JPWO2013038914A1 - 表面プラズモン共鳴及び表面プラズモン励起増強蛍光分光法を用いた特定のアナライトの定量測定方法 - Google Patents

Abstract

[課題] カラムを用いることなく、迅速に測定することができ、カラム処理に伴う抗原のロスもなく、レクチンなどの標識プローブの消費量も抑えることができる特定のアナライトの定量測定方法を提供する。[解決手段] ＳＰＲ測定によって総アナライト濃度を測定した後、蛍光標識プローブによって特定のアナライトを標識して、ＳＰＦＳ測定によって特定のアナライト濃度を測定し、総アナライト濃度と特定のアナライト濃度とから、総アナライト量に対する特定のアナライト量の割合を算出する。

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Surface Plasmon Resonance）現象、及び、ＳＰＲ現象を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理を用いた、特定のアナライトの定量測定方法に関する。

従来から、疾病診断において血液、尿、組織中のタンパク質が広く用いられている。生体内のタンパク質のほとんどは、アミノ酸からなるタンパク質の表面に、糖鎖が修飾された状態で存在する。

同じアミノ酸配列のタンパク質（同一名称のタンパク質）であっても、修飾されている糖鎖は多種多様であり、タンパク質を産生する細胞の状態によってその糖鎖構造は異なることが知られている。

このような糖鎖の変化と疾病との関係性についても明らかになってきており、例えば、非特許文献１、特許文献１に開示されるようなαフェトプロテイン（ＡＦＰ）糖鎖分画測定や、非特許文献２、３に開示されるような癌胎児性抗原（ＣＥＡ）糖鎖分画測定などに応用されている。

ＡＦＰ糖鎖分画測定のうち、癌化に伴う糖鎖の変化をレクチン（ＬＣＡ）との結合性を検出するＡＦＰ−Ｌ３分画が、肝癌のマーカーとして用いられている。ＡＦＰは、ＬＣＡ非結合性分画（Ｌ１）、ＬＣＡ弱結合性分画（Ｌ２）、ＬＣＡ結合性分画（Ｌ３）の３つに分かれ、慢性肝炎や肝硬変では主にＬ１が、肝癌ではＬ３が増加することになる。

このため、総ＡＦＰ量に占めるＬ３分画量を測定することによって、肝癌の発見、肝炎と肝癌との識別などに応用することができる。

また、ＣＥＡ糖鎖分画測定は、主に腺癌に対する指標となり、大腸癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌などの発見に用いられている。

他にも、絨毛癌、直腸癌などで糖鎖の癌性変化が知られており、このような糖鎖の癌性変化を測定することで、癌診断に非常に有用であることがわかってきた。

このような糖鎖が変化した糖タンパク質の存在割合を定量する方法としては、レクチンカラムクロマトグラフィーを用いて、糖タンパク質を修飾している糖鎖の違いを利用して、カラムによって分離した後に、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）測定を行うことによって、特定の糖鎖を有するタンパク質の定量を行うことができる。

特開昭６１−２９２０６２号公報

Sugar Chains of Human Cord Serum α-Fetoprotein: Characteristics of N-linked Sugar Chains of Glycoproteins Produced in Human Liver and Hepatocellular Carcinomas, K. Yamashita et al., Cancer Res., 53, 1 (1993) Carbohydrate Structures of Nonspecific Cross-reacting Antigen-2, a Glycoprotein Purified from Meconium as an Antigen Cross-reacting with Anticarcinoembryonic Antigen Antibody, K. Yamashita et al., Biol. Chem., 264, 17873 (1989) Structural Studies of the Carbohydrate Moieties of Carcinoembryonic Antigens, K. Yamashita et al., Cancer Res., 47, 3451 (1987)

しかしながら、このような方法では、カラムによって抗原を分離精製する工程が含まれており、測定に時間がかかる、カラム処理を行う段階で抗原をロスする、といった問題が生じていた。また、抗原を分離するために必要となるレクチンを非常に大量に消費するため、測定コストが高くなってしまっていた。

また、分画定量に使用されるレクチンは、親和性が低く検出プローブとして用いた場合、ある程度高い濃度の抗原量の定量にしか利用できず、抗原量が少ない場合には、ＥＬＩＳＡのような測定系では、良好に検出・定量することができなかった。

ところで、極微少な物質の検出を行う場合において、物質の物理的現象を応用することでこのような物質の検出を可能とした検体検出装置として、ナノメートルレベルなどの微細領域中で電子と光が共鳴する現象（表面プラズモン現象（ＳＰＲ；Surface Plasmon Resonance）現象）を応用し、例えば、生体内の極微少なアナライトの検出を行うようにした表面プラズモン共鳴装置（以下、「ＳＰＲ装置」と言う）が知られている。

