WO2020175672A1 - 標的物質の検出方法、標的物質の検出のための試薬、及び標的物質の検出のための試薬キット - Google Patents
標的物質の検出方法、標的物質の検出のための試薬、及び標的物質の検出のための試薬キット Download PDFInfo
- Publication number
- WO2020175672A1 WO2020175672A1 PCT/JP2020/008328 JP2020008328W WO2020175672A1 WO 2020175672 A1 WO2020175672 A1 WO 2020175672A1 JP 2020008328 W JP2020008328 W JP 2020008328W WO 2020175672 A1 WO2020175672 A1 WO 2020175672A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- target substance
- detecting
- substance
- reagent
- carbon atoms
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants
- G01N2333/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4725—Mucins, e.g. human intestinal mucin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
- G01N2440/38—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of carbohydrates, e.g. glycosylation, glycation
Definitions
- the present invention relates to a method for detecting a target substance, a reagent for detecting the target substance, and a reagent kit for detecting the target substance.
- Patent Document 1 discloses a sandwich-type assay for quantifying a glycoprotein as a substance to be detected in a sample by using a labeled lectin, and by introducing a simple treatment, impurities are eliminated. Disclosed is a sandwich-type assay method that suppresses the effects of origin.
- Patent Document 1 US Patent Application Publication No. 2 0 1 7/0 1 2 2 9 4 0
- Patent Document 1 describes a method of suppressing non-specific binding of labeled lectin using a reducing agent such as thioglycerol.
- a reducing agent such as thioglycerol
- the present invention provides a Wisteria floribunda. Dried 1 ⁇ 1 ⁇
- the challenge is to improve the detection accuracy of the target substance using the lectin described in 13 13).
- One embodiment of the present invention relates to a Wisteria floribene immobilized on a carrier.
- a method for detecting a target substance comprising the steps of forming a complex containing WFA and the target substance on the carrier by mixing, and detecting the target substance by detecting the complex. ..
- a lectin (WFA) of Wisteriafloribunda immobilized on a carrier and a target substance containing a sugar chain that binds to WF A have 1 carbon atoms.
- To 7 alcohols (excluding thioglycerol) are mixed to form a complex containing WFA and the target substance on the carrier, and the complex is detected. And a step of detecting a target substance.
- a lectin (WFA) of Wisteria floribunda immobilized on a carrier and a target substance containing a sugar chain that binds to WF A have a carbon number of 1 or less.
- WFA lectin
- One embodiment of the present invention relates to a reagent for detecting a target substance, which comprises an alcohol having 1 to 7 carbon atoms, which is composed of only carbon atoms, hydrogen atoms, and oxygen atoms.
- the target substance contains a sugar chain that binds to the lectin (W FA) of Wisteria floribunda (Wisteriaiafloribunda).
- An embodiment of the present invention relates to a reagent for detecting a target substance containing an alcohol having 1 to 7 carbon atoms (excluding thioglycerol).
- the target substance is Wisteria f. ⁇ 2020/175672 3 (:171? 2020/008328
- One embodiment of the present invention relates to a reagent for detecting a target substance, which comprises an alcohol having 1 to 7 carbon atoms (excluding an alcohol containing a thiol group).
- the target substance is Wisteria floribunda (3 ⁇ 3 f I ⁇ r I 6 und 3) Lectin (8) containing sugar chain.
- One embodiment of the present invention is a target substance detection substance; Wisteria floribunda ( ⁇ / ⁇ / 1: 1 ⁇ “1 13 l ⁇ 13) Lectin ( ⁇ / ⁇ /8); and a target substance containing an alcohol having 1 to 7 carbon atoms consisting only of carbon atoms, hydrogen atoms, and oxygen atoms.
- the present invention relates to a reagent kit for detecting, wherein the target substance includes a sugar chain that binds to 8.
- One embodiment of the present invention is a substance for detecting a target substance; Wisteria floribunda ( ⁇ / ⁇ / For detection of target substances containing lectin ( ⁇ / ⁇ /eight) of 1:1 ⁇ "1 13 l ⁇ 13) and alcohols having 1 to 7 carbon atoms (excluding thioglycerol)
- Wisteria floribunda ⁇ / ⁇ / For detection of target substances containing lectin ( ⁇ / ⁇ /eight) of 1:1 ⁇ "1 13 l ⁇ 13) and alcohols having 1 to 7 carbon atoms (excluding thioglycerol)
- the target substance includes a sugar chain that binds to 8.
- One embodiment of the present invention is a target substance detection substance; Wisteria floribunda ( ⁇ / ⁇ / For detection of target substances containing lectin ( ⁇ / ⁇ /eight) of 1:1 ⁇ "1 13 l ⁇ 13) and alcohols having 1 to 7 carbon atoms (excluding thioglycerol)
- Wisteria floribunda ⁇ / ⁇ / For detection of target substances containing lectin ( ⁇ / ⁇ /eight) of 1:1 ⁇ "1 13 l ⁇ 13) and alcohols having 1 to 7 carbon atoms (excluding thioglycerol)
- the target substance includes a sugar chain that binds to 8.
- Alcohol having only 1 to 7 carbon atoms consisting of only carbon atoms, hydrogen atoms, and oxygen atoms, alcohol having 1 to 7 carbon atoms excluding thioglycerol, or carbon number excluding alcohol containing a thiol group
- the accuracy of detection of the target substance can be improved by mixing ⁇ ZVFA with the target substance in the presence of an alcohol of 1 to 7.
- the detection accuracy of the target substance can be improved.
- FIG. 1 (eight) is a diagram showing an example of the appearance of a container containing a reagent.
- (Mi) is a diagram showing an outline of a reagent kit.
- FIG. 3 shows the linearity of dilution when a substance other than alcohol is added to the detection system.
- FIG. 4 Shows the dilution linearity when alcohols with various carbon numbers are added to the detection system.
- FIG. 6 shows the dilution linearity of the WFA-MUC1 detection system when glycerol is added.
- FIG. 7 shows the dilution linearity of the LTL-haptoglobin detection system when glycerol is added.
- FIG. 8 shows the linearity of dilution when a glycerol compound is added to the detection system.
- FIG. 9 Demonstration linearity when various concentrations of glycerol are added to the detection system.
- a complex containing WF A and a target substance on the carrier is prepared by mixing a lectin and a target substance containing a sugar chain that binds to the lectin in the presence of alcohol. And a step of detecting a target substance (detection step) by detecting the complex.
- the detection may be quantitative.
- the target substance is a substance to be detected. It is preferably a glycoprotein, and more preferably has a sugar chain that binds to a lectin (WF A) of Wisteriaf I o ribunda.
- WF A lectin
- As the target substance preferably Mac-2 binding protein (M2BP), Mu cin 1 % cel I surraceassociate ⁇ 1 Acid glycoprotein (80), Neuronal cell adhesion molecule 1_ 1 ⁇ 2020/175672 5 units (:171? 2020/008328
- the target substance is preferably a substance contained in a sample collected from a living body.
- Urine and blood can be used as the sample.
- the blood may be peripheral blood or plasma or serum prepared from the peripheral blood. Of these, plasma or serum is preferable.
- the sample may be diluted with an appropriate aqueous medium, if necessary.
- the aqueous medium is not particularly limited as long as it does not interfere with the detection of the target substance, and examples thereof include water, physiological saline, and a buffer solution.
- the buffer solution is not particularly limited, and a buffer solution near neutrality (eg, 6 or more and 8 or less! can be used. For example, 1 ⁇ /1 M3, Ding Goods buffers such as M3 and M3, phosphate buffered saline (M3), etc. are listed.
- the lectin preferably eight can be mentioned.
- Eight can include, for example, naturally occurring eight or recombinant eight.
- the naturally-occurring ⁇ ZV FA is a tetrameric protein composed of four subunits.
- Eight is Fuji (I3 6 "I3 It is known as a lectin contained in the seeds of sardines. From this tetramer ⁇ ZV FA, a monomer or dimer octa can be obtained by a predetermined treatment with a reducing agent or the like.
- the expression "8" means both a monomer and a multimer.
- ⁇ ZV FA may be a tetramer, a monomer octa or a dimer octa.
- the dimer is preferable because of its high reactivity.
- Examples of alcohols include alcohols having 1 to 7 carbon atoms, preferably 2 to 7 carbon atoms.
- the lower limit of the carbon number of alcohol can be selected from 1, 2 or 3.
- a carbon atom, hydrogen ⁇ 2020/175672 6 boxes (:171? 2020/008328
- Alcohol consisting only of atoms and oxygen atoms is used.
- the alcohol having 1 to 7 carbon atoms does not include thioglycerol. More preferably, the alcohol having 1 to 7 carbon atoms does not include an alcohol containing a thiol group.
- “the alcohol having 1 to 7 carbon atoms does not include thioglycerol” means that alcohols having 1 to 7 carbon atoms other than at least thioglycerol in the detection system, reagent, and reagent kit described later. It does not mean that the detection system, the reagent, and the reagent kit to which thioglycerol is added are completely excluded.
- alcohols having 1 to 7 carbon atoms does not include alcohols containing thiol groups
- the alcohol may be monovalent or polyvalent. Valence intends the number of hydroxyl groups.
- Examples of polyhydric alcohols include dihydric, trihydric, and tetrahydric alcohols.
- the carbon chain contained in the alcohol may be linear or branched, but is preferably linear.
- the alcohol is preferably selected from the group consisting of methanol, ethanol, glycerol, pentanol, heptanol, diglycerol, ethylene glycol, diethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, triethylene glycol, and mixtures thereof. At least one alcohol can be mentioned. More preferably, at least one alcohol selected from the group consisting of glycerol, diglycerol, ethylene glycol, diethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, triethylene glycol, and mixtures thereof, ⁇ 2020/175672 7 ⁇ (:171? 2020/008328
- the formation of the complex between ⁇ ZV FA and the target substance can be carried out, for example, by mixing the sample containing the target substance (or a diluted solution of the sample diluted with an aqueous medium) with It is achieved by incubating for a certain period of time. In this case, it is preferable that 8 is immobilized on a carrier.
- the mode of fixing [0029] to the carrier is not particularly limited.
- ⁇ ZV FA may be directly bound to the carrier, or may be indirectly bound to the carrier via another substance.
- the direct bond includes, for example, physical adsorption.
