JP6772074B2 - ポリジメチルシロキサン親和性ペプチド及びその利用 - Google Patents
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Description
項1.以下の(1a)もしくは(1b)のペプチドまたはその断片からなるポリジメチルシロキサン親和性ペプチドが結合されてなる、ポリジメチルシロキサン基材;
(1a)配列番号1〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1b)前記(1a)のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリジメチルシロキサン親和性を有するペプチド。
項2.前記断片が15〜58のアミノ酸残基からなるペプチドである、項1に記載のポリジメチルシロキサン基材。
項3.前記ポリジメチルシロキサン親和性ペプチドを介して目的タンパク質がポリジメチルシロキサン基材に固定化されてなる、項1または2に記載のポリジメチルシロキサン基材。
項4.目的タンパク質に導入された以下の(1a)もしくは(1b)のペプチドまたはその断片からなるポリジメチルシロキサン親和性ペプチドとポリジメチルシロキサン基材とを接触させる工程を含有する、目的タンパク質のポリジメチルシロキサン基材への固定化方法;
(1a)配列番号1〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1b)前記(1a)のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリジメチルシロキサン親和性を有するペプチド。
項5.項1または2に記載のポリジメチルシロキサン基材に結合したポリジメチルシロキサン親和性ペプチドと目的タンパク質とを結合させる工程を含有する、目的タンパク質のポリジメチルシロキサン基材への固定化方法。
項6.以下の(1a)もしくは(1b)のペプチドまたはその断片からなるポリジメチルシロキサン親和性ペプチドを含有する、ポリジメチルシロキサン基材への目的タンパク質固定化用組成物;
(1a)配列番号1〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1b)前記(1a)のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリジメチルシロキサン親和性を有するペプチド。
項7.目的タンパク質をポリジメチルシロキサン基材へ固定させるための、以下の(1a)もしくは(1b)のペプチドまたはその断片からなるポリジメチルシロキサン親和性ペプチドの使用;
(1a)配列番号1〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1b)前記(1a)のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリジメチルシロキサン親和性を有するペプチド。
項8.以下の(1c)もしくは(1d)のペプチドまたはその断片からなる、ポリジメチルシロキサン親和性ペプチド;
(1c)配列番号2〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1d)配列番号1〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリジメチルシロキサン親和性を有するペプチド。
項9.前記断片が15〜58のアミノ酸残基からなるペプチドである、項8に記載のポリジメチルシロキサン親和性ペプチド。
項10.項8または9に記載のポリジメチルシロキサン親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項11.前記ポリヌクレオチドが配列番号10〜18からなる群より選択される少なくとも1種で表されるポリヌクレオチドである、項10に記載のポリヌクレオチド。
項12.項10または11に記載のポリヌクレオチドを含有する、ポリジメチルシロキサン親和性ペプチド発現ベクター。
項13.項10または11に記載のポリヌクレオチドと目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとが連結されてなる、項8または9に記載のポリジメチルシロキサン親和性ペプチドと目的タンパク質とのペプチド融合タンパク質発現ベクター。
項14.項13に記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
項15.項14に記載の形質転換体から得られる、項8または9に記載のポリジメチルシロキサン親和性ペプチドと目的タンパク質とのペプチド融合タンパク質。
項16.項8または9に記載のポリジメチルシロキサン親和性ペプチドからなる、ポリジメチルシロキサン基材への目的タンパク質の固定化用リンカー。
1.ポリジメチルシロキサン(PDMS)親和性ペプチド
