CN115605742A - 增强胞外囊泡光信号的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
系统、方法和装置可用于检测目标胞外囊泡(“EV”)。方法的一个实例包括获得包括配置为放大电磁辐射的一个或多个特定波长的纳米结构的纳米等离子体阵列，使液体样品在纳米等离子体阵列上流动，任选地用一种或多种报告基团标记纳米等离子体阵列上捕获的目标EV，将电磁辐射投射到纳米等离子体阵列上捕获的标记的目标EV上，以及通过接收由EV或标记的目标EV上的报告基团发出、散射或反射的电磁辐射来捕获目标EV的图像。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月14日递交的第63/009,495号美国专利申请的权益。先前申请的公开内容被认为是本申请的公开内容的一部分(并通过引用并入本文)。
本发明根据基金号R00CA201248和R21CA217662在政府赞助下进行，其由国立卫生研究院的国家癌症研究所批准。政府对本申请享有一定的权利。
技术领域
本申请涉及增强胞外囊泡的光信号的方法，更具体地涉及少量胞外囊泡。
背景技术
胞外囊泡(EV)提供了作为癌症、心血管疾病、神经退行性疾病和传染性疾病等的循环生物标志物的新的机会。这些细胞来源的磷脂囊泡大量存在于各种体液(例如血液、脑脊液、尿液、唾液)中。更重要的是，它们携带起源于其亲代细胞的多种生物分子(脂质、蛋白质和遗传物质)，可以作为一种最小侵入性方式来探测其细胞起源的分子状态。
在进一步开发EV的潜力并加速其临床适应的过程中，一个尚未满足的关键需求是开发敏感、稳健和标准化的测定，其可以确定临床样品中EV的组成和分子特征。然而，它们独特的尺寸(50-1000nm)给传统分析方法带来了技术挑战，这常常导致不同的发现。例如，流式细胞术经常低估EV计数；小EV(即外泌体，通常小于200nm)可能由于其弱光散射而丢失，或者一组囊泡可能被计数为单个事件。传统方法，尤其是蛋白质分析方法(例如，Western印迹法、酶联免疫吸附测定/ELISA)，消耗大量样品，且涉及耗时且广泛的处理步骤，使其在临床应用中不切实际。因此，开发新的EV分子平台是将EV转化为临床相关生物标志物的关键任务。
发明概述
本公开涉及信号放大策略，以增强从存在于单个EV中的有限量生物分子产生的光信号。特别地，金属纳米结构，例如金或银纳米结构的强光学共振可用于增强光信号以显著放大从EV发射的光信号，例如荧光信号。由于等离子体增强是固有信号放大方法，在某些实施方案中，该固有方法与其他化学放大策略(例如，分支DNA条形码)相结合，以甚至进一步提高灵敏度。本公开涉及用于增强EV的光信号的方法和系统。
根据第一方面，本公开提供了用于检测目标胞外囊泡(EV)的纳米等离子体阵列，所述阵列包括或由以下组成：基底；布置为在基底上形成纳米结构的周期性阵列的多个纳米结构，其中纳米结构的所述周期性阵列的布置和尺寸设置为放大由结合至纳米结构的EV和/或结合至临近纳米结构的基底的EV发出、散射或反射的电磁辐射的一个或多个光信号，或者设置为放大由附接至EV的报告基团发出、散射或反射的电磁辐射的一个或多个光信号；以及固定在纳米结构上或临近纳米结构的一个或多种亲和配体，其中所述亲和配体选择性地结合至目标EV，以将目标EV结合至纳米结构或结合至临近纳米结构的基底。
在各种实施方案中，光信号可以是荧光信号、拉曼信号或暗场散射中的一种或多种。
在某些实施方案中，纳米结构可以包括多个纳米孔或由多个纳米孔组成，所述纳米孔布置在阵列中，并且形成于基底中或形成于设置在基底上的金属膜中。在其他实施方案中，纳米结构可以包括或由以下组成：布置于基底的顶面上的阵列中的多个纳米棒、纳米盘或纳米沟槽。
在一些实施方案中，每个纳米结构具有约30至400nm的最大尺寸，例如，直径、宽度或长度。例如，纳米结构可以是纳米棒或纳米块，并且具有约50至约300nm长度、约20至约300nm宽度和约20至约300nm高度的尺寸，或者纳米结构可以是纳米盘，并且具有约50至约200nm直径和约20至约300nm高度的尺寸。在某些实施方案中，纳米结构的周期性阵列在纳米结构之间具有约400至800nm的周期。
在一些实施方案中，亲和配体结合至捕获剂，例如抗体，其中所述捕获剂配置为结合至目标EV上的至少一种表面标志物。在某些实施方案中，亲和配体配置为结合至目标EV上的至少一种表面标志物，和/或结合至目标EV内的至少一种囊泡内标志物。
在一些实施方案中，纳米等离子体阵列还包括设置在基底顶面上的金属膜或由设置在基底顶面上的金属膜组成，其中所述金属膜包括多个纳米孔，多个纳米孔以选定周期穿透金属膜，以放大电磁辐射的一个或多个特定波长，其中在纳米孔之间有约400至800nm的周期，其中所述金属膜包括固定在纳米孔或临近纳米孔的多种亲和配体，并且其中所述多种亲和配体选择性地结合至目标EV表面上的标志物。金属膜可以是或包括例如，贵金属、过渡金属、碱金属，或以上的任意组合。在各种实施方式中，纳米结构和金属膜之一或两者是或包括或由以下组成：金、银、铝或铂。
在另一方面，本公开包括用于检测液体样品中的目标胞外囊泡(EV)的方法，所述方法包括或由以下组成：获得如本文所述或要求保护的纳米等离子体阵列；以使液体样品中的EV(如果存在的话)能够结合至亲和配体，从而捕获纳米等离子体阵列上的EV的流速，使液体样品在纳米等离子体阵列上流动；用一种或多种报告基团标记捕获在纳米等离子体阵列上的目标EV；将一个或多个特定波长的第一电磁辐射投射到捕获在纳米等离子体阵列上的标记的目标EV，其中一个或多个特定波长的电磁辐射被选择以使报告基团发出、散射或反射第一电磁辐射或第二电磁辐射；接收由报告基团发出、散射或反射的第一电磁辐射或第二电磁辐射，其中纳米结构的纳米等离子体阵列的布置和尺寸设置为放大由报告基团发出、散射或反射的第一电磁辐射或第二电磁辐射；以及捕获放大的由报告基团发出、散射或反射的第一电磁辐射或第二电磁辐射的图像。
在这些方法中，目标EV的数量可以小于1,000个。
在某些实施方案中，纳米结构包括穿透基底或穿透设置在基底上的金属膜的多个纳米孔，或者所述纳米结构包括或由以下组成：布置在基底顶面上的多个纳米棒、纳米盘或纳米沟槽。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括或由以下步骤组成：根据大小识别EV，以及丢弃例如大于一微米的大组分；基于对目标EV标志物呈阳性，从识别的EV中选择目标EV；通过对器官或组织特异性标志物呈阳性，选择起源于特定器官或组织的目标EV，以产生特定目标EV；以及基于特定目标EV表面上的囊泡外生物标志物和/或基于特定目标EV内的囊泡内生物标志物，分析单个特定目标EV。
另一方面，本公开提供了用于检测液体样品中的目标胞外囊泡(EV)的系统，所述系统包括或由以下组成：本文所述和要求保护的纳米等离子体阵列；包括泵的样品控制单元；至少一个流体通道，其被配置为以由使液体样品中的EV(如果有的话)能够结合至亲和配体，从而捕获纳米等离子体阵列上的EV的泵控制的流速，使液体样品在纳米等离子体阵列上流动；以及至少一种亲和配体，例如抗体，以用一种或多种报告基团标记捕获在纳米等离子体阵列上的目标EV；以及成像单元，其包括被配置为将电磁辐射投射到捕获在纳米等离子体阵列上的标记的目标EV的光源；以及电磁辐射探测器，例如摄像机或CCD，其被配置为接收由目标EV或捕获在纳米等离子体阵列上的标记的目标EV上的报告基团发出、散射或反射的电磁辐射，并且被配置为捕获标记的目标EV的图像，其中由从报告基团反射的散射光发出、散射或反射的电磁辐射具有由纳米结构的周期性阵列放大的一个或多个波长。
在这些系统的一些实施方案中，纳米结构包括多个纳米孔或由多个纳米孔组成，其布置在阵列中，且形成于基底中或形成于设置在基底上的金属膜中。在其他实施方案中，纳米结构包括或由以下组成：布置于基底顶面上的阵列中的多个纳米棒、纳米盘或纳米沟槽。
在系统的某些实施方案中，每个纳米结构具有约30至400nm的最大尺寸，例如，直径、宽度或长度，和/或所述纳米结构是纳米棒或纳米块，且具有约50至约300nm长度、约20至约300nm宽度和约20至约300nm高度的尺寸，或者其中所述纳米结构是纳米盘，且具有约50至约200nm直径和约20至约300nm高度的尺寸。
在一些实施方案中，亲和配体结合至捕获剂，其中所述捕获剂配置为结合至目标EV上的至少一种表面标志物。在其他实施方案中，亲和配体配置为结合至目标EV上的至少一种表面标志物和/或目标EV内的至少一种囊泡内标志物。
在系统的某些实施方案中，纳米结构的周期性阵列在纳米结构之间具有约400-800nm的周期。
此处收集了本文件中采用的某些术语。除非另有说明或上下文隐含，否则以下术语和短语包括以下提供的含义。除非另有明确说明，或从上下文中显而易见，否则以下术语和短语不排除该术语或短语在其所属领域中获得的含义。提供这些定义是为了帮助描述特定实施方案，且并不旨在限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限制。
如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”是关于组合物、方法及其各自的组分使用的，其对实施例有用，但可包含未指明的元素，无论是否有用。
除非上下文另有明确指示，否则单数术语“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。类似地，“或(or)”一词意在包括“和(and)”，除非上下文另有明确说明。本文使用缩写“例如(e.g.)”来表示非限制性实例。
本文中使用的术语“周期”是指纳米结构通过其在纳米结构上的定位以规则的间隔重现或重复。因此，本文中使用的术语“周期性”是指纳米结构相对于彼此的规则预定义模式，如晶格或其他重复单元配置。纳米结构的随机分布是一种周期性模式。
本文所用的“表面等离子体共振(SPR)”是指其中入射光在平面金属表面，且特别是在受入射光刺激的负介电常数和正介电常数材料之间的界面处激发集体共振电子振荡的物理现象。
术语“局部表面等离子体共振(LSPR)”是指纳米尺寸结构，如金属纳米粒子的表面等离子体共振。振荡电子在金属表面附近的(非导电)环境介质中生强电磁场。
如本文所用，“表面等离子体”、“表面等离子体激元”或“等离子体”是指自由电子在等离子体表面，如金属处的集体振荡。这些振荡导致自维持的表面电磁波，其在平行于金属/电介质(或金属/真空)界面的方向上传播。因为波在金属和外部介质(例如空气或水)的边界上，所以这些振荡对该边界的任何折射率变化都非常敏感，诸如例如分子靶标如EV对金属表面的吸附。另外，电磁场强度从金属表面到周围环境(例如真空或电介质)呈指数衰减。电磁场强度的最大值可以在金属/电介质或金属/真空界面处找到。