- the indirect bond includes, for example, a bond through a combination of piotin and avidin or streptavidin (hereinafter, also referred to as “avidins”). In this case, by modifying Eighth with piotin in advance and previously binding avidins to the carrier, it is possible to indirectly bond Eighth to the carrier through the bond between piotin and avidins.
- the material of the carrier is not particularly limited, and can be selected from, for example, organic polymer compounds, inorganic compounds, biopolymers and the like.
- the organic polymer compound include latex, polystyrene, polypropylene and the like.
- the inorganic compound include magnetic substances (iron oxide, chromium oxide, ferrite, etc.), silica, alumina, glass and the like.
- biopolymers include insoluble agarose, insoluble dextran, gelatin, and cellulose. Two or more of these may be used in combination.
- the shape of the carrier is not particularly limited, and examples thereof include particles, membranes, microplates, microtubes, and test tubes. Among them, particles are preferable, and magnetic particles are particularly preferable. By using magnetic particles, it is possible to improve the reactivity between the target and the target substance.
- the dimer 8 is preferably fixed to the magnetic particles.
- the dimer ⁇ ZV FA can be obtained, for example, by dissociating the subunit of the tetramer ⁇ ZV FA with a sulfhydryl reagent or a reducing agent.
- the tetramer octa can be dimerized by contacting the cross-linking agent with the tetramer octa. So ⁇ 2020/175672 8 ⁇ (:171? 2020/008328
- a cross-linking agent which forms a cross-link with the amino group in the tetramer is preferable.
- a cross-linking agent having a reactive group for an amino group -hydroxysuccinimide ester group, isothiocyano group, chlorosulfone group, chlorocarbonyl group, oxyethylene group, chloroalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, aldehyde group and carboxyl group.
- crosslinkers having at least one functional group selected from the group consisting of groups. If such a crosslinking agent is used, the tetramer can be efficiently dimerized.
- the molar ratio (/crosslinking agent) when the tetramer and the crosslinking agent are mixed is preferably 1/10 or less, and more preferably 1/20 or less.
- the lower limit of (molar ratio cross-linking agent) can be set to 1/100 or more in consideration of the balance between the amount of the cross-linking agent used and the yield of the dimer produced.
- the piotinated dimer octane When immobilizing the octane on the magnetic particles through the bond between piotin and the avidins, the piotinated dimer octane may be used.
- the piotinylated dimer octa can be obtained, for example, by dimerizing the tetramer octa with a crosslinking agent containing piotin.
- the cross-linking agent containing piotin can be obtained, for example, by binding piotin and the above-mentioned reactive group of the cross-linking agent via a spacer.
- a spacer is not particularly limited, and examples thereof include compounds having an aminohexanoyl group (aminocaproyl group).
- the alcohol is contained in an amount of 2 to 20%//%, preferably 4 to 10%.
- the unit “%/% %” means a weight/weight-converted percentage (hereinafter, the same applies.
- a reagent containing an alcohol and a reagent containing is immobilized on a carrier are mixed as separate reagents with a sample (or a diluted solution thereof).
- a mixed solution of alcohol and solidified carrier may be mixed with the sample.
- the order of mixing the reagent and the sample (or the diluted solution thereof) is not particularly limited, and these may be mixed substantially simultaneously or sequentially.
- reagents containing alcohol include: ⁇ 2020/175672 9 boxes (:171? 2020/008328
- the complex can be detected by, for example, further including a detection substance in the complex of the target substance and detecting the signal from the detection substance.
- the complex of ⁇ ZV F A, the target substance and the detection substance can be formed by mixing the complex of the target substance and the detection substance with the detection substance and reacting them for a certain period of time as necessary.
- the complex of the target substance and the detection substance may be formed by coexisting the detection substance when forming the complex of and the target substance.
- the detection substance is not limited as long as it is a substance that specifically binds to the target substance and includes a labeling substance.
- the substance that specifically binds to the target substance preferably binds to the protein portion of the target substance.
- the substance that specifically binds to the target substance include an antibody. It may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a fragment thereof (for example, 3(3')' 2 etc.). Alternatively, a commercially available antibody may be used.
- the labeling substance used as the detection substance a substance usually used in the art in immunological measurement can be used.
- it may be a substance that itself generates a signal (hereinafter, also referred to as a “signal generating substance”) or a substance that catalyzes the reaction of another substance to generate a signal.
- the signal generating substance include fluorescent substances and radioisotopes.
- the substance that catalyzes the reaction of another substance to generate a detectable signal include an enzyme. Enzymes include alkaline phosphatase, peroxidase, — Examples include galactosidase and luciferase.
- fluorescent substance examples include fluorescein isothiocyanate ( ⁇ Dix), oral damamine, 8 ⁇ 6 father 3 ⁇ 1_1 0 "(trademark), fluorescent dye such as ⁇ ⁇ 2020/175672 10 units (:171? 2020/008328
- the labeling substance is preferably an enzyme, and particularly preferably alkaline phosphatase.
- a labeling substance a dinitrophenyl (o) group or a hapten such as piotin can be used.
- a signal from the complex can be obtained by binding a substance having a signal generating substance or an enzyme with the hapten and the detection substance.
- the labeling substance can be bound to a substance that specifically binds to the target substance by a labeling method known in the art. Alternatively, labeling may be performed using a commercially available labeling kit or the like.
- the complex is detected based on the labeling substance of the detection substance contained in the complex. Specifically, by detecting the signal generated by the labeling substance of the detection substance contained in the complex, a measurement value that reflects the amount or concentration of the labeling substance contained in the sample can be obtained.
- detecting a signal includes qualitatively detecting the presence or absence of a signal, quantifying the signal intensity, and semiquantitatively detecting the signal intensity.
- Semi-quantitative detection means indicating the intensity of a signal step by step such as “no signal is generated", “weak”, “medium”, “strong". In the present embodiment, it is preferable to detect the signal intensity quantitatively or semi-quantitatively.
- the method itself for detecting a signal is known in the art.
- the measuring method may be appropriately selected according to the type of signal derived from the labeling substance.
- the labeling substance is an enzyme
- the signal such as light and color generated by reacting a substrate for the enzyme can be measured by using a known device such as a spectrophotometer.
- the substrate of the enzyme can be appropriately selected from known substrates according to the type of the enzyme.
- alkaline phosphatase is used as the enzyme
- ⁇ ⁇ 1 3 8 (trademark) (4-chloro-3-(methoxyspiro [1, 2-dioxetane-3, 2′ 1 (5′ chloro) trixylose [3.3.1.13,7]decane]-4-yl) Phenyl phosphate disodium
- ⁇ 30 (trademark) ⁇ 2020/175672 1 1 ⁇ (: 171-1?2020/008328
- the labeling substance is a radioisotope
- the radiation as a signal can be measured using a known device such as a scintillation counter.
- the labeling substance is a fluorescent substance
- the fluorescence as a signal can be measured using a known device such as a fluorescent microplate reader. The excitation wavelength and the fluorescence wavelength can be appropriately determined according to the type of fluorescent substance used.
- a reagent containing a detection substance for example, when the target substance is IV! (Trademark) 1 ⁇ / 1 2? ⁇ ⁇ (trademark)
- the anti-IV!2 antibody contained in the reagent can be changed according to the substance that specifically binds to the target substance.
- the labeling substance when the labeling substance is an enzyme, the step of contacting the substrate with the labeling substance and the step of detecting a signal are called “detection step”.
- the labeling substance is a fluorescent substance or radioisotope
- the process of detecting the signal is called the “detection process”.
- unreacted free components that have not formed the complex are removed.
- Unreacted free components are components that do not form a complex, for example, unreacted sample components, ⁇ ZV FA, detection substances, etc.
- the method is not particularly limited, but if the carrier is a particle, centrifugation/separation can be performed to recover only the carrier that has captured the complex, and the separation/separation can be performed. For example, by removing the liquid containing the unreacted free components, it is possible to carry out the pit/separation. ⁇ 2020/175672 12 boxes (:171? 2020/008328
- the carrier is magnetic particles
- the liquid containing the unreacted free component can be absorbed by the nozzle to remove the liquid containing the unreacted component while the magnetic particles are magnetically restrained by the magnet so that the liquid can be separated.
- the carrier on which the complex has been captured may be washed with an appropriate aqueous medium such as Minami 3.
- the signal detection result can be used as a measurement value of the target substance.
- the measured value of the signal intensity itself or a value calculated from the measured value can be used as the measured value of the target substance.
- the value calculated from the measured value of the signal intensity includes, for example, a value obtained by subtracting the measured value of the negative control sample from the measured value, a value obtained by dividing the measured value by the measured value of the positive control sample, and a combination thereof. Is mentioned.
- the target substance is detected by a fully automatic immunoassay device manufactured by Sysmex Corporation! (Trademark) series may be used.
- One embodiment of the present disclosure relates to a reagent used for detecting a target substance.
- this embodiment includes a reagent containing an alcohol having 1 to 7 carbon atoms used in some steps of the method described in 1 above.
- Figure 1 () shows the external appearance of the reagent container 51.
- the reagent preferably contains an alcohol having 1 to 7 carbon atoms in an amount of 3 to 30 /%, preferably 4 to 15 /%.
- the reagent 51 preferably contains, for example, an aqueous solvent.
- the aqueous solvent is not particularly limited as long as it does not interfere with the detection described in 1 above, and examples thereof include water, physiological saline, and a buffer solution.
- Buffer solution as long as having a buffering action in 1-1 (e.g. 6 to 8 of 1 to 1) in the vicinity of neutral, is not particularly limited.
- As the buffer solution for example, 1 to 1 Mimi 3, IV!
- Mimi 3, Ding "Hen 3, I” Good buffer solutions such as, phosphate buffered saline (Mitsumi 3) and the like. It is preferably 1 to 1 and 3.
- a buffer solution for example, Sysmex Corporation! ⁇ II 3 (3 1_ (trademark) Can be mentioned. ⁇ 2020/175672 13 ⁇ (: 171-1? 2020/008328
- the reagent containing an alcohol having 1 to 7 carbon atoms may contain 8 immobilized on the carrier described in 1 above.
- the reagent preferably contains, for example, an aqueous solvent.
- the aqueous solvent is not particularly limited as long as it does not interfere with the detection described in 1 above, and examples thereof include water, physiological saline, and a buffer solution.