また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を応用した、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づき、ＳＰＲ装置よりもさらに高精度にアナライト検出を行えるようにした表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」と言う）も、このような検体検出装置として知られている。

この表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザー光などの入射光が、金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；Attenuated Total Reflectance）する条件において、金属薄膜表面に表面プラズモン光（疎密波）を発生させることによって、光源より照射した入射光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やして、表面プラズモン光の電場増強効果を得るようになっている。

そして、この電場増強効果により、金属薄膜近傍に捕捉したアナライトと結合（標識）した蛍光物質を効率良く励起させ、例えば、フォトンカウンティング方式の光電子倍増管（ＰＭＴ；Photomultiplier Tube）やＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラなどの光検出手段を用いて、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度のアナライトをも検出することができる。

本発明では、このようなＳＰＲ装置及びＳＰＦＳ装置を用いて糖鎖の癌化変化を測定することによって、カラムを用いることなく、迅速に測定することができ、カラム処理に伴う抗原のロスもなく、レクチンなどの標識プローブの消費量も抑えることができる特定のアナライトの定量測定方法を提供することを目的とする。

本発明は、前述したような従来技術における課題及び目的を達成するために発明されたものであって、本発明の特定のアナライトの定量測定方法は、
誘電体部材と、該誘電体部材上に形成された金属膜と、該金属膜上に形成され前記特定のアナライトを含むアナライトを捕捉するリガンドと、を有するセンサーチップに、前記特定のアナライトを含む検体を供給して前記リガンドに接触させる工程と、
前記センサーチップの金属膜に対して、前記誘電体部材を介して入射光を照射するとともに、前記入射光が前記金属膜で反射した金属膜反射光を、受光手段によって受光することによって、前記金属膜反射光の光量を測定する工程と、
前記金属膜反射光の光量を測定した後に、前記特定のアナライトを蛍光標識するための蛍光標識プローブを、前記特定のアナライトと反応させる工程と、
前記センサーチップの金属膜に対して、前記誘電体部材を介して入射光を照射することによって発生した表面プラズモン光で、前記特定のアナライトと結合した蛍光標識プローブを励起して、発生した蛍光を光検出手段によって受光することによって、前記蛍光の光量を測定する工程と、
前記金属膜反射光の光量に基づいて、前記検体における総アナライト濃度を算出する工程と、
前記蛍光の光量に基づいて、前記検体における特定のアナライト濃度を算出する工程と、
前記総アナライト濃度と、前記特定のアナライト濃度とから、総アナライト量に対する特定のアナライト量の割合を算出する工程と、
を有することを特徴とする。

このように構成することによって、特定のアナライトをカラムによって予め分離精製する必要がなくなり、迅速に測定することができる。また、カラム処理を行わないため特定のアナライトのロスなどの問題が生じることもない。また、レクチンの消費量を抑制することもできるため、測定コストを低減することもできる。

さらに、特定のアナライトを定量するためにＳＰＦＳ測定を行っているため、特定のアナライトの量が微量であった場合でも、高精度に特定のアナライトを検出することができるため、総アナライト量に対する特定のアナライト量の割合を精確に測定することができる。

また、本発明の定量測定方法は、前記金属膜上に流路が形成され、該流路の一部に、前記リガンドが形成されていることを特徴とする。

このように、金属膜上に流路を形成することで、検体液を送液することができ、流路の一部に形成された捕捉体によって、検体液中のアナライトを確実に捕捉することができる。

また、本発明の定量測定方法は、前記リガンドが、タンパク質または核酸であることを特徴とする。

また、本発明の定量測定方法は、前記特定のアナライトが、糖鎖を有することを特徴とする。

また、本発明の定量測定方法は、前記蛍光標識プローブが、蛍光色素によって標識され、前記特定のアナライトに結合するレクチンであることを特徴とする。

このように、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）や癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの定量測定に用いることができ、例えば、ＡＦＰ−Ｌ３を検出するのに用いることによって、精確かつ迅速に肝癌の診断などを行うことができる。

また、本発明の定量測定方法は、前記検体における総アナライト濃度を算出する工程は、複数の濃度の標準抗原から、予め作成した総アナライト濃度と金属膜反射光の光量に関する検量線と、前記金属膜反射光の光量を測定する工程により測定された金属膜反射光の光量とに基づいて算出することにより行うとともに、
前記検体における特定のアナライト濃度を算出する工程は、複数の濃度の標準抗原から、予め作成した特定のアナライト濃度と蛍光の光量に関する検量線と、前記蛍光の光量を測定する工程により測定された蛍光の光量とに基づいて算出することにより行うことを特徴とする。