如本文所用，术语“样品”意指可能含有一个或多个胞外囊泡(例如外泌体)的任何生物或其他流体。此类生物流体包括但不限于来源于或含有以下成分的流体：细胞、生物体(细菌、病毒)、裂解的细胞或生物体、细胞提取物、核提取物、细胞或生物体的成分、细胞外液、体外培养细胞或生物体的培养基、血液、血浆、血清、胃肠分泌物、腹水、组织或肿瘤的匀浆、滑液、粪便、唾液、痰液、囊液、羊水、脑脊液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、眼泪、胸膜液、乳头抽吸物、母乳、皮肤外部、呼吸道、肠道和泌尿生殖道以及前列腺液。样品可以是病毒或细菌样品、从环境来源获得的样品，如污染水体、空气样品或土壤样品，以及食品工业样品。
“生物样品”来源于或获自活的生物体。生物体可以是整个生物体，或者可以是在培养物中生长的细胞或器官。在一实施方案中，“生物样品”还指来自对象的细胞或细胞群或一定量的组织或流体。最常见的情况是，样品已从对象取出，但术语“生物样品”也可指体内分析的细胞或组织，即未从对象取出。通常，“生物样品”将包含来自对象的细胞，但该术语也可以指非细胞生物材料，如血液、唾液或尿液的非细胞部分。在一实施方案中，生物样品来自原发性、继发性或转移性肿瘤的切除、支气管镜活检或芯针活检，或来自胸膜液的细胞块。另外，细针抽吸生物样品也很有用。在一实施方案中，生物样品包括原代腹水细胞。
生物样品还包括来源于患者组织的外植体和原代和/或转化的细胞培养物。可以通过从对象中移除细胞样品来提供生物样品，但也可以通过使用先前分离的细胞或细胞提取物(例如，由另一个人、在另一时间和/或出于另一目的分离的)来实现。也可以使用档案组织，如那些有治疗或结果史的组织。生物样品包括但不限于组织活检、刮片(例如颊刮片)、全血、血浆、血清、尿液、唾液、细胞培养物或脑脊液。通过本文描述的组合物和方法分析的样品可能已被处理，以纯化或富集其中所含的EV。
如本文所用，“胞外囊泡”(“EV”)是指天然存在的或合成的囊泡，其内部包括空腔。EV包括包裹内腔内容物的脂质双层膜。EV可以包括但不限于外体、微泡、微粒、外泌体、癌小体、凋亡体、脂质体、液泡、溶酶体、运输囊泡、分泌囊泡、气体囊泡、基质囊泡或多囊泡体。EV具有的尺寸多达约10微米，但通常为约1000nm或更小、约900nm或更小、约800nm或更小、约700nm或更小、约600nm或更小、约500nm或更小、约450nm或更小、约400nm或更小、约350nm或更小、约300nm或更小、约250nm或更小、约240nm或更小、约230nm或更小、约220nm或更小、约210nm或更小、约200nm或更小、约190nm或更小、约180nm或更小、约170nm或更小、约160nm或更小、约150nm或更小、约140nm或更小、约130nm或更小、约120nm或更小、约110nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约70nm或更小、约60nm或更小、约50nm或更小、约40nm或更小、约30nm或更小、约20nm或更小，或者约10nm或更小。
外泌体，或称微泡，是EV的一种类型，并且可被真核细胞脱落，或从质膜上出芽，到达细胞外部。这些膜结合的囊泡大小不均匀，直径范围为约10nm至约5000nm。本文描述的方法和组合物同样适用于所有尺寸的微泡。
在一些文献中，术语“外泌体”还指含有外核糖核酸酶的蛋白质复合物，这些酶参与mRNA降解和小核仁RNAs(snoRNAs)、小核RNAs(snRNAs)和核糖体RNAs(rRNA)的加工。这类蛋白质复合物没有膜，且不是“微泡”或“外泌体”，并因此不是EV，如本文中使用的那些术语。
如本文所用，术语“患者”和“对象”可互换地用于指人或动物，如脊椎动物，例如哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于灵长类、啮齿动物、家畜或猎物。灵长类动物包括黑猩猩、猴子和猕猴，例如，恒河猴(Rhesus)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、兔子和仓鼠。家畜和猎物包括奶牛、马、猪、鹿、水牛、猫科物种，例如家猫、犬科物种，例如，狗、狐狸、鸟类物种，例如，鸡、鸭和鸵鸟，以及鱼类，例如，鳟鱼、鲈鱼和鲑鱼。患者或对象包括前述的任何子集，例如所有上述物种，但不包括一个或多个组或物种，如人、灵长类动物或啮齿动物。在本文描述的方面的某些实施方案中，对象是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。对象可以是雄性或雌性。另外，对象可以是任何发育阶段，例如胚胎、胎儿、婴儿、儿童、青春期前、青少年、青年、成年和老年。雌性对象可以怀孕也可以不怀孕。
在一实施方案中，对象可以是患者或临床环境中的其他对象。对象可能被怀疑患有或发展为疾病或病症，或存在患有或发展为疾病或病症的风险，或可能已经被诊断患有疾病或病症。对象可能正在接受治疗。
如本文所用，“捕获剂”是指对EV(例如，外泌体)具有特异性结合的任何试剂。结合可以是与存在于所有EV上的标志物，例如生物标志，或与EV的子集结合。通常，捕获剂特异性地结合完全或部分存在于EV外表面上的生物标志物(本文称为囊泡外标志物)，尽管在一实施方案中，捕获剂特异性地结合存在于EV的内部的标志物(本文称为囊泡内标志物)。捕获剂被固定在与样品接触的等离子体纳米结构的表面(例如，感测区域)上。捕获剂的实例包括但不限于核酸、寡核苷酸、肽、多肽、适体、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、抗体部分、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有机分子、聚合物、来自组合化学文库的化合物、无机分子，或以上的任意组合。
如本文所述的“核酸”可以是RNA或DNA，并且可以是单链或双链，并且可以是例如编码目标蛋白质的核酸、多核苷酸、寡核苷酸、核酸类似物，例如肽-核酸(PNA)、伪互补PNA(pc-PNA)、锁定核酸(LNA)等。核酸序列包括例如，但不限于充当转录阻遏物的核酸序列、反义分子、核酶、小抑制性核酸序列，例如但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、微RNAi(mRNAi)、反义寡核苷酸等。
如本文所用，术语DNA被定义为脱氧核糖核酸。术语“多核苷酸”在本文中可与“核酸”互换使用，以表示核苷的聚合物。通常，多核苷酸由天然存在于DNA或RNA中的通过磷酸二酯键连接的核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)组成。然而，该术语包括分子，包括含有化学或生物修饰的碱基、修饰的主链等的核苷或核苷类似物，无论是否存在于天然存在的核酸中，且此类分子可用于某些应用。
本文中使用的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。肽是相对较短的多肽，通常长度在约2-60个氨基酸之间。本文所用的多肽通常含有氨基酸，如蛋白质中最常见的20个L-氨基酸。然而，可以使用本领域已知的其他氨基酸和/或氨基酸类似物。可以例如通过添加化学实体如碳水化合物基团、磷酸基团、脂肪酸基团、用于缀合、官能化的连接子等来修饰多肽中的一个或多个氨基酸。具有与其共价或非共价相关的非多肽部分的多肽仍被视为“多肽”。修饰的实例包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源纯化、使用重组DNA技术生产、通过化学方式合成，如常规固相肽合成等。“抗原”在本文中定义为诱导免疫反应的物质。抗原决定基团被称为表位，并且表位在载体分子中(其可任选地为同一分子的一部分中)，例如，肉毒杆菌神经毒素A(单个分子)具有三个不同的表位。通常，抗原对于产生免疫反应的动物而言是外来的。
如本文所用，“抗体”可包括多克隆和单克隆抗体以及抗原结合衍生物，或其部分或片段。众所周知的抗原结合片段包括，例如，单结构域抗体(dAbs；其基本上由单个VL或VH抗体结构域组成)、Fv片段，包括单链Fv片段(scFv)、Fab片段和F(ab′)2片段。构建此类抗体分子的方法在本领域是众所周知的。如本文所用，术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白或具有Fc(可结晶片段)区域或Fc区域的FcRn结合片段的单克隆或多克隆抗原结合片段。抗原结合片段可以通过重组DNA技术或通过酶或化学裂解完整抗体来产生。“抗原结合片段”尤其包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、dAb、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双体和含有至少一部分足以赋予多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的多肽。术语Fab、Fc、pFc′、F(ab′)2和Fv以标准免疫学含义使用(参见，例如，Klein,Immunology(John Wiley,New York,N.Y.,1982)；Clark,W.R.(1986)The ExperimentalFoundations of Modern Immunology(Wiley&Sons,Inc.,New York)；和Roitt,I.(1991)Essential Immunology,第7版,(Blackwell Scientific Publications,Oxford)。
本文中使用的术语“报告基团”是指能够产生或增强指示样品中目标存在的可检测光信号的组合物。报告基团的实例包括荧光分子，如异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明(TRITC)、Alexa 
488、Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7；拉曼信号的小分子，如苯硫醇、4,4’-联吡啶和R6G；以及由金属、半导体、塑料、聚合物和玻璃制成的纳米颗粒。
本文使用的术语“标记”是指能够产生或增强指示样品中目标存在的可检测信号的组合物。“标记”在本文中指与生物标志物缀合的一抗或与一抗缀合的二抗。“标记”在本文中被称为带有捕获剂的EV标签。
