WO2023080102A1 - 血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出用キット、及び脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する方法 - Google Patents

血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出用キット、及び脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する方法 Download PDF

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WO2023080102A1
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brain
exosomes
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洋一 牧野
匠 平瀬
耕平 湯山
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凸版印刷株式会社
国立大学法人北海道大学
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase

Definitions

  • the present invention provides a method for detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in blood, a kit for detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in blood, and evaluating the accumulation level of amyloid ⁇ in the brain. on how to.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2021-180612 filed in Japan on November 4, 2021, the contents of which are incorporated herein.
  • Alzheimer's disease is the dementia with the largest number of patients, and Alzheimer's disease accounts for 50-75% of all dementia, and treatment methods are currently being developed.
  • amyloid ⁇ forms a polymer outside the brain nerve cells, accumulates in the brain, and deposits in the brain to form senile plaques. It is thought to be caused by the degeneration of nerves due to the formation of neurofibrils, which are oxidized to form filaments and deposited in the brain, causing neurological disorders such as neuronal cell death and synaptic dysfunction. .
  • amyloid ⁇ For the treatment or prevention of Alzheimer's disease, it is effective to treat or prevent the accumulation of amyloid ⁇ before the tau-dependent neuropathy in the brain is caused.
  • a method that can measure amyloid ⁇ in the brain is required, but the cerebrospinal fluid test currently used to measure amyloid ⁇ is highly invasive, and PET imaging and blood amyloid ⁇ can be measured.
  • the method of detection by mass spectrometry requires special equipment.
  • Exosomes are a type of extracellular vesicle, and are membrane vesicles with a diameter of about 40-150 nm that are secreted from cells. In recent years, it has been pointed out that exosomes may play a role in transmitting information to distant cells and tissues. Exosomes contain various proteins, lipids, and nucleic acids, and are thought to cause functional and physiological changes when transported to different cells.
  • Non-Patent Document 1 reports that amyloid ⁇ binds to ganglioside GM1 present on the surface of exosomes in neurons, amyloid ⁇ is transported by exosomes, and accumulates in the brain to form plaques.
  • Non-Patent Document 2 reports that amyloid ⁇ was detected in exosomes isolated from the plasma of Alzheimer's patients.
  • nucleic acids such as DNA and RNA are quantified by real-time PCR or the like.
  • Non-Patent Document 3 describes a technique of performing an enzymatic reaction in a large number of microcompartments and detecting fluorescence signals. This technique is called digital metrology.
  • the sample solution is divided into an extremely large number of minute solutions. Then, the signal from each minute solution is binarized, only the presence or absence of target molecules is determined, and the number of target molecules is counted. Digital measurement can dramatically improve detection sensitivity and quantification compared to conventional real-time PCR methods and the like.
  • Non-Patent Document 3 discloses a method using micro-sized droplets formed so that each well has a volume of several nanoliters.
  • ICA digital Invasive Cleavage Assay
  • Non-Patent Document 1 detects amyloid ⁇ bound to exosomes released from cultured neurons, but this detection method isolates exosomes released from cultured neurons and extracts amyloid ⁇ bound to exosomes. It is a method of immunostaining and detecting using an electron microscope, and is not a method of rapidly detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain nerve cells in blood.
  • Non-Patent Document 2 also detects amyloid ⁇ in exosomes isolated from plasma, and is not a rapid detection method. Moreover, it is not known to evaluate the accumulation level of amyloid ⁇ in the brain by detecting amyloid ⁇ bound to exosomes in blood.
  • the present invention has been made in view of the circumstances described above, and includes a technique for rapidly and highly sensitively detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons, and a technique for evaluating the accumulation level of amyloid ⁇ in the brain. intended to provide
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain nerve cells in blood wherein amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain nerve cells in blood and labeled with a nucleic acid fragment, specific to amyloid ⁇ and a step of detecting the amyloid ⁇ -specific binding substance.
  • the detection method according to [1] comprising the step of detecting biomarkers present on the surface of exosomes derived from the brain nerve cells.
  • a method for detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in blood comprising a biomarker present on the exosome surface and a biomarker present on the exosome surface labeled with a nucleic acid fragment Specifically binds to the exosome surface biomarker specific binding substance, a step of binding, detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in the blood, and the exosome surface biomarker and detecting a specific binding substance.
  • the amyloid ⁇ is bound to a biomarker present on the surface of exosomes derived from the brain nerve cells, [1] to the detection method according to any one of [3].
  • the step of detecting the biomarker or the amyloid ⁇ is performed by capturing exosomes derived from the brain nerve cells using a substance that specifically binds to the biomarker or the amyloid ⁇ , [2 ] The detection method according to any one of [4]. [6] The detection method according to any one of [1] to [5], wherein the amyloid ⁇ -specific binding substance is an antibody or antibody fragment that specifically binds to amyloid ⁇ . [7] The detection method according to any one of [2] to [6], wherein the biomarker is ganglioside GM1.
  • a kit for detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in blood comprising an amyloid ⁇ -specific binding substance that is labeled with a nucleic acid fragment and specifically binds to amyloid ⁇ .
  • the kit according to [9] further comprising a substance that detects biomarkers present on the surface of exosomes derived from brain neurons.
  • a substance that detects a biomarker present on the surface of exosomes derived from the brain nerve cell is a substance that specifically binds to a biomarker present on the surface of exosomes derived from the brain nerve cell, according to [10] kit.
  • kit for detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in blood, which is labeled with a nucleic acid fragment and specifically binds to a biomarker present on the surface of the brain nerve cell-derived exosomes a kit comprising an exosome surface biomarker-specific binding agent and an amyloid- ⁇ -specific binding agent that specifically binds to amyloid- ⁇ .
  • the biomarker is ganglioside GM1.
  • a method for evaluating the accumulation level of amyloid ⁇ in the brain comprising a step of detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in the blood, and the amount of amyloid ⁇ detected, the amyloid in the brain and a step of evaluating the ⁇ accumulation level.
  • Detection of amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons is performed by the detection method according to any one of [1] to [8], [15] evaluation method.
  • the present invention it is possible to provide a technique for rapidly and highly sensitively detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons and a technique for evaluating the accumulation level of amyloid ⁇ in the brain.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device
  • FIG. 10 is a diagram showing a fluorescence image in Experimental Example 1; 4 is a graph showing fluorescence intensity in Experimental Example 1.
  • FIG. The left figure shows the linear scale fluorescence intensity, and the right figure shows the log scale fluorescence intensity.
  • 2 is a graph showing the fluorescence intensity of exosomes of 3-week-old or 13-week-old human familial mutant APP gene-introduced mice in Experimental Example 2.
  • FIG. 10 is a diagram showing a fluorescence image in Experimental Example 1; 4 is a graph showing fluorescence intensity in Experimental Example 1.
  • FIG. The left figure shows the linear scale fluorescence intensity, and the right figure shows the log scale fluorescence intensity.
  • 2 is a graph showing the fluorescence intensity of exosomes of 3-week-old or 13-week-old human familial mutant APP gene-introduced mice in Experimental Example 2.
  • Control indicates the case of using a buffer solution (PBS) instead of exosomes.
  • 10 is a graph showing concentrations of amyloid ⁇ 40 (A ⁇ 40) and amyloid ⁇ 42 (A ⁇ 42) in the brain tissue of human familial mutant APP gene-introduced mouse in Experimental Example 3.
  • FIG. The left figure shows the concentration of amyloid ⁇ 40, and the right figure shows the concentration of amyloid ⁇ 42.
  • FIG. 10 shows immunohistochemical staining of amyloid ⁇ in brain tissues of 3-week-old or 13-week-old human familial mutant APP gene-introduced mice in Experimental Example 3.
  • the left figure is immunohistochemical staining of amyloid ⁇ in the brain tissue of 3-week-old human familial mutant APP gene-transduced mouse, and the right figure is amyloid ⁇ in 13-week-old human familial mutant APP gene-transduced mouse brain tissue. Immunohistochemical staining is shown.
  • 4 is a graph showing the concentration of free amyloid ⁇ 40 (A ⁇ 40) or amyloid ⁇ 42 (A ⁇ 42) in the serum of 3-week-old or 13-week-old human familial mutant APP gene-introduced mice in Comparative Example 1.
  • FIG. The left figure shows the concentration of amyloid ⁇ 40
  • the right figure shows the concentration of amyloid ⁇ 42.
  • the present invention is a method for detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in blood, wherein the amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in blood is labeled with a nucleic acid fragment. Also provided is a detection method comprising the steps of binding an amyloid ⁇ -specific binding substance that specifically binds to amyloid ⁇ , and detecting the amyloid ⁇ -specific binding substance. The detection method according to this embodiment will be described below.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining the detection method of this embodiment.
  • the detection method of the present embodiment first, amyloid ⁇ 111 bound to exosomes 110 derived from brain neurons in blood, and labeled with a nucleic acid fragment 121, amyloid that specifically binds to amyloid ⁇ 111 ⁇ -specific binding substance 120 is bound.
  • Amyloid ⁇ 111 binds to biomarkers 112 present on the surface of exosomes 110 derived from brain neurons.
  • Blood includes whole blood, serum, plasma and the like.
  • Exosomes are membrane vesicles with a diameter of about 40 nm to 150 nm that are secreted by most cells. In vivo, it is observed in body fluids such as saliva, blood, urine, amniotic fluid, and malignant ascites, and is also secreted from cultured cells. In recent years, it has been pointed out that exosomes may play a role in transmitting information to distant cells and tissues. Exosomes contain various proteins, lipids, and nucleic acids, and are thought to cause functional and physiological changes when transported to different cells. Specific examples thereof have been suggested to play roles in mediating adaptive immune responses against infectious pathogens and tumors, tissue repair, neurotransmission, transport of pathogenic proteins, and the like.
  • exosomes are exosomes derived from brain neurons.
  • Amyloid ⁇ which is considered to be a causative factor of Alzheimer's disease, is known to bind to exosomes derived from brain neurons, be transported, accumulate in the brains of Alzheimer's disease patients, and form plaques. Therefore, by using a substance that specifically binds to amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons, it is possible to detect amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons.
  • Amyloid ⁇ 111 is bound to exosomes 110 by binding to biomarkers 112 present on the membrane surface of exosomes 110 derived from brain neurons. Examples of biomarkers 112 present on the membrane surface of exosomes 110 derived from brain neurons and capable of binding to amyloid ⁇ 111 include ganglioside GM1 and the like.
  • the amyloid ⁇ -specific binding substance 120 labeled with the nucleic acid fragment 121 bound to the amyloid ⁇ 111 bound to the exosomes 110 derived from brain neurons is detected.
  • the detection method of this embodiment is suitable for detection by digital measurement.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • the fluidic device 200 includes a substrate 210 and a lid member 220 arranged to face the substrate 210 .
  • the lid member 220 has a convex portion 221 and the tip of the convex portion 221 is in contact with the substrate 210 .
  • well array 240 is integrally molded with substrate 210 on one surface of substrate 210 and faces lid member 220 .
  • Well array 240 has a plurality of wells 241 .
  • the lid member 220 may be welded or adhered to the substrate 210 .
  • the well 241 is open on the surface of the substrate 210. Although the shape, size, and arrangement of the wells 241 are not particularly limited, it is preferable to introduce exosomes derived from one brain nerve cell into one well 241 .
  • Well 241 is preferably a microwell with a small volume. For example, the volume of one well 241 may be on the order of 10 fL to 100 pL.
  • a plurality of wells 241 of the same shape and size form a well array 240 .
  • the same shape and same size means that they have the same shape and the same capacity to the extent required for performing digital measurement, and variations to the extent of manufacturing error are allowed.
  • the diameter of the well 241 may be, for example, about 1 to 10 ⁇ m, and the depth of the well 241 may be, for example, about 1 to 10 ⁇ m.
  • the arrangement of the wells 241 is not particularly limited, and may be arranged in a triangular lattice, may be arranged in a square lattice, or may be arranged at random.
  • a space is formed between the well array 240 and the lid member 220 due to the presence of the protrusions 221 .
  • the space constitutes the channel 230 .
  • the channel 230 functions as a path for feeding a liquid in which exosomes derived from brain nerve cells, amyloid ⁇ -specific binding substances labeled with nucleic acid fragments, and the like are dispersed, and a sealing liquid described later.
  • the shape, structure, capacity, etc. of the channel 230 are not particularly limited, but the height of the channel 230 (the distance between the surface of the substrate 210 and the surface of the lid member 220 facing the substrate 210) is, for example, 500 ⁇ m or less. For example, it may be 300 ⁇ m or less, for example, it may be 200 ⁇ m or less, or it may be, for example, 100 ⁇ m or less.
  • the convex portion 221 may be formed integrally with the lid member 220 .
  • the lid member 220 can be molded into a plate-like shape having the protrusions 221 by molding a thermoplastic resin fluid using a molding die, for example.
  • the lid member 220 may be formed with a reagent introduction port 222 and a reagent discharge port 223 .
  • the lid member 220 When the lid member 220 has the protrusions 221, the lid member 220 and the substrate 210 are overlapped so that the protrusions 221 are in contact with the surface of the substrate 210 on which the wells 241 are opened. As a result, the space between the lid member 220 and the substrate 210 becomes the channel 230 .
  • the lid member 220 and the substrate 210 may be welded by laser welding or the like.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • fluidic device 500 includes substrate 210 and wall member 510 .
  • well array 240 is formed integrally with substrate 210 on one surface of substrate 210 .
  • Well array 240 has a plurality of wells 241 .
  • the fluidic device 500 mainly differs from the above-described fluidic device 200 in that it does not have a lid member 220 . Therefore, fluidic device 500 does not have a flow channel.
  • the lid member 220 and the convex portion 221 are integrally formed.
  • the lid member 220 and the projection 221 may be formed separately.
  • the well array 240 is formed integrally with the substrate 210 on one surface of the substrate 210 .
  • the well array does not have to be integrally molded with substrate 210 .
  • a well array 240 molded separately from the fluidic device may be placed on the substrate 210 of the fluidic device.
  • a resin layer may be laminated on the surface of the substrate 210 and a well array may be formed in the resin layer by etching or the like.