本発明においてPDMS親和性ペプチドは、以下の(1−1)もしくは(1−2)のペプチドまたはその断片からなる;
(1−1)配列番号1〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1−2)前記(1−1)のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリジメチルシロキサン親和性を有するペプチド。
2.ポリヌクレオチド
本発明は、前記PDMS親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明においてポリヌクレオチドは、前記PDMS親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り制限されず、以下のポリヌクレオチドが例示される;
(2−1)前記PDMS親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(2−2)配列番号10〜18のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
(2−3)前記(2−1)及び(2−2)のいずれかのポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、PDMS親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するPDMS親和性ペプチド発現ベクターを提供する。本発明のPDMS親和性ペプチド発現ベクターは、前記ポリヌクレオチドを含んでおり、且つ、その宿主細胞において該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき前記PDMS親和性ペプチド、あるいは、前記固定化用リンカーを発現できるものであれば特に制限されない。ベクターは、従来公知のように一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。
本発明は、前記ペプチド融合タンパク質発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体を提供する。
本発明は、前記PDMS素親和性ペプチドと前記目的タンパク質とのペプチド融合タンパク質を提供する。ここで、PDMS親和性ペプチド及び目的タンパク質は前述の通りであり、ペプチド融合タンパク質は、前記PDMS親和性ペプチドと前記目的タンパク質とを連結することによって一体化させた融合タンパク質である。
本発明は、前記PDMS親和性ペプチドが結合されてなるPDMS基材を提供する。これは、前記PDMS親和性ペプチドがPDMS基材に結合されてなるものである。PDMS親和性ペプチド、PDMS基材は前述の通りである。
本発明は、目的タンパク質に導入された前記PDMS親和性ペプチドとPDMS基材とを接触させる工程を含有する、目的タンパク質のPDMS基材への固定化方法を提供する。
実施例1
以下の手順に従い、配列番号1で表されるペプチド(ELV1ペプチド)、配列番号2で表されるペプチド(TPV1ペプチド)、配列番号3で表されるペプチド(OCV1ペプチド)のポリジメチルシロキサン(PDMS)に対する親和性について検討した。
1−1.Elongation factor Tu(ELN)発現ベクター、Tryptophanase(TPA)発現ベクター、Outer membrane protein C(OMC)発現ベクターの構築
1)DNA Purification Kit (プロメガ社製)を用いて大腸菌BL21(DE3)(Novagen社製)の染色体DNAの抽出を行った。
2)染色体DNAを鋳型とし、KOD plus ver.2 PCR kit(東洋紡社製)を用いてPCRを行い、ELNの遺伝子を増幅した。
3)増幅したELNの遺伝子とpET-22ベクター(Novagen社製)のモル比が3:1になるように混合し、混合溶液と等量のLigation High(東洋紡社製)を加え、NdeIサイトとNotIサイトの間に増幅したELNの遺伝子を挿入し、クローニングした。
4)上記のベクターで大腸菌HST08 Premium(タカラバイオ社製)を形質転換し、LB-Amp寒天培地中で一晩静置培養をした。
5)Amp.含有LB培地(ナカライテスク社製)を15mlチューブに2mlとり、寒天プレートからシングルコロニーを植菌し、37℃、200rpmで一晩培養した。
6)培養後、アルカリSDS法によってベクターを回収・精製した。
7)アガロース電気泳動によって遺伝子の挿入を確認し、さらに、DNAシーケンス解析(greiner社)によって挿入されたELN遺伝子のヌクレオチド配列を確認した。
8)上記工程6)で得られたベクターで大腸菌Rosetta (DE3)を形質転換し、培養後、ELN発現大腸菌を調製した。
1)大腸菌HST08 Premium Competent cells(タカラバイオ社製)50μlに、GST発現ベクター(pGEX-3X)(GEヘルスケア社製)を1μl加え、氷上で10分間インキュベートした。