如本文所用，术语“标志物”或“生物标志物”是指与EV相关的分子，并且可以结合捕获剂以检测EV。标记可以是EV的任何可被捕获剂识别的组分。标志物的实例包括但不限于蛋白质或核酸，或组成EV膜的脂质双层的组分。有用的标志物包括受体(例如，胞外的)和通道组分。标志物可以是本文定义的囊泡外或囊泡内标志物。标志物可以出现在样本中的所有EV上，也可以出现在样品中的EV子集上。样本中所有EV共用的标志物在本文中称为pan-EV标志物。
如本文所用，当一种要素被“固定”到另一种要素上时，这两种要素经由键，例如离子键、共价键、极性键或氢键直接连接。当两种要素相互“结合”时，这两种要素经由键或经由其他要素如连接基团，例如PEG或本文所述的亲和配体直接或间接连接。
“亲和配体”在本文中被定义为直接附接或固定到分子间隔物或基底或纳米结构上，并且还直接附接到捕获剂或分子间隔物上的分子。换言之，亲和配体将分子间隔物(或基质或纳米结构)和捕获剂(或分子间隔物)物理连接在一起。在一实施方案中，亲和配体是特异性结合对的第一成员。在这样的实施方案中，捕获剂可以是特异性结合对的第二成员。这种特异性结合对的实例包括但不限于抗原、抗体、半抗原、寡核苷酸、多核苷酸、亲和素、链霉亲和素、激素、受体、凝集素、碳水化合物、IgG、蛋白A和核酸结合蛋白。亲和配体可以包括但不限于核酸、寡核苷酸、肽、多肽、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、抗体部分、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有机分子、聚合物、来自组合化学文库的化合物、无机分子或以上的任何组合。
特异性结合对的实例包括抗原-抗体、半抗原-抗体或抗体-抗体对、互补寡核苷酸或多核苷酸、亲和素-生物素、链霉亲和素-生物素、激素-受体、配体-受体、凝集素-碳水化合物、IgG-蛋白A、核酸-核酸结合蛋白和核酸-抗核酸抗体。
如本文所用，术语“特异性结合”是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的化学相互作用，其中第一实体以比其结合非靶标的第三实体更大的特异性和亲和力结合第二目标实体。在一些实施方案中，特定结合可以指第一实体对第二目标实体的亲和力，该亲和力至少是对第三非目标实体的亲和力的10倍大。对给定目标的特异性试剂是在所利用的测定条件下对该目标表现出特异性结合的试剂。在某些实施方案中，特异性结合由解离常数指示，其数量级为≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M或以下。
聚乙二醇(PEG)在本文中被称为纳米等离子体阵列的可能组分，并用作分子间隔物。可以设想PEG的多种形式和组合以用作这种间隔物。聚乙二醇(PEG)是一种聚醚化合物，从工业制造到医药都有许多应用。PEG的结构为(注意括号中重复的要素)：H—(O—CH2-CH2)n-OH。PEG也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)，取决于其分子量。PEG、PEO或POE是指环氧乙烷的低聚物或聚合物。这三个名称在化学上是同义的，但如本文所用，PEG指分子量低于20,000g/mol的低聚物和聚合物，PEO指分子量高于20,000g/mol的聚合物，且POE指任何分子量的聚合物。PEG和PEO是液体或低熔点固体，取决于其分子量。也可获得不同形式的PEG，这取决于用于聚合过程的引发剂，最常见的引发剂是单官能甲醚PEG，或甲氧基聚(乙二醇)，缩写为mPEG。较低分子量的PEGs也可作为较纯的低聚物获得，称为单分散、均匀或离散的。分支PEGs有三到十个PEG链，从中心核心组发出。星形PEGs有10-100个PEG链，从中心核心组发出。梳状PEGs具有通常接枝到聚合物主链上的多个PEG链。
“长链聚乙二醇(PEG)”或“长PEG”在本文中定义为具有等于或高于750Da的分子量的PEG聚合物。
“短链PEG”或“短PEG”在本文中定义为具有等于或小于500Da的分子量的PEG聚合物。
如本文所用，“表达水平”是指细胞或样品中存在的目标基因编码的mRNA分子和/或多肽分子的数量。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述了用于本公开的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。这些材料、方法和实例仅是说明性的，且并非旨在为限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用整体并入本文中。
本发明的一项或多项实施方案的细节在附图、说明书和权利要求书中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从说明书和附图以及权利要求书中显而易见。
附图说明
图1的A至图1的G示出了用于多路复用单EV分析的纳米等离子体阵列的实例。图1的A是多路复用单EV分析的程序步骤的图示。图1的B是纳米等离子体阵列中的周期性纳米孔的图像。图1的C的图像显示了纳米等离子体阵列的纳米孔表面上的增强的电磁场。图1的D是玻璃和纳米等离子基底上的荧光纳米球的图像。图1的E是玻璃基底和纳米等离子基底的像素强度的直方图。图1的F的条形图显示了玻璃和纳米等离子基底上的荧光纳米结构的荧光强度。图1的G的图像显示了纳米等离子体阵列的放大视图。
图2的A至图2的B示出了用于多路复用单EV分析的纳米等离子体阵列的光学系统的实例。图2的A是用于多路复用单EV分析的光学系统的示意图。图2的B是纳米等离子体阵列的显微镜图像。
图3的A至图3的J是用于表征用于检测目标EV的系统的荧光的图像和图。图3的A是涂有不同荧光团缀合的生物素结合蛋白的基底的一系列图像。图3的B的条形图显示了不同荧光团缀合的生物素结合蛋白的强度特征。图3的C的条形图显示了不同荧光团缀合的生物素结合蛋白的荧光强度。图3的D的图显示了不同荧光团缀合的生物素结合蛋白的吸收/发射谱。图3的E是捕获在玻璃和纳米等离子体阵列的基底上的EV的一对图像。图3的F的图显示了捕获在玻璃和纳米等离子体阵列的基底上的EV强度。图3的G的条形图显示了玻璃和纳米等离子体阵列的基底上的EV的数量。图3的H是捕获在具有粘合层的玻璃和纳米等离子体阵列的基底上的EV的一对图像。图3的I的图显示了捕获在具有粘合层的玻璃和纳米等离子体阵列的基底上的EV的强度。图3的J的条形图显示了具有粘合层的玻璃和纳米等离子体阵列的基底上的EV的数量。
图4的A至图4的C示出了单一EV测量。图4的A是捕获的具有不同荧光抗体的EV的一系列显微镜图像。图4的B的一系列图显示了基底上的不同位置中具有不同荧光抗体的EV的强度。图4的C的一系列条形图显示了具有不同荧光抗体的EV的数量/分数。
图5的A至图5的E示出了捕获的EV的肿瘤标志物的测量。图5的A是针对肿瘤标志物EGFR标记的EV的一系列显微镜图像。图5的B是针对肿瘤标志物EGFRvIII标记的EV的一系列显微镜图像。图5的C是显示了不同EV中的EGFR表达的凝胶图示。图5的D的条形图显示了不同EV中的EGFR分数。图5的E的条形图显示了不同EV中的EGFRvIII分数。
图6的A至图6的G示出了EV加标的血浆样品中肿瘤标志物的测量。图6的A的流程图显示了用以对EV群进行分类的决策树。图6的B和图6的C的系列图显示了对不同标志物呈阳性的EV群。图6的D至图6的G的条形图显示了EV检测和标志物分型。
图7的A至图7的B示出了从Gli36-WT和Gli36-EGFRvIII分离的EV的示例性表征。图7的A的图显示了从Gli36-WT和Gli36-EGFRvIII分离的EV的尺寸分布。图7的B的一系列凝胶图像显示了从Gli36-WT和Gli36-EGFRvIII分离的EV的表达水平。
图8的A至图8的B示出了浓度不同的EV的示例性表征。图8的A是针对不同标志物标记的EV的一系列显微镜图像。图8的B的一系列条形图显示了在不同EV浓度下针对不同标志物标记的EV的分数。
图9的A至图9的B示出了用以证明捕获的EV的测试灵敏度和特异性的阴性对照。图9的A的一对显微镜图像显示了针对EGFR标记的EV的灵敏度和特异性。图9的B的一对显微镜图像显示了针对EGFRvIII标记的EV的灵敏度和特异性。
图10的A至图10的D的一系列示意图示出了用于制造包括金纳米棒的纳米等离子体阵列的方法的实例。图10的A是在抗蚀剂层上压印纳米棒的步骤示意图。图10的B的图示显示了对压印模具造型的步骤。图10的C是沉积金纳米棒和剥离掉掩模的步骤的示意图。图10的D的示意图显示了使用纳米等离子体阵列来检测与金纳米棒结合的EV。
图11的A至图11的D示出了用于检测目标EV的方法的实例。图11的A的示意图示出了包括用于等离子体增强的单一EV传感技术(NEXT)的纳米棒的纳米等离子体阵列的实例。图11的B是结合至纳米棒的EV的显微镜图像的图示。图11的C是纳米棒阵列的显微镜图像的图示。图11的D是结合至纳米棒上的不同位置的EV的显微镜图像的图示。
图12的A的图显示了不同大小纳米棒的散射强度。
图12的B的图显示了暗场成像中的散射强度变化。
图13的A至图13的H示出的有限差分时间域(FDTD)模拟显示了不同大小的纳米棒和纳米盘阵列的光学共振。图13的A是捕获于纳米棒上的EV的侧视图的图示。图13的B是纳米盘的顶视图的图示。图13的C是纳米盘的顶视图的图像。图13的D的图显示了具有不同直径的纳米盘的散射强度。图13的E的图显示了具有不同直径的纳米盘的峰漂移。图13的F是纳米棒的顶视图的图示。图13的G的图显示了具有不同直径的纳米棒的散射强度。图13的H的图显示了具有不同直径的纳米棒的峰漂移。
图14的A至图14的F示出的三个FDTD模拟场景显示了EV结合至与基底不同位置和距离中的纳米盘时暗场散射的光谱漂移。图14的A是第一EV结合位置的场景1及其检测的峰波长的图示，以及相应的图。图14的B是第二EV结合位置的场景2及其检测的峰波长的图示，以及显示电磁波的显微镜图像。图14的C是第三EV结合位置的场景3及其检测的峰波长的图示，以及显示电磁波的显微镜图像。图14的D是EV结合于与表面不同距离(z)时纳米盘的暗场散射谱的图示，显示了不同水平的光谱漂移，具体取决于EV和纳米盘之间的距离。图14的E是玻璃基底上的纳米盘的横截面中的电磁场的图示，显示了在纳米盘表面的顶上聚集的电磁场。图14的F是顶视图中的玻璃基底上的纳米盘上的电磁场的图示，显示了沿纳米盘的两侧聚集的电磁场。
