TW201904983A - 對基材具有親和性的肽融合蛋白質 - Google Patents

對基材具有親和性的肽融合蛋白質

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堀內淳一
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Abstract

本發明有關於辨識標的細胞外小胞之蛋白質的N末端側或C末端側具有對基材表面具有吸附功能之肽的蛋白質-肽融合體、包含編碼該融合體之鹼基序列的核酸、包含該核酸之載體、固定化有該融合體之基材、標的細胞外小胞的測定或單離方法、用以測定或單離標的細胞外小胞之套組或裝置。

Description

對基材具有親和性的肽融合蛋白質
本發明有關對基材具有親和性的肽融合蛋白質。
細胞外小胞(small extracellular vesicles)係自細胞分泌之直徑約100nm的小胞，其膜構造與細胞本身或細胞內小器官同樣由脂質雙層所構成。於唾液、血液、尿、羊水等之所有液體中或細胞培養液中安定地存在。進幾年來，作為癌的生物標記物受到矚目，藉由收集體液中之細胞外小胞調查miRNA，而可期待能早期診斷癌症。 　　作為細胞外小胞之例，舉例有外泌體(Exosomes)、微泡(MV：Microvesicles)、細胞凋亡小體(Apoptotic Bodies)。 　　所謂外泌體(Exosomes)係源自細胞內吞路徑(endocytosis pathway)之40-120nm的小胞。作為構成成分，係由蛋白質、核酸(mRNA、miRNA、非包衣RNA)所成。具有扮演細胞間通訊之功能。作為標記物分子舉例有Alix、Tsg101、四跨膜蛋白(tetraspanins) (CD81、CD63、CD9)、flotillin、磷脂絲胺酸(phosphatidylserine)、神經節苷脂(ganglioside)(GM1、GM2、GM3等)。 　　微泡(MV：Microvesicles)係源自細胞質膜之50-1,000 nm之小胞，作為構成成分係由蛋白質、核酸(mRNA、miRNA、非包衣RNA)所成。 　　具有扮演細胞間通訊之功能。作為標記物分子舉例有整合素(Integrins)、選擇素(selectins)、CD40、CD154。 　　細胞凋亡小體(Apoptotic Bodies)係源自細胞質膜之500-2,000nm之小胞，作為構成成分係由經斷片化之核、細胞小器官(細胞器)所成。具有誘導吞噬作用(phagocytosis)之功能。作為標記物分子舉例有Annexin V、磷脂絲胺酸。
作為回收細胞外小胞之方法，已知有利用超離心、藉由粒子尺寸之劃分、免疫沉降之方法。
進幾年來，已報導使用於含有T細胞免疫球蛋白・黏蛋白域(T cell immunoglobulin and mucin domain)分子4(Tim4)蛋白質末端具有His標籤之蛋白質-肽融合體的細胞外小胞之取得方法(專利文獻1)。然而，His標籤由於對基材表面不具有吸附功能，故該等蛋白質-肽融合體不容易直接固定化於基材。
且，已報導使用含有對癌抗原的上皮細胞接著因子(EpCAM：Epithelial cell adhesion molecule)具有結合能之肽的複合材料而用以分離EpCAM表面外泌體之裝置(專利文獻2)。
再者近幾年來，已報導有使用下述肽之外泌體之回收方法：對外泌體具有結合活性之稱為峰毒肽-X(mastoparan-X)的源自黃色胡蜂(Vespa xanthoptera)之由14個胺基酸殘基所成之肽、稱為溶血素(hemolysin)之源自葡萄球菌之由16個胺基酸殘基所成之肽、或hCAP-18之C末端區域藉由蛋白質切斷而游離之稱為LL37之源自人類(智人，homo sapiens)之由37個胺基酸殘基所成之肽(專利文獻3)。然而，該肽亦不容易直接固定於基材。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] WO2016/088689 　　[專利文獻2] WO2014/168230 　　[專利文獻3] 日本特開2017-38566號公報
