JP2023521872A - 細胞外小胞の光学信号を増強する方法およびシステム - Google Patents

Abstract

システム、方法、およびデバイスを使用して、標的細胞外小胞（「ＥＶ」）を検出することができる。方法の一例は、電磁放射線の１つまたは複数の特定の波長を増幅するように構成されるナノ構造体を含むナノプラズモンアレイを得るステップと、ナノプラズモンアレイ上に液体試料を流すステップと、場合により、ナノプラズモンアレイ上に捕捉された標的ＥＶを１つまたは複数のレポーター基で標識するステップと、ナノプラズモンアレイ上に捕捉された標識された標的ＥＶ上に電磁放射線を投射するステップと、ＥＶまたは標識された標的ＥＶ上のレポーター基によって放射、散乱、または反射された電磁放射線を受け取ることによって標的ＥＶの画像を捕捉するステップと、を含む。

Description

発明の詳細な説明

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月１４日に出願された米国特許出願第６３／００９，４９５号の利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部と見なされる（そして参照により本明細書に組み込まれる）。

本発明は、国立衛生研究所の国立癌研究所によって授与された助成金番号Ｒ００ＣＡ２０１２４８およびＲ２１ＣＡ２１７６６２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

技術分野
本発明は、細胞外小胞の光学信号を増強する方法に関し、より詳細には、少数の細胞外小胞に関する。

背景
細胞外小胞（ＥＶ）は、とりわけ癌、心血管疾患、神経変性疾患、および感染症の循環バイオマーカーとしての新たな機会を提示する。これらの細胞由来リン脂質小胞は、様々な体液（例えば、血液、脳脊髄液、尿、唾液）中に豊富に存在する。より重要なことに、それらは、それらの親細胞に由来する様々な生体分子（脂質、タンパク質、および遺伝物質）を担持しており、これは、それらの細胞起源の分子状態をプローブするための低侵襲性手段として利用することができる。

ＥＶの可能性をさらに活用し、それらの臨床適応を加速するうえで、重要な満たされていない必要性は、臨床試料中のＥＶの組成および分子プロファイルを決定することができる高感度で堅牢な標準化されたアッセイを開発することである。しかしながら、それらの固有のサイズ（５０～１０００ｎｍ）は、従来の解析方法において技術的課題を課し、しばしば可変の知見をもたらしている。フローサイトメトリーは、例えば、ＥＶ数を過小評価することが多く、小さなＥＶ（すなわち、典型的には２００ｎｍ未満のエキソソーム）は、それらの弱い光散乱のために見逃される可能性があり、または小胞の群は単一の事象としてカウントされる可能性がある。特にタンパク質解析（例えば、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ／ＥＬＩＳＡ）のための従来の方法は、大量の試料を消費し、時間のかかる広範な処理工程を伴い、臨床シナリオには実用的ではない。したがって、ＥＶのための新しい分子プラットフォームの開発は、ＥＶを臨床的に関連するバイオマーカーとして解釈するための極めて重要な要件である。

概要
本開示は、個々のＥＶ中に存在する限られた量の生体分子から生成された光学信号をブーストするための信号増幅戦略に関する。特に、金属ナノ構造体、例えば金または銀ナノ構造体の強い光共鳴を使用して、光学信号をブーストし、ＥＶから放射される光学信号、例えば蛍光信号を大幅に増幅することができる。プラズモン増強は固有の信号増幅方法であるため、特定の実施形態では、この固有の方法を他の化学増幅戦略（例えば、分枝ＤＮＡバーコード）と組み合わせて、感度をさらに改善する。本開示は、ＥＶの光学信号を増強するための方法およびシステムに関する。

第１の態様によれば、本開示は、標的細胞外小胞（ＥＶ）を検出するためのナノプラズモンアレイを提供し、アレイは、基板と、基板上にナノ構造体の周期的アレイを形成するように配置された複数のナノ構造体であって、ナノ構造体の周期的アレイは、ナノ構造体に結合したＥＶおよび／またはナノ構造体の近くの基板に結合したＥＶによって放射、散乱、もしくは反射された電磁放射線の１つまたは複数の光学信号を増幅するように、またはＥＶに結合したレポーター基によって放射、散乱、もしくは反射された電磁放射線の１つまたは複数の光学信号を増幅するように、配置および寸法決めされる、複数のナノ構造体と、ナノ構造体上またはナノ構造体に隣接して固定された１つまたは複数のアフィニティーリガンドであって、標的ＥＶに選択的に結合して、標的ＥＶをナノ構造体またはナノ構造体に隣接する基板に結合する、１つまたは複数のアフィニティーリガンドと、を含むかそれらからなる。

様々な実施形態において、光学信号は、蛍光信号、ラマン信号、または暗視野散乱のうちの１つまたは複数であり得る。

特定の実施形態では、ナノ構造体は、アレイ状に配置され、かつ基板内または基板上に配置された金属膜内に形成された複数のナノホールであるか、それを含むか、またはそれからなることができる。他の実施形態では、ナノ構造体は、基板の上面にアレイ状に配置された複数のナノロッド、ナノディスク、またはナノグルーブであるか、それらを含むか、それらからなることができる。

いくつかの実施形態では、ナノ構造体の各々は、最大サイズ、例えば直径、幅、または長さが約３０～４００ｎｍである。例えば、ナノ構造体は、ナノロッドまたはナノスクエアであり得、長さが約５０～約３００ｎｍ、幅が約２０～約３００ｎｍ、高さが約２０～約３００ｎｍの寸法を有するか、またはナノ構造体は、ナノディスクであり得、直径が約５０～約２００ｎｍ、高さが約２０～約３００ｎｍの寸法を有する。特定の実施形態では、ナノ構造体の周期的アレイは、ナノ構造体間に約４００～８００ｎｍの周期性を有する。

いくつかの実施形態では、アフィニティーリガンドは、捕捉剤、例えば抗体に結合し、捕捉剤は、標的ＥＶ上の少なくとも１つの表面マーカーに結合するように構成される。特定の実施形態では、アフィニティーリガンドは、標的ＥＶ上の少なくとも１つの表面マーカーおよび／または標的ＥＶ内の少なくとも１つの小胞内マーカーに結合するように構成される。

いくつかの実施形態では、ナノプラズモンアレイは、基板の上面に配置された金属膜をさらに含むか、またはそれからなり、金属膜は、電磁放射線の１つまたは複数の特定の波長を増幅するように選択された周期性で金属膜を貫通する複数のナノホールを含み、周期性はナノホール間で約４００～８００ｎｍであり、金属膜は、ナノホール上に、またはナノホールに隣接して固定された複数のアフィニティーリガンドを含み、複数のアフィニティーリガンドは、標的ＥＶの表面上のマーカーに選択的に結合する。金属膜は、例えば、貴金属、遷移金属、アルカリ金属、またはそれらの任意の組み合わせであり得るか、またはそれらを含み得る。様々な実施態様では、ナノ構造体および金属膜のいずれかまたは両方は、金、銀、アルミニウム、または白金であるか、それらを含むか、それらからなる。

別の態様では、本開示は、液体試料中の標的細胞外小胞（ＥＶ）を検出する方法を含み、この方法は、本明細書に記載または特許請求されるナノプラズモンアレイを得るステップと、液体試料中にＥＶが存在する場合、アフィニティーリガンドに結合することを可能にする流量でナノプラズモンアレイ上に液体試料を流すことによって、ナノプラズモンアレイ上のＥＶを捕捉するステップと、ナノプラズモンアレイ上に捕捉された標的ＥＶを１つまたは複数のレポーター基で標識するステップと、１つまたは複数の特定の波長の第１の電磁放射線を、ナノプラズモンアレイ上に捕捉された標識された標的ＥＶに投射するステップであって、１つまたは複数の特定の波長の電磁放射線は、レポーター基に第１の電磁放射線または第２の電磁放射線を放射、散乱または反射させるように選択される、ステップと、レポーター基によって放射、散乱または反射された第１または第２の電磁放射線を受け取るステップであって、ナノ構造体のナノプラズモンアレイは、レポーター基によって放射、散乱または反射された第１または第２の電磁放射線を増幅するように配置および寸法決めされる、ステップと、レポーター基によって放射、散乱または反射された増幅された第１または第２の電磁放射線の画像を捕捉するステップと、を含むか、それらからなる。

これらの方法では、標的ＥＶの数は１，０００未満であり得る。
特定の実施形態では、ナノ構造体は、基板または基板上に配置された金属膜を貫通する複数のナノホールを含むか、またはナノ構造体は、基板の上面に配置された複数のナノロッド、ナノディスク、またはナノグルーブを含むか、またはそれらからなる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、サイズによってＥＶを識別し、例えば１ミクロンより大きい大きな成分を廃棄するステップと、標的ＥＶマーカーに対する陽性に基づいて、識別されたＥＶから標的ＥＶを選択するステップと、特定の標的ＥＶを生成するために、器官または組織特異的マーカーに対する陽性によって特定の器官または組織に由来するものとして標的ＥＶを選択するステップと、特定の標的ＥＶの表面上の小胞外バイオマーカーに基づいて、および／または特定の標的ＥＶ内の小胞内バイオマーカーに基づいて、個々の特定の標的ＥＶを解析するステップと、をさらに含むか、またはそれらからなる。

さらに別の態様では、本開示は、液体試料中の標的細胞外小胞（ＥＶ）を検出するためのシステムを提供し、システムは、本明細書に記載および特許請求されるナノプラズモンアレイと、試料制御ユニットであって、ポンプと、液体試料中にＥＶが存在する場合、アフィニティーリガンドに結合することを可能にする、ポンプによって制御された流量でナノプラズモンアレイ上に液体試料を流すことによって、ナノプラズモンアレイ上のＥＶを捕捉するように構成される少なくとも１つの流体チャネルと、ナノプラズモンアレイ上に捕捉された標的ＥＶを１つまたは複数のレポーター基で標識するための少なくとも１つのアフィニティーリガンド、例えば抗体と、を含む、試料制御ユニットと、撮像ユニットであって、ナノプラズモンアレイ上に捕捉された標識された標的ＥＶに電磁放射線を投射するように構成される光源と、前記ナノプラズモンアレイ上に捕捉された標識された標的ＥＶ上の標的ＥＶまたはレポーター基によって放射、散乱、または反射された電磁放射線を受け取り、標識された標的ＥＶの画像を捕捉するように構成される電磁放射線検出器、例えばカメラまたはＣＣＤであって、レポーター基から反射された散乱光によって放射、散乱、または反射された電磁放射線は、ナノ構造体の周期的アレイによって増幅された１つまたは複数の波長を有する、電磁放射線検出器と、を含む、撮像ユニットと、を含む。

これらのシステムのいくつかの実施形態では、ナノ構造体は、アレイ状に配置され、かつ基板内または基板上に配置された金属膜内に形成された複数のナノホールを含むか、またはそれらからなる。他の実施形態では、ナノ構造体は、基板の上面にアレイ状に配置された複数のナノロッド、ナノディスク、またはナノグルーブを含むか、またはそれらからなる。

システムの特定の実施形態では、ナノ構造体の各々は、最大サイズ、例えば、直径、幅、または長さが約３０～４００ｎｍであり、および／またはナノ構造体はナノロッドまたはナノスクエアであり、長さが約５０～約３００ｎｍ、幅が約２０～約３００ｎｍ、高さが約２０～約３００ｎｍの寸法を有するか、またはナノ構造体はナノディスクであり、直径が約５０～約２００ｎｍ、高さが約２０～約３００ｎｍの寸法を有する。

いくつかの実施形態では、アフィニティーリガンドは、捕捉剤に結合し、捕捉剤は、標的ＥＶ上の少なくとも１つの表面マーカーに結合するように構成される。他の実施形態では、アフィニティーリガンドは、標的ＥＶ上の少なくとも１つの表面マーカーおよび／または標的ＥＶ内の少なくとも１つの小胞内マーカーに結合するように構成される。

システムの特定の実施形態では、ナノ構造体の周期的アレイは、ナノ構造体間に約４００～８００ｎｍの周期性を有する。

本明細書で使用される特定の用語は、ここで収集される。別段の記載がない限り、または文脈から暗示的でない限り、以下の用語および語句は、以下に提供される意味を含む。特に明記されていない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語および語句は、その用語または語句が関連する技術分野で得られた意味を排除するものではない。定義は、特定の実施形態の説明を助けるために提供され、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、特許請求の範囲に記載された発明を限定することを意図するものではない。

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、一実施形態に有用であるが、有用であるか否かにかかわらず、特定されていない要素を含むことができる組成物、方法、およびそのそれぞれの成分に関して使用される。

単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という単語は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、「および」を含むことを意図している。略語「例えば」は、非限定的な例を示すために本明細書で使用される。

本明細書で使用される「周期性」という用語は、ナノ構造体上に配置されることによる、一定の間隔でのナノ構造体の再発または繰り返しを指す。したがって、本明細書で使用される「周期的」という用語は、格子または他の繰り返し単位構成などの、互いに対するナノ構造体の規則的な所定のパターンを指す。ナノ構造体のランダム分布は周期的パターンである。

本明細書で使用される「表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）」は、入射光が平坦な金属表面、特に入射光によって刺激される負誘電率材料と正誘電率材料との間の界面で集合的な共鳴電子振動を刺激する物理現象を指す。

「局所表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）」という用語は、金属ナノ粒子などのナノメートルサイズの構造の表面プラズモン共鳴を指す。振動電子は、金属の表面付近の（非導電性）周囲媒体中に強い電磁場を生成する。

本明細書で使用される場合、「表面プラズモン」、「表面プラズモンポラリトン」、または「プラズモン」は、金属などのプラズモン表面における自由電子の集団振動を指す。これらの振動は、金属／誘電体（または金属／真空）界面に平行な方向に伝播する自立した表面電磁波をもたらす。波は金属と外部媒体（例えば空気または水）との境界上にあるため、これらの振動は、例えばＥＶなどの分子標的の金属表面への吸着など、この境界の屈折率変化に非常に敏感である。さらに、電磁場強度は、金属表面から周囲環境（例えば、真空または誘電体）へ指数関数的に減衰する。電磁場強度の最大値は、金属／誘電体または金属／真空界面で見出すことができる。

本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、１つまたは複数の細胞外小胞（例えば、エキソソーム）を含み得る任意の生物学的または他の流体を意味する。そのような生物学的流体には、限定されないが、細胞、生物（細菌、ウイルス）、溶解された細胞または生物、細胞抽出物、核抽出物、細胞または生物の成分、細胞外液、細胞または生物がインビトロで培養される培地、血液、血漿、血清、胃腸分泌物、腹水、組織または腫瘍のホモジネート、滑液、糞便、唾液、痰、嚢胞液、羊水、脳脊髄液、腹腔液、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙、胸水、乳頭吸引物、母乳、皮膚の外部切片、呼吸器、腸および尿生殖路、ならびに前立腺液が含まれる。試料は、ウイルスまたは細菌試料、汚染水、空気試料、または土壌試料などの環境源から得られた試料、ならびに食品産業試料であり得る。