图15的A至图15的D示出了通过测量暗场散射强度变化进行的EV结合检测的实例。图15的A是EV结合前纳米盘的代表性的暗场散射图像。图15的B是EV结合后纳米盘的代表性的暗场散射图像。图15的C的代表性图显示了图15的A和图15的B中所示的纳米盘上的EV的暗场散射强度随时间的变化。图15的D的代表性图显示了图15的A和图15的B中所示的纳米盘上的对照的暗场散射强度随时间的变化。
图16的A至图16的C示出了通过测量纳米盘的暗场散射的光谱漂移进行的EV结合检测的实例。
图17示出了不同直径纳米盘的暗场和三种不同荧光信号(TRITC、Cy5和Cy5.5)的等离子体增强。
图18的A至图18的D示出了不同大小纳米盘中的暗场和荧光信号的示例性等离子体增强。图18的A是对应于不同直径的纳米盘的暗场的等离子体强度。图18的B是对应于不同直径的纳米盘的TRITC的等离子体强度。图18的C是对应于不同直径的纳米盘的Cy5等离子体强度的。图18的D是对应于不同直径的纳米盘的Cy5.5的等离子体强度。
不同附图中的相似的参考符号表示相似的要素。
发明详述
本公开涉及用于检测目标胞外囊泡(EV)的系统、方法和装置。EV携带多种表面生物标志物，其可用作监测或诊断某些疾病的指标，例如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病和传染性疾病等。特别地，新的系统和方法可用于检测和诊断阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病以及检测病毒、细菌和/或寄生虫，例如，通过分析含有来自感染剂的物质的免疫细胞。
然而，它们独特的尺寸(50-1000nm)给传统分析方法带来了技术挑战，这常常导致不同的发现。另外，EV通常提供微弱的检测信号，特别是当EV样品不包括足够数量的EV时，或当蛋白质和/或囊泡内标志物丰度低时，这可能使执行能够确定临床样品中EV的组成和分子特征的灵敏、稳健和标准化测定具有挑战性。
本公开提供了这些问题的解决方案，并通过放大其单个光信号以实现对目标EV的精确和准确的多路复用分析，来实现靶向单一EV。分析单一EV可以揭示细胞特异性EV的独特分子特征，这将进一步促进EV的临床应用，例如，根据不同的生物学参数(例如，细胞起源、细胞状态)构建综合EV“图谱”。
本公开的纳米等离子体系统能够以提高的灵敏度对目标膜和囊泡内标志物进行多路复用单EV分析。具体地，使用等离子体金属纳米结构放大光信号，例如荧光，以提供灵敏的多通道EV生物标志物特征。例如，可以通过使用具有纳米结构的周期性阵列的基底来实现增强，如纳米孔、纳米棒、纳米盘、纳米阱、纳米块、纳米沟槽或任何合适的周期性金属纳米结构。铜或铝膜或基底可用于UV照射，并且银和金可用于可见波长照射。一般来说，如果在金属膜下使用，基底是非金属、非导电基底，如玻璃或塑料，但金属、金属氧化物和半导体也可以用作基底。
例如，Au纳米孔的周期性阵列支持在适用于EV的长范围(约100nm)内延伸的表面等离子体共振。此外，可以通过调整纳米孔周期和尺寸来容易地调谐共振波长。对于纳米棒或纳米盘形式的纳米结构也可以做到这一点。在一实施方案中，本文描述的具有增强荧光检测(nPLEX-FL)的纳米等离子体胞外囊泡分析，以及使用其他光信号的类似方法，提供了一种简单、稳健的信号放大策略，其提高了检测灵敏度并实现了多路复用EV分析。
纳米等离子体阵列的制备
本文所用的纳米等离子体阵列包括基底、基底上或基底中的多个纳米结构，以及固定在纳米结构或临近纳米结构的多种亲和配体。不同表面化学特性(缀合至亲和配体)可用于金属，以用于使纳米结构和基底(例如，玻璃)选择性地将亲和配体固定至纳米结构，例如，固定至纳米棒或纳米盘的表面上、纳米沟槽内，以及纳米孔内的壁上或基底或临近纳米孔的金属膜上。多个纳米结构布置为在基底上形成纳米结构的周期性阵列，并且纳米结构的周期性阵列的布置和尺寸设置为放大电磁辐射的一个或多个特定波长。
在一些实施方案中，多种亲和配体固定在纳米结构或临近纳米结构，并且多种亲和配体经由捕获剂选择性地结合至目标EV。不同类型的亲和配体可基于相应的EV制备用于纳米等离子体阵列中。例如，在高亲和力结合对中，纳米等离子体阵列的基底选择生物素结合的蛋白质(例如，亲和素)作为其亲和配体附接在基底上，然后需要目标EV以包含相应的生物素作为捕获剂而被纳米等离子体阵列捕获。在一些实施方案中，基底包括半导体、非导体、塑料或任何合适的透明的基底。用于将相应的捕获剂附接至EV的方法如下所述。
我们开发了一种用于单EV分析的先进纳米等离子体EV传感平台，该平台使用一种用于检测单一EV的新型纳米等离子体传感平台。被称为NEXT(基于纳米结构的胞外囊泡技术)，该系统包括金属阵列，例如金、银、铜或铝纳米结构，例如纳米孔、纳米棒或纳米盘，其尺寸在200nm以下，可被单一EV占据。例如，金纳米棒对低至单分子检测具有高灵敏度，并且通过调整纳米棒尺寸可以精确调谐共振波长。可以使用标准纳米压印光刻技术，通过先进的压印和沉积工艺以良好的再现性制成纳米结构阵列。
在每个纳米结构，例如纳米棒上捕获单个EV会引起光谱偏移；那些来自纳米棒阵列的偏移将通过暗场成像同时检测到。进行了广泛的验证研究，以用基准检测1)单一EV检测灵敏度；2)捕获目标EV亚群的特异性；以及3)鲁棒性和再现性。
可以使用新的纳米压印光刻方法来制造金属，例如金纳米结构，例如纳米棒的密集阵列(例如，105个阵列/cm2)，该方法可以通过简单的压印和金沉积工艺在晶片尺度上对金纳米棒阵列造型(图10的A至图10的D)。该技术利用具有纳米图案的可重复使用的硅模具，该纳米图案被转移到涂覆有薄抗蚀剂层的目标基底(图10的A至图10的B)。在压印之后，将金沉积到图案化区域上；随后去除抗蚀剂将在玻璃基底上留下纳米棒阵列(图10的C)。我们之前使用已知的制造方法以高密度制造了各种金属纳米结构(ACS Nano 2011,5,7555-7564,2011；Anal.Chem.,84,6031-6039,2012)。这些方法可用于使用典型的纳米制造设施在4小时内每个制造周期生产10个芯片，或在一周内生产100个芯片(10个周期×每周期10个芯片)，这对于后续生物实验是足够的芯片生产速率。这种大量生产过程简单、可重复且可扩展。电子束光刻也可以用于以高精度对纳米结构造型。
通过在基底上对薄(50-200nm厚)金膜造型来制造周期性纳米孔。纳米孔可以通过聚焦离子束铣削或通过光刻和金属蚀刻直接造型。使用深紫外(DUV)光刻在金膜上旋涂的抗蚀剂上制造200nm周期性圆形图案。此外，使用抗蚀剂作为蚀刻掩模，通过反应离子蚀刻或离子铣削来蚀刻下面的金膜。抗蚀剂去除揭示了金膜中制造的金纳米孔图案。
通过全面的三维计算机计算设计了阵列芯片，并且我们在一个实例中发现，80nm(长度)×30nm(宽度)×20nm(高度)的纳米棒尺寸实现了100-nm EV(平均直径)检测的最大灵敏度，并对阵列传感器的尺寸和灵敏度进行了实验测试。金纳米棒的不足100nm的尺寸也允许在每个纳米棒上捕获单一EV。纳米棒之间分离3μm的金纳米棒阵列允许EV在纳米棒阵列上均匀分布；使用10×或更高的物镜可以清晰地分辨来自单个EV的信号。芯片中纳米棒的总数很容易根据纳米压印模具的尺寸进行缩放。例如，可以使用微阵列检测仪(MicroSys,Digilab Inc.)，利用亲和配体选择性地使芯片功能化。利用检测仪，从96孔板转移0.1μL溶液，并在设计区域以良好的重现性(<5％变化)检测。温度和湿度在检测仪室内部进行控制，以确保一致的样品检测和孵育条件。
金属，例如金纳米结构，例如纳米棒，在共振波长下表现出独特的暗场光散射峰。EV与纳米棒表面的结合增加了局部折射率，使峰值波长红移。光谱偏移(即EV结合)也可以通过测量固定波长下的光强度变化来检测，并且光谱和强度测量之间存在良好的相关性。强度测量方法可用于从视场中的整个阵列进行高通量并行信号读取。这种方法比过去系统和方法中使用的连续光谱测量快得多。暗场成像也与在相同设置中用于分子EV分型的表面荧光测量兼容。
EV，例如肿瘤来源的EV，可被捕获在纳米棒上，并通过表现出由EV结合到纳米棒表面引起的强度变化的纳米棒的数量来测量。使用有限差分时间域(FDTD)解的计算机计算表明，单个100-nm EV结合引起超过10nm的偏移，这是一个很容易通过暗场强度测量检测到的足够大的偏移。该信号还与捕获的EV的尺寸相关，便于EV尺寸测量。一旦可以使用尺寸标准纳米球进行校准，并将结果与通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)系统获得的那些结果进行比较。结合分子图谱，大小信息可用于识别EV亚型(例如外泌体相对于微泡)。
通过采用暗场成像，可以同时测量来自整个阵列的读出信号。与光谱测量相比，强度测量在大阵列的读出中提供了高得多的通量。为了避免由于光源温度的变化而引起的信号漂移或波动，可以实施温度控制器以稳定光源温度和/或增加信号平均值的数量以减少背景噪声。
图11的A至图11的D示出了包含用于等离子体增强的单一EV传感技术(NEXT)的纳米棒的纳米等离子体阵列的实例。图11的A是由以网格制成的金纳米棒阵列组成的NEXT芯片传感器的示意图。纳米棒的较小表面积允许在每个纳米棒上结合单一EV。图11的B是捕获在金纳米棒(比例尺：50nm)上的纳米球的扫描电子显微图(SEM)。图11的C是通过电子束光刻支撑的纳米棒阵列的SEM，但也可以用纳米压印光刻(比例尺：500nm)支撑。图11的D的SEM显示了纳米棒(比例尺：200nm)上的模拟EV的单一纳米球的结合。通过免疫荧光探针标记捕获的EV，以使用等离子体增强的荧光检测进行高通量多通道分析。捕获的EV以一定距离均匀分布在纳米棒之间；这将提高分析的准确性。
EV的分离和制备
例如从人或其他对象获得生物样品，并且可以在培养基，如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Cellgro)中培养细胞。培养基可以补充有血清，例如10％胎牛血清、抗生素，例如青霉素和/或链霉素，并保持在5％CO2下。参见，例如Min et al.,Plasmon-EnhancedBiosensing for Multiplexed Profiling of Extracellular Vesicles,AdvancedBiosystems,2020,4,200003.DOI:10.1002/adbi.202000003，其通过引用整体并入本文中，包括所有附图和参考文献。
EV可以使用标准超速离心(UC)和尺寸排阻色谱(SEC)方法分离。此外，EV与培养基分离，以用于下一过程。对于UC，滤液被浓缩，例如通过100,000×g，持续1小时。去除上清液后，例如用PBS洗涤EV沉淀并再次离心，例如以100,000×g离心1小时。将EV沉淀再悬浮在缓冲液或血清中，例如PBS中。对于SEC，将滤液加载到过滤器上，例如MWCO＝10kDa，并例如在4℃下以3500×g离心30分钟。浓缩后，用PBS将体积调整至例如1mL。
