JPWO2019159944A1 - 試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キット - Google Patents
試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キット Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2019159944A1 JPWO2019159944A1 JP2020500506A JP2020500506A JPWO2019159944A1 JP WO2019159944 A1 JPWO2019159944 A1 JP WO2019159944A1 JP 2020500506 A JP2020500506 A JP 2020500506A JP 2020500506 A JP2020500506 A JP 2020500506A JP WO2019159944 A1 JPWO2019159944 A1 JP WO2019159944A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- exosome
- polyoxyethylene
- exosomes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 355
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 150
- 238000005259 measurement Methods 0.000 title description 121
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 title description 6
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 claims abstract description 215
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims abstract description 146
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 143
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 93
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 91
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 76
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 188
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 188
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 181
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 181
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 181
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 146
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 47
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 125000005037 alkyl phenyl group Chemical group 0.000 claims description 36
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 claims description 16
- USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N diphenyl ether Chemical compound C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 claims description 9
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 claims description 9
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 claims description 9
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 claims description 9
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 claims description 9
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 claims description 9
- FURYAADUZGZUGQ-UHFFFAOYSA-N phenoxybenzene;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 FURYAADUZGZUGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 4
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 116
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 99
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 62
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 60
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 60
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 58
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 48
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 48
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 42
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 41
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 37
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 36
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 35
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 31
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 21
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 21
- 241000047703 Nonion Species 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 19
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 15
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 14
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 14
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 13
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 9
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- 238000002796 luminescence method Methods 0.000 description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N decane Chemical compound CCCCCCCCCC DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 4
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000012327 Ruthenium complex Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 125000006353 oxyethylene group Chemical group 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 2,2'-[(2-amino-2-oxoethyl)imino]diacetic acid Chemical compound NC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CNC1CCCCC1 INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XCBLFURAFHFFJF-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-hydroxyethyl)azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)CS(O)(=O)=O XCBLFURAFHFFJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GIAVHGFPMPSIFI-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=C(I)C=C(I)C(O)=C1I GIAVHGFPMPSIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XQXPVVBIMDBYFF-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XQXPVVBIMDBYFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100032524 G-protein coupled receptor family C group 5 member C Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 2
- 101001014685 Homo sapiens G-protein coupled receptor family C group 5 member C Proteins 0.000 description 2
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 description 2
- 101000980823 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD53 Proteins 0.000 description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 101150048357 Lamp1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 description 2
- 102100024221 Leukocyte surface antigen CD53 Human genes 0.000 description 2
- 108010009254 Lysosomal-Associated Membrane Protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000001204 arachidyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000002511 behenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 150000002169 ethanolamines Chemical class 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000040 m-tolyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C(=C1[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 2
- 125000002960 margaryl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 125000001117 oleyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 125000002958 pentadecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000000538 pentafluorophenyl group Chemical group FC1=C(F)C(F)=C(*)C(F)=C1F 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920003217 poly(methylsilsesquioxane) Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- CWLYDTVACYGEPD-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[[3,7-bis(dimethylamino)phenothiazine-10-carbonyl]amino]acetate Chemical compound [Na+].C1=C(N(C)C)C=C2SC3=CC(N(C)C)=CC=C3N(C(=O)NCC([O-])=O)C2=C1 CWLYDTVACYGEPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPGZNKGKCSYBGK-UHFFFAOYSA-N 1-n-[4-(dimethylamino)phenyl]-4-n,4-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1NC1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZPGZNKGKCSYBGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJZNKFIBZHDKL-UHFFFAOYSA-N 2-[[3,7-bis(dimethylamino)phenothiazine-10-carbonyl]amino]acetic acid Chemical compound C1=C(N(C)C)C=C2SC3=CC(N(C)C)=CC=C3N(C(=O)NCC(O)=O)C2=C1 XUJZNKFIBZHDKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+](CCO)CCS([O-])(=O)=O AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSXUNHYXJWDLDK-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound CC(O)CS(O)(=O)=O HSXUNHYXJWDLDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 1
