗体の等電点よりもｐＨが０．５以上高い溶液を含有する、項１７に記載の組成物。
項１９．抗体をコードするポリヌクレオチドと、該抗体の等電点より低い等電点を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドとが直接またはリンカーを介して連結されてなる、液相中での抗体のリフォールディング用ペプチド連結抗体発現ベクター。
項２０．項１９に記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
項２１．項２０に記載の形質転換体から得られる、ペプチドが連結されてなる抗体。
項２２．項１、３、４、６、８及び９のいずれかに記載の、前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、液相中での抗体のリフォールディング用ペプチド発現ベクター。
項２３．アスパラギン酸残基からなるペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる抗体、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する。
項２４．前記抗体が、不活性な抗体またはリフォールディングされた抗体である、項２３に記載の抗体。
　本発明によれば、不活性な抗体から所望の活性を備えた抗体へと効率良くリフォールディングすることができる。このように、本発明は所望の活性を備えた抗体を効率良く獲得できることから、抗体の生産コストを低減することが可能となり、従って、本発明によれば抗体をより安価に提供することが可能となる。
　また、本発明において使用する、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが基材への吸着能を備えている場合には、リフォールディングにより得られた所望の活性を備える抗体を、該ペプチドを介して、その活性が保持された状態で、より容易、高効率、高密度に、更にその配向がより均一になるよう制御して基材に固定化することができる。
　また、本発明が対象とする抗体には、前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチド以外にも、基材への吸着能を備えた別のペプチドを更に連結させることができる。このことから、本発明において使用する前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが基材への吸着能を備えていない場合であっても、基材への吸着能を備えた前記別のペプチドを介して、リフォールディングにより得られた所望の活性を備えた抗体を、その活性が保持された状態で、より容易、高効率、高密度に、更にその配向がより均一になるよう制御して基材に固定化することができる。
　このことから本発明によれば、所望の活性を備えた抗体を効率良く獲得できるとともに、所望の活性を備えた抗体が固定化された高精度な基材を、より簡便且つ効率良く得ることができる。このような本発明は、バイオ、医薬、食品をはじめとする様々な分野における抗体利用技術の一層の普及に寄与する。
図１は抗CEA抗体を用いたリフォールディング結果を示す。 図２は抗CEA抗体を用いたリフォールディング結果を示す。 図３は抗RNase抗体を用いたリフォールディング結果を示す。 図４は抗RNase抗体を用いたリフォールディング結果を示す。 図５は抗CRP抗体を用いたリフォールディング結果を示す。 図６は抗CRP抗体を用いたリフォールディング結果を示す。 図７は各抗体におけるリフォールディング結果を示す（抗TSH抗体、抗IgA抗体、抗IgG抗体、抗TF189抗体）。 図８は、リフォールディングされた抗体を基材へ固定させた結果を示す（PM）。 図９は、低等電点ペプチド及び親和性ペプチドを連結させた抗体におけるリフォールディング結果を示す（PS）。 図１０は、低等電点ペプチド及び親和性ペプチドを連結させた抗体におけるリフォールディング結果を示す（SiN）。 図１１は、リフォールディングされた抗体を基材へ固定させた結果を示す（PM）。 図１２は、リフォールディングされた抗体を基材へ固定させた結果を示す（PS）。 図１３は重鎖Fab、軽鎖Fabのリフォールディング結果を示す（抗CEA抗体）。 図１４は重鎖Fab、軽鎖Fabのリフォールディング結果を示す（抗RNase抗体）。 図１５は重鎖Fab、軽鎖Fabのリフォールディング結果を示す（抗TF189抗体）。 図１６は重鎖Fab、軽鎖Fabのリフォールディング結果を示す（抗AFP抗体）。 図１７は、リフォールディングされた重鎖Fab、軽鎖Fabの活性評価の結果を示す（抗CEA抗体）。 図１８は、リフォールディングされた重鎖Fab、軽鎖Fabの活性評価の結果を示す（抗RNase抗体）。 図１９は、リフォールディングされた重鎖Fab、軽鎖Fabの活性評価の結果を示す（抗TF189抗体）。 図２０はラクダ抗体VHHのリフォールディング結果を示す。 図２１はリフォールディングされたVHHの基材へ固定及び活性評価の結果を示す。
　以下、本発明について説明する。
１．液相中での抗体のリフォールディング方法
本発明の液相中での抗体のリフォールディング方法は、（１－１）ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、及び、（１－２）前記工程（１－１）において変性した、前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程、を含むことを特徴とする。ここで、前記工程（１－１）において、前記ペプチドは、前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有することを特徴とする。
　本発明における前記工程（１－１）は、前述の通り、前記ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程である。
　ここで抗体は任意の抗体をいい、特に制限されないが、例えば１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単ドメイン抗体（ナノボディ、variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody（ＶＨＨ）など）、多価性１本鎖抗体、定常部融合１本鎖抗体、完全長抗体（インクローナルなどを含む）などが例示される。
　また、工程（１－１）に使用される前記ペプチド、すなわち、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドは、該不活性な抗体の等電点（ｐＩ）よりも低い等電点を有する。該ペプチドの等電点は、このように不活性な抗体の等電点より低い限り制限されないが、該ペプチドの好ましい等電点として８．５以下が例示され、より好ましくは８以下、更に好ましくは７．５以下、更に特に好ましくは７以下が例示される。
　該ペプチドとしては前述の説明を充足する限り制限されないが、好ましくは５～５０のアミノ酸残基であるものが例示され、より好ましくは５～４１のアミノ酸残基、更に好ましくは１０～３１のアミノ酸残基であるものが例示される。
　また、このような等電点及びアミノ酸残基数を有する前記ペプチドにおいて好ましくは酸性アミノ酸残基を２以上含むものが例示され、より好ましくは酸性アミノ酸残基を３～２０、更に好ましくは酸性アミノ酸残基を４～１５含むものが例示される。
　また、前記酸性アミノ酸残基数を充足する前記ペプチドにおいて好ましくは酸性アミノ酸残基数が塩基性アミノ酸残基数より多いものが例示され、より好ましくは１以上多いもの、更に好ましくは酸性アミノ酸残基数が塩基性アミノ酸残基数より２～２５、特に好ましくは酸性アミノ酸を４～２０多いものが例示される。
　ここで、酸性アミノ酸とはアスパラギン酸、グルタミン酸を指し、塩基性アミノ酸とはリシン、アルギニン、ヒスチジンを指す。
　このようなペプチドとして好ましくは「不活性な抗体」の等電点よりも「該不活性な抗体と前記ペプチドとが直接連結されてなるもの」全体としての等電点を０．３以上低くできるものであり、より好ましくは等電点を０．３～５程度低くできるものであり、更に好ましくは０．３～４程度低くできるものが例示される。また、このようなペプチドとしてより好ましくは「不活性な抗体」の等電点よりも「該不活性な抗体と前記ペプチドとがリンカーを介して連結されてなるもの」全体としての等電点を０．３以上低くできるものであり、より好ましくは等電点を０．３～５程度低くできるものであり、更に好ましくは０．３～４程度低くできるものが例示される。
　また、抗体の等電点にもよるが、ペプチドとして好ましくは、前記不活性な抗体と前記ペプチドとが直接またはリンカーを介して連結されてなるものの全体としての等電点を３．５～７．５程度にできるものが挙げられ、より好ましくは全体としての等電点を３．５～７程度にできるものが挙げられ、更に好ましくは全体としての等電点を４～６．５程度にできるものが挙げられる。
　本発明において使用される、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドは、これが連結される不活性な抗体の等電点を考慮して選択される。使用する該不活性な抗体と該ペプチドとは、当業者であれば容易に選択できる。なお、本発明において等電点は、市販のソフトウェアGenetyx ver6（株式会社ゼネティックス製）を用いて算出される値であり、Genetyx ver6の手順に従いアミノ酸配列を入力することによって、そのアミノ酸残基の配列に基づいてプログラムに従い等電点が算出される。例えば、本発明において算出される抗体の等電点は、抗体のアミノ酸配列が同一であれば、その活性、不活性に関わらず、同じ値が算出される。すなわち、本発明において「不活性な抗体」の等電点と「抗体」の等電点は同じである。
　該ペプチドは、前述のように不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する限り制限されないが、一例として、アスパラギン酸及び／またはグルタミン酸からなるペプチド、アスパラギン酸及び／またはグルタミン酸の残基数が塩基性アミノ酸の残基数より多いペプチド、配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列を２以上有するペプチド、これらのペプチドのアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
　なお、本発明においてペプチドとは、アミノ酸残基の数によってはオリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質と称されるものも含む。また、前記ペプチドにおいて、「１または複数」の範囲は本発明の効果を奏する限り制限されないが、例えば１～１５個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、特に好ましくは１～３個、さらに特に好ましくは１または２個が挙げられる。
　特定のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸を欠失、置換及び／または付加させる技術は公知である。このように欠失、置換及び／または付加されたペプチドとして、例えば、アスパラギン酸及び／またはグルタミン酸からなるペプチド、アスパラギン酸及び／またはグルタミン酸の残基数が塩基性アミノ酸の残基数より多いペプチド、配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または、配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列を２以上有するペプチドの有するアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、本発明の効果を奏するペプチドが例示される。また、該ぺプチドとして、アミノ酸の同一性は通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、更に特に好ましくは９８％以上である。
　該ペプチドは前述の特徴を備える限り制限されないが、リフォールディングされた抗体を何らかの基材に固定させる場合、該抗体を基材により簡便に固定する観点から、前述の、不活性な抗体に直接またはリンカーを介して連結されてなる、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチド（以下、低等電点ペプチドと称する場合がある）は、更に基材に対して親和性を備えているものが好ましい。例えば、本発明を制限するものではないが、前記配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドはポリカーボネート及び／またはポリメタクリル酸メチルに親和性を有しており、従って、基材に対して親和性を備えている低等電点ペプチドとしては配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列を２以上有するペプチド、これらのペプチドのアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ペプチドはポリカーボネート及び／またはポリメタクリル酸メチルに親和性を有するペプチドが例示される。１または複数のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加については前述と同様に、親和性、基材、これらの結合条件については後述と同様に説明される。
　本発明において前記ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体は、前記ペプチドと不活性な抗体とが直接またはリンカーを介して連結されている限り制限されず、連結部位も制限されない。例えば、不活性な抗体は、１種の前記ペプチド１つまたは複数個に、直接またはリンカーを介して連結されていてもよく、複数種の前記ペプチドに直接またはリンカーを介して連結されていてもよい。
　これらの連結部位は、本発明の効果が得られる限り制限されないが、リフォールディングされた抗体において所望の活性の発揮を妨げない部位が例示される。抗体の所望の活性になるべく悪影響を与えないようにする点から、抗体の可変部以外に該ペプチドを連結させることが好ましく、抗体の可変部よりもＣ末端側及び／またはＮ末端側がより好ましく、抗体の可変部よりもＣ末端側が更に好ましい。