「生物学的試料」は、生物に由来するか、または生物から得られる。生物は、生物全体であり得るか、または培養で増殖させた細胞もしくは器官であり得る。一実施形態では、「生物学的試料」はまた、被験体からの細胞もしくは細胞集団または一定量の組織もしくは体液を指す。ほとんどの場合、試料は被験体から除去されているが、「生物学的試料」という用語は、インビボで、すなわち被験体から除去することなく解析された細胞または組織も指すことができる。多くの場合、「生物学的試料」は、被験体由来の細胞を含有するが、この用語は、血液、唾液または尿の非細胞画分などの非細胞生物学的材料も指すことができる。一実施形態では、生物学的試料は、原発性、２次性、または転移性腫瘍の切除、気管支鏡生検、またはコア針生検、または胸水からの細胞ブロックからのものである。さらに、穿刺吸引生体試料も有用である。１つの実施形態において、生物学的試料は、原発腹水細胞を含む。

生物学的試料には、外植片ならびに患者の組織に由来する原発および／または形質転換細胞培養物も含まれる。生物学的試料は、被験体から細胞の試料を除去することによって提供することができるが、以前に単離された細胞または細胞抽出物（例えば、別の人によって、別の時間に、および／または別の目的のために単離される）を使用することによって達成することもできる。処置履歴または転帰履歴を有する組織などの保管組織も使用され得る。生物学的試料には、組織生検、擦過物（例えば、頬側掻き取り）、全血、血漿、血清、尿、唾液、細胞培養物、または脳脊髄液が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の組成物および方法によって解析された試料は、そこに含まれるＥＶの精製または濃縮のために処理されていてもよい。

本明細書で使用される場合、「細胞外小胞」（「ＥＶ」）は、内部に空洞を含む天然に存在するまたは合成の小胞を指す。ＥＶは、内部空洞の内容物を封入する脂質二重層膜を含む。ＥＶには、エクトソーム、微小胞、微粒子、エキソソーム、オンコソーム、アポトーシス小体、リポソーム、空胞、リソソーム、輸送小胞、分泌小胞、ガス小胞、マトリックス小胞、または多小胞体が含まれ得るが、これらに限定されない。ＥＶは、最大約１０ミクロンの寸法を有するが、典型的には、約１０００ｎｍ以下、約９００ｎｍ以下、約８００ｎｍ以下、約７００ｎｍ以下、約６００ｎｍ以下、約５００ｎｍ以下、約４５０ｎｍ以下、約４００ｎｍ以下、約３５０ｎｍ以下、約３００ｎｍ以下、約２５０ｎｍ以下、約２４０ｎｍ以下、約２３０ｎｍ以下、約２２０ｎｍ以下、約２１０ｎｍ以下、約２００ｎｍ以下、約１９０ｎｍ以下、約１８０ｎｍ以下、約１７０ｎｍ以下、約１６０ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１３０ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、約１１０ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約７０ｎｍ以下、約６０ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、約３０ｎｍ以下、約２０ｎｍ以下、または約１０ｎｍ以下である。

エキソソームまたは微小胞はＥＶの一種であり、真核細胞によって放出され得るか、または原形質膜から細胞の外側に出芽し得る。これらの膜結合小胞は、約１０ｎｍ～約５０００ｎｍの範囲の直径を有してサイズが不均一である。本明細書に記載の方法および組成物は、あらゆるサイズの微小胞に等しく適用可能である。

文献のいくつかでは、「エキソソーム」という用語はまた、ｍＲＮＡ分解ならびに核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のプロセシングに関与するエキソリボヌクレアーゼを含有するタンパク質複合体を指す。そのようなタンパク質複合体は膜を有さず、「微小胞」または「エキソソーム」ではなく、したがってそれらの用語が本明細書で使用されるようなＥＶではない。

本明細書で使用される場合、「患者」および「被験体」という用語は、ヒトまたは動物、例えば脊椎動物、例えば哺乳動物を指すために交換可能に使用される。哺乳動物の例としては、限定されないが、霊長類、げっ歯類、家畜、または狩猟動物が挙げられる。霊長類には、チンパンジー、サル、およびマカク、例えばアカゲザルが含まれる。げっ歯類には、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バッファロー、ネコ種、例えばイエネコ、イヌ種、例えばイヌ、キツネ、トリ種、例えばニワトリ、アヒルおよびダチョウ、ならびに魚、例えばマス、バスおよびサケが含まれる。患者または被験体は、上記の任意のサブセット、例えば上記の全てを含むが、ヒト、霊長類、またはげっ歯類などの１つまたは複数の群または種を除外する。本明細書に記載の態様の特定の実施形態では、被験体は哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。被験体は男性または女性であり得る。さらに、被験体は、任意の発達段階、例えば、胚、胎児、乳児、小児、青年期前、青年期、若年成人、成熟成人および高齢成人であり得る。女性被験体は妊娠していてもいなくてもよい。

一実施形態では、被験体は、臨床環境における患者または他の被験体であり得る。被験体は、疾患または障害を有するか、または発症するリスクがあるか、または疾患または障害を有すると既に診断されている可能性がある。被験体は治療を受けている可能性がある。

本明細書で使用される場合、「捕捉剤」は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に対する特異的結合を有する任意の薬剤を指す。結合は、全てのＥＶ上に存在するマーカー、例えばバイオマーカー、またはＥＶのサブセットに対するものであり得る。典型的には、捕捉剤は、ＥＶの外面に完全にまたは部分的に存在するバイオマーカー（本明細書では、神経鞘外マーカーと呼ばれる）に特異的に結合するが、一実施形態では、捕捉剤は、ＥＶの内部に存在するマーカー（本明細書では、神経鞘内マーカーと呼ばれる）に特異的に結合する。捕捉剤は、試料（例えば、センシングエリア）と接触するプラズモンナノ構造体の表面に固定化される。捕捉剤の例としては、限定されないが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、アプタマー、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、抗体部分、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、有機小分子、ポリマー、コンビナトリアル化学ライブラリーからの化合物、無機分子、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

本明細書に記載される「核酸」は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、一本鎖または二本鎖であり得、例えば、目的のタンパク質をコードする核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸類似体、例えばペプチド－核酸（ＰＮＡ）、擬似相補的ＰＮＡ（ｐｃ－ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）などであり得る。核酸配列としては、例えば、限定されないが、転写リプレッサーとして作用する核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、低分子阻害性核酸配列、例えば、限定されないが、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。

本明細書で使用される場合、ＤＮＡという用語はデオキシリボ核酸と定義される。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では、ヌクレオシドのポリマーを示すために「核酸」と互換的に使用される。典型的には、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって結合されたＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）中に天然に見出されるヌクレオシドから構成される。しかしながら、この用語は、天然に存在する核酸に見られるかどうかにかかわらず、化学的または生物学的に修飾された塩基、修飾された骨格などを含有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む分子を包含し、そのような分子は、特定の用途に使用することができる。

本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。ペプチドは、比較的短いポリペプチドであり、典型的には約２～６０アミノ酸長である。本明細書で使用されるポリペプチドは、典型的には、タンパク質に最も一般的に見られる２０個のＬ－アミノ酸などのアミノ酸を含有する。しかしながら、当技術分野で公知の他のアミノ酸および／またはアミノ酸類似体を使用することができる。ポリペプチド中のアミノ酸の１つまたは複数は、例えば、炭水化物基、リン酸基、脂肪酸基、コンジュゲーションのためのリンカー、官能化などの化学的実体の添加によって修飾され得る。共有結合的または非共有結合的に会合した非ポリペプチド部分を有するポリペプチドは、依然として「ポリペプチド」と見なされる。修飾の例としては、グリコシル化およびパルミトイル化が挙げられる。ポリペプチドは、天然源から精製することができ、組換えＤＮＡ技術を使用して産生することができ、従来の固相ペプチド合成などの化学的手段によって合成することができる。「抗原」は、本明細書では免疫応答を誘導する物質と定義される。抗原決定基はエピトープと呼ばれ、担体分子（場合により同じ分子の一部であり得る、例えば、単一分子であるボツリヌス神経毒Ａ）に関連するエピトープは、３つの異なるエピトープを有する。通常、抗原は、免疫反応を生じる動物にとって外来である。

本明細書で使用される場合、「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびに抗原結合誘導体、またはその一部もしくは断片を含み得る。周知の抗原結合断片としては、例えば、単一ドメイン抗体（ｄＡｂこれは、単一のＶＬまたはＶＨ抗体ドメインから本質的になる）、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含むＦｖ断片、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）_２断片が挙げられる。そのような抗体分子の構築方法は、当技術分野で周知である。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン、またはＦｃ（結晶化可能断片）領域もしくはＦｃ領域のＦｃＲｎ結合断片を有するモノクローナルもしくはポリクローナル抗原結合断片を指す。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生することができる。「抗原結合断片」には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、ならびにポリペプチドに結合する特異的抗原を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが含まれる。Ｆａｂ、Ｆｃ、ｐＦｃ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖという用語は、標準的な免疫学的意味で用いられる（例えば、Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ Ｅｄ．，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄを参照されたい）。

本明細書で使用される「レポーター基」という用語は、試料中の標的の存在を示す検出可能な光学信号を生成または増強することができる組成物を指す。レポーター基の例としては、蛍光分子、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７、ベンゼンチオール、４，４’－ビピリジン、およびＲ６Ｇなどのラマン信号の小分子、金属、半導体、プラスチック、ポリマー、およびガラスからなるナノ粒子が挙げられる。

本明細書で使用される「標識」という用語は、試料中の標的の存在を示す検出可能な信号を生成または増強することができる組成物を指す。「標識」は、本明細書では、バイオマーカーとコンジュゲートした１次抗体、または１次抗体とコンジュゲートした２次抗体と呼ばれる。「標識」は、本明細書では、捕捉剤によるＥＶ標識と呼ばれる。

本明細書で使用される場合、「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、ＥＶと会合し、ＥＶを検出するための捕捉剤に結合することができる分子を指す。マーカーは、捕捉剤によって認識され得るＥＶの任意の成分であり得る。マーカーの例としては、限定されないが、タンパク質、または核酸、またはＥＶの膜を構成する脂質二重層の成分が挙げられる。有用なマーカーには、受容体（例えば、細胞外）およびチャネル成分が含まれる。マーカーは、本明細書で定義されるように、小胞外マーカーまたは小胞内マーカーのいずれかであり得る。マーカーは、試料中の全てのＥＶ、または試料中のＥＶのサブセットに存在し得る。試料中の全てのＥＶに共通のマーカーは、本明細書ではｐａｎ－ＥＶマーカーと呼ばれる。

本明細書で使用される場合、１つの要素が別の要素に「固定」されている場合、２つの要素は、結合、例えば、イオン結合、共有結合、極性結合、または水素結合を介して直接接続されている。２つの要素が互いに「結合」している場合、２つの要素は、結合を介して、またはリンカー基、例えばＰＥＧ、または本明細書に記載のアフィニティーリガンドなどの他の要素を介して、直接的または間接的に接続されている。

「アフィニティーリガンド」は、本明細書では、分子スペーサまたは基板もしくはナノ構造体に直接結合または固定され、捕捉剤または分子スペーサにも直接結合する分子として定義される。別の言い方をすれば、アフィニティーリガンドは、分子スペーサ（または基質またはナノ構造体）と捕捉剤（または分子スペーサ）とを物理的に連結する。一実施形態において、アフィニティーリガンドは、特異的結合対の第１のメンバーである。そのような実施形態では、捕捉剤は、特異的結合対の第２のメンバーであり得る。そのような特異的結合対の例には、抗原、抗体、ハプテン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アビジン、ストレプトアビジン、ホルモン、受容体、レクチン、炭水化物、ＩｇＧ、プロテインＡ、および核酸結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。アフィニティーリガンドには、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、抗体部分、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、有機小分子、ポリマー、コンビナトリアル化学ライブラリー由来の化合物、無機分子、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。

特異的結合対の例としては、抗原－抗体、ハプテン－抗体または抗体－抗体対、相補的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、アビジン－ビオチン、ストレプトアビジン－ビオチン、ホルモン－受容体、リガンド－受容体、レクチン－炭水化物、ＩｇＧ－プロテインＡ、核酸－核酸結合タンパク質、および核酸－抗核酸抗体が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、２つの分子、化合物、細胞および／または粒子間の化学的相互作用を指し、第１の実体は、非標的である第３の実体に結合するよりも高い特異性および親和性で第２の標的実体に結合する。いくつかの実施形態において、特異的結合は、第３の非標的実体に対する親和性よりも少なくとも１０倍大きい、第２の標的実体に対する第１の実体の親和性を指すことができる。所与の標的に特異的な試薬は、利用されるアッセイの条件下でその標的に特異的な結合を示す試薬である。特定の実施形態では、特異的結合は、１０^－８Ｍ以下、１０^－９Ｍ以下、１０^－１０Ｍ以下のオーダーの解離定数によって示される。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、本明細書ではナノプラズモンアレイの可能な構成要素と呼ばれ、分子スペーサとして使用される。そのようなスペーサとして使用するために、ＰＥＧの様々な形態および組み合わせが想定される。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、工業生産から医学への多くの用途を有するポリエーテル化合物である。ＰＥＧの構造は、（括弧内の繰り返し元素に留意されたい）、Ｈ－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－ＯＨである。ＰＥＧは、その分子量に応じて、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られている。ＰＥＧ、ＰＥＯまたはＰＯＥは、エチレンオキシドのオリゴマーまたはポリマーを指す。３つの名称は化学的に同義であるが、本明細書で使用される場合、ＰＥＧは２０，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有するオリゴマーおよびポリマーを指し、ＰＥＯは２０，０００ｇ／ｍｏｌを超える分子量を有するポリマーを指し、ＰＯＥは任意の分子量のポリマーを指す。ＰＥＧおよびＰＥＯは、それらの分子量に応じて、液体または低融点固体である。重合プロセスに使用される開始剤に応じて、異なる形態のＰＥＧも利用可能であり、最も一般的な開始剤は、単官能性メチルエーテルＰＥＧ、またはメトキシポリ（エチレングリコール）、略してｍＰＥＧである。低分子量ＰＥＧは、単分散、均一、または離散と呼ばれるより純粋なオリゴマーとしても入手可能である。分枝ＰＥＧは、中心コア基から生じる３～１０個のＰＥＧ鎖を有する。星型ＰＥＧは、中心コア基から生じる１０～１００個のＰＥＧ鎖を有する。Ｃｏｍｂ ＰＥＧは、ポリマー骨格に通常グラフトされた複数のＰＥＧ鎖を有する。

