WO2018207906A1 - 基材への親和性を有するペプチド融合タンパク質 - Google Patents

基材への親和性を有するペプチド融合タンパク質 Download PDF

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一隆 的場
淳子 片山
陽一 熊田
堀内　淳一
亮太 赤井
裕太 新
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日産化学株式会社
国立大学法人京都工芸繊維大学
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a peptide fusion protein having affinity for a substrate.
  • Extracellular vesicles are vesicles having a diameter of about 100 nm that are secreted from cells, and their membrane structure is composed of a lipid bilayer similar to cells themselves and intracellular organelles. It is stably present in all body fluids such as saliva, blood, urine, amniotic fluid, and cell culture media. In recent years, it has attracted attention as a biomarker of cancer, and it is expected that early diagnosis of cancer will be possible by collecting extracellular vesicles in body fluids and examining miRNA. Examples of extracellular vesicles include Exosomes, Microvesicles (MV; microvesicles), and Apoptotic Bodies.
  • Exosomes are 40-120 nm vesicles derived from endocytosis-pathways. Constituent components consist of proteins and nucleic acids (mRNA, miRNA, non-coating RNA). Has the function of managing intercellular communication. Examples of marker molecules include Alix, Tsg101, tetraspanins (CD81, CD63, CD9), flotillin, phosphatidylserine, ganglioside (GM1, GM2, GM3) and the like.
  • Microvesicles (MV) are 50-1,000 nm vesicles derived from the cytoplasmic membrane, and are composed of proteins and nucleic acids (mRNA, miRNA, non-coated RNA). Has the function of managing intercellular communication.
  • marker molecules include Integrins, selectins, CD40, and CD154.
  • Apoptotic Bodies are 500-2,000 nm vesicles derived from the cytoplasmic membrane, and are composed of fragmented nuclei and organelles. Has the function of inducing phagocytosis.
  • marker molecules include Annexin V and phosphatidylserine.
  • Patent Document 1 a method for obtaining extracellular vesicles using a protein-peptide fusion having a His tag at the end of a T cell immunoglobulin / mucin domain-containing molecule 4 (Tim4) protein has been reported (Patent Document 1).
  • the His tag does not have an adsorption function to the substrate surface, it is not easy to directly immobilize this protein-peptide fusion on the substrate.
  • EpCAM Epithelial cell adhesion factor
  • An object of the present invention is to provide a peptide fusion protein useful for capturing extracellular vesicles.
  • the present inventors have found that a peptide fusion protein in which a specific protein that binds to the membrane protein CD9, phosphatidylserine, GM1, etc. and a peptide having an affinity for the substrate are optimal for capturing extracellular vesicles
  • the present invention was completed. That is, the present invention is as follows.
  • a kit or apparatus for measuring or isolating a target extracellular vesicle comprising the substrate according to [10]
  • [14] A method for producing a substrate on which a protein-peptide fusion is immobilized, comprising the step of bringing the fusion according to any one of [1] to [7] into contact with the substrate.
  • the fusion according to [1] or [2], wherein the protein that recognizes a target extracellular vesicle is an anti-CD9 antibody, an anti-CD63 antibody, an anti-CD81 antibody, a CTB or a TIM protein (TIM1 to 4).
  • the adsorption density ( ⁇ mol / m 2 ) of the protein-peptide fusion of the present invention on the substrate surface is not particularly limited, but can be determined by a known method (for example, JP-A-2011-168505). For example, at 1.0 [mu] mol / m 2 or more, for example at 1.5 ⁇ mol / m 2 or more, for example 2.0 ⁇ mol / m 2 or more, for example 3.0 ⁇ mol / m 2 or more.
  • the extracellular vesicle is a small membrane vesicle composed of a lipid bilayer membrane that is secreted from a cell in a living body or a cultured cell.
  • the diameter of the vesicle is usually 20 nm to 1000 nm, or usually 50 nm to 500 nm, or usually 50 nm to 200 nm.
  • the membrane surface is known to contain membrane proteins such as tetraspanins such as CD63 and CD9, gangliosides such as GM1, and phosphatidylserine.
  • a peptide is a peptide in which 2 to 49 amino acids are peptide-bonded.
  • a protein is a product in which 50 or more amino acids are peptide-bonded.
  • the N-terminal side of a protein is a terminal on the side terminated with a free amino group
  • the C-terminal side of the protein is a terminal on the side terminated with a free carboxyl group.
  • the protein-peptide fusion is a combination of the above protein and peptide. This bond may be directly bonded. Alternatively, the protein and peptide may be bound via an appropriate linker that does not impair the ability to recognize a specific target antigen and the ability to adsorb a substrate.
  • the amino acid sequence of the protein-peptide fusion is less than 10%, preferably less than 8%, more preferably less than 5% within a range that does not impair the recognition ability and substrate adsorption ability of a specific target antigen. More preferably, less than 3%, more preferably less than 2%, particularly preferably less than 1%, allow deletion, substitution, addition or insertion of amino acid residues. In terms of the number of amino acid residues, for example, 20 or less, such as 10 or less, such as 5 or less, such as 3 or less, such as 2 or less, for example 1 amino acid residue deletion or substitution. Addition or insertion is allowed.
  • the deletion, substitution, addition or insertion described on the left is preferably only at the C-terminal or N-terminal of the amino acid sequence of the protein or peptide of the fusion.
  • a protein-peptide fusion can also be referred to as a peptide fusion protein.
  • the peptide portion is a PS tag and the protein portion is an anti-CD9 single chain antibody, it can be expressed as an anti-CD9 single chain antibody-PS tag fusion or a PS tag fusion anti-CD9 single chain antibody.
  • the PS peptide refers to a peptide included in a peptide group described in Japanese Patent No. 5553336 that exhibits a specific adsorption function with respect to a substrate surface having a hydrophilic resin surface. It is suitable when a polystyrene resin or a polycarbonate resin having increased hydrophilicity is used as a base material.
  • the present invention can be applied to general polystyrene resins or polycarbonate resins in general as a substrate for sandwich assays with antibodies such as lectin arrays, ELISA, and immunoassay methods.
  • KGLRGWREMISSL SEQ ID NO: 11
  • ADYLSRWSGIRN SEQ ID NO: 12
  • SRVHRAVLGVS SEQ ID NO: 13
  • RPPGVVRRYALG SEQ ID NO: 14
  • VRSWEEQARVTT SEQ ID NO: 15
  • RAFIASRIRKRP SEQ ID NO: 15
  • AGLRLKKAAIHR SEQ ID NO: 18
  • SSLLLAVPEPTG SEQ ID NO: 19
  • RAFIASRRIRRP SEQ ID NO: 20
  • hydrophilic resins Since it has a specific adsorption ability for a solid phase having a surface, it can be similarly used as the “PS peptide” of the present invention.