  • the substrate 210 is formed using resin, for example.
  • resin for example.
  • the type of resin is not particularly limited, it is preferably a resin that is resistant to reagents and sealing liquids.
  • the signal to be detected is fluorescence, it is preferable to use a resin with little autofluorescence. Examples include, but are not limited to, cycloolefin polymers, cycloolefin copolymers, silicon, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polyethylene, polyvinyl acetate, fluororesins, and amorphous fluororesins.
  • a plurality of wells 241 may be formed on one surface of the substrate 210 in the plate thickness direction.
  • Methods of forming wells using a resin include injection molding, thermal imprinting, optical imprinting, and the like.
  • a well array may be formed by laminating a fluororesin on the substrate 210 and processing the fluororesin by etching or the like.
  • a fluorine resin for example, CYTOP (registered trademark) (Asahi Glass) or the like can be used.
  • the material of the lid member 220 is preferably a resin with low autofluorescence, and may be, for example, a thermoplastic resin such as cycloolefin polymer or cycloolefin copolymer.
  • the lid member 220 may be made of a material that does not transmit light having a wavelength in the vicinity of the wavelength detected during fluorescence observation of the signal, or may be made of a material that completely does not transmit light.
  • the lid member 220 may be made of thermoplastic resin to which carbon, metal particles, or the like is added.
  • the detection method of the present embodiment is a method for detecting amyloid ⁇ 111 bound to exosomes 110 derived from brain neurons in blood, wherein the exosomes 110 derived from brain neurons in blood are labeled with a nucleic acid fragment 121, amyloid ⁇ and a step of detecting the amyloid ⁇ -specific binding substance 120. According to the method of this embodiment, amyloid ⁇ 111 bound to exosomes 110 derived from brain neurons can be detected.
  • the detection method of the present embodiment may further comprise a step of detecting biomarkers 112 present on the surface of exosomes 110 derived from brain neurons.
  • the step of detecting biomarkers 112 present on the surface of brain nerve cell-derived exosomes 110 uses a substance that detects biomarkers 112 present on the surface of brain nerve cell-derived exosomes 110, exosomes 110 derived from brain nerve cells.
  • biomarkers 112 by detecting biomarkers 112 present on the surface of the If biomarkers 112 are present on the surface of exosomes 110 derived from brain neurons, a substance that specifically binds to biomarkers 112 present on the surface of exosomes 110 derived from brain neurons (exosome surface biomarker-specific binding substance) Since it is possible to capture brain nerve cell-derived exosomes 110 using, the detection of biomarkers 112 present on the surface of brain nerve cell-derived exosomes 110 is performed using a biomarker-specific binding substance on the exosome surface, cranial nerves This can be done by capturing exosomes 110 derived from cells.
  • the reagent liquid L210 is introduced from the introduction port 222 of the fluidic device 200 and sent to the channel 230.
  • Reagent solution L210 is a liquid in which amyloid ⁇ -specific binding substance 120 labeled with brain nerve cell-derived exosomes 110 and nucleic acid fragment 121 is dispersed, and also contains a reagent for detecting nucleic acid fragment 121.
  • amyloid ⁇ 111 is bound to exosomes 110 derived from brain neurons
  • amyloid ⁇ -specific binding substance 120 labeled with nucleic acid fragment 121 binds to amyloid ⁇ 111 bound to exosomes 110 derived from brain neurons. .
  • the reagent liquid L210 sent to the channel 230 contacts the well array 240.
  • a reagent solution L210 is accommodated inside the well 241 .
  • brain nerve cell-derived exosomes 110, amyloid ⁇ -specific binding substance 120 labeled with nucleic acid fragment 121, and a reagent for detecting nucleic acid fragment 121 are introduced into well 241.
  • the number of brain nerve cell-derived exosomes 110 to be introduced into one well 241 is not particularly limited, but preferably one or less, i.e., 0 or 1 brain nerve cell-derived exosomes 110 are introduced into one well 241. be done.
  • amyloid ⁇ 111 bound to exosomes 110 derived from brain nerve cells can be detected in units of one, that is, digital measurement becomes possible.
  • the means for introducing the brain nerve cell-derived exosomes 110 into the well 241 is not particularly limited, and an appropriate means can be selected according to the selected brain nerve cell-derived exosomes 110.
  • exosomes 110 derived from brain nerve cells are sedimented in the fluidic device (within the channel) by their own weight, and a method of distributing them to the wells 241 can be mentioned.
  • exosomes 110 derived from brain neurons using the above-mentioned exosome surface biomarker-specific binding substance, exosomes surface biomarker-specific binding substance to exosomes 110 derived from brain neurons that are difficult to sediment under their own weight may be bound and sent, in advance in the well 241, by immobilizing the biomarker-specific binding substance on the exosome surface and capturing the exosomes 110 derived from the sent brain nerve cells, brain nerve cells It is also possible to improve the efficiency of introduction of exosomes 110 derived from wells 241.
  • the step of binding biomarker-specific binding substances on the surface of exosomes to biomarkers 112 present on the surface of brain nerve cell-derived exosomes 110 to capture brain nerve cell-derived exosomes 110 is any of the detection methods of the present embodiment. can be done at the time of For example, in this step, prior to the step of introducing brain nerve cell-derived exosomes 110 into the well 241, the brain nerve cell-derived exosomes 110 and the exosome surface biomarker-specific binding substance are brought into contact in the sample tube. good too.
  • the exosomes 110 derived from brain neurons are introduced into the well 241, and within the well 241 the biomarker-specific binding substance on the exosome surface and the brain nerve cell-derived Exosomes 110 may be contacted.
  • the exosome surface biomarker-specific binding substance may be a conjugate between a solid phase and an exosome surface biomarker-specific binding substance.
  • Solid phases include particles, films, substrates, and the like.
  • the exosome surface biomarker-specific binding substance may be one type, or may be two or more types. For example, there may be three types, four types, or five or more types.
  • the particles are not particularly limited, and include polymer particles, magnetic particles, glass particles, and the like. Particles are preferably surface-treated particles to avoid non-specific adsorption. Particles having a functional group such as a carboxyl group on the surface are preferred for immobilizing a specific binding substance. More specifically, JSR's product name "Magnosphere LC300" or the like can be used.
  • Amyloid ⁇ -specific binding substances 120 and exosome surface biomarker-specific binding substances include antibodies, antibody fragments, aptamers, and the like.
  • antibody fragments include Fab, F(ab') 2 , Fab', single-chain antibodies (scFv), disulfide-stabilized antibodies (dsFv), dimerized V region fragments (diabody), peptides containing CDRs, and the like. be done.
  • Antibodies may be monoclonal antibodies or polyclonal antibodies. Alternatively, it may be a commercially available antibody.
  • ganglioside GM1 is present as a biomarker on the surface of exosomes derived from brain neurons, so the biomarker-specific binding substance on the exosome surface is specific to ganglioside GM1. It may be an antibody, antibody fragment, aptamer, protein, etc. that specifically binds. Proteins that specifically bind to ganglioside GM1 include cholera toxin subunit B (hereinafter also referred to as CTB).
  • CTB cholera toxin subunit B
  • Methods for labeling amyloid ⁇ -specific binding substances with nucleic acid fragments include methods using a cross-linking agent.
  • the nucleic acid fragment may be labeled with an amyloid- ⁇ specific binding substance via a linker molecule.
  • the linker is not particularly limited, and examples thereof include polyethylene chains, hydrocarbon chains, peptides and the like.
  • a nucleic acid fragment may be DNA or RNA. It may also contain artificial nucleic acids such as BNA and LNA.
  • nucleic acid detection reaction takes about 1 minute to 30 minutes, enabling rapid nucleic acid detection.
  • the method of immobilizing the biomarker-specific binding substance on the exosome surface on the particle surface is not particularly limited, and the method by physical adsorption, the method by chemical binding, the method of using avidin-biotin binding, protein G or protein A. and a method that utilizes the binding of an antibody.
  • the method by physical adsorption includes a method of immobilizing a biomarker-specific binding substance on the exosome surface on the particle surface by hydrophobic interaction and electrostatic interaction.
  • Methods using chemical bonding include a method using a cross-linking agent.
  • the carboxyl group of the biomarker-specific binding substance on the exosome surface is reacted with a cross-linking agent to form an active ester, and then the hydroxyl group and the ester group are reacted to exosomes.
  • Surface biomarker-specific binding substances can be immobilized on the particle surface.
  • one exosome surface biomarker-specific binding substance has exosomes 110 derived from brain nerve cells. It is preferable to form a conjugate between the biomarker-specific binding substance on the exosome surface and exosomes 110 derived from brain nerve cells under conditions where 0 or 1 is detected.
  • one well 241 is preferably configured to introduce 0 or 1 biomarker-specific binding substance on the surface of exosomes. This enables digital measurement.
  • amyloid ⁇ 111 is bound to exosomes 110 derived from brain neurons
  • Amyloid ⁇ 111 bound to exosomes 110 and amyloid ⁇ -specific binding substance 120 labeled with nucleic acid fragment 121 bind to form complex 100 .
  • Formation of the complex 100 may be performed within the sample tube or within the well 241 .
  • ⁇ Enclosure process After introducing exosomes 110 derived from brain nerve cells, amyloid ⁇ -specific binding substance 120 or the like labeled with nucleic acid fragment 121 into well 241, a step of sealing the opening of well 241 may be performed.
  • the method of sealing the opening of the well 241 is not particularly limited as long as the liquid contained in one well 241 and the liquid contained in another well 241 do not mix with each other.
  • the well 241 may be sealed by covering the opening of the well 241 with a sealing liquid.
  • the opening of the well 241 may be sealed by laminating a plate-like member such as a glass plate.
  • the sealing liquid L220 is sent from the introduction port 222 of the lid member 220 to the channel 230 between the substrate 210 and the lid member 220.
  • the sealing liquid L220 sent to the channel 230 contacts the well array 240.
  • the sealing liquid L220 pushes away and replaces the reagent liquid L210 not contained in the well 241 among the reagent liquid L210 sent to the channel 230 .
  • the sealing liquid L220 individually seals the plurality of wells 241 containing the reagent liquid L210 containing exosomes 110 derived from brain neurons, and the wells 241 become independent reaction spaces (micropartitions 242).
  • FIG. 4 shows a state in which all wells 241 of well array 240 are sealed with sealing liquid L220 to form sealed wells (microcompartments) 242 .
  • Lipids forming a lipid bilayer membrane include, for example, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG), Examples thereof include, but are not limited to, mixtures thereof.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPG 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol
  • Wells 242 sealed by any of the sealing methods described above may contain amyloid ⁇ -specific binding substance 120 that does not bind to exosomes 110 derived from brain neurons.
  • the sealing liquid is a liquid capable of individually sealing the liquids introduced into the plurality of wells 241 so as not to mix with each other to form droplets (microdroplets), and is preferably an oily solution. , more preferably oil.
  • oil fluorine-based oil, silicone-based oil, hydrocarbon-based oil, or a mixture thereof can be used. More specifically, the product name "FC-40” manufactured by Sigma can be used. FC-40 (CAS number: 86508-42-1) is a fluorinated aliphatic compound with a specific gravity of 1.85 g/mL at 25°C.
  • Detection of the nucleic acid fragment 121 is preferably performed using a signal amplification reaction.
  • Signal amplification reactions include, for example, Invasive Cleavage Assay (ICA).
  • the ICA reaction is related to the principle that signal amplification proceeds through a cycle of two reactions: (1) complementary binding between nucleic acids and (2) recognition and cleavage of the triplex structure by an enzyme.
  • the ICA reaction is less affected by reaction cycle inhibition by contaminants. Therefore, by using the ICA reaction, exosomes 110 derived from brain neurons can be detected with high accuracy.
  • the reagent solution L210 liquid containing the brain nerve cell-derived exosomes 110 and the amyloid ⁇ -specific binding substance 120 contains reaction reagents necessary for the ICA reaction.
  • Reaction reagents required for the ICA reaction include ICA reaction reagents such as flap probes, invasion probes, flap endonuclease (FEN), and fluorescent substrates. Flap probes and invasion probes are nucleic acid fragments designed to hybridize to nucleic acid fragment 121 and form a flap structure with nucleic acid fragment 121 .
  • FIG. 8 is a schematic diagram explaining an example of the ICA method.
  • the flap probe and the invasion probe are hybridized to the nucleic acid fragment 121 .
  • flap probe 810 and invasion probe 130 hybridize to nucleic acid fragment 121 .
  • a first flap portion 811 is formed.
  • the first flap site 811 is reacted with FEN, the first flap site 811 is cleaved and a nucleic acid fragment 811 is generated. Nucleic acid fragment 811 then hybridizes to a fluorescent substrate (nucleic acid fragment 820 ) to form second flap region 821 .
  • a fluorescent substance F is bound to the 5' end of the nucleic acid fragment 820, and a quenching substance Q is bound several bases 3' from the 5' end of the nucleic acid fragment 820.
  • the second flap site 821 is reacted with FEN, the second flap site 821 is cleaved and a nucleic acid fragment 821 is produced.
  • the fluorophore F is separated from the quencher Q, generating a fluorescence signal.
  • the nucleic acid fragment 121 can be detected by detecting this fluorescence signal.
  • the reagent liquid L210 a common liquid used in biochemical analysis performed using a fluidic device can be used, preferably an aqueous solution. Further, the reagent liquid L210 may contain a surfactant or the like to make it easier to enclose the liquid in the well.
  • the fluorescent substance F is liberated from the quenching substance Q by an isothermal enzymatic reaction, and a predetermined fluorescent signal is generated in response to the excitation light. emitted.
  • a known appropriate method can be selected according to the type of signal to be detected. For example, when observing a fluorescent signal, the well 242 is irradiated with excitation light corresponding to the fluorescent substance, and fluorescence emitted by the fluorescent substance is observed. For example, as shown in FIG. 4, a predetermined reaction is performed in sealed well 242 and the generated signal is observed.
  • Well 242R is the well in which signal was detected and well 242 is the well in which no signal was detected.
  • a reagent liquid L210 is introduced into the fluidic device 500 as shown in FIG.