「長鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）」または「長ＰＥＧ」は、本明細書では、７５０Ｄａ以上の分子量を有するＰＥＧポリマーとして定義される。

「短鎖ＰＥＧ」または「短ＰＥＧ」は、本明細書では、５００Ｄａ以下の分子量を有するＰＥＧポリマーとして定義される。

本明細書で使用される場合、「発現レベル」は、細胞または試料中に存在する目的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子および／またはポリペプチド分子の数を指す。

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本開示で使用するための方法および材料を本明細書に記載するが、当技術分野で公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。

本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面、説明、および特許請求の範囲に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

多重化単一ＥＶ解析用のナノプラズモンアレイの一例を示す。 多重化単一ＥＶ解析用のナノプラズモンアレイの一例を示す。 多重化単一ＥＶ解析用のナノプラズモンアレイの一例を示す。 多重化単一ＥＶ解析用のナノプラズモンアレイの一例を示す。 多重化単一ＥＶ解析用のナノプラズモンアレイの一例を示す。 多重化単一ＥＶ解析用のナノプラズモンアレイの一例を示す。 多重化単一ＥＶ解析用のナノプラズモンアレイの一例を示す。 多重化単一ＥＶ解析用のナノプラズモンアレイの光学系の一例を示す。 多重化単一ＥＶ解析用のナノプラズモンアレイの光学系の一例を示す。 標的ＥＶを検出するためのシステムを特徴付けるために使用される蛍光の画像およびグラフである。 標的ＥＶを検出するためのシステムを特徴付けるために使用される蛍光の画像およびグラフである。 標的ＥＶを検出するためのシステムを特徴付けるために使用される蛍光の画像およびグラフである。 標的ＥＶを検出するためのシステムを特徴付けるために使用される蛍光の画像およびグラフである。 標的ＥＶを検出するためのシステムを特徴付けるために使用される蛍光の画像およびグラフである。 標的ＥＶを検出するためのシステムを特徴付けるために使用される蛍光の画像およびグラフである。 標的ＥＶを検出するためのシステムを特徴付けるために使用される蛍光の画像およびグラフである。 標的ＥＶを検出するためのシステムを特徴付けるために使用される蛍光の画像およびグラフである。 標的ＥＶを検出するためのシステムを特徴付けるために使用される蛍光の画像およびグラフである。 標的ＥＶを検出するためのシステムを特徴付けるために使用される蛍光の画像およびグラフである。 単一ＥＶ測定値を示す。 単一ＥＶ測定値を示す。 単一ＥＶ測定値を示す。 捕捉されたＥＶの腫瘍マーカーの測定値を示す。 捕捉されたＥＶの腫瘍マーカーの測定値を示す。 捕捉されたＥＶの腫瘍マーカーの測定値を示す。 捕捉されたＥＶの腫瘍マーカーの測定値を示す。 捕捉されたＥＶの腫瘍マーカーの測定値を示す。 ＥＶ添加血漿試料中の腫瘍マーカーの測定値を示す。 ＥＶ添加血漿試料中の腫瘍マーカーの測定値を示す。 ＥＶ添加血漿試料中の腫瘍マーカーの測定値を示す。 ＥＶ添加血漿試料中の腫瘍マーカーの測定値を示す。 ＥＶ添加血漿試料中の腫瘍マーカーの測定値を示す。 ＥＶ添加血漿試料中の腫瘍マーカーの測定値を示す。 ＥＶ添加血漿試料中の腫瘍マーカーの測定値を示す。 Ｇｌｉ３６－ＷＴおよびＧｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩから単離されたＥＶの例示的な特性評価を示す。 Ｇｌｉ３６－ＷＴおよびＧｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩから単離されたＥＶの例示的な特性評価を示す。 濃度が変化したＥＶの例示的な特性評価を示す。 濃度が変化したＥＶの例示的な特性評価を示す。 捕捉されたＥＶの試験感度および特異性を実証するための陰性対照を示す。 捕捉されたＥＶの試験感度および特異性を実証するための陰性対照を示す。 金ナノロッドを含むナノプラズモンアレイの製造方法の一例を示す一連の概略図である。 金ナノロッドを含むナノプラズモンアレイの製造方法の一例を示す一連の概略図である。 金ナノロッドを含むナノプラズモンアレイの製造方法の一例を示す一連の概略図である。 金ナノロッドを含むナノプラズモンアレイの製造方法の一例を示す一連の概略図である。 標的ＥＶを検出する方法の一例を示す。 標的ＥＶを検出する方法の一例を示す。 標的ＥＶを検出する方法の一例を示す。 標的ＥＶを検出する方法の一例を示す。 異なるサイズのナノロッドの散乱強度を示すグラフである。 暗視野撮像における散乱強度の変化を示すグラフである。 異なるサイズのナノロッドおよびナノディスクアレイの光共鳴を示す有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）シミュレーションを示す。 異なるサイズのナノロッドおよびナノディスクアレイの光共鳴を示す有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）シミュレーションを示す。 異なるサイズのナノロッドおよびナノディスクアレイの光共鳴を示す有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）シミュレーションを示す。 異なるサイズのナノロッドおよびナノディスクアレイの光共鳴を示す有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）シミュレーションを示す。 異なるサイズのナノロッドおよびナノディスクアレイの光共鳴を示す有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）シミュレーションを示す。 異なるサイズのナノロッドおよびナノディスクアレイの光共鳴を示す有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）シミュレーションを示す。 異なるサイズのナノロッドおよびナノディスクアレイの光共鳴を示す有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）シミュレーションを示す。 異なるサイズのナノロッドおよびナノディスクアレイの光共鳴を示す有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）シミュレーションを示す。 基板までの異なる位置および距離におけるナノディスクへのＥＶ結合時の暗視野散乱のスペクトルシフトを示す３つのＦＤＴＤシミュレーションシナリオを示す。 基板までの異なる位置および距離におけるナノディスクへのＥＶ結合時の暗視野散乱のスペクトルシフトを示す３つのＦＤＴＤシミュレーションシナリオを示す。 基板までの異なる位置および距離におけるナノディスクへのＥＶ結合時の暗視野散乱のスペクトルシフトを示す３つのＦＤＴＤシミュレーションシナリオを示す。 基板までの異なる位置および距離におけるナノディスクへのＥＶ結合時の暗視野散乱のスペクトルシフトを示す３つのＦＤＴＤシミュレーションシナリオを示す。 基板までの異なる位置および距離におけるナノディスクへのＥＶ結合時の暗視野散乱のスペクトルシフトを示す３つのＦＤＴＤシミュレーションシナリオを示す。 基板までの異なる位置および距離におけるナノディスクへのＥＶ結合時の暗視野散乱のスペクトルシフトを示す３つのＦＤＴＤシミュレーションシナリオを示す。 暗視野散乱強度変化を測定することによるＥＶ結合検出の一例を示す。 暗視野散乱強度変化を測定することによるＥＶ結合検出の一例を示す。 暗視野散乱強度変化を測定することによるＥＶ結合検出の一例を示す。 暗視野散乱強度変化を測定することによるＥＶ結合検出の一例を示す。 ナノディスクの暗視野散乱のスペクトルシフトを測定することによるＥＶ結合検出の一例を示す。 ナノディスクの暗視野散乱のスペクトルシフトを測定することによるＥＶ結合検出の一例を示す。 ナノディスクの暗視野散乱のスペクトルシフトを測定することによるＥＶ結合検出の一例を示す。 ナノディスクの異なる直径に対する暗視野および３つの異なる蛍光信号（ＴＲＩＴＣ、Ｃｙ５およびＣｙ５．５）のプラズモン増強を示す。 異なるサイズのナノディスクにおける暗視野および蛍光信号の例示的なプラズモン増強を示す。 異なるサイズのナノディスクにおける暗視野および蛍光信号の例示的なプラズモン増強を示す。 異なるサイズのナノディスクにおける暗視野および蛍光信号の例示的なプラズモン増強を示す。 異なるサイズのナノディスクにおける暗視野および蛍光信号の例示的なプラズモン増強を示す。

図１Ａは、多重化単一ＥＶ解析の手順ステップの図である。図１Ｂは、ナノプラズモンアレイにおける周期的なナノホールの画像である。図１Ｃは、ナノプラズモンアレイのナノホール表面の増強された電磁場を示す画像である。図１Ｄは、ガラスおよびナノプラズモン基板上の蛍光ナノスフェアの画像である。図１Ｅは、ガラス基板およびナノプラズモン基板の画素強度のヒストグラムである。図１Ｆは、ガラスおよびナノプラズモン基板上の蛍光ナノ構造体の蛍光強度を示す棒グラフである。図１Ｇは、ナノプラズモンアレイの拡大図を示す画像である。

図２Ａは、多重化単一ＥＶ解析用の光学系の概略図である。図２Ｂは、ナノプラズモンアレイの顕微鏡画像である。

図３Ａは、異なるフルオロフォア結合ビオチン結合タンパク質をコーティングした基板の一連の画像である。図３Ｂは、異なるフルオロフォア結合ビオチン結合タンパク質の強度プロファイルを示す棒グラフである。図３Ｃは、異なるフルオロフォア結合ビオチン結合タンパク質の蛍光強度を示す棒グラフである。図３Ｄは、異なるフルオロフォア結合ビオチン結合タンパク質の吸収／発光スペクトルを示すグラフである。図３Ｅは、ナノプラズモンアレイのガラスおよび基板上に捕捉されたＥＶの一対の画像である。図３Ｆは、ナノプラズモンアレイのガラスおよび基板上に捕捉されたＥＶの強度を示すグラフである。図３Ｇは、ナノプラズモンアレイのガラスおよび基板上のＥＶの数を示す棒グラフである。図３Ｈは、接着剤層を有するナノプラズモンアレイのガラスおよび基板上に捕捉されたＥＶの一対の画像である。図３Ｉは、接着剤層を有するナノプラズモンアレイのガラスおよび基板上に捕捉されたＥＶの強度を示すグラフである。図３Ｊは、接着剤層を有するナノプラズモンアレイのガラスおよび基板上のＥＶの数を示す棒グラフである。

図４Ａは、異なる蛍光抗体で捕捉されたＥＶの一連の顕微鏡画像である。図４Ｂは、基板上の異なる位置の異なる蛍光抗体を有するＥＶの強度を示す一連のグラフである。図４Ｃは、異なる蛍光抗体を有するＥＶの数／割合を示す一連の棒グラフである。

図５Ａは、腫瘍マーカーＥＧＦＲに対して標識されたＥＶの一連の顕微鏡画像である。図５Ｂは、腫瘍マーカーＥＧＦＲｖＩＩＩに対して標識されたＥＶの一連の顕微鏡画像である。図５Ｃは、異なるＥＶにおけるＥＧＦＲ発現を示すゲルの図である。図５Ｄは、異なるＥＶ中のＥＧＦＲの割合を示す棒グラフである。図５Ｅは、異なるＥＶ中のＥＧＦＲｖＩＩＩの割合を示す棒グラフである。

図６Ａは、ＥＶ集団を分類する決定木を示すフローチャートである。図６Ｂは、異なるマーカーについて陽性のＥＶ集団を示す一連のグラフである。図６Ｃは、異なるマーカーについて陽性のＥＶ集団を示す一連のグラフである。図６Ｄは、ＥＶ検出およびマーカーのプロファイリングを示す棒グラフである。図６Ｅは、ＥＶ検出およびマーカーのプロファイリングを示す棒グラフである。図６Ｆは、ＥＶ検出およびマーカーのプロファイリングを示す棒グラフである。図６Ｇは、ＥＶ検出およびマーカーのプロファイリングを示す棒グラフである。

図７Ａは、Ｇｌｉ３６－ＷＴおよびＧｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩから単離されたＥＶのサイズ分布を示すグラフである。図７Ｂは、Ｇｌｉ３６－ＷＴおよびＧｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩから単離されたＥＶの発現レベルを示すゲルの一連の画像である。

図８Ａは、異なるマーカーに対して標識されたＥＶの一連の顕微鏡画像である。図８Ｂは、異なるＥＶ濃度下で異なるマーカーに対して標識されたＥＶの割合を示す一連の棒グラフである。

図９Ａは、ＥＧＦＲに対して標識されたＥＶの感度および特異性を示す一対の顕微鏡画像である。図９Ｂは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対して標識されたＥＶの感度および特異性を示す一対の顕微鏡画像である。

図１０Ａは、レジスト層にナノロッドをインプリントするステップの概略図である。図１０Ｂは、インプリント型をパターニングするステップを示す概略図である。図１０Ｃは、金ナノロッドを堆積し、マスクを剥離するステップの概略図である。図１０Ｄは、金ナノロッドに結合するＥＶを検出するためのナノプラズモンアレイの使用を示す概略図である。

図１１Ａは、プラズモン増強単一ＥＶ検知技術（ＮＥＸＴ）用のナノロッドを含むナノプラズモンアレイの一例を示す概略図である。図１１Ｂは、ナノロッドに結合したＥＶの顕微鏡画像の図である。図１１Ｃは、ナノロッドアレイの顕微鏡画像の図である。図１１Ｄは、ナノロッド上の異なる位置に結合したＥＶの顕微鏡画像の図である。

図１３Ａは、ナノロッド上で捕捉されたＥＶの側面図である。図１３Ｂは、ナノディスクの上面図である。図１３Ｃは、ナノディスクの上面図の画像である。図１３Ｄは、直径の異なるナノディスクの散乱強度を示すグラフである。図１３Ｅは、直径の異なるナノディスクのピークシフトを示すグラフである。図１３Ｆは、ナノロッドの上面図である。図１３Ｇは、直径の異なるナノロッドの散乱強度を示すグラフである。図１３Ｈは、直径の異なるナノロッドのピークシフトを示すグラフである。

図１４Ａは、対応するグラフと共に、第１のＥＶ結合位置およびその検出されたピーク波長のシナリオ１の図である。図１４Ｂは、電磁波を示す顕微鏡画像と共に、第２のＥＶ結合位置およびその検出されたピーク波長のシナリオ２の図である。図１４Ｃは、電磁波を示す顕微鏡画像と共に、第３のＥＶ結合位置およびその検出されたピーク波長のシナリオ３の図である。図１４Ｄは、表面までの様々な距離（ｚ）でのＥＶ結合時のナノディスクの暗視野散乱スペクトルの図であり、ＥＶとナノディスクとの間の距離に応じて異なるレベルのスペクトルシフトを示す。図１４Ｅは、ガラス基板上のナノディスクの断面における電磁場の図であり、ナノディスク表面上の集中した電磁場を示す。図１４Ｆは、ガラス基板上のナノディスク上の電磁場の上面図であり、ナノディスクの側面に沿った集中した電磁場を示す。