  • the PS peptide can also be referred to as a PS tag.
  • PMMA / PC peptide has a high substrate affinity mainly when the substrate surface is a polycarbonate or a polymethyl methacrylate resin.
  • Polycarbonate is widely used as an engineering plastic, and polymethyl methacrylate resin is used as a base material such as a protein chip (Japanese Patent No. 5655254).
  • peptide tags including “SEQ ID NO: 21 (DVEGIGDVDLVNYFEVGATYYFNK)” and “SEQ ID NO: 36 (DVEGIGDVDLVNYFEVGATYTFNK)”, which are called PMOMP25 peptides in Japanese Patent No. 5655254, can be mentioned. However, it is not limited to this, and any of the peptides disclosed in Japanese Patent No. 5655254 can be used.
  • the PMMA / PC peptide can also be referred to as a PMMA / PC tag.
  • the SiN peptide has a high substrate affinity when the substrate surface is a silicon nitride (Si 3 N 4 ). Silicon nitride is widely used as a semiconductor material (International Publication WO2013 / 122061).
  • SiN tag examples include a peptide tag including “SEQ ID NO: 22 (GGRHTPFFKGYRPQFYFRTTDVTGTIELPE)” which is referred to as V821 peptide in International Publication WO2013 / 122061, but is not limited thereto, and is not limited to International Publication WO2013 / Any of the peptides shown in 122061 can be used.
  • SiN peptide can also be referred to as a SiN tag.
  • the PDMS peptide has a high affinity for a substrate when the substrate surface is a polydimethylsiloxane which is a kind of silicone rubber.
  • Polydimethylsiloxane is known as one of microchip substrates such as microchannels (International Publication WO2016 / 129695).
  • the PDMS tag include a peptide tag including “SEQ ID NO: 23 (MVMPGDNIKMVVTLIHPIAMDDGLRFAIRE)” referred to as ELN-V81 peptide in International Publication WO2016 / 129695, but is not limited to this and is internationally published. Any peptide shown in WO2016 / 129695 can be used.
  • a PDMS peptide can also be referred to as a PDMS tag.
  • the anti-CD9 antibody is an antibody or antibody-like molecule that recognizes CD9, which is a membrane protein classified as tetraspanin.
  • the anti-CD63 antibody is an antibody or antibody-like molecule that recognizes CD63, which is a membrane protein classified as tetraspanin.
  • the anti-CD81 antibody is an antibody or antibody-like molecule that recognizes CD81, which is a membrane protein classified as tetraspanin.
  • CTB represents cholera toxin B subunit, which is a protein that recognizes ganglioside GM1, and is a binding unit for cholera toxin.
  • the TIM protein refers to an amino acid sequence of less than 10%, preferably less than 8%, more preferably within a range that does not impair the ability to recognize T cell immunoglobulin / mucin domain-containing molecules or phosphatidylserine. Less than 5%, more preferably less than 3%, more preferably less than 2%, particularly preferably less than 1% T cell immunoglobulin mucin domain with amino acid residues deleted, substituted, added or inserted It is a contained molecular variant. As long as it does not impair the ability to recognize phosphatidylserine, for example, any one having an amino acid sequence of an IgV domain may be used.
  • the TIM protein is preferably an animal-derived TIM protein. Of these, the TIM protein possessed by humans or mice is preferred.
  • TIM 1 to 4 are known as T cell immunoglobulin / mucin domain-containing molecules.
  • the PMMA tag includes, among PMMA / PC peptides, peptides such as “SEQ ID NO: 21 (DVEGIGDVDLVNYFEVGATYYFNK)” and “SEQ ID NO: 36 (DVEGIGDVDLVNYFEVGATYTFNK)”, but the invention is not limited to this. Any peptide disclosed in the publication can be used.
  • the blocking agent is added to suppress non-specific binding when it is desired to promote specific binding such as antigen-antibody reaction.
  • the contact means that the fusion product of the present invention and the target product are present in the same reaction system, for example, mixing the fusion product of the present invention and a sample, This includes adding a fusion, adding the fusion of the present invention to a substrate, and the like.
  • the kit for measuring or isolating a target extracellular vesicle (for example, exosome) of the present invention includes, in addition to a substrate on which a fusion is immobilized, a reagent generally used in this field, For example, buffer, sensitizer, surfactant, preservative (eg, sodium azide, salicylic acid, benzoic acid, etc.), stabilizer (eg, albumin, globulin, water-soluble gelatin, surfactant, saccharide, etc.), activator Coexisting substance influence avoiding agent, washing solution, protein denaturant-containing solution, etc., which are used in this field and inhibit the stability with coexisting reagents or the protein-peptide fusion according to the present invention Body and base material, and those that do not inhibit the reaction or binding between the protein-peptide fusion according to the present invention bound to the base material according to the present invention and the target extracellular vesicle in the sample.
  • a reagent generally used in this field For example, buffer,
  • kits in addition, in the isolation kit, instruments, devices, etc. including separation beads, separation columns, separation filters, etc., using a substrate on which the fusion product of the present invention is immobilized can be included in the kit. .
  • the kit of the present invention may contain instructions for the method for measurement or isolation of the present invention.
  • the “instructions” are the instruction manuals, package inserts, pamphlets (leaflets), etc. of the kits in which the features, principles, operation procedures, judgment procedures, etc. of the method are substantially described in text or diagrams. Means.
  • the step of measuring or isolating the target extracellular vesicle can measure or isolate the presence and / or amount of the complex of the fusion according to the present invention and the target extracellular vesicle (eg, exosome).
  • Any method may be used, and any known immunological measurement or isolation method can be used.
  • a solid phase enzyme immunoassay (ELISA) or a flow cytometry method is preferable as a measurement method, and a magnetic bead method, a column chromatography method, or a filter filtration method is preferable as an isolation method.
  • the apparatus for measuring or isolating a target extracellular vesicle (for example, exosome) of the present invention comprises a detector, a pressure regulator, a power source, a temperature regulator, in addition to the substrate on which the fusion is immobilized.
  • Amplifiers, converters, calculators, computers, autosamplers, reagent reservoirs, waste tanks, light sources, freeze dryers, and other equipment commonly used in this field can be included.
