JP2019078767A - 表面プラズモン励起増強蛍光分光法(spfs)を用いた免疫測定法における夾雑物由来の非特異的シグナルの抑制方法 - Google Patents
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Abstract
Description
表面プラズモン励起増強蛍光分析法(SPFS)を用いた免疫測定法(一次抗体に替えて測定対象化合物に対するレセプターを用いる場合を含む)における夾雑物由来の非特異的シグナルの抑制方法であって、
(1)検体に酸又はアルカリを添加する前処理、
(2)検体に金属イオンを添加する前処理、及び
(3)検体を加熱する前処理
の少なくとも一つの前処理を行うことを特徴とする非特異的シグナルの抑制方法。
(1)検体
本発明は、用いる検体は特に制限はなく、例えば、ヒトや動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、細胞、組織及び器官及びこれらの調整物(例えば、生検標本)が挙げられる。特に、癌抗原、腫瘍マーカーを含む可能性のある血液、血清及び血漿は測定する生体試料として好適である。
測定対象化合物は、免疫測定法でリガンド(抗体)によって捕捉可能な物質であればよい。また、サンドイッチ法の蛍光標識体としてレクチンを用いる場合は、糖鎖を有する物質を測定対象化合物とする。
本発明では、(i)検体に酸又はアルカリを添加する前処理、(ii)検体に金属イオンを添加する前処理、及び、(iii)検体を加熱する前処理の少なくとも一つの前処理を実施する。これらの前処理を単独で行っても、組み合わせて行ってもよい。前処理は、検体中の夾雑物がSPFSのセンサ部に非特異的に吸着することを抑制するために行うため、検体を後述するSPFS用測定装置の測定領域へ供給する(センサチップの金属薄膜上の反応層に接触させる)前に行う。以下、それぞれの前処理について説明する。
添加する酸、アルカリに特に制限はなく、有機酸、無機酸いずれも使用可能である。
酸、アルカリは、検体中で所定のpHを維持するために、通常は緩衝液の形で検体に添加する。緩衝液は、目的とするpHに応じて適宜選択すればよく、例えば、pH1.0〜2.2では塩酸−塩化カリウム緩衝液、pH2.2〜3.6ではグリシン−塩酸緩衝液、pH3.0〜6.2ではクエン酸緩衝液、pH3.0〜5.6では酢酸緩衝液、pH2.6〜7.0ではクエン酸−リン酸緩衝液、pH5.8〜8.0ではリン酸緩衝液、pH7.2〜9.0ではトリス−塩酸緩衝液、pH8.6〜10.6ではグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、pH9.2〜10.6では炭酸−重炭酸緩衝液、pH11.0〜12.0ではリン酸水素2ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、等がある。
添加する金属イオンは、検体中の夾雑物であるタンパク質、脂質、等の変性を起こさせる金属イオンであればよく、特に、重金属イオンが好ましい。重金属イオンとしては、例えば、Pb2+、Cr3+、Fe3+、Fe2+、Cd2+、Ni2+、Hg2+、Co2+、Sn2+、Sn4+、Mn2+、Mo3+、W3+、Zn2+、Cu2+、Ag2+等を挙げることができる。使用にあたっては、廃液等の環境汚染を考慮することが好ましく、この点からは、例えば、Fe3+、Zn2+が好ましい。
検体を加熱する前処理は、検体と測定対象化合物に応じて、その測定の目的から、検体中の夾雑物由来の非特異的シグナルが必要な程度に抑制され、測定対象化合物のシグナルの低下が許容できる範囲で選べばよい。特に、シアル酸を含む糖鎖は加熱等の前処理で切断その他の変性が起こりやすく(特に糖鎖の末端に結合したシアル酸は切断されやすい)、測定対象化合物がシアル酸を含む糖鎖を有する糖タンパク質又は糖脂質である場合、特に、このような測定対象化合物を標識したレクチンを用いて測定する場合には、測定化合物のシグナル低下の許容範囲を考慮して合目的的な範囲で前処理条件(加熱温度及び時間)を選ぶ必要がある。そのような前処理条件の範囲は後述する方法で評価し、適宜調整できるが、一般的には、検体を95〜100℃で5〜10分間加熱する前処理が好ましい(実施例2及び3の処理方法8を参照)。
前処理条件の効果は、前処理を行った検体についてのバックグランドに対するシグナルの比(S/B)と前処理を行わない検体についてのS/Bとを比較することで評価することができる(実施例及び比較例を参照)。