　また、使用可能なリンカーとしても本発明の効果が得られる限り制限されず、従来公知の技術を用いて当業者が通常の検討範囲内で適宜決定すればよい。このようなリンカーとして、一般にフレキシブルリンカーと称されるリンカーが例示され、広く用いられているフレキシブルリンカーのアミノ酸配列としては（Ｇ４Ｓ）ｎ（例えばｎ＝１～４）が例示される。
　また、前記ペプチドが基材に対して親和性を備えているか否かにかかわらず、前述のようにリフォールディングされた抗体を基材により簡便に固定する観点から、リンカーとして、基材に親和性を備えているペプチド（以下、親和性ペプチドと称する場合がある）を用いてもよい。
　このような親和性ペプチドとしては、本発明の効果が制限されず、また、基材に親和性を有している限り制限されないが、一例として配列番号５～５２のいずれかで示されるアミノ酸配列を含有するペプチド、ヒスチジンからなるペプチド、ＴＡＴペプチドなどが挙げられる。
　例えば、配列番号５～８で表されるペプチドは、ポリカーボネート及び／またはポリメタクリル酸メチルに親和性を有しており、配列番号９～２８で表されるペプチドは親水性ポリスチレンなどの親水性の樹脂に親和性を有しており、配列番号２９～５２で表されるペプチドは窒化ケイ素に親和性を有しており、ヒスチジンからなるペプチドはニッケル、亜鉛、銅、コバルト、鉄などの二価の金属をはじめとする金属に親和性を有しており、ＴＡＴペプチドは細胞膜等に代表されるリン脂質二重膜に親和性を有している。このことから、これらのペプチドはそれぞれポリカーボネート及び／またはポリメタクリル酸メチル製の基材、親水性の樹脂製の基材、窒化ケイ素製の基材、金属製の基材、またはリン脂質二重膜が付されてなる基材に親和性を有している。基材の詳細は後述のように説明される。
　また、このほか親和性ペプチドとしては、配列番号５～５２のいずれかで表されるアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、前記所定の基材に親和性を有するペプチドが例示される。これらのアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加についても、前述と同様に説明され、基材への親和性を有する範囲であれば制限されない。また、これらにおいて前記低等電点ペプチドに該当するペプチドは、前述する基材に親和性を有する低等電点ペプチドとして好ましく用いられる。
　また、親和性ペプチドは、不活性な抗体と低等電点ペプチドとの間以外の部分に連結されてもよい。また、該親和性ペプチドは、前記フレキシブルリンカーなど他の任意のリンカーと更に連結されていてもよい。
　また、本発明において前記低等電点ペプチドと不活性な抗体との間には、更には、低等電点ペプチド、親和性ペプチド、不活性な抗体の間には、必要に応じて低等電点ペプチド、親和性ペプチド及び／または抗体とを切断できるように切断部位が連結されていてもよい。切断方法も制限されず、従来公知の技術を用いて当業者が通常の検討範囲内で適宜決定すればよい。例えば、このような切断については、従来公知の制限酵素による切断が例示され、この場合、制限酵素による切断可能な部位を必要に応じて連結させておけばよく、不活性な抗体をリフォールディングさせた後に従来公知の制限酵素で切断可能なようにしておくことが例示される。
　本発明において低等電点ペプチドと不活性な抗体が連結される一例として、更に親和性ペプチドが連結される一例として、これらに制限されないが、不活性な抗体－低等電点ペプチド、不活性な抗体－親和性ペプチド－低等電点ペプチド、不活性な抗体－低等電点ペプチド－親和性ペプチド、不活性な抗体－親和性ペプチド－低等電点ペプチド－親和性ペプチド、親和性ペプチド－不活性な抗体－低等電点ペプチドなどが挙げられる。
　また、例えば、低等電点ペプチドが基材への親和性を備えている場合には、該低等電点ペプチドを介して、リフォールディングされた抗体を基材に容易に固定させることができる。また、低等電点ペプチドが基材への親和性を備えてない場合には、例えば前述の親和性ペプチドを連結させることによって、該親和性ペプチドを介して、リフォールディングされた抗体を基材に容易に固定させることができる。また、例えば不活性な抗体－親和性ペプチド－低等電点ペプチドのような構造を有する場合には、抗体をリフォールディングさせた後に低等電点ペプチドを切断して、残った親和性ペプチドを介して、リフォールディングされた抗体を基材に容易に固定させることもできる。
　なお、本発明において親和性を有するとは、ペプチドが基材に直接結合できるかどうかに基づき判断すればよく、直接結合すれば親和性を有するといえる。また、ペプチドによって親和性が異なることから、親和性を有するペプチドを介して抗体を基材に固定させる場合には、親和性を有するペプチドと基材とを適宜選択することによって一層容易に抗体を基材に固定できる。
　親和性ペプチドとしては前述のものが例示でき、これらに適する基材としてはそれぞれ前述のポリメタクリル酸メチル製の基材、ポリカーボネート製の基材、親水性の樹脂製の基材、窒化ケイ素製の基材などが例示される。
　基材としてより具体的に、例えば「ポリメタクリル酸メチル製の基材」とは、表面が修飾されていないポリメタクリル酸メチルを基材表面の一部及び／または全面に有し、且つ、そのポリメタクリル酸メチル表面に前記ポリメタクリル酸メチルに対して親和性を有するペプチドが結合できる限り制限されない。例えば、ポリメタクリル酸メチル製の基材とは、ポリメタクリル酸メチルからなる基材、他の成分で構成されたものの一部または全面にポリメタクリル酸メチルが積層及び／または被覆されてなる基材などが挙げられる。また、例えば「親水性の樹脂製の基材」とは、表面が修飾されていない親水性の樹脂を基材表面の一部及び／または全面に有し、且つ、その親水性の樹脂表面に前記親水性の樹脂に対して親和性を有するペプチドが結合できる限り制限されない。例えば、親水性の樹脂製の基材とは、親水性の樹脂からなる基材、他の成分で構成されたものの一部または全面に親水性の樹脂が積層及び／または被覆されてなる基材など親水性の樹脂表面を有する基材が挙げられる。親水性の樹脂としては、親水性の、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサンといった樹脂が例示される。通常、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンなどは疎水性であるが、基材表面にこれらの樹脂が使用される場合には、その表面を親水化処理して親水性としたものを指す。親水化処理は化学処理、電子線照射処理、オゾン酸化処理、プラズマ処理、コロナ処理、紫外線照射処理など、従来公知の方法によって適宜行えばよい。また、例えば「窒化ケイ素基材」とは、表面が修飾されていない窒化ケイ素を基材表面の一部及び／または全面に有し、且つ、前記窒化ケイ素親和性ペプチドが窒化ケイ素表面に結合できる限り制限されない。例えば、窒化ケイ素基材とは、窒化ケイ素からなる基材、他の成分で構成されたものの一部または全面に窒化ケイ素が積層及び／または被覆されてなる基材などが挙げられる。また、前述の「ポリカーボネート製の基材」、「金属製の基材」、「リン脂質二重膜を有する基材」もこれらと同様に説明でき、当業者であればこれらの基材を容易に取得することができる。
　不活性な抗体、低等電点ペプチド、親和性ペプチドなどは、従来公知の遺伝子工学的手法や化学合成法などによって作製できる。例えば、不活性な抗体やこれらのペプチドは、抗体及び／または前記ペプチドの産生能を有する微生物から単離・精製することによって取得してもよい。また、前記ペプチドは、前記ペプチドのアミノ酸配列またはこれをコードするヌクレオチド配列の情報に従って、従来公知の化学合成法により合成して取得してもよい。化学合成法には、液相法や固相法によるペプチド合成法が包含される。取得したペプチドが基材への親和性を有するかどうかについては、取得したペプチドが基材に直接結合できるかどうかに基づき判断すればよく、直接結合すれば親和性を有するといえる。結合条件は、使用するペプチドの種類や基材に応じて、あるいは、基材に固定化させたい抗体等に応じて適宜決定すればよく、例えはＰＢＳといった任意の緩衝液中でペプチドを基材と接触させることにより、取得したペプチドが基材に直接結合できるかどうか判断すればよい。低等電点ペプチドが連結されてなる不活性な抗体、あるいは、更に親和性ペプチドが連結されてなる不活性な抗体は例えば架橋剤などを利用して作製でき、また、例えば後述する発現ベクターを用いて作製でき、低等電点ペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体をコードするポリヌクレオチド、更に必要に応じて親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチドをベクター等に挿入し、次いで、該ベクターが組み込まれた形質転換体を培養したのち、所望のペプチドを取得すればよい。
　本発明において使用される前記「ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体」の全体としての等電点は、使用する抗体の等電点にもよって異なり、本発明の効果が得られる限り制限されないが、例えば、全体としての等電点は好ましくは３．５～７．５、より好ましくは３．５～７程度、更に好ましくは４～６．５程度が例示される。
　本発明の前記工程（１－１）は、前記ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程である。ここで変性とは前述の不活性な抗体を可溶化させることであり、例えば、不活性な抗体に対して変性剤、還元剤などをはじめとするカオトロピック剤や界面活性剤といったタンパク質変性能を有する薬剤を作用させることにより、不活性な抗体を変性させて可溶化することが例示される。より具体的な薬剤の例として、尿素（例えば８Ｍ）、塩酸グアニジン（例えば６Ｍ）、ＳＤＳ(sodium lauryl sulfate、例えば１％)、チオシアン酸ナトリウム（例えば４Ｍ）、チオシアン酸カリウム（例えば４Ｍ）、β－メルカプトエタノール、ジチオトレイトールなどが挙げられ、より具体的な変性の例として、前述のペプチドが連結されてなる不活性な抗体に前記薬剤を作用させることにより実施できる。このような不活性な抗体の変性は本発明の分野においてよく知られており、当業者であれば従来公知の技術を用いて当業者が通常の検討範囲内でタンパク質変性能を有する薬剤の種類、その濃度、変性時間等を適宜決定すればよい。
　本発明において不活性な抗体としては、抗体が持つ特有の活性が十分に発揮されない抗体をいう。例えば、組換え大腸菌などを宿主として抗体を生産させた場合、その抗体の大部分が不溶で不活性な凝集体（封入体（inclusion body））として回収されることがあり、この凝集体（封入体）の状態にある抗体が例示される。
　前記工程（１－２）は、前記工程（１－１）において変性した、前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体を、液相に分散させることによって、所望の活性を有する抗体へとリフォールディングする工程である。より具体的には、前記工程（１－２）は、前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体を、基材などの固相に固定されていない状態で液相に分散させることによって、所望の活性を有する抗体へとリフォールディングする工程である。固相とは特に制限されないが、前述するようなポリカーボネート及び／またはポリメタクリル酸メチル製の基材、親水性の樹脂製の基材、窒化ケイ素製の基材、金属製の基材、リン脂質二重膜が付されてなる基材、ゲルなどが例示される。液相へ分散させる例としては、変性した、前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体の、希釈による液相への分散、透析による液相への分散、ゲルクロマトグラフィーを用いた液相への分散などが挙げられ、変性した、前記ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体が更に液相に分散される限り制限されない。
　このような分散は、前述の変性した、ペプチドが連結されなる不活性な抗体がリフォールディングされる限り制限されないが、例えば、前記工程（１－２）において液相に分散される直前の前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体が接触している前記薬剤濃度が例えば１／１０～１／１００などへと低減されるように、前記変性したペプチドが連結されなる不活性な抗体を液相に分散されることが例示される。液相に分散される温度、時間も当業者であれば適宜設定でき、例えば後述する実施例に従い実施できる。
　液相へ分散させるにあたって使用可能な溶液は、前述の変性した、ペプチドが連結されなる不活性な抗体を液相に分散させることが可能であって、該不活性な抗体のリフォールディングが可能な溶液であれば制限されない。このような溶液として、後述の実施例に記載されるような緩衝液といった溶液が例示され、必要に応じて、溶液のイオン強度、組成等を適宜設定すればよい。例えばこのような溶液として、前記ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体全体の等電点よりｐＨが０．５以上高い溶液が例示され、好ましくは前記等電点よりｐＨが０．５～４．５高い溶液が例示され、より好ましくは前記等電点よりｐＨが１～４高い溶液が例示され、更に好ましくは前記等電点よりｐＨが１．５～４高い溶液が例示される。また、本発明の効果が得られる限り制限されないが、抗体をこのような液相へ分散させるにあたって使用可能な溶液のイオン強度は、好ましくはＮａＣｌ濃度０～５００ｍＭが例示され、イオン強度が低い場合であっても高効率でのリフォールディングが可能である点から、より好ましくはＮａＣｌ濃度０～３００ｍＭが例示され、更に好ましくはＮａＣｌ濃度０～１５０ｍＭが例示される。