- the buffer solution is not particularly limited as long as it has a buffering effect in the range of 1 to 1 near neutrality (for example, 6 or more and 8 or less !!).
- buffer solution for example, 1 to 1 mitsumi 3, 1 ⁇ /1 mits 3, Ding " ⁇ 3, I Good buffer solutions such as, phosphate buffered saline (Mimi 3) and the like. It is preferably 1 to 1 and 3.
- a buffer solution for example, 1 to 1 ⁇ 30!_ (trademark) M 2 BPG ⁇ (trademark) manufactured by Sysmex Corporation Mention may be made of reagents.
- the reagent may contain the detection substance described in 1 above.
- Reagents are /3-mercaptoethanol, stabilizers for knives, etc.; protective agents for albumin, etc.; polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, polyoxyethylene (1 0)
- a surfactant such as octylphenyl ether
- at least one additive selected from stabilizers such as sodium azide and bovine serum albumin may be contained.
- the reagent may contain a metal salt (preferably chloride) of sodium, potassium, calcium, manganese or the like.
- the reagent kit contains at least an alcohol having 1 to 7 carbon atoms, ⁇ ZV FA, and a substance to be detected.
- Figure 1 shows an example of an outline of the reagent kit.
- the reagent kit 50 shown in Fig. 1 (Mimi) consists of the outer box 55 and the first container 51 containing the reagent containing the alcohol having 1 to 7 carbon atoms described in 2. (1) above.
- the attached document 54 can describe the handling method, storage conditions, expiration date, etc. of the reagent kit. ⁇ 2020/175672 14 (:171? 2020/008328
- the alcohol containing 1 to 7 carbon atoms is contained in the reagent containing immobilized on the carrier contained in the second container 52, the above-mentioned 2.
- a reagent containing the aqueous solvent described in (1) and, if necessary, at least one selected from the group consisting of additives and metal salts is included.
- the alcohol contained in the carrier contained in the second container 52 is in a dry form.
- the eight contained in the reagent kit, if not immobilized on the carrier at the time of distribution, are individually packaged with the reagent for immobilizing the carrier before use, ⁇ ZV FA and the carrier. May be.
- the reagent contained in the third container 53 for example, when the target substance is 1 ⁇ /12, the product manufactured by Sysmex Corporation is used.
- the reagent kit includes a container containing a diluting solution for diluting the sample (eg, 1 to 1 I 3 (3 1_ (trademark) manufactured by Sysmex Corporation).
- a container containing a diluting solution for diluting the sample eg, 1 to 1 I 3 (3 1_ (trademark) manufactured by Sysmex Corporation.
- Substrate reagent (For example, Sysmex Corporation! ⁇ II 3 (3 1_ (trademark)
- a container containing a, a container containing an aqueous medium for cleaning, and the like may have the same pattern as the outer box 55. The explanation of the terms described in 1 above is incorporated in this section.
- LTL (VECTOR Laboratories (trade name: Vector Laboratories), trade name: Lotus tetragono lobus Lectin] was added to 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) at a concentration of 2.5 mg/mL, and LTL was added. A containing solution was obtained.
- the obtained LTL-containing solution was mixed with 5-(N-succinimidyloxycarbonyl)pentyl D-pyotinamide, which is a crosslinking agent containing piotin, manufactured by Dojindo Laboratories, Inc., trade name: Biot in- AC5-0su] was added so that the LTL/crosslinking agent (molar ratio) was 1/100.
- the LTL/crosslinking agent molar ratio
- reaction product obtained in (1-2'-1) was purified by high performance liquid chromatography under the following conditions to obtain purified piotinylated LTL.
- Streptavidin (STA)-immobilized complex on the surface of magnetic particles (average particle size 2 Mm) (Amount of streptavidin per 1 g of magnetic particles: 2.9 to 3.5 mg; below, "STA-bonded magnetic particles" (Also referred to as )) was washed 3 times with 0.01 M HEPES buffer (pH 7.5). Add the washed STA-bound magnetic particles to 0.01M HEPES buffer (pH 7.5) so that the STA concentration is 18 to 22 M g/mL (STA-bound magnetic particle concentration is 0.48 to 0.52 mg/mL). A liquid containing STA-bonded particles was obtained.
- the piotinylated LTL was added to the STA-bonded particle-containing solution obtained so that the concentration of the piotinylated LTL was 20 Mg/mL, and the streptavidin of the STA-bonded magnetic particles and the biotin LTL piotin were bound to each other.
- the obtained product was washed 3 times with 0.1 M MES buffer (pH 6.5) to obtain an LTL-immobilized carrier.
- the obtained LTL-immobilized carrier was added to MES buffer To obtain a liquid containing the LTL-immobilized carrier.
- HISCL trademark
- M2BPG1 trademark
- R3 reagent manufactured by Sysmex Corporation was used for the system using M2BP.
- MY.1E12 Journal of Immunological Methods Volume 270, Issue 2, 15 December 2002, Pages 199-209 was used as the MUC1 antibody.
- the MUC1 antibody was dissolved in phosphate buffer, and the EDTA concentration of the resulting solution was adjusted to 1 mM.
- An appropriate amount of 2-mercaptoethylamine hydrochloride solution was added to the antibody solution, and the mixture was reacted at 37 ° C for a predetermined time. Then, the antibody solution was desalted using a PD-10 column (GE Healthcare Japan) and adjusted to a predetermined concentration.
- a maleimide crosslinking agent solution as an ALP labeling agent was dissolved in N,N-dimethylformamide (DMF) to prepare a maleimide crosslinking agent solution.
- DMF N,N-dimethylformamide
- To the ALP solution an appropriate amount of the above-mentioned maleimide cross-linking agent solution was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C for a predetermined time to introduce a maleimide group. After that, the solution was desalted using a PD-10 column (GE Healthcare Japan) and adjusted to a predetermined concentration.
- the above antibody solution and the above ALP solution were mixed at a predetermined ratio and placed in a refrigerator to cause a coupling reaction. Then, 2-mercaptoethylamine hydrochloride solution was added to stop the reaction. The ALP antibody solution was subjected to gel filtration to collect the desired fraction.
- the desired fraction obtained was dissolved in a buffer solution containing BSA at a predetermined concentration and used as the third reagent of the labeled MUC1 antibody.
- Labeled haptoglobin antibody was obtained from ABCAM (manufacturer catalog number: AB13429), labeled in the same manner as 1-3', and used as the third reagent of labeled haptoglobin antibody.
- HISCLTM R5 reagent manufactured by Sysmex Corporation
- CDP-StaKTM Applied Biosystems
- an undiluted solution of human serum and a diluted serum prepared by diluting the human serum with HISCL (trademark) sample dilution solution 2-fold, 4-fold, and 8-fold were used.
- M2BP was measured using the above-mentioned first to fifth reagents with a fully automatic immunoassay device HISCL (trademark) 5000 (manufactured by Sysmex Corporation).
- HISCL human immunoassay device
- glycerol was added to the R1 reagent of HISCL (trademark) M2BPG 1 (trademark) at 15 w/i4.
- R1 reagent 100 ⁇ , R2 reagent 30 ⁇ and measurement sample 10 M were mixed and incubated according to the setting of the device, then B/F separation was performed, and R3 reagent was added to obtain the measured value (luminescence intensity).
- the target substance is not selected for the addition of alcohol, It was shown to be useful for a detection system using.
- the reducing agent (thioglycerol) was added and the performance was compared with that of glycerol.
- Each additive was added to the first reagent, and the measurement was performed in the same manner as in Example 1.
- diglycerol, ethylene glycol, diethylene glycol, and dipropylene glycol also improved the sample dilution linearity.
- £06000 which is a high-molecular-weight glycerol
- the sample dilution linearity was remarkably reduced.