  • the fusion of the present invention can be immobilized on a substrate and can capture exosomes.
  • the peptide or protein of the present invention is chemically or prokaryotic (specific examples include E. coli, Gram-positive bacteria (Corynebacterium glutamicum, Brevibacillus choshinensis, etc.)) and fungi such as yeast (S. cerevisiae). Insect cells (Sf9, High Five), animal cells (CHO cells, HEK293T, etc.) and the like can be synthesized by genetic engineering techniques. Among these, prokaryotes are preferable from the viewpoints of cost and production efficiency, and E. coli is particularly preferable.
  • the peptide When the peptide is chemically synthesized, it can be synthesized by a well-known peptide synthesis method. In addition, the solid phase synthesis method and the liquid phase synthesis method can be applied to the synthesis. A commercially available peptide synthesizer (eg, Shimadzu Corporation PSSM-8) may be used.
  • DNA encoding the peptide is first designed and synthesized.
  • the design and synthesis can be performed by PCR using primers designed to synthesize a desired DNA region using a vector containing a nucleic acid encoding the target protein as a template.
  • a recombinant vector for protein expression is obtained by ligating the above DNA to an appropriate vector, and a transformant is obtained by introducing this recombinant vector into a host so that the target gene can be expressed (Sambrook). J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).
  • a phage or plasmid that can autonomously grow in a host microorganism is used.
  • animal virus and insect virus vectors can also be used.
  • the purified DNA may be cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or the like of an appropriate vector DNA, and ligated to the vector.
  • the host used for transformation is not particularly limited as long as it can express the target gene. Examples include bacteria (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), yeast, animal cells (COS cells, CHO cells, etc.), insect cells or insects. It is also possible to use a mammal such as a goat as a host. Methods for introducing a recombinant vector into a host are known.
  • “Culture” means any of (a) culture supernatant, (b) cultured cells or cultured cells, or crushed materials thereof.
  • scFv single chain antibody
  • cDNA encoding the heavy chain variable region (H chain V region) and light chain variable region (L chain V region) of the antibody
  • DNA encoding scFv is constructed.
  • Binding Affinity Binding affinity can be determined by the association rate constant (Kon) and dissociation rate constant (Koff).
  • the affinity equilibrium constant (Ka) is expressed as the ratio Kon / Koff, and the dissociation constant (Kd) is the reciprocal thereof.
  • the binding rate constant (Kon) and the dissociation rate constant (Koff) can be measured using surface plasmon resonance (SPR), and a known apparatus and method for detecting the binding rate in real time and further monitoring it should be adopted.
  • SPR surface plasmon resonance
  • Biacore registered trademark
  • T200 GE Healthcare
  • ProteON XPR36 Bio-Rad
  • anti-CD9scFv As an antigen, a protein in which a carrier protein is bound to a partial peptide of CD9 extracellular domain 2 (EC2) or a protein in which human Fc region is fused to EC2 on the C-terminal side of EC2 (EC2-hFc) or cell membrane
  • CD9-expressing cells CD9 forced-expressing cells
  • rabbits are immunized with these antigens, RNA is extracted from the spleen, cDNA is synthesized, PCR is performed using it as a template, and the rabbit antibody gene is Amplification was performed, and an scFv phage library was prepared based on the amplification.
  • the scFv phage library was subjected to biopanning using the above-mentioned antigen, and scFv was selected. As a result, four clones having strong binding activity against EC2-hFc were obtained.
  • the entire amino acid sequence of each clone (02a004, 02a018, 02a039 and 02a045) is shown in SEQ ID NOs: 24-27.
  • the amino acid sequences of the heavy chain variable region (HV) and light chain variable region (LV) of each clone are shown in SEQ ID NOs: 28 to 35, respectively.
  • Escherichia coli Rosetta (DE3) was transformed with E. coli by adding anti-CD9 scFv-PM and anti-CD9 scFv-ELN expression vectors, and 2 ⁇ YT medium containing Amp and Cm E. coli was inoculated into 10 mL, and cultured overnight at 37 ° C. and 200 rpm overnight.
  • exosome sample (1) 5 ⁇ L of purified exosome was used as sample 1. (2) After performing the operations (1) to (4) for confirming the immobilization, 5 ⁇ L of the exosome purified in (2) was mixed, and mixed by inverting with a rotator at 25 ° C. for 2 hours. (3) PS beads were submerged by flushing, the supernatant was removed, and washing was performed as described above. This was designated as sample 2. (4) 10 ⁇ L of BugBuster (registered trademark) was added to each of samples 1 and 2 to suspend them, and ultrasonic waves were applied for about 20 seconds. (5) Incubated for 15 minutes on ice.
  • BugBuster registered trademark
  • Exosome Binding Enhancer of 1/500 of the total volume was added and incubated at room temperature for 1 hour.
  • PS beads were submerged by flushing, the supernatant was removed, and washing was performed as described above.
  • 50 ⁇ L of anti-CD9 total IgG (mouse) 5 ⁇ g / mL (in 0.2% BSA-TBS) was added and mixed by inversion with a rotator at room temperature for 1 hour.
  • the PS beads were submerged by flushing, the supernatant was removed, and washing was performed as described above.
  • the peptide fusion protein of the present invention is useful for capturing target extracellular vesicles (for example, exosomes).