　この観点から、本発明は、抗体のリフォールディング用組成物を提供するともいえ、該組成物は、前記ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を含有し、より好ましくは、前述のようにして変性した、前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体を含有する。また、該組成物は、更に必要に応じて、前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体のリフォールディングが可能な溶液を含有し、好ましくは前記ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体全体の等電点よりｐＨが０．５以上高い溶液を含有し、より好ましくは前記等電点よりｐＨが０．５～４．５高い溶液を含有し、更に好ましくは前記等電点よりｐＨが１～４高い溶液を含有し、特に好ましくは前記等電点よりｐＨが１．５～４高い溶液を含有してもよい。該組成物を用いることによって不活性な抗体をより簡便にリフォールディングでき、該組成物中でリフォールディングが進む観点からは、該組成物にリフォールディングされた抗体が含有されている場合もある。
　本発明においてリフォールディングとは本発明の分野で通常使用されている意味であり、抗体が、凝集体すなわち封入体といった不活性な状態から、非凝集体（非封入体）であり且つその抗体特有の活性を発揮できる状態になることをいう。このような非凝集体（非封入体）の状態にある抗体が前記液相に存在していれば、不活性な抗体がリフォールディングされたということができる。あるいは、このような所望の活性を備える抗体が前記液相に存在していれば、不活性な抗体がリフォールディングされたということができる。
　また、本発明は効率よくリフォールディングを行うことができるものであり、リフォールディング効率は、前記液相において、凝集体（封入体）の状態にある抗体の量と、非凝集体（非封入体）の状態にある抗体の量とを比較することによって判断され、非凝集体（非封入体）の状態にある抗体の量が多いほど、リフォールディング効率が高いと判断する。後述する実施例に基づけば、得られた液相の吸光度を測定したり、遠心前の液相中の抗体濃度と遠心後に得られた上清中の抗体濃度とを比較することにより判断でき、前者では吸光度が低いほど、後者では遠心前の液相中の抗体濃度に対して遠心後に得られた上清中の抗体濃度が高いほど、リフォールディング効率が高いと判断する。より具体的には、例えば、後述する透析を用いた実施例に基づけば、リフォールディング後に得られる抗体を含有する溶液の吸光度を測定したり、リフォールディング後に得られる抗体を含有する溶液において、遠心前の溶液中の抗体濃度と遠心後に得られた上清中の抗体濃度とを比較することにより判断でき、前者では吸光度が低いほど、後者では遠心前の液相中の抗体濃度に対して遠心後に得られた上清中の抗体濃度が高いほど、リフォールディング効率が高いと判断する。また、例えば、後述するゲルクロマトグラフィを用いた実施例に基づけば、カラムに負荷する直前の溶液中の抗体濃度（あるいは重量）と、カラムから溶出させた抗体濃度（あるいは重量）とを比較して、前者に対する後者の割合が高いほど、抗体が効率よくリフォールディングされたといえる。
 　このように、本発明において「液相中での抗体のリフォールディング」とは、前記工程（１－１）において変性された、前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体が、前記工程（１－２）において、基材などの固相に固定されていない状態で、所望の活性を有する抗体へとリフォールディングされることをいう。該方法によれば、不活性な抗体のリフォールディング効率を向上させることができ、従って、所望の活性を備えた抗体を高効率で獲得することができる。このことから、該方法はまた、不活性な抗体のリフォールディング効率を高める方法ともいえる。
　また、ここで使用される不活性な抗体が親和性を有するペプチドに連結されている場合には、後述の固定化方法に記載されるように、抗体のリフォールディング後、該親和性を有するペプチドを介して、所望の抗体を基材により簡便、高精度且つ高効率で固定化させることができ、これは、所望の抗体がより高精度且つ高効率で固定されてなる基材の提供に寄与する。
　また、このように不活性な抗体に前記低等電点ペプチドを連結させることによって不活性な抗体を効率良くリフォールディングできることから、該低等電点ペプチドは、液相中での抗体のリフォールディング助剤ということができる。このことから、本発明は抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドからなる、液相中での抗体のリフォールディング助剤を提供する。該助剤は、抗体のリフォールディング効率を向上させるために使用される。該助剤、すなわち、低等電点ペプチドは前述と同様にして説明される。
　また、このように不活性な抗体に前記低等電点ペプチドを連結させることによって不活性な抗体を効率良くリフォールディングできることから、本発明は、前記低等電点ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体やリフォールディングされた抗体を提供するものともいえる。これらの低等電点ペプチド、抗体等についても前述と同様にして説明される。
２．リフォールディングされた抗体の製造方法
　本発明のリフォールディングされた抗体の製造方法は、（２－１）ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、及び、（２－２）前記工程（２－１）において変性した、前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程、を含むことを特徴とする。ここで、前記工程（２－１）において、前記ペプチドは、前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有することを特徴とする。
　ここで、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチド、抗体、不活性な抗体、ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体、リンカー、変性、液相、分散、変性や分散の条件、抗体のリフォールディング等は、前述と同様にして説明される。また、リンカーとして親和性ペプチドを用いる場合、その基材等についても前述と同様に説明される。
　該製造方法によればリフォールディングされた抗体が製造され、特に、リフォールディングされた抗体を効率良く製造できる。
　該製造方法において得られる前記ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる抗体においては、必要に応じて、不要なペプチドを切断することも可能であり、この場合、例えば前述する切断部位をあらかじめ連結させておき、リフォールディング後に制限酵素等を用いて不要なペプチドを切断させればよい。
　このような本発明の製造方法によれば、前記ペプチドが連結されてなる抗体を効率良く獲得することができる。このことから、本発明の製造方法は、リフォールディングされた抗体の製造効率を高める方法ともいえる。また、このようにして得られたリフォールディングされた抗体が基材に対して親和性を有するペプチドと連結されている場合には、必要に応じて該親和性を有するペプチドを介して、得られた抗体を基材により容易、高精度且つ高効率で固定でき、従って、本発明は、種々の分析等においてより高精度な基材の提供に寄与する。
３．リフォールディングされた抗体の基材への固定化方法、及び該固定化方法によってリフォールディングされた抗体が固定されてなる基材
　本発明のリフォールディングされた抗体の基材への固定化方法は、前述の液相中での抗体のリフォールディング方法によってリフォールディングされた抗体及び／または前述のリフォールディングされた抗体の製造方法によって得られたリフォールディングされた抗体を、基材に接触させる工程を含有することを特徴とする。
　ここで、液相中での抗体のリフォールディング方法、リフォールディングされた抗体の製造方法、及びリフォールディングされた抗体は前述の通りである。
　本発明のリフォールディングされた抗体の基材への固定化方法は、前述のようにして得られたリフォールディングされた抗体を、基材に接触させる工程を含有し、これによってリフォールディングされた抗体が基材に固定される。本発明の固定化方法は前述のリフォールディングされた抗体が基材に固定される限り制限されないが、抗体をより簡便に固定できる観点から、好ましくは前述の抗体に連結されてなる低等電点ペプチド及び／または親和性ペプチドを介して、該ペプチドが連結されたままリフォールディングされた抗体が基材に固定化され、より好ましくは前述の抗体に連結されてなる基材への親和性を有するペプチドを介して、該ペプチドが連結されたまま前述のリフォールディングされた抗体が固定化される。抗体を一層簡便に固定できる観点から、抗体を、基材に接触させる前に、抗体に連結されてなる低等電点ペプチド及び／または親和性ペプチドのうち固定に不要なペプチドを、前述するような制限酵素等を用いて切断しておくことが好ましい。この具体的な例としては、前述の低等電点ペプチド自体が基材への親和性を有しているのであれば、低等電点ペプチド介してリフォールディングされた抗体を基材へ固定すればよい。また、低等電点ペプチド自体が基材への親和性を有していないのであれば、例えば、抗体－親和性ぺプチド－低等電点ペプチドのように連結されたリフォールディングされた抗体を獲得した後、抗体－親和性ぺプチドと低等電点ペプチドとを切断して、前者を基材に接触させることによって、親和性ぺプチドを介してリフォールディングされた抗体を基材へ固定すればよい。
　ここで「親和性を有する」とは前述と同様に説明され、ペプチドが基材に直接結合できるかどうかに基づき判断すればよく、直接結合すれば親和性を有するといえる。また、ペプチドによって親和性が異なることから、親和性を有するペプチドを介して抗体を基材に固定させる場合には、親和性を有するペプチドと基材とを適宜選択することによって一層容易に抗体を基材に固定できる。親和性を有するペプチドとしては前述のものが例示でき、これらに適する基材としてはポリメタクリル酸メチル製の基材、ポリカーボネート製の基材、親水性の樹脂製の基材、窒化ケイ素製の基材など前述の基材が例示される。これらの基材も前述と同様に説明される。また、基材の形状も、前記ペプチドを結合できる限り制限されず、例えば、板状、フィルム状（シート状）、球状、粒状（ビーズ状）、繊維状、マイクロプレート状、筒状など任意の形状が挙げられる。本発明の基材をプロテインチップなどのバイオチップとして使用する場合には、窒化ケイ素基材は板状、フィルム状（シート状）等の形状が好ましく例示される。
　また、接触条件も前述と同様に説明され、一例として、後述の実施例に示される接触条件を採用してもよく、該実施例に示される条件を参考にして、当業者が適宜決定すればよい。例えば、前記親和性を有するペプチドが連結されてなる抗体を含有する緩衝液といった任意の溶液、例えばＰＢＳ溶液等を、基材と一定時間接触させることによって、前記ペプチドと基材とを結合させることができ、また、後述の実施例を参考にして、必要に応じて溶液を希釈したりｐＨ等を変更して基材と結合させることができる。
　本発明の固定化方法によれば、効率良く回収されたリフォールディングされた抗体を簡便に基材に固定できることから、リフォールディングされた抗体が固定化された基材を効率良く獲得することができる。また、リフォールディングされた抗体が基材に親和性を有するペプチドと連結されている場合には、該ペプチドを介して、活性が保持された状態で抗体を基材により簡便且つ高密度に固定することができ、更に、抗体の配向がより均一になるよう制御して固定することができる。このことから、本発明は所望の抗体をより簡便、高精度且つ高効率で固定化させることができる。また、本発明の固定化方法によれば、リフォールディングされた所望の抗体がより高精度且つ高効率で固定されてなる基材を容易に製造できることから、本発明はプロテインチップ等のバイオチップをはじめ、抗原抗体反応や酵素反応等を利用するカラムの充填剤、ＥＬＩＳＡ法などにおけるマイクロプレートなどの製造も容易にする。このことから、本発明の固定化方法や基材は、臨床検査、創薬研究、環境モニタリング、生化学などのあらゆる分野において有用である。
４．発現ベクター、形質転換体、及び該形質転換体から得られるペプチドが連結されてなる抗体
　本発明の液相中での抗体のリフォールディング用ペプチド連結抗体発現ベクターは、抗体をコードするポリヌクレオチドと、該抗体の等電点より低い等電点を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドとが直接またはリンカーを介して連結されてなることを特徴とする。
　該ペプチド連結抗体発現ベクターは、後述するポリヌクレオチドを含んでおり、且つ、その宿主細胞において該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づきペプチド連結抗体を発現できるものであれば特に制限されない。該ペプチド連結抗体発現ベクターは、このベクターを用いて発現される、前記ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる抗体の液相中でのリフォールディングを効率良く行うことを目的として用いられる。ここで、液相、抗体、リフォールディング、抗体、抗体の等電点より低い等電点を有するペプチド、リンカー等については前述と同様にして説明される。ポリヌクレオチドは以下のようにして説明される。
　本発明において使用される、抗体の等電点より低い等電点を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現されたペプチドの等電点が、該ペプチドに直接またはリンカーを介して連結される抗体の等電点より低いものであれば制限されず、前述の「１．液相中での抗体のリフォールディング方法」において説明される低等電点ペプチドをコードするポリヌクレオチドが例示される。該低等電点ペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば制限されないが、一例として、アスパラギン酸及び／またはグルタミン酸からなるペプチドをコードするポリヌクレオチド、アスパラギン酸及び／またはグルタミン酸の残基数が塩基性アミノ酸残基数より多いペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号５３～５６のいずれかで表される塩基配列を有するポリヌクレオチド、また、これらのポリヌクレオチドの塩基配列を２以上有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。また、これらのいずれかのポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドなどが例示される。
　ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」するとは、標準的なハイブリダイゼーション条件下に、２つのポリヌクレオチド断片が互いにハイブリダイズできることを意味し、本条件は、Sambrook et al., Molecular Cloning : A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USAに記載されている。より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、６．０ｘＳＳＣ中で、約４５℃にてハイブリダイゼーションを行い、そして２．０ｘＳＳＣによって５０℃にて洗浄することを意味する。前記相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、通常、前述のヌクレオチド配列と一定以上の同一性を有し、その同一性は、例えば７０％以上が例示され、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、さらに特に好ましくは９９％以上である。ヌクレオチド配列の同一性は、市販のまたはインターネット等の電気通信回線を通じて利用可能な解析ツールを用いて知ることができ、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のソフトウェアを用いて計算できる。
　これらのポリヌクレオチドは、従来公知の遺伝子工学的手法や化学合成法などを用いて作製できる（Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)；Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press(1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）等参照）。例えば、所望のポリヌクレオチドを有する微生物をはじめ適当な起源から定法に従ってｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ライブラリーから、適切なプローブ等を用いて、所望のポリヌクレオチドを取得すればよい。また、当業者であれば前記ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、従来公知の手法に基づき容易に解析、入手すればよい。配列番号５３～５６のいずれかで表されるポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列は、それぞれ前記配列番号１～４で表されるアミノ酸配列に相当し、例えば、配列番号１～４いずれかで表されるアミノ酸の配列情報や、配列番号５３～５６のいずれかで表されるヌクレオチドの配列情報に基づいて、あるいは、前述のペプチドの配列情報などに基づいて、従来公知の化学的ＤＮＡ合成法により容易に作製、取得すればよい。
　抗体をコードするポリヌクレオチドが、前記低等電点ペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に連結されるか下流に連結されるか、また、抗体の分子内部に前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドが連結されるかについては、当業者が適宜決定すればよい。いずれにおいても、抗体の生理活性や立体構造を損なわない位置に連結することが好ましい。
　本発明のペプチド連結抗体発現ベクターには、必要に応じて前述のリンカーや切断部位が更に接続されていてもよい。リンカーを構成する塩基配列は、本発明の効果が得られる限り制限されず、従来公知の技術を用いて当業者が通常の検討範囲内で適宜決定すればよい。このようなリンカーとして前述のフレキシブルリンカーが例示され、該リンカーを好適に発現可能なヌクレオチド配列を、該ベクターに適宜接続すればよい。
　また、特にリンカーとして親和性ペプチドを用いる場合には、親和性ペプチドとして前述のものが例示され、親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチドについても前述と同様に説明される。例えば親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号５～５２のいずれかで示されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号５７～８６のいずれかで表される塩基配列を有するポリヌクレオチド、ヒスチジンからなるペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＴＡＴペプチドをコードするポリヌクレオチドなどが挙げられる。また、これらのうちいずれかのポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドなどが例示され、ストリンジェントな条件や各ポリヌクレオチドの作製手順等は前述と同様に説明される。
　親和性ペプチドなどのリンカー等も、本発明の効果を奏する限り、ペプチド連結抗体発現ベクターへの連結部位は制限されないが、好ましくは前記プロモーターの制御下に配置される。また、例えば、抗体－親和性ペプチド－低等電点ペプチドの順となるよう発現させたい場合には、ベクターにおいてポリヌクレオチドをこの順で連結させればよい。この際、前記この他のリンカーや切断部位も必要に応じて更に適宜連結させればよい。
　例えば、低等電点ペプチドを構成する塩基配列やリンカーを構成する塩基配列は、抗体をコードするポリヌクレオチドの５’末端側及び／または３’末端側など任意の場所に連結させることができ、抗体の所望の活性になるべく悪影響を与えないようにする点から、前記ペプチドやリンカーをコードするポリヌクレオチドは、抗体の可変部を構成する塩基配列以外に連結させることが好ましく、抗体の可変部を構成する塩基配列よりも５’末端側及び／または３’末端側がより好ましく、抗体の可変部を構成する塩基配列よりも３’末端側が更に好ましい。
　ベクターは、従来公知のように一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。より具体的には、本発明において使用されるベクターは、遺伝子工学分野において一般的に使用されている発現ベクターであれば制限されず、ｐＢＲ、ｐＵＣ、ｐＣＤ、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＣＭＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬをはじめとする、大腸菌等の細菌や酵母由来のプラスミドベクターや、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、バキュロウイルス、更にファージ等由来のウイルスベクターが例示される。これらのベクターは、前述するように宿主細胞との関係から適宜選択される。
　これらのベクターには、必要に応じてプロモーターが接続されており、プロモーターは宿主細胞に適したプロモーターであれば制限されず、従来公知のプロモーターを使用できる。例えば、プロモーターとしてｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｒａｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター等が挙げられ、これは例えば宿主細胞として大腸菌を用いる場合に使用される。また、例えば、プロモーターとしてＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター等が挙げられ、これは例えば宿主細胞として動物細胞を用いる場合に使用される。プロモーターとして、宿主細胞との関係等を考慮して、他に酵母細胞用プロモーター、昆虫細胞用プロモーター、ウイルスプロモーター等も使用することができる。プロモーターが内在しているベクターにおいては、内在のプロモーターを使用してもよい。
　本発明のペプチド連結抗体発現ベクターにおけるプロモーターの接続位置は、その宿主細胞において、前記ペプチド連結抗体が発現される限り制限されない。一般に、プロモーターは、前記ペプチド連結抗体をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の上流に接続される。すなわち、本発明のペプチド連結抗体発現ベクターにおいて、前記ペプチド連結抗体をコードするポリヌクレオチドは該プロモーターの制御下にある。
　宿主細胞としては、従来公知の原核細胞や真核細胞の各種細胞が使用でき、大腸菌、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、放線菌、糸状菌等の細菌、酵母、アスペルギルス、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫などの細胞、また、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ａｒｔ－２０細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ミエローマ細胞、ＧＨ３細胞、ＦＬ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＶ－１細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、アフリカツメガエルなどの卵母細胞等の動植物などの細胞が例示される。
　これらのベクター、プロモーター及び宿主細胞は、本分野の技術常識に基づき適宜組み合わせて使用すればよい。一例であるが組み合わせとしては、ｐＥＴ（Ｔ７プロモーター）／大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＧＥＸ（Ｔａｃプロモーター）／大腸菌ＢＬ２１が例示される。
　このほか、本発明のペプチド発現ベクターには、更に、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、薬剤耐性遺伝子、Green Fluorescent Protein（ＧＦＰ）等のマーカー遺伝等の塩基配列が接続されていてもよい。これらの塩基配列は、目的に応じて前記発現ベクターの任意の位置に接続される。
　本発明のペプチド連結抗体発現ベクターは、該分野で従来公知の方法を用いて作製すればよく、制限酵素等を用いて前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドや前記抗体をコードするポリヌクレオチドをはじめとする必要な塩基配列を、前記ベクター上の適切な位置に配置して作製すればよい。これら発現ベクターによれば、所望のペプチドが連結されてなる抗体を容易に獲得できる。
　また、本発明は、前記ペプチド連結抗体発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体を提供する。本発明において宿主細胞は、前述の宿主細胞が例示される。ペプチド連結抗体発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得る方法は特に制限されず、従来公知の一般的な方法に従い行えばよい。例えば、多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法に従って行うことができ、その具体的手法としては、塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、リポソーム等のカチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、ファージ等による感染等が挙げられる。
　また、本発明は、前記形質転換体から得られる、前記ペプチドが連結されてなる抗体を提供する。形質転換体、ペプチド、及び抗体については前述の通りである。本発明において前記ペプチドが連結されてなる抗体は、前記ペプチドと前記抗体とを前述のように連結することによって一体化させたペプチド融合抗体である。
　本発明において前記ペプチドが連結されてなる抗体は、前記形質転換体を適切な培地で培養し、該形質転換体及び／又は培養物から所望のペプチド融合抗体を回収することにより製造することができる。培養、回収する方法も特に制限されず、従来公知の一般的な方法に従い行えばよい。例えば、培養は、宿主細胞に適した任意の培地を用いて継代培養またはバッチ培養を行えばよく、形質転換体の内外に産生されたタンパク質量を指標にして、ペプチド融合抗体が適当量得られるまで行えばよい。該培養に用いられる培地としては、宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択すればよく、温度、時間等の培養条件も宿主細胞に適した従来公知の条件で実施すればよい。
　このようにして得られるペプチド融合抗体は、更に、必要に応じて、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作、例えば溶媒抽出、蒸留、各種クロマトグラフィー等の操作によって分離、精製してもよい（「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年、株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)等参照）。
　このようにして得られたペプチド融合抗体は、前記液相中での抗体のリフォールディング方法やリフォールディングされた抗体の製造方法に好ましく使用される。
　以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
試験例１：Anti-CEA scFvのリフォールディング効率の評価