図１５Ａは、ＥＶ結合前のナノディスクの代表的な暗視野散乱画像である。図１５Ｂは、ＥＶ結合後のナノディスクの代表的な暗視野散乱画像である。図１５Ｃは、図１５Ａおよび図１５Ｂに示すナノディスク上のＥＶの暗視野散乱強度の経時変化を示す代表的なグラフである。図１５Ｄは、図１５Ａおよび図１５Ｂに示すナノディスク上の対照についての暗視野散乱強度の経時変化を示す代表的なグラフである。

図１８Ａは、ナノディスクの異なる直径に対応する暗視野のプラズモン強度である。図１８Ｂは、ナノディスクの異なる直径に対応するＴＲＩＴＣのプラズモン強度である。図１８Ｃは、ナノディスクの異なる直径に対応するＣｙ５のプラズモン強度である。図１８Ｄは、ナノディスクの異なる直径に対応するＣｙ５．５のプラズモン強度である。

様々な図面における同様の参照符号は、同様の要素を示す。

詳細な説明
本開示は、標的細胞外小胞（ＥＶ）を検出するためのシステム、方法、およびデバイスに関する。ＥＶは、特定の疾患、例えばとりわけ癌、心血管疾患、神経変性疾患、および感染症を監視または診断するための指標として使用することができる複数の表面バイオマーカーを有する。特に、新しいシステムおよび方法は、アルツハイマー病および他の神経変性疾患を検出および診断するために、ならびに例えば病原体由来の物質を含有する免疫細胞を解析することによって、ウイルス、細菌および／または寄生虫を検出するために使用することができる。

しかしながら、それらの固有のサイズ（５０～１０００ｎｍ）は、従来の解析方法において技術的課題を課し、しばしば可変の知見をもたらしている。さらに、ＥＶは、特にＥＶ試料が十分な数のＥＶを含まない場合、またはタンパク質および／または小胞内マーカーの存在量が少ない場合、弱い検出信号を提供することが多く、これにより、臨床試料中のＥＶの組成および分子プロファイルを決定することができる高感度で堅牢な標準化されたアッセイを実行することが困難になる可能性がある。

本開示は、これらの問題に対する解決策を提供し、個々の光学信号を増幅することによって単一のＥＶを標的化して、標的ＥＶの正確で精密な多重化解析を達成することを可能にする。単一のＥＶを解析することにより、細胞特異的ＥＶの固有の分子プロファイルを明らかにすることができ、これにより、例えば、異なる生物学的パラメータ（例えば、細胞起源、細胞状態）ごとに包括的なＥＶ「アトラス」を構築するためのＥＶの臨床使用がさらに促進される。

本開示のナノプラズモンシステムは、改善された感度で標的膜および小胞内マーカーの多重化単一ＥＶ解析を可能にする。具体的には、光学信号、例えば蛍光は、プラズモン金属ナノ構造体を使用して増幅され、高感度のマルチチャネルＥＶバイオマーカープロファイリングを提供する。増強は、例えば、ナノホール、ナノロッド、ナノディスク、ナノウェル、ナノスクエア、ナノグルーブ、または任意の適切な周期的金属ナノ構造体などのナノ構造体の周期的アレイを有する基板を使用することによって達成することができる。銅またはアルミニウムのフィルムまたは基板をＵＶ照明に使用することができ、銀および金を可視波長照明に使用することができる。一般に、基板は、金属膜の下で使用される場合、ガラスまたはプラスチックなどの非金属の非導電性基板であるが、金属、金属酸化物、および半導体も基板として使用することができる。

例えば、Ａｕナノホールの周期的アレイは、ＥＶに適した長距離（約１００ｎｍ）に拡張された表面プラズモン共鳴を支持する。さらに、共鳴波長は、ナノホールの周期性およびサイズを調整することによって容易に調整することができる。同じことを、ナノロッドまたはナノディスクの形態のナノ構造体を用いて行うことができる。一実施形態では、本明細書に記載の増強された蛍光検出（ｎＰＬＥＸ－ＦＬ）を用いたナノプラズモン細胞外小胞解析は、他の光学信号を使用する同様の方法と共に、検出感度を改善し、多重化ＥＶ解析を達成する単純で堅牢な信号増幅戦略を提供する。

ナノプラズモンアレイの調製
本明細書で使用されるナノプラズモンアレイは、基板と、基板上または基板内の複数のナノ構造体と、ナノ構造体上またはナノ構造体に隣接して固定された複数のアフィニティーリガンドとを含む。ナノ構造体を作製するために使用される金属および基板（例えば、ガラス）には、例えば、ナノロッドまたはナノディスクの表面、ナノグルーブ内、およびナノホール内の壁、またはナノホールに隣接する基板もしくは金属膜上で、アフィニティーリガンドをナノ構造体に選択的に固定するために、異なる表面化学（アフィニティーリガンドへの結合）を使用することができる。複数のナノ構造体は、基板上にナノ構造体の周期的アレイを形成するように配置され、ナノ構造体の周期的アレイは、電磁放射の１つまたは複数の特定の波長を増幅するように配置され寸法決めされる。

いくつかの実施形態では、複数のアフィニティーリガンドは、ナノ構造体上またはナノ構造体に隣接して固定され、複数のアフィニティーリガンドは、捕捉剤を介して標的ＥＶに選択的に結合する。異なるタイプのアフィニティーリガンドを、対応するＥＶ調製物に基づいてナノプラズモンアレイに使用することができる。例えば、高親和性結合対の中で、ナノプラズモンアレイの基板は、基板に結合したそれらのアフィニティーリガンドとしてビオチン結合タンパク質（例えば、アビジン）を選択し、次いで、標的ＥＶは、ナノプラズモンアレイによって捕捉される捕捉剤として、対応するビオチンを含む必要がある。いくつかの実施形態では、基板は、半導体、非導体、プラスチック、または任意の適切な透明基板を含む。対応する捕捉剤をＥＶに付着させる方法を以下に説明する。

本発明者らは、単一ＥＶ検出用の新しいナノプラズモンセンシングプラットフォームを使用して、単一ＥＶ解析用の高度なナノプラズモンＥＶセンシングプラットフォームを開発した。ＮＥＸＴ（ナノ構造ベースの細胞外小胞技術）と呼ばれるシステムは、金属、例えば金、銀、銅、またはアルミニウム、ナノ構造体、例えばナノホール、ナノロッド、またはナノディスクのアレイを、単一のＥＶが占めることができる２００ｎｍ未満の寸法で含む。例えば、金ナノロッドは、ナノロッドの寸法を調整することによって、単一分子検出までの高い感度および共鳴波長の正確な調整可能性を有する。ナノ構造体のアレイは、標準的なナノインプリントリソグラフィ技術を使用して、高度なインプリントおよび堆積プロセスによって再現性よく作製することができる。

各ナノ構造体、例えばナノロッド上の個々のＥＶの捕捉は、スペクトルシフトを誘発する。ナノロッドアレイからのシフトは、暗視野撮像によって同時に検出される。広範な検証研究を、ベンチマーク１）単一ＥＶ検出感度、２）標的ＥＶ亜集団を捕捉するための特異性、および３）堅牢性および再現性について行った。

金属、例えば金、ナノ構造、例えばナノロッドの高密度アレイ（例えば、１０^５アレイ／ｃｍ^２）は、単純なインプリントおよび金堆積プロセス（図１０Ａ～図１０Ｄ）によってウェハスケールで金ナノロッドアレイをパターニングすることができる新しいナノインプリントリソグラフィ法を使用して作製することができる。この技術は、薄いレジスト層でコーティングされた標的基板に転写されるナノパターンを有する再利用可能なシリコン型を利用する（図１０Ａ～図１０Ｂ）。インプリント後、パターニングされた領域上に金が堆積される、その後レジストを除去すると、ガラス基板上にナノロッドアレイが残る（図１０Ｃ）。本発明者らは以前に、既知の製造方法（ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１１，５，７５５５－７５６４，２０１１；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８４，６０３１－６０３９，２０１２）を使用して様々な金属ナノ構造体を高密度で作製した。これらの方法を使用して、典型的なｎａｎｏｆａｂ設備を使用して、４時間で各製造サイクル当たり１０個のチップまたは１週間で１００個のチップ（１０サイクル×１サイクル当たり１０個のチップ）を製造することができ、これはその後の生物学的実験に十分なチップ製造速度である。この大量生産プロセスは、簡単で再現性があり、スケーラブルである。電子ビームリソグラフィを使用して、ナノ構造体を高精度でパターニングすることもできる。

周期的なナノホールは、基板上に薄い（厚さ５０～２００ｎｍ）金膜をパターニングすることによって作製される。ナノホールは、集束イオンビームミリングまたはリソグラフィおよび金属エッチングによって直接パターニングすることができる。深紫外線（ＤＵＶ）リソグラフィを使用して、金膜上にスピンコート塗布されたレジスト上に２００ｎｍの周期的円形パターンを作製する。さらに、レジストをエッチングマスクとして使用して、反応性イオンエッチングまたはイオンミリングにより下地の金膜をエッチングする。レジスト除去は、金膜に作製された金ナノホールパターンを明らかにする。

包括的な３次元コンピュータ計算によってアレイチップを設計し、一例では、８０ｎｍ（長さ）×３０ｎｍ（幅）×２０ｎｍ（高さ）のナノロッド寸法が、１００ｎｍＥＶ（平均直径）検出の最大感度を達成することを見出し、アレイセンサの寸法および感度を実験的に試験した。金ナノロッドの寸法が１００ｎｍを下回ると、各ナノロッド上での単一のＥＶの捕捉も可能になる。ナノロッド間に３μｍの間隔を有する金ナノロッドアレイは、ナノロッドアレイ上のＥＶの均一な分布を可能にする。個々のＥＶからの信号は、１０倍以上の対物レンズを使用して明確に分解される。チップ内のナノロッドの総数は、ナノインプリント型サイズで容易に拡張可能である。例えば、マイクロアレイスポッター（ＭｉｃｒｏＳｙｓ、Ｄｉｇｉｌａｂ Ｉｎｃ）を使用して、アフィニティーリガンドでチップを選択的に機能化することができる。スポッターを用いて、０．１μＬの溶液を９６ウェルプレートから移し、設計された領域に良好な再現性（５％未満の変動）でスポットする。温度および湿度は、一貫した試料スポッティングおよびインキュベーション条件のために、スポッターチャンバ内で制御される。

金属、例えば金、ナノ構造、例えばナノロッドは、共鳴波長で固有の暗視野光散乱ピークを示す。ナノロッド表面へのＥＶ結合は局所屈折率を増加させ、ピーク波長をレッドシフトさせる。スペクトルシフト（すなわち、ＥＶ結合）は、固定波長での光強度変化を測定することによっても検出することができ、スペクトル測定値と強度測定値との間には優れた相関がある。強度測定方法は、視野内のアレイ全体からの高スループット並列信号読み取りに使用することができる。この手法は、過去のシステムおよび方法で使用された逐次スペクトル測定よりもはるかに速い。暗視野撮像はまた、同じ設定での分子ＥＶプロファイリングのための落射蛍光測定に対応している。

ＥＶ、例えば腫瘍由来ＥＶをナノロッド上に捕捉し、ナノロッド表面へのＥＶ結合によって誘導される強度変化を示すナノロッドの数によって測定することができる。有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）解を使用したコンピュータ計算は、単一の１００ｎｍＥＶ結合が１０ｎｍを超えるシフトを誘導し、暗視野強度測定によって十分に大きなシフトが容易に検出されることを示す。信号はまた、捕捉されたＥＶのサイズと相関し、ＥＶサイズ測定を容易にする。一度、較正のためにサイズ標準ナノスフェアを使用し、結果をナノ粒子追跡解析（ＮＴＡ）システムによって得られたものと比較することができる。分子プロファイリングと組み合わせて、サイズ情報を使用してＥＶサブタイプ（例えば、エキソソーム対微小胞）を識別することができる。

暗視野撮像を使用することにより、アレイ全体からの読み出し信号を同時に測定することができる。強度測定は、膨大なアレイの読み出しにおいてスペクトル測定よりもはるかに高いスループットを提供する。光源温度の変化に起因する信号ドリフトまたは変動を回避するために、温度コントローラを実装して、光源温度を安定させる、および／または信号平均の数を増加させて背景ノイズを低減することができる。

図１１Ａ～図１１Ｄは、プラズモン増強単一ＥＶ検知技術（ＮＥＸＴ）用のナノロッドを含むナノプラズモンアレイの一例を示す。図１１Ａは、格子状に作製された金ナノロッドアレイからなるＮＥＸＴチップセンサの概略図である。ナノロッドの小さな表面積は、各ナノロッド上の単一のＥＶ結合を可能にする。図１１Ｂは、金ナノロッド（スケールバー：５０ｎｍ）上に捕捉されたナノスフェアの走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。図１１Ｃは、電子ビームリソグラフィによって作製されたナノロッドアレイのＳＥＭであるが、ナノインプリントリソグラフィ（スケールバー：５００ｎｍ）を用いて作製することもできる。図１１Ｄは、ナノロッド（スケールバー：２００ｎｍ）上のＥＶを模倣する単一ナノスフェアの結合を示すＳＥＭである。捕捉されたＥＶを、プラズモン増強蛍光検出を用いたハイスループットマルチチャネル解析のための免疫蛍光プローブによって標識する。捕捉されたＥＶは、ナノロッド間の距離によって均等に分布する。これにより、解析の精度が向上する。

ＥＶの単離および調製
生物学的試料を、例えばヒトまたは他の被験体から得て、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｅｌｌｇｒｏ）などの培養培地中で細胞を培養することができる。培地に血清、例えば１０％ウシ胎児血清、抗生物質、例えばペニシリンおよび／またはストレプトマイシンを補充し、５％ＣＯ２下で維持することができる。例えば、Ｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｏｎ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，２０２０，４，２００００３．ＤＯＩ：１０．１００２／ａｄｂｉ．２０２０００００３を参照されたく、これは、全ての図および参照引用を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ＥＶは、標準的な超遠心分離（ＵＣ）法およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法の両方を使用して単離することができる。さらに、ＥＶは、次のプロセスのために培地から単離される。ＵＣの場合、濾液を例えば１００，０００×ｇで１時間濃縮する。上清を除去した後、ＥＶペレットを、例えばＰＢＳで洗浄し、再度、例えば１００，０００×ｇで１時間遠心分離する。ＥＶペレットを緩衝液または血清、例えばＰＢＳに再懸濁する。ＳＥＣの場合、濾液をフィルター、例えばＭＷＣＯ＝１０ｋＤａに負荷し、例えば３５００×ｇで３０分間、４°Ｃで遠心分離する。濃縮後、体積を、例えばＰＢＳを用いて１ｍＬに調整する。