2)42℃で45秒間インキュベートし、再び氷上で冷却した。
3)形質転換した上記大腸菌を、Amp.含有LB寒天プレートに植菌し、37℃で一晩培養した。
4)Amp.含有LB培地を15mlチューブに2mlとり、寒天プレートからシングルコロニーを植菌し、37℃、200rpmで一晩培養した。
5)10,000gで10分間遠心分離し、上清を除去した。
6)アルカリSDS法によってpGEX-3Xを回収した。
7)回収したベクター溶液20μlに、Cut Smart Buffer(ナカライテスク社製)10μl、CIAP(Calf intestine Alkaline Phosphatase、東洋紡社製)2μl、Eco RI-HF(New England Biolabs社製)2μl、Bam HI-HF(New England Biolabs社製)2μlを加え、37℃で一晩インキュベートし、ベクターの切断・脱リン酸化処理を行った。pGEX-3Xの切断状況はアガロース電気泳動により確認した。
8)酵素処理を行ったベクターをillustraTMGFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare社製)を用いて精製した。
1)ELV1ペプチドのアミノ酸配列からこの遺伝子をコードするヌクレオチド配列を決定し、委託合成にてオリゴDNAを合成した。ELV1ペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号10で表される。
2)前記1)で得られたヌクレオチド配列を、前述のように構築したGST発現ベクターpGEX-3XのBam HIサイトとEco RIサイトの間にクローニングし、DNAシーケンス解析によって、ベクター中に挿入されたELV1ペプチドをコードするヌクレオチド配列を確認した。
3)構築した発現ベクターで大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、アンピシリン(Amp.ナカライテスク社製)含有2×YT培地(Novagen社製)10ml中で一晩前培養した。
4)前記3)と同様の培地50mlに、前培養液をOD600=0.1になるように加え、37℃、200rpmでOD600=1.0になるまで(約1.5時間)培養した。
5)1M IPTG(Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside、和光純薬社製)を5μl加え、30℃、200rpmでさらに7時間培養した。
6)培養後、4500rpmで20分間遠心分離し、上清を除去した。
7)菌体にBug buster(BugButer Protein Extraction Reagent、Novagen社製)3ml、Benzonase Nuclease(Novagen社製)1.5μl、Lysozyme(生化学工業社製)3mgを加えよく撹拌し、37℃で1時間インキュベートすることにより、菌体を溶菌した。
8)10000rpmで20分間遠心分離し、上清を可溶性画分として回収した。
9)可溶性画分をGSTrap HPカラム(GEヘルスケア社製)中にアプライし、1mM DTT(Dithiothreitol、ナカライテスク社製)を含むPBSでカラム内を洗浄した。
10)20mM 還元型グルタチオンを含む100mM Tris-HCl(pH 8.0)のグラジェント溶出によってELV1ペプチド融合GSTを回収した。
11)溶離液をPBSで一晩透析し、DC Protein Assay Kit(バイオラッドラボラトリーズ社製)によって濃度を定量した。
1)PDMS(Sylgard(登録商標)184 Silicone Elastomer、DOW CORNING社製)をクロロホルムで溶解し、2.5w/v%のPDMS溶液を調製した。
2)QCM(水晶振動子マイクロバランス)センサーチップ(QCMST27C、イニシアム社製)上に1)のPDMS溶液を60μl添加し、スピンコーティング(6000rpm、1分間)によりPDMS薄膜を形成し、これをPDMS基材(概算表面積81cm2、面積/体積比27cm-1)とした。
3)得られたPDMS基材をQCM本体(AFFINIX QN、イニシアム社製)にセットし、PBS中でベースラインが安定するまでインキュベートした。
4)終濃度が0.1、0.4、1.3、3.4、9.7μg/mlとなるように逐次的に前述のwt-GST又は各ペプチド融合GST溶液(以下、GST溶液)を加え、それぞれ1時間ずつモニタリングした。GST溶液は、前述のwt-GST又は各ペプチド融合GSTをPBS中に添加することにより作製した。
5)測定データから吸着密度を算出した(-1Hz=0.62ng/cm2)。また、吸着密度とモル濃度から以下の式を用いて吸着密度(μg/cm2)を算出した。
結果を図1に示す。