このように、予め金属膜反射光の光量に関する検量線及び蛍光の光量に関する検量線を作成しておくことで、定量演算手段などによって、正確かつ迅速に総アナライト濃度及び特定のアナライト濃度の定量を行うことができる。

本発明によれば、ＳＰＲ測定によって総アナライト濃度を測定した後、ＳＰＦＳ測定によって特定のアナライト濃度を測定することによって、アナライトの分画を行う必要がなく、総アナライト量に対する特定のアナライトの濃度を精確かつ迅速に測定することができ、例えば、ＡＦＰ−Ｌ３の検出に用いることによって、肝癌の疾病診断などに応用することなどができる。

図１は、本発明の特定のアナライトの定量測定方法を説明する定量測定装置の概略を模式的に示す概略図である。 図２は、図１の定量測定装置の部分拡大図である。 図３は、標準抗原（アナライト４６）を送液する前のセンサ部３８を模式的に表す拡大模式図である。 図４は、標準抗原（アナライト４６）を送液した後のセンサ部３８を模式的に表す拡大模式図である。 図５は、各検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液のＳＰＲシグナルと、ブランクシグナルとの差であるＳＰＲシグナル値の、時間経過に伴う変化を示すグラフである。 図６は、各検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液のＳＰＲシグナル値と、各検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液のＡＦＰ濃度との関係を示すグラフである。 図７は、蛍光標識プローブ４８を送液した後のセンサ部３８を模式的に表す拡大模式図である。 図８は、各検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液のＳＰＦＳシグナル値と、各検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液のＡＦＰ―Ｌ３濃度との関係を示すグラフである。

以下、本発明の実施の形態（実施例）を図面に基づいてより詳細に説明する。
１．定量測定装置の構成
図１は、本発明のアナライトの定量測定方法を説明する定量測定装置の概略を模式的に示す概略図、図２は、図１の定量測定装置の部分拡大図である。

図１，２に示すように、本発明の定量測定装置１０は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２と、この誘電体部材１２の水平な上面１２ａに形成された金属膜１４とを有するセンサーチップ１６を備えており、このセンサーチップ１６は、定量測定装置１０のセンサーチップ装填部１８に装填されている。

また、誘電体部材１２の下方の一方の側面１２ｂの側には、図１に示すように、光源２０が配置されており、この光源２０からの入射光２２が、誘電体部材１２の外側下方から、誘電体部材１２の側面１２ｂに入射して、誘電体部材１２を介して、誘電体部材１２の上面１２ａに形成された金属膜１４に向かって照射されるようになっている。

なお、誘電体部材１２の材料としては、特に限定されるものではないが、光学的に透明な、例えば、ガラス、セラミックスなどの各種の無機物、天然ポリマー、合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性、製造安定性、光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）または二酸化チタン（ＴｉＯ₂）を含むものが好ましい。

また、誘電体部材１２は、ｄ線（波長５８８ｎｍ）における屈折率（ｎ_d）が、好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが、好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍである。なお、誘電体部材１２の大きさ（縦×横）は特に限定されない。

なお、ガラス製の誘電体部材１２は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率（ｎ_d）１．５２）および「ＬａＳＦＮ９」（屈折率（ｎ_d）１．８５）、（株）住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ３」（屈折率（ｎ_d）１．８４）、「Ｋ−ＬａＳＦｎ１７」（屈折率（ｎ_d）１．８８）および「Ｋ−ＬａＳＦｎ２２」（屈折率（ｎ_d）１．９０）、（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ１０」（屈折率（ｎ_d）１．７２）などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。

また、誘電体部材１２は、その上面１２ａに金属膜１４を形成する前に、表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。

酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。

プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。

また、この実施例では、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２を用いたが、鉛直断面形状を三角形（いわゆる三角プリズム）、半円形状、半楕円形状にするなど、誘電体部材１２の形状は、適宜変更可能である。

また、誘電体部材１２の上面１２ａに形成される金属膜１４の材質としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは、金からなり、さらに、これらの金属の合金から構成してもよい。

このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ、後述するように、表面プラズモン光による電場増強が大きくなるので、金属膜１４として好適である。

また、金属膜１４の形成方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法など）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。好ましくは、スパッタリング法、蒸着法を使用するのが、薄膜形成条件の調整が容易であるので望ましい。

さらに、金属膜１４の厚さとしては、特に限定されるものではないが、好ましくは、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、および、それらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であるのが望ましい。

なお、後述する電場増強効果の観点から、より好ましい金属膜１４の厚さとしては、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、および、それらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であるのが望ましい。