本発明では免疫測定法(イムノアッセイ法)を用いており、抗原抗体反応でセンサ部に捕捉された標識蛍光分子をSPFSによって励起させ、増強させた蛍光発光を測定する。従って、本発明で用いる免疫測定法は、蛍光免疫測定法(蛍光イムノアッセイ法)であればいずれも使用可能であり、通常はサンドイッチ法が用いられる。以下に、サンドイッチ法を用いた本発明について説明する。
(a)リガンド
本発明で使用するリガンド(サンドイッチ法の一次抗体)は、測定対象化合物を特異的に認識して結合する抗体である。特に、測定対象化合物に対するモノクローナル抗体が好適である。なお、本発明では、測定対象化合物に応じて、そのレセプターもリガンドとして用いることができ、本発明の範囲には、サンドイッチ法の一次抗体に替えて測定対象化合物に対するレセプターを用いる場合も含んでいる。
本発明では、上記(a)のリガンドを通して測定対象化合物を捕捉し、捕捉した測定対象化合物に結合した蛍光標識分子をSPFSによって励起する必要がある。従って、リガンドはSPFSのセンサ部の金属薄膜上に固相化(固定化)する。金属薄膜上への固相化の方法は通常の方法を用いればよく、詳細は後述のSPFSにおいて説明する。
本発明では、上記(b)でリガンドを通してSPFSのセンサ部の金属薄膜上に捕捉された測定対象化合物を蛍光標識するために、二次抗体、レクチン、その他、通常のサンドイッチ法で使用可能な蛍光標識体が用いられる。
また、測定対象化合物が糖鎖を有する場合、その糖鎖と高い結合能で結合するレクチンもサンドイッチ法の蛍光標識体として用いることができる。レクチンとしては、リシンB鎖関連の「R型レクチン」、「カルネキシン・カルレティキュリン」、「C型レクチン」、「ガレクチン」、「豆科レクチン」、「L型レクチン」、「P型レクチン」、「アネキシン」、「I型レクチン」等、種々のものがあるが、目的にあったものを用いればよく、例えば、測定対象化合物が前立腺特異抗原(PSA)の場合はWFA(ノダフジレクチン)、SBA(ダイズレクチン)、TJA−II(キカラスウリレクチン)、測定対象化合物がα−フェトプロテイン(AFP)の場合はLCA(レンズマメレクチン)、AAL(ヒイロチャワンダケレクチン)、AOL(アスペルギルス・オリゼレクチン)、測定対象が癌胎児性抗原(CEA)の場合はTJA−I(キカラスウリレクチン)等が挙げられる。
表面プラズモン励起増強蛍光分光(Surface Plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy:SPFS)法(SPFS)は、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰(ATR)が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉された測定対象化合物を標識する蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなSPFSは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中に測定対象化合物がごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。SPFS法を用いる場合の測定部材は流路、ウエルのいずれの構成もとることができ、センサチップ、反応層、SPFSシステム、SPFS測定装置等は通常用いられているものを用いることができる。
SPFS用測定装置は、基本的に、SPFS用測定部材が着脱可能となっており、使用する蛍光体に応じた適切な波長の励起光(好適にはレーザー光)を照射するための光源、励起光をセンサチップの金属薄膜の裏面に所定の角度で入射させるためのプリズム(透明支持体が平面基板状のセンサチップを使用する場合)、金属薄膜で反射した光を受光しその強度を測定する受光器、蛍光体から発せられる蛍光を集光するためのレンズおよびその蛍光の強度を測定するための検出器、励起光および蛍光から所定の波長を有する光のみを透過させそれ以外の光をカットするための各種のフィルタなどを備える。
図1は、本発明で使用する上で好適なSPFS用測定装置の全体構成を模式的に示す概略図である。図2は、図1の測定装置のセンサチップ周辺の部分拡大図である。
また、センサチップ16の上方には、後述するような蛍光物質が励起されて発光した蛍光30を受光するための光検出手段32が備えられている。
なお、センサチップ16、光源20、光検出手段32によって、定量測定装置10のSPFS測定を行うSPFS測定部34が構成されている。
上記のSPFS用測定装置の内、SPFS用測定部材は、一般的に、サンドイッチ型免疫複合体を形成してSPFSによる蛍光測定を行うための場(測定領域)が形成されているセンサチップと、サンドイッチ型免疫複合体の形成などに用いられる各種の溶液(測定対象化合物を含む検体、蛍光標識体の溶液、その他の反応試薬等)を測定領域上に保持することのできる流路またはウェルを構築するための部材とを積層化した構成をとる。