以下の手順に従い、PDMS基材に固定させたペプチド融合GSTが、GST本来の活性を維持しているかどうかについて検討した。
1.手順
1−1.ペプチド融合GSTの構築
本実施例では、前記実施例1で作製したELV1ペプチド融合GST、TPV1ペプチド融合GST、OCV1ペプチド融合GST、OAT1ペプチド融合GST、wt-GSTを用いた。
1.手順
1)前述のwt-GST、ELV1ペプチド融合GST、TPV1ペプチド融合GST、OCV1ペプチド融合GST、OAT1ペプチド融合GSTの各GST溶液をPPBで希釈し、100mM CDNB、100mM GSHを30μlずつ添加した際、GST濃度が0.5μg/mlになるように各GST溶液を2940μl調製した。
2)100mM CDNB、100mM GSHを30μlずつ添加し、25℃において分光光度計(V-630BIO、日本分光社製)によって340nmの吸光度を3分間測定し、吸光度の変化率(min-1・cm-1)を算出した。
3)以下の式より吸着前の各GSTの比活性の値を算出した。生成物CDNB-GSHのモル吸光係数ε=9.6 mM-1・cm-1を基に1分間に生じた生成物量を算出し、酵素活性とした。
5)上清を除去し、PDMS基材をPBSで3回、PPBで1回洗浄した。
6)洗浄したPDMS基材にPPB 2940μl、100mM CDNB、100mM GSHを30μlずつ添加した。37℃、300rpmで攪拌しながら30分間ごとに340nmの吸光度の変化をnano drop(Thermo社製)で測定し、吸光度の変化率(min-1・cm-1)を算出した。
7)前記の式より吸着後の各GSTの比活性の値を算出し、吸着前後の比活性の値から残存活性を算出した。
2.結果
結果を図2に示す。図2から明らかなようにペプチド融合GSTを構成するGSTは、PDMS基材に固定させた後であってもGST本来の活性を維持していた。このことから、PDMS親和性ペプチドが連結した目的タンパク質は、PDMS基材に固定された状態であっても、目的タンパク質の高い活性を発揮できることが確認できた。
以下の手順に従い、配列番号1〜9で表されるペプチドのPDMS基材に対する親和性について検討した。
1.手順
1)配列番号1〜9で表されるペプチド含むPBS溶液に、実施例1と同じPDMS基材(概算表面積 81cm2面積/体積比 27cm-1)を混合し、25℃、200rpmで2時間振盪した。ここで、なお、配列番号1〜4で表されるペプチドは前述と同様であり、配列番号5で表されるペプチドをTPV2ペプチド、配列番号6で表されるペプチドをTPT1ペプチド、配列番号7で表されるペプチドをOCT2ペプチド、配列番号8で表されるペプチドをOCV2ペプチド、配列番号9で表されるペプチドをOCT3ペプチドとした。
2)当該溶液の上清の一部をHPLCで分析し、残りの溶液を更にPDMS基材と混合した。その際、1ml当たりの基材面積/体積比が27cm-1となるように設定した。
3)2)を合計3回繰り返した。
4)吸着後のピーク面積の減少が著しいペプチドがPDMS基材に対して親和性を有すると判断できることから、吸着前後のクロマトグラムを比較した。
HPLCシステム
PU-2089 Quaternary Gradient Pump(ジャスコインターナショナル社製)
LC-NetII/ADC(ジャスコインターナショナル社製)
MD-2018Plus Photodiode Array Detector(ジャスコインターナショナル社製)
UV-1575 Intelligent UV/VIS Detector(ジャスコインターナショナル社製)
TSKgel ODS-100Z 3μm (カラムサイズ4.6mmI.D.x15cm)(東ソー社製)
A液
超純水(1L)
TFA(Trifluoroacetic acid、高速液体グラフ用、和光純薬社製)(1ml) 0.1v/v%
B液
Acetonitrile [Chromasolv, for HPLC, gradient grade, ≧99.9%](シグマアルドリッチ ジャパン社製)(1L)
TFA(高速液体グラフ用)(1ml) 0.1v/v%
前処理フィルター
Non-Sterile 4mm Millex(登録商標)HV syringe Driven Filter Unit (450nm)(ミリポア社製)
プログラム
プログラムは図3に示す。
結果を表1に示す。
以下の手順に従い、配列番号1で表されるペプチド(ELV1ペプチド)、配列番号2で表されるペプチド(TPV1ペプチド)または配列番号3で表されるペプチド(OCV1ペプチド)と、C反応性蛋白(CRP、C-reactive protein)に対する一本鎖抗体とを連結し、得られたペプチド融合タンパク質のPDMS基材への親和性及び活性について評価した。
1−1.ペプチド融合scFvの作製
1−1−1.ELV1ペプチド、TPV1ペプチド、OCV1ペプチドを有するベクターの構築
1)配列番号1で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列(配列番号10)を有するセンス鎖と、該配列に対して相補的な配列を有するアンチセンス鎖を委託合成した。