金属膜１４の厚さが上記範囲内であれば、後述する表面プラズモン光が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属膜１４であれば、大きさ（縦×横）の寸法、形状は、特に限定されない。

また、光源２０としては、金属膜１４にプラズモン光を発生させることができるものであれば、特に限定されるものではないが、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、フォトダイオードなどのレーザー光を光源として用いることが好ましい。フォトダイオードなどのレーザー光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。

なお、光源２０として、レーザー光を用いる場合には、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷのＬＤ（Laser Diode）；波長２３０〜８００ｎｍ、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザーなどを用いることができる。

また、光学フィルタとしては、例えば、ＮＤ（減光）フィルタ、中性濃度フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。ＮＤ（減光）フィルタや中性濃度フィルタなどは、入射レーザー光量を調整することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには、精度の高い測定を実施するために、このような光学フィルタを用いることが好ましい。

また、光源２０と誘電体部材１２との間には、光源２０から照射されるレーザー光を、金属膜１４上で表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするための偏光フィルタを設けることもできる。

また、誘電体部材１２の下方の他方の側面１２ｃの側には、図１に示すように、入射光２２が金属膜１４によって反射された金属膜反射光２４を受光する受光手段２６が備えられている。

なお、光源２０には、光源２０から照射される入射光２２の、金属膜１４に対する入射角α１を適宜変更可能とする入射角調整手段（図示せず）が備えられている。一方で、受光手段２６にも、図示しない可動手段が備えられており、金属膜反射光２４の反射角が変わった場合にも、光源２０と同期して、確実に金属膜反射光２４を受光するように構成されている。

また、光源２０の入射角調整手段や受光手段２６の可動手段としては、特に限定されるものではなく、例えば、ステッピングモーターや歯車列などを用いて、光源２０や受光手段２６を回動（例えば、図１において、平面内で金属膜１４への入射光の照射位置を中心に回動）させるように構成することができる。

なお、センサーチップ１６、光源２０、受光手段２６によって、本発明の定量測定装置１０のＳＰＲ測定を行うＳＰＲ測定部２８が構成されている。

また、センサーチップ１６の上方には、後述するような蛍光物質が励起されて発光した蛍光３０を受光するための光検出手段３２が備えられている。

ここで、光検出手段３２としては、特に限定されるものではないが、例えば、フォトンカウンティング方式の光電子増倍管（ＰＭＴ；PhotoMultiplier Tube）や、多点計測が可能なＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサなどを用いることができる。

なお、センサーチップ１６と、光検出手段３２との間には、例えば、カットフィルタや集光レンズなどを設けることもできる。

カットフィルタは、外光（定量測定装置１０外の照明光や環境光など）、光源２０から照射された入射光の透過成分、迷光（各所における入射光の散乱成分）、プラズモン光の散乱光（入射光を起源とし、センサーチップ１６表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）などの光学ノイズや、蛍光物質の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタや色フィルタなどを用いることができる。

また、集光レンズは、蛍光物質が励起されて生じる蛍光シグナルを、光検出手段３２に効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系を用いることができる。簡易な集光系としては、例えば、顕微鏡などで使用されている、例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製などの市販の対物レンズを転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。

なお、センサーチップ１６、光源２０、光検出手段３２によって、本発明の定量測定装置１０のＳＰＦＳ測定を行うＳＰＦＳ測定部３４が構成されている。

また、受光手段２６および光検出手段３２は、それぞれ、定量演算手段４０に接続されており、受光手段２６によって受光した金属膜反射光２４の光量と、光検出手段３２によって受光した蛍光３０の光量とが、定量演算手段４０に送信されるように構成されている。

また、本実施例のセンサーチップ１６では、金属膜１４の上面１４ａに流路３６が形成されている。この流路３６の一部には、特定のアナライトを含むアナライトと特異的に結合するリガンド（以下、「特定のアナライトを含むアナライトを捕捉するリガンド」ともいう。両者は同じ意味である。）が固定化されたセンサ部３８が設けられている。

ここで、アナライトとしては、特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む）、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等の癌胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよい。

また、特定のアナライトとしては、例えば、上述するアナライトのうち、後述するような蛍光標識プローブと特異的に結合するものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、特定のレクチンと結合する糖鎖を有するアナライトとすることができる。

また、例えば、特定のアナライトをリン酸化したタンパク質として、リン酸化したタンパク質と特異的に結合する蛍光標識プローブを用いることによって、本発明の定量測定方法を、ｐ５３やＫ−ｒａｓなどの癌に関係するタンパク質のリン酸化レベルの違いを見分けたり、特異的変異を有するＫ−ｒａｓタンパク質の割合を測定したりすることなどに用いることもできる。