金属薄膜上へのリガンドの固相化(固定化)方法の例として、SAM(Self−Assembled Monolayer:自己組織化単分子膜)を形成する方法を示す。
このような「誘電体からなるスペーサ層」の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素(SiO2),二酸化チタン(TiO2)または酸化アルミニウム(Al2O3)を含むことが好ましい。
この「3次元構造」とは、後述するリガンドの固定化を、「センサ基板」表面(及びその近傍)の2次元に限定することなく、該基板表面から遊離した3次元空間にまで広げられる固相化層の構造をいう。
固相化層(例えば、デキストランまたはデキストラン誘導体からなるもの)は、その密度として2ng/mm2未満を有することが好ましい。固相化層の密度は、用いる高分子の種類に応じて適宜調整することができる。上記高分子が上記SAMに、このような密度の範囲内で固相化されていると、プラズモンセンサをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。なお、Biacoreライフサイエンス社製「Sensor Chip CM5」の密度は2ng/mm2であった。この密度は、このCM5基板および金膜のみの基板を用いて、Biacoreライフサイエンス社製のSPR測定機器により得られた測定シグナルにおいて、平均2000RUを測定した結果、2ng/mm2と見積もられたものである。
すなわち、好ましくは分子量1kDa以上5,000kDa以下であり、上述したようなカルボキシメチルデキストランを0.01mg/mL以上100mg/mL以下と、N−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)を0.01mM以上300mM以下と、水溶性カルボジイミド(WSC)を0.01mM以上500mM以下とを含むMES緩衝生理食塩水〔MES〕に、透明支持体と金属薄膜とSAMとがこの順序で積層された基板を0.2時間以上3.0時間以下浸漬し、SAMにカルボキシメチルデキストランを固定化することができる。
検体中の測定対象化合物のシグナル測定は、通常のSPFSを用いた免疫測定法における手順に従って実施することができる。本発明の夾雑物由来の非特異的シグナルの抑制方法は、測定対象化合物を定性的に検出する場合、定量的に測定する場合、いずれにも実施することができる。
(定量測定装置の構成)
以下の実施例においては、測定装置として、SPFS測定装置を自作して使用した。当該SPFS測定装置は、上記3.(2)(a)「SPFS用測定装置」の定量測定装置10と同様の構成である。以下の記載中の符号は、上記3.(2)(a)、図1及び図2の符号と同じである。
また、センサチップ16の上部には、集光レンズとして対物レンズを備え、光検出手段32としては、光電子増倍管(PMT)を用いた。
屈折率1.72、厚さ1mmのガラス製の透明平面基板((株)オハラ製のS−LAL 10)をプラズマ洗浄し、この基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法によって形成した。その後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法によって形成した。クロム薄膜の厚さは1〜3nm、金薄膜の厚さは44〜52nmであった。
[調製例1]
〔抗PSA抗体固相化基板〕
上記のとおりプラズモン励起センサを接続した外部流路に、超純水を10分間、その後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を20分間、ペリスタポンプによって、室温(25℃)、流速500μL/分の条件で循環送液させ、プラズモン励起センサの表面を平衡化した。
その後、1重量%牛血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を30分間循環送液することによって、流路内の非特異吸着防止処理を行った。
[作製例1]
〔蛍光標識PSA抗体〕
蛍光標識PSA抗体を、蛍光物質ラベリングキット「Alexa Fluor(商標名)647タンパク質ラベリングキット」(インビトロジェン社製)を利用して作製した。PSA抗体(2E2、ミクリ免疫研究所製)100μg相当と、0.1M重炭酸ナトリウムと、Alexa Fluor 647 reactive dyeとを混合し、室温で1時間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を行い、標識に利用されなかったAlexa Fluor 647 reactive dyeを取り除いて、蛍光標識PSA抗体を得た。その後、吸光度を測定し蛍光標識PSA抗体濃度を定量した。