  • Reagent solution L210 is a liquid in which brain nerve cell-derived exosomes 110 and amyloid ⁇ -specific binding substance 120 labeled with nucleic acid fragment 121 are dispersed, and also contains a reagent for detecting nucleic acid fragment 121.
  • the concentration of the brain nerve cell-derived exosomes 110 is preferably adjusted so that one molecule or less of the brain nerve cell-derived exosomes 110 enters the wells 241 per well.
  • a sealing liquid L220 is introduced into the fluidic device 500.
  • the specific gravity of the sealing liquid L220 is greater than that of the reagent liquid L210. Therefore, the sealing liquid L220 sinks below the reagent liquid L210 that is not contained in the wells 241 among the reagent liquids L210 and contacts the well array 240 . Then, the sealing liquid L220 individually seals the plurality of wells 241 containing the reagent liquid L210 containing brain nerve cell-derived exosomes to form independent reaction spaces (micropartitions 242).
  • Well 242R is the well in which signal was detected and well 242 is the well in which no signal was detected.
  • the present invention in one embodiment, is a method for detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in blood, wherein the exosome surface labeled with a biomarker present on the exosome surface and a nucleic acid fragment
  • a step of binding a substance that specifically binds to a biomarker present on the exosome surface (biomarker-specific binding substance on the exosome surface) and a step of detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in the blood
  • a detection method comprising detecting a biomarker-specific binding substance on the surface of exosomes.
  • the detection method according to this embodiment will be described below.
  • FIG. 9 is a schematic diagram for explaining the detection method of this embodiment.
  • biomarkers 112 present on the surface of brain nerve cell-derived exosomes, labeled with a nucleic acid fragment 151, brain nerve cell-derived exosomes present on the surface and a biomarker-specific binding substance 150 on the exosome surface that specifically binds to the biomarker 112 .
  • Amyloid ⁇ 111 binds to biomarkers 112 present on the surface of exosomes 110 derived from brain neurons.
  • the exosome surface biomarker-specific binding agent 150 binds to the exosome-specific biomarker 112 to which amyloid ⁇ 111 is not bound.
  • biomarkers 112 present on the membrane surface of exosomes 110 derived from brain neurons and capable of binding to amyloid ⁇ 111 include those described above.
  • the detection method of this embodiment is suitable for detection by digital measurement.
  • the detection method of this embodiment is performed by digital measurement, it is preferable to use a fluidic device having a well array in which a plurality of wells are arranged.
  • the fluidic device the fluidic device described in the first embodiment is used.
  • a nucleic acid fragment-labeled exosome surface biomarker-specific binding agent is used instead of a nucleic acid fragment-labeled amyloid ⁇ -specific binding agent.
  • amyloid ⁇ 111 bound to biomarker 112 present on the surface of exosomes derived from brain neurons is detected.
  • the step of detecting amyloid ⁇ 111 bound to the biomarker 112 present on the surface of exosomes derived from brain neurons uses an amyloid ⁇ -specific binding substance 120 that specifically binds to amyloid ⁇ , to exosomes 110 derived from brain neurons This can be done by detecting bound amyloid ⁇ 111. If amyloid ⁇ 111 is bound to the biomarker 112 present on the surface of brain nerve cell-derived exosomes, the amyloid ⁇ -specific binding substance 120 can be used to capture the brain nerve cell-derived exosomes 110. Therefore, the brain nerve cell Detection of amyloid ⁇ bound to the derived exosomes 110 can be performed by capturing the exosomes 110 derived from brain neurons using the amyloid ⁇ -specific binding substance 120.
  • the reagent liquid L210 is introduced from the introduction port 222 of the fluidic device 200 and sent to the channel 230.
  • Reagent solution L210 is labeled with brain nerve cell-derived exosomes 110 and nucleic acid fragments 151, is a liquid in which biomarker-specific binding substances 150 on the exosome surface are dispersed, and also contains reagents for detecting nucleic acid fragments 151.
  • exosome surface biomarker-specific binding substance 150 is not bound by amyloid ⁇ 111, biomarkers 112 on the surface of exosomes 110 derived from brain neurons bind to
  • the reagent liquid L210 sent to the channel 230 contacts the well array 240.
  • a reagent solution L210 is accommodated inside the well 241 .
  • the number of brain nerve cell-derived exosomes 110 to be introduced into one well 241 is not particularly limited, but preferably one or less, i.e., 0 or 1 brain nerve cell-derived exosomes 110 are introduced into one well 241. be done.
  • amyloid ⁇ 111 bound to exosomes 110 derived from brain nerve cells can be detected in units of one, that is, digital measurement becomes possible.
  • the means for introducing the brain nerve cell-derived exosomes 110 into the well 241 is not particularly limited, and an appropriate means can be selected according to the selected brain nerve cell-derived exosomes 110.
  • exosomes 110 derived from brain nerve cells are sedimented in the fluidic device (within the channel) by their own weight, and a method of distributing them to the wells 241 can be mentioned.
  • the amyloid ⁇ -specific binding substance 120 which can capture brain nerve cell-derived exosomes 110, the amyloid ⁇ -specific binding substance 120 is bound to the brain nerve cell-derived exosomes 110 that are difficult to sediment under their own weight.
  • the liquid may be sent, and the amyloid ⁇ -specific binding substance 120 is immobilized in the well 241 in advance, and the exosomes 110 derived from the brain nerve cells are captured by the sent brain nerve cell-derived exosomes 110. 241 can also be improved.
  • the step of binding amyloid ⁇ -specific binding substance 120 to amyloid ⁇ 111 bound to brain nerve cell-derived exosomes 110 and capturing brain nerve cell-derived exosomes 110 can be performed at any time in the detection method of this embodiment. can. For example, this step may be performed by contacting brain nerve cell-derived exosomes 110 and amyloid ⁇ binding substance 120 in a sample tube before the step of introducing brain nerve cell-derived exosomes 110 into the well 241. Alternatively, after introducing amyloid ⁇ -specific binding substance 120 into well 241, brain nerve cell-derived exosomes 110 are introduced into well 241, and amyloid ⁇ -specific binding substance 120 and brain nerve cell-derived exosomes 110 are introduced into well 241. may be brought into contact.
  • the amyloid ⁇ -specific binding substance may be a conjugate between a solid phase and an amyloid ⁇ -specific binding substance.
  • the solid phase the amyloid ⁇ -specific binding substance, and the exosome surface biomarker-specific binding substance, the same ones as described in the first embodiment are used.
  • Methods for labeling biomarker-specific binding substances on the surface of exosomes with nucleic acid fragments include methods using cross-linking agents.
  • the nucleic acid fragment may be labeled with an amyloid- ⁇ specific binding substance via a linker molecule.
  • the linker is not particularly limited, and examples thereof include polyethylene chains, hydrocarbon chains, peptides and the like.
  • a nucleic acid fragment may be DNA or RNA. It may also contain artificial nucleic acids such as BNA and LNA.
  • nucleic acid detection reaction takes about 1 minute to 30 minutes, enabling rapid nucleic acid detection.
  • the method for immobilizing the amyloid ⁇ -specific binding substance on the particle surface is not particularly limited, and includes a method using physical adsorption, a method using chemical bonding, a method using avidin-biotin binding, and a method using protein G or protein A and an antibody.
  • a method using the combination of The physical adsorption method includes a method in which the amyloid ⁇ -specific binding substance is immobilized on the particle surface by hydrophobic interaction or electrostatic interaction.
  • Methods using chemical bonding include a method using a cross-linking agent.
  • the carboxyl group of the amyloid ⁇ -specific binding substance is reacted with a cross-linking agent to form an active ester, and then the hydroxyl group is reacted with the ester group to obtain amyloid ⁇ -specific A binding substance can be immobilized on the particle surface.
  • one well 241 is preferably configured to introduce 0 or 1 amyloid ⁇ -specific binding substance. This enables digital measurement.
  • amyloid ⁇ 111 When amyloid ⁇ 111 is bound to brain nerve cell-derived exosomes 110, the amyloid ⁇ 111 bound to the brain nerve cell-derived exosomes 110 and the amyloid ⁇ -specific binding substance 120 are bound and introduced into the well 241.
  • the brain nerve cell-derived exosomes 110, labeled with nucleic acid fragment 151, exosome surface biomarker-specific binding substance 150 is brought into contact, the brain nerve cell-derived exosomes 110, labeled with nucleic acid fragment 151 , binds to a biomarker-specific binding substance 150 on the exosome surface to form a complex 100. Formation of the complex 100 may be performed within the sample tube or within the well 241 .
  • the encapsulation step after introducing exosomes 110 derived from brain nerve cells, nucleic acid fragment 151-labeled exosome surface biomarker-specific binding substance 150, etc. into well 241 can be performed in the same manner as in the first embodiment. can.
  • nucleic acid fragment 151 is detected. Detection of the nucleic acid fragment 151 can be performed in the same manner as in the first embodiment except that the nucleic acid fragment 151 is used instead of the nucleic acid fragment 121 .
  • a reagent liquid L210 is introduced into the fluidic device 500 as shown in FIG.
  • Reagent solution L210 is a liquid in which exosomes 110 derived from brain nerve cells and biomarker-specific binding substances 150 on the surface of exosomes labeled with nucleic acid fragments 151 are dispersed, and also contains reagents for detecting nucleic acid fragments 151.
  • the concentration of the brain nerve cell-derived exosomes 110 is preferably adjusted so that one molecule or less of the brain nerve cell-derived exosomes 110 enters the wells 241 per well.
  • a sealing liquid L220 is introduced into the fluidic device 500.
  • the specific gravity of the sealing liquid L220 is greater than that of the reagent liquid L210. Therefore, the sealing liquid L220 sinks below the reagent liquid L210 that is not contained in the wells 241 among the reagent liquids L210 and contacts the well array 240 . Then, the sealing liquid L220 individually seals the plurality of wells 241 containing the reagent liquid L210 containing brain nerve cell-derived exosomes to form independent reaction spaces (micropartitions 242).
  • Well 242R is the well in which signal was detected and well 242 is the well in which no signal was detected.
  • the present invention provides a kit for detecting amyloid ⁇ 111 bound to brain nerve cell-derived exosomes 110 in blood, which is labeled with a nucleic acid fragment 121 and contains an amyloid ⁇ specific binding substance 120, Offer a kit.
  • the kit of this embodiment includes amyloid ⁇ 111 bound to exosomes 110 derived from brain neurons in blood, and an amyloid ⁇ -specific binding substance 120 that specifically binds to amyloid ⁇ labeled with a nucleic acid fragment 121, and a step of detecting the amyloid ⁇ -specific binding substance 120. can.
  • exosomes derived from brain neurons, amyloid ⁇ -specific binding substances, and nucleic acid fragments are the same as those described above.
  • the kit of this embodiment may include a well array 240 having multiple wells 241 .
  • the kit of this embodiment may further include a sealing liquid L220 for sealing the opening of the well 241.
  • FIG. The sealing liquid L220 is the same as described above.
  • kit of the present embodiment may further contain a substance that detects biomarkers 112 present on the surface of exosomes 110 derived from brain neurons.
  • a substance that detects biomarkers 112 present on the surface of exosomes 110 derived from brain neurons include the above-described exosome surface biomarker-specific binding substances.
  • kit of this embodiment may further contain a reagent for detecting the nucleic acid fragment 121.
  • reagents examples include the reagents for the ICA reaction described above, and specific examples include flap probes, invasion probes, flap endonucleases (FEN), fluorescent substrates, and the like.
  • the present invention provides a kit for detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in blood, wherein the biomarkers present on the surface of the brain nerve cell-derived exosomes labeled with a nucleic acid fragment
  • a kit is provided that includes an exosome surface biomarker-specific binding agent that specifically binds to and an amyloid- ⁇ -specific binding agent that specifically binds to amyloid- ⁇ .
  • the kit of this embodiment is a method for detecting amyloid ⁇ 111 bound to exosomes 110 derived from brain nerve cells in blood, and is labeled with a biomarker 112 present on the surface of the exosomes 110 and a nucleic acid fragment 151.
  • the step of binding the exosome surface biomarker-specific binding substance 150, exosomes 110 derived from brain neurons in the blood amyloid bound can also be said to be for use in a detection method comprising the step of detecting ⁇ 111 and the step of detecting the biomarker-specific binding substance 150 on the exosome surface.
  • the exosomes derived from brain neurons, the amyloid ⁇ -specific binding substance, the exosome surface biomarker-specific binding substance, and the nucleic acid fragment are the same as those described above.
  • the kit of this embodiment may include a well array 240 having multiple wells 241 .
  • the kit of this embodiment may further include a sealing liquid L220 for sealing the opening of the well 241.
  • FIG. The sealing liquid L220 is the same as described above.
  • kit of this embodiment may further contain a reagent for detecting the nucleic acid fragment 151.
  • reagents examples include the reagents for the ICA reaction described above, and specific examples include flap probes, invasion probes, flap endonucleases (FEN), fluorescent substrates, and the like.
  • the present invention is a method for evaluating the accumulation level of amyloid ⁇ in the brain, comprising the steps of detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain nerve cells in blood, and detecting the amount of amyloid ⁇ and Evaluating the level of amyloid ⁇ accumulation in the brain.
  • the evaluation method of this embodiment when the detected amount of amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons is high, it can be evaluated that the accumulation level of amyloid ⁇ in the brain is high. In addition, when the detected amount of amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons is low, it can be evaluated that the accumulation level of amyloid ⁇ in the brain is low.
  • the evaluation method of this embodiment can evaluate the level of amyloid ⁇ accumulation in the brain, early treatment and prevention of Alzheimer's disease, which is thought to be caused by amyloid ⁇ accumulation in the brain, becomes possible. For example, when the evaluation method of this embodiment determines that the amyloid ⁇ accumulation level in the brain is high, it becomes possible to start treatment for Alzheimer's disease.
  • the detection of amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in blood can be performed using the above-described detection method for amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in blood. Therefore, the evaluation method of this embodiment can quickly and accurately evaluate the accumulation level of amyloid ⁇ in the brain.