また、リガンドとしては、特定のアナライトを含むアナライトと特異的に結合するものであれば、特に限定されるものではなく、タンパク質であっても核酸であっても構わない。

本実施例においては、流路３６に特定のアナライトを含む検体液を送液することによって、アナライトをセンサ部３８に結合させ、後述するように、ＳＰＲ測定部２８およびＳＰＦＳ測定部３４によって、金属膜反射光２４の光量と、蛍光３０の光量とを測定するように構成されている。

なお、流路３６を設けずに、金属膜１４の上にリガンドが固定化されたセンサ部３８を設けた構成にしてもよい。このように構成した場合には、特定のアナライトを含む検体液を、例えば、スポイトなどを用いてセンサ部３８に適量添加することによって、センサ部３８に特定のアナライトを含むアナライトを捕捉させることができる。

このように、金属膜１４上にセンサ部３８を設ける場合には、例えば、金属膜１４上にＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer；自己組織化単分子膜）を形成するとともに、ＳＡＭ上に固相化層を設けるなどし、この固相化層に、リガンドを固定化することによって、構成することができる。

なお、このようなＳＡＭを構成する単分子としては、通常、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同任化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。

このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属膜がその表面に形成された誘電体部材を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。

また、ＳＡＭを形成する代わりに「誘電体からなるスペーサ層」を形成してもよく、この場合、有機物とケイ素から構成される化合物で、分子中に２種以上の異なった反応基を持つシランカップリング剤を用いてもよい。シランカップリング剤としては、加水分解でシラノール基〔Ｓｉ-ＯＨ〕を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、他端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有する分子が利用できる。

誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。

誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法，電子線蒸着法，熱蒸着法，ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法，またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。

また、ＳＡＭ上に形成される固相化層としては、グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性高分子ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。

固相化層の平均膜厚は、３ｎｍ以上８０ｎｍ以下であることが好ましい。この膜厚は原子間力顕微鏡〔ＡＦＭ〕などを用いて測定することができる。固相化層の平均膜厚がこのような範囲内であると、ＳＰＦＳ用センサーチップをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。
２．定量測定に用いる検量線について
上述する定量測定装置１０を用いて、特定の糖鎖を有するアナライトの定量を行う場合に用いる検量線の作成方法について詳述する。

まず、定量測定装置１０のＳＰＲ測定部２８において、光源２０から入射光２２を、誘電体部材１２を介して、金属膜１４に照射するとともに、金属膜反射光２４を受光手段２６によって受光する。

この状態で、入射角調整手段によって、入射光２２の入射角α１を変えながら、受光手段２６において受光する金属膜反射光２４のシグナル（ＳＰＲシグナル）を測定する。

そして、ＳＰＲシグナルが最も小さくなる入射角α２（ＡＴＲする入射角）を探しだし、入射光２２の入射角がα２となるように、入射角調整手段を固定する。

続いて、センサーチップ１６に設けられた流路３６に、所定濃度の標準抗原を適量送液し、所定時間循環させる。ここで、標準抗原としては、例えば、ミューコスワコー ＡＦＰ−Ｌ３用コントロールＬなどを用いることができる。また、標準抗原の濃度は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などによって希釈することで調整することができる。

標準抗原を送液するのと同時に、定量測定装置１０のＳＰＲ測定部２８において、ＳＰＲ測定を開始する。すなわち、光源２０から入射光２２を、誘電体部材１２を介して、金属膜１４に照射するとともに、金属膜反射光２４を受光手段２６によって受光する。

続いて、流路３６に、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（Tris-Buffered Saline）などの洗浄液を送液し、所定時間経過後のＳＰＲ測定による金属膜反射光の光量（以下、「ＳＰＲシグナル」と呼ぶ。）を測定する。

次に、蛍光標識プローブとして、蛍光色素によって標識され、特定のアナライトと結合するレクチンを含んだレクチン溶液を、流路３６に適量送液し、所定時間循環させる。ここで、蛍光色素としては、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７などを用いることができる。

続いて、流路３６に、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳなどの洗浄液を送液し、所定時間洗浄を行う。そして、ＳＰＦＳ測定部３４によって、ＳＰＦＳ測定を行う。すなわち、光源２０から入射光２２を、誘電体部材１２を介して、金属膜１４に照射するとともに、蛍光３０を光検出手段３２によって受光することによって、ＳＰＦＳ測定による蛍光の光量（以下、「ＳＰＦＳシグナル」と呼ぶ。）を測定する。

複数の濃度の標準抗原について、上述するのと同様にして、ＳＰＲシグナルとＳＰＦＳシグナルとをそれぞれ測定することによって、標準抗原の総アナライト濃度とＳＰＲシグナルとに関する検量線、および、標準抗原の特定のアナライト濃度とＳＰＦＳシグナルとに関する検量線を作成することができる。