可以使用不同的生物标志物和各自的亲和结合对及其制造方向来选择EV。
EV标记和分析方案
基于本文所述的nPLEX-FL方案进行EV分析，其包括使用多种荧光标记、拉曼信号和暗场散射信号来检测目标EV以进行EV分析。对于荧光检测，通过与亲和配体缀合的荧光探针标记EV。对于拉曼检测，可以直接检测表面膜上或EV内的分子，或通过与亲和配体缀合的拉曼探针标记EV。对于暗场散射检测，可以直接检测来自EV的散射信号，而无需任何标记。用结合至特异性结合EV的捕获剂的亲和配体标记纳米等离子体阵列的纳米结构，然后将基底暴露于生物样品足够的时间，以确保基底结合足够数量的EV。在一实施方案中，将生物素化的EV捕获在中性亲和素涂覆的纳米结构上，然后在固定/渗透溶液中进行EV固定和渗透。表面钝化可通过将表面(有或没有EV)置于封闭溶液(Superblock PBS，ThermoFisher)中20分钟来实现。这一步骤对于最小化不希望的非特异性结合非常重要。捕获的EV经由两步间接标记进行染色：首先用一抗，然后用兼容的二抗。步骤之间进行彻底清洗。
用捕获剂，如链霉亲和素标记EV。最后，用安装溶液经由捕获剂将标记的EV附接到纳米结构上，并用玻璃盖玻片覆盖。可用于本公开的抗体列于下表1中。一抗用于特异性结合EV表面上的特定生物标志物，且二抗用于特异性结合一抗。此外，二抗与用于图像处理的报告基团，例如荧光探针，或捕获剂如链霉亲和素缀合。测定缓冲剂可以是例如BD渗透/洗涤缓冲液(BD Biosciences)。
表1.抗体和稀释因子
基于具体用途，任何其他抗体也可用于本公开中。考虑到EV的不同生物标志物，可以选择相应的抗体。与不同疾病和目的相关的EV生物标志物列于下表2中。
表2.EV生物标志物
在本公开的一些实施方案中，使用图像分析软件，如
和
执行捕获的EV的图像处理。链霉亲和素成像通道用于识别捕获的EV的位置，并将目标区域定义为掩模。对于每个分子目标(例如，EV的膜上或内部的蛋白质)，使用
插件对齐来自目标分子的相应荧光图像(对齐堆栈中的切片)。在每个掩模位置处，获得平均像素强度。通过减去掩模周围的背景信号来校正信号。
使用方法
新方法和纳米等离子体阵列可用于在多种场景中分析单一EV。例如，肿瘤来源的EV含有反映原发性肿瘤细胞的蛋白质和RNA标志物，并且新的纳米等离子体阵列传感器可以快速且灵敏地直接从临床样品中检测肿瘤EV。因此，EV分析为诊断癌症和监测纵向肿瘤对治疗的反应提供了令人信服的临床潜力。
本文所述的高灵敏度单一EV检测平台将显著提高我们对EV生物学的理解，允许从临床样本中快速且可靠地筛选EV，并能够分析治疗期间的细微表型变化。重要的是，这将有助于该领域了解EV与其原发性肿瘤对应物的一致性如何，以及EV计数和/或分子谱是否提供了对癌症进展或治疗反应的额外见解。从长远来看，在血液中成功实现高通量EV分析将为其他临床基础筛查研究(例如，其他体液和癌症类型中的EV)铺平道路。这将提供一种更易获取的工具，以显著加快EV分析作为临床环境中癌症护理的常规筛查测试的临床应用。本文所述的单一EV检测平台能够识别来源于肿瘤或特定器官的单个EV，并检测来自目标亚群的EV膜上或EV内部的特定目标分子，否则其会被来自非目标起源的EV稀释或检测不到。来自目标特异性肿瘤或器官的EV的分子分析可以指示起源细胞的分子状态。
数值模拟
此外，数值模拟可用于计算共振峰波长，确定最大光信号放大的标签选择，并优化纳米结构尺寸和材料。可以使用有限差分时间域(FDTD)方法进行电动力学计算。对于电场分布，沿z方向照射x偏振平面波。对于位于纳米孔中心的0.3×0.3×0.2μm3的容积使用2-nm网格尺寸。沿x和y方向施加周期性边界条件，并对z方向使用完美匹配层。将z极化偶极子源用于辐射衰减率模拟。偶极子的位置设置为x＝100nm、y＝0nm和z＝6nm，以将其定位在纳米孔的边缘和纳米等离子体阵列的Au表面上方6nm处。
此外，可以在GraphPad Prism 
中进行统计分析和数据绘制。使用非配对t检验检验组间差异。所有检验都是双侧的，且P值<0.05被认为是统计学上显著的。
一般方法学
图1的A至图1的G示出了用于多路复用单EV分析的纳米等离子体阵列的实例。图1的A示出了多路复用单EV分析的程序步骤，其起始于捕获EV、标记捕获的EV、采集标记的EV的图像，以及分析EV的图像。将EV捕获在纳米孔表面上，并通过荧光检测探针进行免疫染色，然后对不同荧光通道中的标记的EV成像，并分析其强度。例如，经由亲和配体将EV捕获在Au纳米孔表面上(例如，将生物素化的EV捕获在亲和素涂覆的Au纳米孔表面上)。然后通过荧光标记的抗体在不同颜色通道(通常为3-4种颜色)中对捕获的EV进行免疫染色。取决于荧光团的吸收和发射谱，通过下方的Au纳米孔结构激发的表面等离子体共振(SPR)放大荧光信号。
图1的B示出了纳米等离子体阵列中的周期性纳米孔的扫描电子显微图。纳米孔的直径约为200nm，且周期为500nm。图1的B中的比例尺为1μm。将图1的B中的纳米结构优化为SPR基底，且基底为100-nm厚的Au薄膜。
图1的C示出的有限差分时间域模拟显示了约束在纳米等离子体阵列的纳米孔表面上的增强的电磁场。强场是等离子体增强的荧光信号的原因。芯片表面上赋予的周期性纳米孔使电磁场集中，最大场强可达300倍。共振场在z方向上延伸至110nm，其主要覆盖小EV(例如，平均直径为100nm的外泌体)。除了局部化的近场之外，通过Au纳米结构与共振范围内的近端荧光团的相互作用，可以进一步增强荧光辐射。
图1的D示出了玻璃和现有纳米等离子基底上的荧光纳米球(使用Cy5，200nm)的图像。图1的D中的比例尺为10μm。相比玻璃基底测试了通过使用荧光纳米球(Cy5，200nm)的nPLEX芯片的Au纳米孔结构进行的等离子体增强的荧光。此外，图1的E示出了玻璃基底和现有纳米等离子基底的像素强度的示例性直方图。其显示，单个纳米球的荧光强度显著高于nPLEX-FL基底上的荧光强度(双尾t检验，p<0.0001)。图1的F示出了玻璃和纳米等离子基底上的荧光纳米球的平均荧光强度。平均荧光强度增加了18倍，且信噪比(由信号除以空白的3倍标准偏差给出)增加了20倍，从17.7(玻璃)增加到358(nPLEX-FL)。对于玻璃(36.2％)和nPLEX-FL基底(33.6％)之间的荧光强度，由标准偏差与平均值之比给出的变异系数没有显著差异，表明信号放大不会增加强度变化。
图1的G示出了显示纳米孔周围增强的电磁场的有限差分时间域模拟。扫描电子显微镜显示了功能化Au纳米孔芯片捕获的EV。虚线圆圈表示纳米孔周围增强的电磁场分布。
双模型成像装置
图2的A示出了用于多路复用单EV分析(NEXT读出系统)的纳米等离子体阵列的光学系统的实例，其将暗场成像与多通道荧光成像集成。图2的A示出了用于暗场(传输)和表面光双模型成像的示例性直立显微镜组10。光学组的电荷耦合装置(CCD)20可用于捕获由捕获在纳米等离子体阵列上的标记的目标EV上的报告基团(例如，荧光抗体)发出、散射或反射的电磁辐射。在一些实施方案中，直立的显微镜组10包括滤波器组22以处理/过滤电磁辐射、其上具有纳米等离子体阵列的基底被置于物镜24下的显微镜载物台26、摄像机，例如，CCD,20，以捕获通过滤波器组22处理的辐射。系统还包括布置于载物台26下方的暗场冷凝器28、布置为从上方照射显微镜载物台26的第一光源30，以及布置为从下方照射显微镜载物台26的第二光源32。在一些实施方案中，将暗场散射成像用于从下方照射纳米等离子体阵列，以捕获从纳米等离子体阵列通过物镜24发出、散射或反射的电磁辐射。在一些实例中，暗场散射成像系统的第二光源32和暗场冷凝器28可以设置在物镜24的上方，以从上方照射显微镜载物台26。
图2的B示出了纳米结构阵列的暗场散射图像的实例。插图显示了纳米结构阵列的缩放图像。在一些实施方案中，纳米结构阵列可以是纳米棒阵列，并且每个纳米棒隔开2μm。
实施例
在以下实例中进一步描述了本公开，这些实例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例1–表征纳米等离子体阵列系统
我们研究了EV中的等离子体增强。我们在玻璃和nPLEX-FL基底上捕获生物素化的EV，并随后用链霉亲和素缀合染料标记捕获的EV(Cy5，图3的E和AF488)。
使用上述光刻方法制备nPLEX-FL芯片。将芯片在室温下与硫醇化的生物素聚乙二醇(PEG)(于PBS中10×10-3m，PG2-BNTH-1k，Nanocs)一起孵育过夜。用PBS洗涤后，将与AlexaFluor 488、Cy3、Cy5或Cy5.5(Biolegend)缀合的链霉亲和素分子的等摩尔混合物孵育10分钟。由于与其他通道相比，荧光信号较弱，将每种荧光染料的浓度稀释至2.5μg mL–1，但Alexa Fluor 488缀合的链霉亲和素(于PBS中25μg mL–1)除外。
我们使用基于多酚蛋白的生物粘附层捕获不同基底(玻璃和Au)上相同量的EV，并研究了荧光强度和可检测的EV计数。根据背景校正后的荧光强度，AF488的平均信号增强因子为1.54，且Cy5为8.60(图3的F)。捕获的EV中的总体信号增强不如链霉亲和素单层涂层显著(参见图3的C和图3的F)，这可能是因为EV和链霉亲和素单层之间的厚度差异；表面附近的电磁场更强。然而，与玻璃基底相比，我们可以在nPLEX-FL芯片上检测到数量级更大的Cy5标记EV，这表明通过等离子体增强信号放大获得了更高的灵敏度(图3的G)。
我们还观察到纳米孔芯片和玻璃上AF488标记的EV的相当的平均像素强度和EV计数(参见图3的H)。这表明Cy5染料上的等离子体增强揭示了具有弱荧光信号的EV，否则在没有信号增强(玻璃基底)或弱增强(AF488)的情况下无法检测到EV。因此，在随后的验证研究中，我们在Cy5通道中分配了低丰度或关键EV标志物，以实现最大信号增强。
特别地，图3的A是涂覆有四种颜色的荧光团缀合的链霉亲和素(AF488、Cy3、Cy5和Cy5.5)的纳米等离子体阵列/芯片的一系列荧光图像。图3的A中的比例尺为20μm。在由白色虚线框突出显示的100×100μm2大小的方形区域，例如，使用AF488的荧光图像中显示的白色虚线框中制作纳米孔阵列。