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Abstract

本発明は、基材表面に吸着機能を有するペプチドを、標的細胞外小胞を認識するタンパク質のＮ末端側もしくはＣ末端側に有するタンパク質－ペプチド融合体、該融合体をコードする塩基配列を含む核酸、該核酸を含むベクター、該融合体が固定化された基材、標的細胞外小胞の測定又は単離方法、標的細胞外小胞を測定又は単離するためのキット又は装置に関する。

Description

基材への親和性を有するペプチド融合タンパク質
　本発明は、基材への親和性を有するペプチド融合タンパク質に関する。
　細胞外小胞は、細胞から分泌される直径約１００ｎｍの小胞であり、その膜構造は細胞自身や細胞内小器官と同様に脂質二重層からなっている。唾液、血液、尿、羊水など、あらゆる体液中や細胞培養液中に安定して存在する。近年、がんのバイオマーカーとして注目されており、体液中の細胞外小胞を集めてｍｉＲＮＡを調べることで、がんの早期診断が可能になると期待されている。
　細胞外小胞の例としては、Exosomes（エクソソーム）、Microvesicles（MV; 微小小胞体）、Apoptotic Bodies（アポトーシス小体）が挙げられる。
　Exosomes（エクソソーム）とは、エンドサイト－シス・パスウエイに由来する、40-120nmの小胞である。構成成分としては、タンパク質、核酸(mRNA、miRNA、ノン・コーティングRNA)から成る。細胞間コミュニケーションを司る機能を有する。マーカー分子としてはAlix, Tsg101, tetraspanins （CD81, CD63, CD9）, flotillin，phosphatidylserine（ホスファチジルセリン）,　ganglioside（GM1, GM2, GM3）等が挙げられる。
　Microvesicles（MV; 微小小胞体）は細胞質膜に由来する、50-1,000nmの小胞であり、構成成分としては、タンパク質、核酸(mRNA、miRNA、ノン・コーティングRNA)から成る。
　細胞間コミュニケーションを司る機能を有する。マーカー分子としてはIntegrins, selectins, CD40，CD154が挙げられる。
　Apoptotic Bodies（アポトーシス小体）は細胞質膜に由来する、500-2,000nmの小胞であり、構成成分としては、断片化された核、細胞小器官（オルガネラ）から成る。ファゴサイトーシスの誘導する機能を有する。マーカー分子としては、Annexin V, phosphatidylserineが挙げられる。
　細胞外小胞を回収する方法としては、超遠心、粒子のサイズによる分画、免疫沈降を利用する方法が知られている。
　近年、ＨｉｓタグをＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子４（Ｔｉｍ４）タンパク質の末端に有する、タンパク質－ペプチド融合体を用いる細胞外小胞の取得方法が報告されている（特許文献１）。しかし、Ｈｉｓタグは、基材表面に対する吸着機能を有していないことから、このタンパク質－ペプチド融合体を基材に直接固定化することは容易ではない。
　また、がん抗原である上皮細胞接着因子（ＥｐＣＡＭ：Epithelial cell adhesion molecule）に対して結合能を有するペプチドを含む複合素材を用いる、ＥｐＣＡＭ発現エクソソームを分離するための装置が報告されている（特許文献２）。
　さらに近年、エクソソームへの結合活性を有する、Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ－Ｘと呼ばれるキイロスズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）由来の１４アミノ酸残基からなるペプチド、Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎと呼ばれるｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ由来の１６アミノ酸残基からなるペプチド、又はｈＣＡＰ-１８のＣ末端領域がタンパク質切断により遊離した、ＬＬ３７と呼ばれるヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）由来の３７アミノ酸残基からなるペプチドを用いるエクソソームの回収方法が報告されている（特許文献３）。しかし、このペプチドも、基材に直接固定化することは容易ではない。
ＷＯ２０１６／０８８６８９ ＷＯ２０１４／１６８２３０ 特開２０１７－３８５６６号公報
　本発明の課題は、細胞外小胞の捕捉に有用な、ペプチド融合タンパク質を提供することにある。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、膜タンパク質ＣＤ９、phosphatidylserine、GM1等に結合する特定のタンパク質と基材に親和性を持つペプチドを結合したペプチド融合タンパク質が、細胞外小胞の捕捉に最適であることを初めて見出し本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］基材表面に固定化される機能を有するペプチドを、標的細胞外小胞の膜上にある分子を認識するタンパク質のＮ末端側もしくはＣ末端側に有する、タンパク質－ペプチド融合体、
［２］標的細胞外小胞の膜上にある分子が、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＧＭ１又はホスファチジルセリンである、［１］に記載の融合体、
［３］上記分子を認識するタンパク質が、原核生物または菌類よって発現可能なタンパク質である、［１］又は［２］に記載の融合体、
［４］当該ペプチドが、ＰＳペプチド、ＰＭＭＡ／ＰＣペプチド、ＳｉＮペプチド及びＰＤＭＳペプチドからなる群から選択される、［１］～［３］のいずれかに記載の融合体、
［５］ペプチドが配列番号１～２３及び３６に示されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド群から選択されたペプチドである、［１］又は［２］に記載の融合体、
［６］ペプチドが、ＰＳＩタグ（配列番号２）、ＰＳＳタグ（配列番号９）、ＰＭＭＡタグ（配列番号２１又は３６）を含むペプチドである、［１］～［６］のいずれかに記載の融合体、
［７］前記タンパク質－ペプチド融合体を構成するタンパク質及び／又はペプチドのアミノ酸配列が、それぞれの全アミノ酸配列に対し１０％未満のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含む、［１］～［６］のいずれかに記載の融合体、
［８］　［１］～［７］に記載の融合体をコードする塩基配列を含む、核酸、
［９］　［８］に記載の核酸を含む、ベクター、
［１０］　［１］～［７］のいずれかに記載の融合体が固定化された、基材、
［１１］　［１０］に記載の基材を用いることを特徴とする、標的細胞外小胞の測定又は単離方法、
［１２］前記標的細胞外小胞が、体液中に含まれる、［１１］に記載の方法、
［１３］　［１０］に記載の基材を含む、標的細胞外小胞を測定又は単離するための、キット又は装置、
［１４］　［１］～［７］のいずれかに記載の融合体を基材に接触させる工程を含む、タンパク質－ペプチド融合体が固定化された基材の製造方法。
［１５］標的細胞外小胞を認識するタンパク質が、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、ＣＴＢ又はＴＩＭタンパク質（ＴＩＭ１～４）である［１］又は［２］に記載の融合体。
　本発明のタンパク質-ペプチド融合体の基材表面上に対する吸着密度（μmol/ｍ2）は特に制限が無いが、公知の方法（例えば特開2011-168505号公報）に記載の方法で求められる。例えば１．０μmol/ｍ2以上であり、例えば１．５μmol/ｍ2以上であり、例えば２．０μmol/ｍ2以上であり、例えば３．０μmol/ｍ2以上である。
