JP7281092B2 - 試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キット - Google Patents
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Description
[1]試料中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いて測定する方法であって、抗原抗体反応を、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする、試料中のエクソソームの測定方法。
[2]以下の工程(1)~(3)を含み、工程(1)及び/又は工程(2)の反応が、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する水性媒体中で行われる、[1]記載の方法。
(1)試料と、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させ、該第1抗体若しくは該抗体断片と、該エクソソームと、からなる免疫複合体1を生成させる工程;
(2)エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片を、水性媒体中で、前記工程(1)で生成した免疫複合体1と反応させ、該第1抗体若しくは該抗体断片と、該エクソソームと、該第2抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体2を生成させる工程;
(3)前記工程(2)で生成した免疫複合体2を測定する工程。
[3]エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である[1]又は[2]記載の方法。
[4]ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance)値が14以上20以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である[3]記載の方法。
[5]ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である[3]又は[4]記載の方法。
[6]第1抗原及び第2抗原のうち少なくとも一方が、CD9、CD63及びCD81からなる群より選択される抗原である、[2]~[5]のいずれかに記載の方法。
[8]エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である[7]記載の試薬。
[9]ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、HLB値が14以上20以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である[8]記載の試薬。
[10]ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である[8]又は[9]記載の試薬。
[11]第1抗原及び第2抗原のうち少なくとも一方が、CD9、CD63及びCD81からなる群より選択される抗原である、[7]~[10]のいずれかに記載の試薬。
[13]エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含有する第1試薬、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片を含有する第2試薬、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第3試薬を含む、試料中のエクソソームの測定キット。
[14]エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である[12]又は[13]記載のキット。
[15]ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、HLB値が14以上20以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である[14]記載のキット。
[16]ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である[14]又は[15]記載のキット。
[17]第1抗原及び第2抗原のうち少なくとも一方が、CD9、CD63及びCD81からなる群より選択される抗原である、[12]~[16]のいずれかに記載のキット。
本発明の試料中のエクソソームの測定方法は、試料中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いて測定する方法であって、抗原抗体反応を、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする方法であり、試料中のエクソソームを破壊することなく、エクソソームがその表面に有する抗原、すなわち、エクソソーム表面抗原を、抗原抗体反応を用いて測定する方法である。ここで、「試料中のエクソソームを破壊することなく」とは、エクソソーム特有の脂質二重膜構造を保持し、この脂質二重膜上にエクソソーム表面抗原が保持されることを意味する。
本発明の試料中のエクソソームの測定方法は、以下の工程(1A)~(3A)を含み、工程(1A)及び/又は工程(2A)の反応が、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する水性媒体中で行われる方法である。
(1A)試料と、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させ、該第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片と、該第1抗原を有するエクソソームと、からなる免疫複合体1を生成させる工程;
(2A)エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片を、水性媒体中で、前記工程(1A)で生成した免疫複合体1と反応させ、該第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片と、該第1抗原及び該第2抗原を有するエクソソームと、該第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体2を生成させる工程;
(3A)前記工程(2A)で生成した免疫複合体2を測定する工程。
工程(1A)における試料としては、前述の試料等が挙げられる。
工程(1A)において、試料と、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させる方法は、エクソソームと、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体1を生成させる方法であれば特に制限はない。
エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片が不溶性担体に固定化されている場合、該第1抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の組み合わせの一方(A)が結合した該第1抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(a)が結合した不溶性担体とを、抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、該第1抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。