图3的B示出了沿着图3的A中的灰色水平虚线的横截面强度特征。使用分子单层测试不同荧光通道中的等离子体增强。使用硫醇化的生物素聚乙二醇衍生物(硫醇-PEG-生物素)对Au纳米孔表面进行功能化，并将荧光团缀合的链霉亲和素分子固定在生物素化的Au表面上。为了防止下方Au基底的荧光猝灭，将Au表面用硫醇-PEG-生物素(1kDa，6-8nm)和中性亲和素(60kDa，4-5nm)功能化，这导致厚度为10-13nm的粘附层。图3的A和图3的B显示了与平坦Au区域(正方形外部，图3的B)相比，100×100μm2大小的纳米孔光栅正方形区域(由白色虚线框突出显示)中的强信号增强。
图3的C示出了不同荧光通道中荧光强度的示例增强因子(EF)。信号增强主要在Cy5通道中，并且与平坦的Au区域相比，纳米孔区域中的荧光强度的EF是23倍。
图3的D示出了通过覆盖有荧光团的吸收/发射光谱的纳米孔阵列的示例等离子体支持的光透射光谱。当AF488信号仅增加3倍时，Cy5.5和Cy3强度也分别增加17倍和9倍。不同通道中的这些EFs可以通过等离子体支持的通过纳米孔的光透射和荧光团的吸收/发射光谱之间的光谱重叠来解释。在667nm处测量光透射峰，其与Cy5吸收(649nm)和发射(666nm)峰最重叠，其次是Cy5.5和Cy3。
图3的E至图3的I示出了EV上的示例性等离子体增强。图3的E表明生物素化的EV被捕获在玻璃和纳米等离子体阵列的基底上，并随后用链霉亲和素缀合的染料标记。将捕获的EV用Cy5缀合的链霉亲和素标记，然后成像。图3的E中的比例尺为10μm。图3的H表示在涂覆有基于L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)的生物粘合层的装置表面上捕获的生物素化EV，并将捕获的EV用AF488缀合的链霉亲和素标记，然后成像。图3的I示出了平均荧光强度的比较，且图3的J示出了图3的H中的在纳米孔芯片和玻璃基底之间的目标区域(ROI)中捕获的EV的数量。基于L-DOPA的生物粘合层用于在不同基底(玻璃和Au)上以相同密度捕获EV，并研究荧光强度和可检测EV计数。
此外，图3的F示出了图3的E的捕获EV的像素强度的示例性直方图。根据背景校正后的荧光强度，AF488和Cy5的平均信号增强因子为1.54，且Cy5为8.60。总体增强不如图3的C中的链霉亲和素单层涂层显著，这可能是由于局部电磁场，其在图3的C所示的表面附近最强。
图3的G示出了图3的E的在纳米孔芯片和玻璃基底之间检测到的EV的数量。荧光强度由背景信号归一化，背景信号由在没有EV的情况下的平均荧光强度和标准偏差的三倍之和定义。与玻璃基底相比，检测到nPLEX-FL芯片上的Cy5标记EV的数量级更大，这表明等离子体增强信号放大获得了更高的灵敏度。相反，在纳米孔芯片和玻璃上观察到AF488标记EV的相当的平均像素强度和EV计数。观察到的差异是，Cy5的等离子体诱导的信号放大揭示了具有弱信号的较小EV，这些弱信号在玻璃基底上未被检测到。因此，由于其与等离子体共振的最大光谱重叠，选择Cy5染料标记低丰度的囊泡内标志物。
实施例2–单一EV测量
我们应用nPLEX-FL技术来证明其在多路复用单EV分析中的可行性。我们使用胶质母细胞瘤细胞系进行测试：Gli36-WT和Gli36-EGFRvIII(过表达人EGFRvII)。EGFR和EGFRvIII是胶质母细胞瘤的目标生物标志物，因为EGFR及其变体(EGFRvII)的扩增在胶质母细胞瘤中经常发生。蛋白质标志物的存在，包括1)普遍存在的EV四次穿膜蛋白组合，命名为CD-pan(CD9、CD63和CD81)；2)GAPDH；3)EGFR；和4)EGFRvIII，通过nPLEX-FL进行检测，并将其作为标准方法针对western印迹分析用基准检测(参见图6的A和图6的B)。
从条件细胞培养基中分离EV。纳米粒子追踪分析表明，本研究中使用的分离EV具有的尺寸分布范围为50–200nm，平均直径为100nm，透射电子显微照片也证实了这一点。将分离的EV生物素化，在纯缓冲剂(1×108–10×108EV mL–1磷酸盐缓冲盐水(PBS))中稀释，并捕获在中性亲和素涂覆的金纳米孔表面上。将捕获的EV针对膜(即CD63、EGFR)和/或囊泡内标志物(即GAPDH)进行免疫标记，并在荧光显微镜下成像。因为大多数EV小于衍射极限，所以荧光图像中检测到的囊泡的平均斑点尺寸约为500nm(8个像素，像素尺寸为63nm)。单一EV产生可检测的荧光信号，这通过扫描电子显微照片证实。一些双链EV在链霉亲和素通道中表现出更高的强度。成像大于1μm(或16像素)的粒子被认为是大聚合物，并从我们的分析中排除。
我们选择了成熟的EV标志物，以对基于标志物的信号的EV分析和亚群分选进行原理验证。考虑到荧光信号增强，我们将1)绿色染料(AF488)指定为高丰度/易检测标志物，并将2)远红色染料(Cy5)指定为低丰度/难检测标志物。图4的A显示了针对CD-pan(AF488)、链霉亲和素(Cy3)和GAPDH(Cy5)标记的生物素化EV的代表性nPLEX-FL图像。我们选择GAPDH作为代表性的囊泡内标志物，它通常用作许多其他定量方法的对照(例如，western印迹、qPCR)。我们改变EV浓度并计算捕获的EV数量。线扫描(图4的B)显示单个囊泡上所选标志物的高信噪比和信号异质性。然后，我们分析了原始强度数据，以用于EV的标志物分析。对于给定的标志物，我们确定了两个亚群—标志物阳性的和标志物阴性的，它们可以通过强度截止值(平均值+2×阴性对照的标准差)分开。大约40％的捕获的链霉亲和素阳性囊泡为CD-pan阳性，且在CD-pan阴性EV中，一部分表达GAPDH(25％)(图3的C)。对于链霉亲和素染色(<1％)和抗体染色(<0.2％)，对照样品(无EV)的假阳性率可忽略不计。基于阴性对照数据，我们将阳性阈值设置为1％。
特别地，图4的A说明来自Gli36-WT细胞系的EV被生物素化，并捕获在纳米孔表面上。通过用荧光Cy3-链霉亲和素染色检测单个EV(左上图)。为了进行分子分析，用针对跨膜EV标志物(CD63)和囊泡内标志物(GAPDH)的荧光抗体标记EV。选择多种EV标志物以基于标志物表达水平检测和分类单个EV。分配AF488染料为高丰度/易检测标志物，且Cy5为低丰度/难检测标志物。图4的A显示了针对CD63(AF488)和GAPDH(Cy5)标记的Gli36-WT来源的EV的代表性nPLEX-FL图像。GAPDH被选为代表性的囊泡内标志物，其常用作许多其他定量方法(例如，Western印迹、qPCR)的对照。
图4的B示出的线扫描显示了用于本实施例中的所选标志物的高信噪比。灰色阴影突出显示EV位置。线扫描显示单个囊泡上所选标志物的高信噪比和异质性。
图4的C示出了EV子类型。然后分析图4的B中所示的原始强度数据以用于标志物表达和EV亚型。对于给定的标志物，我们确定了两个亚群：标志物阳性的和标志物阴性的，它们可以通过100的强度截止值分开。大约一半捕获的囊泡具有CD63(46％)，且在CD63+EV中，一部分表达GAPDH(58％)。证实了GAPDH+EV与CD63+EV的强重叠(>95％)。观察到纳米孔芯片上Cy5-GAPDH+EV的比例高于其他基底，这可能归因于Cy5红色通道中的等离子体来源的信号放大。
实施例3–肿瘤诊断潜能的证明
图5的A至图5的E示出了捕获的EV的肿瘤标志物的示例性测量，以证明新系统和方法的肿瘤诊断潜力。将来自三种不同细胞系(Gil36-WT、Gli36-EGFRvIII、MCF7)的EV生物素化，并捕获在纳米孔阵列表面上，并用针对CD-pan标志物组(CD9、CD63和CD81)的荧光抗体以及包含图5的A中的EGFR和图5的B中的EGFRvIII的肿瘤标志物标记EV。图5的A和图5的B中带点线圆圈的斑点表示肿瘤标志物阳性EV。
图5的C示出了Gli36-WT、Gli36-EGFRvIII和MCF-7细胞系中EGFR表达的Western印迹分析。MCF-7细胞用作EGFR表达的阴性对照。针对GAPDH的印迹抗体用于加载对照。
图5的D和图5的E中的条形图示出了EV子类型。分数(％)＝EVCD-pan+目标+/EVCD-pan+。如图5的D所示，Gli36-WT EV的大量部分对EGFR呈阳性(54％)，而Gli36-EGFRvIII的小部分对EGFR呈阳性(7％)。如图5的E所示，略超过10％的Gli36-EGFRvIII囊泡对EGFRvIII呈阳性，而Gli36-WT和MCF7显示低于统计显著性阈值的EGFRvIII阳性分数(<1％)。用无EV孵育的相同程序制备阴性对照。
为了进一步测试临床应用的诊断潜力，我们将来自Gli36-WT和Gli36-EGFRvIII细胞系的≈1010EV加标至1mL人血浆样品中。使用尺寸排除柱(Izon柱)从加标血浆样品中分离EV，将其生物素化，然后加载到芯片(1-5μL)上。将捕获的EV针对CD-pan(AF488)、链霉亲和素(Cy3)和EGFR或EGFRvIII(Cy5)进行标记。我们利用嵌套门控策略实现了决策树算法，以基于EGFR和EGFRvIII信号对EV群进行分类(图6的A)。简言之，首先检测用Cy3缀合的链霉亲和素标记的颗粒，并根据尺寸排除(<1μm)进行预筛选，以从分析中排除大聚集体。在链霉亲和素阳性的颗粒中，我们定义了对CD-pan标志物(CD9、CD63和CD81)呈阳性的EV。然后，用EGFR或EGFRvIII的目标胶质母细胞瘤标志物对预筛选的EV进行亚门控。我们使用两个独立组(EV阳性和阴性)进行了Mann–Whitney检验的功率分析，以计算必要的EV样本量(n>100)，给定的统计功率为0.9，且效应大小为0.43。鉴于EV表面覆盖为0.1–0.5EVμm–2，所需的最小面积约为200–1000μm2。然而，我们在全视场(FOV)(120μm×100μm)中使用荧光图像(n＝4)，且每测量取样数千个囊泡，以确保统计学显著和稳健的分析。
图6的B和图6的C显示了在单个EV水平上的生物标志物分布分析。我们绘制了来自FOV为120μm×100μm的三通道荧光图像的双变量直方图。平均而言，我们在单一图像中检测到约4200个链霉亲和素阳性颗粒(最小值＝3604，最大值＝5057EV，图6的D)。我们观察到链霉亲和素阳性颗粒对CD-pan标志物的阳性率为10％–15％(图6的E)。与纯缓冲剂(PBS)相比，血浆样品中CD-pan+链霉亲和素+颗粒的分数较低，这可能是由于人血浆中存在脂蛋白和血浆蛋白聚集体。为了进行标志物分析，对检测到的CD-pan阳性EV进行EGFR和EGFRvIII目标标志物的筛选。对于加标有来自Gli36-WT和Gli36-EGFRvIII细胞系的EV的血浆样品，在两种样品中，约10％–20％的检测到的EV对EGFR呈阳性(图6的F)。然而，仅在具有Gli36-EGFRvIII EV的血浆样品中，大约10％的EV对EGFRvIII呈阳性，而具有Gli36-WT EV的其他样品显示小于1％的阳性EV分数，其低于阈值(图6的G)。在血浆样品和纯缓冲剂样品之间观察到相当的对EGFR和EGFRvIII的生物标志物阳性。