- XEZFKMUDMLXWAW-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)-n-methylphenothiazine-10-carboxamide Chemical compound CN(C)C1=CC=C2N(C(=O)NC)C3=CC=C(N(C)C)C=C3SC2=C1 XEZFKMUDMLXWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOTXQRRUWFSXCN-UHFFFAOYSA-N 3-(3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound COC1=CC(NCC(O)CS(O)(=O)=O)=CC(OC)=C1 AOTXQRRUWFSXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MENXRDLDYNLDHE-UHFFFAOYSA-N 3-(3,5-dimethoxyanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound COC1=CC(NCCCS(O)(=O)=O)=CC(OC)=C1 MENXRDLDYNLDHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTIDJAQNJLWPTI-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1 BTIDJAQNJLWPTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NZAVBNVWEPQSBL-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3,5-dimethoxyanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CC)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1 NZAVBNVWEPQSBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPROGRQJOGOVDS-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3,5-dimethylanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CC)C1=CC(C)=CC(C)=C1 NPROGRQJOGOVDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLQNJZKBJSMXCJ-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3-methoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC(OC)=C1 ZLQNJZKBJSMXCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STBWJPWQQLXSCK-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3-methoxyanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CC)C1=CC=CC(OC)=C1 STBWJPWQQLXSCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IBSUMVZKDLDAEK-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3-methylanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 IBSUMVZKDLDAEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LHZMSRLULDAWLM-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethylanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC=C1 LHZMSRLULDAWLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXITYOAFXWBMLL-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethylanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CC)C1=CC=CC=C1 HXITYOAFXWBMLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYLUYMWPXIIXDX-UHFFFAOYSA-N 3-(phenylazaniumyl)propane-1-sulfonate Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1=CC=CC=C1 NYLUYMWPXIIXDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KYYHRMMRLHFQEU-UHFFFAOYSA-N 3-[3,5-dimethoxy-n-(3-sulfopropyl)anilino]propane-1-sulfonic acid Chemical compound COC1=CC(OC)=CC(N(CCCS(O)(=O)=O)CCCS(O)(=O)=O)=C1 KYYHRMMRLHFQEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 3-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCC(CO)(CO)NCC(O)CS(O)(=O)=O RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMTZYGZMIJRCFG-UHFFFAOYSA-N 3-phenyldioxetane Chemical compound C1OOC1C1=CC=CC=C1 UMTZYGZMIJRCFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXNZTHHGJRFXKQ-UHFFFAOYSA-N 4-chlorophenol Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1 WXNZTHHGJRFXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YUDPTGPSBJVHCN-DZQJYWQESA-N 4-methylumbelliferyl beta-D-galactoside Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YUDPTGPSBJVHCN-DZQJYWQESA-N 0.000 description 1
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 108700016232 Arg(2)-Sar(4)- dermorphin (1-4) Proteins 0.000 description 1
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100027217 CD82 antigen Human genes 0.000 description 1
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710184216 Cardioactive peptide Proteins 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SDKQRNRRDYRQKY-UHFFFAOYSA-N Dioxacarb Chemical compound CNC(=O)OC1=CC=CC=C1C1OCCO1 SDKQRNRRDYRQKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- DSIFMINXCSHZPQ-UHFFFAOYSA-M FUN-1 Chemical compound [I-].S1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=C(C1=CC=CC=C11)C=C(Cl)N1C1=CC=CC=C1 DSIFMINXCSHZPQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241001191009 Gymnomyza Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- GIZQLVPDAOBAFN-UHFFFAOYSA-N HEPPSO Chemical compound OCCN1CCN(CC(O)CS(O)(=O)=O)CC1 GIZQLVPDAOBAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000914469 Homo sapiens CD82 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101000946850 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD86 Proteins 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010064171 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014944 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical group ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100034924 T-lymphocyte activation antigen CD86 Human genes 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 229920004896 Triton X-405 Polymers 0.000 description 1
- 229920004898 Triton X-705 Polymers 0.000 description 1
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWXOJIDBSHLIFI-UHFFFAOYSA-N [3-(1-chloro-3'-methoxyspiro[adamantane-4,4'-dioxetane]-3'-yl)phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O1OC2(C3CC4CC2CC(Cl)(C4)C3)C1(OC)C1=CC=CC(OP(O)(O)=O)=C1 QWXOJIDBSHLIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N [3-(3'-methoxyspiro[adamantane-2,4'-dioxetane]-3'-yl)phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O1OC2(C3CC4CC(C3)CC2C4)C1(OC)C1=CC=CC(OP(O)(O)=O)=C1 XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N ammonium bromide Chemical compound [NH4+].[Br-] SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000001448 anilines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- DMSMPAJRVJJAGA-UHFFFAOYSA-N benzo[d]isothiazol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NSC2=C1 DMSMPAJRVJJAGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 229910001622 calcium bromide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- WGEFECGEFUFIQW-UHFFFAOYSA-L calcium dibromide Chemical compound [Ca+2].[Br-].[Br-] WGEFECGEFUFIQW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- DHNRXBZYEKSXIM-UHFFFAOYSA-N chloromethylisothiazolinone Chemical compound CN1SC(Cl)=CC1=O DHNRXBZYEKSXIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- UKWLRLAKGMZXJC-QIECWBMSSA-L disodium;[4-chloro-3-[(3r,5s)-1-chloro-3'-methoxyspiro[adamantane-4,4'-dioxetane]-3'-yl]phenyl] phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].O1OC2([C@@H]3CC4C[C@H]2CC(Cl)(C4)C3)C1(OC)C1=CC(OP([O-])([O-])=O)=CC=C1Cl UKWLRLAKGMZXJC-QIECWBMSSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid Chemical compound CCS(O)(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 125000003055 glycidyl group Chemical group C(C1CO1)* 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBSYJULDYOVADU-UHFFFAOYSA-N hydrazine;3-methyl-1,3-benzothiazol-2-one Chemical compound NN.C1=CC=C2SC(=O)N(C)C2=C1 HBSYJULDYOVADU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 125000002463 lignoceryl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- OTCKOJUMXQWKQG-UHFFFAOYSA-L magnesium bromide Chemical compound [Mg+2].[Br-].