ＥＶは、異なるバイオマーカーおよびそれぞれのアフィニティーリガンド対ならびにそれらの製造者の指示を使用して選択することができる。

ＥＶ標識および解析プロトコル
ＥＶ解析は、本明細書に記載のｎＰＬＥＸ－ＦＬプロトコルに基づいて行われ、これは、ＥＶ解析のために標的ＥＶを検出するために複数の蛍光標識、ラマン信号、および暗視野散乱信号を使用することを含む。蛍光検出の場合、ＥＶは、アフィニティーリガンドと結合した蛍光プローブによって標識される。ラマン検出の場合、表面膜上またはＥＶの内部の分子を直接検出することができ、またはＥＶはアフィニティーリガンドと結合したラマンプローブによって標識される。暗視野散乱検出の場合、ＥＶからの散乱信号を標識なしで直接検出することができる。ナノプラズモンアレイのナノ構造体は、ＥＶに特異的に結合する捕捉剤に結合するアフィニティーリガンドで標識され、次いで、基板が十分な数のＥＶに結合することを確実にするのに十分な時間、基板を生物学的試料に曝露する。一実施形態では、ビオチン化ＥＶをニュートラアビジン被覆ナノ構造体上に捕捉し、引き続いて固定／透過溶液中でＥＶ固定および透過処理する。表面不動態化は、表面を（ＥＶの有無にかかわらず）ブロッキング溶液（スーパーブロックＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に２０分間置くことによって達成することができる。このステップは、望ましくない非特異的結合を最小限に抑えるために重要である。捕捉されたＥＶは、最初に１次抗体で、次いで適合性の２次抗体で、２段階の間接標識によって染色される。ステップ間で十分な洗浄を行う。

ＥＶは、ストレプトアビジンなどの捕捉剤で標識される。最後に、標識されたＥＶを、捕捉剤を介して封入溶液でナノ構造体に付着させ、ガラス製カバースリップで覆う。本開示において使用することができる抗体を以下の表１に列挙する。１次抗体はＥＶの表面の特定のバイオマーカーに特異的に結合するために使用され、２次抗体は１次抗体に特異的に結合するために使用される。さらに、２次抗体は、画像処理に使用されるレポーター基、例えば蛍光プローブ、またはストレプトアビジンなどの捕捉剤と結合される。アッセイ緩衝液は、例えば、ＢＤ透過／洗浄緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であり得る。

具体的な使用に基づいて、任意の他の抗体も本開示において使用することができる。ＥＶの異なるバイオマーカーを考慮して、対応する抗体を選択することができる。異なる疾患および目的に関連するＥＶバイオマーカーを以下の表２に列挙する。

本開示のいくつかの実施形態では、補足されたＥＶの画像処理は、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）およびＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）などの画像解析ソフトウェアを使用して実行される。ストレプトアビジン撮像チャネルは、捕捉されたＥＶの位置を特定し、関心領域をマスクとして定義するために使用される。各分子標的（例えば、ＥＶの膜上または内部のタンパク質）について、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）プラグイン（スタック内のスライス整列）を使用して、標的分子からの対応する蛍光画像を整列させる。各マスク位置において、平均画素強度が得られる。信号は、マスクを取り囲む背景信号を減算することによって補正される。

使用方法
新しい方法およびナノプラズモンアレイを使用して、複数のシナリオで単一のＥＶを解析することができる。例えば、腫瘍由来ＥＶは、原発性腫瘍細胞を反映するタンパク質およびＲＮＡマーカーを含み、新しいナノプラズモンアレイセンサは、臨床試料から直接腫瘍ＥＶを迅速かつ高感度に検出することができる。したがって、ＥＶ解析は、癌を診断し、治療に対する長期腫瘍応答を監視するための説得力のある臨床的可能性を提供する。

本明細書に記載の高感度単一ＥＶ検出プラットフォームは、ＥＶ生物学の理解を著しく改善し、臨床検体からのＥＶの迅速かつ信頼性の高いスクリーニングを可能にし、治療中の微妙な表現型変化の解析を可能にする。重要なことに、これは、ＥＶがそれらの原発腫瘍対応物とどのようにうまく整列するか、およびＥＶ数および／または分子プロファイルが癌の進行または治療応答に対するさらなる洞察を提供するかどうかを当分野が理解するのに役立つだろう。長期的には、血液中でのハイスループットＥＶプロファイリングの成功は、他の臨床的に根拠のあるスクリーニング研究（例えば、他の体液および癌型のＥＶ）への道を開くであろう。これにより、臨床現場における癌ケアのための日常的なスクリーニング検査としてのＥＶ解析の臨床的採用を有意に加速するためのよりアクセスしやすいツールがもたらされる。本明細書に記載の単一ＥＶ検出プラットフォームは、腫瘍または特定の器官に由来する個々のＥＶを同定し、標的亜集団からのＥＶの膜上または内部の特定の標的分子を検出することを可能にするが、他の方法では希釈されるかまたは非標的起源からのＥＶによっては検出されない。標的特異的腫瘍または器官からのＥＶの分子プロファイリングは、起源細胞の分子状態を示すことができる。

数値シミュレーション
さらに、数値シミュレーションを適用して、共鳴ピーク波長を計算し、最大光学信号増幅のための標識の選択を決定し、ナノ構造体の寸法および材料を最適化することができる。電気力学的計算は、有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）法を使用して実行することができる。電場分布では、ｚ方向に沿ってｘ偏波の平面波を照射する。２ｎｍのメッシュサイズは、ナノホールの中心に位置する０．３×０．３×０．２μｍ^３の体積に使用される。周期的境界条件がｘおよびｙ方向に沿って課され、完全整合層がｚ方向に使用される。放射減衰率シミュレーションには、ｚ偏波双極子源が使用される。双極子の位置は、ナノプラズモンアレイのナノホールの縁部およびＡｕ表面の上方６ｎｍに位置するように、ｘ＝１００ｎｍ、ｙ＝０ｎｍおよびｚ＝６ｎｍに設定される。

さらに、統計解析およびデータプロットは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（登録商標）で行うことができる。群差を、対応のないｔ検定を用いて試験する。全ての検定は両側であり、０．０５未満のＰ値は統計学的に有意であると考えられる。

一般的な方法
図１Ａ～図１Ｇは、多重化単一ＥＶ解析用のナノプラズモンアレイの一例を示す。図１Ａは、ＥＶの捕捉から始まり、捕捉されたＥＶの標識、標識されたＥＶの画像の撮影、およびＥＶの画像の解析を含む多重化単一ＥＶ解析の手順ステップを示す。ＥＶをナノホール表面に捕捉し、蛍光検出プローブによって免疫染色し、次いで標識されたＥＶを異なる蛍光チャネルで撮像し、それらの強度を解析する。例えば、ＥＶは、アフィニティーリガンドを介してＡｕナノホール表面に捕捉される（例えば、アビジン被覆Ａｕナノホール表面上のビオチン化ＥＶの捕捉）。次いで、捕捉されたＥＶを、異なる色チャネル（典型的には３～４色）で蛍光標識抗体によって免疫染色する。フルオロフォアの吸収および発光スペクトルに応じて、蛍光信号は、下にあるＡｕナノホール構造によって励起される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって増幅される。

図１Ｂは、ナノプラズモンアレイにおける周期的ナノホールの走査型電子顕微鏡写真を示す。ナノホールの直径は約２００ｎｍであり、周期性は５００ｎｍである。図１Ｂのスケールバーは１μｍである。図１Ｂのナノ構造体はＳＰＲ基板として最適化されており、基板は厚さ１００ｎｍのＡｕ膜である。

図１Ｃは、ナノプラズモンアレイのナノホール表面に閉じ込められた増強された電磁場を示す有限差分時間領域シミュレーションを示す。強い場は、プラズモン増強蛍光信号によるものである。チップ表面への周期的なナノホール付与は電磁場を集中させ、最大電場強度が最大３００倍になる。共鳴場はｚ方向に１１０ｎｍまで延在し、これは主に小さなＥＶ（例えば、１００ｎｍの平均直径を有するエキソソーム）をカバーする。局所的な近接場に加えて、共鳴範囲内の近位フルオロフォアとＡｕナノ構造との相互作用によって蛍光放射をさらに増強することができる。

図１Ｄは、ガラスおよび本ナノプラズモン基板上の蛍光ナノスフェア（Ｃｙ５を使用、２００ｎｍ）の画像を示す。図１Ｄのスケールバーは１０μｍである。蛍光ナノスフェア（Ｃｙ５、２００ｎｍ）を使用したｎＰＬＥＸチップのＡｕナノホール構造体によるプラズモン増強蛍光を、ガラス基板と比較して試験する。また、図１Ｅは、ガラス基板と本ナノプラズモン基板の画素強度のヒストグラムの一例を示している。これは、個々のナノスフェアの蛍光強度がｎＰＬＥＸ－ＦＬ基板上で有意に高いことを示す（両側ｔ検定、ｐ＜０．０００１）。図１Ｆは、ガラスおよびナノプラズモン基板上の蛍光ナノスフェアの平均蛍光強度を示す。平均蛍光強度は１８倍に増加し、信号対雑音比（ブランクの３倍の標準偏差で割った信号によって与えられる）は、１７．７（ガラス）から３５８（ｎＰＬＥＸ－ＦＬ）まで２０倍に増加する。ガラス（３６．２％）とｎＰＬＥＸ－ＦＬ基板（３３．６％）との間の蛍光強度について、平均に対する標準偏差の比によって与えられる変動係数に有意差はなく、信号増幅が強度変動を増加させないことを示す。

図１Ｇは、ナノホールの周りの増強された電磁場を示す有限差分時間領域シミュレーションを示す。走査型電子顕微鏡は、官能基化Ａｕナノホールチップによって捕捉されたＥＶを示す。点線の円は、ナノホールの周りの増強された電磁場分布を表す。

デュアルモード撮像装置
図２Ａは、暗視野撮像をマルチチャネル蛍光撮像と統合する、多重化単一ＥＶ解析（ＮＥＸＴ読み出しシステム）用のナノプラズモンアレイの光学系の一例を示す。図２Ａは、暗視野（透過）および落射蛍光デュアルモード撮像用の例示的な直立顕微鏡構成１０を示す。光学設定の電荷結合素子（ＣＣＤ）２０を使用して、ナノプラズモンアレイ上で捕捉された標識された標的ＥＶ上のレポーター基（例えば、蛍光抗体）によって放射、散乱、または反射された電磁放射を捕捉することができる。いくつかの実施形態では、直立顕微鏡構成１０は、電磁放射線を処理／フィルタリングするためのフィルタセット２２と、ナノプラズモンアレイを有する基板が対物レンズ２４の下に配置される顕微鏡ステージ２６と、フィルタセット２２によって処理された放射線を捕捉するためのカメラ、例えばＣＣＤ２０とを含む。システムはまた、ステージ２６の下方に配置された暗視野コンデンサ２８と、上方から顕微鏡ステージ２６を照明するように配置された１次光源３０と、下方から顕微鏡ステージ２６を照明するように配置された２次光源３２とを含む。いくつかの実施形態では、暗視野散乱撮像は、ナノプラズモンアレイを下方から照明して、ナノプラズモンアレイから放射、散乱、または反射された電磁放射を対物レンズ２４を介して捕捉するために使用される。いくつかの例では、暗視野散乱撮像システムの第２の光源３２および暗視野コンデンサ２８は、対物レンズ２４の上方に配置され、顕微鏡ステージ２６を上方から照明することができる。

図２Ｂは、ナノ構造体アレイの暗視野散乱画像の一例を示す。挿入図は、ナノ構造体アレイの拡大画像を示す。いくつかの実施形態では、ナノ構造体アレイはナノロッドアレイであってもよく、各ナノロッドは２μｍ離れている。

実施例
本開示は、特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。

実施例１－ナノプラズモンアレイシステムの特性評価
本発明者らは、ＥＶのプラズモン増強を調査した。本発明者らは、ビオチン化ＥＶをガラスおよびｎＰＬＥＸ－ＦＬ基板上に捕捉し、続いて捕捉したＥＶをストレプトアビジン結合色素（Ｃｙ５、図３ＥおよびＡＦ４８８）で標識した。

上記のリソグラフィ法を用いてｎＰＬＥＸ－ＦＬチップを作製した。チップを室温で一晩、チオール化ビオチンポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ＰＢＳ中１０×１０^－３ｍ、ＰＧ２－ＢＮＴＨ－１ｋ、Ｎａｎｏｃｓ）とインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＣｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）のいずれかと結合したストレプトアビジン分子の等モル混合物を１０分間インキュベートした。他のチャネルと比較して弱い蛍光信号のために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合ストレプトアビジン（ＰＢＳ中２５μｇｍＬ－１）を除いて、各蛍光色素の濃度を２．５μｇｍＬ－１に希釈した。

本発明者らは、ポリフェノールタンパク質ベースの生体接着層を使用して、異なる基板（ガラスおよびＡｕ）上の同じ量のＥＶを捕捉し、蛍光強度および検出可能なＥＶ数を調査した。バックグラウンド補正後の蛍光強度に関する平均信号増強係数を測定したところ、ＡＦ４８８では１．５４、Ｃｙ５では８．６０であった（図３Ｆ）。捕捉されたＥＶの全体的な信号増強は、おそらくＥＶとストレプトアビジン単層との間の厚さの差のために、ストレプトアビジン単層コーティング（図３Ｃおよび図３Ｆ参照）よりも顕著ではなかった。電磁場は表面付近でより強い。それにもかかわらず、本発明者らは、ガラス基板と比較してｎＰＬＥＸ－ＦＬチップ上で桁違いに多い数のＣｙ５標識ＥＶを検出することができ、プラズモン増強信号増幅によって達成されるよりも高い感度を示している（図３Ｇ）。

本発明者らはまた、ナノホールチップとガラスの両方でＡＦ４８８標識ＥＶについて同等の平均画素強度およびＥＶ数を観察した（図３Ｈ参照）。これは、Ｃｙ５色素上のプラズモン増強が、そうでなければ信号増強なしでは検出されない弱い蛍光信号を有するＥＶ（ガラス基板）または弱い増強を有するＥＶ（ＡＦ４８８）を明らかにすることを示す。したがって、本発明者らは、最大の信号増強のためのその後の検証研究において、Ｃｙ５チャネルに少量のまたは重要なＥＶマーカーを割り当てる。
特に、図３Ａは、４色のフルオロフォア結合ストレプトアビジン（ＡＦ４８８、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ５．５）でコーティングされたナノプラズモンアレイ／チップの一連の蛍光画像である。図３Ａのスケールバーは２０μｍである。ナノホールアレイは、白色の破線ボックス、例えば、ＡＦ４８８を使用した蛍光画像に示される白色の破線ボックスによって強調表示された１００×１００μｍ^２のサイズの正方形領域で作製された。