なお、ＳＰＲシグナルおよびＳＰＦＳシグナルに関する検量線の作成には、既知の方法を用いることができ、例えば、得られたＳＰＲシグナルやＳＰＦＳシグナルから、線形近似や線形補間、二次補間などを用いて、検量線を作成することができる。

また、ＳＰＲシグナルおよびＳＰＦＳシグナルは、得られた値をそのまま用いて検量線を作成してもよいし、後述するようにブランクシグナルを測定し、ＳＰＲシグナルとブランクシグナルとの差であるＳＰＲシグナル値、および、ＳＰＦＳシグナルとブランクシグナルとの差であるＳＰＦＳシグナル値を用いて検量線を作成することもできる。

なお、このようにして得られたＳＰＲシグナルおよびＳＰＦＳシグナルに関する検量線は、定量演算手段４０に事前に記憶しておくことで、以下のようにして、未知のサンプルを定量することができる。
３．定量測定方法
まず、センサーチップ１６に設けられた流路３６に、未知のサンプルを適量送液し、所定時間循環させる。未知のサンプルを送液するのと同時に、定量測定装置１０のＳＰＲ測定部２８において、ＳＰＲ測定を開始する。

続いて、流路３６に洗浄液を送液し、所定時間経過後のＳＰＲシグナルを測定する。ここで得られたＳＰＲシグナルは、定量演算手段４０に送られ、ＳＰＲシグナルに関する検量線に基づいて、未知のサンプルに含まれる総アナライト濃度が算出される。

次に、蛍光色素によって標識され、特定のアナライトと結合するレクチンを含んだレクチン溶液を、流路３６に適量送液し、所定時間反応させる。

続いて、流路３６に洗浄液を送液し、所定時間洗浄を行う。そして、ＳＰＦＳ測定部３４によって、ＳＰＦＳシグナルを測定する。ここで得られたＳＰＦＳシグナルは、定量演算手段４０に送られ、ＳＰＦＳシグナルに関する検量線に基づいて、未知のサンプルに含まれる特定のアナライト濃度が算出される。

このようにして得られた総アナライト濃度及び特定のアナライト濃度に基づいて、定量演算手段４０において、数１に示す計算式によって総アナライト量に対する特定のアナライトの割合（以下、単に「特定のアナライトの割合（％）」とも言う。）が算出される。

（定量測定装置の構成）
この実施例で用いた定量測定装置は、基本的には、上述した定量測定装置１０と同様な構成となっている。

なお、光源２０として、波長６３５ｎｍの光を照射することができるレーザーダイオード（ＬＤ）を用いており、光源２０と誘電体部材１２との間には、光学フィルタとして減光フィルタ（中性濃度フィルタ）を設けてフォトン量を調整できるようにした。

また、誘電体部材１２としては、シグマ光機（株）製の６０度プリズムを用い、この誘電体部材１２の上部に、後述する、プラズモン励起センサを固定することによって、センサーチップ１６を構成する。

また、センサーチップ１６の上部には、集光レンズとして対物レンズを備え、光検出手段３２としては、光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いた。
（プラズモン励起センサの作製）
屈折率１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ １０）をプラズマ洗浄し、この基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法によって形成した。その後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法によって形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。

このようにして金薄膜が形成された基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の表面にＳＡＭ膜を形成した。基板をこの溶液から取り出し、エタノール及びイソプロパノールで洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。

高さ０．５ｍｍの流路となる溝を有し、溝の両端に貫通穴を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを、ＳＡＭ膜の表面が流路の内側となるように溝をＳＡＭ膜に対向させて基板上に配置し、流路の外側のＰＤＭＳ製シート上部から圧着して、ビスでＰＤＭＳ製シート（流路３６）とプラズモン励起センサとを固定した。
（標識レクチンの作製）
蛍光標識レクチンを、蛍光物質ラベリングキットを利用して作製した。ＬＣＡレクチン１００μｇ相当と、０．１Ｍ重炭酸ナトリウムと、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅとを混合し、室温で１時間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィー及び限外濾過を行い、標識に利用されなかったＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅを取り除いた。その後、吸光度を測定し標識レクチン濃度を定量した。
（抗体の固相化）
作製したセンサーチップを外部流路に接続し、超純水を１０分間、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２０分間、ペリスタポンプによって、室温（２５℃）、流速５００μＬ／分の条件で循環送液させ、その表面を平衡化した。