- the addition of thioglycerol also caused a significant decrease in the linearity of sample dilution.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
ウィステリア・フロリブンダ(Wisteria floribunda)のレクチンを用いた標的物質の検出系の検査精度を向上させることを課題とする。 担体に固定化されたウィステリア・フロリブンダ(Wisteria floribunda)のレクチン(WFA)と、WFAと結合する糖鎖を含む標的物質とを、炭素原子、水素原子、及び酸素原子のみからなる炭素数が1から7のアルコールの存在下で混合することにより、前記担体上にWFAと標的物質とを含む複合体を形成する工程、及び前記複合体を検出することにより、標的物質を検出する工程、を含む、標的物質の検出方法により、課題を解決する。
Description
\¥0 2020/175672 1 ?01/^2020/008328
明 細 書
発明の名称 :
標的物質の検出方法、 標的物質の検出のための試薬、 及び標的物質の検出 のための試薬キット
技術分野
[0001 ] 本発明は、 標的物質の検出方法、 標的物質の検出のための試薬、 及び標的 物質の検出のための試薬キッ トに関する。
背景技術
[0002] 特許文献 1 には、 標識化レクチンを用いて検体中の検出対象物質としての 糖タンパク質を定量するためのサンドイッチ型アッセイであって、 簡便な処 理を導入することにより、 夾雑物に由来する影響を抑制したサンドイッチ型 アッセイ法が開示される。
先行技術文献
特許文献
[0003] 特許文献 1 :米国特許出願公開第 2 0 1 7 / 0 1 2 2 9 4 0号明細書
発明の概要
発明が解決しようとする課題
[0004] 特許文献 1 には、 チオグリセロール等の還元剤を用いて、 標識化レクチン の非特異結合を抑制する方法が記載されている。 しかし、 発明者らは、 後述 する実施例に示すように特許文献 1 に記載の方法では、 検出精度の向上が十 分ではないことを見出した。
13リ ¢1 3) のレクチンを用いた標的物質の検出精度を向上させることを課 題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明のある実施形態は、 担体に固定化されたウイステリア · フロリブン
ダ ( W i s t e r i a f l o r i b u n d a) のレクチン ( W F A) と、 WF Aと結合する糖鎖を含む標的物質とを、 炭素原子、 水素原子、 及び酸素 原子のみからなる炭素数が 1から 7のアルコールの存在下で混合することに より、 前記担体上に WF Aと標的物質とを含む複合体を形成する工程及び前 記複合体を検出することにより標的物質を検出する工程、 を含む、 標的物質 の検出方法に関する。
[0007] 本発明のある実施形態は、 担体に固定化されたウイステリア · フロリブン ダ ( W i s t e r i a f l o r i b u n d a) のレクチン (W F A) と、 WF Aと結合する糖鎖を含む標的物質とを、 炭素数が 1から 7のアルコール (但し、 チオグリセロールを除く) の存在下で混合することにより、 前記担 体上に WF Aと標的物質とを含む複合体を形成する工程、 及び前記複合体を 検出することにより標的物質を検出する工程、 を含む、 標的物質の検出方法 に関する。
[0008] 本発明のある実施形態は、 担体に固定化されたウイステリア · フロリブン ダ ( W i s t e r i a f l o r i b u n d a) のレクチン (W F A) と、 WF Aと結合する糖鎖を含む標的物質とを、 炭素数が 1から 7のアルコール (但し、 チオール基を含むアルコールを除く) の存在下で混合することによ り、 前記担体上に WF Aと標的物質とを含む複合体を形成する工程、 及び前 記複合体を検出することにより標的物質を検出する工程、 を含む、 標的物質 の検出方法に関する。
[0009] 本発明のある実施形態は、 炭素原子、 水素原子、 及び酸素原子のみからな る炭素数が 1から 7のアルコールを含む、 標的物質を検出するための試薬に 関する。 ここで、 前記標的物質は、 ウイステリア · フロリブンダ (W i s t e r i a f l o r i b u n d a) のレクチン (W FA) と結合する糖鎖を 含む。
[0010] 本発明のある実施形態は、 炭素数が 1から 7のアルコール (但し、 チオグ リセロールを除く) を含む標的物質を検出するための試薬に関する。 ここで 、 前記標的物質は、 ウイステリア · フロリブンダ (W i s t e r i a f I
〇 2020/175672 3 卩(:171? 2020 /008328
〇 r \ b 〇 〇 6 a) のレクチン ( 八) と結合する糖鎖を含む。
[0011] 本発明のある実施形態は、 炭素数が 1から 7のアルコール (但し、 チオー ル基を含むアルコールを除く) を含む、 標的物質を検出するための試薬に関 する。 前記標的物質は、 ウイステリア · フロリブンダ ( 丨 3 ㊀
3 f I 〇 r I 6 u n d 3) のレクチン ( 八) と結合する糖鎖を含む。
[0012] 本発明のある実施形態は、 標的物質の検出物質; ウイステリア · フロリブ ンダ ( \/\/
1: 1 〇 「 1 13リ门〇13) のレクチン ( \/\/ 八) ; 及び炭素原子、 水素原子、 及び酸素原子のみからなる炭素数が 1から 7のア ルコールを含む、 標的物質を検出するための試薬キッ トに関する。 ここで、 前記標的物質は、 八と結合する糖鎖を含む。
[0013] 本発明のある実施形態は、 標的物質の検出物質; ウイステリア · フロリブ ンダ ( \/\/
1: 1 〇 「 1 13リ门〇13) のレクチン ( \/\/ 八) ; 及び炭素数が 1から 7のアルコール (但し、 チオグリセロールを除く) を含 む、 標的物質を検出するための試薬キッ トに関する。 ここで、 前記標的物質 は、 八と結合する糖鎖を含む。
[0014] 本発明のある実施形態は、 標的物質の検出物質; ウイステリア · フロリブ ンダ ( \/\/
1: 1 〇 「 1 13リ门〇13) のレクチン ( \/\/ 八) ; 及び炭素数が 1から 7のアルコール (但し、 チオグリセロールを除く) を含 む、 標的物質を検出するための試薬キッ トに関する。 ここで、 前記標的物質 は、 八と結合する糖鎖を含む。
[0015] 炭素原子、 水素原子、 及び酸素原子のみからなる、 炭素数が 1から 7のア ルコール、 チオグリセロールを除く炭素数が 1から 7のアルコール、 又はチ オール基を含むアルコールを除く炭素数が 1から 7のアルコールの存在下で 、 \ZVFAと標的物質とを混合することにより、 標的物質の検出精度を向上さ せることができる。
発明の効果
[0016] 標的物質の検出精度を向上させることができる。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1] (八) は、 試薬を含む容器の外観例を示す図である。 (巳) は試薬キッ 卜の概略を示す図である。
[図 2]検出系にグリセロールを添加した場合の希釈直線性を示す。
[図 3]検出系にアルコール以外の物質を添加した場合の希釈直線性を示す。
[図 4]検出系に様々な炭素数を有するアルコールを添加した場合の希釈直線性 を示す。
[図 5]グリセロールを添加した場合の WFA-M2BP検出系の検体の希釈直線性を示 す。
[図 6]グリセロールを添加した場合の WFA-MUC1検出系の希釈直線性を示す。
[図 7]グリセロールを添加した場合の LTL-haptog lob i n検出系の希釈直線性を 示す。
[図 8]検出系にグリセロール化合物を添加した場合の希釈直線性を示す。
[図 9]検出系に様々な濃度のグリセロールを添加した場合の希釈直線性を示す 発明を実施するための形態
[0018] 1. 検出方法
本明細書に開示される検出方法の実施形態の一例を示す。 本開示のある実 施形態は、 レクチンと、 前記レクチンと結合する糖鎖を含む標的物質とを、 アルコールの存在下で混合することにより、 前記担体上に WF Aと標的物質 とを含む複合体を形成する工程 (形成工程) 、 及び前記複合体を検出するこ とにより、 標的物質を検出する工程 (検出工程) を含む、 標的物質の検出方 法に関する。 好ましくは、 前記検出は定量でありうる。
[0019] 標的物質は、 検出の対象となる物質である。 好ましくは糖タンパク質であ り、 より好ましくはウイステリア · フロリブンダ (W i s t e r i a f I 〇 r i b u n d a) のレクチン (WF A) と結合する糖鎖を有する。 標的物 質として、 好ましくは M a c— 2— b i n d i n g p r o t e i n (M2 B P) 、 Mu c i n 1 % c e l I s u r r a c e a s s o c i a t e
《 1酸性糖タンパク質 (八〇 ) 、 神経細胞接着分子 1_ 1
〇 2020/175672 5 卩(:171? 2020 /008328
(1_ 1 〇八1\/1) 、 <!_ - 6抗原等を挙げることができる。
[0020] 標的物質は、 生体から採取された試料に含まれる物質であることが好まし い。 試料は、 尿、 血液を用いることができる。 血液は、 末梢血であってもよ く、 該末梢血から調製した血漿又は血清であってもよい。 これらの中でも血 漿又は血清が好ましい。 本実施形態では、 必要に応じて、 試料を適切な水性 媒体で希釈してもよい。 そのような水性媒体は、 標的物質の検出を妨げない かぎり特に限定されず、 例えば、 水、 生理食塩水、 緩衝液などが挙げられる 。 緩衝液は特に限定されず、 中性付近の !·! (例えば 6以上 8以下の ! !) の緩衝液を用いることができる。 例えば、
1\/1巳3、 丁 「 丨 3、 丨 日 3などのグッ ド緩衝液、 リン酸緩衝生理食塩水 ( 巳3) などが挙 げられる。
[0021 ] レクチンは、 好ましくは 八を挙げることができる。 八として、 例 えば、 天然に存在する 八またはリコンビナント 八を挙げることがで きる。 天然に存在する \ZV F Aは、 4つのサブユニッ トから構成される 4量体 タンパク質である。 八は、 フジ ( I 3 6 「 I 3 干