[Br-] OTCKOJUMXQWKQG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001623 magnesium bromide Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 108010077372 mast cell degranulating peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- CWOMTHDOJCARBY-UHFFFAOYSA-N n,n,3-trimethylaniline Chemical compound CN(C)C1=CC=CC(C)=C1 CWOMTHDOJCARBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JSABTPDNEXHNOQ-UHFFFAOYSA-N n-phenylaniline;sodium Chemical compound [Na].C=1C=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 JSABTPDNEXHNOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000010753 nasal discharge Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005691 oxidative coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RDBMUARQWLPMNW-UHFFFAOYSA-N phosphanylmethanol Chemical compound OCP RDBMUARQWLPMNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SVLRFMQGKVFRTB-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].COC1=CC(NCC(O)CS([O-])(=O)=O)=CC(OC)=C1 SVLRFMQGKVFRTB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HDARHUHTZKLJET-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1 HDARHUHTZKLJET-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HLXGRHNZZSMNRX-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3,5-dimethylanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(C)=CC(C)=C1 HLXGRHNZZSMNRX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- IRQRBVOQGUPTLG-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3-methylanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 IRQRBVOQGUPTLG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZPCAZHPYLUKSMY-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3-methylanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate;dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 ZPCAZHPYLUKSMY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
試料中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いて測定する方法であって、抗原抗体反応を、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする、試料中のエクソソームの測定方法を提供する。本発明の試料中のエクソソームの測定方法は、がん等の診断に有用である。
Description
本発明は、試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キットに関する。
エクソソームは、動物細胞から分泌される直径30〜200 nmの脂質二重膜構造を有する小胞顆粒である。エクソソーム表面には、一般的な細胞表面と同様に、種々の膜タンパク質が存在することが知られており、エクソソームの内部には、サイトカイン等各種タンパク質以外にもｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれることも知られている（非特許文献１）。また、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種がん細胞から分泌されることが報告されており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役として機能し生理現象と関連することや、がんなどの疾患との関連性が注目されている。
これまで、エクソソームの測定方法として、血清等の生体成分を遠心分離してエクソソームを単離し、単離したエクソソームをウェスタンブロッティング、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）等により測定する方法や、エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、及び、エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体を用いる免疫測定方法を用いるエクソスクリーン法（特許文献１）等が知られている。
近年、エクソソームの分離方法において、エクソソームと、当該エクソソームの表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、当該エクソソームと前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、当該複合体を洗浄する洗浄工程を含み、当該複合体形成工程及び当該洗浄工程の少なくともいずれかを、芳香族基を分子中に含まない非イオン性界面活性剤の存在下にて行うことを特徴とするエクソソームの分離方法が報告されている（特許文献２）。
Int. J. Biol. Sci. 2013, 9; 10:1021-31
これまでのエクソソームの測定方法は、操作が煩雑で感度も十分とはいえなかった。本発明の目的は、簡便、かつ、高感度な試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キットを提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、エクソソームを含む試料と、エクソソームがその表面に有する抗原に結合する抗体若しくは該抗体断片との反応を、特定の、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する水性媒体中で行うことにより、エクソソームを破壊することなく、試料中のエクソソームを簡便、かつ、高感度に測定できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１７］に関する。
［１］試料中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いて測定する方法であって、抗原抗体反応を、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする、試料中のエクソソームの測定方法。
［２］以下の工程（１）〜（３）を含み、工程（１）及び／又は工程（２）の反応が、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する水性媒体中で行われる、［１］記載の方法。
（１）試料と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させ、該第１抗体若しくは該抗体断片と、該エクソソームと、からなる免疫複合体１を生成させる工程；
（２）エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を、水性媒体中で、前記工程（１）で生成した免疫複合体１と反応させ、該第１抗体若しくは該抗体断片と、該エクソソームと、該第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２を生成させる工程；
（３）前記工程（２）で生成した免疫複合体２を測定する工程。
［３］エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である［１］又は［２］記載の方法。
［４］ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、ＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｌａｎｃｅ）値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である［３］記載の方法。
［５］ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である［３］又は［４］記載の方法。
［６］第１抗原及び第２抗原のうち少なくとも一方が、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１からなる群より選択される抗原である、［２］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［１］試料中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いて測定する方法であって、抗原抗体反応を、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする、試料中のエクソソームの測定方法。
［２］以下の工程（１）〜（３）を含み、工程（１）及び／又は工程（２）の反応が、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する水性媒体中で行われる、［１］記載の方法。
（１）試料と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させ、該第１抗体若しくは該抗体断片と、該エクソソームと、からなる免疫複合体１を生成させる工程；
（２）エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を、水性媒体中で、前記工程（１）で生成した免疫複合体１と反応させ、該第１抗体若しくは該抗体断片と、該エクソソームと、該第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２を生成させる工程；
（３）前記工程（２）で生成した免疫複合体２を測定する工程。
［３］エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である［１］又は［２］記載の方法。
［４］ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、ＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｌａｎｃｅ）値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である［３］記載の方法。
［５］ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である［３］又は［４］記載の方法。
［６］第１抗原及び第２抗原のうち少なくとも一方が、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１からなる群より選択される抗原である、［２］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有することを特徴とする、試料中のエクソソームの測定試薬。
［８］エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である［７］記載の試薬。
［９］ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、ＨＬＢ値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である［８］記載の試薬。
［１０］ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である［８］又は［９］記載の試薬。
［１１］第１抗原及び第２抗原のうち少なくとも一方が、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１からなる群より選択される抗原である、［７］〜［１０］のいずれかに記載の試薬。
［８］エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である［７］記載の試薬。
［９］ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、ＨＬＢ値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である［８］記載の試薬。
［１０］ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である［８］又は［９］記載の試薬。
［１１］第１抗原及び第２抗原のうち少なくとも一方が、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１からなる群より選択される抗原である、［７］〜［１０］のいずれかに記載の試薬。
［１２］エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含有する第１試薬、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含有する第２試薬を含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１試薬、及び、第２試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、試料中のエクソソームの測定キット。
［１３］エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含有する第１試薬、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含有する第２試薬、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第３試薬を含む、試料中のエクソソームの測定キット。
［１４］エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である［１２］又は［１３］記載のキット。
［１５］ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、ＨＬＢ値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である［１４］記載のキット。
［１６］ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である［１４］又は［１５］記載のキット。
［１７］第１抗原及び第２抗原のうち少なくとも一方が、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１からなる群より選択される抗原である、［１２］〜［１６］のいずれかに記載のキット。
［１３］エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含有する第１試薬、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含有する第２試薬、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第３試薬を含む、試料中のエクソソームの測定キット。
［１４］エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である［１２］又は［１３］記載のキット。