[發明欲解決之課題]
本發明之課題在於提供可用於捕捉細胞外小胞之肽融合蛋白質。 [用以解決課題之手段]
本發明人等積極研究之結果，首先發現與膜蛋白質CD9、磷脂絲胺酸、GM1等結合之特定蛋白質及與基材具有親和性之肽結合之肽融合蛋白質最適於捕捉細胞外小胞，因而完成本發明。亦即本發明係如以下。 　　[1] 一種蛋白質-肽融合體，其於辨識位於標的細胞外小胞的膜上之分子的蛋白質的N末端側或C末端側具有對基材表面具有固定化功能之肽。 　　[2] 如[1]之融合體，其中位於標的細胞外小胞的膜上之分子係CD9、CD63、CD81、GM1或磷脂絲胺酸。 　　[3] 如[1]或[2]之融合體，其中上述辨識分子之蛋白質係可藉由原核生物或菌類而表現之蛋白質。 　　[4] 如[1]~[3]中任一項之融合體，其中該肽係自PS肽、PMMA/PC肽、SiN肽及PDMS肽所組成之群選出者。 　　[5] 如[1]或[2]之融合體，其中肽係自包含序列編號1~23及36所示之任一胺基酸序列的肽群選出之肽。 　　[6] 如[1]~[6]中任一項之融合體，其中肽係包含PSI標籤(序列編號2)、PSS標籤(序列編號9)、PMMA標籤(序列編號21或36)之肽。 　　[7] 如[1]~[6]中任一項之融合體，其中構成前述蛋白質-肽融合體之蛋白質及/或肽之胺基酸序列包含對於各全胺基酸序列進行未達10%之胺基酸殘基的刪除、取代、插入或附加之胺基酸序列。 　　[8] 一種核酸，其包含編碼如[1]~[7]中任一項之融合體的鹼基序列。 　　[9] 一種載體，其包含如[8]之核酸。 　　[10] 一種基材，其固定化有如[1]~[7]中任一項之融合體。 　　[11] 一種標的細胞外小胞之測定或單離方法，其特徵為使用如[10]之基材。 　　[12] 如[11]之方法，其中前述標的細胞外小胞包含於體液中。 　　[13] 一種套組或裝置，其係包含如[10]之基材，且用以測定或單離標的細胞外小胞。 　　[14] 一種固定化有蛋白質-肽融合體之基材的製造方法，其包含使如[1]~[7]中任一項之融合體接觸於基材之步驟。 　　[15] 如[1]或[2]之融合體，其中辨識標的細胞外小胞之蛋白質係抗CD9抗體、抗CD63抗體、抗CD81抗體、CTB或TIM蛋白質(TIM1 ~4)。 　　本發明之蛋白質肽融合體對於基材表面之吸附密度(μmol/m2 )並未特別限制，但可藉由習知方法(例如日本特開2011-168505號公報)中記載之方法求得。例如為1.0μmol /m2 以上，例如為1.5μmol/m2 以上，例如為2.0μmol/m2 以上，例如為3.0μmol/m2 以上。
本發明中之細胞外小胞係由生體內之細胞或培養細胞分泌之脂質雙重膜所構成之小型膜小胞。該小胞之直徑通常為20nm至1000 nm，或通常為50nm至500nm，或通常為50nm至200nm。已知其膜表面包含CD63或CD9等之四跨膜蛋白(tetraspanins)等之膜蛋白質、GM1等之神經節苷脂(ganglioside)及磷脂絲胺酸。
本發明中所謂肽係肽結合有2~49個胺基酸者。
本發明中所謂蛋白質係肽結合有50個以上胺基酸者。
本發明中所謂蛋白質N末端側係以游離胺基終端之側的末端，所謂蛋白質之C末端側係以游離羧基終端之側的末端。
本發明中所謂蛋白質-肽融合體係上述之蛋白質與肽結合而成者。該結合可直接結合。或亦可於蛋白質與肽之間以不損及特定標的抗原之辨識能及基材吸附能之方式經由適當連結基結合。