匕リ门 の種子に含まれるレクチンとして知られている。 この 4量体の \ZV F A からは、 還元剤などを用いた所定の処理によって、 単量体又は 2量体の 八を得ることができる。 本明細書では、 特に断りのないかぎり、 「 八」 との表記は、 単量体の 及び多量体の の両方を意図する。 また、 本明細書において、 所定の数のサブユニッ トから構成される を表す場 合は、 例えば 「単量体 \ZV F A」 、 「2量体\^/ 」 、 「4量体 」 のよ うに、 サブユニッ トの数を明示して表記する。
[0022] 本実施形態では、 \ZV F Aは、 4量体 であってもよく、 単量体 八 又は 2量体 八であってもよい。 それらの中でも、 反応性の高さから、 2 量体 が好ましい。
[0023] アルコールとして、 例えば、 炭素数が 1から 7、 好ましくは炭素数が 2か ら 7のアルコールを挙げることができる。 アルコールの炭素数の下限値は、 1、 2又は 3から選択することができる。 一実施形態では、 炭素原子、 水素
〇 2020/175672 6 卩(:171? 2020 /008328
原子及び酸素原子のみからなるアルコールが用いられる。 好ましくは、 前記 炭素数が 1から 7のアルコールにはチオグリセロールは含まない。 より好ま しくは、 前記炭素数が 1から 7のアルコールにはチオール基を含むアルコー ルは含まない。 ここで、 「炭素数が 1から 7のアルコールにはチオグリセロ —ルは含まない」 とは、 後述する検出系、 試薬、 及び試薬キッ トにおいて、 少なくともチオグリセロール以外の炭素数が 1から 7のアルコールを含んで いればよいことを意味し、 チオグリセロールを添加する検出系、 試薬、 及び 試薬キッ トを完全に排除するものではない。 「炭素数が 1から 7のアルコー ルにはチオール基を含むアルコールは含まない」 との表現についても、 後述 する検出系、 試薬、 及び試薬キッ トにおいて、 少なくともチオール基を含む アルコール以外の炭素数が 1から 7のアルコールを含んでいればよいことを 意味し、 チオール基を含むアルコールを添加する検出系、 試薬、 及び試薬キ ッ トを完全に排除するものではない。 すなわち、 標的物質の検出を妨げない 程度にチオグリセロールを含んでいてもよい。
[0024] アルコールは、 一価であっても多価であってもよい。 価数は、 水酸基の数 を意図する。 多価アルコールとして、 例えば二価、 三価、 四価のアルコール を挙げることができる。
[0025] アルコールに含まれる炭素鎖は、 直鎖であっても分岐鎖であってもよいが 、 好ましくは直鎖である。
[0026] アルコールは、 一種のみを用いてもよいし、 複数種類を用いてもよい。
[0027] アルコールとして、 好ましくはメタノール、 エタノール、 グリセロール、 ペンタノール、 ヘプタノール、 ジグリセロール、 エチレングリコール、 ジエ チレングリコール、 プロピレングリコール、 ジプロピレングリコール、 トリ エチレングリコール、 及びこれらの混合物からなる群より選択される少なく とも一種のアルコールを挙げることができる。 グリセロール、 ジグリセロー ル、 エチレングリコール、 ジエチレングリコール、 プロピレングリコール、 ジプロピレングリコール、 トリエチレングリコール、 及びこれらの混合物か らなる群より選択される少なくとも一種のアルコールがより好ましく、 グリ
〇 2020/175672 7 卩(:171? 2020 /008328
セロールが最も好ましい。
[0028] \ZV F Aと、 標的物質との複合体の形成は、 例えば標的物質を含む試料 (ま たは試料を水性媒体で希釈した希釈液等) と、 とを混合し、 必要に応 じて一定時間インキユベーシヨンすることにより達成される。 この場合、 八は、 担体に固定化されていることが好ましい。
[0029] の担体への固定の態様は、 特に限定されない。 例えば、 \ZV F Aと担 体とを直接結合させてもよく、 あるいは と担体との間を別の物質を介 して間接的に結合させてもよい。 直接の結合としては、 例えば、 物理的吸着 などが挙げられる。 間接的な結合としては、 例えば、 ピオチンと、 アビジン 又はストレブトアビジン (以下、 「アビジン類」 ともいう) との組み合わせ を介した結合が挙げられる。 この場合、 八をあらかじめピオチンで修飾 し、 担体にアビジン類をあらかじめ結合させておくことにより、 ピオチンと アビジン類との結合を介して、 八と担体とを間接的に結合させることが できる。
[0030] 担体の素材は特に限定されず、 例えば、 有機高分子化合物、 無機化合物、 生体高分子などから選択できる。 有機高分子化合物としては、 ラテックス、 ポリスチレン、 ポリプロピレンなどが挙げられる。 無機化合物としては、 磁 性体 (酸化鉄、 酸化クロム及びフェライ トなど) 、 シリカ、 アルミナ、 ガラ スなどが挙げられる。 生体高分子としては、 不溶性アガロース、 不溶性デキ ストラン、 ゼラチン、 セルロースなどが挙げられる。 これらのうちの 2種以 上を組み合わせて用いてもよい。 担体の形状は特に限定されず、 例えば、 粒 子、 膜、 マイクロプレート、 マイクロチユーブ、 試験管などが挙げられる。 それらの中でも粒子が好ましく、 磁性粒子が特に好ましい。 磁性粒子を用い ることで、 八と標的物質の反応性を向上することができる。
[0031 ] 磁性粒子に固定させる 八は、 2量体 八が好ましい。 2量体 \ZV F A は、 例えば、 スルフヒドリル試薬や還元剤を用いて、 4量体 \ZV F Aのサブユ ニッ トを解離させて得ることができる。 また、 架橋剤と 4量体 八とを接 触させることによっても、 4量体 八を 2量体化させることができる。 そ
〇 2020/175672 8 卩(:171? 2020 /008328
のような架橋剤としては、 4量体 中のアミノ基と架橋を形成する架橋 剤が好ましい。 例えば、 アミノ基に対する反応基を有する架橋剤として、 -ヒドロキシスクシンイミ ドエステル基、 イソチオシアノ基、 クロロスルホ ン基、 クロロカルボニル基、 オキシエチレン基、 炭素数 1から 4のクロロア ルキル基、 アルデヒド基及びカルボキシル基からなる群より選択される少な くとも一種の官能基を有する架橋剤が挙げられる。 そのような架橋剤を用い れば、 4量体 を効率よく 2量体化させることができる。
[0032] 4量体 と架橋剤とを混合する際のモル比 ( /架橋剤) は、 好 ましくは 1 / 1 0以下、 より好ましくは 1 / 2 0以下である。 一方、 モル比 架橋剤) の下限は、 架橋剤の使用量及び生成する 2量体 八の 収率とのバランスを考慮して、 1 / 1 0 0以上とすることができる。
[0033] ピオチンとアビジン類との結合を介して 八を磁性粒子に固定させる場 合は、 ピオチン化 2量体 八を用いてもよい。 ピオチン化 2量体 八は 、 例えば、 ピオチンを含む架橋剤を用いて 4量体 八を 2量体化すること により得ることができる。 ピオチンを含む架橋剤は、 例えば、 ピオチンと、 架橋剤の上記反応基とをスぺーサーを介して結合させることにより得られる 。 そのようなスぺーサーは、 特に限定されないが、 例えば、 アミノへキサノ イル基 (アミノカプロイル基) を有する化合物などが挙げられる。
[0034] 標的物質と の複合体の形成時に、 前記アルコールが 2から 2 0 ¾// %、 好ましくは 4から 1 0 / %含まれることが好ましい。 本開示にお いて単位 「%/ % %」 は、 重量/重量換算の百分率を意図する (以下、 同じ
[0035] アルコール存在下で、 標的物質と の複合体を形成させる場合、 アル コールを含む試薬と、 担体に固定化された を含む試薬とを個別の試薬 として試料 (またはその希釈液) と混合してもよく、 アルコールと担体に固 定化された の混合液を試料と混合してもよい。 試薬と試料 (またはそ の希釈液) を混合する順序は特に限定されず、 これらを実質的に同時に混合 してもよいし、 逐次混合してもよい。 アルコールを含む試薬の例としては、
〇 2020/175672 9 卩(:171? 2020 /008328
シスメックス株式会社製!· I I 3(3 1_ (商標)
にアルコールを添加 した試薬を挙げることができる。 この場合、 担体に固定化された 八を含 む試薬として、 例えば、 シスメックス株式会社製 1~1 I 3(3 1_ (商標) IV! 2 巳 〇 丨 (商標)
試薬を挙げることができる。
[0036] 複合体の検出は、 例えば と標的物質との複合体にさらに検出物質を 含ませ、 検出物質からのシグナルを検出することにより可能となる。 \ZV F A と標的物質と検出物質との複合体は、 と標的物質との複合体と、 検出 物質とを混合して必要に応じて一定時間反応させることにより形成すること ができる。 また、 と標的物質との複合体を形成する際に検出物質を共 存させることにより、 八と標的物質と検出物質との複合体を形成しても よい。
[0037] 検出物質は、 標的物質と特異的に結合する物質であって、 標識物質を含む 物質であるかぎり制限されない。 標的物質が糖タンパク質である場合、 標的 物質と特異的に結合する物質は、 標的物質のタンパク質部分に結合すること が好ましい。 標的物質と特異的に結合する物質として、 例えば抗体を挙げる ことができる。 モノクローナル抗体、 ポリクローナル抗体、 及びそれらの断 片 (例えば、 3 (3匕’ ) 2など) のいずれであってもよい。 また 、 市販の抗体を用いてもよい。
[0038] 検出物質に用いられる標識物質は、 免疫学的測定において当業界で通常用 いられる物質を用いることができる。 例えば、 それ自体がシグナルを発生す る物質 (以下、 「シグナル発生物質」 ともいう) であってもよいし、 他の物 質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよい。 シグナル発 生物質としては、 例えば、 蛍光物質、 放射性同位元素などが挙げられる。 他 の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、 例 えば、 酵素が挙げられる。 酵素としては、 アルカリホスファターゼ、 ペルオ キシダーゼ、
—ガラクトシダーゼ、 ルシフエラーゼなどが挙げられる。 蛍 光物質としては、 フルオレセインイソチオシアネート ( 丨 丁〇) 、 口ーダ ミン、 八 丨 6父 3 丨 1_1 0 「 (商標) などの蛍光色素、 ◦ などの蛍光
〇 2020/175672 10 卩(:171? 2020 /008328