［１５］ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、ＨＬＢ値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である［１４］記載のキット。
［１６］ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である［１４］又は［１５］記載のキット。
［１７］第１抗原及び第２抗原のうち少なくとも一方が、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１からなる群より選択される抗原である、［１２］〜［１６］のいずれかに記載のキット。
本発明により、簡便、かつ、高感度な試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キットが提供される。
１．測定方法
本発明の試料中のエクソソームの測定方法は、試料中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いて測定する方法であって、抗原抗体反応を、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする方法であり、試料中のエクソソームを破壊することなく、エクソソームがその表面に有する抗原、すなわち、エクソソーム表面抗原を、抗原抗体反応を用いて測定する方法である。ここで、「試料中のエクソソームを破壊することなく」とは、エクソソーム特有の脂質二重膜構造を保持し、この脂質二重膜上にエクソソーム表面抗原が保持されることを意味する。
本発明の試料中のエクソソームの測定方法は、試料中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いて測定する方法であって、抗原抗体反応を、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする方法であり、試料中のエクソソームを破壊することなく、エクソソームがその表面に有する抗原、すなわち、エクソソーム表面抗原を、抗原抗体反応を用いて測定する方法である。ここで、「試料中のエクソソームを破壊することなく」とは、エクソソーム特有の脂質二重膜構造を保持し、この脂質二重膜上にエクソソーム表面抗原が保持されることを意味する。
本発明におけるエクソソームとは、動物細胞から分泌される直径30〜200 nmの脂質二重膜構造を有する小胞顆粒である。
本発明における試料としては、エクソソームが測定され得る試料であれば特に制限はなく、例えば血液、尿、唾液、乳汁、鼻汁、精漿、脳脊髄液、細胞培養上清等が挙げられ、血液が好ましい。前記血液としては、例えば、全血、血清、血漿等が挙げられ、血清、血漿が好ましい。
本発明の試料中のエクソソームの測定方法は、抗原抗体反応を用いる方法であれば特に制限はなく、例えばサンドイッチ法、競合法等が挙げられる。
［測定方法１：サンドイッチ法］
本発明の試料中のエクソソームの測定方法は、以下の工程（１Ａ）〜（３Ａ）を含み、工程（１Ａ）及び／又は工程（２Ａ）の反応が、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する水性媒体中で行われる方法である。
（１Ａ）試料と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させ、該第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、該第１抗原を有するエクソソームと、からなる免疫複合体１を生成させる工程；
（２Ａ）エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を、水性媒体中で、前記工程（１Ａ）で生成した免疫複合体１と反応させ、該第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、該第１抗原及び該第２抗原を有するエクソソームと、該第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２を生成させる工程；
（３Ａ）前記工程（２Ａ）で生成した免疫複合体２を測定する工程。
本発明の試料中のエクソソームの測定方法は、以下の工程（１Ａ）〜（３Ａ）を含み、工程（１Ａ）及び／又は工程（２Ａ）の反応が、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する水性媒体中で行われる方法である。
（１Ａ）試料と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させ、該第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、該第１抗原を有するエクソソームと、からなる免疫複合体１を生成させる工程；
（２Ａ）エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を、水性媒体中で、前記工程（１Ａ）で生成した免疫複合体１と反応させ、該第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、該第１抗原及び該第２抗原を有するエクソソームと、該第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２を生成させる工程；
（３Ａ）前記工程（２Ａ）で生成した免疫複合体２を測定する工程。
＜工程（１Ａ）＞
工程（１Ａ）における試料としては、前述の試料等が挙げられる。
工程（１Ａ）において、試料と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させる方法は、エクソソームと、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体１を生成させる方法であれば特に制限はない。
工程（１Ａ）における試料としては、前述の試料等が挙げられる。
工程（１Ａ）において、試料と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させる方法は、エクソソームと、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体１を生成させる方法であれば特に制限はない。
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片が不溶性担体に固定化されている場合、該第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ａ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ａ）が結合した不溶性担体とを、抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、該第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片が不溶性担体に固定化されている場合、該第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ａ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ａ）が結合した不溶性担体とを、抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、該第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ａ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ａ）が結合した不溶性担体とを用いて、工程（１Ａ）において免疫複合体１を生成させる方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
・試料と、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ａ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ａ）が結合した不溶性担体とを、水性媒体中で同時に反応させて、免疫複合体１を生成させる方法；
・試料と、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ａ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させた後、当該反応の反応液中に一組の親和性物質の組み合わせの他方（ａ）が結合した不溶性担体を添加し、免疫複合体１を生成させる方法；
・一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ａ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ａ）が結合した不溶性担体とを、水性媒体中で反応させた後、当該反応の反応液中に試料を添加し、免疫複合体１を生成させる方法。
・試料と、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ａ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ａ）が結合した不溶性担体とを、水性媒体中で同時に反応させて、免疫複合体１を生成させる方法；
・試料と、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ａ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させた後、当該反応の反応液中に一組の親和性物質の組み合わせの他方（ａ）が結合した不溶性担体を添加し、免疫複合体１を生成させる方法；
・一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ａ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ａ）が結合した不溶性担体とを、水性媒体中で反応させた後、当該反応の反応液中に試料を添加し、免疫複合体１を生成させる方法。
Ａ−ａの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ；
・エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体のFc領域と、該Fc領域に結合する抗体との組み合わせ。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ；
・エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体のFc領域と、該Fc領域に結合する抗体との組み合わせ。
不溶性担体としては、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を固定化し、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする不溶性担体であれば特に制限はなく、例えばマイクロタイタープレート等の合成樹脂製プレート、ガラス製または合成樹脂製の粒状物（ビーズ）、ガラス製または合成樹脂製の球状物（ボール）、ラテックス、磁性粒子、ニトロセルロース膜等の各種メンブレン、合成樹脂製の試験管等が挙げられる。合成樹脂製プレートとしては、例えばポリエチレンプレート、ポリプロピレンプレート、ポリスチレンプレート等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片の不溶性担体への固定化としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする固定化であれば特に制限はなく、物理吸着、化学結合による固定化等が挙げられる。物理吸着としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学結合としては、例えば共有結合、配位結合等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片は、前述の物理吸着及び／又は化学結合を利用して、直接、不溶性担体に固定化してもよいし、間接的に不溶性担体に固定化してもよい。間接的な固定化方法としては、例えばビオチンとアビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）との特異的結合を介して、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を不溶性担体に固定化する方法等が挙げられる。また、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片は、リンカーを介した共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。
リンカーとしては、不溶性担体表面の官能基と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片が有する官能基の両者を共有結合できる分子等が挙げられ、例えば、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片が有する官能基と反応することができる第１の反応活性基と、不溶性担体表面の官能基と反応することができる第２の反応活性基とを同時に持つ分子であって、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基である分子が好ましく用いられる。エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片が有する官能基、および不溶性担体がその表面に保持している官能基としては、例えばカルボキシル基、アミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、N-ヒドロキシスクシンイミド基、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける反応活性基としては、例えばアリールアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、ペンタフルオロフェニル(PFP)エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。
工程（１Ａ）における、試料と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片との反応の反応温度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、0〜50℃であり、4〜45℃が好ましく、15〜40℃が特に好ましい。当該反応の反応時間は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、通常、1分間〜24時間であり、5分間〜3時間が好ましく、10分間〜2時間が特に好ましい。エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片の反応溶液中の濃度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.01〜100μg/mLであり、0.03〜20μg/mLが好ましく、0.05〜10μg/mLが特に好ましい。エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の反応液中の濃度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.00005〜10.0%(w/v)であり、0.0001〜5.0%(w/v)が好ましく、0.0025〜1.0%(w/v)が特に好ましい。
また、試料と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の水溶液とを予め混合した後、得られた混合液を抗原抗体反応に供してもよい。エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の水溶液は、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を後述の水性媒体に溶解することにより調製することができる。