針對蛋白質-肽融合體之胺基酸序列，亦在不損及特定標的抗原之辨識能及基材吸附能之範圍內，於胺基酸序列中若未達10%，較好未達8%，更好未達5%，又更好未達3%，再更佳未達2%，特佳未達1%，則可容許胺基酸殘基的刪除、取代、附加或插入。上述若以胺基酸殘基數來說，則若為例如20個以下、例如10個以下、例如5個以下、例如3個以下、例如2個以下、例如若為1個，則可容許胺基酸殘基的刪除、取代、附加或插入。前述刪除、取代、附加或插入較好僅於該融合體之蛋白質或肽之胺基酸序列的C末端或N末端。
蛋白質-肽融合體亦可改稱為肽融合蛋白質。且例如於肽部分為PS標籤，蛋白質部分為抗CD9單鏈抗體時，可表示為抗CD9單鏈抗體-PS標籤融合體或PS標籤融合抗CD9單鏈抗體。
本發明中所謂PS肽係指日本專利第5553336號公報所記載之對具有親水性之樹脂表面的基材表面發揮特異吸附功能之肽群中所含之肽，尤其適合以表面親水性提高之聚苯乙烯樹脂或聚碳酸酯樹脂為基材之情況。可適用作為凝集素陣列或ELISA、免疫分析法等之與抗體之夾心分析用之基材之一般聚苯乙烯樹脂或聚碳酸酯樹脂之所有。
具體而言，係以主要包含胺基酸序列「RXXXRRXRR(其中，X=I、L、V、A、G、M、S或T之一或複數的胺基酸殘基之組合)：序列編號1」之肽表示之肽群，例如包含「RIIIRRIRR(序列編號2)」、「RAIARRIRR (序列編號3)」、「RLLLRRLRR(序列編號4)」、「RVVVRRVRR(序列編號5)」、「RAAARRARR(序列編號6)」、「RGGGRRGRR(序列編號7)」、「RMMMRRMRR(序列編號8)」、「RSSSRRSRR(序列編號9)」、或「RTTTRRTRR(序列編號10)」之肽。
此外，由於包含「KGLRGWREMISL(序列編號11)」、「ADYLSRWGSIRN(序列編號12)」、「SRVHRAVLNGVS(序列編號13)」、「RPPGVVRRYALG(序列編號14)」、「VRSWEEQARVTT(序列編號15)」、「RAFIASRRIKRP(序列編號16)」、「RESTLKGTSRAV(序列編號17)」、「AGLRLKKAAIHR(序列編號18)」、「SSLLRAVPEPTG(序列編號19)」或「RAFIASRRIRRP(序列編號20)」之肽同樣對於具有親水性樹脂表面之固相具有特異吸附能，故同樣可作為本發明之「PS肽」使用。 　　PS肽亦可改稱為PS標籤。
本發明中所謂PMMA/PC肽於基材表面主要為聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯樹脂的基材時，基材親和性高。聚碳酸酯係廣泛使用作為工程塑膠使用，聚甲基丙烯酸甲酯樹脂係使用作為蛋白質晶片等之基材(日本專利第5655254號公報)。
具體而言，例如PMMA肽中，於日本專利第5655254號公報舉例有稱為PMOMP25肽之包含「序列編號21(DVEGIGDVDLVNYFEVGATYYFNK)」或「序列編號36(DVEGIGDVDLVNYFEVGATYTFNK)」之肽標籤等，但不限定於該等，而可使用日本專利第5655254號公報所示之任一肽。 　　PMMA/PC肽亦可改稱為PMMA/PC標籤。
本發明中所謂SiN肽於基材表面為氮化矽(Si3 N4 )的基材時，基材親和性高。氮化矽廣泛使用作為半導體材料(國際公開WO2013/ 122061)。
具體而言，SiN標籤中，於國際公開WO2013 /122061舉例有稱為V821肽之包含「序列編號22 (GGRHTPFFKGYRPQFYFRTTDVTGTIELPE)」之肽標籤等，但不限定於此，亦可使用國際公開WO2013/122061所示之任一肽。 　　SiN肽亦可改稱為SiN標籤。
本發明中所謂PDMS肽於表面基材係聚矽氧橡膠的一種之聚二甲基矽氧烷的基材時之基材親和性高。聚二甲基矽氧烷已知作為微流路等微晶片基材之一(國際公開WO2016/129695)。