図３Ｂは、図３Ａの灰色の水平破線に沿った断面強度プロファイルを示す。分子単層を使用して、異なる蛍光チャネルにおけるプラズモン増強を試験する。チオール化ビオチンポリエチレングリコール誘導体（チオール－ＰＥＧ－ビオチン）を使用してＡｕナノホール表面を官能化し、フルオロフォア結合ストレプトアビジン分子をビオチン化Ａｕ表面に固定化する。下地のＡｕ基板による蛍光消光を防止するために、Ａｕ表面をチオール－ＰＥＧ－ビオチン（１ｋＤａ、６～８ｎｍ）およびニュートラアビジン（６０ｋＤａ、４～５ｎｍ）で官能化し、その結果、厚さ１０～１３ｎｍの接着層が得られる。図３Ａおよび図３Ｂは、平坦なＡｕ領域（正方形の外側、図３Ｂ）と比較して、１００×１００μｍ^２サイズのナノホール格子の正方形領域（白色の破線ボックスで強調表示）における強い信号増強を示している。

図３Ｃは、異なる蛍光チャネルにおける蛍光強度の例示的な増強係数（ＥＦ）を示す。信号増強はＣｙ５チャネルにおいて最も支配的であり、平坦なＡｕ領域と比較してナノホール領域における蛍光強度のＥＦは２３倍である。

図３Ｄは、フルオロフォアの吸収／発光スペクトルが重ね合わされたナノホールアレイを通る例示的なプラズモン支持光透過スペクトルを示す。Ｃｙ５．５およびＣｙ３の強度もまた、ＡＦ４８８信号が３倍だけ増加しても、それぞれ１７倍および９倍増加する。異なるチャネルにおけるこれらのＥＦは、ナノホールを通じたプラズモン支持光透過とフルオロフォアの吸収／発光スペクトルとの間のスペクトル重複によって説明することができる。光透過ピークは６６７ｎｍで測定され、これはＣｙ５吸収（６４９ｎｍ）および発光（６６６ｎｍ）ピークと最も重なり、Ｃｙ５．５およびＣｙ３が続く。

図３Ｅ～図３Ｉは、ＥＶのプラズモン増強の例を示す。図３Ｅは、ビオチン化ＥＶがナノプラズモンアレイのガラスおよび基板上に捕捉され、続いて捕捉されたＥＶをストレプトアビジン結合色素で標識することを示す。捕捉されたＥＶをＣｙ５結合ストレプトアビジンで標識し、次いで撮像する。図３Ｅのスケールバーは１０μｍである。図３Ｈは、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ＤＯＰＡ）ベースの生体接着剤層でコーティングされたデバイス表面上に捕捉されたビオチン化ＥＶを示し、捕捉されたＥＶをＡＦ４８８結合ストレプトアビジンで標識し、次いで撮像した。図３Ｉは、平均蛍光強度の比較を示し、図３Ｊは、ナノホールチップとガラス基板との間の関心領域（ＲＯＩ）における図３Ｈの捕捉されたＥＶの数を示す。Ｌ－ＤＯＰＡベースの生体接着剤層を使用して、異なる基板（ガラスおよびＡｕ）上の同じ密度のＥＶを捕捉し、蛍光強度および検出可能なＥＶ数を調査した。

さらに、図３Ｆは、図３Ｅの捕捉されたＥＶの画素強度の例示的なヒストグラムを示す。バックグラウンド補正後の蛍光強度に関する平均信号増強係数を測定したところ、ＡＦ４８８では１．５４、Ｃｙ５では８．６０であった。全体的な増強は、おそらく図３Ｃに示す表面付近で最も強い局所的な電磁場に起因して、図３Ｃのストレプトアビジン単層コーティングよりも有意ではない。

図３Ｇは、ナノホールチップとガラス基板との間の図３Ｅの検出されたＥＶの数を示す。蛍光強度は、ＥＶの非存在下での平均蛍光強度と標準偏差の３倍との和によって定義されるバックグラウンド信号によって正規化される。ｎＰＬＥＸ－ＦＬチップ上で桁違い意に多い数のＣｙ５標識ＥＶがガラス基板と比較するために検出され、プラズモン増強信号増幅によって達成されるより高い感度を示している。対照的に、ＡＦ４８８標識ＥＶの同等の平均画素強度およびＥＶ計数は、ナノホールチップとガラスの両方で観察される。観察された違いは、Ｃｙ５のプラズモン誘導信号増幅が、ガラス基板上では検出されない弱い信号を有するより小さなＥＶを明らかにすることである。したがって、プラズモン共鳴とのその最大スペクトル重複のために、Ｃｙ５色素は、少量の小胞内マーカーを標識するように選択される。

実施例２－単一ＥＶ測定
本発明者らは、ｎＰＬＥＸ－ＦＬ技術を適用して、多重化単一ＥＶ解析におけるその実現可能性を実証した。本発明者らは、試験のために膠芽腫細胞株：Ｇｌｉ３６－ＷＴおよびＧｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現する）を使用した。ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲおよびその変異型（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）の増幅が神経膠芽腫で頻繁に起こるため、神経膠芽腫にとって関心のあるバイオマーカーである。以下を含むタンパク質マーカーの存在。１）ＣＤ－ｐａｎと命名された遍在性ＥＶテトラスパニンの組み合わせ（ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１）、２）ＧＡＰＤＨ、３）ＥＧＦＲ、４）ＥＧＦＲｖＩＩＩをｎＰＬＥＸ－ＦＬによって検査し、標準的な方法としてウエスタンブロッティング解析に対してベンチマークした（図６Ａおよび６Ｂを参照）。

ＥＶを馴化細胞培養培地から単離した。ナノ粒子追跡解析は、この研究で使用した単離ＥＶが５０～２００ｎｍの範囲のサイズ分布を有し、平均直径が１００ｎｍであることを示し、これも透過型電子顕微鏡写真によって確認された。単離したＥＶをビオチン化し、純粋な緩衝液（１－１０×１０^８ＥＶｍＬ－１リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈し、ニュートラアビジン被覆金ナノホール表面に捕捉した。捕捉されたＥＶを膜（すなわち、ＣＤ６３、ＥＧＦＲ）および／または小胞内マーカー（すなわち、ＧＡＰＤＨ）に対して免疫標識し、蛍光顕微鏡下で撮像した。ほとんどのＥＶは回折限界よりも小さいため、蛍光画像における検出された小胞の平均ブロブサイズは約５００ｎｍ（６３ｎｍの画素サイズを有する８画素）であった。単一ＥＶは検出可能な蛍光信号を生成し、走査型電子顕微鏡写真によって確認された。いくつかのダブレットＥＶは、ストレプトアビジンチャネルにおいてより高い強度を示した。１μｍ（または１６画素）より大きく撮像された粒子は、大きな凝集体と見なされ、本発明者らの解析では除外された。

本発明者らは、マーカー信号に基づくＥＶプロファイリングおよび亜集団選別の原理証明実証のために十分に確立されたＥＶマーカーを選択した。蛍光信号増強を考慮して、本発明者らは、１）緑色色素（ＡＦ４８８）を多量／検出しやすいマーカーに割り当て、２）遠赤色色素（Ｃｙ５）を少量／検出しにくいマーカーに割り当てた。図４Ａは、ＣＤ－ｐａｎ（ＡＦ４８８）、ストレプトアビジン（Ｃｙ３）およびＧＡＰＤＨ（Ｃｙ５）に対して標識されたビオチン化ＥＶの代表的なｎＰＬＥＸ－ＦＬ画像を示す。本発明者らは、ＧＡＰＤＨを代表的な小胞内マーカーとして選択し、これは多くの他の定量的方法（例えば、ウエスタンブロッティング、ｑＰＣＲ）の対照として一般的に使用される。本発明者らはＥＶ濃度を変化させ、捕捉されたＥＶの数をカウントした。ラインスキャン（図４Ｂ）は、個々の小胞について選択されたマーカーについて高い信号対ノイズ比および信号不均一性を示した。次いで、ＥＶのマーカープロファイリングのために生の強度データを解析した。所与のマーカーについて、本発明者らは、強度カットオフ（陰性対照の平均＋２×標準偏差）によって分離することができる２つの亜集団（マーカー陽性およびマーカー陰性）を同定した。捕捉されたストレプトアビジン陽性小胞の約４０％がＣＤ－ｐａｎ陽性であり、ＣＤ－ｐａｎ陽性ＥＶのうち、ＧＡＰＤＨを発現した割合は２５％であった（図３Ｃ）。対照試料（ＥＶなし）における偽陽性率は、ストレプトアビジン染色（１％未満）および抗体染色（０．２％未満）の両方について無視できるものであった。陰性対照データに基づいて、陽性の閾値を１％に設定した。

特に、図４Ａは、Ｇｌｉ３６－ＷＴ細胞株からのＥＶがビオチン化され、ナノホール表面に捕捉されることを示す。個々のＥＶは、蛍光Ｃｙ３－ストレプトアビジンによる染色によって検出される（左上）。分子プロファイリングのために、ＥＶを膜貫通ＥＶマーカー（ＣＤ６３）および小胞内マーカー（ＧＡＰＤＨ）に対する蛍光抗体で標識する。複数のＥＶマーカーを選択して、マーカー発現レベルに基づいて単一のＥＶを検出および分類する。ＡＦ４８８色素を多量／検出しやすいマーカーに割り当て、Ｃｙ５を少量／検出しにくいマーカーに割り当てる。図４Ａは、ＣＤ６３（ＡＦ４８８）およびＧＡＰＤＨ（Ｃｙ５）に対して標識されたＧｌｉ３６－ＷＴ由来ＥＶの代表的なｎＰＬＥＸ－ＦＬ画像を示す。ＧＡＰＤＨは代表的な小胞内マーカーとして選択され、これは多くの他の定量的方法（例えば、ウエスタンブロッティング、ｑＰＣＲ）の対照として一般的に使用される。

図４Ｂは、この例における選択されたマーカーについての高い信号対雑音を示すラインスキャンを示す。グレーのシェーディングはＥＶ位置を強調する。ラインスキャンは、個々の小胞について選択されたマーカーについての高い信号対ノイズおよび不均一性を示す。

図４ＣはＥＶサブタイピングを示す。次いで、図４Ｂに示す生の強度データを、マーカー発現およびＥＶサブタイピングについて解析する。所与のマーカーについて、本発明者らは、１００の強度カットオフによって分離することができる２つの亜集団：マーカー陽性およびマーカー陰性を同定した。捕捉された小胞の約半分はＣＤ６３を有し（４６％）、ＣＤ６３＋ＥＶのうち、ＧＡＰＤＨを発現した割合は５８％であった。ＧＡＰＤＨ＋ＥＶとＣＤ６３＋ＥＶの強い重複（９５％超）が確認される。ナノホールチップ上のＣｙ５－ＧＡＰＤＨ＋ＥＶのより高い割合が他の基板よりも観察され、これはＣｙ５レッドチャネルにおけるプラズモン由来信号増幅に起因する可能性がある。

実施例３－腫瘍診断能の実証
図５Ａ～図５Ｅは、新しいシステムおよび方法の腫瘍診断の可能性を実証するために、捕捉されたＥＶの腫瘍マーカーの測定例を示す。３つの異なる細胞株（Ｇｉｌ３６－ＷＴ、Ｇｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＣＦ７）からのＥＶをビオチン化し、ナノホールアレイ表面に捕捉し、ＥＶをＣＤ－ｐａｎマーカーパネル（ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１）ならびに図５ＡのＥＧＦＲおよび図５ＢのＥＧＦＲｖＩＩＩを含む腫瘍マーカーに対する蛍光抗体で標識した。点線の円のスポットは、図５Ａおよび図５Ｂ中の腫瘍マーカー陽性ＥＶを示す。

図５Ｃは、Ｇｌｉ３６－ＷＴ、Ｇｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびＭＣＦ－７細胞株におけるＥＧＦＲ発現のウエスタンブロット解析を示す。ＭＣＦ－７細胞は、ＥＧＦＲ発現の陰性対照としての役割を果たした。ＧＡＰＤＨに対するブロッティング抗体を、ローディングコントロールのために使用した。

図５Ｄおよび図５Ｅ中の棒グラフは、ＥＶサブタイピングを示す。割合（％）＝ＥＶ_{ＣＤ－ｐａｎ＋ｔａｒｇｅｔ}＋／ＥＶ_{ＣＤ－ｐａｎ＋}。図５Ｄに示すように、有意な割合のＧｌｉ３６－ＷＴ ＥＶがＥＧＦＲについて陽性であった（５４％）が、わずかな割合のＧｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩがＥＧＦＲについて陽性である（７％）。図５Ｅに示すように、Ｇｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩ小胞の１０％超がＥＧＦＲｖＩＩＩについて陽性であったが、Ｇｌｉ３６－ＷＴおよびＭＣＦ７は、統計学的有意性の閾値未満のＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性割合（１％未満）を示した。陰性対照を、ＥＶインキュベーションなしと同じ手順で調製した。

臨床応用の診断可能性をさらに試験するために、本発明者らは、Ｇｌｉ３６－ＷＴおよびＧｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞株から約１０^１０個のＥＶを１ｍＬのヒト血漿試料に添加した。サイズ排除カラム（Ｉｚｏｎカラム）を使用して、添加した血漿試料からＥＶを単離し、ビオチン化し、次いでチップにロード（１～５μＬ）した。捕捉されたＥＶをＣＤ－ｐａｎ（ＡＦ４８８）、ストレプトアビジン（Ｃｙ３）、およびＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｃｙ５）に対して標識した。本発明者らは、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ信号に基づいてＥＶ集団を分類するためのネステッドゲーティング戦略を用いて決定木アルゴリズムを実施した（図６Ａ）。簡潔には、Ｃｙ３結合ストレプトアビジンで標識された粒子を最初に検出し、サイズ排除（１μｍ未満）によって予備スクリーニングして、大きな凝集体を解析から除外した。ストレプトアビジンについて陽性の粒子の中で、本発明者らはＣＤ－ｐａｎマーカー（ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１）について陽性のＥＶを定義した。次いで、予備スクリーニングされたＥＶを、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩの標的神経膠芽腫マーカーでサブゲートした。本発明者らは、２つの独立した群（ＥＶ陽性および陰性）を使用してマン・ホイットニー検定の出力解析を行い、０．９の統計的出力および０．４３の効果サイズを考慮して必要なＥＶ試料サイズ（ｎ＞１００）を算出した。０．１～０．５ＥＶμｍ^－２のＥＶ表面被覆率を考慮すると、必要な最小面積は約２００～１０００μｍ^２である。しかし、本発明者らは、統計的有意性および堅牢な解析を確実にするために、全視野（ＦＯＶ）（１２０μｍ×１００μｍ）で蛍光画像（ｎ＝４）を使用し、測定ごとに数千の小胞をサンプリングした。