１．後述する手順に従い、以下の実施例１－１～１－３及び比較例１に示す構造を備えた、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製した。
　なお、実施例１－１は癌胎児性抗原（CEA、carcinoembryonic antigen）に対する１本鎖抗体（anti-CEA scFv）に、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（PM）とヒスチジン残基（His）を直線状に連結させたものである。実施例１－２～１－３は、実施例１－１において配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに代えて、それぞれアスパラギン酸残基５個からなるペプチド（D5）、アスパラギン酸残基１０個からなるペプチド（D10）を用いた以外は、実施例１と同じ構造を有するものである。なお、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを連結させていない以外は、実施例１と同じ構造を有するものを比較例１とした。本試験例において「等電点」は、実施例１－１～１－３のペプチドが連結されてなる抗体、または比較例１におけるヒスチジンが連結されてなる抗体のアミノ酸配列から計算した値であり、市販のソフトウェアGenetyx ver6（株式会社ゼネティックス製）を用いて、その手順に従いアミノ酸配列を入力することによって算出された値である。
実施例１－１：anti-CEA scFv-PM-His（等電点４．９）
実施例１－２：anti-CEA scFv-D5-His（等電点４．７）
実施例１－３：anti-CEA scFv-D10-His（等電点４．４）
比較例１：anti-CEA scFv-His（等電点５．３）
　まず、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号５６）の３’末端側に６つのヒスチジン残基を連結させたヌクレオチド配列を合成し、これをpET22ベクター（メルク社製）のNot I/Xho Iサイトに導入した。次いで、anti-CEA scFvをPCRで増幅し、前記ベクターのNdeI/NotIサイトに導入した。これにより、T7プロモーター/Lacオペレーター→RBS→スタートコドン（ATG）- anti-CEA scFv→前記ペプチド-Stopコドン→T7ターミネーターの順で連結された、実施例１－１を作製するための発現ベクターを得た。同様に、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドに代えて、５つの連続するアスパラギン酸残基からなるポリヌクレオチド、または、１０つの連続するアスパラギン酸残基からなるポリヌクレオチドを用いた以外は同様にして、実施例１－２または実施例１－３を作製するためのするための発現ベクターを得た。また、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いない以外は実施例１－１同様にして、比較例１を作製するための発現ベクターを得た。
　このようにして得た各発現ベクターを用いてRosetta（登録商標）DE3 Competent Cells（Novagen社製）を形質転換し、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むLB-agarプレートで培養し、コロニーを形成させた。コロニーを採取して2xYT培地（アンピシリン及びクロラムフェニコール含有）10mL中に植菌し、一晩、200rpm、37℃で振盪培養して培養液を得た。続いて、500mLのバッフル付きフラスコにOvernight Express TB Instant Medium（メルク社製）を50mL加え、更にアンピシリン、クロラムフェニコール、培養液をOD=0.1となるように加えて37℃、200rpm、24時間振盪培養した。
　培養後、菌体を遠心分離によって回収し、PBS(NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 8.1mM, KH2PO41.47 mM (pH 7.4))を5mL加えて超音波破砕し、遠心分離によって封入体を回収し、封入体を蒸留水で3回洗浄したのち凍結乾燥した。このようにすることによって、粉末状の、前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体を得た。
　このようにして得られた粉末状の封入体を6M塩酸グアニジン溶液に可溶化し（25℃、10分）、遠心分離（25℃、10,000rpm、15分）して上清を回収した。次いで、His-Trap HPカラム（GEヘルスケア社製）を8M 尿素、20mMイミダゾールを含む2xPBSで平衡化し、そこに、前述のようにして得た上清を供給して、前記ペプチドが連結されてなる抗体をカラムに吸着させ、8M 尿素、0.4M イミダゾールを含む2xPBSで溶出し、得られた溶出液を、8M尿素を含むPBSで透析し、前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体を終濃度500μg/mLで含有する溶液を得た。
　後述するリフォールディング用の液相をBD Flacon（登録商標）９６ウェルマイクロプレートウェル（日本ベクトンディッキンソン社製）内に準備し、前述のようにして変性させた、前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体を、終濃度200μug/mL(0.5M Uera)となるようにそれぞれのウェル中へ分散させた（総体積200uL）。
　リフォールディング用の液相について、後述の図中、pH6の液相は0.05M MESグッドバッファー（商品名MES(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic Acid)、ナカライテスク社製）、pH6.5の液相は0.05M ADAグッドバッファー（商品名ADA(N-(2-Acetamido)iminodiacetic Acid)、ナカライテスク社製）、pH7の液相は0.05M MOPSグッドバッファー（商品名MOPS(3-(N-Morpholino)propanesulfonic Acid)、ナカライテスク社製）、pH7.5の液相は0.05M HEPESグッドバッファー（商品名HEPES(2-[4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl]ethanesulfonic Acid)、ナカライテスク社製）、pH8の液相は0.05M EPPSグッドバッファー（商品名EPPS(N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-3-propanesulfonic Acid)、ナカライテスク社製）、pH8.5の液相は0.05M TAPSグッドバッファー（商品名TAPS(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic Acid)、ナカライテスク社製）を用いて、また、必要に応じて、NDSB及び／またはNaClを添加することにより準備した。また、図中の各液相のpH（6.0～7.5）、NDSB（１－（３－スルホナトプロピル）ピリジニウム、0Mまたは0.5M）、NaCl濃度（0～300mM）は、マイクロプレートウェルにおいて前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体を分散させた後の液相中の値である。
　前述のようにして分散させた後、室温でインキュベートしながら、インキュベート開始時から30分おきに合計６時間、波長450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。得られた吸光度を凝集体の指標として評価した。吸光度値が高いほど、凝集体すなわちリフォールディングされていない抗体が多く残存していることを示す。
２．結果を図１及び図２示す。図はいずれも６時間インキュベートした後に測定した結果である。
　実施例１－１（anti-CEA scFv-PM-His）及び比較例１（anti-CEA scFv-His）を用いた結果を図１に示す。図１から明らかなように、比較例１に対して、実施例１－１においてOD値が著しく小さいことが確認された。図１はOD値が小さいほど不溶で不活性な凝集体としての抗体が減少していることを示し、すなわち、OD値が小さいほどリフォールディング効率が高いことを示す。なお、図１において、例えばpH6.0-、0mMで示されるものは、pH6、NDSB無添加、NaCl 0mMの液相に分散させてリフォールディングを行ったことを示し、pH6.0+、50mMで示されるものは、pH6、NDSB 0.5M、NaCl 50mMの液相に分散させてリフォールディングを行ったことを示す。また、図中、例えば「pH6.0-」や「pH6.0+」においてはそれぞれ４本のバーが示されているが、これは左から順に、すなわち図１の比較例１（anti-CEA scFv-His）の結果を示すグラフにおいて「pH6.0-」のバーの上部に示されている１～４の数字の小さいほうから順にNaCl 0mM、50mM、150mM、300mMの結果を示す。後述する同様の図においても同様に説明される。
　また、図中には示さないが、pH8やpH8.5の液相に分散させた場合であっても、NDSBの添加の有無、NaCl濃度にかかわらず、実施例１－１においてpH7の場合と同様の良好な結果が得られた。
　また、実施例１－２及び１－３を用いた場合の効果を図２に示す。図２から明らかなように、実施例１－２及び１－３のいずれにおいても前述の比較例１と比べてOD値が著しく小さいことが確認された。
　このことから、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドを連結させた不活性な抗体を変性させ、これを液相に分散させることによって、該ペプチドを連結させていない抗体を用いた場合と比較して、抗体のリフォールディング効率が著しく向上されることが確認できた。
試験例２：Anti-RNase scFvのリフォールディング効率の評価
１．以下の手順で、以下の実施例２－１～２－５及び比較例２に示す構造を備えた、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製した。
実施例２－１：anti-RNase scFv-PM-His（等電点５．９６）
実施例２－２：anti-RNase scFv-D5-His（等電点５．７５）
実施例２－３：anti-RNase scFv-D10-His（等電点４．９３）
実施例２－４：anti-RNase scFv-D15-His（等電点４．５５）
実施例２－５：anti-RNase scFv-D20-His（等電点４．３２）
比較例２：anti-RNase scFv-His（等電点７．２６）
　抗体としてRNaseに対する１本鎖抗体を用いた以外は試験例１の実施例１－１～１－３及び比較例１と同様にして、実施例２－１～２－３及び比較例２に示す、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製した。
　更に、抗体としてRNaseに対する１本鎖抗体を用い、アスパラギン酸残基５個からなるペプチドに代えてアスパラギン酸残基１５個からなるペプチド（D15）またはアスパラギン酸残基２０個からなるペプチド（D20）を用いる以外は試験例１の実施例１－２と同様にして、実施例２－４及び２－５に示す、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製した。なお、該調製において、実施例１－２において使用した５つの連続するアスパラギン酸残基からなるポリヌクレオチドに代えて、１５つの連続するアスパラギン酸残基からなるポリヌクレオチド、または、２０つの連続するアスパラギン酸残基からなるポリヌクレオチドを用いた以外は同様にして実施例２－４及び２－５を作製するためのするための発現ベクターを使用した。
　次いで、実施例２－１～２－５及び比較例２に示される抗体に対して試験例１と同様の手順にて変性、リフォールディングを行い、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を評価した。
２．結果を図３及び図４に示す。
　実施例２－１及び比較例２を用いた場合の効果を図３に示す。図３から明らかなように、比較例２に対して、実施例２－１においてOD値が著しく小さいことが確認された。
　また、実施例２－２～２－５を用いた場合の効果を図４に示す。図４から明らかなように、実施例２－２～２－５のいずれにおいても前述の比較例２と比べてOD値が著しく小さいことが確認された。
　このことから、anti-RNase scFvにおいても、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドを連結させた不活性な抗体を変性させ、液相に分散させることによって、該ペプチドを連結させていない抗体を用いた場合と比較して、抗体のリフォールディング効率が著しく向上できることが確認できた。
試験例３：Anti-CRP scFvのリフォールディング効率の評価
１．以下の手順で、次の実施例３－１～３－５及び比較例３に示す構造を備えた、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製した。試験例２とは異なる抗体である、Ｃ反応性蛋白（CRP、C-reactive protein）に対する１本鎖抗体を用いた以外は試験例２と同様にして試験を行った。
実施例３－１：anti-CRP scFv-PM-His（等電点５．９）
実施例３－２：anti-CRP scFv-D5-His（等電点５．８）
実施例３－３：anti-CRP scFv-D10-His（等電点５）
実施例３－４：anti-CRP scFv-D15-His（等電点４．６）
実施例３－５：anti-CRP scFv-D20-His（等電点４．４）
比較例３：anti-CRP scFv-His（等電点６．６）
２．結果を図５及び図６に示す。
　実施例３－1及び比較例３を用いた場合の効果を図５に示す。図５から明らかなように、比較例３に対して、実施例３－１においてOD値が著しく小さいことが確認された。