続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を５ｍＬ送液し、２０分間循環させた後、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）溶液２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。なお、１重量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３０分間循環送液することによって、流路内の非特異吸着防止処理を行った。
（ＳＰＲシグナルに関する検量線の作成）
図３は、標準抗原（アナライト４６）を送液する前のセンサ部３８を模式的に表す拡大模式図、図４は、標準抗原（アナライト４６）を送液した後のセンサ部３８を模式的に表す拡大模式図である。

標準抗原を送液する前のセンサ部３８には、図３に示すように、上記のような１次抗体（リガンド４４）が形成された状態となっている。

標準抗原として、ミュータスワコー ＡＦＰ−Ｌ３用コントロールＬ（Ｌ３＝３２％、ＡＦＰ濃度４９ｎｇ／ｍＬ）を用い、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液にて希釈して、ＡＦＰ抗原濃度０ｎｇ／ｍＬ、１．０ｎｇ／ｍＬ、２．０ｎｇ／ｍＬ、４．０ｎｇ／ｍＬ、８．０ｎｇ／ｍＬの検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液を作製した。

各検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液は、Ｌ３を３２％含有する抗原溶液であり、Ｌ３の濃度としては、０ｎｇ／ｍＬ、０．３２ｎｇ／ｍＬ、０．６４ｎｇ／ｍＬ、１．２８ｎｇ／ｍＬ、２．５６ｎｇ／ｍＬとなっている。

各濃度の検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液を、流路に０．５ｍＬ添加し、２０分間循環送液させた。続いて、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、１５分間洗浄した。

このように、標準抗原（アナライト４６）を送液することによって、図４に示すように、アナライト４６として、検量線用サンプルＡＦＰ抗原が、リガンド４４と結合することになる。なお、符号４６ａは、検量線用サンプルＡＦＰ抗原のタンパク質、符号４６ｂ、４６ｃは、検量線用サンプルＡＦＰ抗原の糖鎖である。本実施例においては、糖鎖４６ｃを有する検量線用サンプルＡＦＰ抗原が、特定のアナライトであるＡＦＰ−Ｌ３に特有の糖鎖構造を有するＡＦＰとする。

検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液を送液すると同時に、定量測定装置１０によって、レーザー光を所定の入射角（本実施例では５６°）にて入射させ、金薄膜で反射された光を受光手段２６としてフォトダイオードを用いてリアルタイムにＳＰＲ測定を行った。

ＡＦＰ抗原濃度０ｎｇ／ｍＬの検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液を送液した時のＳＰＲシグナルをブランクシグナルとして、各検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液のＳＰＲシグナルと、ブランクシグナルとの差であるＳＰＲシグナル値は、図５に示すようになった。また、ＴＢＳによる洗浄後１０分経過時のＳＰＲシグナル値は、以下の表１のようになった。

表１にまとめた各検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液のＳＰＲシグナル値を用いて、図６に示すような検量線が得られた。なお、検量線の作成には、線形近似を用いた。
（ＳＰＦＳシグナルに関する検量線の作成）
図７は、蛍光標識プローブ４８を送液した後のセンサ部３８を模式的に表す拡大模式図である。

各検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液の反応後、蛍光標識プローブ４８として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７を標識したＬＣＡレクチン溶液（１μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したもの）を１ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて５分間送液した。

その後Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、５分間洗浄した。その後、定量測定装置によって、ＳＰＦＳ測定を行った。

このように、蛍光標識プローブ４８としてＬＣＡレクチン溶液を送液することによって、図７に示すように、ＬＣＡレクチンは、糖鎖４６ｃと特異的に結合し、ＡＦＰ−Ｌ３のみを選択的に蛍光標識することができる。

ＡＦＰ抗原濃度０ｎｇ／ｍＬの検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液を送液した時のＳＰＦＳシグナルをブランクシグナルとして、各検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液のＳＰＦＳシグナルと、ブランクシグナルとの差であるＳＰＦＳシグナル値は、以下の表２のようになった。

表２にまとめた各検量線用サンプルＡＦＰ抗原溶液のＳＰＦＳシグナル値を用いて、図８に示すような検量線が得られた。なお、検量線の作成には、線形近似を用いた。
（テストサンプルの定量測定）
テストサンプルとして、ＡＦＰ抗原濃度５ｎｇ／ｍＬ、Ｌ３含有量２０％のＡＦＰ抗原溶液を調製した。調製は、ミュータスワコー ＡＦＰ−Ｌ３用コントロールＬ（Ｌ３＝２０％、ＡＦＰ濃度２００ｎｇ／ｍＬ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって希釈することで行った。