2)該センス鎖と該アンチセンス鎖それぞれを10pmol/μlとなるように滅菌水で希釈し、各1μlに10×High buffer(東洋紡社製)を2μl、滅菌水を16μl混合した。混合液を90℃で5分間インキュベートした後、インキュベータの電源を切り室温まで冷まし、ELV1ペプチド用の2本鎖DNAとした。
2)pET-22ベクター保有大腸菌(pET-22-XL1 Blue、Novagen社製)をAmp.含有LB培地10mlに植菌し、37℃、回転数200rpmで一晩培養し、ミニプレップによりプラスミドを回収し、NotIとXhoIの制限酵素で消化した。
3)前記1)で調製した2本鎖DNA(インサート)とpET-22ベクター(制限酵素処理済)を、インサート:ベクター=3:1のモル比となるように混合し、50℃で10分間インキュベートした後、温度を16℃に下げて混合液と同量のLigation high ver.2(東洋紡社製)を添加し、3時間インキュベートした。
4)大腸菌HST08 Premium Competent cellsに対してライゲーション後のサンプルを加え、42℃で45秒間インキュベートして、大腸菌を形質転換した。
5)形質転換した大腸菌をAmp.含有LB寒天培地に植菌し、37℃で一晩インキュベートした。Amp.含有LB培地2mlに、該寒天培地上で発現したコロニーを6つピックアップして植菌し、37℃、回転数200rpmで一晩培養した。
6)得られた培養液2mlをエッペンドルフチューブに移し、遠心分離(4℃、10000rpm、15分間)し、上清を除去した。さらにアルカリSDS法によりプラスミドDNAを回収した。回収したプラスミドDNAの一部に制限酵素XhoIを加え、切断されるかどうかをアガロースゲル電気泳動により確認した。切断されなかったサンプルをDNA受託解析に出し配列を確認した。
1)CRPに対する1本鎖抗体をモデルscFvとしてPCRを行い、scFv遺伝子の増幅を行った。
2)前記1−1−1で得た、ELV1ペプチドをコードするDNAを有するpET-22ベクターと、PCRで増幅させたscFvとを、NdeIとNotIの制限酵素で消化した。
3)次いで、前記1−1−1の3)〜6)と同様に、ライゲーション、形質転換、培養を行い、ミニプレップによりプラスミドを回収し、アガロースゲル電気泳動によるバンドの確認後、DNA受託解析に出し配列を確認した。
1)前記1−1−2で得たペプチド融合scFvベクターを大腸菌Rosetta(DE3)に加えて形質転換し、Amp.含有2×YT培地10mlに植菌し、37℃、200rpmで一晩前培養した。
2)Amp.及びクロラムフェニコール(Cm.)含有Overnight Express TB medium (OE培地、ナカライテスク社製)50mlの入ったバッフル付き500ml三角フラスコに、前記1)の培養液をOD600=0.1になるように加えて37℃、200rpmで一晩培養した後、50ml遠沈管に培養液を移して10000rpmで20分間遠心分離し、上清を取り除いた。
3)ペレット状の菌体に1×PBSを10ml、Triton X-100を100μl、Protease inhibitor Cocktail(ナカライテスク社製)を100μl添加し、ボルテックスで懸濁し、超音波ホモジナイザーのチップを溶液に浸し、4分間×3回超音波破砕を行った(output 50W、DUTY 30%)。
3)次いで、遠心分離(4℃、10000rpm、15分間)し、上清を除去した後、イオン交換水を5 ml添加後、ボルテックスで撹拌して再度遠心分離(4℃、10000rpm、15分間)した。この操作を2回繰り返し、上清を除去後、イオン交換水を3ml添加し、ボルテックスで懸濁した後、−80℃で凍結し、さらに一晩凍結乾燥させた。
4)次いで、6M 塩酸グアニジンを含む可溶化バッファー(6Mグアニジン塩酸、2xPBS、pH7.5)を5 mlを凍結乾燥物に加え、封入体を可溶化し、遠心分離(4℃、10000rpm、15分間)を行い、上清を回収した。
5)次の条件下での金属キレートアフィニティクロマトグラフィにより、ELV1ペプチド融合scFvを精製した。
カラム:His-Trap HP
Binding buffer(1リットルあたり):尿素8 M(480g)、イミダゾール20mM (1.36g)、10×PBS 200ml(HClでpH7.5に調整後、脱イオン水で1リットルにメスアップした。)
Elution buffer(1リットルあたり):尿素8M(480g)、イミダゾール400 mM(27.2g)、10×PBS 200ml(HClでpH7.5に調整後、脱イオン水で1リットルにメスアップした。)
TPV1ペプチド、OCV1ペプチドについても同様にして、TPV1ペプチド融合scFv、OCV1ペプチド融合scFvを作製した。また、コントロールとして、ELV1ペプチドに代えてD10ペプチド(アスパラギン酸残基が10個連続するペプチド)を用いた以外は同様にして、D10ペプチド融合scFvを作製した。なお、各ペプチド融合scFvは、その3’末端にヒスチジン残基が6個連続するペプチド配列を有する。