　本発明において細胞外小胞は、生体内の細胞又は培養細胞から分泌される、脂質二重膜で構成される小型膜小胞である。当該小胞の直径は、通常２０ｎｍから１０００ｎｍ、又は通常５０ｎｍから５００ｎｍ、又は通常５０ｎｍから２００ｎｍである。その膜表面には、ＣＤ６３やＣＤ９等のテトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ）等の膜タンパク質、ＧＭ１等のガングリオシドおよびホスファチジルセリンを含むことが知られている。
　本発明においてペプチドとは、２～４９個のアミノ酸がペプチド結合したものである。
　本発明においてタンパク質とは、５０個以上のアミノ酸がペプチド結合したものである。
　本発明においてタンパク質のＮ末端側とは、フリーなアミノ基で終端している側の末端であり、タンパク質のＣ末端側とは、フリーなカルボキシル基で終端している側の末端である。
　本発明においてタンパク質－ペプチド融合体とは、上記のタンパク質とペプチドを結合させたものである。この結合は直接結合されていてもよい。或いはタンパク質とペプチドの間に特定の標的抗原の認識能及び基材吸着能を損なわないような適切なリンカーを介して結合してもよい。
　タンパク質－ペプチド融合体のアミノ酸配列についても、特定の標的抗原の認識能及び基材吸着能を損なわない範囲内で、アミノ酸配列において10％未満、好ましくは8％未満、より好ましくは5％未満、さらに好ましくは3％未満、もっと好ましくは2％未満、特に好ましくは1％未満であればアミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入が許容される。上記をアミノ酸残基数で言えば、例えば20個以下、例えば10個以下、例えば5個以下、例えば3個以下、例えば2個以下、例えば1個であれば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入が許容される。左記の欠失、置換、付加又は挿入は、当該融合体のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列のC末端又はN末端のみであることが好ましい。
　タンパク質－ペプチド融合体はペプチド融合タンパク質とも言い換えることができる。また、例えば、ペプチド部分がＰＳタグ、タンパク質部分が抗ＣＤ９単鎖抗体である場合、抗ＣＤ９単鎖抗体－ＰＳタグ融合体またはＰＳタグ融合抗ＣＤ９単鎖抗体と表すことができる。
　本発明においてＰＳペプチドとは、特許第５５５３３３６号公報に記載された、親水性の樹脂表面を有する基材表面に対して特異的吸着機能を発揮するペプチド群に含まれるペプチドを指し、特に表面の親水性を高めたポリスチレン樹脂又はポリカーボネート樹脂を基材とする場合に適している。レクチンアレイやELISA、イムノアッセイ法などの抗体とのサンドイッチアッセイ用の基材として一般的なポリスチレン樹脂又はポリカーボネート樹脂全般に適用できる。
　具体的には、主としてアミノ酸配列「ＲＸＸＸＲＲＸＲＲ（ここで、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｍ、Ｓ又はＴの一つ又は複数のアミノ酸残基の組合わせ）：配列番号１」を含むペプチドとして示されるペプチド群であり、例えば、「ＲＩＩＩＲＲＩＲＲ（配列番号２）」「ＲＡＩＡＲＲＩＲＲ（配列番号３）」、「ＲＬＬＬＲＲＬＲＲ（配列番号４）」、「ＲＶＶＶＲＲＶＲＲ（配列番号５）」、「ＲＡＡＡＲＲＡＲＲ（配列番号６）」「ＲＧＧＧＲＲＧＲＲ（配列番号７）」、「ＲＭＭＭＲＲＭＲＲ（配列番号８）」、「ＲＳＳＳＲＲＳＲＲ（配列番号９）」、又は「ＲＴＴＴＲＲＴＲＲ（配列番号１０）」を含むペプチドである。
　その他、「ＫＧＬＲＧＷＲＥＭＩＳＬ（配列番号１１）」、「ＡＤＹＬＳＲＷＧＳＩＲＮ（配列番号１２）」、「ＳＲＶＨＲＡＶＬＮＧＶＳ（配列番号１３）」、「ＲＰＰＧＶＶＲＲＹＡＬＧ（配列番号１４）」、「ＶＲＳＷＥＥＱＡＲＶＴＴ（配列番号１５）」「ＲＡＦＩＡＳＲＲＩＫＲＰ（配列番号１６）」、「ＲＥＳＴＬＫＧＴＳＲＡＶ（配列番号１７）」、「ＡＧＬＲＬＫＫＡＡＩＨＲ（配列番号１８）」、「ＳＳＬＬＲＡＶＰＥＰＴＧ（配列番号１９）」又は「ＲＡＦＩＡＳＲＲＩＲＲＰ（配列番号２０）」を含むペプチドも同様に親水性の樹脂表面を有する固相に特異的な吸着能を有するため、本発明の「ＰＳペプチド」として同様に用いることができる。
　ＰＳペプチドはＰＳタグとも言い換えることができる。
　本発明においてＰＭＭＡ／ＰＣペプチドとは、主として基材表面がポリカーボネート又はポリメタクリル酸メチル樹脂である基材の場合に基材親和性が高い。ポリカーボネートはエンジニアリングプラスチックとして広範に使用されており、ポリメタクリル酸メチル樹脂はプロテインチップなどの基材として用いられている（特許第５６５５２５４号公報）。
　具体的には、例えば、PMMAペプチドのうち、特許第５６５５２５４号公報でPMOMP25ペプチドと呼ばれている「配列番号２１（DVEGIGDVDLVNYFEVGATYYFNK）」や「配列番号３６（DVEGIGDVDLVNYFEVGATYTFNK）」を含むペプチドタグ等があげられるが、これには限定されず特許第５６５５２５４号公報に示されたいずれのペプチドも使用できる。
　ＰＭＭＡ／ＰＣペプチドはＰＭＭＡ／ＰＣタグとも言い換えることができる。
　本発明においてＳｉＮペプチドとは、基材表面が窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）である基材の場合に基材親和性が高い。窒化ケイ素は、半導体材料として広範に用いられている（国際公開ＷＯ２０１３／１２２０６１）。
　具体的には、ＳｉＮタグのうち、国際公開ＷＯ２０１３／１２２０６１でV821ペプチドと呼ばれている「配列番号２２（GGRHTPFFKGYRPQFYFRTTDVTGTIELPE）」を含むペプチドタグ等があげられるが、これに限定されず国際公開ＷＯ２０１３／１２２０６１に示されたいずれのペプチドも使用できる。
　ＳｉＮペプチドはＳｉＮタグとも言い換えることができる。
　本発明においてＰＤＭＳペプチドとは、基材表面がシリコーンゴムの一種であるポリジメチルシロキサンである基材の場合に基材親和性が高い。ポリジメチルシロキサンは、マイクロ流路などマイクロチップ基材の一つとして知られている（国際公開ＷＯ２０１６／１２９６９５）。
　具体的には、PDMSタグのうち、国際公開ＷＯ２０１６／１２９６９５でELN-V81ペプチドと呼ばれている「配列番号２３（MVMPGDNIKMVVTLIHPIAMDDGLRFAIRE）」を含むペプチドタグ等があげられるが、これに限定されず国際公開ＷＯ２０１６／１２９６９５に示されたいずれのペプチドも使用できる。
　ＰＤＭＳペプチドはＰＤＭＳタグとも言い換えることができる。
　本発明において抗ＣＤ９抗体とは、テトラスパニンに分類される膜タンパク質であるＣＤ９を認識する抗体または抗体様分子である。
　本発明において抗ＣＤ６３抗体とは、テトラスパニンに分類される膜タンパク質であるＣＤ６３を認識する抗体または抗体様分子である。
　本発明において抗ＣＤ８１抗体とは、テトラスパニンに分類される膜タンパク質であるＣＤ８１を認識する抗体または抗体様分子である。
　本発明においてＣＴＢとは、コレラトキシンＢサブユニットを表し、これはガングリオシドＧＭ１を認識するタンパク質で、コレラトキシンのバインディングユニットである。
　本発明においてＴＩＭタンパク質（ＴＩＭ１～４）とは、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子またはphosphatidylserineへの認識能を損なわない範囲内で、アミノ酸配列において10％未満、好ましくは8％未満、より好ましくは5％未満、さらに好ましくは3％未満、もっと好ましくは2％未満、特に好ましくは1％未満であればアミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入がなされたＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子改変体である。phosphatidylserineへの認識能を損なわない範囲内としては、例えばIgVドメインのアミノ酸配列を有しているものであればよい。ＴＩＭタンパク質は動物に由来するＴＩＭタンパク質が好ましい。なかでも、ヒト、又はマウスが有するＴＩＭタンパク質が好ましい。Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子にはＴＩＭ１～４までが知られている。