具體而言，PDMS標籤中，於國際公開WO2016/129695舉例有稱為ELN-V81肽之包含序列編號23 (MVMPGDNIKMVVTLIHPIAMDDGLRFAIRE)之肽標籤等，但不限於該等，亦可使用國際公開WO2016/129695所示之任一肽。 　　PDMS肽亦可改稱為PDMS標籤。
本發明中所謂抗CD9抗體係可辨識分類為四跨膜蛋白之膜蛋白質的CD9之抗體或抗體類分子。
本發明中所謂抗CD63抗體係可辨識分類為四跨膜蛋白之膜蛋白質的CD63之抗體或抗體類分子。
本發明中所謂抗CD81抗體係可辨識分類為四跨膜蛋白之膜蛋白質的CD81之抗體或抗體類分子。
本發明中所謂CTB表示霍亂毒素(Cholera toxin) B次單元，其係辨識神經節苷脂GM1之蛋白質，係霍亂毒素之結合單元。
本發明中所謂TIM蛋白質(TIM1~4)，係在不損及對含有T細胞免疫球蛋白・黏蛋白域之分子或磷脂絲胺酸的辨識之範圍內，胺基酸序列中若為未達10%、較好未達未達8%，更好未達5%，又更好未達3%，再更佳未達2%，特佳未達1%，則經進行胺基酸殘基的刪除、取代、附加或插入之含有T細胞免疫球蛋白・黏蛋白域之分子改質體。作為不損及對磷脂絲胺酸之辨識的範圍內，只要為具有例如IgV域之胺基酸序列者即可。TIM蛋白質較好為源自動物之TIM蛋白質。其中，較好為人類或小鼠所具有之TIM蛋白質。含有T細胞免疫球蛋白・黏蛋白域之分子已知有TIM1~4。
本發明中所謂PMMA標籤，於PMMA/PC肽中，舉例有「序列編號21 (DVEGIGDVDLVNYFEVGATYYFNK)」或「序列編號36 (DVEGIGDVDLVNYFEVGATYTFNK)」之肽等，但不限於該等，亦可使用日本專利第5655254號公報文獻中所示之任一肽。
本發明中所謂阻斷劑，係於欲促進抗原抗體反應等之特異結合時，用以抑制非特異結合而添加者。
本發明中所謂接觸意指於同一反應系中存在本發明之融合體與目的物。例如包含使本發明之融合體與試料混合、於試料中添加本發明之融合體、於基材中添加本發明之融合體等。
本發明之用以測定或單離標的細胞外小胞(例如外泌體)之套組，除了固定化有融合體之基材以外，於測定套組中，亦可具有通常該領域所用之試藥類例如緩衝劑、增感劑、界面活性劑、防腐劑(例如疊氮化鈉、水楊酸、苯甲酸等)、安定化劑(例如白蛋白、球蛋白、水溶性明膠、界面活性劑、糖類等)、賦活劑、共存物質之影響避免劑、洗淨溶液、含蛋白質改質劑之溶液、其他之該領域所用者、不阻礙與共存藥劑之安定性、不阻礙本發明之蛋白質-肽融合體與基材、結合於本發明之基材之本發明的蛋白質-肽融合體與試料中之標的細胞外小胞的反應或結合者，於單離套組中，亦可於套組中包含使用固定化有本發明之融合體的基材之分離用珠粒、分離用管柱、分離用過濾器等之器具、裝置等。且進而，本發明之套組中，亦可含有本發明之測定或單離用之方法的說明書等。所謂該「說明書」，係利用文章或圖表等實質上記載該方法中之特徵・原理・操作順序、判定順序等之該套組的操作說明書、附屬文書或手冊(廣告單)等。測定或單離標的細胞外小胞(例如外泌體)之步驟可為可測定或單離本發明之融合體與標的細胞外小胞(例如外泌體)之複合體的有無及/或量之方法的任一者，亦可利用本身習知之免疫學測定或單離所用之方法的任一者。其中作為測定方法較好為固相酵素免疫測定法(ELISA)或流式細胞法，作為單離法較好為磁珠法、管柱層析法、過濾器過濾法。
用以測定或單離本發明之標的細胞外小胞(例如外泌體)之裝置，除了固定化有融合體之基材以外，亦可包含檢測器、壓力調整器、動力源、溫度調節器、擴增器、轉換器、計算機、電腦、自動取樣機、試藥儲器、廢液槽、光源、凍結乾燥器、其他之該領域通常所用之機器。 [發明效果]
本發明之融合體可固定化於基材，可捕捉外泌體。