タンパク質などが挙げられる。 放射性同位元素としては、 1 2 5 丨、 1 4 0 , 3 2 などが挙げられる。 それらの中でも、 標識物質として、 酵素が好ましく、 アルカリホスファターゼが特に好ましい。 標識物質としてジニトロフエニル (〇 ) 基やピオチンなどのハプテンを用いることもできる。 ハプテンに 結合し且つシグナル発生物質や酵素などを有する物質を検出物質に結合する ことにより、 複合体からのシグナルを取得することができる。
[0039] 標識物質は、 当該技術において公知の標識方法により、 標的物質と特異的 に結合する物質に結合させることができる。 また、 市販のラベリングキッ ト などを用いて標識してもよい。
[0040] 本実施形態では、 複合体は、 複合体に含まれる検出物質の標識物質に基づ いて検出される。 具体的には、 複合体に含まれる検出物質の標識物質により 生じるシグナルを検出することにより、 試料に含まれる標識物質の量又は濃 度を反映する測定値を取得できる。 ここで、 「シグナルを検出する」 とは、 シグナルの有無を定性的に検出すること、 シグナル強度を定量すること、 及 び、 シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。 半定量的な検出とは 、 シグナルの強度を、 「シグナル発生せず」 、 「弱」 、 「中」 、 「強」 など のように段階的に示すことをいう。 本実施形態では、 シグナルの強度を定量 的又は半定量的に検出することが好ましい。
[0041 ] シグナルを検出する方法自体は、 当該技術分野において公知である。 本実 施形態では、 上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を 適宜選択すればよい。 例えば、 標識物質が酵素である場合、 該酵素に対する 基質を反応させることによって発生する光、 色などのシグナルを、 分光光度 計などの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
[0042] 酵素の基質は、 該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。 例 えば、 酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、 基質として、 〇〇 一 3 8 「 (商標) (4 -クロロー 3 - (メ トキシスピロ [ 1 , 2 -ジオ キセタンー 3 , 2’ 一 (5’ ークロロ) トリクシロ [ 3 . 3 . 1 . 1 3 , 7 ] デカン] - 4 -イル) フエニルリン酸 2ナトリウム) 、 〇3 0 (商標)
〇 2020/175672 1 1 卩(:171? 2020 /008328
(3 - (4 -メ トキシスピロ [ 1 , 2 -ジオキセタンー 3 , 2 - (5’ ーク ロロ) トリシクロ [ 3 . 3 . 1 . 1 3 , 7 ] デカン] - 4 -イル) フエニル リン酸 2ナトリウム) などの化学発光基質、 5 -ブロモー4 -クロロー 3 - インドリルリン酉愛 (巳〇 I ) 、 5 -ブロモー 6 -クロローインドリルリン 酸 2ナトリウム、 ーニトロフエニルリン酸などの発色基質が挙げられる。
[0043] 標識物質が放射性同位体である場合は、 シグナルとしての放射線を、 シン チレーシヨンカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。 また、 標識 物質が蛍光物質である場合は、 シグナルとしての蛍光を、 蛍光マイクロプレ —トリーダ—などの公知の装置を用いて測定できる。 なお、 励起波長及び蛍 光波長は、 用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。
[0045] 本実施形態において、 標識物質が酵素である場合には、 基質を標識物質と 接触させる工程及びシグナルを検出する工程を 「検出工程」 と呼ぶ。 また標 識物質が蛍光物質又は放射性同位元素である場合には、 シグナルを検出する 工程を 「検出工程」 と呼ぶ。
[0046] 本実施形態においては、 上記複合体の形成と検出工程との間に、 複合体を 形成していない未反応の遊離成分を除去する巳〇リ 〇1 / 「 6 6 (巳/ ) 分離を行ってもよい。 未反応の遊離成分とは、 複合体を構成しない成分を いう。 例えば、 未反応の試料成分、 \ZV F A、 検出物質等を挙げることができ る。 巳/ 分離の手段は特に限定されないが、 担体が粒子であれば、 遠心分 離により、 複合体を捕捉した担体だけを回収することにより巳 / 分離がで きる。 担体がマイクロプレートやマイクロチユーブなどの容器であれば、 未 反応の遊離成分を含む液を除去することにより巳/ 分離ができる。 また、
〇 2020/175672 12 卩(:171? 2020 /008328
担体が磁性粒子の場合は、 磁石で磁性粒子を磁気的に拘束した状態でノズル によって未反応の遊離成分を含む液を吸弓 I除去することにより巳 / 分離が でき、 自動化の観点で好ましい。 未反応の遊離成分を除去した後、 複合体を 捕捉した担体を 巳 3などの適切な水性媒体で洗浄してもよい。
[0047] シグナルの検出結果は、 標的物質の測定値として用いることができる。 例 えば、 シグナルの強度を定量的に検出する場合は、 シグナル強度の測定値自 体又は該測定値から算出される値を、 標的物質の測定値として用いることが できる。 シグナル強度の測定値から算出される値としては、 例えば、 該測定 値から陰性対照試料の測定値を差し引いた値、 該測定値を陽性対照試料の測 定値で除した値、 及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。
[0049] 2 . 試薬及び試薬キッ ト
(1) 試薬
本開示のある実施形態は、 標的物質の検出に使用する試薬に関する。 好ま しくは、 本実施形態は、 上記 1で述べた方法の一部の工程で使用される炭素 数 1から 7のアルコールを含む試薬を含む。 図 1 ( ) に試薬の容器 5 1の 外観を示す。
[0050] 試薬は、 炭素数 1から 7のアルコールを 3から 3 0 / %、 好ましくは 4から 1 5 / %で含むことが好ましい。 また試薬 5 1は、 例えば水性溶 媒を含むことが好ましい。 水性溶媒は、 上記 1で述べた検出を妨げないかぎ り特に限定されず、 例えば、 水、 生理食塩水、 緩衝液などが挙げられる。 緩 衝液は、 中性付近の 1~1 (例えば 6以上 8以下の 1~1) で緩衝作用を有する かぎり、 特に限定されない。 緩衝液として、 例えば、 1~1巳 巳 3、 IV!巳 3、 丁 「 丨 3、 I
などのグッ ド緩衝液、 リン酸緩衝生理食塩水 ( 巳3 ) などが挙げられる。 好ましくは 1~1巳 巳 3である。 このような緩衝液とし て、 例えば、 シスメックス株式会社製!· I I 3(3 1_ (商標)
を挙げ ることができる。
〇 2020/175672 13 卩(:171? 2020 /008328
[0051 ] また、 炭素数 1から 7のアルコールを含む試薬は、 上記 1で述べた担体に 固定化された 八を含んでいてもよい。 この場合にも、 試薬は、 例えば水 性溶媒を含むことが好ましい。 水性溶媒は、 上記 1で述べた検出を妨げない かぎり特に限定されず、 例えば、 水、 生理食塩水、 緩衝液などが挙げられる 。 緩衝液は、 中性付近の 1~1 (例えば 6以上 8以下の ! !) で緩衝作用を有 するかぎり、 特に限定されない。 緩衝液として、 例えば、 1~1巳 巳 3、 1\/1巳 3、 丁 「 丨 3、 I
などのグッ ド緩衝液、 リン酸緩衝生理食塩水 ( 巳 3) などが挙げられる。 好ましくは 1~1巳 巳 3である。 このような緩衝液 として、 例えば、 シスメックス株式会社製 1~1 丨 3〇!_ (商標) M 2 B P G \ (商標)
試薬を挙げることができる。
[0052] さらに、 試薬は、 上記 1で述べた検出物質を含んでいてもよい。
[0053] 試薬は、 /3—メルカプトエタノール、 口丁丁等の安定化剤; アルブミン等 の保護剤;ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、 ポリオキシエチ レン (2 0) ソルビタンモノラウレート、 ポリオキシエチレン ( 1 0) オク チルフエニルエーテル等の界面活性剤;及びアジ化ナトリウム、 ウシ血清ア ルブミン等の安定化剤から選択される少なくとも一種の添加剤を含んでいて もよい。 試薬は、 ナトリウム、 カリウム、 カルシウム、 マンガン等の金属塩 (好ましくは塩化物) を含んでいてもよい。
[0054] (2) 試薬キッ ト
本開示のある実施形態は、 標的物質の検出に使用する試薬キッ トに関する 。 試薬キッ トは、 少なくとも炭素数 1から 7のアルコールと、 \ZV F Aと、 検 出物質とを含む。 図 1 (巳) に試薬キッ トの概要の例を示す。 図 1 (巳) に 示す、 試薬キッ ト 5 0は、 外装箱 5 5と、 上記 2 . (1) で述べた炭素数 1 から 7のアルコールを含む試薬を格納した第 1の容器 5 1のと、 上記 1で述 ベた担体に固定化された を含む試薬を格納した第 2の容器 5 2と、 上 記 1で述べた標的物質に結合可能な検出物質を含む試薬を格納した第 3の容 器 5 3と、 試薬キッ トの添付文書 5 4とを含む。 添付文書 5 4には、 試薬キ ッ トの取り扱い方法、 保管条件、 使用期限などを記載しておくことができる
〇 2020/175672 14 卩(:171? 2020 /008328
[0055] 炭素数が 1から 7のアルコールが、 第 2の容器 5 2に含まれる担体に固定 化された を含む試薬に含まれる場合には、 第 1の容器 5 1 には、 上記 2 . (1) で述べた水性溶媒と、 必要に応じて添加物及び金属塩からなる群 より選択される少なくとも一種とを含む試薬が含まれる。
[0056] 炭素数が 1から 7のアルコールが、 第 1の容器 5 1 に含まれる試薬に含ま れる場合には、 第 2の容器 5 2に含まれる担体に固定化された は、 乾 燥形態であってもよい。 また、 試薬キッ トに含まれる 八は、 流通時には 担体に固定化されていない場合には、 使用する前に を担体に固定化す るための試薬と \ZV F Aと担体が各々個別に柄包されていてもよい。
(商標)
3試薬を挙げることができる。 また、 他の標的物質を検出する 場合には、 1~1 1 3(3 1_ (商標) 1\/1 2巳?〇 丨 (商標)
試薬に含まれ る抗 IV! 2巳 抗体を標的物質と特異的に結合する物質に合わせて変更するこ とができる。
[0058] さらに、 試薬キッ トには、 試料を希釈するための希釈液を含む容器 (例え ば、 シスメックス株式会社製 1~1 I 3(3 1_ (商標)