  • the evaluation method of the present embodiment can evaluate the accumulation level of amyloid ⁇ in the brain only by collecting blood from a subject, is not invasive like a cerebrospinal fluid test, and is also a PET imaging method. No special equipment is required.
  • Example 1 ⁇ Reagent preparation> (Exosome-containing sample derived from brain nerve cells)
  • a sample containing brain neuron-derived exosomes bound to amyloid ⁇ is a mouse neuro 2A (N2a) cell containing human amyloid ⁇ precursor protein (amyloid- ⁇ precursor protein; hereinafter also referred to as APP) isoform 751 (APP751).
  • the culture supernatant is stepwise centrifuged at 2000 x g for 10 minutes, 10000 x g for 30 minutes, and 100000 x g for 70 minutes to collect exosomes, and samples containing exosomes derived from brain neurons. and Collection of exosomes from serum was performed using MagCapture (registered trademark) exosome isolation kit PS (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • MagCapture registered trademark
  • exosome isolation kit PS manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • CTB-immobilized magnetic beads In order to immobilize Cholera Toxin subunit B (CTB, manufactured by Sigma) on magnetic beads, CTB was added to a solution of carboxyl group-modified magnetic beads (Magnosphere, LC300, manufactured by JSR) and mixed to 100 ⁇ L. Then, the mixture was reacted for 30 minutes with a rotator, and the condensing agent EDC was added and reacted for 3 hours to immobilize CTB on carboxyl magnetic beads.
  • CTB Cholera Toxin subunit B
  • CTB beads Immobilized carboxyl magnetic beads
  • DNA fragment 1 has the base sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • Flap probe 1 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • - Invasion probe 1 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:3.
  • DNA fragment 1 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 was bound to an anti-amyloid ⁇ monoclonal antibody (model "BAN50", manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to prepare a nucleic acid-labeled anti-amyloid ⁇ antibody.
  • a commercially available kit (trade name “Protein-Oligo Conjugation Kit” manufactured by Sollink) was used for conjugation of DNA fragments.
  • the nucleic acid-labeled anti-amyloid ⁇ antibody was prepared so that the amount of nucleic acid modified was 5 to 20 times that of the antibody (one antibody molecule).
  • An ICA reaction reagent was prepared as a nucleic acid detection reagent in order to detect a nucleic acid-modified antibody by the ICA reaction.
  • the reagent composition of the ICA reaction reagent in this experimental example is as follows.
  • the ICA reaction reagents in this experimental example are 0.1 ⁇ M flap probe 1 (SEQ ID NO: 2), 1 ⁇ M invasion probe 1 (SEQ ID NO: 3), 2 ⁇ M FRET Cassette (FAM) (manufactured by Hologic), and 2 ⁇ M FRET Cassette (Redmond RED).
  • CTB-immobilized magnetic beads specifically binds to ganglioside GM1 present on the membrane surface of exosomes derived from brain neurons. Therefore, exosomes derived from brain neurons can be captured using CTB-immobilized magnetic beads. Specifically, in the following manner, CTB-immobilized magnetic beads are used to capture brain nerve cell-derived exosomes, and amyloid ⁇ bound to the captured brain nerve cell-derived exosomes and an amyloid ⁇ -specific binding substance. allowed to bind and form a complex.
  • PBS adjusted to contain 6 ⁇ 10 5 CTB-immobilized carboxyl magnetic beads (CTB beads), 0, 4, 20, 100, 500, 2000, 8000, or 15000 ng of exosomes in a sample tube; Nucleic acid-modified anti-amyloid ⁇ antibodies adjusted to 1 ng/mL were mixed to a total volume of 100 ⁇ L, and reacted on a rotator at room temperature for 1 hour to form a complex.
  • the magnetic beads obtained were magnetically captured using a magnet stand, and the procedure of removing the supernatant and adding PBS containing 0.1% Tween (PBS-T) was repeated five times for washing. The supernatant was removed to obtain the complex.
  • the resulting complex was diluted after washing to prepare each reaction mixture.
  • a substrate having a large number of minute wells was made of COP (cycloolefin polymer), and a cover made of COP was attached to the substrate to make a device.
  • the total well volume per cm 2 was 0.93 ⁇ L.
  • the total number of wells used for counting was 1,000,000.
  • ⁇ Liquid delivery of reaction mixed solution > 18 ⁇ L of each of the above reaction mixtures was sent to the device and introduced into each well. Subsequently, 200 ⁇ L of FC-40 (manufactured by Sigma) was delivered as a sealing liquid to seal each well.
  • ⁇ Nucleic acid detection reaction> The above device after feeding each reaction mixture solution was set on a hot plate and reacted at 66° C. for 25 minutes. As a result, recognition of the nucleic acid fragment modifying the anti-amyloid ⁇ antibody by the flap probe and the invasion probe, cleavage of the flap probe by FEN, binding of the released flap probe fragment to the FRET Cassette, and cleavage of the FRET Cassette by FEN. progressed and a fluorescent signal was emitted from Alexa488.
  • Example 2 ⁇ Reagent preparation> (Exosome-containing sample derived from brain nerve cells) As a sample containing brain nerve cell-derived exosomes, the serum of 3-month-old or 13-month-old mice [human APP Sw, Ind transgenic mice (J20, Jackson Laboratory)] into which a human familial mutant APP gene was introduced was used. Collection of exosomes from serum was performed using MagCapture (registered trademark) exosome isolation kit PS (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). PBS was used as a control containing no exosomes.
  • MagCapture registered trademark
  • exosome isolation kit PS manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • CTB-immobilized magnetic beads ⁇ Reaction of exosomes, CTB-immobilized magnetic beads and nucleic acid-modified anti-amyloid ⁇ antibody>
  • CTB beads CTB-immobilized carboxyl magnetic beads
  • 50, 100, 250 ⁇ L of exosomes collected from each mouse serum or PBS nucleic acid-modified anti-amyloid adjusted to 0.1 ng/mL
  • the ⁇ antibody was mixed so that the total amount was 100 ⁇ L, and reacted on a rotator at room temperature for 1 hour to form a complex.
  • the magnetic beads obtained were magnetically captured using a magnet stand, and the procedure of removing the supernatant and adding PBS containing 0.1% Tween (PBS-T) was repeated five times for washing. The supernatant was removed to obtain the complex. The resulting complex was washed and diluted with PBS to prepare a reaction mixture.
  • PBS-T PBS containing 0.1% Tween
  • ⁇ Nucleic acid detection reaction> The above device after feeding each reaction mixture solution was set on a hot plate and reacted at 66° C. for 25 minutes. As a result, recognition of the nucleic acid fragment modifying the anti-amyloid ⁇ antibody by the flap probe and the invasion probe, cleavage of the flap probe by FEN, binding of the released flap probe fragment to the FRET Cassette, and cleavage of the FRET Cassette by FEN. progressed and a fluorescent signal was emitted from Alexa488.
  • Example 3 (Detection of amyloid ⁇ in mouse brain tissue)
  • the brain tissue of the 3-month-old or 13-month-old human familial mutant APP gene-introduced mouse used in Experimental Example 2 was excised, the left hemisphere was separated, dissolved in 5 M guanidine hydrochloride, and then subjected to A ⁇ ELISA kit (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Co.) was used to measure the concentrations of amyloid ⁇ 40 and amyloid ⁇ 42 in the mouse brain tissue.
  • brain tissue was excised, and the right hemisphere was immersed and fixed overnight in 4% paraformaldehyde to prepare a sagittal paraffin section.
  • FIG. 13 shows the results of measurement of amyloid ⁇ 40 and amyloid ⁇ 42 concentrations in mouse brain tissue
  • FIG. 14 shows the results of immunohistochemical staining of amyloid ⁇ in the mouse brain tissue.
  • amyloid ⁇ was not accumulated in the brain tissue of 3-month-old human familial mutant APP gene-transduced mice, but the brain tissue of 13-month-old human familial mutant APP gene-transfected mice did not accumulate. Amyloid ⁇ was accumulated in the tissue.
  • amyloid ⁇ was not detected in the exosomes in the serum of 3-month-old human familial mutant APP transgenic mice in which amyloid ⁇ had not accumulated in brain tissue. It was revealed that amyloid ⁇ was detected in exosomes in the serum of 13-month-old human familial mutant APP gene-introduced mice in which amyloid ⁇ had accumulated in brain tissue. This result indicates that the accumulation level of amyloid ⁇ in the brain can be evaluated by detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons in the blood.
  • the present invention it is possible to provide a technique for rapidly and highly sensitively detecting amyloid ⁇ bound to exosomes derived from brain neurons and a technique for evaluating the accumulation level of amyloid ⁇ in the brain.
  • 100... complex 110... brain neuron-derived exosomes, 111... amyloid ⁇ , 112... biomarkers, 120... amyloid ⁇ -specific binding substances, 121, 151... nucleic acid fragments, 130: invasion probes, 150... exosome surface bio Marker-specific binding substance 200, 500 Fluid device 210 Substrate 220 Lid member 221 Convex part 222 Introduction port 223 Discharge port 230 Flow path 240 Well array 241 Well , 242 ... sealed well (microcompartment), L210 ... reagent solution, L220 ... sealing liquid, 242R ... well in which the signal was detected, 510 ... wall member, 810 ... flap probe, 811 ... flap site (nucleic acid fragment ), 821... second flap site (nucleic acid fragment), 820, 820'... nucleic acid fragment, F... fluorescent substance, Q... quenching substance.

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Abstract