試料と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の水溶液とを予め混合する際の温度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、0〜50℃であり、4〜45℃が好ましく、15〜40℃が特に好ましい。混合時間は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、通常、1分間〜4時間であり、10分間〜3時間が好ましく、30分間〜2時間が特に好ましい。混合液中の、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の濃度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.0005〜30.0%(w/v)であり、0.001〜20.0%(w/v)が好ましく、0.025〜10.0%(w/v)が特に好ましい。
≪工程（２Ａ）≫
工程（２Ａ）において、工程（１Ａ）で生成した免疫複合体１に、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を添加して反応させてもよいし、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片に、工程（１Ａ）で生成した免疫複合体１を添加して反応させてもよい。
工程（２Ａ）において、工程（１Ａ）で生成した免疫複合体１に、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を添加して反応させてもよいし、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片に、工程（１Ａ）で生成した免疫複合体１を添加して反応させてもよい。
工程（２Ａ）における、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２を生成させる反応の反応温度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、0〜50℃であり、4〜45℃が好ましく、15〜40℃が特に好ましい。当該反応の反応時間は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、1分間〜24時間であり、5分間〜3時間が好ましく、10分間〜2時間が特に好ましい。エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片の反応溶液中の濃度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.01〜100μg/mLであり、0.03〜20μg/mLが好ましく、0.05〜10μg/mLが好ましい。エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の反応液中の濃度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.00005〜10.0%(w/v)であり、0.0001〜5.0%(w/v)が好ましく、0.0025〜1.0%(w/v)が特に好ましい。
工程（１Ａ）と工程（２Ａ）は順次行われても、同時に行われてもよい。
工程（１Ａ）と工程（２Ａ）とを同時に行う場合には、試料と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で同時に反応させ、該第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、該第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２を生成させ、生成した免疫複合体２を測定することにより、試料中のエクソソームを測定する。工程（１Ａ）と工程（２Ａ）とを同時に行う場合には、免疫複合体２は、前述の不溶性担体上に生成されることが好ましい。不溶性担体上に免疫複合体２を生成させる方法としては、例えば、次のような方法等が挙げられる。
(i)試料を、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片、及び、不溶性担体と、水性媒体中で同時に反応させる方法；
(ii)試料を、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片と、水性媒体中で同時に反応させる方法
上記(i)の方法においては、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ａ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ａ）が結合した不溶性担体とを用いることが好ましい。当該（Ａ）−（ａ）の組み合わせとしては、前述の組み合わせ等が挙げられる。
工程（１Ａ）と工程（２Ａ）とを同時に行う場合には、試料と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で同時に反応させ、該第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、該第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２を生成させ、生成した免疫複合体２を測定することにより、試料中のエクソソームを測定する。工程（１Ａ）と工程（２Ａ）とを同時に行う場合には、免疫複合体２は、前述の不溶性担体上に生成されることが好ましい。不溶性担体上に免疫複合体２を生成させる方法としては、例えば、次のような方法等が挙げられる。
(i)試料を、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片、及び、不溶性担体と、水性媒体中で同時に反応させる方法；
(ii)試料を、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片と、水性媒体中で同時に反応させる方法
上記(i)の方法においては、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ａ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ａ）が結合した不溶性担体とを用いることが好ましい。当該（Ａ）−（ａ）の組み合わせとしては、前述の組み合わせ等が挙げられる。
また、工程（１Ａ）と工程（２Ａ）の間に、必要に応じて、工程（１Ａ）の反応後の不溶性担体を洗浄する工程を追加してもよい。工程（１Ａ）の反応後の不溶性担体の洗浄の際に使用する洗浄液としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする洗浄液であれば特に制限はなく、例えばリン酸緩衝化生理食塩水（0.15 mol/L 塩化ナトリウムを含有する10 mmol/Lリン酸緩衝液、pH 7.2、以下、PBSと記す）や界面活性剤を含有するPBS等が挙げられる。界面活性剤としては、例えばTween 20等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
工程（２Ａ）の後に、洗浄工程を追加しても、追加しなくてもよいが、追加することが好ましい。工程（２Ａ）の後の不溶性担体の洗浄に用いられる洗浄液は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする洗浄液であれば特に制限はなく、例えば前述の洗浄液等が挙げられる。
工程（２Ａ）の後に、洗浄工程を追加しても、追加しなくてもよいが、追加することが好ましい。工程（２Ａ）の後の不溶性担体の洗浄に用いられる洗浄液は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする洗浄液であれば特に制限はなく、例えば前述の洗浄液等が挙げられる。
工程（１Ａ）におけるエクソソームがその表面に有する第１抗原と、工程（２）におけるエクソソームがその表面に有する第２抗原とは異なっていても同じでもよい。第１抗原と第２抗原との組み合わせとしては、例えば後述の表１に示す組み合わせが挙げられる。
≪工程（３Ａ）≫
工程（３Ａ）において、工程（２Ａ）で生成した免疫複合体２を以下の方法を用いて測定することにより、試料中のエクソソーム濃度が決定される。
工程（３Ａ）において、工程（２Ａ）で生成した免疫複合体２を以下の方法を用いて測定することにより、試料中のエクソソーム濃度が決定される。
（i）エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片が標識化されていない場合
エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片に結合する抗体（以下、第３抗体と記す）若しくは該第３抗体の抗体断片に標識が結合した標識化第３抗体若しくは該抗体断片を、免疫複合体２（エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体）中の該第２抗体若しくは該抗体断片と反応させて、該第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、該第２抗体若しくは該抗体断片と、標識化第３抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体３を形成させ、免疫複合体３中の標識を後述の方法により測定することにより、工程（２Ａ）で生成した免疫複合体２の量を測定することができる。第３抗体としては、例えばエクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体のFc領域に結合する抗体若しくは該抗体断片等が挙げられる。標識としては、後述の標識等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片に結合する抗体（以下、第３抗体と記す）若しくは該第３抗体の抗体断片に標識が結合した標識化第３抗体若しくは該抗体断片を、免疫複合体２（エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体）中の該第２抗体若しくは該抗体断片と反応させて、該第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、該第２抗体若しくは該抗体断片と、標識化第３抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体３を形成させ、免疫複合体３中の標識を後述の方法により測定することにより、工程（２Ａ）で生成した免疫複合体２の量を測定することができる。第３抗体としては、例えばエクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体のFc領域に結合する抗体若しくは該抗体断片等が挙げられる。標識としては、後述の標識等が挙げられる。
標識化第３抗体若しくは該抗体断片と、免疫複合体２中の、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片との反応の反応温度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、0〜50℃であり、4〜45℃が好ましく、15〜40℃が特に好ましい。当該反応の反応時間は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、通常、1分間〜24時間であり、5分間〜3時間が好ましく、10分間〜2時間が特に好ましい。標識化第３抗体若しくは該抗体断片の反応溶液中の濃度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.01〜100μg/mLであり、0.03〜20μg/mLが好ましく、0.05〜10μg/mLが好ましい。
（ii）エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片が標識化されている場合
免疫複合体２中の標識を測定することにより、工程（２Ａ）で生成した免疫複合体２を測定することができる。すなわち、第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、標識化該第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２中の標識を測定することにより、工程（２Ａ）で生成した免疫複合体２を測定することができる。標識化該第２抗体若しくは該抗体断片は、該第２抗体若しくは該抗体断片に後述の標識が結合した物質であり、公知の方法により調製することができる。
免疫複合体２中の標識を測定することにより、工程（２Ａ）で生成した免疫複合体２を測定することができる。すなわち、第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、標識化該第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２中の標識を測定することにより、工程（２Ａ）で生成した免疫複合体２を測定することができる。標識化該第２抗体若しくは該抗体断片は、該第２抗体若しくは該抗体断片に後述の標識が結合した物質であり、公知の方法により調製することができる。
標識としては、例えば酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、タグ配列を含むポリペプチド、金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子等が挙げられる。
酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。
蛍光物質としては、例えば、フルオレッセイン イソチオシアネート(FITC)、ローダミンＢ−イソチオシアネート(RITC)等が挙げられる。その他の蛍光物質としては、例えばquantum dot (Science, 281, 2016-2018, 1998)、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、GFP (Green fluorescent Protein)、RFP (Red fluorescent Protein）、YFP (Yellow fluorescent Protein)、BFP (Blue fluorescent Protein）等の蛍光を発する蛋白質が挙げられる。
発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステルおよびその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。ルテニウム錯体化合物としては、例えば、Clin. Chem. 37, 9, 1534-1539, 1991に示されたルテニウム錯体化合物等が挙げられる。
放射性同位元素としては、例えば、3H、14C、35S、32P、125I、131I等が挙げられる。タグ配列を含むポリペプチドとしては、例えばFLAG等が挙げられる。金属コロイドとしては、例えば金コロイド等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、標識化された、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２中の標識の測定、並びに、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片と、標識化第３抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体３中の標識の測定は、用いる標識により適宜、選択することができる。
標識が発色物質、すなわち、ある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いて吸光度を測定することができる。
標識が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いて蛍光強度を測定することができる。
標識が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いて、発光強度を測定することができる。
標識が放射性同位元素である場合、シンチレーションカウンター、γ−ウェルカウンター等により、放射活性を測定することができる。
標識が酵素である場合、標識量は、酵素活性を測定することにより定量することができる。例えば酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識量を測定することができる。