・試料と、一組の親和性物質の組み合わせの一方(A)が結合した該第1抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(a)が結合した不溶性担体とを、水性媒体中で同時に反応させて、免疫複合体1を生成させる方法;
・試料と、一組の親和性物質の組み合わせの一方(A)が結合した該第1抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させた後、当該反応の反応液中に一組の親和性物質の組み合わせの他方(a)が結合した不溶性担体を添加し、免疫複合体1を生成させる方法;
・一組の親和性物質の組み合わせの一方(A)が結合した該第1抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(a)が結合した不溶性担体とを、水性媒体中で反応させた後、当該反応の反応液中に試料を添加し、免疫複合体1を生成させる方法。
・ビオチンとアビジン類(アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等)との組み合わせ;
・アビジン類(アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等)とビオチンとの組み合わせ;
・エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体のFc領域と、該Fc領域に結合する抗体との組み合わせ。
工程(2A)において、工程(1A)で生成した免疫複合体1に、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片を添加して反応させてもよいし、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片に、工程(1A)で生成した免疫複合体1を添加して反応させてもよい。
工程(1A)と工程(2A)とを同時に行う場合には、試料と、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で同時に反応させ、該第1抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、該第2抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体2を生成させ、生成した免疫複合体2を測定することにより、試料中のエクソソームを測定する。工程(1A)と工程(2A)とを同時に行う場合には、免疫複合体2は、前述の不溶性担体上に生成されることが好ましい。不溶性担体上に免疫複合体2を生成させる方法としては、例えば、次のような方法等が挙げられる。
(i)試料を、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片、及び、不溶性担体と、水性媒体中で同時に反応させる方法;
(ii)試料を、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体、及び、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片と、水性媒体中で同時に反応させる方法
上記(i)の方法においては、一組の親和性物質の組み合わせの一方(A)が結合した該第1抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(a)が結合した不溶性担体とを用いることが好ましい。当該(A)-(a)の組み合わせとしては、前述の組み合わせ等が挙げられる。
工程(2A)の後に、洗浄工程を追加しても、追加しなくてもよいが、追加することが好ましい。工程(2A)の後の不溶性担体の洗浄に用いられる洗浄液は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする洗浄液であれば特に制限はなく、例えば前述の洗浄液等が挙げられる。
工程(3A)において、工程(2A)で生成した免疫複合体2を以下の方法を用いて測定することにより、試料中のエクソソーム濃度が決定される。
エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片に結合する抗体(以下、第3抗体と記す)若しくは該第3抗体の抗体断片に標識が結合した標識化第3抗体若しくは該抗体断片を、免疫複合体2(エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体)中の該第2抗体若しくは該抗体断片と反応させて、該第1抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、該第2抗体若しくは該抗体断片と、標識化第3抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体3を形成させ、免疫複合体3中の標識を後述の方法により測定することにより、工程(2A)で生成した免疫複合体2の量を測定することができる。第3抗体としては、例えばエクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体のFc領域に結合する抗体若しくは該抗体断片等が挙げられる。標識としては、後述の標識等が挙げられる。
免疫複合体2中の標識を測定することにより、工程(2A)で生成した免疫複合体2を測定することができる。すなわち、第1抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、標識化該第2抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体2中の標識を測定することにより、工程(2A)で生成した免疫複合体2を測定することができる。標識化該第2抗体若しくは該抗体断片は、該第2抗体若しくは該抗体断片に後述の標識が結合した物質であり、公知の方法により調製することができる。
(4A)試料として、既知濃度のエクソソームを用いて前記工程(1A)から(3A)を行い、エクソソーム濃度と標識の測定値との関係を表す検量線を作成する工程;
(5A)工程(4A)で作成された検量線と、工程(2A)で測定された標識の測定値と、から、試料中のエクソソームの濃度を決定する工程。
本発明のエクソソームの測定方法の別の態様として、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片、及び競合物質を用いる競合法が挙げられる。当該競合法においては、標識化競合物質、または、標識化された、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を用いることができる。
標識化競合物質は、競合物質に前述の標識が結合した物質であり、公知の方法により調製することができる。標識化された、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片は、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片に前述の標識が結合した物質であり、公知の方法により調製することができる。
競合物質とは、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片に結合し、かつその結合が、測定対象物質であるエクソソームと競合的であるような物質を意味し、測定対象物質であるエクソソームそのものや、該第1抗原も含まれる。競合物質としては、該第1抗体若しくは該抗体断片が認識するエクソソーム中のエピトープと同じ構造を有している物質が好ましく、さらに該第1抗体若しくは該抗体断片に対する結合の強さが、該第1抗体若しくは該抗体断片に対するエクソソームの結合の強さと同程度であるものがより好ましく、具体的には、測定対象物質であるエクソソームそのもの、該第1抗原等が挙げられる。