血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法であって、前記血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβと、核酸断片で標識された、アミロイドβに特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質と、を結合させる工程と、前記アミロイドβ特異的結合物質を検出する工程と、を備える、検出方法、及び、脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する方法であって、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを検出する工程と、前記アミロイドβの検出量により、脳内のアミロイドβ蓄積レベルを評価する工程と、を備える、評価方法。

Description

血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出用キット、及び脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する方法
　本発明は、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出用キット、及び脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する方法に関する。
　本願は、２０２１年１１月４日に、日本に出願された特願２０２１－１８０６１２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　アルツハイマー病は、最も患者数の多い認知症であり、認知症全体に占めるアルツハイマー病の割合は５０～７５％であり、現在、治療法の開発が進められている。
　アルツハイマー病は、脳神経細胞外でアミロイドβが重合体を形成して脳内に蓄積し、脳に沈着することによって老人斑が形成され、続いて、脳神経細胞内で、タウと呼ばれる蛋白質が過剰リン酸化してフィラメントを形成して脳に沈着することにより、神経原線維が形成され、神経細胞死やシナプス機能障害等の神経障害を引き起こすことにより、神経が変性することが原因と考えられている。
　アルツハイマー病の治療又は予防には、上記脳内でのタウ依存性の神経障害が引き起こされる前の、アミロイドβの蓄積時に治療又は予防を行うことが有効である。そのためには、脳内のアミロイドβを測定できる方法が必要であるが、現在アミロイドβの測定法として用いられている髄液検査は侵襲性が高く、ＰＥＴイメージング法や、血中のアミロイドβを質量分析により検出する方法は特別な設備が必要である。
　エクソソームは、細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）の一種で、細胞から分泌される直径４０～１５０ｎｍ程度の膜小胞である。近年、エクソソームは、離れた細胞や組織に情報を伝達するための役割を担っている可能性が指摘されている。エクソソームには様々なタンパク質や脂質、核酸が含まれており、別の細胞に運搬されることによって機能的変化や生理的変化を引き起こすと考えられている。非特許文献１には、神経細胞のエクソソームの表面に存在するガングリオシドＧＭ１にアミロイドβが結合し、エクソソームによりアミロイドβが運搬され、脳に蓄積しプラークを形成することが報告されている。また、非特許文献２には、アルツハイマー患者の血漿から単離したエクソソームにアミロイドβが検出されたことが報告されている。
　一方、生体試料中の標的分子を定量的に検出することにより、疾患の早期発見や投薬の効果予測が行われている。ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の定量は、リアルタイムＰＣＲ法等により行われている。
　近年、疾患をより早期に発見する等の目的で、標的分子をより精度よく検出するニーズが高まっている。標的分子を精度よく検出する手法として、例えば、非特許文献３には、多数の微小区画内で酵素反応を行い、蛍光シグナルを検出する技術が記載されている。この手法は、デジタル計測と呼ばれている。
　デジタル計測では、試料溶液を極めて多数の微小溶液に分割する。そして、各微小溶液からの信号を２値化し、標的分子が存在するか否かのみを判別して、標的分子数を計測する。デジタル計測によれば、従来のリアルタイムＰＣＲ法等と比較して、検出感度及び定量性を格段に向上させることができる。
　デジタル計測の１種であるデジタルＰＣＲでは、微小区画内の１つの微小液滴に存在する鋳型となる核酸が０個ないし１個になるように、ＰＣＲ反応試薬と核酸との混合物が希釈されている。デジタルＰＣＲでは、核酸増幅の感度を高めるために、また多数の微小液滴に対して同時に核酸増幅を行うために、各微小液滴の体積は小さい方が好ましい。例えば、非特許文献３には、各ウェルの容積が数ナノリットルとなるように形成されたマイクロサイズの液滴を用いた方法が開示されている。
　また、デジタル計測の別の手法として、デジタルＩｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）がある。特許文献１には、ＰＣＲ反応によりＤＮＡサンプルを増幅させ、変性させたＰＣＲ産物を、マイクロウェルを有するデバイスに導入し、検出時にはＤＮＡを増幅せずにインベーダー（登録商標）法によってＤＮＡを検出する手法が開示されている。
国際公開第２０１５／１１５６３５号
Lawrence Rajendran et al., Alzheimer’s disease β-amyloid peptides are released in association with exosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006 Jul 25;103(30):11172-11177. Massimo S. Fiandaca et ai., Identification of preclinical Alzheimer’s disease by a profile of pathogenic proteins in neurally derived blood exosomes: A case-control study. Alzheimer’s & Dementia 11(2015)600-607 Olmedillas-Lopez S., et al., Current and Emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology. Mol Diagn Ther. 2017 Oct;21(5):493-510
　非特許文献１では、培養神経細胞から放出されるエクソソームに結合したアミロイドβを検出しているが、この検出方法は、培養神経細胞から放出されるエクソソームを単離し、エクソソームに結合したアミロイドβを免疫染色して電子顕微鏡を用いて検出する方法であり、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを迅速に検出する方法ではない。非特許文献２でも、血漿から単離したエクソソームにおけるアミロイドβを検出しており、迅速な検出方法ではない。また、血液中のエクソソームに結合したアミロイドβを検出することにより、脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価することは知られていない。
　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを迅速且つ高感度に検出する技術、及び脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する技術を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法であって、前記血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβと、核酸断片で標識された、アミロイドβに特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質と、を結合させる工程と、前記アミロイドβ特異的結合物質を検出する工程と、を備える、検出方法。
［２］さらに、前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーを検出する工程を備える、［１］に記載の検出方法。
［３］血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法であって、前記エクソソーム表面上に存在するバイオマーカーと、核酸断片で標識された、前記エクソソーム表面上に存在するバイオマーカーに特異的に結合する、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質と、を結合させる工程と、前記血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを検出する工程と、前記エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を検出する工程と、を備える、検出方法。
［４］前記アミロイドβが、前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーに結合している、［１］～［３］のいずれか一項に記載の検出方法。
［５］前記バイオマーカー又は前記アミロイドβを検出する工程が、前記バイオマーカー又は前記アミロイドβに特異的に結合する物質を用いて、前記脳神経細胞由来のエクソソームを捕捉することにより行われる、［２］～［４］のいずれか一項に記載の検出方法。
［６］前記アミロイドβ特異的結合物質が、アミロイドβに特異的に結合する抗体又は抗体断片である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の検出方法。
［７］前記バイオマーカーが、ガングリオシドＧＭ１である、［２］～［６］のいずれか一項に記載の検出方法。
［８］前記アミロイドβ特異的結合物質を検出する工程が、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙにより行われる、［１］～［７］のいずれか一項に記載の検出方法。
［９］血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出用キットであって、核酸断片で標識された、アミロイドβに特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質を含む、キット。
［１０］前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーを検出する物質を更に含む、［９］に記載のキット。
［１１］前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーを検出する物質が、前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーに特異的に結合する物質である、［１０］に記載のキット。
［１２］血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出用キットであって、核酸断片で標識された、前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーに特異的に結合する、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質と、アミロイドβに特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質と、を含む、キット。
［１３］前記アミロイドβ特異的結合物質が、アミロイドβに特異的に結合する抗体又は抗体断片である、［９］～［１２］いずれか一項に記載のキット。
［１４］前記バイオマーカーが、ガングリオシドＧＭ１である、［１０］～［１３］のいずれか一項に記載のキット。
［１５］脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する方法であって、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを検出する工程と、前記アミロイドβの検出量により、脳内のアミロイドβ蓄積レベルを評価する工程と、を備える、評価方法。
［１６］前記脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出が、［１］～［８］のいずれか一項に記載の検出方法により行われる、［１５］に記載の評価方法。
　本発明によれば、脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを迅速且つ高感度に検出する技術、及び脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する技術を提供することができる。
第１実施形態の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法を説明する模式図である。 流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）法の一例を説明する模式図である。 第２実施形態の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法を説明する模式図である。 実験例１における蛍光画像を示した図である。 実験例１における蛍光強度を示したグラフである。左図がＬｉｎｅａｒ　ｓｃａｌｅの蛍光強度、右図がＬｏｇ　ｓｃａｌｅの蛍光強度を示す。 実験例２における、３週齢又は１３週齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスのエクソソームの蛍光強度を示したグラフである。「コントロール」は、エクソソームの代わりに緩衝液（ＰＢＳ）を用いた場合を示す。 実験例３におけるヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウス脳組織中のアミロイドβ４０（Ａβ４０）とアミロイドβ４２（Ａβ４２）の濃度を示したグラフである。左図がアミロイドβ４０、右図がアミロイドβ４２の濃度を示す。 実験例３における３週齢又は１３週齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウス脳組織中のアミロイドβの免疫組織染色を示す図である。左図が、３週齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウス脳組織中のアミロイドβの免疫組織染色、右図が、１３週齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウス脳組織中のアミロイドβの免疫組織染色を示す。 比較例１における３週齢又は１３週齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウス血清中の遊離のアミロイドβ４０（Ａβ４０）又はアミロイドβ４２（Ａβ４２）の濃度を示すグラフである。左図がアミロイドβ４０、右図がアミロイドβ４２の濃度を示す。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［アミロイドβの検出方法］
＜第１実施形態＞
　本発明は、一実施形態において、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法であって、前記血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβに、核酸断片で標識された、アミロイドβに特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質と、を結合させる工程と、前記アミロイドβ特異的結合物質を検出する工程と、を備える、検出方法を提供する。以下、本実施形態に係る検出方法について説明する。
　図１は、本実施形態の検出方法を説明する模式図である。図１に示すように、本実施形態の検出方法では、まず、血液中の脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１と、核酸断片１２１で標識された、アミロイドβ１１１に特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質１２０と、を結合させる。アミロイドβ１１１は、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面上に存在するバイオマーカー１１２に結合している。血液としては、全血、血清、血漿等が挙げられる。
　エクソソームは、ほとんどの細胞で分泌される直径４０ｎｍ～１５０ｎｍ程度の膜小胞である。
　生体では唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水等の体液中で観察され、培養細胞からも分泌される。近年、エクソソームは、離れた細胞や組織に情報を伝達するための役割を担っている可能性が指摘されている。エクソソームには様々なタンパク質や脂質、核酸が含まれており、別の細胞に運搬されることによって機能的変化や生理的変化を引き起こすと考えられている。その具体例としては、感染性病原体や腫瘍に対する適応免疫応答の媒介、組織修復、神経伝達や病原性タンパク質の運搬等の役割を持つことが示唆されている。
　本実施形態の検出方法においては、エクソソームは、脳神経細胞由来のエクソソームである。アルツハイマー病の原因因子と考えられているアミロイドβは、脳神経細胞由来のエクソソームに結合して運搬され、アルツハイマー病患者の脳に蓄積しプラークを形成することが知られている。そのため、脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβに特異的に結合する物質を利用することにより、脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを検出することが可能である。
　アミロイドβ１１１は、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の膜表面上に存在するバイオマーカー１１２に結合することにより、エクソソーム１１０に結合している。アミロイドβ１１１が結合可能な、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の膜表面上に存在するバイオマーカー１１２としては、ガングリオシドＧＭ１等が挙げられる。
　続いて、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１に結合した、核酸断片１２１で標識された、アミロイドβ特異的結合物質１２０を検出する。本実施形態の検出方法は、デジタル計測による検出に適している、本実施形態の検出方法をデジタル計測で行う場合、複数のウェルが配置されたウェルアレイを有する流体デバイスを用いることが好ましい。
（流体デバイス）
　図２は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。図２に示すように、流体デバイス２００は、基板２１０と、基板２１０に対向して配置される蓋部材２２０とを備えている。蓋部材２２０は凸部２２１を有しており、凸部２２１の先端は基板２１０に接している。流体デバイス２００においては、ウェルアレイ２４０は基板２１０の一方面上に基板２１０と一体成型されており、蓋部材２２０と対向している。ウェルアレイ２４０は複数のウェル２４１を有する。蓋部材２２０は、基板２１０に溶着又は接着されていてもよい。
　ウェル２４１は、基板２１０の表面に開口している。ウェル２４１の形状、寸法、及び配置は特に限定されないが、１つのウェル２４１に１個の脳神経細胞由来のエクソソームが導入されることが好ましい。ウェル２４１は容積が小さい微小ウェルであることが好ましい。例えば、１つのウェル２４１の容積は１０ｆＬ～１００ｐＬ程度であってもよい。流体デバイス２００では、同形同大の複数のウェル２４１がウェルアレイ２４０を構成している。同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。
　ウェル２４１の直径は例えば１～１０μｍ程度であってもよく、ウェル２４１の深さは例えば１～１０μｍ程度であってもよい。また、ウェル２４１の配置は特に制限されず、例えば三角格子状に整列していてもよいし、正方格子状も整列していてもよいし、ランダムに配置されていてもよい。
　流体デバイス２００では、凸部２２１の存在により、ウェルアレイ２４０と蓋部材２２０との間に空間が形成されている。当該空間は流路２３０を構成している。流路２３０は、脳神経細胞由来のエクソソーム、核酸断片で標識された、アミロイドβ特異的結合物質等が分散した液体及び後述する封止液を送液するための経路として機能する。流路２３０の形状、構造、容量等は特に限定されないが、流路２３０の高さ（基板２１０の表面と、蓋部材２２０の基板２１０と対向する面との間の距離）は、例えば５００μｍ以下であってもよいし、例えば３００μｍ以下であってもよいし、例えば２００μｍ以下であってもよいし、例えば１００μｍ以下であってもよい。
　凸部２２１は蓋部材２２０と一体に成形されていてもよい。蓋部材２２０は、例えば、熱可塑性樹脂の流動体を、成形型を用いて成形することで、凸部２２１を有する板状に成形することができる。また、蓋部材２２０には試薬の導入ポート２２２及び排出ポート２２３が形成されていてもよい。
　蓋部材２２０が凸部２２１を有する場合、基板２１０のウェル２４１が開口する面に凸部２２１が接するように、蓋部材２２０と基板２１０とが重ねられる。この結果、蓋部材２２０と基板２１０との間の空間が流路２３０となる。蓋部材２２０と基板２１０とは、レーザー溶着等により溶着されてもよい。
（流体デバイスの変形例１）
　本実施形態の検出方法に用いられる流体デバイスは上述した流体デバイス２００に限られない。図５は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。図５に示すように、流体デバイス５００は、基板２１０と、壁部材５１０とを備えている。流体デバイス５００においては、ウェルアレイ２４０は基板２１０の一方面上に基板２１０と一体成形されている。ウェルアレイ２４０は複数のウェル２４１を有する。
　流体デバイス５００は、蓋部材２２０を有していない点で上述した流体デバイス２００と主に異なっている。このため、流体デバイス５００は流路を有していない。
（流体デバイスの変形例２）
　上述した流体デバイス２００においては、蓋部材２２０と凸部２２１は一体成形されていた。しかしながら、蓋部材２２０と凸部２２１は別体として成形されていてもよい。