这些结果表明，胶质母细胞瘤EV可用于检测EGFRvIII突变蛋白。
实施例4–分离自肿瘤细胞系的EV的表征
对nPLEX-FL技术进行了扩展，以证明其对多路复用单EV分析的可行性。将胶质母细胞瘤(GBM)细胞系用于测试：Gli36-WT和Gli36-EGFRvIII，其为对EGFRvIII突变呈阳性的Gli36 EV的克隆。从条件细胞培养基收集EV，并进行膜过滤、生物素化、固定在纳米孔阵列芯片表面上，并针对膜(即CD63、EGFR)和/或囊泡内标志物(即GAPDH)进行免疫标记。本研究中使用的分离的EV具有50-200nm的尺寸分布范围，平均直径为100nm，并且通过western印迹法测定普遍存在的EV蛋白标志物(CD9、CD63和CD81，图7的B)的高纯度。亲和素功能化的Au芯片对生物素化的EV捕获表现出高特异性，这一点通过电子显微镜证实。
特别地，图7的A示出了通过纳米粒子追踪分析(NTA)获得的Gli36-WT和Gli36-EGFRvIII EV的尺寸分布图。图7的B示出了Gli36-WT和Gli36-EGFRvIII EV的Western印迹测量，以确定整体中的pan-CD标志物表达水平(CD9/CD63/CD81)。
实施例5-不同浓度EV的表征
图8的A示出了在纳米等离子体阵列装置上生物素化并捕获的来自OVCA429细胞系的EV。从条件细胞培养基中收集EV，并进行膜过滤、生物素化，并固定在纳米孔阵列芯片表面上。将捕获的EV用pan-CD标志物标记，后者是CD9、CD63和CD81(AF488)以及EGFR(Cy5)的组合。EV被人为地进行了颜色编码，以用于视觉辅助。图8的A中的比例尺为10μm。图8的B中的三个条形图示出了各种EV浓度(4倍差异)和捕获的EV的数量。无论EV浓度如何，大约一半的CD-pan+EV表达EGFR。我们通过用Cy3-链霉亲和素染色EV来鉴定单个囊泡。
实施例6–用以证明测试灵敏度的阴性对照
图9的A至图9的B示出了阴性对照，以证明捕获的EV的测试灵敏度和特异性。从条件细胞培养基收集来自MCF7细胞系的EV，并进行膜过滤、生物素化，并固定在纳米孔阵列芯片表面上。用CDpan标志物标记EV，前者是CD63/CD81/CD9(AF488)和EGFR(图9的A所示)或EGFRvIII(Cy5)(图9的B所示)的组合。
用相同的程序制备阴性对照(例如，无EV)，但无EV孵育。图9的A至图9的B指示了本发明的用于检测目标EV的纳米等离子体阵列传感器系统的统计学意义。
实施例7–纳米棒阵列的光学表征
图12的A至图12的B示出了纳米棒传感器阵列的示例性光学表征。图12的A的图示出了有限差分时间域(FDTD)模拟的结果，其显示了具有40、60、80、100和120nm长度的不同大小的纳米棒的光学共振峰。光学调谐对于通过纳米棒的表面等离子体共振将荧光信号增强最大化非常重要。纳米等离子体阵列可以基于目标EV的大小和/或分析步骤中的其他要求(例如，以检测SPR的特定波长)，针对每个纳米棒具有特定的大小/尺寸。
图12的B中的图显示了随着表面折射率从1.33增加到1.45，暗场散射的光谱漂移和强度变化的实验结果。制备了不同混合比例的水和乙醇混合物，并将其应用于纳米棒阵列，以使折射率从1.3变化到1.45。测量了光谱漂移的量，并针对表面折射率绘图。将表面折射率为1.33的峰值波长用作计算光谱漂移的参考。EV与纳米棒的结合增加了表面折射率，从而改变了共振峰。EV结合事件可以通过测量光谱漂移或散射光强度变化来检测。
实施例8–纳米棒相对于纳米盘的光学共振
图13的A是捕获在纳米棒上的EV的侧视图的图示。图13的B是阵列中的纳米盘的顶视图的图示。图13的C是纳米结构上的EV的顶视图的扫描电子显微镜图像。
图13的D的图显示了具有通过FDTD模拟计算的40、60、80、100、120、140、160、180或200nm的不同直径纳米盘的散射强度(a.u)。如图所示，散射强度随纳米盘直径增加，并且峰散射强度的波长也随纳米盘直径增加。
图13的E的图显示了具有40-200nm的不同直径纳米盘的峰漂移(nm)。如图所示，具有40nm直径的纳米盘的峰漂移最高，从60至80nm直径急剧下降，然后随直径增加继续下降，直到在约180nm处稳定。
图13的F是具有长度L和30nm宽度的纳米棒的顶视图的图示。图13的G的图显示了具有40、60、80、100、120、140、160、180和200nm的不同长度纳米棒的散射强度(a.u)。如图所示，峰散射强度随波长和纳米棒长度增加。
图13的H的图显示了具有40-120nm的不同长度的纳米棒的峰漂移(nm)。如图所示，峰漂移随纳米棒长度下降。
纳米等离子体阵列可以基于目标EV的大小以及其他要求(例如，以检测SPR的特定波长)，设计为具有特定大小/尺寸的纳米棒或纳米盘的纳米结构，以用于检测目标EV。也可以将类似于纳米棒或纳米盘的任何形状用作等离子体纳米结构，以放大荧光和暗场信号。
实施例9-有限差分时间域(FDTD)模拟
图14的A至图14的C示出的FDTD模拟显示了EV在与基底的不同位置和距离中结合至纳米盘时暗场散射的光谱漂移。
图14的A是第一EV结合位置的场景1及其检测的峰波长的图示，以及相应的图。图14的B是第二EV结合位置的场景2及其检测的峰波长的图示，以及显示电磁波的显微镜图像。图14的C是第三EV结合位置的场景3及其检测的峰波长的图示，以及显示电磁波在纳米盘表面上聚集的显微镜图像。结果表明在各种结合场景中结合至纳米盘表面的单一EV均可通过测量暗场散射峰波长的光谱漂移进行检测。
实施例10–实时EV结合实验
使用本文所述的系统和方法分析EV与纳米盘的实时结合。
图15的A至图15的D示出了通过实时测量暗场散射强度变化进行的EV结合检测的实例。如图15的A中所示的时间线(1)在EV结合至阵列中心的纳米盘(中间的圆圈)之前。如图15的B中所示的时间线(2)在EV结合至阵列中心的纳米盘(中间的圆圈)之后。
图15的C的图显示了实时测量，显示了EV结合到中心纳米盘时在时间点(2)处突然的强度变化。特别地，图15的C表明当EV结合到纳米盘时，强度在100秒处增加，如图15的A和图15的B(中间的圆圈)所示的信号差异。
图15的D的图显示了实时测量，显示了两个对照的强度没有突然变化，这显示没有结合到阵列中的任何纳米盘。特别地，图15的D显示了没有亲和配体的对照纳米盘(图15的A和图15的B中的对照1和对照2)的暗场散射强度随时间的变化。没有EV结合，并因此没有测量到强度变化。图15的C和图15的D中的垂直虚线(1)和(2)表示获取图15的A和图15的B时的时间点。
实施例11–纳米盘暗场散射的光谱漂移
上述的方法和纳米盘阵列我们用于分析由纳米盘引起的暗场散射的光谱漂移。图16的A至图16的C示出了通过纳米盘测量暗场散射的光谱漂移如何能够检测EV结合的结果。通过与EV荧光图像的重叠来确认EV结合。通过特定荧光探针标记EV，以定位具有捕获的EV的纳米盘。
图16的A至图16的C显示了EV的荧光通道和纳米盘的暗场散射的重叠图像，其显示EV被捕获在纳米盘上(图像中的圆圈)。右图显示了EV结合在那些纳米盘之前和之后的暗场散射光谱，表明EV与纳米盘表面的结合会引起光谱漂移。
图16的A中的图像显示了中心纳米盘，其显示指示EV结合的荧光信号。在EV结合之前或之后的归一化散射中，单个纳米盘光谱的附图显示出轻微的光谱偏移，其中没有偏移意味着完美的重叠。
图16的B的图像显示了具有指示EV结合的荧光变化的中心纳米盘。单个纳米盘光谱的附图显示了EV结合后归一化散射的明显右移(峰值波长增加)。
图16的C中的图像显示了纳米盘，其显示指示EV结合的荧光信号。单个纳米盘光谱的附图显示，在EV结合之前或之后，归一化散射没有明显的偏移，其中没有偏移意味着完美的重叠。
实施例12-具有不同直径纳米盘的暗场和荧光信号的等离子体增强
如图17和图18的A至图18的D所示，可以将纳米等离子体阵列设计成具有基于用于检测目标EV的相应暗场/荧光标记的具有特定直径的纳米盘。在纳米盘阵列的顶上形成荧光分子单层，并测量纳米盘和基底上的荧光信号。
图17示出了具有80、100、120、140、160、180和200nm的不同直径纳米盘的暗场和3种不同荧光信号(TRITC、Cy5和Cy5.5)的等离子体增强。
图18的A至图18的D的图示出了不同大小的纳米盘的暗场和荧光信号的等离子体增强。图18的A是对应于80、100、120、140、160、180和200nm的不同直径纳米盘的暗场测量的等离子体强度的图，并且如图所示，水平随直径增加至高达约180nm，然后在200nm处略微下降。
图18的B是对应于80、100、120、140、160、180和200nm的不同直径纳米盘的TRITC的等离子体强度的图，并且如图所示，水平随直径快速增加至高达120nm，然后快速下降至140nm、略微下降至180nm，然后再次增加至200nm。
图18的C是对应于80、100、120、140、160、180和200的不同直径纳米盘的Cy5的等离子体强度的图，并且如图所示，水平从80略微下降至100nm，然后随直径快速增加至高达120nm，然后下降至200nm。
图18的D是对应于80、100、120、140、160、180和200nm的不同直径纳米盘的Cy5.5的等离子体强度的图，并且如图所示，水平从80至100nm保持相同，随直径从100快速增加至高达140nm，然后快速下降至180nm，然后略微下降至200nm。
TRICT和Cy5在其涂覆在120nm(直径)纳米盘上时显示最大强度，而Cy5.5在140nm直径纳米盘上显示最大强度。
实施例13-EV的分离和制备
从Gli36-WT(ATCC)、Gli36-EGFRvIII(通过慢病毒转导从Gli36-WT产生)的细胞培养物，以及生长在DMEM(Cellgro)中的MCF-7细胞(ATCC)、培养于RPMI-1640培养基(Cellgro)中的OVCA429细胞(ATCC)分离EV。将培养基在37℃下，于5％ CO2中补充10％胎牛血清(FBS，Thermo Fisher)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Cellgro)。此外，对细胞系进行了测试，且没有支原体污染(MycoAlertTM支原体检测试剂盒，Lonza)。
对于EV分离和生物素化，在收集EV之前，将EV在具有1％外泌体耗尽的FBS(ThermoFisher)的DMEM中孵育48小时。收集条件培养基并离心，例如以300x g离心5分钟，然后将上清液过滤，例如通过0.2μm膜过滤器(Millipore Sigma)。