基質試薬 ( 例えば、 シスメックス株式会社製!· I I 3(3 1_ (商標) 用
を含む 容器、 洗浄用の水性媒体を含む容器などを外装箱 5 5に同柄してもよい。 なお、 上記 1で記述の用語の説明は、 本項に援用する。
実施例
[0059] 1 . 試薬 ·検体 ·測定
(1 -1) 試料希釈用緩衝液(第 1試薬)
(1-2’ -1) LTLレクチンのピオチン化
LTL 〔VECTOR Laboratories (ベクター · ラボラトリーズ) 社製、 商品名 : L otus tetragono lobus Lectin〕 を当該 LTLの濃度が 2.5 mg/mLとなるように 20 mMリン酸緩衝液 (pH 7.5) に添加し、 LTL含有溶液を得た。
[0062] 得られた LTL含有溶液に、 ピオチンを含む架橋剤である 5— (N—スクシン イミジルオキシカルボニル) ペンチル D—ピオチンアミ ド 〔 (株) 同仁化学 研究所製、 商品名 : Biot in-AC5-0su〕 を LTL/架橋剤 (モル比) が 1/100とな るように添加した。 得られた溶液を 25°Cで 90分間インキユベーシヨンするこ とにより、 前記 LTLと前記ピオチンを含む架橋剤とを反応させ、 反応産物を得 た。
[0063] (1-2, -2)ピオチン化 LTLの精製
(1-2’ -1)で得られた反応産物を、 高速液体クロマトグラフィーにより、 以 下の条件で精製し、 精製ピオチン化 LTLを得た。
-溶出溶媒: リン酸緩衝液 ( p H 6. 5)
-分離カラム:ゲル濾過カラム
[0064] (1-2’ -3) ストレブトアビジン結合粒子含有液の調製
ストレプトアビジン(STA)が磁性粒子 (平均粒子径 2 M m) の表面に固定化 された複合体 (磁性粒子 1 gあたりのストレプトアビジンの量: 2.9〜 3.5mg ;以下、 「STA結合磁性粒子」 ともいう) を 0.01M HEPES緩衝液(pH7.5)で 3回 洗浄した。 洗浄後の STA結合磁性粒子を STA濃度が 18〜 22Mg/mL (STA結合磁性 粒子の濃度が 0.48〜 0.52 mg/mL) となるように 0.01M HEPES緩衝液(pH7.5)に 添加し、 STA結合粒子含有液を得た。
[0065] (1-2’ -4)LTL固定化担体の調製
ピオチン化 LTLを当該ピオチン化 LTLの濃度が 20 Mg/mLとなるように得られ た STA結合粒子含有液に添加し、 STA結合磁性粒子のストレプトアビジンとビ オチン LTLのピオチンとを結合させた。 得られた産物を 0.1M MES緩衝液(pH6.5 )で 3回洗浄し、 LTL固定化担体を得た。 得られた LTL固定化担体を MES緩衝液
に懸濁し、 LTL固定化担体含有液を得た。
[0066] (1-3) 標識 M2BP抗体を含む溶液(第 3試薬)
標的物質として、 M2BPを使用する系にはシスメックス株式会社製の HISCL ( 商標) M2BPG1 (商標) R3試薬を用いた。
[0067] (1-3’ ) 標識 MUC1抗体を含む溶液(第 3試薬)
MUC1抗体として MY.1E12 (Journal of Immunological Methods Volume 270, Issue 2, 15 December 2002, Pages 199-209) を使用した。 MUC1抗体をリン 酸緩衝液に溶解し、 得られた溶液の EDTA濃度を 1 mMに調整した。 抗体溶液に 2 -メルカプトエチルアミン塩酸塩溶液を適量添加し、 37°Cで所定時間反応させ た。 その後、 PD-10カラム(GEヘルスケアジャパン)を用いて抗体溶液を脱塩し 、 所定濃度に調整した。
[0068] ALP標識剤としてのマレイミ ド架橋剤を N,N-ジメチルホルムアミ ド(DMF)に 溶解し、 マレイミ ド架橋剤溶液を調製した。 ALP溶液に、 上記のマレイミ ド架 橋剤溶液を適量添加し、 37°Cで所定時間置き、 マレイミ ド基を導入した。 そ の後、 PD-10カラム(GEヘルスケアジャパン)を用いて溶液を脱塩し、 所定濃度 に調整した。
[0069] 上記の抗体溶液と、 上記の ALP溶液とを所定割合で混合し、 冷蔵庫に入れ、 カップリング反応をさせた。 その後、 2 -メルカプトエチルアミン塩酸塩溶液 を添加し、 反応を停止した。 ALP抗体溶液をゲル濾過し、 所望の画分を回収し た。
[0070] 得られた所望の画分は BSAを含む緩衝液で所定の濃度に溶解し、 標識 MUC1抗 体の第 3試薬として用いた。
[0071] (1-3’ ’ ) 標識 haptoglobin抗体を含む溶液(第 3試薬)
標識 haptoglobin抗体を ABCAM社 (メーカーカタログ番号: AB13429) から入 手し、 1-3’ と同様の方法で標識化して、 標識 haptoglobin抗体の第 3試薬と して使用した。
[0072] (1-4) 測定用緩衝液(第 4試薬)
シスメックス株式会社製の HISCL (商標) R4試薬を用いた。
[0073] (1 -5) 基質(第 5試薬)
アルカリホスファターゼの化学発光基質として CDP-StaK商標)(アプライ ド バイオシステムズ社)を用いた HISCL (商標) R5試薬(シスメックス株式会社 製)を、 第 5試薬として使用した。
[0074] (1 -6) 検体
測定検体としてヒト血清の原液と、 前記ヒト血清を HISCL (商標) 検体希釈 液を用いて 2倍、 4倍、 8倍に希釈した希釈血清を用いた。
[0075] 2 . 実施例 1
グリセロールの添加が希釈直線性に及ぼす影響を検討した。
上記の第 1から第 5試薬を用いて全自動免疫測定装置 HISCL (商標) 5000( シスメックス株式会社製)により M2BPを測定した。 測定する際に、 HISCL (商 標) M2BPG 1 (商標) の R1試薬に、 グリセロールを 15 w/i4となるように添加 した。 R1試薬 100 ^と R2試薬 30 ^と測定検体 10 Mとを混合し、 装置の設定 にしたがってインキュベーションした後に B/F分離を行い、 R3試薬を添加して 測定値 (発光強度) を取得した。
[0076] 測定結果に基づいて、 希釈倍数から得られる理論上の回帰直線と、 実測結 果との相関係数 (R2値) を求めた。
[0077] 図 2に示すように、 Reference (無添加) に比べ、 グリセロールを添加した 検出系は、 良好な R2値を示し、 検体希釈直線性の明らかな向上を示した。
[0078] 3 . 実施例 2
グリセロール及び他の物質の添加が希釈直線性に及ぼす影響を検討した。 H ISCL (商標) M2BPG 1 (商標) の R1試薬に、 tween80、 NaC U ウシ血清アルブ ミン (BSA) 又はグリセロールを 15 w/i4となるように添加し、 実施例 1 と同 様に M2BP測定の希釈直線性を検討した。 図 3に示すように、 Reference (無添 カロ) に比べ、 グリセロールのみが、 他の物質を添加した場合と比較して、 良 好な R2値を示し検体希釈直線性の明らかな向上を示した。
[0079] 4 . 実施例 3
次に、 炭素数の異なるメタノール(C1)、 エタノール(C2)、 グリセロール(C3
〇 2020/175672 18 卩(:171? 2020 /008328
)、 ペンタノール(05)、 ヘプタノール(07)、 オクタノール(08)を (商標 ) (商標) の 1^1試薬に 15 «¾/ 14となるように添加し、 11/128?測定の検体 希釈直線性への影響を確認した。 測定は、 実施例 1 と同様に行った。 図 4に 示すように、 炭素数が 1から 7、 特に炭素数が 2から 7のアルコールにおい て、 検体希釈直線性の向上が示された。 一方で炭素数が 8のオクタノールを 添加しても検体希釈直線性の向上は認められなかった。
[0080] 5 . 実施例 4
レクチン及び標的物質を変えて検体の希釈直線性を確認した。 レクチンと
を使用した。 標的物質とし て、 11/128?、 11/11^1又は 3 〇9 1〇1)_ を使用した。 1_丁1_を用いる系では、 第 2試薬 として(1 -2’ )で述べた □!レクチンを固定した磁性粒子を使用した。 11/11^1を 測定する場合には、 第 3試薬として(1 -3’ )で述べた標識 (:1抗体を含む溶液 を使用した。 3 1〇9 1〇1)_ を測定する場合には第 3試薬として(1 -3’ ’ )で述 ベた標識 3 1〇9 1〇1)_ 抗体を使用した。 全ての検出系で第 1試薬として (商標)
(商標) の 1^1試薬を用い、 第 1試薬にグリセロールを実施例 1 と同様に添加した。 測定は、 実施例 1 と同様に行った。
[0081 ] その結果を図 5から図 7に示す。 レクチンとして 1^八を使用した検出系 (図
5及び図 6) は、 標的物質 (11/128?及び (:1) に関わらず、 グリセロール添加 により検体希釈直線性の向上を示した。 一方、 レクチンとして□!を使用した 113卩 〇9 1〇1)_ の検出系 (図 7) は、 グリセロールの添加により、 検体希釈直線 性が低下した。
[0083] 6 . 実施例 5
他のアルコールの効果を確認するため、 グリセロールの他、 ジグリセロー ル、 エチレングリコール、 ジエチレングリコール、 ジプロピレングリコール 、 £06000を添加し、 標的物質を として検体希釈直線性を検討した。 さら に、 特許文献 1で標識化レクチンの非特異結合を抑制する処理に使用されて
〇 2020/175672 19 卩(:171? 2020 /008328
いる還元剤 (チオグリセロール) を添加し、 グリセロールとの性能比較を行 った。 各添加剤は第 1試薬に添加し、 測定は、 実施例 1 と同様に行った。 図 8に示すように、 ジグリセロール、 エチレングリコール、 ジエチレングリコ —ル、 ジプロピレングリコールでも、 検体希釈直線性が向上した。 一方で、 高分子グリセロール類である £06000を添加した場合、 逆に検体希釈直線性は 著しく低下した。 また、 チオグリセロールを添加した場合にも、 検体希釈直 線性の著しい性能低下が生じた。
[0084] 以上の結果から、 炭素数 3から 6のアルコールとして他のグリセロール化 合物を添加しても、 検体希釈直線性の向上が認められることが明らかとなっ た。
[0085] 7 . 実施例 6
次に 1^1試薬に添加するグリセロール濃度を 0 ¾0¾%、 5. 0 «0^、 12. 5 «0^、 15. 0 ««/ 、 20. 0 / と変化させて、 標的物質を
としたときの検体希釈 直線性を検討した。 各添加剤は第 1試薬に添加し、 測定は、 実施例 1 と同様 に行った。 図 9に示すように、 5. 0 !/ø«%、 12. 5 !/ø«%、 15.
20.