　また、上述した流体デバイス２００及び流体デバイス５００においては、ウェルアレイ２４０は基板２１０の一方面上に基板２１０と一体成形されていた。しかしながら、ウェルアレイは、基板２１０と一体成形されていなくてもよい。例えば、流体デバイスとは別体として成形されたウェルアレイ２４０を、流体デバイスの基板２１０上に配置してもよい。あるいは、基板２１０の表面に樹脂層を積層し、エッチング等により、樹脂層にウェルアレイを形成してもよい。
（流体デバイスの材質）
　基板２１０は、例えば樹脂を用いて形成される。樹脂の種類は特に限定されないが、試薬及び封止液に対して耐性のある樹脂であることが好ましい。また、検出するシグナルが蛍光である場合には、自家蛍光が少ない樹脂であることが好ましい。例えば、シクロオレフィンポリマーや、シクロオレフィンコポリマー、シリコン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、アモルファスフッ素樹脂等が挙げられるがこれらに限定されない。
　基板２１０の板厚方向の一方面に複数のウェル２４１が形成されていてもよい。樹脂を用いたウェルの形成方法としては、射出成形、熱インプリント、光インプリント等が挙げられる。
　あるいは、例えば、基板２１０の上にフッ素樹脂を積層し、当該フッ素樹脂をエッチング等により加工してウェルアレイを形成してもよい。フッ素樹脂としては、例えばＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子）等を用いることができる。
　また、流体デバイスが蓋部材２２０を有する場合、蓋部材２２０の材質は、自家蛍光の少ない樹脂であることが好ましく、例えば、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー等の熱可塑性樹脂であってもよい。
　また、蓋部材２２０は、シグナルを蛍光観察する際に検出される波長の近傍の波長の光を透過しない材料から形成されていてもよく、完全に光を透過しない材料から形成されていてもよい。例えば、蓋部材２２０は、カーボンや金属粒子等を添加した熱可塑性樹脂から形成されていてもよい。
（本実施形態の検出方法）
　続いて、場合により図２～４を参照しながら、流体デバイス２００を用いた場合を例に、本実施形態の検出方法について説明する。本実施形態の検出方法は、血液中の脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１の検出方法であって、血液中の脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に、核酸断片１２１で標識された、アミロイドβに特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質１２０と、を結合させる工程と、前記アミロイドβ特異的結合物質１２０を検出する工程と、を備える、検出方法である。本実施形態の方法によれば、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１を検出することができる。
　本実施形態の検出方法は、さらに、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面上に存在するバイオマーカー１１２を検出する工程を備えていてもよい。脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面上に存在するバイオマーカー１１２を検出する工程は、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面上に存在するバイオマーカー１１２を検出する物質を用いて、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面に存在するバイオマーカー１１２を検出することにより行うことができる。脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面にバイオマーカー１１２が存在すれば、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面上に存在するバイオマーカー１１２に特異的に結合する物質（エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質）を用いて、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を捕捉することができるため、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面に存在するバイオマーカー１１２の検出は、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を用いて、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を捕捉することにより行うことができる。
《導入工程》
　まず、図２に示すように、流体デバイス２００の導入ポート２２２から試薬液Ｌ２１０を導入し、流路２３０に送液する。試薬液Ｌ２１０は、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０及び核酸断片１２１で標識された、アミロイドβ特異的結合物質１２０が分散した液体であり、核酸断片１２１を検出するための試薬も含む。脳神経細胞由来のエクソソーム１１０にアミロイドβ１１１が結合している場合は、核酸断片１２１で標識された、アミロイドβ特異的結合物質１２０が、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合しているアミロイドβ１１１に結合する。
　流路２３０に送液された試薬液Ｌ２１０は、ウェルアレイ２４０に接触する。そして、ウェル２４１の内部に試薬液Ｌ２１０が収容される。この結果、ウェル２４１に脳神経細胞由来のエクソソーム１１０、核酸断片１２１で標識された、アミロイドβ特異的結合物質１２０、及び、核酸断片１２１を検出するための試薬が導入される。
　１つのウェル２４１に導入される脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の数は特に制限されないが、好ましくは、１つのウェル２４１に１つ以下、すなわち、０個又は１個の脳神経細胞由来のエクソソーム１１０が導入される。これにより、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１の検出を１個単位で行うことができ、すなわちデジタル計測が可能となる。また、ウェルアレイの全てのウェルに脳神経細胞由来のエクソソーム１２０が導入される必要はない。
　脳神経細胞由来のエクソソーム１１０をウェル２４１に導入する手段は、特に制限されず、選択した脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に応じた適切な手段を選択することができる。例えば、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を自重により流体デバイス内（流路内）で沈降させ、ウェル２４１に分配する方法が挙げられる。あるいは、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を捕捉することができる、上記エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を利用し、自重で沈降しにくい脳神経細胞由来のエクソソーム１１０にエクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を結合させて送液してもよく、予めウェル２４１に、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を固定化させておき、送液された脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を捕捉させることで、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０のウェル２４１への導入効率を向上させることもできる。
　エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面上に存在するバイオマーカー１１２に結合させて、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を捕捉する工程は、本実施形態の検出方法の任意の時点で行うことができる。例えば、この工程は、ウェル２４１に脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を導入する工程の前に、サンプルチューブ内で脳神経細胞由来のエクソソーム１１０とエクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を接触させることにより行ってもよい。あるいは、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質をウェル２４１に導入した後に、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０をウェル２４１に導入し、ウェル２４１内でエクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質と脳神経細胞由来のエクソソーム１１０とを接触させてもよい。
　エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質は、固相とエクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質との結合体であってもよい。
　固相としては、粒子、膜、基板等が挙げられる。また、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質は１種類でもよいし、２種類以上であってもよい。例えば３種類であってもよいし、４種類であってもよいし、５種類以上であってもよい。
　粒子としては、特に制限されず、ポリマー粒子、磁気粒子、ガラス粒子等が挙げられる。粒子は、非特異的な吸着を避けるための表面処理が施された粒子が好ましい。また、特異的結合物質を固定化するために、表面にカルボキシル基等の官能基を有する粒子が好ましい。より具体的には、ＪＳＲ社製の商品名「Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＬＣ３００」等を用いることができる。
　アミロイドβ特異的結合物質１２０及びエクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、２量化体Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ＣＤＲを含むペプチド等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
　エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質としては、例えば、脳神経細胞由来のエクソソーム表面上には、バイオマーカーとして、ガングリオシドＧＭ１が存在するため、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質は、ガングリオシドＧＭ１に特異的に結合する抗体、抗体断片、アプタマー、蛋白質等であってもよい。ガングリオシドＧＭ１に特異的に結合する蛋白質としては、コレラ毒素サブユニットＢ（以下、ＣＴＢとも称する）等が挙げられる。
　核酸断片でアミロイドβ特異的結合物質を標識する方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。核酸断片は、リンカーである分子を介してアミロイドβ特異的結合物質に標識されてもよい。リンカーとしては、特に限定されず、例えば、ポエリエチレン鎖、炭化水素鎖、ペプチド等が挙げられる。核酸断片は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。また、ＢＮＡ、ＬＮＡ等の人工核酸を含んでいてもよい。
　また、例えば、アミロイドβ特異的結合物質として抗体分子を用い、抗体分子に核酸断片を標識する場合、核酸断片は比較的分子が小さいことから、抗体１分子あたり例えば数個～数十個の核酸断片を標識することができる。抗体１分子あたりの核酸断片の数を増加させることにより、アミロイドβ特異的結合物質を検出するのに要する時間を更に短縮することができる。また、抗体分子に核酸断片を標識する場合、抗体１分子あたり数個～数百個の核酸断片を標識してもよい。
　本実施形態によれば、例えば、核酸検出反応(例えばＩＣＡ反応)に係る時間が１分～３０分間程度であり、迅速な核酸検出が可能となる。
　エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法としては、特に制限されず、物理吸着による方法、化学結合による方法、アビジン－ビオチンの結合を利用する方法、プロテインＧ又はプロテインＡと抗体との結合を利用する方法等が挙げられる。物理吸着による方法としては、疎水的相互作用、静電的相互作用により、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法が挙げられる。化学結合による方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。例えば、粒子の表面が水酸基を有する場合、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質が有するカルボキシル基に架橋剤を反応させて活性エステル化した後、水酸基とこのエステル基とを反応させることにより、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を粒子表面に固定化させることができる。また、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質による脳神経細胞由来のエクソソームの認識能を阻害しないよう、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質と粒子表面との間にスペーサーを設けることが好ましい。
　上述したように、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を用いて脳神経細胞由来のエクソソーム１１０をウェル２４１に導入する場合、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１個に脳神経細胞由来のエクソソーム１１０が０個又は１個検出される条件でエクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質と脳神経細胞由来のエクソソーム１１０との結合体を形成することが好ましい。さらに、１つのウェル２４１には、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質が０個又は１個導入されるように構成されることが好ましい。これによりデジタル計測が可能となる。
　脳神経細胞由来のエクソソーム１１０と、核酸断片１２１で標識された、アミロイドβ特異的結合物質１２０とを接触させると、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０にアミロイドβ１１１が結合している場合は、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１と、核酸断片１２１で標識された、アミロイドβ特異的結合物質１２０とが結合し、複合体１００が形成される。複合体１００の形成は、サンプルチューブ内で行われてもよいし、ウェル２４１内で行われてもよい。
《封入工程》
　ウェル２４１に、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０、核酸断片１２１で標識された、アミロイドβ特異的結合物質１２０等を導入した後、ウェル２４１の開口部を封止する工程を実施してもよい。
　ウェル２４１の開口部を封止する方法は、あるウェル２４１の内部に収容された液体が、別のウェル２４１の内部に収容された液体と互いに混合しない状態にすることができる限り特に限定されず、例えば、封止液でウェル２４１の開口部を覆うことにより封止してもよい。あるいは、ウェル２４１の開口部にガラス板等の板状部材を積層することにより封止してもよい。
　例えば、図３に示すように、蓋部材２２０の導入ポート２２２から、基板２１０と蓋部材２２０との間の流路２３０に、封止液Ｌ２２０を送液する。流路２３０に送液された封止液Ｌ２２０は、ウェルアレイ２４０に接触する。そして、封止液Ｌ２２０は、流路２３０に送液された試薬液Ｌ２１０のうち、ウェル２４１に収容されていない試薬液Ｌ２１０を押し流して置換する。これにより、封止液Ｌ２２０が、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を含む試薬液Ｌ２１０を収容した複数のウェル２４１をそれぞれ個別に封止し、ウェル２４１は独立した反応空間（微小区画２４２）となる。流路２３０が封止液Ｌ２２０で満たされると、余分な封止液Ｌ２２０は排出ポート２２３から排出される。図４は、ウェルアレイ２４０のウェル２４１の全てが封止液Ｌ２２０で封止され、封止されたウェル（微小区画）２４２が形成された状態を示す。
　また、試薬液Ｌ２１０に脂質を溶解させておき、封止液Ｌ２２０を流路２３０に送液した後、再び脂質を含む液体を送液することにより、ウェル２４１の開口部に脂質二重膜を形成し、当該脂質二重膜によって複数のウェル２４１をそれぞれ個別に封止し、封止されたウェル２４２を形成することもできる。脂質二重膜を形成する脂質としては、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、これらの混合物等が挙げられるがこれらに限定されない。
　上述したいずれかの封止方法により封止されたウェル２４２は、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合していないアミロイドβ特異的結合物質１２０を含んでいてもよい。
　封止液は、複数のウェル２４１に導入された液体同士を互いに混合しないように個別に封止して液滴（微小液滴）を形成することができる液であり、好ましくは油性溶液であり、より好ましくはオイルである。オイルとしては、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイル又はこれらの混合物等を使用することができる。より具体的には、シグマ社製の商品名「ＦＣ－４０」等を用いることができる。ＦＣ－４０（ＣＡＳ番号：８６５０８－４２－１）はフッ素化脂肪族化合物であり、２５℃における比重が１．８５ｇ／ｍＬである。
《検出工程》
　続いて、核酸断片１２１を検出する。核酸断片１２１の検出は、シグナル増幅反応を用いて行うことが好ましい。シグナル増幅反応としては、例えば、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）が挙げられる。
　ＩＣＡ反応は、（１）核酸同士の相補的結合と、（２）酵素による三重鎖構造の認識及び切断との２つの反応のサイクルによってシグナル増幅が進行するという原理に関連する。
　ＩＣＡ反応は、夾雑物による反応サイクル阻害の影響が小さい。したがって、ＩＣＡ反応を用いることにより、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を精度よく検出することができる。シグナル増幅反応にＩＣＡ反応を用いる場合、試薬液Ｌ２１０（脳神経細胞由来のエクソソーム１１０及びアミロイドβ特異的結合物質１２０を含む液体）は、ＩＣＡ反応に必要な反応試薬を含む。
　ＩＣＡ反応に必要な反応試薬としては、フラッププローブ、侵入プローブ、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）、蛍光基質等のＩＣＡ反応試薬が挙げられる。フラッププローブ及び侵入プローブは、核酸断片１２１にハイブリダイズして核酸断片１２１とフラップ構造を形成するように設計された核酸断片である。
　図８は、ＩＣＡ法の一例を説明する模式図である。まず、核酸断片１２１にフラッププローブと侵入プローブをハイブリダイズさせる。図８の例では、フラッププローブ８１０及び侵入プローブ１３０は、核酸断片１２１にハイブリダイズする。その結果、第１フラップ部位８１１が形成される。
　続いて、第１フラップ部位８１１にＦＥＮを反応させると、第１フラップ部位８１１が切断され、核酸断片８１１が生成される。続いて、核酸断片８１１は、蛍光基質（核酸断片８２０）にハイブリダイズして第２フラップ部位８２１を形成する。
　図８の例では、核酸断片８２０の５’末端には蛍光物質Ｆが結合されており、核酸断片８２０の５’末端から数塩基３’側に消光物質Ｑが結合されている。続いて、第２フラップ部位８２１にＦＥＮを反応させると、第２フラップ部位８２１が切断され、核酸断片８２１が生成される。その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れ、蛍光シグナルを発生する。この蛍光シグナルを検出することにより、核酸断片１２１を検出することができる。
　試薬液Ｌ２１０としては、流体デバイスを用いて行われる生化学分析において使用される一般的な液体を用いることができ、好ましくは水性溶液である。また、試薬液Ｌ２１０に界面活性剤等を含ませることにより、ウェル内に液体を封入しやすくしてもよい。
　核酸断片１２１の検出にＩＣＡ反応を用いる場合、核酸断片１２１が存在する場合には、等温反応による酵素反応によって、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから遊離し、励起光に対応して所定の蛍光シグナルを発する。
　核酸断片１２１の検出は、検出するシグナルの種類に応じて公知の適切な方法を選択することができる。例えば、蛍光シグナルを観察する場合は、蛍光物質に対応する励起光をウェル２４２に照射し、蛍光物質が発する蛍光を観察する。例えば、図４に示すように、封止されたウェル２４２内で所定の反応を行い、発生したシグナルを観察する。ウェル２４２Ｒはシグナルが検出されたウェルであり、ウェル２４２はシグナルが検出されなかったウェルである。
　続いて、図５～図７を参照しながら、流体デバイス５００を用いた場合を例に、本実施形態の方法について説明する。