1)精製後のscFvの終濃度が1mg/ml、DTTが100mM、総体積が2mlとなるように、8M尿素-PBSで希釈し、4℃で2時間インキュベートした。
2)前記1)の溶液を透析膜内に入れて、8 M尿素、50mM Tris-HCl(pH8.5)1lを外液として、4℃で65時間透析を行い、DTT除去と空気酸化を行った(外液を途中で交換した)。
3)外液を50mM Tris-HCl(pH8.5)1lに交換して透析を行い、残存する尿素を除去した(外液を途中で交換した)。
4)透析後の内液を4℃、20000rpm、5分で遠心分離して上清を回収し、DC Protein Assay Kitにより回収したペプチド融合scFvの濃度を算出した。
5)また、回収率は、回収したペプチド融合scFvの濃度を透析前のペプチド融合scFv濃度で除し、これに100を乗じることにより算出した。
1)前記実施例1の1−4と同様に、PDMSをクロロホルムで溶解し、2.5w/v%のPDMS溶液を調製し、スピンコーティング(6000rpm、1min)によりQCMセンサーチップ上にPDMS薄膜を形成した。これをPDMS基材とした。
2)得られたQCM基材をQCM本体にセットし、PBS中でベースラインが安定化するまでインキュベートした後、各ペプチド融合scFv溶液を終濃度0.5、1.8、4.9、12.7、32.3μg/mlとなるように加えて、25℃、回転数1000rpmにおける吸着挙動を各濃度で1時間モニタリングした。溶液は、ペプチド融合scFvをPBSに添加することにより作製した。
3)前記2)で得た測定データ(ΔF:-1Hz=0.62ng/cm2)に基づいて吸着密度を算出した。
1)CRP(抗原)1μg/ml(1×PBSで希釈)をMaxisorpマイクロプレート(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)に固定化した (4℃、overnight) 。
2)プレートを0.1% PBST(PBS-0.1%Tween20)で洗浄後、2%BSA-PBSTを加えて25℃で1時間ブロッキングした。
3)プレートを0.1%PBSTで洗浄後、0.2%BSA-PBSTで0〜100μg/mlに4倍段階希釈したペプチド融合scFvを添加し、25℃で1時間インキュベートした。
4)プレートを0.1%PBSTで洗浄後、0.2%BSA-PBSTで5000倍希釈したHRP(horseradish peroxidase)標識Anti 6×His抗体を添加し25℃で1時間インキュベートした。
5)プレートを0.1%PBSTで洗浄後、TMB基質溶液を加えて発色させ(25℃、15分)、0.3M H2SO4を添加し、主波長450nm、副波長650nmの吸光度を測定した。
1)前述と同様にしてPDMS基材を作製した。
2)QCM基材をQCM本体にセットし、PBS中でベースラインが安定化するまでインキュベートした後、各ペプチド融合scFv溶液を15μg/ml添加し、25℃、回転数1000rpmにおいて固定化した。溶液は、ペプチド融合scFvをPBSに添加することにより作製した。
3)次いで、PBSを0.2%BSA-PBSTに変えて、CRPを終濃度0.1、1.1、6.1μg/mlとなるように添加し、各濃度で平衡到達するまでの吸着挙動を前述と同様にしてモニタリングし、測定データ(ΔF:-1Hz=0.62ng/cm2)に基づいて抗原結合量(ng/cm2)を算出した。
2−1.ペプチド融合scFvの回収濃度及び回収効率
表2に、前記1−2の結果、すなわちペプチド融合scFvの回収濃度及び回収効率を示す。
図4に前記1−3の結果を示す。図4から明らかなように、D10ペプチド融合scFv(D10-scFv)ではPDMS基材表面への吸着はほとんど認められなかった。これに対して、ELV1ペプチド、TPV1ペプチド、OCV1ペプチドとの融合scFvでは、濃度依存的にPDMS基材への吸着量が増加した。特にELV1ペプチド融合scFvを用いた場合に、吸着量が著しく高まった。このこととから、PDMSへの親和性を有するペプチドを用いることにより、所望のタンパク質をPDMS基材により効率良く固定できることが分かった。
図5に前記1−4の結果を示す。図5から明らかなように、リフォールディング後のペプチド融合scFvの抗原結合活性を間接ELISA法により評価したところ、いずれにおいても良好な抗原結合活性が認められた。また、ペプチド融合scFv濃度依存的にシグナルが高まっていることから、ペプチド融合scFvが抗原抗体反応に有用な抗原結合活性を有することが分かった。