使用标准超速离心(UC)和尺寸排阻色谱(SEC)方法分离EV：(i)对于UC，通过以100,000x g离心1小时来浓缩滤液。去除上清液后，用缓冲剂或盐水溶液如PBS洗涤EV沉淀，并以100,000x g离心1小时。将EV沉淀重新悬浮在PBS中，以及(ii)对于SEC，将滤液加载到离心过滤器(
Plus-70离心过滤器(MWCO＝10kDa，Millipore Sigma)上，并在低温如4℃下以3,500x g离心30分钟。
浓缩后，用PBS将体积调节至1mL。SEC的执行作了修改。简言之，制备10mL注射器(BD Biosciences)，其底部具有20μm孔径的尼龙网(Millipore Sigma)，并用10mLSepharose CL-4B(GE healthcare)填充。将浓缩物加载在顶上，并通过在柱顶上添加PBS而在恒定重力流下收集6份1mL级分。级分4和5用于EV分离。将这些样品加载到Amicon Ultra-2离心过滤器(MWCO＝10kDa，Millipore Sigma)上，并在4℃下以3,500x g离心30分钟。分离的EV在-80℃下储存，直到进一步测量。
将分离的EV重新悬浮在缓冲剂或盐水溶液，例如PBS中，并与捕获剂，如EZ-LinkSulfo-NHS-LC-生物素(Thermo Fisher)一起在室温下孵育足够的时间，例如30分钟。例如，在0.5mL体积中使用20倍摩尔过量的磺基-NHS-生物素与EV蛋白。每个分子中掺入有4-6个生物素。然后根据试剂盒说明，利用Exosome Spin Columns，MW3000(Thermo Fisher)除去过量的生物素。使用0.22μm离心过滤器(
Millipore)过滤制备的EV。
其他实施方案
尽管本说明书包含许多具体的实施细节，但这些细节不应被解释为对任何发明的范围或可能要求保护的范围的限制，而是对特定发明的特定实施方式可能特有的特征的描述。本说明书中在单独实施方式的上下文中描述的某些特征也可以在单一实施方式中组合实施。相反，在单一实施方式的上下文中描述的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合在多种实施方式中实施。此外，尽管特征可以在上文中描述为以某一组合的方式起作用，甚至最初是这样要求保护的，但在一些情况下，可以从组合中删除要求保护的组合中的一个或多个特征，并且要求保护的组合可以针对子组合或子组合的变型。
已经描述了主题的特定实施方式。所描述的实施方式的其他实施方式、改变和排列在以下权利要求的范围内，这对于本领域技术人员是显而易见的。虽然在附图或权利要求中以特定顺序描述了操作，但这不应理解为要求以所示的特定顺序或按相继顺序执行这些操作，或者执行所有所示的操作(一些操作可以被认为是任选的)，以实现期望的结果。在某些情况下，多任务和并行处理可能是有利的。
此外，上述实施方式中的各种系统模块和组件的分离和/或集成不应理解为在所有实施方式中都需要这种分离和/或者集成，并且应当理解，所描述的程序组件和系统通常可以在单个软件产品中集成在一起，或包装到多个软件产品中。
因此，以上对不同实施方案和实施方式的描述并不限定或约束本公开。在不背离本公开的精神和范围的情况下，其他变化、替换和改变也是可能的。
Claims (25)
1.用于检测目标胞外囊泡(EV)的纳米等离子体阵列，所述阵列包括：
基底；
多个纳米结构，所述多个纳米结构被布置为在所述基底上形成纳米结构的周期性阵列，其中纳米结构的周期性阵列的布置和尺寸被设置为放大由结合至所述纳米结构的EV和/或结合至临近所述纳米结构的基底的EV发出、散射或反射的电磁辐射的一个或多个光信号，或被设置为放大由附接至所述EV的报告基团发出、散射或反射的电磁辐射的一个或多个光信号；以及
一种或多种亲和配体，其被固定在所述纳米结构或临近所述纳米结构，其中所述亲和配体选择性地结合至目标EV，以将所述目标EV结合至所述纳米结构或结合至临近所述纳米结构的基底。
2.如权利要求1所述的纳米等离子体阵列，其中所述光信号包括荧光信号、拉曼信号或暗场散射。
3.如权利要求1或权利要求2所述的纳米等离子体阵列，其中所述纳米结构包括多个纳米孔，所述多个纳米孔被布置在阵列中，且形成于所述基底中或设置在所述基底上的金属膜中。
4.如权利要求1或权利要求2所述的纳米等离子体阵列，其中所述纳米结构包括被布置于所述基底的顶面上的阵列中的多个纳米棒、纳米盘或纳米沟槽。
5.如权利要求1-4中任一项所述的纳米等离子体阵列，其中每个所述纳米结构都具有约30至400nm的最大尺寸，例如直径、宽度或长度。
6.如权利要求4所述的纳米等离子体阵列，其中所述纳米结构是纳米棒或纳米块，并且具有约50至约300nm长度、约20至约300nm宽度和约20至约300nm高度的尺寸，或者其中所述纳米结构是纳米盘，并且具有约50至约200nm直径和约20至约300nm高度的尺寸。
7.如权利要求1-6中任一项所述的纳米等离子体阵列，其中所述亲和配体结合至捕获剂，其中所述捕获剂被配置为与所述目标EV上的至少一种表面标志物结合。
8.如权利要求1-5中任一项所述的纳米等离子体阵列，其中所述亲和配体被配置为结合至所述目标EV上的至少一种表面标志物和/或结合至所述目标EV内的至少一种囊泡内标志物。
9.如权利要求1-8中任一项所述的纳米等离子体阵列，其中纳米结构的周期性阵列在纳米结构之间具有约400至800nm的周期。
10.如权利要求1-9中任一项所述的纳米等离子体阵列，其还包括设置在所述基底顶面上的金属膜，
其中所述金属膜包括多个纳米孔，所述多个纳米孔以选定周期穿透所述金属膜，以放大电磁辐射的一个或多个特定波长，其中在纳米孔之间有约400至800nm的周期，
其中所述金属膜包括多种亲和配体，所述多种亲和配体固定在所述纳米孔或临近所述纳米孔，并且
其中所述多种亲和配体选择性地结合至所述目标EV的表面上的标志物。
11.如权利要求10所述的纳米等离子体阵列，其中所述金属膜包括贵金属、过渡金属、碱金属，或以上的任意组合。
12.如权利要求1-11中任一项所述的纳米等离子体阵列，其中所述纳米结构和所述金属膜之一或两者包括金、银、铝或铂。
13.用于检测液体样品中的目标胞外囊泡(EV)的方法，其包括：
获得权利要求1-12中任一项所述的纳米等离子体阵列；
以使所述液体样品中的EV(如果有的话)能够结合至所述亲和配体，从而将所述EV捕获在所述纳米等离子体阵列上的流速，使液体样品在所述纳米等离子体阵列上流动；
用一种或多种报告基团标记捕获在所述纳米等离子体阵列上的目标EV；
将一个或多个特定波长的第一电磁辐射投射到捕获在所述纳米等离子体阵列上的标记的目标EV上，其中一个或多个特定波长的电磁辐射被选择为使所述报告基团发出、散射或反射所述第一电磁辐射或第二电磁辐射；
接收由所述报告基团发出、散射或反射的所述第一电磁辐射或第二电磁辐射，其中纳米结构的所述纳米等离子体阵列的布置和尺寸被设置为放大由所述报告基团发出、散射或反射的所述第一电磁辐射或第二电磁辐射；以及
捕获放大的由所述报告基团发出、散射或反射的所述第一电磁辐射或第二电磁辐射的图像。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述目标EV的数量少于1,000个。
15.如权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述纳米结构包括多个纳米孔，所述多个纳米孔穿透所述基底或设置在所述基底上的金属膜。
16.如权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述纳米结构包括布置在所述基底的顶面上的多个纳米棒、纳米盘或纳米沟槽。
17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其还包括：
根据大小识别EV并丢弃例如大于一微米的大组分；
基于对目标EV标志物的呈阳性，从所识别的EV选择目标EV；
通过对器官或组织特异性标志物呈阳性，选择起源于特定器官或组织的目标EV，以产生特定目标EV；以及
基于所述特定目标EV表面上的囊泡外生物标志物，和/或基于所述特定目标EV内的囊泡内生物标志物，分析单个特定目标EV。
18.用于检测液体样品中的目标胞外囊泡(EV)的系统，所述系统包括：
权利要求1-12中任一项所述的纳米等离子体阵列；
样品控制单元，其包括：
泵；
至少一个流体通道，其被配置为以由使所述液体样品中的EV(如果有的话)能够结合至所述亲和配体，从而捕获所述纳米等离子体阵列上的EV的泵控制的流速，使液体样品在所述纳米等离子体阵列上流动；和
至少一种亲和配体，例如抗体，以用一种或多种报告基团标记捕获在所述纳米等离子体阵列上的目标EV；以及
成像单元，其包括：
光源，其被配置为将电磁辐射投射到捕获在所述纳米等离子体阵列上的标记的目标EV上；和
电磁辐射探测器，例如摄像机或CCD，其被配置为接收由所述目标EV或捕获在所述纳米等离子体阵列上的所述标记的目标EV上的报告基团发出、散射或反射的电磁辐射，以及捕获所述标记的目标EV的图像，其中从所述报告基团反射的散射光发出、散射或反射的电磁辐射具有由纳米结构的周期性阵列放大的一个或多个波长。
19.如权利要求18所述的系统，其中所述纳米结构包括多个纳米孔，所述多个纳米孔被布置在阵列中，并且形成于所述基底中或设置在所述基底上的金属膜中。
20.如权利要求18或权利要求19所述的系统，其中所述纳米结构包括布置于所述基底的顶面上的阵列中的多个纳米棒、纳米盘或纳米沟槽。
21.如权利要求18-20中任一项所述的系统，其中每个纳米结构都具有约30至400nm的最大尺寸，例如直径、宽度或长度。
22.如权利要求21所述的系统，其中所述纳米结构是纳米棒或纳米块，并且具有约50至约300nm长度、约20至约300nm宽度和约20至约300nm高度的尺寸，或者其中所述纳米结构是纳米盘，并且具有约50至约200nm直径和约20至约300nm高度的尺寸。
23.如权利要求18-22中任一项所述的系统，其中所述亲和配体结合至捕获剂，其中所述捕获剂被配置为与所述目标EV上的至少一种表面标志物结合。
24.如权利要求18-22中任一项所述的系统，其中所述亲和配体被配置为结合至所述目标EV上的至少一种表面标志物，和/或结合至所述目标EV内的至少一种囊泡内标志物。
25.如权利要求18-24中任一项所述的系统，其中纳米结构的周期性阵列在纳米结构之间具有约400至800nm的周期。
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