　まず、図５に示すように、流体デバイス５００の内部に試薬液Ｌ２１０を導入する。試薬液Ｌ２１０は、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０、及び、核酸断片１２１で標識された、アミロイドβ特異的結合物質１２０が分散した液体であり、核酸断片１２１を検出するための試薬も含む。試薬液Ｌ２１０において、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の濃度は、ウェル２４１に１ウェルあたり１分子以下の脳神経細胞由来のエクソソーム１１０が入る濃度に調整されていることが好ましい。
　続いて、図６に示すように、流体デバイス５００の内部に封止液Ｌ２２０を導入する。封止液Ｌ２２０の比重は試薬液Ｌ２１０よりも大きい。このため、封止液Ｌ２２０は、試薬液Ｌ２１０のうち、ウェル２４１に収容されていない試薬液Ｌ２１０よりも下に沈み、ウェルアレイ２４０に接する。そして、封止液Ｌ２２０は、脳神経細胞由来のエクソソームを含む試薬液Ｌ２１０を収容した複数のウェル２４１をそれぞれ個別に封止し、独立した反応空間（微小区画２４２）となる。
　続いて、図７に示すように、ウェル２４２内で所定の反応を行い、発生したシグナルを観察する。ウェル２４２Ｒはシグナルが検出されたウェルであり、ウェル２４２はシグナルが検出されなかったウェルである。
＜第２実施形態＞
　本発明は、一実施形態において、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法であって、前記エクソソーム表面上に存在するバイオマーカーと、核酸断片で標識された、前記エクソソーム表面上に存在するバイオマーカーに特異的に結合する物質（エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質）と、を結合させる工程と、前記血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを検出する工程と、前記エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を検出する工程と、を備える、検出方法を提供する。以下、本実施形態に係る検出方法について説明する。
　図９は、本実施形態の検出方法を説明する模式図である。図９に示すように、本実施形態の検出方法では、まず、脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカー１１２と、核酸断片１５１で標識された、脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカー１１２に特異的に結合するエクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１５０と、を結合させる。アミロイドβ１１１は、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面上に存在するバイオマーカー１１２に結合している。前記エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１５０は、アミロイドβ１１１が結合していない、前記エクソソーム特異的バイオマーカー１１２に結合する。
　アミロイドβ１１１が結合可能な、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の膜表面上に存在するバイオマーカー１１２としては、前記したものが挙げられる。
　続いて、神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカー１１２に結合したエクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１５０を検出する。本実施形態の検出方法は、デジタル計測による検出に適している、本実施形態の検出方法をデジタル計測で行う場合、複数のウェルが配置されたウェルアレイを有する流体デバイスを用いることが好ましい。流体デバイスとしては、前記第１実施形態に記載した流体デバイスが用いられる。ただし、核酸断片で標識された、アミロイドβ特異的結合物質の代わりに、核酸断片で標識された、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質が用いられる。
　次に、脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカー１１２に結合したアミロイドβ１１１を検出する。脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカー１１２に結合したアミロイドβ１１１を検出する工程は、アミロイドβに特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質１２０を用いて、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１を検出することにより行うことができる。脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカー１１２にアミロイドβ１１１が結合していれば、アミロイドβ特異的結合物質１２０を用いて、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を捕捉することができるため、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβの検出は、アミロイドβ特異的結合物質１２０を用いて、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を捕捉することにより行うことができる。
《導入工程》
　まず、図２に示すように、流体デバイス２００の導入ポート２２２から試薬液Ｌ２１０を導入し、流路２３０に送液する。試薬液Ｌ２１０は、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０及び核酸断片１５１で標識された、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１５０が分散した液体であり、核酸断片１５１を検出するための試薬も含む。脳神経細胞由来のエクソソーム１１０にアミロイドβ１１１が結合している場合は、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１５０は、アミロイドβ１１１が結合していない、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面上のバイオマーカー１１２に結合する。
　流路２３０に送液された試薬液Ｌ２１０は、ウェルアレイ２４０に接触する。そして、ウェル２４１の内部に試薬液Ｌ２１０が収容される。この結果、ウェル２４１に脳神経細胞由来のエクソソーム１１０、核酸断片１５１で標識された、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１５０、及び、核酸断片１５１を検出するための試薬が導入される。
　１つのウェル２４１に導入される脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の数は特に制限されないが、好ましくは、１つのウェル２４１に１つ以下、すなわち、０個又は１個の脳神経細胞由来のエクソソーム１１０が導入される。これにより、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１の検出を１個単位で行うことができ、すなわちデジタル計測が可能となる。また、ウェルアレイの全てのウェルに脳神経細胞由来のエクソソーム１２０が導入される必要はない。
　脳神経細胞由来のエクソソーム１１０をウェル２４１に導入する手段は、特に制限されず、選択した脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に応じた適切な手段を選択することができる。例えば、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を自重により流体デバイス内（流路内）で沈降させ、ウェル２４１に分配する方法が挙げられる。あるいは、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を捕捉することができる、上記アミロイドβ特異的結合物質１２０を利用し、自重で沈降しにくい脳神経細胞由来のエクソソーム１１０にアミロイドβ特異的結合物質１２０を結合させて送液してもよく、予めウェル２４１に、アミロイドβ特異的結合物質１２０を固定化させておき、送液された脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を捕捉させることで、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０のウェル２４１への導入効率を向上させることもできる。
　アミロイドβ特異的結合物質１２０を脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１に結合させて、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を捕捉する工程は、本実施形態の検出方法の任意の時点で行うことができる。例えば、この工程は、ウェル２４１に脳神経細胞由来のエクソソーム１１０を導入する工程の前に、サンプルチューブ内で脳神経細胞由来のエクソソーム１１０とアミロイドβ結合物質１２０を接触させることにより行ってもよい。あるいは、アミロイドβ特異的結合物質１２０をウェル２４１に導入した後に、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０をウェル２４１に導入し、ウェル２４１内でアミロイドβ特異的結合物質１２０と脳神経細胞由来のエクソソーム１１０とを接触させてもよい。
　アミロイドβ特異的結合物質は、固相とアミロイドβ特異的結合物質との結合体であってもよい。
　固相、アミロイドβ特異的結合物質、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質としては、前記第１実施形態に記載したものと同じものが用いられる。
　核酸断片でエクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を標識する方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。核酸断片は、リンカーである分子を介してアミロイドβ特異的結合物質に標識されてもよい。リンカーとしては、特に限定されず、例えば、ポエリエチレン鎖、炭化水素鎖、ペプチド等が挙げられる。核酸断片は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。また、ＢＮＡ、ＬＮＡ等の人工核酸を含んでいてもよい。
　また、例えば、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質として抗体分子を用い、抗体分子に核酸断片を標識する場合、核酸断片は比較的分子が小さいことから、抗体１分子あたり例えば数個～数十個の核酸断片を標識することができる。抗体１分子あたりの核酸断片の数を増加させることにより、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を検出するのに要する時間を更に短縮することができる。また、抗体分子に核酸断片を標識する場合、抗体１分子あたり数個～数百個の核酸断片を標識してもよい。
　本実施形態によれば、例えば、核酸検出反応(例えばＩＣＡ反応)に係る時間が１分～３０分間程度であり、迅速な核酸検出が可能となる。
　アミロイドβ特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法としては、特に制限されず、物理吸着による方法、化学結合による方法、アビジン－ビオチンの結合を利用する方法、プロテインＧ又はプロテインＡと抗体との結合を利用する方法等が挙げられる。物理吸着による方法としては、疎水的相互作用、静電的相互作用により、アミロイドβ特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法が挙げられる。化学結合による方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。例えば、粒子の表面が水酸基を有する場合、アミロイドβ特異的結合物質が有するカルボキシル基に架橋剤を反応させて活性エステル化した後、水酸基とこのエステル基とを反応させることにより、アミロイドβ特異的結合物質を粒子表面に固定化させることができる。また、アミロイドβ特異的結合物質による脳神経細胞由来のエクソソームの認識能を阻害しないよう、アミロイドβ特異的結合物質と粒子表面との間にスペーサーを設けることが好ましい。
　上述したように、アミロイドβ特異的結合物質１２０を用いて脳神経細胞由来のエクソソーム１１０をウェル２４１に導入する場合、アミロイドβ特異的結合物質１個に脳神経細胞由来のエクソソーム１１０が０個又は１個検出される条件でアミロイドβ特異的結合物質と脳神経細胞由来のエクソソーム１１０との結合体を形成することが好ましい。さらに、１つのウェル２４１には、アミロイドβ特異的結合物質が０個又は１個導入されるように構成されることが好ましい。これによりデジタル計測が可能となる。
　脳神経細胞由来のエクソソーム１１０にアミロイドβ１１１が結合している場合は、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１とアミロイドβ特異的結合物質１２０とが結合し、ウェル２４１に導入される。
　続いて、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０と、核酸断片１５１で標識された、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１５０とを接触させると、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０と、核酸断片１５１で標識された、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１５０とが結合し、複合体１００が形成される。複合体１００の形成は、サンプルチューブ内で行われてもよいし、ウェル２４１内で行われてもよい。
《封入工程》
　ウェル２４１に、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０、核酸断片１５１で標識された、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１５０等を導入した後の封入工程は、上記第１実施形態と同様に行うことができる。
《検出工程》
　続いて、核酸断片１５１を検出する。核酸断片１５１の検出は、核酸断片１２１の代わりに、核酸断片１５１を用いる以外は、上記第１実施形態と同様に行うことができる。
　続いて、図５～図７を参照しながら、流体デバイス５００を用いた場合を例に、本実施形態の方法について説明する。
　まず、図５に示すように、流体デバイス５００の内部に試薬液Ｌ２１０を導入する。試薬液Ｌ２１０は、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０、及び、核酸断片１５１で標識された、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１５０が分散した液体であり、核酸断片１５１を検出するための試薬も含む。試薬液Ｌ２１０において、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の濃度は、ウェル２４１に１ウェルあたり１分子以下の脳神経細胞由来のエクソソーム１１０が入る濃度に調整されていることが好ましい。
　続いて、図６に示すように、流体デバイス５００の内部に封止液Ｌ２２０を導入する。封止液Ｌ２２０の比重は試薬液Ｌ２１０よりも大きい。このため、封止液Ｌ２２０は、試薬液Ｌ２１０のうち、ウェル２４１に収容されていない試薬液Ｌ２１０よりも下に沈み、ウェルアレイ２４０に接する。そして、封止液Ｌ２２０は、脳神経細胞由来のエクソソームを含む試薬液Ｌ２１０を収容した複数のウェル２４１をそれぞれ個別に封止し、独立した反応空間（微小区画２４２）となる。
　続いて、図７に示すように、ウェル２４２内で所定の反応を行い、発生したシグナルを観察する。ウェル２４２Ｒはシグナルが検出されたウェルであり、ウェル２４２はシグナルが検出されなかったウェルである。
［キット］
　１実施形態において、本発明は、血液中の脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１の検出用キットであって、核酸断片１２１で標識された、アミロイドβの特異的結合物質１２０を含む、キットを提供する。
　本実施形態のキットにより、上述した第１実施形態の脳神経細胞由来のエクソソームの検出方法を好適に行うことができる。したがって、本実施形態のキットは、血液中の脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１と、核酸断片１２１で標識された、アミロイドβに特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質１２０と、を結合させる工程と、前記アミロイドβ特異的結合物質１２０を検出する工程と、を備える、血液中の脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１の検出方法に用いるためのものであるということもできる。
　本実施形態のキットにおいて、脳神経細胞由来のエクソソーム、アミロイドβ特異的結合物質、及び、核酸断片については上述したものと同様である。
　本実施形態のキットには、複数のウェル２４１を有するウェルアレイ２４０が含まれていてもよい。また、本実施形態のキットには、ウェル２４１の開口部を封止する封止液Ｌ２２０を更に含んでいてもよい。封止液Ｌ２２０については、上述したものと同様である。
　また、本実施形態のキットには、脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面上に存在するバイオマーカー１１２を検出する物質をさらに含んでいてもよい。脳神経細胞由来のエクソソーム１１０の表面上に存在するバイオマーカー１１２を検出する物質としては、上述したエクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質が挙げられる。
　また、本実施形態のキットは、核酸断片１２１を検出する試薬を更に含んでいてもよい。
　このような試薬としては、上述したＩＣＡ反応用の試薬が挙げられ、具体的には、フラッププローブ、侵入プローブ、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）、蛍光基質等が挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出用キットであって、核酸断片で標識された、前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーに特異的に結合する、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質と、アミロイドβに特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質と、を含む、キットを提供する。
　本実施形態のキットにより、上述した第２実施形態の脳神経細胞由来のエクソソームの検出方法を好適に行うことができる。したがって、本実施形態のキットは、血液中の脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１の検出方法であって、前記エクソソーム１１０の表面上に存在するバイオマーカー１１２と、核酸断片１５１で標識された、前記エクソソーム表面上に存在するバイオマーカーに特異的に結合する、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１５０と、を結合させる工程と、前記血液中の脳神経細胞由来のエクソソーム１１０に結合したアミロイドβ１１１を検出する工程と、前記エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質１５０を検出する工程と、を備える、検出方法に用いるためのものであるということもできる。
　本実施形態のキットにおいて、脳神経細胞由来のエクソソーム、アミロイドβ特異的結合物質、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質、及び、核酸断片については上述したものと同様である。
　本実施形態のキットには、複数のウェル２４１を有するウェルアレイ２４０が含まれていてもよい。また、本実施形態のキットには、ウェル２４１の開口部を封止する封止液Ｌ２２０を更に含んでいてもよい。封止液Ｌ２２０については、上述したものと同様である。
　また、本実施形態のキットは、核酸断片１５１を検出する試薬を更に含んでいてもよい。
　このような試薬としては、上述したＩＣＡ反応用の試薬が挙げられ、具体的には、フラッププローブ、侵入プローブ、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）、蛍光基質等が挙げられる。
［脳内のアミロイドβ蓄積レベルの評価方法］
　１実施形態において、本発明は、脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する方法であって、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを検出する工程と、前記アミロイドβの検出量により、脳内のアミロイドβ蓄積レベルを評価する工程と、を備える、評価方法を提供する。
　本実施形態の評価方法において、脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出量が高い場合は、脳内のアミロイドβの蓄積レベルは高いと評価することができる。また、脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出量が低い場合は、脳内のアミロイドβの蓄積レベルは低いと評価することができる。