図６Ｂおよび図６Ｃは、単一ＥＶレベルでのバイオマーカー分布解析を示す。１２０μｍ×１００μｍのＦＯＶでの３チャネル蛍光画像からの二変量ヒストグラムをプロットした。平均して、本発明者らは、単一画像でストレプトアビジン陽性の粒子を約４２００個検出する（最小＝３６０４、最大＝５０５７個のＥＶ、図６Ｄ）。ＣＤ－ｐａｎマーカーについてストレプトアビジン陽性粒子の１０～１５％の陽性が観察された（図６Ｅ）。純粋な緩衝液（ＰＢＳ）中のＣＤ－ｐａｎ＋ストレプトアビジン＋粒子と比較して血漿試料中のＣＤ－ｐａｎ＋ストレプトアビジン＋粒子の割合が低いのは、ヒト血漿中のリポタンパク質および血漿タンパク質凝集体の存在に起因し得る。マーカープロファイリングのために、ＣＤ－ｐａｎに対して陽性である検出されたＥＶを、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの標的マーカーについてスクリーニングした。Ｇｌｉ３６－ＷＴおよびＧｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞株からのＥＶを添加した血漿試料では、検出されたＥＶの約１０～２０％が両方の試料でＥＧＦＲについて陽性であった（図６Ｆ）。しかし、ＥＶの約１０％が、Ｇｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＥＶを有する血漿試料でのみＥＧＦＲｖＩＩＩについて陽性であったが、Ｇｌｉ３６－ＷＴ ＥＶを有する他の試料は１％未満の陽性ＥＶ割合を示し、これは閾値未満である（図６Ｇ）。血漿試料と純粋緩衝液試料との間で、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩについて同等のバイオマーカー陽性が観察された。

これらの結果は、神経膠芽腫ＥＶを使用してＥＧＦＲｖＩＩＩ変異タンパク質を検出できることを示している。

実施例４－腫瘍細胞株から単離されたＥＶの特性評価
ｎＰＬＥＸ－ＦＬ技術は、多重化単一ＥＶ解析の実現可能性を実証するために拡張された。神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞株を試験のために使用した：Ｇｌｉ３６－ＷＴおよびＧｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異について陽性であるＧｌｉ３６ ＥＶのクローン。ＥＶを馴化細胞培養培地から収集し、膜濾過し、ビオチン化し、ナノホールアレイチップ表面に固定化し、膜（すなわち、ＣＤ６３、ＥＧＦＲ）および／または小胞内マーカー（すなわち、ＧＡＰＤＨ）に対して免疫標識した。この研究で使用された単離されたＥＶは、平均直径１００ｎｍで５０～２００ｎｍの範囲のサイズ分布を有し、偏在性ＥＶタンパク質マーカー（ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１、図７Ｂ）についてウエスタンブロッティングによって決定された高純度である。アビジン官能化Ａｕチップはビオチン化ＥＶ捕捉に対して高い特異性を示し、これは電子顕微鏡法によって確認された。

特に、図７Ａは、ナノ粒子追跡解析（ＮＴＡ）によって得られたＧｌｉ３６－ＷＴおよびＧｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＥＶのサイズ分布グラフを示す。図７Ｂは、バルクにおけるｐａｎ－ＣＤマーカー発現レベル（ＣＤ９／ＣＤ６３／ＣＤ８１）を決定するためのＧｌｉ３６－ＷＴおよびＧｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＥＶのウエスタンブロット測定を示す。

実施例５－濃度が変化したＥＶの特性評価
図８Ａは、ビオチン化され、ナノプラズモンアレイデバイス上に捕捉されたＯＶＣＡ４２９細胞株由来のＥＶを示す。ＥＶを馴化細胞培養培地から回収し、膜濾過し、ビオチン化し、ナノホールアレイチップ表面に固定した。捕捉されたＥＶを、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１（ＡＦ４８８）とＥＧＦＲ（Ｃｙ５）との組み合わせであるｐａｎ－ＣＤマーカーに対して標識した。ＥＶを視覚補助のために人工的に色分けした。図８Ａのスケールバーは１０μｍである。図８Ｂの３つの棒グラフは、様々なＥＶ濃度（４倍の差）および捕捉されたＥＶの数を示す。ＥＶ濃度にかかわらず、ＣＤ－ｐａｎ＋ＥＶの約半分がＥＧＦＲを発現した。本発明者らは、ＥＶをＣｙ３－ストレプトアビジンで染色することによって個々の小胞を同定した。

実施例６－試験感度を実証するための陰性対照
図９Ａ～図９Ｂは、捕捉されたＥＶの試験感度および特異性を実証するための陰性対照を示す。ＭＣＦ７細胞株からのＥＶを馴化細胞培養培地から回収し、膜濾過し、ビオチン化し、ナノホールアレイチップ表面に固定化した。ＥＶを、ＣＤ６３／ＣＤ８１／ＣＤ９（ＡＦ４８８）とＥＧＦＲ（図９Ａに示す）またはＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｃｙ５）（図９Ｂに示す）との組み合わせであるＣＤｐａｎマーカーで標識した。

陰性対照（例えば、ＥＶなし）を、ＥＶインキュベーションなしと同じ手順で調製した。図９Ａ～図９Ｂは、標的ＥＶを検出するための本ナノプラズモンアレイセンサシステムの統計的有意性を示す。

実施例７－ナノロッドアレイの光学特性評価
図１２Ａ～図１２Ｂは、ナノロッドセンサアレイの例示的な光学特性評価を示す。図１２Ａのグラフは、４０、６０、８０、１００、および１２０ｎｍの長さを有する異なるサイズのナノロッドについての光共鳴ピークを示す有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）シミュレーションの結果を示す。光学的調整は、ナノロッドの表面プラズモン共鳴による蛍光信号増強を最大化するために重要である。ナノプラズモンアレイは、解析ステップにおける標的ＥＶのサイズおよび／または他の要件（例えば、ＳＰＲの特定の波長を検出するため）に基づいて、ナノロッドの各々に対して特定のサイズ／寸法を有することができる。

図１２Ｂのグラフは、表面屈折率が１．３３から１．４５に増加するにつれての暗視野散乱のスペクトルシフトおよび強度変化の実験結果を示す。異なる混合比の水およびエタノール混合物を調製し、ナノロッドアレイに適用して屈折率を１．３３から１．４５に変化させた。スペクトルシフトの量を測定し、表面屈折率に対してプロットした。表面屈折率が１．３３のピーク波長を基準とし、スペクトルシフトを算出した。ナノロッドへのＥＶ結合は、表面屈折率を増加させ、共鳴ピークをシフトさせる。ＥＶ結合事象は、スペクトルシフトまたは散乱光強度変化のいずれかを測定することによって検出することができる。

実施例８－ナノロッド対ナノディスクの光共鳴
図１３Ａは、ナノロッド上で捕捉されたＥＶの側面図である。図１３Ｂは、アレイ内のナノディスクの上面図である。図１３Ｃは、ナノ構造体上のＥＶの上面の走査型電子顕微鏡画像である。

図１３Ｄは、ＦＤＴＤシミュレーションによって算出された、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、または２００ｎｍの直径の異なるナノディスクの散乱強度（任意単位）を示すグラフである。示されるように、散乱強度はナノディスクの直径と共に増加し、ピーク散乱強度の波長もナノディスクの直径と共に増加する。

図１３Ｅは、４０～２００ｎｍまでの直径の異なるナノディスクのピークシフト（ｎｍ）を示すグラフである。示されているように、ピークシフトは、４０ｎｍの直径のナノディスクについて最も高く、６０ｎｍ～８０ｎｍの直径で急激に低下し、次いで約１８０ｎｍで横ばいになるまで直径が増加するにつれて減少し続ける。

図１３Ｆは、長さＬおよび幅３０ｎｍのナノロッドの上面図である。図１３Ｇは、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、および２００ｎｍの長さの異なるナノロッドの散乱強度（任意単位）を示すグラフである。示されるように、ピーク散乱強度は、ナノロッドの波長および長さと共に増加する。

図１３Ｈは、４０～１２０ｎｍまでの長さの異なるナノロッドのピークシフト（ｎｍ）を示すグラフである。示されるように、ピークシフトはナノロッド長と共に減少する。
ナノプラズモンアレイは、標的ＥＶのサイズならびに標的ＥＶを検出するための他の要件（例えば、ＳＰＲの特定の波長を検出する）に基づいて、特定のサイズ／寸法のナノロッドまたはナノディスクを有するナノ構造体を有するように設計することができる。ナノロッドまたはナノディスクと同様の任意の形状をプラズモンナノ構造体として使用して、蛍光信号および暗視野信号を増幅することもできる。

実施例９－有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）シミュレーション
図１４Ａ～図１４Ｃは、基板までの異なる位置および距離におけるナノディスクへのＥＶ結合時の暗視野散乱のスペクトルシフトを示すＦＤＴＤシミュレーションを示す。

図１４Ａは、対応するグラフと共に、第１のＥＶ結合位置およびその検出されたピーク波長のシナリオ１の表現である。図１４Ｂは、電磁波を示す顕微鏡画像と共に、第２のＥＶ結合位置およびその検出されたピーク波長のシナリオ２の図である。図１４Ｃはナノディスク表面に集中した電磁波を示す顕微鏡画像と共に、第３のＥＶ結合位置およびその検出されたピーク波長のシナリオ３の図である。結果は、暗視野散乱ピーク波長のスペクトルシフトを測定することによって、様々な結合シナリオにおけるナノディスク表面への単一ＥＶ結合を検出できることを示している。

実施例１０－リアルタイムＥＶ結合実験
ナノディスクへのＥＶのリアルタイム結合を、本明細書に記載のシステムおよび方法を使用して解析した。

図１５Ａ～図１５Ｄは、暗視野散乱強度変化をリアルタイムで測定することによるＥＶ結合検出の一例を示す。タイムライン（１）は、図１５Ａに示されるように、アレイの中央（中央の円）でナノディスクにＥＶ結合する前のものである。タイムライン（２）は、図１５Ｂに示されるように、アレイの中央（中央の円）でナノディスクにＥＶ結合した後のものである。

図１５Ｃのグラフは、中央ナノディスクへのＥＶ結合時の時点（２）での急激な強度変化を示すリアルタイム測定値を示す。特に、図１５Ｃは、図１５Ａおよび図１５Ｂに示された信号差として、ＥＶがナノディスクに結合する１００秒で強度が増加することを示している（中央の円）。

図１５Ｄのグラフは、アレイ内のナノディスクのいずれにも結合を示さない２つの対照の急激な強度変化を示さないリアルタイム測定を示す。特に、図１５Ｄは、アフィニティーリガンドを有しない対照ナノディスク（図１５Ａおよび図１５Ｂの対照１および対照２）の暗視野散乱強度の経時変化を示す。ＥＶ結合はなく、したがって強度変化は測定されない。図１５Ｃおよび図１５Ｄの縦破線（１）および（２）は、図１５Ａおよび図１５Ｂを撮影した時点を示す。

実施例１１－ナノディスクの暗視野散乱のスペクトルシフト
上記の方法およびナノディスクアレイを使用して、ナノディスクによって引き起こされた暗視野散乱のスペクトルシフトを解析した。図１６Ａ～図１６Ｃは、ナノディスクによる暗視野散乱のスペクトルシフトを測定することによってＥＶ結合を検出することができる方法の結果を示す。ＥＶ結合は、ＥＶ蛍光画像との重ね合わせによって確認される。ＥＶを特異的蛍光プローブによって標識して、捕捉したＥＶを有するナノディスクの位置を特定した。

図１６Ａ～図１６Ｃは、ＥＶの蛍光チャネルおよびナノディスクの暗視野散乱のオーバーレイ画像を示しており、ＥＶがナノディスク上に捕捉されていることを示している（画像内の円）。これらのナノディスク上のＥＶ結合前後の暗視野散乱スペクトルを右側に示し、ナノディスク表面へのＥＶ結合がスペクトルシフトを誘導することを実証している。

図１６Ａの画像は、ＥＶ結合を示す蛍光信号を示す中央ナノディスクを示す。単一のナノディスクスペクトルの添付のグラフは、ＥＶ結合の前または後の正規化散乱において、わずかなスペクトルシフトを示し、シフトがないことは完全な重ね合わせを意味する。

図１６Ｂの画像は、ＥＶ結合を示す蛍光の変化を伴う中央ナノディスクを示す。単一のナノディスクスペクトルの付随するグラフは、ＥＶ結合後の正規化散乱の顕著な右方向（ピーク波長の増加）シフトを示す。

図１６Ｃの画像は、ＥＶ結合を示す蛍光信号を示すナノディスクを示す。単一のナノディスクスペクトルの添付のグラフは、ＥＶ結合の前または後に正規化散乱に有意なシフトを示さず、シフトがないことは完全な重ね合わせを意味する。

実施例１２－異なる直径のナノディスクを用いた暗視野および蛍光信号のプラズモン増強
図１７および図１８Ａ～図１８Ｄに示すように、ナノプラズモンアレイは、標的ＥＶを検出するための対応する暗視野／蛍光標識に基づく特定の直径を有するナノディスクを有するように設計することができる。ナノディスクアレイの上部に蛍光分子の単層が形成され、ナノディスクおよび基板上の蛍光信号が測定された。

図１７は、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０および２００ｎｍの異なる直径のナノディスクの暗視野および３つの異なる蛍光信号（ＴＲＩＴＣ、Ｃｙ５およびＣｙ５．５）のプラズモン増強を示す。

図１８Ａ～図１８Ｄは、異なるサイズのナノディスクに対する暗視野および蛍光信号のプラズモン増強を示すグラフである。図１８Ａは、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０および２００ｎｍのナノディスクの異なる直径に対応する暗視野測定のプラズモン強度のグラフであり、示されるように、レベルは約１８０ｎｍまで直径と共に増加し、次いで２００ｎｍでわずかに減少する。

図１８Ｂは、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０および２００ｎｍのナノディスクの異なる直径に対応するＴＲＩＴＣのプラズモン強度のグラフであり、示されるように、レベルは、１２０ｎｍまで直径と共に急激に増加し、次いで１４０ｎｍまで急激に減少し、１８０ｎｍまでわずかに減少し、次いで再び２００ｎｍまで増加する。

図１８Ｃは、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０および２００のナノディスクの異なる直径に対応するＣｙ５のプラズモン強度のグラフであり、示されるように、レベルは８０から１００ｎｍまでわずかに減少し、次いで１２０ｎｍまで直径と共に急激に増加し、次いで２００ｎｍまで減少する。