　また、実施例３－２～３－５を用いた場合の効果を図６に示す。図６から明らかなように、実施例３－２～３－５のいずれにおいても前述の比較例３と比べてOD値が著しく小さいことが確認された。
　このことから、anti-CRP scFvにおいても、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドを連結させた不活性な抗体を変性させ、液相に分散させることによって、該ペプチドを連結させていない抗体を用いた場合と比較して、抗体のリフォールディング効率が著しく向上できることが確認された。
試験例４：Anti-TSH、Anti-IgA、Anti-IgGまたはAnti-TF189のscFvのリフォールディング効率の評価
１．前述の実施例１において抗体としてTSH、IgA、IgGまたはTF189を用いる以外は同様にして実施例４～７に示す構造を備えた、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製し、同様にして試験を行った。
実施例４：anti-TSH scFv-PM-His（等電点６．４１）
実施例５：anti-IgA scFv-PM-His（等電点６．４９）
実施例６：anti-IgG scFv-PM-His（等電点６．１４）
実施例７：anti-TF189 scFv-PM-His（等電点５．８６）
２．結果を図７に示す。
　図７に示すように、抗体としてTSH、IgA、IgGまたはTF189の１本鎖抗体を用いた場合も、前記ペプチドを連結させることによってリフォールディング効率を高めることができた。なお、図中、例えば「pH7.5-」や「pH7.5+」においてはそれぞれ４本のバーが示されているが、これは左から順にTSH、IgA、IgG、TF189の結果を示す。また、図はイオン強度（NaCl濃度）0ｍMの溶液に分散させてリフォールディングを行った結果である。
試験例５：リフォールディング効率の算出
　前記実施例１－１、実施例２－１、実施例３－１、実施例４及び比較例１に示される不活性な抗体を以下のように変性、リフォールディングを行うことによって、これらにおけるリフォールディング効率を算出した。
　具体的には、それぞれの前記ペプチドを連結させた不活性な抗体を、終濃度500μg/mLとなるように8M 尿素を含有するPBS中に希釈した。このようにして変性させたそれぞれの前記ペプチドを連結させた不活性な抗体を、液相（0.05M TAPSグッドバッファー、pH8.5、NDSB201無添加、NaCl濃度0mM）に透析により18時間分散させた（最終濃度0.5M Uera）。10000g、25℃で、2分間遠心分離を行い、上清を回収した。遠心分離前後の抗体濃度をDC Protein Assay Kit（バイオラッドラボラトリーズ社製）によって定量し、遠心後に回収した上清中の抗体濃度を、遠心直前の液相中の抗体濃度で除して回収率を算出した。
　その結果、実施例１－１におけるリフォールディング効率は９１．２％であり、これは比較例１におけるリフォールディング効率４３．９％を、２倍以上で上回る回収率であった。また、リフォールディング効率は、実施例２－１では８８％、実施例３－１では９０％、実施例４では９３％であり、いずれも高効率であった。
試験例６：リフォールディングされた抗体の基材への固定化
１．配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(PM)は、ポリメタクリル酸メチル(PMMA)製の基材に親和性を有しており、実施例２－１において該ペプチドは１本鎖抗体に連結されている。このことから、前述のようにして得た、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが連結されたリフォールディングされた抗体を、ポリメタクリル酸メチル製の基材と接触させることによって、該ペプチドを介してリフォールディングされた抗体が該基材上に良好に固定できるかどうかについて検討した。比較例として、前記比較例２をリフォールディングしたものを用いた。なお、リフォールディングでは0.05M TAPSグッドバッファーを用い、pH8.5、NDSB201無添加、NaCl濃度0mMに調整した液相を用いた。
　具体的には、リフォールディング後に得られた各抗体をPBSで２倍ずつ段階希釈し、ポリメタクリル酸メチル製のマイクロプレート中に100μLずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、マイクロプレートをPBST(PBS-0.1％Tween20)で洗浄後、２％BSA-PBSTを300μLずつ加えて25℃で１時間インキュベートした。PBSTでプレートを洗浄後、２％BSA-PBSTで100ng/mLに希釈したビオチン化RNase（抗原）を100μLずつ加えて２５℃で1時間インキュベートした。PBSTでプレートを洗浄後、２％BSA-PBSTで5000倍希釈したHRP標識ストレプトアビジンを100μLずつ加えて２５℃で１時間インキュベートした。PBSTで洗浄後、TMB基質溶液を100μLずつ加えて２５℃で１５分インキュベートし、0.3M H2SO4を100μLずつ加えて発色反応を停止した。マイクロプレートリーダーで波長４５０ｎｍにおける吸光度（副波長６５０ｎｍ）を測定した。
２．結果を図８に示す。該結果から明らかなように、実施例２－１を用いた場合には、基材上での活性が、リフォールディングされた抗体の濃度依存的に向上した。これに対して、前記ペプチドが連結されていない比較例２を用いた場合には、リフォールディングされた抗体に基づく活性が著しく低かった。このことから、実施例２－１で用いられたペプチドは、抗体の変性及びリフォールディング後であっても、そのポリメタクリル酸メチルに対する良好且つ特異的な親和性を維持していることが確認され、前述のようにしてリフォールディングされた抗体も、その特有の活性を十分に保持していることが確認された。
試験例７：低等電点ペプチド及び親和性ペプチドを連結させた抗体における、リフォールディング効率の評価
１．前記実施例２－４において連結させたペプチドに加えて、以下の親和性ペプチドを連結させた以外は試験例２と同様にして、抗体のリフォールディング効率を比較した。ここで、下記PSは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる親和性ペプチドであり、親水性ポリスチレンに対して親和性を有する。下記SiNは、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなる親和性ペプチドであり、窒化ケイ素に対して親和性を有する。実施例８－１においてPSとD15との間に酵素により切断可能な切断部位を連結させた。同様に、実施例８－２においてSiNとD15との間に切断部位を連結させた。また、実施例２－４の低等電点ペプチドに代えて、前記親和性ペプチドを連結させたものを、比較例４（PS）及び比較例５（SiN）とした。なお、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドは配列番号６１で表され、配列番号２９で表されるアミノ酸配列ペプチドをコードするポリヌクレオチドは配列番号６３で表される。
実施例２－４：anti-RNase scFv-D15-His（等電点４．５５）
実施例８－１：anti-RNase scFv-PS-D15-His（等電点５）
実施例８－２：anti-RNase scFv-SiN-D15-His（等電点４．８３）
比較例２：anti-RNase scFv-His（等電点７．２６）
比較例４：anti-RNase scFv-PS-His（等電点８．９７）
比較例５：anti-RNase scFv-SiN-His（等電点８．１４）
２．結果を図９及び１０に示す。
　図９はPSを用いた結果であり、図１０はSiNを用いた結果である。図９から明らかなように、親和性ペプチドPSの存在下でも、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結された不活性な抗体ではODが低く、その抗体のリフォールディング効率を高めることができた。同様に、図１０においても同様に、親和性ペプチドSiNの存在下でも、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結された不活性な抗体では、その抗体のリフォールディング効率を高めることができた。
試験例８：リフォールディングされた抗体の基材への固定化
１．前記実施例２－１、実施例２－４、実施例８－１を用いて、リフォールディングされた抗体を、ポリメタクリル酸メチル製の基材と接触させることによって、前記ペプチドを介してリフォールディングされた抗体が前記基材上に良好に固定できるかどうかについて検討した。
　具体的には、前記実施例２－４、実施例８－１、比較例４をそれぞれ前記試験例７に従いリフォールディングさせたのち（液相0.05M TAPSグッドバッファー、pH8.5、NDSB201無添加、NaCl濃度0mM）、各ペプチドが連結されてなるリフォールディングされた抗体が50ug/mLの濃度になるようPBSで調製し、これをポリメタクリル酸メチル製の基材（マイクロプレート）に100uLずつ加えて25℃で2時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、2%BSAを含むPBST（2% BSA-PBST）を300uLずつ加え、25℃で1時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、biotin標識RNaseを0～1ug/mLとなるよう2%BSA-PBSTで希釈し、100uLずつ加えて25℃で1時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、HRP標識ストレプトアビジンを0.2ug/mLとなるよう2%BSA-PBSTで希釈し、100uLずつ加えて25℃で1時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、TMBを100uLずつ加えて25℃で15分間インキュベートし、0.3M硫酸を100uL加えて発色反応を停止させた(発色反応)。その後、450nmにおける吸光度（副波長 650nm）をマイクロプレートリーダーで測定した。
　また、ポリメタクリル酸メチル製の基材（マイクロプレート）を親水性ポリスチレン製の基材（マイクロプレート）に代えた以外は前述と同様にして前記実施例２－４、実施例８－１を用いて試験を行い、親水性ポリスチレン製の基材に対して固定の程度を測定した。
２．結果を図１１及び１２に示す。
　図１１から明らかなように、ポリメタクリル酸メチルに親和性を有し、且つ、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチド（PM）が導入されている実施例２－１においてリフォールディングされた抗体によれば、該リフォールディングされた抗体に連結されているPMの効果によって、ポリメタクリル酸メチル製の基材にリフォールディングされた抗体が高密度に固定化され、ポリメタクリル酸メチルに親和性を有するペプチドが連結されていない他のリフォールディングされた抗体と比較して、高いシグナルが得られた。
　また、図１２においても同様の傾向が認められ、親水性ポリスチレンに親和性を有するペプチド（PS）と不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドの両ペプチドが導入されている実施例８－１においてリフォールディングされた抗体によれば、該リフォールディングされた抗体に連結されているPSの効果によって、親水性ポリスチレン製の基材にリフォールディングされた抗体が高密度に固定化され、親水性ポリスチレンに親和性を有するペプチドが連結されていない他のリフォールディングされた抗体と比較して、高いシグナルが得られた。
試験例９：重鎖Fab、軽鎖Fabのリフォールディング効率の評価
１．実施例１－１（anti-CEA scFv-PM-His）における一本鎖抗体を、CEAに対する重鎖のFab抗体（Fab H）またはCEAに対する軽鎖のFab抗体（Fab L）に代えた以外は、試験例１と同様にして、以下の実施例９－１及び実施例９－２に示される、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を作製した。また、実施例２－１（anti-RNase scFv-PM-His）における一本鎖抗体を、RNaseに対する重鎖のFab抗体（Fab H）またはRNaseに対する軽鎖のFab抗体（Fab L）に代えた以外は、試験例２と同様にして、以下の実施例９－３及び実施例９－４に示される、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を作製した。また、実施例７（anti-TF189 scFv-PM-His）における一本鎖抗体を、TF189に対する重鎖のFab抗体（Fab H）またはTF189に対する軽鎖のFab抗体（Fab L）に代えた以外は、試験例４と同様にして、以下の実施例９－５及び実施例９－６に示される、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を作製した。また、同様に、抗体としてAFPを用いる以外は実施例９－１等と同様にして、以下の実施例９－７及び実施例９－８に示される、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を作製した。
実施例９－１：anti-CEA Fab H-PM-His　（等電点４．９１）
実施例９－２：anti-CEA Fab L-PM-His　（等電点５．８１）
実施例９－３：anti-RNase Fab H-PM-His　（等電点６．３２）
実施例９－４：anti-RNase Fab L-PM-His　（等電点５．５５）
実施例９－５：anti-TF189 Fab H-PM-His　（等電点６．５４）
実施例９－６：anti-TF189 Fab L-PM-His　（等電点５．３３）
実施例９－７：anti-AFP Fab H-PM-His　（等電点７．２９）
実施例９－８：anti-AFP Fab L-PM-His　（等電点５．８１）