本發明之肽或蛋白質可藉由化學性、或使用原核生物(作為具體例，為大腸菌(E. coli)、革蘭氏陽性菌(穀胺酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、橋石短芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)等)或酵母(釀酒酵母(S. cerevisiae))等之菌類、昆蟲細胞(Sf9、High Five)、動物細胞(CHO細胞、HEK293T)等)等之基因工程方法而合成。 　　該等中，基於成本面、生產效率之觀點，較好為原核生物，其中特佳為大腸菌(E. coli)。
進行肽的化學合成時，可利用習知之肽合成方法合成。且，其合成亦可應用固相合成法及液相合成法之任一者。亦可使用市售之肽合成裝置(例如島津製作所製：PSSM-8等)。
以基因工程合成肽或蛋白質時，首先設計並合成編碼該肽之DNA。該設計及合成可以包含編碼目的蛋白質之核酸的載體(vector)作為鑄模，使用以可合成期望DNA區域之方式設計之引子，藉由PCR法進行。接著，藉由使上述DNA連結於適當載體而獲得蛋白質表現用重組載體，以可使該重組載體表現目的基因之方式導入宿主中而獲得轉形體(Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)。
載體可使用可自主地以宿主微生物增殖之噬菌體或質體。再者，亦可使用動物病毒、昆蟲病毒載體。重組載體之製作只要以適當限制酵素切斷經純化之DNA，插入於適當之載體DNA之限制酵素部位等連結於載體即可。作為轉形中使用之宿主，若為可表現目的基因者，則未特別限制。舉例為例如細菌(大腸菌、枯草菌等)、酵母、動物細胞(COS細胞、CHO細胞等)、昆蟲細胞或昆蟲。亦可使用山羊等之哺乳動物作為宿主。重組載體對宿主之導入方法為習知。
接著，培養前述轉形體，自該培養物採取作為抗原使用之肽。所謂「培養物」意指(a)培養上清液、(b)培養細胞或培養菌體或其破碎物之任一者。
單鏈抗體(scFv)之製作 　　取得編碼抗體之重鏈可變區域(H鏈V區域)及輕鏈可變區域(L鏈V區域)之cDNA，構築編碼scFv之DNA。將該DNA插入表現載体，將該表現載軆導入宿主生物並表現，可製造scFv。
結合親和性 　　結合親和性可藉由結合速度常數(Kon)及解離速度常數(Koff)而決定。親和性平衡常數(Ka)係以Kon/Koff之比表示，解離常數(Kd)為其倒數。結合速度常數(Kon)及解離速度常數(Koff)可使用表面電漿子共振(SPR)測定，即時檢測結合率，進而可採用監測之習知機器及方法(例如Biacore(註冊商標) T200(GE Healthcare公司)、ProteON XPR36 (Bio-Rad公司)等)。 [實施例]
抗CD9scFv之調製 　　作為抗原係使用於CD9之細胞外區段(domain)2(EC2)之部分肽經結合載體蛋白質之蛋白質或對EC2於EC2之C末端側融合人類Fc區域之蛋白質(EC2-hFc)或於細胞膜上表現CD9之細胞(CD9強制表現細胞)，對兔子免疫該等抗原，自脾臟萃取RNA，合成cDNA，將其作為鑄模進行PCR，使兔子抗體基因擴增，以該等為基礎製作scFv噬菌體庫。對於該等scFv噬菌體庫使用上述抗原進行生物淘洗(biopanning)，進行scFv之篩選。其結果，獲得對EC2-hFc具有強結合活性之4個選植株。各選植株(02a004、02a018、02a039及02a045)之全部胺基酸序列示於序列編號24~27。且，各選植株之重鏈可變區域(HV)及輕鏈可變區域(LV)之胺基酸序列示於序列編號28~35。
抗CD9 scFv-PM及CD9 scFv-ELN表現載體之調製