〔蛍光標識WFAレクチン〕
蛍光標識WFAレクチンを、蛍光物質ラベリングキット「Alexa Fluor(商標名)647タンパク質ラベリングキット」(インビトロジェン社製)を利用して作製した。WFAレクチン(L-1350、Vector社)100μg相当と、0.1M重炭酸ナトリウムと、Alexa Fluor 647 reactive dyeとを混合し、室温で1時間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を行い、標識に利用されなかったAlexa Fluor 647 reactive dyeを取り除いて、蛍光標識WFAレクチンを得た。その後、吸光度を測定し標識レクチン濃度を定量した。
検体としてPSAフリープールヒト血清を用意した。また、陽性検体として、PSAフリープール血清に、LNCaP(ヒト前立腺癌細胞培養株)培養上清をPSA濃度1ng/mLとなるように添加した血清サンプルを調製し、実施例1〜2における測定サンプルとした。なお、前記PSAフリープールヒト血清としては、コージンバイオ社から正常ヒトプール血清を購入し、ELISAにてPSA濃度が1pg/mL以下であることを確認した血清を用いた。
この実質的にPSAを含まない、非特異的反応を示す試料溶液50μLに対して各種検体前処理を施すことで観察されていた非特異的反応が抑制できるか検討を行った。
試料溶液50μLに表1に示した緩衝液または金属塩溶液50μLを添加し、チューブ内で良く撹拌した。撹拌後室温にて30分間放置した。放置後、生理食塩水へバッファー交換を行いSPFS測定用サンプルとした。
試料溶液50μLに生理食塩水を50μL添加し、100℃5分間加熱処理を行った。その後室温に放置し、SPFS測定用サンプルとした。
試料溶液50μLに生理食塩水を50μL添加し、SPFS測定用サンプルとした。
上記実施例1、2および比較例1と同様の処理を陽性検体試料においても実施した。
各測定サンプルを抗PSA抗体を固相化した基板(調製例1)と反応させ、その後、蛍光標識PSA抗体(作製例1)と接触させた。詳しくは以下の通りである。
タンパク質を変性させる効果がある前処理を行うことで、生理食塩水にて希釈するのみの処理方法に比べて血清バックグラウンドが低下し、S/Bが大幅に向上することが確認できた。
各測定サンプルを抗PSA抗体を固相化した基板(調製例1)と反応させ、その後、蛍光標識WFAレクチン(作製例2)と接触させた。詳しくは以下の通りである。
12 誘電体部材
12a 上面
12b 側面
12c 側面
14 金属薄膜
14a 上面
16 センサチップ
18 センサチップ装填部
20 光源
22 入射光
24 金属薄膜反射光
26 受光手段
28 SPR測定部
30 蛍光
32 光検出手段
34 SPFS測定部
36 微細流路
38 センサ部
40 定量演算手段
Claims (8)
- 表面プラズモン励起増強蛍光分析法(SPFS)を用いた免疫測定法(一次抗体に替えて測定対象化合物に対するレセプターを用いる場合を含む)における夾雑物由来の非特異的シグナルの抑制方法であって、
検体に金属イオンを添加する前処理を行う前処理工程を含む非特異的シグナルの抑制方法。 - 前記前処理を行った検体についてのバックグランドに対するシグナルの比(S/B)が前記前処理を行わない検体についてのS/Bより大きい請求項1に記載の非特異的シグナルの抑制方法。
- 前記前処理が、検体にFe3+イオン又はZn2+イオンを10μM〜5M添加する前処理である請求項1又は2に記載の非特異的シグナルの抑制方法。
- 前記検体が血漿又は血清である請求項1〜3いずれかに記載の非特異的シグナルの抑制方法。
- 前記測定対象化合物が糖タンパク質又は糖脂質である請求項1〜4いずれかに記載の非特異的シグナルの抑制方法。
- 前記測定対象化合物がシアル酸を含む糖鎖を有する糖タンパク質又は糖脂質である請求項1〜5いずれかに記載の非特異的シグナルの抑制方法。
- 前記検体が血漿又は血清であり、前記測定対象化合物がシアル酸を含む糖鎖を有する糖タンパク質又は糖脂質であり、
SPFSのセンサ部に捕捉された測定対象化合物を標識するためのレクチンを用いて、前記測定対象化合物由来のシグナルを測定する測定工程を更に含む請求項1〜3いずれかに記載の非特異的シグナルの抑制方法。 - 前記測定対象化合物が前立腺特異抗原(prostate specific antigen、PSA)である請求項6又は7に記載の非特異的シグナルの抑制方法。
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