のいずれの濃度でも検体希釈直線性が向上した。
Claims
[請求項 1 ] 担体に固定化されたウィステリア · フロリブンダ ( 丨 3 ㊀ 「 I
3 干 1 0 1^ 1 b u n 6 a) のレクチン ( 八) と、 八と結合 する糖鎖を含む標的物質とを、 炭素原子、 水素原子、 及び酸素原子の みからなる炭素数が 1から 7のアルコールの存在下で混合することに より、 前記担体上に と標的物質とを含む複合体を形成する工程 、 及び
前記複合体を検出することにより、 標的物質を検出する工程 を含む、 標的物質の検出方法。
[請求項 2] 前記形成工程において、 前記 \ZV F Aと、 前記標的物質と、 前記標的 物質に結合し且つ標識物質を有する検出物質とが前記アルコールの存 在下で混合され、 前記 と前記標的物質と前記検出物質とを含む 複合体が形成され、
前記検出工程において、 前記複合体が前記複合体の標識物質に基づ いて検出される、 請求項 1 に記載の検出方法。
[請求項 3] 前記アルコールの炭素数が 2から 7である、 請求項 1又は 2に記載 の検出方法。
[請求項 4] 前記アルコールが、 メタノール、 エタノール、 グリセロール、 ペン タノール、 ヘプタノール、 ジグリセロール、 エチレングリコール、 ジ エチレングリコール、 プロピレングリコール、 ジプロピレングリコー ル、 トリエチレングリコール、 及びこれらの混合物からなる群より選 択される少なくとも 1のアルコールである、 請求項 1から 3のいずれ か一項に記載の検出方法。
[請求項 5] 前記形成工程において、 2から 2〇 / %の濃度のアルコールの 存在下で前記複合体が形成される、 請求項 1から 4に記載の検出方法
[請求項 6] 標的物質が、 糖タンパク質である、 請求項 1から 5に記載の検出方 法。
[請求項 7] 標的物質が、 Ma c-2- b i n d i n g p r o t e i n (M2
B P) 、 Mu c i n 1 , c e l l s u r f a c e a s s o c i a t e d (MUC 1 ) , a 1酸性糖タンパク質 (AG P) 、 神経 細胞接着分子 L 1 (L 1 CAM) 、 または KL_ 6抗原である、 請求 項 6に記載の検出方法。
[請求項 8] 前記検出物質が、 前記標的物質に特異的に結合する抗体である、 請 求項 1から 7のいずれか一項に記載の検出方法。
[請求項 9] 前記標識物質が、 ハプテン、 酵素および蛍光物質からなる群より選 択される少なくとも 1である、 請求項 1から 8のいずれか一項に記載 の検出方法。
[請求項 10] 前記担体が粒子である、 請求項 1から 9のいずれか一項に記載の検 出方法。
[請求項 11] 前記検出工程において、 標的物質が定量される、 請求項 1から 1 〇 のいずれか一項に記載の検出方法。
[請求項 12] 担体に固定化されたウィステリア · フロリブンダ (W i s t e r i a f l o r i b u n d a) のレクチン (WFA) と、 WF Aと結合 する糖鎖を含む標的物質とを、 炭素数 1から 7のアルコール (但し、 チオグリセロールを除く) の存在下で混合することにより、 前記担体 上に W F Aと標的物質とを含む複合体を形成する工程、 及び
前記複合体を検出することにより、 標的物質を検出する工程 を含む、 標的物質の検出方法。
[請求項 13] 担体に固定化されたウィステリア · フロリブンダ (W i s t e r i a f l o r i b u n d a) のレクチン (WFA) と、 WF Aと結合 する糖鎖を含む標的物質とを、 炭素数が 1から 7のアルコール (但し 、 チオール基を含むアルコールを除く) の存在下で混合することによ り、 前記担体上に WF Aと標的物質とを含む複合体を形成する工程、 及び
前記複合体を検出することにより、 標的物質を検出する工程
〇 2020/175672 22 卩(:171? 2020 /008328
を含む、 標的物質の検出方法。
[請求項 14] 標的物質を検出するための試薬であって、
炭素原子、 水素原子、 及び酸素原子のみからなる炭素数が 1から 7 のアルコールを含み、
前記標的物質が、 ウイステリア · フロリブンダ ( 丨 3 6 「 丨 3 干 I 〇 「 I b 0 n d a) のレクチン ( 八) と結合する糖鎖を含 む、
前記試薬。
[請求項 15] 標的物質を検出するための試薬であって、
炭素数が 1から 7のアルコール (但し、 チオグリセロールを除く) を含み、
前記標的物質が、 ウイステリア · フロリブンダ ( 丨 3 6 「 丨 3 干 I 〇 「 I b 0 n d a) のレクチン ( 八) と結合する糖鎖を含 む、
前記試薬。
[請求項 16] 標的物質を検出するための試薬であって、
炭素数が 1から 7のアルコール (但し、 チオール基を含むアルコー ルを除く) を含み、 前記標的物質が、 ウイステリア · フロリブンダ (\/\/
1: 1 〇 「 1 13リ门〇13) のレクチン (\/\/ 八) と結合する糖鎖を含む、
前記試薬。
[請求項 17] 標的物質を検出するための試薬キッ トであって、 前記試薬キッ トは 標的物質の検出物質;
炭素原子、 水素原子、 及び酸素原子のみからなる炭素数が 1から 7 のアルコール;
〇 2020/175672 23 卩(:171? 2020 /008328
を含み、
ここで、 前記標的物質が、 と結合する糖鎖を含む
前記試薬キッ ト。
[請求項 18] 標的物質を検出するための試薬キッ トであって、 前記試薬キッ トは 標的物質の検出物質;
炭素数が 1 から 7のアルコール (但し、 チオグリセロールを除く) を含み、
ここで、 前記標的物質が、 と結合する糖鎖を含む
前記試薬キッ ト。
[請求項 19] 標的物質を検出するための試薬キッ トであって、 前記試薬キッ トは 標的物質の検出物質;
炭素数が 1 から 7のアルコール (但し、 チオグリセロールを除く) を含み、
ここで、 前記標的物質が、 と結合する糖鎖を含む
前記試薬キッ ト。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP20763781.0A EP3933405A4 (en) | 2019-02-28 | 2020-02-28 | METHODS FOR DETECTING TARGET SUBSTANCE, REAGENTS FOR DETECTING TARGET SUBSTANCE AND REAGENT KIT FOR DETECTING TARGET SUBSTANCE |
CN202080016523.9A CN113474655A (zh) | 2019-02-28 | 2020-02-28 | 目标物质的检测方法、用于目标物质的检测的试剂、及用于目标物质的检测的试剂盒 |
JP2021502397A JP7459045B2 (ja) | 2019-02-28 | 2020-02-28 | 標的物質の検出方法、標的物質の検出のための試薬、及び標的物質の検出のための試薬キット |
US17/459,158 US20210389312A1 (en) | 2019-02-28 | 2021-08-27 | Method for detecting target substance, reagent for detecting target substance |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019-035529 | 2019-02-28 | ||
JP2019035529 | 2019-02-28 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
US17/459,158 Continuation US20210389312A1 (en) | 2019-02-28 | 2021-08-27 | Method for detecting target substance, reagent for detecting target substance |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2020175672A1 true WO2020175672A1 (ja) | 2020-09-03 |
Family
ID=72238612
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2020/008328 WO2020175672A1 (ja) | 2019-02-28 | 2020-02-28 | 標的物質の検出方法、標的物質の検出のための試薬、及び標的物質の検出のための試薬キット |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210389312A1 (ja) |
EP (1) | EP3933405A4 (ja) |
JP (1) | JP7459045B2 (ja) |
CN (1) | CN113474655A (ja) |
WO (1) | WO2020175672A1 (ja) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015129384A1 (ja) * | 2014-02-27 | 2015-09-03 | シスメックス株式会社 | 糖鎖を含む標的物質の検出用試薬、検出方法、および糖鎖を含む標的物質を検出するために用いられる担体ならびにその製造方法 |
WO2015194350A1 (ja) * | 2014-06-20 | 2015-12-23 | コニカミノルタ株式会社 | 標識化レクチンを用いるサンドイッチ型アッセイおよびそのためのキット |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105424942B (zh) * | 2010-09-17 | 2017-07-18 | 国立研究开发法人产业技术综合研究所 | 肺癌鉴定标志物 |
WO2014087802A1 (ja) * | 2012-12-05 | 2014-06-12 | コニカミノルタ株式会社 | 表面プラズモン励起増強蛍光分光法(spfs)を用いた免疫測定法における夾雑物由来の非特異的シグナルの抑制方法 |
WO2017047813A1 (ja) * | 2015-09-18 | 2017-03-23 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 肝硬変患者における肝細胞がん発生リスク及び予後を予測するための方法 |
-
2020
- 2020-02-28 CN CN202080016523.9A patent/CN113474655A/zh active Pending
- 2020-02-28 WO PCT/JP2020/008328 patent/WO2020175672A1/ja unknown
- 2020-02-28 EP EP20763781.0A patent/EP3933405A4/en active Pending
- 2020-02-28 JP JP2021502397A patent/JP7459045B2/ja active Active
-
2021
- 2021-08-27 US US17/459,158 patent/US20210389312A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015129384A1 (ja) * | 2014-02-27 | 2015-09-03 | シスメックス株式会社 | 糖鎖を含む標的物質の検出用試薬、検出方法、および糖鎖を含む標的物質を検出するために用いられる担体ならびにその製造方法 |
WO2015194350A1 (ja) * | 2014-06-20 | 2015-12-23 | コニカミノルタ株式会社 | 標識化レクチンを用いるサンドイッチ型アッセイおよびそのためのキット |
US20170122940A1 (en) | 2014-06-20 | 2017-05-04 | Konica Minolta, Inc. | Sandwich assay using labeled lectin and kit therefor |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, vol. 270, 15 December 2002 (2002-12-15), pages 199 - 209 |
See also references of EP3933405A4 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20210389312A1 (en) | 2021-12-16 |
EP3933405A1 (en) | 2022-01-05 |
JP7459045B2 (ja) | 2024-04-01 |
JPWO2020175672A1 (ja) | 2021-12-23 |
CN113474655A (zh) | 2021-10-01 |
EP3933405A4 (en) | 2023-03-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2779191C (en) | Method and kit for measuring component to be assayed in specimen | |
WO2011012053A1 (zh) | 检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法 | |
EP3425406B1 (en) | Method for measuring lipoprotein's capacity to accept cholesterol and reagent kit | |
CN109564223B (zh) | 肿瘤标记物的测定方法及测定试剂 | |
EP3415912B1 (en) | Analyte detection method and reagent kit for detecting analyte | |
US20220299502A1 (en) | Reagent for detecting target substance containing sugar chain, detection method, carrier used in detection of target substance containing sugar chain, and method for manufacturing said carrier | |
TWI224674B (en) | Immunoassay using insoluble magnetic support particles | |
CN101281200B (zh) | 碱性磷酸酶标记试剂盒、免疫测定试剂盒及免疫测定方法 | |
JP6042937B2 (ja) | 可溶性インターロイキン−2受容体の測定方法及び測定用試薬 | |
WO2020175672A1 (ja) | 標的物質の検出方法、標的物質の検出のための試薬、及び標的物質の検出のための試薬キット | |
JP7281092B2 (ja) | 試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キット | |
JP2022058732A (ja) | 線維芽細胞増殖因子-23の測定方法、測定試薬及び測定キット | |
JP2007225603A (ja) | 試料中の測定対象物の免疫測定方法および免疫測定試薬 | |
EP3919513A1 (en) | Calibrator, complex, and method for measuring iga aggregate | |
JP2017191012A (ja) | 可溶性インターロイキン2受容体の免疫学的測定法 | |
JP5902714B2 (ja) | 検体中の測定対象物の連続的免疫測定法における非特異反応抑制方法 | |
JP2015212237A (ja) | 新規ペプチドおよびその使用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 20763781 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2021502397 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2020763781 Country of ref document: EP Effective date: 20210928 |