(1B)試料と、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片と、標識化競合物質とを、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する水性媒体中で反応させて、該第1抗体若しくは該抗体断片とエクソソームとの免疫複合体、及び、該第1抗体若しくは該抗体断片と標識化競合物質との免疫複合体4を生成させる工程;
(2B)工程(1B)で生成した該第1抗体若しくは該抗体断片と標識化競合物質との免疫複合体4中の標識を測定する工程;
(3B)試料の代わりに既知濃度のエクソソームを用いて前記工程(1B)及び工程(2B)を行い、エクソソーム濃度と標識の測定値との関係を表す検量線を作成する工程;
(4B)工程(3B)で作成された検量線と、工程(2B)で測定された標識の測定値とから、試料中のエクソソーム濃度を決定する工程。
・ビオチンとアビジン類(アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等)との組み合わせ;
・アビジン類(アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等)とビオチンとの組み合わせ;
・該第1抗体のFc領域と、該Fc領域と結合する抗体との組み合わせ。
(1C)試料と、標識化された、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片と、競合物質とを、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む水性媒体中で反応させて、標識化された該第1抗体若しくは該抗体断片とエクソソームとの免疫複合体、及び、標識化された該第1抗体若しくは該抗体断片と競合物質との免疫複合体5を生成させる工程;
(2C)工程(1C)で生成した標識化された該第1抗体若しくは該抗体断片と競合物質との免疫複合体5中の標識を測定する工程;
(3C)試料の代わりに既知濃度のエクソソームを用いて前記工程(1C)及び工程(2C)を行い、エクソソーム濃度と標識の測定値との関係を表す検量線を作成する工程;
(4C)工程(3C)で作成された検量線と、工程(2C)で測定された標識の測定値とから、試料中のエクソソーム濃度を決定する工程。
・ビオチンとアビジン類(アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等)との組み合わせ;
・アビジン類(アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等)とビオチンとの組み合わせ。
本発明における、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体の抗体断片としては、該第2抗原に結合し、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする抗体断片であれば特に制限はなく、例えば、抗体をパパイン処理することにより得られるFab、抗体をペプシン処理することにより得られるF(ab’)2、抗体をペプシン処理-還元処理することにより得られるFab’等の、Fc部分が除去された抗体断片、遺伝子工学的手法によりFc部分が除去された抗体断片等が挙げられる。
本発明における、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体としては、該第2抗原に結合し、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用可能である。
本発明のエクソソームの測定試薬は、本発明のエクソソームの測定方法に用いられる試薬である。本発明のエクソソームの測定試薬の具体的態様を以下に記す。
エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片、並びに、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する試薬
該第1抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片、標識化競合物質、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する試薬
該第1抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。標識、競合物質としては、例えば前述の標識、競合物質がそれぞれ挙げられる。
この場合、本発明の測定試薬には、該第1抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方(D)が結合した該第1抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(d)が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Dとdの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類(アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等)との組み合わせ;
・アビジン類(アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等)とビオチンとの組み合わせ;
・エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体のFc領域と、該Fc領域に結合する抗体との組み合わせ。
標識化された、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片、競合物質、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する試薬
競合物質は不溶性担体に固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。標識、競合物質としては、例えば前述の標識、競合物質がそれぞれ挙げられる。
この場合、本発明の測定試薬には、競合物質が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方(E)が結合した競合物質と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(e)が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Eとeの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類(アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等)との組み合わせ;
・アビジン類(アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等)とビオチンとの組み合わせ。
本発明の測定試薬において、2種類以上の、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の組み合わせが含有されてもよい。
本発明のエクソソームの測定試薬は、保存、運搬、流通等の観点からキットの形態を取ることもできる。本発明の測定キットは、本発明のエクソソームの測定方法に用いられる。本発明のエクソソームの測定キットの具体的態様を以下に記す。
エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含有する第1試薬と、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片を含有する第2試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第1試薬及び第2試薬の少なくとも1つの試薬に含まれる、キット
該第1抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含有する第1試薬と、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片を含有する第2試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第3試薬とを含む、キット
該第1抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
この場合、本発明の測定試薬には、該第1抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方(F)が結合した該第1抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(f)が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Fとfの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類(アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等)との組み合わせ;
・アビジン類(アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等)とビオチンとの組み合わせ;
・エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体のFc領域と、該Fc領域に結合する抗体との組み合わせ。
一組の親和性物質の組み合わせの一方(F)が結合した該第1抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(f)が結合した不溶性担体とが、別々の試薬に含まれている以下のキット、すなわち、測定キット3~5も本発明のキットに含まれる。
一組の親和性物質の組み合わせの一方(F)が結合した、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含む第1試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(f)が結合した不溶性担体、及び、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片を含む第2試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第1試薬及び第2試薬の少なくとも1つの試薬に含まれる、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方(F)が結合した、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含む第1試薬と、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片を含む第2試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(f)が結合した不溶性担体を含む第3試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第1~3試薬の少なくとも1つの試薬に含まれる、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方(F)が結合した、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含む第1試薬と、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片を含む第2試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(f)が結合した不溶性担体を含む第3試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む第4試薬とを含む、キット
・測定キット6
エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含む第1試薬と、標識化競合物質を含む第2試薬とを含有し、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、第1試薬及び第2試薬の少なくとも1つの試薬に含まれる、キット
該第1抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含む第1試薬と、標識化競合物質を含む第2試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第3試薬とを含む、キット
該第1抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
この場合、本発明の測定試薬には、該第1抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方(G)が結合した該第1抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(g)が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Gとgの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類(アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等)との組み合わせ;
・アビジン類(アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等)とビオチンとの組み合わせ;
・エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体のFc領域と、該Fc領域に結合する抗体との組み合わせ。
一組の親和性物質の組み合わせの一方(G)が結合した該第1抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(g)が結合した不溶性担体とが、別々の試薬に含まれている以下のキット、すなわち、測定キット8~10も本発明のキットに含まれる。