このＡＦＰ抗原溶液について、上述するのと同様に、ＳＰＲ測定及びＳＰＦＳ測定を実施した。その結果、ＳＰＲシグナル値は８０、ＳＰＦＳシグナル値は２０１０６となった。ＳＰＲシグナルに関する検量線及びＳＰＦＳシグナルに関する検量線を用いて定量を行うと、総アナライト濃度は４．６１、Ｌ３濃度は１．０３となった。これらの値を数１に代入することによって、特定のアナライトであるＬ３の割合は２２％となる。

このように、濃度定量の結果は、±５％に収まり、かつ、Ｌ３の割合も実測値と理論値とがほぼ一致する結果が得られた。このように、本発明の定量測定方法を用いることによって、例えば、癌患者血清中の糖鎖量を精確かつ迅速に定量することが可能となる。

以上、本発明の好ましい実施の態様を説明してきたが、本発明はこれに限定されることはなく、例えば、上記実施例では、ＳＰＲ測定部の光源と、ＳＰＦＳ測定部の光源とを共通した１台の光源で賄っているが、必要に応じて複数の光源を備えていてもよい。

また、各種溶液を循環送液する態様を例として説明したが、必ずしも循環させる必要はなく、一方向に送液し続ける態様や、両方向に往復送液する態様、あるいは、所定量の溶液を送液した後、所定時間滞留させる態様など、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。

本発明は、ＡＦＰ糖鎖測定やＣＥＡ糖鎖測定などの臨床試験のような、高精度の測定が要求される分野において、精確でかつ迅速に特定のアナライトの定量測定を行うことができる。

１０ 定量測定装置
１２ 誘電体部材
１２ａ 上面
１２ｂ 側面
１２ｃ 側面
１４ 金属膜
１４ａ 上面
１６ センサーチップ
１８ センサーチップ装填部
２０ 光源
２２ 入射光
２４ 金属膜反射光
２６ 受光手段
２８ ＳＰＲ測定部
３０ 蛍光
３２ 光検出手段
３４ ＳＰＦＳ測定部
３６ 微細流路
３８ センサ部
４０ 定量演算手段
４４ リガンド
４６ アナライト
４６ａ タンパク質
４６ｂ 糖鎖
４６ｃ 糖鎖
４８ 蛍光標識プローブ

Claims (6)

1. 特定のアナライトを定量するための定量測定方法であって、
   誘電体部材と、該誘電体部材上に形成された金属膜と、該金属膜上に形成され前記特定のアナライトを含むアナライトを捕捉するリガンドと、を有するセンサーチップに、前記特定のアナライトを含む検体を供給して前記リガンドに接触させる工程と、
   前記センサーチップの金属膜に対して、前記誘電体部材を介して入射光を照射するとともに、前記入射光が前記金属膜で反射した金属膜反射光を、受光手段によって受光することによって、前記金属膜反射光の光量を測定する工程と、
   前記金属膜反射光の光量を測定した後に、前記特定のアナライトを蛍光標識するための蛍光標識プローブを、前記特定のアナライトと反応させる工程と、
   前記センサーチップの金属膜に対して、前記誘電体部材を介して入射光を照射することによって発生した表面プラズモン光で、前記特定のアナライトと結合した蛍光標識プローブを励起して、発生した蛍光を光検出手段によって受光することによって、前記蛍光の光量を測定する工程と、
   前記金属膜反射光の光量に基づいて、前記検体における総アナライト濃度を算出する工程と、
   前記蛍光の光量に基づいて、前記検体における特定のアナライト濃度を算出する工程と、
   前記総アナライト濃度と、前記特定のアナライト濃度とから、総アナライト量に対する特定のアナライト量の割合を算出する工程と、
   を有することを特徴とする定量測定方法。
2. 前記金属膜上に流路が形成され、該流路の一部に、前記リガンドが形成されていることを特徴とする請求項１に記載の定量測定方法。
3. 前記リガンドが、タンパク質または核酸であることを特徴とする請求項１または２に記載の定量測定方法。
4. 前記特定のアナライトが、糖鎖を有することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の定量測定方法。
5. 前記蛍光標識プローブが、蛍光色素によって標識され、前記特定のアナライトに結合するレクチンであることを特徴とする請求項４に記載の定量測定方法。
6. 前記検体における総アナライト濃度を算出する工程は、複数の濃度の標準抗原から、予め作成した総アナライト濃度と金属膜反射光の光量に関する検量線と、前記金属膜反射光の光量を測定する工程により測定された金属膜反射光の光量とに基づいて算出することにより行うとともに、
   前記検体における特定のアナライト濃度を算出する工程は、複数の濃度の標準抗原から、予め作成した特定のアナライト濃度と蛍光の光量に関する検量線と、前記蛍光の光量を測定する工程により測定された蛍光の光量とに基づいて、算出することにより行うことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の定量測定方法。

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