PMMA標籤融合抗CD9 scFv之生產 　　(1)對於大腸菌Rosetta(DE3)添加抗CD9 scFv-PM及抗CD9 scFv-ELN表現載體，對大腸菌進行轉形，於含有Amp、Cm之2×YT培養基10mL中植菌大腸菌，於37℃、200rpm培養整整一晚。 　　(2)於放入含有Amp、Cm之2×YT培養基100mL之附擋板之500mL三角瓶中以成為OD600=0.1之方式添加前述培養液，於37℃、200rpm培養直至OD600=1。 　　(3)將1L之放入OE培養基之小型發酵槽(Jar fermentor)於120℃進行15分鐘高壓釜滅菌後，對Amp、Cm及(2)之全培養液進行全量植菌，於30℃、800rpm、pH7.0正式培養24小時。 　　(4)於離心管中移入每50mL之培養液，於10,000rpm離心分離15分鐘，回收上清液。 　　(5)於培養上清液中添加1%之TritonX，過濾器過濾後，藉由親和性層析儀純化scFv。此時，以結合緩衝液吸附於管柱後，以1×PBS洗淨管柱，以溶洗緩衝液溶出。 　　(6)以1×PBS透析2天(液體交換一次)，進行藉由DC蛋白質分析之濃度測定及藉由SDS-PAGE之表現確認。
PMMA標籤融合抗CD9 scFv固定化PS乳膠珠之製作 　　(1)將經純化之1mg/mL之抗CD9 scFv 02a039-PM或抗人類IgG scFv(對照組)100μL、PS珠粒100μL(4.85×107 個)及500mM TAPS(pH8.5) 20μL予以混合，於4℃藉由旋轉器倒轉混合一晚。 　　(2)藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液，以50mM TAPS(pH8.5) 200μL懸浮，於4℃保存。
使用PMMA標籤融合抗CD9 scFv固定化PS乳膠珠粒之外泌體回收 　　PMMA標籤融合抗CD9 scFv對PS乳膠珠粒之固定化確認 　　(1)將所製作之scFv固定化珠粒10μL(2.5×106 個)取入Eppendorf離心管中，藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液。 　　(2)添加2%BSA、50mM TAPS(pH8.5) 10μL，於室溫藉由旋轉器倒轉混合1小時。 　　(3)藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液。 　　(4)以0.2%BSA-PBS 50μL懸浮，藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液。該操作重複2次(洗淨)。 　　(5)添加50μL之抗6×His全IgG(小鼠) 5μg/mL(0.2%BSA-PBS中)，於室溫藉由旋轉器倒轉混合1小時。 　　(6)藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液，與(4)同樣洗淨。 　　(7)添加50μL之PE標識抗小鼠IgG(兔子)5μg/mL (0.2%BSA-PBS中)，於室溫藉由旋轉器倒轉混合1小時。 　　(8)藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液，與(4)同樣洗淨，最後以250μL之1×PBS懸浮，以流式細胞計測定。結果示於圖1。