　本発明においてＰＭＭＡタグとは、ＰＭＭＡ／ＰＣペプチドのうち、「配列番号２１（DVEGIGDVDLVNYFEVGATYYFNK）」や「配列番号３６（DVEGIGDVDLVNYFEVGATYTFNK）」のペプチド等があげられるが、これには限定されず特許第５６５５２５４号公報文献に示されたいずれのペプチドも使用できる。
　本発明においてブロッキング剤とは、抗原抗体反応などの特異的な結合を促進したいときに、非特異的な結合を抑制するために添加されるものである。
　本発明において、接触とは、本発明の融合体と目的物とを同一の反応系に存在させることを意味し、たとえば、本発明の融合体と試料とを混合すること、試料に本発明の融合体を添加すること、本発明の融合体を基材に添加すること等が含まれる。
　本発明の標的細胞外小胞（例えばエクソソーム）を測定又は単離するためのキットは、融合体が固定化された基材に加えて、測定キットにおいては、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、増感剤、界面活性剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、サリチル酸、安息香酸等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類等）、賦活剤、共存物質の影響回避剤、洗浄溶液、タンパク質変性剤含有溶液、その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬との安定性を阻害したり、本発明に係るタンパク質－ペプチド融合体と基材、本発明に係る基材に結合した本発明に係るタンパク質－ペプチド融合体と試料中の標的細胞外小胞との反応又は結合を阻害したりしないものを有していてもよく、単離キットにおいては、本発明の融合体が固定化された基材を用いた分離用ビーズ、分離用カラム、分離用フィルターなどを含めた器具、装置などをキットに含めることもできる。さらにまた、本発明のキットには、本発明の測定又は単離するための方法の説明書等を含ませておいても良い。当該「説明書」とは、当該方法における特徴・原理・操作手順、判定手順等が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取扱説明書、添付文書、あるいはパンフレット（リーフレット）等を意味する。標的細胞外小胞（例えばエクソソーム）を測定又は単離する工程は、本発明に係る融合体と標的細胞外小胞（例えばエクソソーム）の複合体の有無及び／又は量を測定又は単離可能な方法であればいずれでもよく、自体公知の免疫学的測定又は単離に用いられる方法はいずれも利用できる。中でも測定法としては固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はフローサイトメトリー法が好ましく、単離法としては磁気ビーズ法、カラムクロマトグラフィー法、フィルター濾過法が好ましい。
　本発明の標的細胞外小胞（例えばエクソソーム）を測定又は単離するための装置は、融合体が固定化された基材に加えて、検出器、圧力調整器、動力源、温度調節器、増幅器、変換器、計算機、コンピューター、オートサンプラー、試薬リザーバー、廃液タンク、光源、凍結乾燥器、その他この分野で通常用いられる機器を含むことができる。
　本発明の融合体は、基材に固定化することができ、エクソソームを捕捉することができる。
ＰＭＭＡタグ融合抗ＣＤ９単鎖抗体のＰＳラテックスビーズへの固定化のフローサイトメトリーによる確認である。 ＰＭＭＡタグ融合抗ＣＤ９単鎖抗体固定化ラテックスビーズを用いたエクソソームの回収のフローサイトメトリーによる確認である。 ＰＭＭＡタグ融合抗ＣＤ９単鎖抗体固定化ラテックスビーズを用いたエクソソームの回収のウェスタンブロティングによる確認である。 ＰＭＭＡタグ融合ＴＩＭタンパク質固定化ラテックスビーズを用いたエクソソームの回収のフローサイトメトリーによる確認である。
　本発明のペプチド又はタンパク質は、化学的か、又は原核生物（具体例としては、大腸菌（E. coli）、グラム陽性菌（Corynebacterium glutamicum、Brevibacillus choshinensisなど））や酵母（S. cerevisiae）などの菌類、昆虫細胞（Sf9、High Five）、動物細胞（CHO細胞、HEK293T）等）などを用いる遺伝子工学的手法によって合成することができる。
　これらの中でも、コスト面、生産効率の観点から原核生物が好ましく、その中でも特に大腸菌（E. coli）が好ましい。
　ペプチドの化学合成を行う場合は、周知のペプチドの合成方法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（例えば、島津製作所製：ＰＳＳＭ－８など）を使用してもよい。
　ペプチド又はタンパク質を遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするＤＮＡを設計し合成する。当該設計及び合成は、目的タンパク質をコードする核酸を含むベクター等を鋳型とし、所望のＤＮＡ領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
　ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
　そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
　単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の作製
　抗体の重鎖可変領域（Ｈ鎖Ｖ領域）及び軽鎖可変領域（Ｌ鎖Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｓｃＦｖを製造することができる。
結合親和性
　結合親和性は、結合速度定数（Ｋon）及び解離速度定数（Ｋoff）により決定することができる。親和性平衡定数（Ｋa）はＫon／Ｋoffの比で表され、解離定数（Ｋd）はその逆数である。結合速度定数（Ｋon）及び解離速度定数（Ｋoff）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる（例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＰｒｏｔｅＯＮ　ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）等）。
　抗ＣＤ９ｓｃＦｖの調製
　抗原として、CD9の細胞外ドメイン2(EC2)の部分ペプチドにキャリアタンパク質を結合させたタンパク質あるいはEC2にヒトFc領域をEC2のC末端側に融合したタンパク質（EC2-ｈFc）あるいは細胞膜上にCD9 を発現させた細胞（CD9強制発現細胞）を用い、ウサギにこれらの抗原を免疫し、脾臓からRNAを抽出し、cDNAを合成し、それを鋳型にPCRを行い、ウサギ抗体遺伝子を増幅し、それらをもとにｓｃFvファージライブラリを作製した。このｓｃFvファージライブラリに対して上記の抗原を用いてバイオパンニングを行い、scFv の選別を行った。その結果、EC2-hFc に対して強い結合活性を有する4 つのクローンが得られた。それぞれのクローン（02a004, 02a018, 02a039及び02a045）の全アミノ酸配列を配列番号２４～２７に示した。また、それぞれのクローンの重鎖可変領域(HV)及び軽鎖可変領域(LV)のアミノ酸配列を配列番号２８～３５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　抗ＣＤ９　ｓｃＦｖ－ＰＭ及びＣＤ９　ｓｃＦｖ－ＥＬＮ　発現ベクターの調製