酵素がペルオキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法等によりペルオキシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼと、その基質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。
ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、o-フェニレンジアミン、10-N-カルボキシメチルカルバモイル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン(CCAP)、10-N-メチルカルバモイル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン(MCDP)、N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩(DA-64)、10-N-カルボキシメチルカルバモイル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジンナトリウム塩(DA-67)、4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔3-ビス（4-クロロフェニル）メチル-4-ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば4-アミノアンチピリン(4-AA)、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。
アニリン類としては、N-（3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メチルアニリン(TOOS)、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメチルアニリン(MAOS)、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン(DAOS)、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3-メチルアニリン(TOPS)、N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)、N,N-ジメチル-3-メチルアニリン、N,N-ビス（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメチルアニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（3-メチルフェニル）-N’-サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N-エチル-N-（3-メチルフェニル）-N’-アセチルエチレンジアミン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-4-フルオロ-3,5-ジメトキシアニリン(F-DAOS)等が挙げられる。
フェノール類としては、フェノール、4-クロロフェノール、3-メチルフェノール、3-ヒドロキシ-2,4,6-トリヨード安息香酸(HTIB)等が挙げられる。
蛍光法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼと、その基質である過酸化水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で生成した蛍光の強度を測定する方法等が挙げられる。当該蛍光物質としては、例えば4-ヒドロキシフェニル酢酸、3-（4-ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
発光法によるペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼと、その基質である過酸化水素および発光物質の組み合わせとを反応させ、発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で生成した発光の強度を測定する方法等が挙げられる。当該発光物質としては、例えばルミノール化合物、ルシゲニン化合物等が挙げられる。
酵素がアルカリホスファターゼである場合には、例えば発光法等によりアルカリホスファターゼ活性を測定することができる。発光法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する方法としては、例えばアルカリホスファターゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。
アルカリホスファターゼの基質としては、例えば3-（2’-スピロアダマンタン）-4-メトキシ-4-（3’-ホスホリルオキシ）フェニル-1,2-ジオキセタン・二ナトリウム塩(AMPPD)、2-クロロ-5-｛4-メトキシスピロ［1,2-ジオキセタン-3,2’-（5’-クロロ）トリシクロ［3.3.1.13.7］デカン］-4-イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩(CDP-StarTM)、3-｛4-メトキシスピロ［1,2-ジオキセタン-3,2’-（5’-クロロ）トリシクロ［3.3.1.13.7］デカン］-4’-イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩(CSPDTM)、 9-［（フェニルオキシ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］-10-メチルアクリダン・二ナトリウム、9-［（4-クロロフェニルチオ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］-10-メチルアクリダン・二ナトリウム(LumigenTM APS-5)等が挙げられる。
酵素がβ-D-ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）、発光法又は蛍光法等によりβ-D-ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法（比色法）によりβ-D-ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、β-D-ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。吸光度法（比色法）によりβ-D-ガラクトシダーゼ活性を測定する方法における、β-D-ガラクトシダーゼの基質としては、例えばo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド等が挙げられる。発光法によりβ-D-ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ-D-ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。発光法によりβ-D-ガラクトシダーゼ活性を測定する方法における、β-D-ガラクトシダーゼの基質としては、例えばガラクトン−プラス［Galacton-Plus、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製］及びその類似化合物等が挙げられる。蛍光法によりβ-D-ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ-D-ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の蛍光度を蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。蛍光法によりβ-D-ガラクトシダーゼ活性を測定する方法における、β-D-ガラクトシダーゼの基質としては、例えば4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトピラノシド等が挙げられる。
酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法等によりルシフェラーゼ活性を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ活性を測定する方法としては、例えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。ルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジン等が挙げられる。
標識（標識１）が蛍光物質、発光物質、放射性同位元素および酵素以外の場合は、当該標識（当該標識１）に特異的に結合する物質を蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素等の標識（標識２）で標識した標識体と、免疫複合体２中の標識（標識１）、又は、免疫複合体３中の標識（標識１）とを反応させ、当該標識体と、当該免疫複合体２中の標識（標識１）、又は、当該免疫複合体３中の標識（標識１）との複合体を生成させ、当該複合体中の標識（標識２）、すなわち、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素又は酵素を、上述の方法により測定することにより、当該標識を測定することができる。標識に特異的に結合する物質としては、標識に特異的に結合する抗体の他、標識がビオチンの場合は、アビジン類等が挙げられる。
工程(３Ａ)の後に以下の工程(４Ａ)及び工程(５Ａ)を行うことにより、試料中のエクソソームの濃度を決定することができる。
(４Ａ)試料として、既知濃度のエクソソームを用いて前記工程(１Ａ)から(３Ａ)を行い、エクソソーム濃度と標識の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
(５Ａ)工程(４Ａ)で作成された検量線と、工程(２Ａ)で測定された標識の測定値と、から、試料中のエクソソームの濃度を決定する工程。
(４Ａ)試料として、既知濃度のエクソソームを用いて前記工程(１Ａ)から(３Ａ)を行い、エクソソーム濃度と標識の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
(５Ａ)工程(４Ａ)で作成された検量線と、工程(２Ａ)で測定された標識の測定値と、から、試料中のエクソソームの濃度を決定する工程。
［測定方法２：競合法］
本発明のエクソソームの測定方法の別の態様として、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、及び競合物質を用いる競合法が挙げられる。当該競合法においては、標識化競合物質、または、標識化された、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を用いることができる。
標識化競合物質は、競合物質に前述の標識が結合した物質であり、公知の方法により調製することができる。標識化された、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片は、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片に前述の標識が結合した物質であり、公知の方法により調製することができる。
競合物質とは、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片に結合し、かつその結合が、測定対象物質であるエクソソームと競合的であるような物質を意味し、測定対象物質であるエクソソームそのものや、該第１抗原も含まれる。競合物質としては、該第１抗体若しくは該抗体断片が認識するエクソソーム中のエピトープと同じ構造を有している物質が好ましく、さらに該第１抗体若しくは該抗体断片に対する結合の強さが、該第１抗体若しくは該抗体断片に対するエクソソームの結合の強さと同程度であるものがより好ましく、具体的には、測定対象物質であるエクソソームそのもの、該第１抗原等が挙げられる。
本発明のエクソソームの測定方法の別の態様として、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、及び競合物質を用いる競合法が挙げられる。当該競合法においては、標識化競合物質、または、標識化された、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を用いることができる。
標識化競合物質は、競合物質に前述の標識が結合した物質であり、公知の方法により調製することができる。標識化された、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片は、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片に前述の標識が結合した物質であり、公知の方法により調製することができる。
競合物質とは、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片に結合し、かつその結合が、測定対象物質であるエクソソームと競合的であるような物質を意味し、測定対象物質であるエクソソームそのものや、該第１抗原も含まれる。競合物質としては、該第１抗体若しくは該抗体断片が認識するエクソソーム中のエピトープと同じ構造を有している物質が好ましく、さらに該第１抗体若しくは該抗体断片に対する結合の強さが、該第１抗体若しくは該抗体断片に対するエクソソームの結合の強さと同程度であるものがより好ましく、具体的には、測定対象物質であるエクソソームそのもの、該第１抗原等が挙げられる。
本発明において、競合法の１つの態様（競合法１）として、例えば以下の工程を含む方法が挙げられる。
（１Ｂ）試料と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、標識化競合物質とを、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する水性媒体中で反応させて、該第１抗体若しくは該抗体断片とエクソソームとの免疫複合体、及び、該第１抗体若しくは該抗体断片と標識化競合物質との免疫複合体４を生成させる工程；
（２Ｂ）工程（１Ｂ）で生成した該第１抗体若しくは該抗体断片と標識化競合物質との免疫複合体４中の標識を測定する工程；
（３Ｂ）試料の代わりに既知濃度のエクソソームを用いて前記工程（１Ｂ）及び工程（２Ｂ）を行い、エクソソーム濃度と標識の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（４Ｂ）工程（３Ｂ）で作成された検量線と、工程（２Ｂ）で測定された標識の測定値とから、試料中のエクソソーム濃度を決定する工程。
（１Ｂ）試料と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、標識化競合物質とを、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する水性媒体中で反応させて、該第１抗体若しくは該抗体断片とエクソソームとの免疫複合体、及び、該第１抗体若しくは該抗体断片と標識化競合物質との免疫複合体４を生成させる工程；
（２Ｂ）工程（１Ｂ）で生成した該第１抗体若しくは該抗体断片と標識化競合物質との免疫複合体４中の標識を測定する工程；
（３Ｂ）試料の代わりに既知濃度のエクソソームを用いて前記工程（１Ｂ）及び工程（２Ｂ）を行い、エクソソーム濃度と標識の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（４Ｂ）工程（３Ｂ）で作成された検量線と、工程（２Ｂ）で測定された標識の測定値とから、試料中のエクソソーム濃度を決定する工程。
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
また、工程（１Ｂ）において、試料を、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の水溶液で希釈した後、得られた希釈試料を、該第１抗体若しくは該抗体断片、及び、標識化競合物質と反応させてもよい。エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の水溶液は、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を後述の水性媒体で溶解することにより調製することができる。