図6に前記1−5の結果を示す。図6から明らかなように、D10ペプチド融合scFvでは抗原結合量が非常に少なかった。このことから、D10ペプチド融合scFvは、基材上にほとんど吸着していないことが分かった。これに対して、ELV1ペプチド、TPV1ペプチド、OCV1ペプチドの各融合scFv では抗原濃度依存的に抗原結合量が増加しており、これらの融合scFvは、PDMS基材へ固定化された状態で十分な抗原結合活性を有していることが分かった。
Claims (14)
- 以下の(1a)または(1b)のペプチドからなるポリジメチルシロキサン親和性ペプチドが結合されてなる、ポリジメチルシロキサン基材;
(1a)配列番号1〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1b)前記(1a)のアミノ酸配列において1〜3のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリジメチルシロキサン親和性を有するペプチド。 - 前記ポリジメチルシロキサン親和性ペプチドを介して目的タンパク質がポリジメチルシロキサン基材に固定化されてなる、請求項1に記載のポリジメチルシロキサン基材。
- 目的タンパク質に導入された以下の(1a)または(1b)のペプチドからなるポリジメチルシロキサン親和性ペプチドとポリジメチルシロキサン基材とを接触させる工程を含有する、目的タンパク質のポリジメチルシロキサン基材への固定化方法;
(1a)配列番号1〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1b)前記(1a)のアミノ酸配列において1〜3のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリジメチルシロキサン親和性を有するペプチド。 - 請求項1に記載のポリジメチルシロキサン基材に結合したポリジメチルシロキサン親和性ペプチドと目的タンパク質とを結合させる工程を含有する、目的タンパク質のポリジメチルシロキサン基材への固定化方法。
- 以下の(1a)または(1b)のペプチドからなるポリジメチルシロキサン親和性ペプチドを含有する、ポリジメチルシロキサン基材への目的タンパク質固定化用組成物;
(1a)配列番号1〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1b)前記(1a)のアミノ酸配列において1〜3のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリジメチルシロキサン親和性を有するペプチド。 - 目的タンパク質をポリジメチルシロキサン基材へ固定させるための、以下の(1a)または(1b)のペプチドからなるポリジメチルシロキサン親和性ペプチドの使用;
(1a)配列番号1〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1b)前記(1a)のアミノ酸配列において1〜3のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリジメチルシロキサン親和性を有するペプチド。 - 以下の(1c)または(1d)のペプチドからなる、ポリジメチルシロキサン親和性ペプチド;
(1c)配列番号2〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1d)配列番号1〜9からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列において1〜3のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリジメチルシロキサン親和性を有するペプチド。 - 請求項7に記載のポリジメチルシロキサン親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが配列番号10〜18からなる群より選択される少なくとも1種で表されるポリヌクレオチドである、請求項8に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項8または9に記載のポリヌクレオチドを含有する、ポリジメチルシロキサン親和性ペプチド発現ベクター。
- 請求項8または9に記載のポリヌクレオチドと目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとが連結されてなる、請求項7に記載のポリジメチルシロキサン親和性ペプチドと目的タンパク質とのペプチド融合タンパク質発現ベクター。
- 請求項11に記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
- 請求項12に記載の形質転換体から得られる、請求項7に記載のポリジメチルシロキサン親和性ペプチドと目的タンパク質とのペプチド融合タンパク質。
- 請求項7に記載のポリジメチルシロキサン親和性ペプチドからなる、ポリジメチルシロキサン基材への目的タンパク質の固定化用リンカー。
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