一組の親和性物質の組み合わせの一方(G)が結合した、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含む第1試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(g)が結合した不溶性担体、及び、標識化競合物質を含む第2試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第1試薬及び第2試薬の少なくとも1つに含まれる、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方(G)が結合した、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含む第1試薬と、標識化競合物質を含む第2試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(g)が結合した不溶性担体を含む第3試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第1~3試薬の少なくとも1つに含まれる、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方(G)が結合した、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含む第1試薬と、標識化競合物質を含む第2試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(g)が結合した不溶性担体を含む第3試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む第4試薬とを含む、キット
・測定キット11
標識化された、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含む第1試薬と、競合物質を含む第2試薬とを含有し、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、第1試薬、第2試薬の少なくとも1つの試薬に含まれる、キット
競合物質は不溶性担体に固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
標識化された、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含む第1試薬と、競合物質を含む第2試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第3試薬とを含む、キット
競合物質は不溶性担体に固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
この場合、本発明の測定試薬には、競合物質が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方(H)が結合した競合物質と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(h)が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Hとhの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類(アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等)との組み合わせ;
・アビジン類(アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等)とビオチンとの組み合わせ。
一組の親和性物質の組み合わせの一方(H)が結合した競合物質と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(h)が結合した不溶性担体とが、別々の試薬に含まれている以下のキット、すなわち、測定キット13~15も本発明のキットに含まれる。
一組の親和性物質の組み合わせの一方(H)が結合した競合物質を含む第1試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(h)が結合した不溶性担体、及び、標識化された、該第1抗体若しくは該抗体断片を含む第2試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第1試薬及び第2試薬の少なくとも1つの試薬に含まれる、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方(H)が結合した競合物質を含む第1試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(h)が結合した不溶性担体を含む第2試薬と、標識化された、該第1抗体若しくは該抗体断片を含む第3試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第1~3試薬の少なくとも1つの試薬に含まれる、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方(H)が結合した競合物質を含む第1試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方(h)が結合した不溶性担体を含む第2試薬と、標識化された、該第1抗体若しくは該抗体断片を含む第3試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む第4試薬とを含む、キット
本発明の測定キットの、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片の含量としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、通常、前述の水性媒体中、又は、前述の水性媒体で溶解された状態で通常0.01~100μg/mLであり、0.03~20μg/mLが好ましく、0.05~10μg/mLが特に好ましい。
本発明の測定キットの構成試薬における、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の含量としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、通常、前述の水性媒体中、又は、前述の水性媒体で溶解された状態で0.00005~30.0%(w/v)となる含量であり、0.0001~20.0%(w/v)となる含量が好ましく、0.0025~10.0%(w/v)となる含量が特に好ましい。
本発明の測定キットにおいては、2種類以上の、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の組み合わせが含有されてもよい。
<材料>
リン酸水素二ナトリウム(リン酸緩衝液;関東化学社製)、リン酸二水素ナトリウム(リン酸緩衝液;関東化学社製)、塩化ナトリウム(和光純薬工業社製)、塩化マグネシウム(和光純薬工業社製)、MES(同仁化学研究所社製)、MOPS(同仁化学研究所社製)、Tween 20(関東化学社製)、ストレプトアビジン結合磁性粒子(Dynabeads MyOne Streptavidin C1;ダイナル社製)、ノニオンHS-240(HLB値:17.9)、ノニオンNS-240(HLB値:17.8)、ノニオンHS-220(HLB値:16.2)、ノニオンNS-220(HLB値:16.0)、ノニオンHS-215(HLB値:15.0)、ノニオンNS-215(HLB値:15.0)(以上、HLB値が14以上20以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル;日油社製)、ニューコール610、ニューコール714、ニューコール723、ニューコール740、ニューコール2609、ニューコール2614(以上、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル;日本乳化剤社製)、ニューコール740SF、ニューコール723SF(以上、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩;日本乳化剤社製)、トラックスN-700B(ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩;日油社製)、トリトンX-100[ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル(HLB値:13.5);シグマ-アルドリッチ社製]、ノニデットP-40[ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル(HLB値:13.1);シグマ-アルドリッチ社製]、BSA(オリエンタル酵母工業社製)、抗ヒトCD9モノクローナル抗体(クローン:A100-4)(医学生物学研究所社製)、抗ヒトCD63モノクローナル抗体(クローン:C047-1)(医学生物学研究所社製)、抗ヒトCD81モノクローナル抗体(クローン:A103-10)(医学生物学研究所社製)。