該第１抗体若しくは該抗体断片が不溶性担体に固定化されている場合、該第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｂ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｂ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、該第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ｂ−ｂの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ；
・該第１抗体のFc領域と、該Fc領域と結合する抗体との組み合わせ。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ；
・該第１抗体のFc領域と、該Fc領域と結合する抗体との組み合わせ。
競合法１の工程（１Ｂ）における試料と該第１抗体若しくは該抗体断片との反応の反応温度は、本発明のエクソソームの測定を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、0〜50℃であり、4〜45℃が好ましく、15〜40℃が特に好ましい。該反応の反応時間は、本発明のエクソソームの測定を可能とする時間であれば特に制限はなく、通常、1分間〜24時間であり、5分間〜3時間が好ましく、10分間〜2時間が特に好ましい。該反応における該第１抗体若しくは該抗体断片の反応溶液中の濃度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.01〜100μg/mLであり、0.03〜20μg/mLが好ましく、0.05〜10μg/mLが好ましい。該反応における、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の濃度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.00005〜10.0%(w/v)であり、0.0001〜5.0%(w/v)が好ましく、0.0025〜1.0%(w/v)が特に好ましい。
競合法１の工程（２Ｂ）における標識の測定方法としては、本発明のエクソソームの測定を可能とする方法であれば特に制限はなく、例えば前述の方法等が挙げられる。
本発明における競合法の別の態様（競合法２）として、例えば以下の工程を含む方法が挙げられる。
（１Ｃ）試料と、標識化された、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、競合物質とを、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む水性媒体中で反応させて、標識化された該第１抗体若しくは該抗体断片とエクソソームとの免疫複合体、及び、標識化された該第１抗体若しくは該抗体断片と競合物質との免疫複合体５を生成させる工程；
（２Ｃ）工程（１Ｃ）で生成した標識化された該第１抗体若しくは該抗体断片と競合物質との免疫複合体５中の標識を測定する工程；
（３Ｃ）試料の代わりに既知濃度のエクソソームを用いて前記工程（１Ｃ）及び工程（２Ｃ）を行い、エクソソーム濃度と標識の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（４Ｃ）工程（３Ｃ）で作成された検量線と、工程（２Ｃ）で測定された標識の測定値とから、試料中のエクソソーム濃度を決定する工程。
（１Ｃ）試料と、標識化された、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片と、競合物質とを、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む水性媒体中で反応させて、標識化された該第１抗体若しくは該抗体断片とエクソソームとの免疫複合体、及び、標識化された該第１抗体若しくは該抗体断片と競合物質との免疫複合体５を生成させる工程；
（２Ｃ）工程（１Ｃ）で生成した標識化された該第１抗体若しくは該抗体断片と競合物質との免疫複合体５中の標識を測定する工程；
（３Ｃ）試料の代わりに既知濃度のエクソソームを用いて前記工程（１Ｃ）及び工程（２Ｃ）を行い、エクソソーム濃度と標識の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（４Ｃ）工程（３Ｃ）で作成された検量線と、工程（２Ｃ）で測定された標識の測定値とから、試料中のエクソソーム濃度を決定する工程。
競合物質は不溶性担体に固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。標識としては、例えば前述の標識等が挙げられる。
また、工程（１Ｃ）において、試料を、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の水溶液で希釈した後、得られた希釈試料を、標識化された、該第１抗体若しくは該抗体断片、及び、競合物質と反応させてもよい。エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の水溶液は、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を後述の水性媒体で溶解することにより調製することができる。
競合物質が不溶性担体に固定化されている場合、競合物質が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｃ）が結合した競合物質と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｃ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、競合物質が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ｃ−ｃの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ。
競合法２の工程(１Ｃ)における試料と、標識化された該第１抗体若しくは該抗体断片との反応、及び、競合物質と、標識化された該第１抗体若しくは該抗体断片との反応の反応温度は、本発明のエクソソームの測定を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、0〜50℃であり、4〜45℃が好ましく、15〜40℃が特に好ましい。当該反応の反応時間は、本発明のエクソソームの測定を可能とする時間であれば特に制限はなく、通常、1分間〜24時間であり、5分間〜3時間が好ましく、10分間〜2時間が特に好ましい。標識化された該第１抗体若しくは該抗体断片の反応溶液中の濃度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.01〜100μg/mLであり、0.03〜20μg/mLが好ましく、0.05〜10μg/mLが好ましい。該反応における、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の濃度は、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.00005〜10.0%(w/v)であり、0.0001〜5.0%(w/v)が好ましく、0.0025〜1.0%(w/v)が特に好ましい。
競合法２の工程（２Ｃ）における標識の測定方法としては、本発明のエクソソームの測定を可能とする方法であれば特に制限はなく、例えば前述の方法等が挙げられる。
本発明における、エクソソームがその表面に有する第１抗原、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする抗原であれば特に制限はなく、例えばＣＤ９、ＣＤ１１、ＣＤ１３、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：細胞間接着分子−１）、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ:上皮細胞接着分子）、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、又はＬＡＭＰ１（ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １：リソソーム膜タンパク質１）、ＧＰＲＣ５Ｃ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙＣ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｃ：Ｇタンパク質共役受容体、ファミリーＣ、グループ５、メンバーＣ）等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第１抗原と、エクソソームがその表面に有する第２抗原とは異なっていても同じでもよい。第１抗原と第２抗原との組み合わせとしては、例えば以下の表１に記載の組み合わせが挙げられる。
本発明における、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする抗体であれば特に制限はなく、例えばＰｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ９（日本ベクトン・ディッキンソン社製、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ａ（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：２７／ＣＤ１１ａ）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：ＩＣＲＦ４４）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ｃ（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：３．９）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１３（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：ＷＭ１５）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ３７（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：Ｍ−Ｂ３７１）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ５３（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：ＨＩ２９）、クローン：Ｍ−Ｌ１３）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＣＤ６３（日本ベクトン・ディッキンソン社製、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ８１（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：ＪＳ−８１）、クローン：Ｈ５Ｃ６）、Ａｎｔｉ−ＣＤ８２ ａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｃ３３］（アブカム社製）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＭｏｕｓｅＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ８６（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：２３３１ (ＦＵＮ−１)）、抗ＣＤ１４７抗体［ＭＥＭ−Ｍ６／１］（Ｎｏｖｏｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）Ａｎｔｉ−ＩＣＡＭ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＨＭ１］（アブカム社製）、Ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ抗体［３２３／Ａ３］（アブカム社製）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｒａｂ５（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：１／Ｒａｂ５）、Ａｎｔｉ−Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＥＰＲ３９７９］（アブカム社製）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｌａｍｐ−１（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：２５／Ｌａｍｐ−１）、Ａｎｔｉ−ＧＰＲＣ５Ｃ抗体−Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ（ａｂ１３７４８２）（アブカム社製）、Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＧＰＲＣ５Ｃ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ）［１１９−１００８６］（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）等が挙げられる。
第１抗体と第２抗体との組み合わせとしては、例えば以下の表２に記載の組み合わせが挙げられる。
本発明における、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体の抗体断片としては、該第１抗原に結合し、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする抗体断片であれば特に制限はなく、例えば、抗体をパパイン処理することにより得られるFab、抗体をペプシン処理することにより得られるF(ab’)2、抗体をペプシン処理−還元処理することにより得られるFab’等の、Fc部分が除去された抗体断片、遺伝子工学的手法によりFc部分が除去された抗体断片等が挙げられる。
本発明における、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体の抗体断片としては、該第２抗原に結合し、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする抗体断片であれば特に制限はなく、例えば、抗体をパパイン処理することにより得られるFab、抗体をペプシン処理することにより得られるF(ab’)2、抗体をペプシン処理−還元処理することにより得られるFab’等の、Fc部分が除去された抗体断片、遺伝子工学的手法によりFc部分が除去された抗体断片等が挙げられる。
本発明における、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体の抗体断片としては、該第２抗原に結合し、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする抗体断片であれば特に制限はなく、例えば、抗体をパパイン処理することにより得られるFab、抗体をペプシン処理することにより得られるF(ab’)2、抗体をペプシン処理−還元処理することにより得られるFab’等の、Fc部分が除去された抗体断片、遺伝子工学的手法によりFc部分が除去された抗体断片等が挙げられる。
本発明における、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体としては、該第１抗原に結合し、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用可能である。
本発明における、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体としては、該第２抗原に結合し、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用可能である。
本発明における、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体としては、該第２抗原に結合し、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用可能である。