　ＰＭＭＡタグ融合抗ＣＤ９　ｓｃＦｖの生産
（１）大腸菌　Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に対して、抗ＣＤ９　ｓｃＦｖ－ＰＭ及び抗ＣＤ９　ｓｃＦｖ－ＥＬＮ　発現ベクターを加えて大腸菌を形質転換し、Ａｍｐ、Ｃｍ含有２×ＹＴ培地１０ｍＬに大腸菌を植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩前々培養した。
（２）Ａｍｐ、Ｃｍ含有２×ＹＴ培地１００ｍＬの入ったバッフル付き５００ｍＬ三角フラスコに前々培養液をＯＤ６００＝０．１になるように加え、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００＝１になるまで培養した。
（３）１ＬのＯＥ培地を入れたジャーファーメンターを１２０℃で１５分オートクレーブ滅菌した後、Ａｍｐ、Ｃｍ、及び（２）の全培養液を全量植菌し、３０℃、８００ｒｐｍ、ｐＨ７．０で２４時間本培養した。
（４）遠沈管に５０ｍＬずつ培養液を移して１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（５）培養上清に１％のＴｒｉｔｏｎＸを加え、フィルターろ過後、アフィニティークロマトグラフィーによりｓｃＦｖを精製した。この時、バインディングバッファーでカラムに吸着させた後、１×ＰＢＳでカラムを洗浄し、エリューションバッファーで溶出した。
（６）１×ＰＢＳで２日間透析し（液交換１回）、ＤＣプロテインアッセイによる濃度測定とＳＤＳ－ＰＡＧＥによる発現確認を行った。
　ＰＭＭＡタグ融合抗CD9ｓｃＦｖ固定化ＰＳラテックスビーズの作製
（１）精製した１ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ９　ｓｃＦｖ　０２ａ０３９－ＰＭ、または抗ヒトＩｇＧ　ｓｃＦｖ（コントロール）１００μＬ、ＰＳビーズ１００μＬ（４．８５×１０７個）、及び５００ｍＭ　ＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）２０μＬを混合し、４℃で一晩、ローテーターにより転倒混和した。
（２）　フラッシングによりＰＳビーズを沈殿させ、上清を除去し、５０ｍＭＴＡＰＳ（ｐＨ　８．５）２００μＬで懸濁し、４℃で保存した。
　ＰＭＭＡタグ融合抗ＣＤ９ｓｃＦｖ固定化ＰＳラテックスビーズを用いたエクソソームの回収
　ＰＭＭＡタグ融合抗ＣＤ９　ｓｃＦｖのＰＳビーズへの固定化の確認
（１）作製したｓｃＦｖ固定化ビーズ１０μＬ（２．５×１０６個）をエッペンドルフチューブにとり、フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去した。
（２）２％ＢＳＡ、５０ｍＭ　ＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）１０μＬを加え、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（３）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去した。
（４）０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳ５０μＬで懸濁し、フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去した。この操作を２回繰り返した（洗浄）。
（５）抗６×Ｈｉｓ全ＩｇＧ（マウス）５μｇ／ｍＬ（０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳ中）を５０μＬ添加し、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（６）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、（４）と同様も洗浄した。
（７）ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（ヤギ）５μｇ／ｍＬ（０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳ中）を５０μＬ添加し、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（８）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、（４）と同様に洗浄し、最後は２５０μＬの１×ＰＢＳで懸濁し、フローサイトメーターで測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
結果を図１に示す。
　フローサイトメトリーによるｓｃＦｖ固定化ビーズのエクソソームに対する活性評価
（１）前記固定化の確認の（１）～（４）の操作を行った。
（２）Ｈｅｌａ細胞培養上清（Hela細胞を５％FBS含有MEM培地で3日間培養した際の培養上清）２５０μＬ、または精製したエクソソーム（上記培養上清20mlを和光純薬のMag CaptureTM Exosome Isolation Kit PSを用いて精製したエクソソーム）１０μＬをそれぞれのエッペンドルフチューブに加えて室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（３）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、上記と同様に洗浄した。
（４）抗ＣＤ９全ＩｇＧ（マウス）５μｇ／ｍＬ（０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳ中）を５０μＬ添加し、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（５）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、上記と同様に洗浄した。
（６）ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（ヤギ）５μｇ／ｍＬ（０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳ中）を５０μＬ添加し、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（７）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、上記と同様に洗浄し、最後は２５０μＬの１×ＰＢＳで懸濁し、フローサイトメーターで測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
結果を図２に示す。
ウェスタンブロッティングによる回収したエクソソーム中の分析
エクソソームサンプルの準備
（１）精製したエクソソーム５μＬをサンプル１とした。
（２）前記固定化の確認の（１）～（４）の操作を行った後、で精製したエクソソーム５μＬを混合し、２５℃で２時間、ローテーターにより転倒混和した。
（３）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、上記と同様に洗浄した。これをサンプル２とした。
（４）サンプル１及び２にＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）１０μＬをそれぞれ加えて懸濁させ、超音波を２０秒程度かけた。
（５）氷上で１５分間インキュベーションした。
（６）２×サンプルバッファーとサンプル１または２を１：１で混合し、９８℃で１０分加熱した。