また、以下の表3に示す第1抗体と第2抗体との組合せを用いて、比較例1として、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合第1抗体溶液及びALP標識第2抗体溶液においてトリトンX-100を含む測定キット(測定キット1X~6X)、ノニデット P-40を含む測定キット(測定キット1Y~6Y)、界面活性剤の代わりにPBS[リン酸緩衝化生理食塩水(0.15 mol/L 塩化ナトリウムを含有する10 mmol/L リン酸緩衝液、pH7.2)]を含む測定キット(測定キット1Z~6Z)も作製した(表4~表9)。
市販のストレプトアビジン結合磁性粒子(Dynabeads MyOne Streptavidin C1)を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.225 mg/mL
界面活性剤 (表4~表9に記載の界面活性剤の濃度)
Biotin Labeling Kit-NH2 (同仁化学研究所社製)を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、抗CD9モノクローナル抗体をビオチンで標識し、ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体(ビオチン結合第1抗体)を調製した。同様の方法を用いて、ビオチン結合抗CD63モノクローナル抗体(ビオチン結合第1抗体)およびビオチン結合抗CD81モノクローナル抗体(ビオチン結合第1抗体)を調製した。
得られたビオチン結合第1抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液、ビオチン結合抗CD63モノクローナル抗体溶液、ビオチン結合抗CD81モノクローナル抗体溶液を調製した。
・ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 (表4~表9に記載の界面活性剤の濃度)
・ビオチン結合抗CD63モノクローナル抗体溶液
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD63モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 (表4~表9に記載の界面活性剤の濃度)
・ビオチン結合抗CD81モノクローナル抗体溶液
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD81モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 (表4~表9に記載の界面活性剤の濃度)
Alkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2(同仁化学研究所社製)を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、抗CD9モノクローナル抗体をALPで標識し、ALP標識抗CD9モノクローナル抗体(ALP標識第2抗体)を作製した。同様の方法を用いて、ALP標識抗CD63モノクローナル抗体(ALP標識第2抗体)およびALP標識抗CD81モノクローナル抗体(ALP標識第2抗体)を調製した。得られたALP標識第2抗体を用いて、以下の組成からなるALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液, ALP標識抗CD63モノクローナル抗体溶液, ALP標識抗CD81モノクローナル抗体溶液を調製した。
・ALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
ALP標識抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 (表4~表9に記載の界面活性剤の濃度)
・ALP標識抗CD63モノクローナル抗体溶液
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
ALP標識抗CD63モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 (表4~表9に記載の界面活性剤の濃度)
・ALP標識抗CD81モノクローナル抗体溶液
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
ALP標識抗CD81モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 (表4~表9に記載の界面活性剤の濃度)
協和メデックス株式会社所属の健常人ボランティアより末梢血を採取し、当該末梢血から遠心分離(2000rpm、20分間、25℃)により血清(以下、健常人血清という)を調製した。
表4~表9記載の各キットを用いて、以下の手順により試料中のエクソソームを測定した。健常人血清(10 μL)又はPBS(0濃度試料)(10 μL)に、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液(30 μL)、ビオチン結合第1抗体溶液(30 μL)、及び、ALP標識第2抗体溶液(30 μL)を加えて攪拌し、37 ℃で10分間反応させた。磁性粒子を磁力で集めて、磁性粒子以外の反応溶液を除去すると共に、洗浄液[0.075% Tween 20、0.2 mmol/L 塩化マグネシウム、0.3 mol/L塩化ナトリウム、を含む0.005 mol/L MOPS緩衝液(pH7.3)]で磁性粒子を5回洗浄した。その後、9-[(4-クロロフェニルチオ)(ホスホリルオキシ)メチリデン]-10-メチルアクリダン・二ナトリウム塩(LumigenTM APS-5)を主成分とする発光基質液(100 μL)を加えて攪拌し、生じた発光量(RLU)を測定した。
上記(1)により得られた各測定キットにおける発光量(健常人血清の発光量;0濃度試料の発光量)を用いて、S/N比を算出した。S/N比とは、免疫測定における測定感度を評価する指標の1つであり、0濃度試料を測定した際に得られるシグナル(ノイズ[noise])に対する、既知濃度試料を測定した際に得られるシグナル(signal)の比を示している。S/N比は以下の式により算出することができる。
S/N比=[健常人血清の発光量]/[0濃度試料の発光量]
その後、各測定キットにおけるS/N比を比較するため、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合第1抗体溶液及びALP標識第2抗体溶液においてPBSを含む測定キット(測定キット1Z~6Z)を用いた際のS/N比を基準(100%)として、各測定キットにおけるS/N比を算出し、測定感度相対値(%)とした。その結果を、表4~表9に示す。ここで、測定感度相対値(%)が大きいほど測定感度が高いことを示し、測定感度相対値(%)が100%を越えた場合、界面活性剤を含まない測定キットと比べて測定感度が高いことを示している。