図１８Ｄは、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０および２００ｎｍのナノディスクの異なる直径に対応するＣｙ５．５のプラズモン強度のグラフであり、示されるように、レベルは８０から１００ｎｍまで同じままであり、１００から１４０ｎｍまで直径と共に急激に増加し、次いで１８０ｎｍまで急激に減少し、次いで２００ｎｍまでわずかに減少する。

ＴＲＩＣＴおよびＣｙ５は、１２０ｎｍ（直径）ナノディスク上にコーティングされた場合に最大強度を示し、一方、Ｃｙ５．５は、１４０ｎｍ直径ナノディスクで最大強度を示した。

実施例１３－ＥＶの単離および調製
ＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で増殖させたＧｌｉ３６－ＷＴ（ＡＴＣＣ）、Ｇｌｉ３６－ＥＧＦＲｖＩＩＩ（レンチウイルス形質導入によりＧｌｉ３６－ＷＴから生成）およびＭＣＦ－７細胞（ＡＴＣＣ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で培養したＯＶＣＡ４２９細胞（ＡＴＣＣ）の細胞培養物からＥＶを単離した。培地に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１００ Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を５％ ＣＯ_２中３７°Ｃで添加した。さらに、細胞株を試験し、マイコプラズマ汚染を含まなかった（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）マイコプラズマ検出キット、Ｌｏｎｚａ）。

ＥＶの単離およびビオチン化のために、ＥＶを、１％エキソソーム枯渇ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＤＭＥＭ中でＥＶ収集の前に４８時間インキュベートした。馴化培地を回収し、例えば３００×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を、例えば０．２μｍメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を通して濾過した。

標準的な超遠心分離（ＵＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法の両方を使用してＥＶを単離した：（ｉ）ＵＣについては、濾液を１００，０００×ｇで１時間の遠心分離によって濃縮した。上清を除去した後、ＥＶペレットをＰＢＳなどの緩衝液または生理食塩水で洗浄し、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。ＥＶペレットをＰＢＳに再懸濁し、（ｉｉ）ＳＥＣについては、濾液を遠心分離フィルター（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ－７０ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ（ＭＷＣＯ＝１０ ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）にロードし、３，５００×ｇで３０分間、低温、例えば４°Ｃで遠心分離した。

濃縮後、体積をＰＢＳを用いて１ｍＬに調整した。ＳＥＣは修正を加えて行った。簡潔には、底部に２０μｍの孔径を有するナイロン網（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を備えた１０ｍＬシリンジ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を調製し、１０ｍＬのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した。濃縮物を上部にロードし、ＰＢＳをカラムの上部に添加することによって一定の重力流の下で１ｍＬの６つの画分を収集した。画分４および５をＥＶ単離に使用した。これらをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－２ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ（ＭＷＣＯ＝１０ ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）にロードし、３，５００×ｇで３０分間、４°Ｃで遠心分離した。単離したＥＶを、さらなる測定まで－８０°Ｃで保存した。

単離したＥＶを緩衝液または生理食塩水、例えばＰＢＳに再懸濁し、室温で十分な時間、例えば３０分間、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）などの捕捉剤と共にインキュベートした。例えば、ＥＶタンパク質に対して２０倍モル過剰のスルホ－ＮＨＳ－ビオチンを０．５ｍＬ容量で使用した。１分子当たり約４～６個のビオチンが組み込まれる。次いで、キットの説明書に従ってＥｘｏｓｏｍｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ、ＭＷ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を利用して過剰のビオチンを除去した。調製したＥＶを、０．２２μｍ遠心フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過した。

他の実施形態
本明細書は多くの具体的な実施の詳細を含むが、これらはいずれかの発明の範囲または特許請求され得るものの範囲に対する限定として解釈されるべきではなく、特定の発明の特定の実施に特有であり得る特徴の説明として解釈されるべきである。別個の実装形態のコンテキストで本明細書に記載されている特定の特徴は、単一の実施態様において組み合わせて実施することもできる。逆に、単一の実装形態のコンテキストで説明されている様々な特徴は、複数の実装において別々に、または任意の適切な部分的組み合わせで実施することもできる。さらに、特徴は、特定の組み合わせで作用するものとして上述され、最初にそのように特許請求されてもよいが、特許請求される組み合わせからの１つまたは複数の特徴は、場合によっては、その組み合わせから削除することができ、特許請求される組み合わせは、部分的な組み合わせまたは部分的な組み合わせの変形を対象とすることができる。

本主題の特定の実施態様について説明した。記載された実装の他の実装、変更、および置換は、当業者には明らかであるように、以下の特許請求の範囲内である。動作は特定の順序で図面または特許請求の範囲に示されているが、これは、望ましい結果を達成するために、そのような動作が示された特定の順序でまたは順次に実行されること、または全ての示された動作が実行されることを必要とすると理解されるべきではない（いくつかの動作は任意選択であると考えられ得る）。特定の状況では、マルチタスク処理および並列処理が有利であり得る。

さらに、上述の実装における様々なシステムモジュールおよび構成要素の分離および／または統合は、全ての実装においてそのような分離および／または統合を必要とすると理解されるべきではなく、記載されたプログラム構成要素およびシステムは、一般に、単一のソフトウェア製品または複数のソフトウェア製品へのパッケージに一緒に統合することができることを理解されたい。

したがって、異なる実施形態および実装の上記の説明は、本開示を定義または限定するものではない。本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、他の変更、置換、および変更も可能である。

Claims (25)

1. 標的細胞外小胞（ＥＶ）を検出するためのナノプラズモンアレイであって、
   基板と、
   前記基板上にナノ構造体の周期的アレイを形成するように配置された複数のナノ構造体であって、前記ナノ構造体の周期的アレイは、前記ナノ構造体に結合したＥＶおよび／または前記ナノ構造体の近くの前記基板に結合したＥＶによって放射、散乱、もしくは反射された電磁放射線の１つまたは複数の光学信号を増幅するように、または前記ＥＶに結合したレポーター基によって放射、散乱、もしくは反射された電磁放射線の１つまたは複数の光学信号を増幅するように、配置および寸法決めされる、複数のナノ構造体と、
   前記ナノ構造体上または前記ナノ構造体に隣接して固定された１つまたは複数のアフィニティーリガンドであって、標的ＥＶに選択的に結合して、前記標的ＥＶを前記ナノ構造体または前記ナノ構造体に隣接する前記基板に結合する、１つまたは複数のアフィニティーリガンドと、を含む、ナノプラズモンアレイ。
2. 前記光学信号は、蛍光信号、ラマン信号、または暗視野散乱を含む、請求項１に記載のナノプラズモンアレイ。
3. 前記ナノ構造体は、アレイ状に配置され、かつ前記基板内または前記基板上に配置された金属膜内に形成された複数のナノホールを含む、請求項１または請求項２に記載のナノプラズモンアレイ。
4. 前記ナノ構造体は、前記基板の上面にアレイ状に配置された複数のナノロッド、ナノディスク、またはナノグルーブを含む、請求項１または請求項２に記載のナノプラズモンアレイ。
5. 前記ナノ構造体の各々は、最大サイズ、例えば直径、幅、または長さが約３０～４００ｎｍである、請求項１から４のいずれか１項に記載のナノプラズモンアレイ。
6. 前記ナノ構造体は、ナノロッドまたはナノスクエアであり、長さが約５０～約３００ｎｍ、幅が約２０～約３００ｎｍ、高さが約２０～約３００ｎｍの寸法を有するか、または前記ナノ構造体は、ナノディスクであり、直径が約５０～約２００ｎｍ、高さが約２０～約３００ｎｍの寸法を有する、請求項４に記載のナノプラズモンアレイ。
7. 前記アフィニティーリガンドは捕捉剤に結合し、前記捕捉剤は前記標的ＥＶ上の少なくとも１つの表面マーカーに結合するように構成される、請求項１から６のいずれか１項に記載のナノプラズモンアレイ。
8. 前記アフィニティーリガンドは、前記標的ＥＶ上の少なくとも１つの表面マーカーおよび／または前記標的ＥＶ内の少なくとも１つの小胞内マーカーに結合するように構成される、請求項１から５のいずれか１項に記載のナノプラズモンアレイ。
9. 前記ナノ構造体の周期的アレイは、ナノ構造体間に約４００から８００ｎｍの周期性を有する、請求項１から８のいずれか１項に記載のナノプラズモンアレイ。
10. 前記基板の上面に配置された金属膜をさらに含み、
    前記金属膜は、電磁放射線の１つまたは複数の特定の波長を増幅するように選択された周期性で前記金属膜を貫通する複数のナノホールを含み、前記周期性は、ナノホール間で約４００～８００ｎｍであり、
    前記金属膜は、前記ナノホール上に、または前記ナノホールに隣接して固定された複数のアフィニティーリガンドを含み、
    前記複数のアフィニティーリガンドは、前記標的ＥＶの表面上のマーカーに選択的に結合する、請求項１から９のいずれか１項に記載のナノプラズモンアレイ。
11. 前記金属膜は、貴金属、遷移金属、アルカリ金属、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０に記載のナノプラズモンアレイ。
12. 前記ナノ構造体および前記金属膜のいずれかまたは両方は、金、銀、アルミニウム、または白金を含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載のナノプラズモンアレイ。
13. 液体試料中の標的細胞外小胞（ＥＶ）を検出する方法であって、
    請求項１から１２のいずれか１項に記載のナノプラズモンアレイを得るステップと、
    前記液体試料中に前記ＥＶが存在する場合、前記アフィニティーリガンドに結合することを可能にする流量で前記ナノプラズモンアレイ上に液体試料を流すことによって、前記ナノプラズモンアレイ上の前記ＥＶを捕捉するステップと、
    前記ナノプラズモンアレイ上に捕捉された標的ＥＶを１つまたは複数のレポーター基で標識するステップと、
    １つまたは複数の特定の波長の第１の電磁放射線を、前記ナノプラズモンアレイ上に捕捉された標識された前記標的ＥＶに投射するステップであって、前記１つまたは複数の特定の波長の前記電磁放射線は、前記レポーター基に前記第１の電磁放射線または第２の電磁放射線を放射、散乱または反射させるように選択される、ステップと
    前記レポーター基によって放射、散乱または反射された前記第１または第２の電磁放射線を受け取るステップであって、前記ナノ構造体のナノプラズモンアレイは、前記レポーター基によって放射、散乱または反射された前記第１または第２の電磁放射線を増幅するように配置および寸法決めされる、ステップと、
    前記レポーター基によって放射、散乱、または反射された増幅された前記第１または第２の電磁放射線の画像を捕捉するステップと、を含む、方法。
14. 前記標的ＥＶの数は１，０００未満である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ナノ構造体は、前記基板または前記基板上に配置された金属膜を貫通する複数のナノホールを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
16. 前記ナノ構造体は、前記基板の上面に配置された複数のナノロッド、ナノディスク、またはナノグルーブを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
17. サイズによってＥＶを識別し、例えば１ミクロンより大きい大きな成分を廃棄するステップと、
    標的ＥＶマーカーに対する陽性に基づいて、識別された前記ＥＶから標的ＥＶを選択するステップと、
    特定の標的ＥＶを生成するために、器官または組織特異的マーカーに対する陽性によって特定の器官または組織に由来するものとして標的ＥＶを選択するステップと、
    前記特定の標的ＥＶの前記表面上の小胞外バイオマーカーに基づいて、および／または前記特定の標的ＥＶ内の小胞内バイオマーカーに基づいて、個々の特定の標的ＥＶを解析するステップと、をさらに含む、
    請求項１２から１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 液体試料中の標的細胞外小胞（ＥＶ）を検出するためのシステムであって、
    請求項１から１２のいずれか１項に記載のナノプラズモンアレイと、
    試料制御ユニットであって、
    ポンプと、
    前記液体試料中にＥＶが存在する場合、前記アフィニティーリガンドに結合することを可能にする、前記ポンプによって制御された流量で前記ナノプラズモンアレイ上に前記液体試料を流すことによって、前記ナノプラズモンアレイ上の前記ＥＶを捕捉するように構成される少なくとも１つの流体チャネルと、
    前記ナノプラズモンアレイ上に捕捉された標的ＥＶを１つまたは複数のレポーター基で標識するための少なくとも１つのアフィニティーリガンド、例えば抗体と、を含む、試料制御ユニットと、
    撮像ユニットであって、
    前記ナノプラズモンアレイ上に捕捉された標識された前記標的ＥＶに電磁放射線を投射するように構成される光源と、
    前記ナノプラズモンアレイ上に捕捉された標識された前記標的ＥＶ上の前記標的ＥＶまたはレポーター基によって放射、散乱、または反射された電磁放射線を受け取り、標識された前記標的ＥＶの画像を捕捉するように構成される電磁放射線検出器、例えばカメラまたはＣＣＤであって、前記レポーター基から反射された散乱光によって放射、散乱、または反射された前記電磁放射線は、前記ナノ構造体の周期的アレイによって増幅された１つまたは複数の波長を有する、電磁放射線検出器と、を含む、撮像ユニットと、を含む、システム。
19. 前記ナノ構造体は、アレイ状に配置され、かつ前記基板内または前記基板上に配置された金属膜内に形成された複数のナノホールを含む、請求項１８に記載のシステム。
20. 前記ナノ構造体は、前記基板の上面にアレイ状に配置された複数のナノロッド、ナノディスク、またはナノグルーブを含む、請求項１８または１９に記載のシステム。
21. 前記ナノ構造体の各々は、最大サイズ、例えば直径、幅、または長さが約３０～４００ｎｍである、請求項１８から２０のいずれか１項に記載のシステム。
22. 前記ナノ構造体は、ナノロッドまたはナノスクエアであり、長さが約５０～約３００ｎｍ、幅が約２０～約３００ｎｍ、高さが約２０～約３００ｎｍの寸法を有するか、または前記ナノ構造体は、ナノディスクであり、直径が約５０～約２００ｎｍ、高さが約２０～約３００ｎｍの寸法を有する、請求項２１に記載のシステム。
23. 前記アフィニティーリガンドは捕捉剤に結合し、前記捕捉剤は前記標的ＥＶ上の少なくとも１つの表面マーカーに結合するように構成される、請求項１８から２２のいずれか１項に記載のシステム。
24. 前記アフィニティーリガンドは、前記標的ＥＶ上の少なくとも１つの表面マーカーおよび／または前記標的ＥＶ内の少なくとも１つの小胞内マーカーに結合するように構成される、請求項１８から２２のいずれか１項に記載のシステム。
25. 前記ナノ構造体の周期的アレイは、ナノ構造体間に約４００～８００ｎｍの周期性を有する、請求項１８から２４のいずれか１項に記載のシステム。

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