　得られた実施例９－１～９－８のペプチドが連結されてなる不活性な抗体を、前記試験例１と同様にして変性、リフォールディングを行い、そのリフォールディング効率を評価した。なお、本試験例では、変性、リフォールディングは実施例９－１～９－８がそれぞれ単独で存在する条件下で行うことに加えて、実施例９－１及び９－２が共存する条件下（anti-CEA Fab-PM-His (H+L)）、実施例９－３及び９－４が共存する条件下（anti-RNase Fab-PM-His (H+L)）、実施例９－５及び９－６が共存する条件下（anti-TF189 Fab-PM-His (H+L)）、実施例９－７及び９－８が共存する条件下（anti-AFP Fab-PM-His (H+L)）でも行った。
２．結果を図１３～図１６に示す。
　図１３～図１６は、それぞれCEA、RNase、TF189、AFPに関する各結果を示す。これらの結果から明らかなように、いずれにおいてもOD値が小さく、効率良くリフォールディングされていることが確認された。
試験例１０：リフォールディング効率の算出
　試験例９において実施例９－１及び９－２が共存する条件下（anti-CEA Fab-PM-His (H+L)）、実施例９－３及び９－４が共存する条件下（anti-RNase Fab-PM-His (H+L)）、実施例９－５及び９－６が共存する条件下（anti-TF189 Fab-PM-His (H+L)）を用いて、前記試験例５と同様にして変性、リフォールディングを行うことによって、これらにおけるリフォールディング効率を算出した。
　その結果、リフォールディング効率は、anti-CEA Fab-PM-His (H+L)では９３％、anti-RNase Fab-PM-His (H+L)では１００％、anti-TF189 Fab-PM-His (H+L)では１００％であり、いずれも高効率であった。
試験例１１：リフォールディングされた重鎖Fab、軽鎖Fabの活性評価
１．以下のペプチドを連結させた不活性な抗体を、前記試験例１０と同様にして変性、リフォールディングすることによって得た、リフォールディングされた各抗体を、後述の手順に従いポリメタクリル酸メチル製の基材と接触させ、固定された各抗体の活性を評価した。また、前記試験例１０において用いたanti-CEA Fab -PM-His (H+L)、anti-RNase Fab -PM-His (H+L)、anti-TF189 Fab -PM-His (H+L)についてもリフォールディングを行い、同様にしてポリメタクリル酸メチル製の基材と接触させて、固定された各抗体の活性を評価した。リフォールディングは、0.05M TAPSグッドバッファーを用い、pＨ8.5、NDSB201無添加、NaCl濃度0mMに調整された液相を用いて行った。
－CEAに対する抗体
実施例１－１：anti-CEA scFv-PM-His
実施例９－１：anti-CEA Fab H-PM-His
実施例９－２：anti-CEA Fab L-PM-His
－RNaseに対する抗体
実施例２－１：anti-RNase scFv-PM-His
実施例９－３：anti-RNase Fab H-PM-His
実施例９－４：anti-RNase Fab L-PM-His
－TF189に対する抗体
実施例７：anti-TF189 scFv-PM-His
実施例９－５：anti-TF189 Fab H-PM-His
実施例９－６：anti-TF189 Fab L-PM-His
　より具体的には、前述のようにして得た、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる、リフォールディングされた抗体（anti-CEA抗体、anti-RNase抗体）が100ug/mLの濃度になるようPBSで調製し、これをポリメタクリル酸メチル製の基材（マイクロプレート）に100uLずつ加えて25℃で2時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、2%BSAを含むPBST（2% BSA-PBST）を300uLずつ加え、25℃で1時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、biotin標識CEAまたはbiotin標識RNaseを0～1ug/mLとなるよう2%BSA-PBSTで希釈し、100uLずつ加えて25℃で1時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、HRP標識ストレプトアビジンを0.2ug/mLとなるよう2%BSA-PBSTで希釈し、100uLずつ加えて25℃で1時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、TMBを100uLずつ加えて25℃で15分間インキュベートし、0.3M硫酸を100uL加えて発色反応を停止させた。その後、450nmにおける吸光度（副波長 650nm）をマイクロプレートリーダーで測定した。
　また、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる、リフォールディングされた抗体（anti-TF189抗体）については、同様に、前述のようにして得たペプチドが連結されてなるリフォールディングされた抗体が100ug/mLの濃度になるようPBSで調製し、これをポリメタクリル酸メチル製の基材（マイクロプレート）に100uLずつ加えて25℃で2時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、2%BSAを含むPBST（2% BSA-PBST）を300uLずつ加え、25℃で1時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、Transferrinを0～1ug/mLとなるよう2%BSA-PBSTで希釈し、100uLずつ加えて25℃で1時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、biotin標識抗Transferrin抗体を0.25ug/mLとなるよう2%BSA-PBSTで希釈し、100uLずつ加えて25℃で1時間インキュベートした。これ以降の手順は前述同様にして行い、吸光度測定した。
２．結果を図１７～１９に示す。
　図１７～１９から明らかなように、特にFab LとFab Hを混合させた場合に、一本鎖抗体を用いた場合と同様に、所望の活性が観察された。通常、H鎖とL鎖はこれらが協力して抗原認識を行うと考えられている。本試験例において、Fab HやFab Lが単独で存在する場合と比較して、Fab LとFab Hとが共存させてリフォールディングを行い、この場合に高い活性が認められたことは、本発明によれば抗体に由来する所望の活性が良好に回復されていることを示している。
試験例１２：VHHのリフォールディング効率の評価
　前述の実施例１において抗体としてラクダ由来VHHを用いる以外は同様にして実施例１０に示す構造を備えた、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製し、同様にして試験を行った。また、比較のため、比較例６に示す構造を備えた抗体を調製し、同様にして試験行った。
実施例１０：VHH-PM-His（等電点６．０５）
比較例６：VHH-His（等電点８．２０）
　図２０に示すように、抗体としてVHH単ドメイン抗体を用いた場合も、前記ペプチドを連結させることによって凝集が著しく解消され、これによってリフォールディング効率を高めることができることが分かった。液相のｐＨが７．５など更に低い場合であっても、同様の傾向が認められた。
試験例１３：リフォールディング効率の算出
　試験例１２に記載される実施例１０及び比較例６を用いて、前記試験例５と同様にして変性、リフォールディングを透析によって行い、これらにおけるリフォールディング効率を算出した。具体的には、8M Urea-PBSに溶解させた実施例１０（VHH-PM-His）を、0.5mg/mL VHH-PM-His、0.5M Urea、50mM TAPSとなるよう希釈して得た溶液1mLを透析チューブ内に入れ、50mM TAPS 1Lの外液に対して4℃で一晩透析した。次いで、透析チューブ内の溶液を回収し、遠心分離によって凝集体を除去した。遠心分離前後のタンパク質濃度をDC Protein Assay（バイオラッドラボラトリーズ社製）によってそれぞれ定量し、回収率を算出した。比較例６（VHH-His）についても同様にして回収率を算出した。
　その結果、実施例１０では回収率が９５％であったのに対し、比較例６では回収率が２０％であった。このことから、抗体としてVHHを用いた場合であっても不活性な抗体を効率よくリフォールディングできたことが分かった。
試験例１４：リフォールディング効率の算出
　試験例１３とは異なる方法を用いて、実施例１０についてリフォールディング効率を算出した。具体的には、ゲルクロマトグラフィーによってリフォールディング効率を算出した。まず、AKTA Purifier UPC10 クロマトグラフィシステム（GEヘルスケア社製）にゲル濾過カラムHi Trap Desalting（GEヘルスケア社製） 5mL を2個連結してセットし、50mM TAPS (pH 8.5)で平衡化した。次に、8M Urea-PBSに溶解させた実施例１０（VHH-PM-His）を、0.5mg/mL VHH-PM-His、0.5M Urea、50mM TAPS、0.5M NDSB201となるよう希釈して得た溶液2mLを前記カラムに負荷し、50mM TAPS (pH 8.5)を供給した。次いで 最初に溶出されるタンパク質のピークを含有する溶液を回収した（3mL回収）。 回収したタンパク質溶液の濃度をDC protein assay（バイオラッドラボラトリーズ社製）で定量し、アプライ量と回収量から回収率を算出した。その結果、実施例１０では回収率が９９％であった。このことから、抗体としてVHHを用いた場合であっても不活性な抗体を効率よくリフォールディングできたことが分かった。
試験例１５：リフォールディングされたVHHの基材への固定及び活性評価
１．前記実施例１０を用いてリフォールディングされた抗体を、ポリメタクリル酸メチル製の基材と接触させることによって、前記ペプチドを介してリフォールディングされた抗体が前記基材上に良好に固定できるかどうかについて検討した。また、当該固定化された抗体がその活性を維持しているかどうかについて検討した。比較例６についても同様にして検討した。
　具体的には、前記実施例１０を試験例１３に従いリフォールディングさせたのち、ペプチドが連結されてなるリフォールディングされた抗体が45ug/mLの濃度になるようPBSで調製し、これをポリメタクリル酸メチル製の基材（マイクロプレート）に100uLずつ加えて25℃で2時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、2% BSA-PBSTを300uLずつ加え、25℃で1時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、biotin標識hCGを0～1ug/mLとなるよう2%BSA-PBSTで希釈し、100uLずつ加えて25℃で1時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、HRP標識ストレプトアビジンを0.2ug/mLとなるよう2%BSA-PBSTで希釈し、100uLずつ加えて25℃で1時間インキュベートした。次いで、PBSTで5回基材を洗浄後、TMBを100uLずつ加えて25℃で15分間インキュベートし、0.3M硫酸を100uL加えて発色反応を停止させた(発色反応)。その後、450nmにおける吸光度（副波長 650nm）をマイクロプレートリーダーで測定した。
２．結果を図２１に示す。
　図２１から明らかなように、ポリメタクリル酸メチルに親和性を有し、且つ、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチド（PM）が導入されている実施例１０においてリフォールディングされた抗体によれば、該リフォールディングされた抗体に連結されているPMの効果によって、ポリメタクリル酸メチル製の基材にリフォールディングされた抗体が高密度に固定化され、ポリメタクリル酸メチルに親和性を有するペプチドが連結されていない抗体と比較して、高いシグナルが得られた。このことから、実施例１０においてリフォールディングされた抗体が基材に高密度に固定化され、また、抗体に由来する所望の活性が良好に回復されていることが分かった。

Claims (19)

  1. （１－１）ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する、及び、
    （１－２）前記工程（１－１）において変性した、前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程、
    を含む、液相中での抗体のリフォールディング方法。
  2. 抗体が１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単ドメイン抗体、多価性１本鎖抗体、定常部融合１本鎖抗体及び完全長抗体からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載のリフォールディング方法。
  3. 前記ペプチドの等電点が８．５以下である、請求項１または２に記載のリフォールディング方法。
  4. （２－１）ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する、及び、
    （２－２）前記工程（２－１）において変性した、前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程、
    を含む、リフォールディングされた抗体の製造方法。
  5. 抗体が１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単ドメイン抗体、多価性１本鎖抗体、定常部融合１本鎖抗体及び完全長抗体からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の製造方法。
  6. 前記ペプチドの等電点が８．５以下である、請求項４または５に記載の製造方法。