藉由流式細胞計之scFv固定化珠粒對外泌體之活性評價 　　(1)進行前述固定化之確認之(1)~(4)的操作。 　　(2)於各Eppendorf離心管中添加Hela細胞培養上清液(Hela細胞以含5%FBS之MEM培養基培養3天時之培養上清液) 250μL、或經純化之外泌體(將上述培養上清液20ml使用和光純藥之Mag CaptureTM 外泌體單離套組PS純化之外泌體) 10μL，於室溫藉由旋轉器倒轉混合1小時。 　　(3)藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液，與上述同樣洗淨。 　　(4)添加50μL之抗CD9全IgG(小鼠) 5μg/mL(0.2%BSA-PBS中)，於室溫藉由旋轉器倒轉混合1小時。 　　(5)藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液，與上述同樣洗淨。 　　(6)添加50μL之PE標識抗小鼠IgG(兔子) 5μg/mL (0.2%BSA-PBS中)，於室溫藉由旋轉器倒轉混合1小時。 　　(7)藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液，與上述同樣洗淨，最後以250μL之1×PBS懸浮，以流式細胞計測定。 結果示於圖2。
藉由西方墨點之回收外泌體中之分析 外泌體樣品之準備 　　(1)將純化之外泌體5μL作為樣品1。 　　(2)進行前述固定化之確認的(1)~(4)之操作後，混合純化之外泌體5μL，於25℃藉由旋轉器倒轉混合2小時。 　　(3)藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液，與上述同樣洗淨。將此設為樣品2。 　　(4)於樣品1及2中分別添加BugBuster(註冊商標) 10μL予以懸浮，施加20秒左右之超音波。 　　(5)於冰上培育15分鐘。 　　(6)將2×樣品緩衝液與樣品1或2以1:1混合，於98℃加熱10分鐘。 　　(7)將SDS-PAGE之凝膠設置於電泳裝置中，添加SDS-PAGE用電泳緩衝液。 　　(8)分子量標記物及樣品各15μL施加於凝膠中。該時，樣品2藉由沖洗使PS珠粒沉澱，施加上清液。 　　(9)將電壓設定於200V，進行約1小時電泳。於BPB之線達到下端的時點結束電泳。
外泌體樣品之西方墨點 　　(1)自玻璃板取下凝膠，藉由Towbin轉印緩衝液以35 rpm振盪5分鐘。 　　(2)將膜轉印用濾紙(超厚墨點紙(Extra Thick Blot Paper)，BIO-RAD) 2片切斷成與凝膠同樣大小，充分染入Towbin轉印緩衝液。 　　(3)將轉印膜(Immobilon Transfer PVDF Membrane，MILLIPORE)切斷成與凝膠同樣大小，於100%甲醇中浸泡15分鐘。隨後，藉由Towbin轉印緩衝液浸漬5分鐘予以置換，以35rpm振盪。 　　(4)於轉墨點SD胞(Trans-Blot Semi-Dry Transfer Cell 221BR，BIO-RAD)上，設置凝膠、PVDF膜及濾紙。此時，使氣泡不進入其間。 　　(5)以25V之定電壓通電50分鐘，將圖型自凝膠轉印至膜上。 　　(6)於Blocking one原液中，以35rpm振盪1小時。 　　(7)以TBST洗淨後，於以TBST稀釋3000倍之抗CD9全抗體中，以35rpm振盪1小時。 　　(8)以TBST洗淨後，於以TBST稀釋3000倍之AP標識抗小鼠IgG抗體中，以35rpm振盪1小時。 　　(9)以TBST洗淨後，添加顯色液(BCIP/NBT)，以35rpm振盪10分鐘。 結果示於圖3。
PMMA標籤融合TIM蛋白質固定化PS乳膠珠粒之製作 　　(1)將經純化之500μL之TIM溶液(無標籤：109.6μg/ ml，附PMMA標籤：55.2μg/ml溶解於PBS中)、PS珠粒100 μL(4.85×107 個)予以混合，於4℃藉由旋轉器倒轉混合一晚。 　　(2)藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液，以TBS (pH7.2) 200μL懸浮，於4℃保存。