（７）ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルを電気泳動装置にセットし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用泳動バッファーを加えた。
（８）分子量マーカー及び、サンプルを１５μＬずつゲルにアプライした。この時、サンプル２はフラッシングによりＰＳビーズを沈殿させて、上清をアプライした。
（９）電圧を２００Ｖに設定し、約１時間電気泳動を行った。ＢＰＢのラインが下端に達した時点で泳動を終了させた。
　エクソソームサンプルのウェスタンブロッティング
（１）ゲルをガラス板から外し、Ｔｏｗｂｉｎ転写バッファーにより５分間、３５ｒｐｍで振とうした。
（２）膜転写用のろ紙（Ｅｘｔｒａ　Ｔｈｉｃｋ　Ｂｌｏｔ　Ｐａｐｅｒ、ＢＩＯ－ＲＡＤ）２枚を、ゲルと同様の大きさに切断し、Ｔｏｗｂｉｎ転写バッファーをよく染み込ませた。
（３）転写膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＰＶＤＦ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を、ゲルと同様の大きさに切断し、１００％メタノールに１５分浸した。その後、Ｔｏｗｂｉｎ転写バッファーにより５分間浸して置換し、３５ｒｐｍで振とうした。
（４）トランスブロットＳＤセル（Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ　Ｓｅｍｉ－Ｄｒｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｃｅｌｌ　２２１ＢＲ、ＢＩＯ－ＲＡＤ）上に、ゲル、ＰＶＤＦ膜及びろ紙をセットした。この際、間に気泡が入らないようにした。
（５）２５Ｖの定電圧で５０分間通電し、ゲルから膜にタンパクを転写した。
（６）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｏｎｅ原液中で、１時間、３５ｒｐｍで振とうした。
（７）ＴＢＳＴで洗浄後、ＴＢＳＴで３０００倍希釈した抗ＣＤ９全抗体中で、１時間、３５ｒｐｍで振とうした。
（８）ＴＢＳＴで洗浄後、ＴＢＳＴで３０００倍希釈したＡＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体中で、１時間、３５ｒｐｍで振とうした。
（９）ＴＢＳＴで洗浄後、発色液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を添加し、１０分間、３５ｒｐｍで振とうした。
結果を図３に示す。
　ＰＭＭＡタグ融合ＴＩＭタンパク質固定化ＰＳラテックスビーズの作製
（１）精製した500μLのTIM溶液（タグなし：109.6ug/ml、PMMAタグ付き：55.2ug/mlでPBS中に溶解）、ＰＳビーズ１００μＬ（４．８５×１０７個）を混合し、４℃で一晩、ローテーターにより転倒混和した。
（２）　フラッシングによりＰＳビーズを沈殿させ、上清を除去し、ＴＢＳ（ｐＨ　７．２）２００μＬで懸濁し、４℃で保存した。
　ＰＭＭＡタグ融合ＴＩＭタンパク質固定化ＰＳラテックスビーズを用いたエクソソームの回収
（１）作製したＴＩＭ固定化ビーズ１０μＬ（２．５×１０６個）をエッペンドルフチューブにとり、フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去した。
（２）２％ＢＳＡ、ＴＢＳ（ｐＨ７．２）１０μＬを加え、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（３）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去した。
（４）Ｈｅｌａ細胞培養上清（上記と同じもの）２５０μＬ、または精製したエクソソーム１０μＬをそれぞれのエッペンドルフチューブに加えた。さらに、総体積の1/500量のＥｘｏｓｏｍｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｅｎｈａｎｃｅｒを加えて、室温で１時間インキュベートした。
（５）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、上記と同様に洗浄した。
（６）抗ＣＤ９全ＩｇＧ（マウス）５μｇ／ｍＬ（０．２％ＢＳＡ－ＴＢＳ中）を５０μＬ添加し、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（７）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、上記と同様に洗浄した。
（８）ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（ヤギ）５μｇ／ｍＬ（０．２％ＢＳＡ－ＴＢＳ中）を５０μＬ添加し、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
結果を図４に示す。
　本発明のペプチド融合タンパク質は、標的細胞外小胞（例えばエクソソーム）の捕捉のために有用である。

Claims (15)

  1. 　基材表面に固定化される機能を有するペプチドを、標的細胞外小胞の膜上にある分子を認識するタンパク質のＮ末端側もしくはＣ末端側に有する、タンパク質－ペプチド融合体。
  2. 　標的細胞外小胞の膜上にある分子が、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＧＭ１又はホスファチジルセリンである、請求項１に記載の融合体。
  3. 　上記分子を認識するタンパク質が、原核生物または菌類によって発現可能なタンパク質である、請求項１又は２に記載の融合体。
  4. 　当該ペプチドが、ＰＳペプチド、ＰＭＭＡ／ＰＣペプチド、ＳｉＮペプチド及びＰＤＭＳペプチドからなる群から選択される、請求項１～３いずれか１項に記載の融合体。
  5. 　ペプチドが、配列番号１～２３及び３６に示されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド群から選択されたペプチドである、請求項１～４いずれか１項に記載の融合体。
  6. 　ペプチドが、ＰＳＩタグ（配列番号２）、ＰＳＳタグ（配列番号９）、ＰＭＭＡタグ（配列番号２１又は３６）を含むペプチドである、請求項１～５いずれか１項に記載の融合体。
  7. 　前記タンパク質－ペプチド融合体を構成するタンパク質及び／又はペプチドのアミノ酸配列が、それぞれの全アミノ酸配列に対し１０％未満のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合体。
  8. 　請求項１～７に記載の融合体をコードする塩基配列を含む、核酸。
  9. 　請求項８に記載の核酸を含む、ベクター。
  10. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の融合体が固定化された、基材。
  11. 　請求項１０に記載の基材を用いることを特徴とする、標的細胞外小胞の測定又は単離方法。
  12. 　前記標的細胞外小胞が、体液中に含まれる、請求項１１に記載の方法。
  13. 　請求項１０に記載の基材を含む、標的細胞外小胞を測定又は単離するための、キット又は装置。
  14. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の融合体を基材に接触させる工程を含む、タンパク質－ペプチド融合体が固定化された基材の製造方法。
  15. 　標的細胞外小胞を認識するタンパク質が、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、ＣＴＢ又はＴＩＭタンパク質（ＴＩＭ１～４）である請求項１又は２に記載の融合体。
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