  7. 前記リンカーが、基材に対して親和性を有するペプチドである、請求項４～６のいずれかに記載の製造方法。
  8. 請求項４～７のいずれかに記載の製造方法によって得られる、リフォールディングされた抗体。
  9. 請求項１～３のいずれかに記載の方法によってリフォールディングされた抗体及び／または請求項４～７のいずれかに記載の製造方法によって得られたリフォールディングされた抗体を、基材に接触させる工程を含有する、リフォールディングされた抗体の基材への固定化方法。
  10. 抗体に連結されたペプチドを介して、抗体が基材に固定される、請求項９に記載の固定化方法。
  11. 前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが以下の（ａ）または（ｂ）に示すペプチドであり、基材がポリカーボネート及びポリメタクリル酸メチルからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項９または１０に記載の固定化方法、
    （ａ）配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
    （ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリカーボネート及びポリメタクリル酸メチルからなる群より選択される少なくとも１種に親和性を有するペプチド。
  12. 請求項９～１１のいずれかに記載の固定化方法によってリフォールディングされた抗体が固定されてなる、基材。
  13. ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を含有する、液相中での抗体のリフォールディング用組成物、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する。
  14. 更に、前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体の等電点よりもｐＨが０．５以上高い溶液を含有する、請求項１３に記載の組成物。
  15. 抗体をコードするポリヌクレオチドと、該抗体の等電点より低い等電点を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドとが直接またはリンカーを介して連結されてなる、液相中での抗体のリフォールディング用ペプチド連結抗体発現ベクター。
  16. 請求項１５に記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
  17. 請求項１６に記載の形質転換体から得られる、ペプチドが連結されてなる抗体。
  18. アスパラギン酸残基からなるペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる抗体、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する。
  19. 前記抗体が、不活性な抗体またはリフォールディングされた抗体である、請求項１８に記載の抗体。
     
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020533980A (ja) * 2017-09-07 2020-11-26 コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ 組換えタンパク質の分泌を増加させる方法
WO2021193566A1 (ja) * 2020-03-23 2021-09-30 国立大学法人京都工芸繊維大学 新規抗体及びその用途
US11168139B2 (en) 2016-11-28 2021-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding domain, and polypeptide including conveying section
US12030955B2 (en) 2017-11-28 2024-07-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide including antigen-binding domain and carrying section
US12060654B2 (en) 2016-11-28 2024-08-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule having adjustable ligand binding activity
US12077577B2 (en) 2018-05-30 2024-09-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide comprising aggrecan binding domain and carrying moiety

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201841935A (zh) * 2017-04-11 2018-12-01 國立研究開發法人產業技術總合研究所 凝集素的固定化方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005033307A1 (ja) 2003-09-30 2005-04-14 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 新規のリフォールディング方法およびその方法によって得られたタンパク質
JP2007537139A (ja) 2003-12-15 2007-12-20 エム−ファシス ゲー・エム・ベー・ハー 単分散形態のリフォールディングされた膜タンパク質
JP2008520616A (ja) 2004-11-24 2008-06-19 アプラーゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 固相ペプチド合成および精製方法
WO2009101807A1 (ja) 2008-02-14 2009-08-20 National University Corporation Kyoto Institute Of Technology ペプチド、当該ペプチドの用途及び生産方法並びに当該ペプチドが固定化された固相及びその生産方法
JP2011168505A (ja) 2010-02-16 2011-09-01 Kyoto Institute Of Technology ポリカーボネートおよび／またはポリメタクリル酸メチル親和性ペプチド、およびその利用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002226930A1 (en) * 2000-11-17 2002-05-27 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Reduction of the nonspecific animal toxicity of immunotoxins by mutating the framework regions of the fv to lower the isoelectric point
GB0224082D0 (en) * 2002-10-16 2002-11-27 Celltech R&D Ltd Biological products
US20060216775A1 (en) 2003-06-17 2006-09-28 The Regents Of The University Of Califoenia Compositions and methods for analysis and manipulation of enzymes in biosynthetic proteomes
US8883985B2 (en) * 2010-02-16 2014-11-11 National University Corporation Kyoto Institute Of Technology Antibody-immobilized carrier, method of producing antibody-immobilized carrier, and use of said antibody-immobilized carrier

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005033307A1 (ja) 2003-09-30 2005-04-14 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 新規のリフォールディング方法およびその方法によって得られたタンパク質
JP2007537139A (ja) 2003-12-15 2007-12-20 エム−ファシス ゲー・エム・ベー・ハー 単分散形態のリフォールディングされた膜タンパク質
JP2008520616A (ja) 2004-11-24 2008-06-19 アプラーゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 固相ペプチド合成および精製方法
WO2009101807A1 (ja) 2008-02-14 2009-08-20 National University Corporation Kyoto Institute Of Technology ペプチド、当該ペプチドの用途及び生産方法並びに当該ペプチドが固定化された固相及びその生産方法
JP2011168505A (ja) 2010-02-16 2011-09-01 Kyoto Institute Of Technology ポリカーボネートおよび／またはポリメタクリル酸メチル親和性ペプチド、およびその利用

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Biochemistry Data Book II", 1980, KAGAKU-DOJIN PUBLISHING CO., INC., pages: 1175 - 1259
"Lectures on Biochemical Experiments (Genetic Research Methods I, II, III", JOURNAL OF THE JAPANESE BIOCHEMISTRY SOCIETY, 1986
"Molecular Cloning 2d Ed", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
BIOCHEMISTRY, vol. 25, no. 25, 1986, pages 8274
EUR. J. BIOCHEM., vol. 163, 1987, pages 313
KUMADA Y. ET AL.: "N ovel solid-phase refolding method for preparation of scFv-immobilized polystyrene plates with high-antigen-binding activity.", ANAL. BIOANAL. CHEM., vol. 398, no. 3, 2010, pages 1295 - 1303, XP019839541 *
PROC. NATL. ACAD. SCI., USA., vol. 78, 1981, pages 6613
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
SCIENCE, vol. 222, 1983, pages 778
See also references of EP2957633A4

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11168139B2 (en) 2016-11-28 2021-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding domain, and polypeptide including conveying section
US11932697B2 (en) 2016-11-28 2024-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding domain, and polypeptide including conveying section
US12060654B2 (en) 2016-11-28 2024-08-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule having adjustable ligand binding activity
JP2020533980A (ja) * 2017-09-07 2020-11-26 コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ 組換えタンパク質の分泌を増加させる方法
JP7016552B2 (ja) 2017-09-07 2022-02-07 コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ 組換えタンパク質の分泌を増加させる方法
US12030955B2 (en) 2017-11-28 2024-07-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide including antigen-binding domain and carrying section
US12077577B2 (en) 2018-05-30 2024-09-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide comprising aggrecan binding domain and carrying moiety
WO2021193566A1 (ja) * 2020-03-23 2021-09-30 国立大学法人京都工芸繊維大学 新規抗体及びその用途

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