使用PMMA標籤融合TIM蛋白質固定化PS乳膠珠粒之外泌體回收 　　(1)所製作之TIM固定化珠粒10μL(2.5×106 個)取入Eppendorf離心管，藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液。 　　(2)添加2%BSA、TBS(pH7.2) 10μL，於室溫藉由旋轉器倒轉混合1小時。 　　(3)藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液。 　　(4)於各Eppendorf離心管中添加Hela細胞培養上清液(與上述相同者) 250μL，或經純化之外泌體10μL。進而，添加總體積之1/500量的外泌體結合促進劑(Exosome Binding Enhancer)，於室溫培育1小時。 　　(5)藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液，與上述同樣進行洗淨。 　　(6)添加50μL之抗CD9全IgG(小鼠) 5μg/mL(0.2%BSA-TBS中)，於室溫藉由旋轉器倒轉混合1小時。 　　(7)藉由沖洗使PS珠粒沉澱，去除上清液，與上述同樣進行洗淨。 　　(8)添加50μL之PE標識抗小鼠IgG(兔子) 5μg/mL(0.2% BSA-TBS中)，於室溫藉由旋轉器倒轉混合1小時。結果示於圖4。 [產業上之可利用性]
本發明之肽融合蛋白質於用以捕捉標的細胞外小胞(例如外泌體)中有用。
圖1係利用流式細胞儀確認PMMA標籤融合抗CD9單鏈抗體對PS乳膠珠之固定化。 　　圖2係利用流式細胞儀確認使用PMMA標籤融合抗CD9單鏈抗體固定化乳膠珠之外泌體回收。 　　圖3係利用西方墨點法確認使用PMMA標籤融合抗CD9單鏈抗體固定化乳膠珠之外泌體回收。 　　圖4係利用流式細胞儀確認使用PMMA標籤融合TIM蛋白質固定化乳膠珠之外泌體回收。

Claims (15)

  1. 一種蛋白質-肽融合體，其於辨識位於標的細胞外小胞的膜上之分子的蛋白質的N末端側或C末端側具有對基材表面具有固定化功能之肽。
  2. 如請求項1之融合體，其中位於標的細胞外小胞的膜上之分子係CD9、CD63、CD81、GM1或磷脂絲胺酸。
  3. 如請求項1或2之融合體，其中上述辨識分子之蛋白質係可藉由原核生物或菌類而表現之蛋白質。
  4. 如請求項1~3中任一項之融合體，其中該肽係自PS肽、PMMA/PC肽、SiN肽及PDMS肽所組成之群選出者。
  5. 如請求項1~4中任一項之融合體，其中肽係自包含序列編號1~23及36所示之任一胺基酸序列的肽群選出之肽。
  6. 如請求項1~5中任一項之融合體，其中肽係包含PSI標籤(序列編號2)、PSS標籤(序列編號9)、PMMA標籤(序列編號21或36)之肽。
  7. 如請求項1~6中任一項之融合體，其中構成前述蛋白質-肽融合體之蛋白質及/或肽之胺基酸序列包含對於各全胺基酸序列進行未達10%之胺基酸殘基的刪除、取代、插入或附加之胺基酸序列。
  8. 一種核酸，其包含編碼如請求項1~7中任一項之融合體的鹼基序列。
  9. 一種載體，其包含如請求項8之核酸。
  10. 一種基材，其固定化有如請求項1~7中任一項之融合體。
  11. 一種標的細胞外小胞之測定或單離方法，其特徵為使用如請求項10之基材。
  12. 如請求項11之方法，其中前述標的細胞外小胞包含於體液中。
  13. 一種套組或裝置，其係包含如請求項10之基材，且用以測定或單離標的細胞外小胞。
  14. 一種固定化有蛋白質-肽融合體之基材的製造方法，其包含使如請求項1~7中任一項之融合體接觸於基材之步驟。
  15. 如請求項1或2之融合體，其中辨識標的細胞外小胞之蛋白質係抗CD9抗體、抗CD63抗體、抗CD81抗體、CTB或TIM蛋白質(TIM1~4)。
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