　本実施形態の評価方法によって、脳内のアミロイドβ蓄積レベルを評価することができるため、脳内のアミロイドβ蓄積が原因と考えられているアルツハイマー病の早期治療及び予防が可能となる。例えば、本実施形態の評価方法によって、脳内のアミロイドβ蓄積レベルが高いと判断された場合は、アルツハイマー病の治療を開始することが可能となる。
　本実施形態の評価方法において、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出は、上述した、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法を用いることができる。そのため、本実施形態の評価方法は、迅速且つ的確に、脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価することが可能である。
　また、本実施形態の評価方法は、被験者から血液を採取するだけで脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価することができ、髄液検査のような侵襲性がなく、また、ＰＥＴイメージング法のような特別な設備も必要がない。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
＜試薬調製＞
（脳神経細胞由来のエクソソーム含有試料）
　アミロイドβが結合した脳神経細胞由来のエクソソームを含む試料は、マウスニューロ２Ａ（Ｎ２ａ）細胞に、ヒトアミロイドβ前駆体蛋白質（ａｍｙｌｏｉｄ－β　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、ＡＰＰとも称する）のアイソフォーム７５１（ＡＰＰ７５１）の遺伝子を組み込んだプラスミドを安定導入して作成した細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地で２４時間培養した培養上清を用いた。培養上清からのエクソソームの回収は超遠心分離法を用いた。具体的には、培養上清を、２０００×ｇで１０分間、１００００×ｇで３０分間、１０００００×ｇで７０分間段階的に遠心分離してエクソソームを回収し、脳神経細胞由来のエクソソームを含む試料とした。血清からのエクソソームの回収は、ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ（登録商標）エクソソーム　アイソレーションキットＰＳ（富士フィルム和光純薬社製）を用いて行った。
（ＣＴＢ固定化磁性ビーズの調製）
　コレラ毒素サブユニットＢ（Ｃｈｏｌｅｒａ　Ｔｏｘｉｎ　ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｂ；ＣＴＢ、Ｓｉｇｍａ社製）を磁性ビーズに固定化するため、カルボキシル基修飾磁性ビーズ（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ、ＬＣ３００、ＪＳＲ社製）溶液に、ＣＴＢを添加し１００μＬに混合し、ローテーターにて３０分間反応させ、さらに縮合剤ＥＤＣを加え３時間反応させ、ＣＴＢのカルボキシル磁性ビーズへの固定化を行った。
　反応後未反応のＣＴＢと試薬を取り除くため、マグネットスタンドを用いてＣＴＢ固定化カルボキシル磁性ビーズを磁気捕集、および、ＰＢＳ－Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）による洗浄を３回繰り返し、ＣＴＢ固定化カルボキシル磁性ビーズ（ＣＴＢビーズ）を調製した。
（抗アミロイドβ抗体修飾用核酸及び検出用核酸）
　抗アミロイドβ抗体修飾用及び核酸検出反応用の核酸としては、以下に示す核酸を用いた。
・ＤＮＡ断片１：配列番号１に示す塩基配列を有する。
・フラッププローブ１：配列番号２に示す塩基配列を有する。
・侵入プローブ１：配列番号３に示す塩基配列を有する。
（核酸修飾抗アミロイドβ抗体の調製）
　抗アミロイドβモノクローナル抗体（型式「ＢＡＮ５０」、富士フィルム和光純薬社製）に、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片１）を結合させ、核酸標識抗アミロイドβ抗体を作製した。ＤＮＡ断片の結合には、市販のキット（商品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｏｌｉｇｏ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」、ソルリンク社製）を用いた。なお、核酸標識抗アミロイドβ抗体は、抗体（抗体一分子）に対して５～２０倍量の核酸が修飾されるように調製した。
（核酸検出試薬の調製）
　ＩＣＡ反応による核酸修飾抗体検出を行うため、核酸検出試薬として、ＩＣＡ反応試薬を調製した。本実験例におけるＩＣＡ反応試薬の試薬組成は以下の通りである。
　本実験例におけるＩＣＡ反応試薬は、０．１μＭフラッププローブ１（配列番号２）、１μＭ侵入プローブ１（配列番号３）、２μＭ　ＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＦＡＭ）（ホロジック社製）、２μＭ　ＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤ）（ホロジック社製）、１０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び１０００Ｕ／μＬクリベースを含んでいた。
　なお、これらのＩＣＡ反応試薬における各成分の濃度は、本実験例１で用いたＩＣＡ反応試薬における終濃度である。
＜エクソソーム、ＣＴＢ固定化磁性ビーズ及び核酸修飾抗アミロイドβ抗体の反応＞
　ＣＴＢは、脳神経細胞由来のエクソソーム膜表面に存在するガングリオシドＧＭ１と特異的に結合する。そのため、ＣＴＢ固定化磁性ビーズを用いれば、脳神経細胞由来のエクソソームを捕捉することができる。具体的には、下記のようにして、ＣＴＢ固定化磁性ビーズを用いて脳神経細胞由来のエクソソームを捕捉し、捕捉された脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβとアミロイドβ特異的結合物質とを結合させ、複合体を形成させた。
　サンプルチューブに、６×１０5個のＣＴＢ固定化カルボキシル磁性ビーズ（ＣＴＢビーズ）、０、４、２０、１００、５００、２０００、８０００、又は、１５０００ｎｇのエクソソームを含むように調整したＰＢＳ、０．１ｎｇ／ｍＬに調整した核酸修飾抗アミロイドβ抗体を全量が１００μＬとなるように混合し、ローテーター上で室温１時間反応させ、複合体を形成させた。
　反応後、マグネットスタンドを用いて得られた磁性ビーズを磁気捕集し、上清の除去及び０．１％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）を加える操作を５回繰り返して洗浄し、最後に上清を除去して複合体を得た。
　得られた複合体を洗浄後にて希釈し、各反応混合液を調製した。
＜デバイスの準備＞
　多数の微小のウェルを設けた基材をＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）で作製し、ＣＯＰ製の蓋材を貼合することでデバイスを作製した。１ｃｍ２あたりのウェルの総体積は０．９３μＬであった。計測に用いられた総ウェル数は、１００００００個であった。
＜反応混合溶液の送液＞
　デバイスに、上記各反応混合液を１８μＬ送液し、各ウェルに導入した。続いて、封止液としてＦＣ－４０（Ｓｉｇｍａ社製）を２００μＬ送液し、各ウェルを封止した。
＜核酸検出反応＞
　各反応混合溶液の送液後の上記デバイスをホットプレート上にセットし、６６℃で２５分間、反応させた。これにより、フラッププローブ及び侵入プローブによる、抗アミロイドβ抗体を修飾している核酸断片の認識、ＦＥＮによるフラッププローブの切断、放出されたフラッププローブ断片のＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅへの結合、ＦＥＮによるＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅの切断が進行し、Ａｌｅｘａ４８８から蛍光シグナルが発せられた。
＜ウェルの蛍光観察＞
　６６℃で２５分間加熱した後、蛍光顕微鏡（ＢＺ－７００、ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で４倍の対物レンズ、ＧＦＰの蛍光フィルターを用いて、デバイスにおける各ウェルの核酸検出反応で得られる蛍光シグナルの蛍光画像を撮影した。露光時間は、３０００ｍｓｅｃとした。得らえた各反応混合液１の蛍光画像を図１０に、エクソソーム濃度とデバイスのウェルに封入されたビーズの総数における蛍光シグナル数の割合（％）との関係を図１１にそれぞれ示す。
　図１０及び図１１に示したように、エクソソームの濃度に依存して、蛍光強度が増加した。この結果から、核酸標識抗アミロイドβ抗体により、脳神経由来のエクソソームに結合したアミロイドβを検出できることが明らかとなった。
［実験例２］
＜試薬調製＞
（脳神経細胞由来のエクソソーム含有試料）
　脳神経細胞由来のエクソソームを含む試料として、ヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子を導入した３月齢又は１３月齢のマウス［ヒトＡＰＰＳｗ，Ｉｎｄ遺伝子導入マウス（Ｊ２０、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）］の血清を用いた。血清からのエクソソームの回収は、ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ（登録商標）エクソソーム　アイソレーションキットＰＳ（富士フィルム和光純薬社製）を用いて行った。エクソソームを含まないコントロールとしては、ＰＢＳを用いた。
（ＣＴＢ固定化磁性ビーズ、抗アミロイドβ抗体修飾用核酸、検出用核酸、核酸修飾抗アミロイドβ抗体、及び、核酸検出試薬の調製）
　実験例１と同様にして、ＣＴＢ固定化磁性ビーズ、抗アミロイドβ抗体修飾用核酸、検出用核酸、核酸修飾抗アミロイド抗体、及び、核酸検出試薬を調製した。
＜エクソソーム、ＣＴＢ固定化磁性ビーズ及び核酸修飾抗アミロイドβ抗体の反応＞
　サンプルチューブに、６×１０5個のＣＴＢ固定化カルボキシル磁性ビーズ（ＣＴＢビーズ）、５０、１００、２５０μＬの各マウス血清から回収されたエクソソーム又はＰＢＳ、０．１ｎｇ／ｍＬに調整した核酸修飾抗アミロイドβ抗体を全量が１００μＬとなるように混合し、ローテーター上で室温１時間反応させ、複合体を形成させた。
　反応後、マグネットスタンドを用いて得られた磁性ビーズを磁気捕集し、上清の除去及び０．１％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）を加える操作を５回繰り返して洗浄し、最後に上清を除去して複合体を得た。
　得られた複合体を洗浄後ＰＢＳにて希釈し、反応混合液を調製した。
＜デバイスの準備と反応混合液の送液＞
　実験例１に記載のデバイスを用い、実験例１と同じ手順で反応混合溶液の送液を行った。
＜核酸検出反応＞
　各反応混合溶液の送液後の上記デバイスをホットプレート上にセットし、６６℃で２５分間、反応させた。これにより、フラッププローブ及び侵入プローブによる、抗アミロイドβ抗体を修飾している核酸断片の認識、ＦＥＮによるフラッププローブの切断、放出されたフラッププローブ断片のＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅへの結合、ＦＥＮによるＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅの切断が進行し、Ａｌｅｘａ４８８から蛍光シグナルが発せられた。
＜蛍光強度の測定＞
　６６℃で２５分間加熱した後、蛍光顕微鏡（ＢＺ－７００、ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で４倍の対物レンズ、ＧＦＰの蛍光フィルターを用いて、デバイスにおける各ウェルの核酸検出反応で得られる蛍光シグナルの蛍光画像を撮影した。露光時間は、３０００ｍｓｅｃとした。３月齢又は１３月齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウス血清、及びコントロールにおける各反応混合液について測定された、デバイスのウェルに封入されたビーズの総数における蛍光シグナル数の割合（％）を図１２に示した。
　図１２に示したように、３月齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスの血清からはコントロールと同様に蛍光が殆ど検出されなかった。それに対し、１３月齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスの血清からは、３月齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスの血清と比較して有意な蛍光強度の増加が認められた。
［実験例３］
（マウス脳組織中のアミロイドβの検出）
　実験例２で用いた３月齢又は１３月齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスの脳組織を摘出し、左半球を分取し、５Ｍグアニジン塩酸で溶解後、Ａβ　ＥＬＩＳＡキット(富士フィルム和光純薬社製)用いて、上記マウス脳組織中のアミロイドβ４０及びアミロイドβ４２濃度の測定を行った。また、脳組織を摘出し、右半球を４％パラホルムアルデドで一晩浸漬固定し、矢状断パラフィン切片を作製した。この切片を、抗アミロイドβモノクローナル抗体（型式「４Ｇ８」、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いて、アミロイドβの免疫組織染色を行った。マウス脳組織中のアミロイドβ４０及びアミロイドβ４２濃度の測定の結果を図１３に、上記マウス脳組織中のアミロイドβの免疫組織染色の結果を図１４にそれぞれ示す。図１３及び図１４に示すように、３月齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスの脳組織には、アミロイドβは蓄積していなかったが、１３月齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスの脳組織には、アミロイドβが蓄積していた。
　実験例２と実験例３の結果より、脳組織にアミロイドβが蓄積していなかった３月齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスの血清中のエクソソームには、アミロイドβが検出されなかったが、脳組織にアミロイドβが蓄積していた１３月齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスの血清中のエクソソームには、アミロイドβが検出されることが明らかとなった。この結果は、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを検出することにより、脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価できることを示している。
［比較例１］
（マウス血清中の遊離アミロイドβの検出）
　Ａβ　ＥＬＩＳＡキット（富士フィルム和光純薬社製）を用いて、実験例２で用いた３月齢又は１３月齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウス血清中の遊離のアミロイドβ４０及びアミロイドβ４２濃度の測定を行った。その結果を図１５に示す。
　図１５に示したように、血清中の遊離アミロイドβは、３月齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスでも、１３月齢のヒト家族性変異ＡＰＰ遺伝子導入マウスでも変化はなかった。この結果は、エクソソームに結合していない遊離のアミロイドβを測定することでは、脳内のアミロイドβの蓄積レベルは評価できないことを示している。
　本発明によれば、脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを迅速且つ高感度に検出する技術、及び脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する技術を提供することができる。
　１００…複合体、１１０…脳神経細胞由来のエクソソーム、１１１…アミロイドβ、１１２…バイオマーカー、１２０…アミロイドβ特異的結合物質、１２１，１５１…核酸断片、１３０：侵入プローブ、１５０…エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質、２００，５００…流体デバイス、２１０…基板、２２０…蓋部材、２２１…凸部、２２２…導入ポート、２２３…排出ポート、２３０…流路、２４０…ウェルアレイ、２４１…ウェル、２４２…封止されたウェル（微小区画）、Ｌ２１０…試薬液、Ｌ２２０…封止液、２４２Ｒ…シグナルが検出されたウェル、５１０…壁部材、８１０…フラッププローブ、８１１…フラップ部位（核酸断片）、８２１…第２フラップ部位（核酸断片）、８２０，８２０’…核酸断片、Ｆ…蛍光物質、Ｑ…消光物質。

Claims (16)

  1. 　血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法であって、
    　前記血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβと、核酸断片で標識された、アミロイドβに特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質と、を結合させる工程と、
    　前記アミロイドβ特異的結合物質を検出する工程と、
    を備える、検出方法。
  2. 　さらに、前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーを検出する工程を備える、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法であって、
    　前記エクソソーム表面上に存在するバイオマーカーと、核酸断片で標識された、前記エクソソーム表面上に存在するバイオマーカーに特異的に結合する、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質と、を結合させる工程と、
    　前記血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを検出する工程と、
    　前記エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質を検出する工程と、
    を備える、検出方法。
  4. 　前記アミロイドβが、前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーに結合している、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出方法。
  5. 　前記バイオマーカー又は前記アミロイドβを検出する工程が、前記バイオマーカー又は前記アミロイドβに特異的に結合する物質を用いて、前記脳神経細胞由来のエクソソームを捕捉することにより行われる、請求項２～４のいずれか一項に記載の検出方法。
  6. 　前記アミロイドβ特異的結合物質が、アミロイドβに特異的に結合する抗体又は抗体断片である、請求項１～５のいずれか一項に記載の検出方法。
  7. 　前記バイオマーカーが、ガングリオシドＧＭ１である、請求項２～６のいずれか一項に記載の検出方法。
  8. 　前記アミロイドβ特異的結合物質を検出する工程が、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙにより行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の検出方法。
  9. 　血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出用キットであって、
    　核酸断片で標識された、アミロイドβに特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質を含む、キット。
  10. 　前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーを検出する物質を更に含む、請求項９に記載のキット。
  11. 　前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーを検出する物質が、前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーに特異的に結合する物質である、請求項１０に記載のキット。
  12. 　血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出用キットであって、
    　核酸断片で標識された、前記脳神経細胞由来のエクソソーム表面上に存在するバイオマーカーに特異的に結合する、エクソソーム表面上バイオマーカー特異的結合物質と、
    　アミロイドβに特異的に結合するアミロイドβ特異的結合物質と、を含む、キット。
  13. 　前記アミロイドβ特異的結合物質が、アミロイドβに特異的に結合する抗体又は抗体断片である、請求項９～１２のいずれか一項に記載のキット。
  14. 　前記バイオマーカーが、ガングリオシドＧＭ１である、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のキット。
  15. 　脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する方法であって、
    　血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβを検出する工程と、
    　前記アミロイドβの検出量により、脳内のアミロイドβ蓄積レベルを評価する工程と、
    を備える、評価方法。
  16. 　前記脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出が、請求項１～８のいずれか一項に記載の検出方法により行われる、請求項１５に記載の評価方法。
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