実施例1と同じ磁性粒子(Dynabeads MyOne Streptavidin C1)を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.225 mg/mL
ノニオンNS-240 表10記載の濃度
実施例1で作製したビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ノニオンNS-240 表10記載の濃度
実施例1で作製したALP標識抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
ALP標識抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ノニオンNS-240 表10記載の濃度
実施例1と同じ磁性粒子(Dynabeads MyOne Streptavidin C1)を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.225 mg/mL
トラックスN-700B 表11記載の濃度
実施例1で作製したビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
トラックスN-700B 表11記載の濃度
実施例1で作製したALP標識抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
ALP標識抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
トラックスN-700B 表11記載の濃度
実施例1と同じ磁性粒子(Dynabeads MyOne Streptavidin C1)を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.225 mg/mL
ニューコール740 表12記載の濃度
実施例1で作製したビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ニューコール740 表12記載の濃度
実施例1で作製したALP標識抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES(pH6.5) 0.05 mol/L
ALP標識抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ニューコール740 表12記載の濃度
Claims (16)
- 試料中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いて測定する方法であって、以下の工程(1)~(3)を含み、工程(1)及び/又は工程(2)の反応が、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する水性媒体中で行われる、試料中のエクソソームの測定方法。
(1)試料と、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させ、該第1抗体若しくは該抗体断片と、該エクソソームと、からなる免疫複合体1を生成させる工程;
(2)エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片を、水性媒体中で、前記工程(1)で生成した免疫複合体1と反応させ、該第1抗体若しくは該抗体断片と、該エクソソームと、該第2抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体2を生成させる工程;
(3)前記工程(2)で生成した免疫複合体2を測定する工程。 - エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である請求項1記載の方法。
- ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、HLB値が14以上20以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である請求項2記載の方法。
- ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である請求項2又は3記載の方法。
- 第1抗原及び第2抗原のうち少なくとも一方が、CD9、CD63及びCD81からなる群より選択される抗原である、請求項1~4のいずれかに記載の方法。
- 請求項1~5のいずれかに記載の方法に用いるための、試料中のエクソソームの測定試薬であって、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有することを特徴とする、試料中のエクソソームの測定試薬。
- エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である請求項6記載の試薬。
- ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、HLB値が14以上20以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である請求項7記載の試薬。
- ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である請求項7又は8記載の試薬。
- 第1抗原及び第2抗原のうち少なくとも一方が、CD9、CD63及びCD81からなる群より選択される抗原である、請求項6~9のいずれかに記載の試薬。
- 請求項1~5のいずれかに記載の方法に用いるための、試料中のエクソソームの測定キットであって、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含有する第1試薬、及び、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片を含有する第2試薬を含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第1試薬、及び、第2試薬の少なくとも1つの試薬に含まれる、試料中のエクソソームの測定キット。
- 請求項1~5のいずれかに記載の方法に用いるための、試料中のエクソソームの測定キットであって、エクソソームがその表面に有する第1抗原に結合する第1抗体若しくは該抗体断片を含有する第1試薬、エクソソームがその表面に有する第2抗原に結合する第2抗体若しくは該抗体断片を含有する第2試薬、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第3試薬を含む、試料中のエクソソームの測定キット。
- エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である請求項11又は12記載のキット。
- ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、HLB値が14以上20以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である請求項13記載のキット。
- ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である請求項13又は14記載のキット。
- 第1抗原及び第2抗原のうち少なくとも一方が、CD9、CD63及びCD81からなる群より選択される抗原である、請求項11~15のいずれかに記載のキット。
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