本発明における、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤は、エクソソームを破壊しない機能を有し、かつ、分子内に芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤である。エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤における芳香環とは、例えばベンゼン環等が挙げられる。本発明における、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体としては、エクソソームを破壊しない機能を有し、本発明のエクソソームの測定方法を可能とするポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体であれば特に制限はなく、例えばＨＬＢ値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩等が挙げられる。
ＨＬＢ値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、及び、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩におけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２４のアルキルが挙げられ、炭素数１０〜２０のアルキルが好ましい。炭素数８〜２４のアルキルとしては、例えばオクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、オレイル、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル等が挙げられる。炭素数１０〜２０のアルキルとしては、例えばデシル、イソデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、オレイル、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。
ＨＬＢ値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの市販品としては、例えばノニオンＨＳ−２１５（ＨＬＢ値：１５．０）、ノニオンＨＳ−２２０（ＨＬＢ値：１６．２）、ノニオンＨＳ−２４０（ＨＬＢ値：１７．９）、ノニオンＮＳ−２１５（ＨＬＢ値：１５．０）、ノニオンＮＳ−２２０（ＨＬＢ値：１６．０）、ノニオンＨＳ−２４０（ＨＬＢ値：１７．８）（以上、日油社製）、トリトンＸ−４０５（ＨＬＢ値：１７．９）、トリトンＸ−７０５（ＨＬＢ値：１８．４）（以上、シグマ−アルドリッチ社製）等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩における塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩の市販品としては、例えばトラックスＮ−３００、トラックスＮ−７００Ｂ（以上、日油社製）ハイテノールＮ−０７、ハイテノールＮ−０８、ハイテノールＮ−１７（以上、第一工業製薬社製）等が挙げられる。
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体としては、エクソソームを破壊しない機能を有し、本発明のエクソソームの測定方法を可能とするポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体であれば特に制限はなく、例えばポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩等が挙げられる。
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、及び、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩における多環フェニルとは、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。基内に１つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。基内に２つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルの市販品としては、例えばニューコール７０４、ニューコール７０６、ニューコール７０７、ニューコール７０８、ニューコール７０９、ニューコール７１０、ニューコール７１２、ニューコール７１４、ニューコール６１０、ニューコール２６０７、ニューコール２６０９、ニューコール２６１４（以上、日本乳化剤社製）等が挙げられる。
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩における塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩の市販品としては、例えばニューコール７０７−ＳＦ、ニューコール７０７−ＳＦＣ、ニューコール７０７−ＳＮ、ニューコール７１４−ＳＦ、ニューコール７１４−ＳＮ（以上、日本乳化剤社製）等が挙げられる。
本発明のエクソソームの測定方法においては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、及びポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体からなる群より選ばれる、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を、２種類以上組み合わせて用いてもよい。
本発明における水性媒体としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられ、緩衝液が好ましい。水性媒体のｐＨとしては、例えば４〜１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに適した緩衝液を用いることが好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。
グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（MES）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Bis-Tris）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ADA）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（PIPES）緩衝剤、２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ACES）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（MOPSO）緩衝剤、２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（BES）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS）緩衝剤、２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（TES）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン（HEPES）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（TAPSO）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（POPSO）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（HEPPSO）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（EPPS）緩衝剤、［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］（Tricine）緩衝剤、［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］（Bicine）緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（TAPS）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（CHES）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（CAPSO）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（CAPS）緩衝剤等が挙げられる。
水性媒体には、塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。塩類としては、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化マグネシウム、臭化アンモニウム等が挙げられる。金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン300、プロキセル（Proxel）ＧＸＬ等が挙げられる。蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン（以下、BSAと記す）等が挙げられる。蛋白質安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液［Peroxidase StabilizingBuffer、ダコサイトメーション（DakoCytomation）社製］等が挙げられる。
２．測定試薬
本発明のエクソソームの測定試薬は、本発明のエクソソームの測定方法に用いられる試薬である。本発明のエクソソームの測定試薬の具体的態様を以下に記す。
本発明のエクソソームの測定試薬は、本発明のエクソソームの測定方法に用いられる試薬である。本発明のエクソソームの測定試薬の具体的態様を以下に記す。
・測定試薬１
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片、並びに、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する試薬
該第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片、並びに、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する試薬
該第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
・測定試薬２
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、標識化競合物質、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する試薬
該第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。標識、競合物質としては、例えば前述の標識、競合物質がそれぞれ挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、標識化競合物質、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する試薬
該第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。標識、競合物質としては、例えば前述の標識、競合物質がそれぞれ挙げられる。
上記の測定試薬１及び測定試薬２において、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と、該第１抗体若しくは該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。
この場合、本発明の測定試薬には、該第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｄ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｄ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｄとｄの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ；
・エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体のFc領域と、該Fc領域に結合する抗体との組み合わせ。
この場合、本発明の測定試薬には、該第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｄ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｄ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｄとｄの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ；
・エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体のFc領域と、該Fc領域に結合する抗体との組み合わせ。
・測定試薬３
標識化された、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、競合物質、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する試薬
競合物質は不溶性担体に固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。標識、競合物質としては、例えば前述の標識、競合物質がそれぞれ挙げられる。
標識化された、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、競合物質、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する試薬
競合物質は不溶性担体に固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。標識、競合物質としては、例えば前述の標識、競合物質がそれぞれ挙げられる。
上記の測定試薬３において、競合物質が固定化された不溶性担体は、試料と、競合物質との反応の反応液中で生成されてもよい。
この場合、本発明の測定試薬には、競合物質が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｅ）が結合した競合物質と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｅ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｅとｅの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ。
この場合、本発明の測定試薬には、競合物質が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｅ）が結合した競合物質と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｅ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｅとｅの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ。
本発明の測定試薬は、凍結乾燥状態でも液状でもよい。凍結乾燥状態の測定試薬を使用する場合には、測定前に水性媒体で溶解して液状にして測定に供する。液状の測定試薬においては、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、標識化された該第１抗体若しくは該抗体断片、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片、競合物質、及び標識化競合物質は、水性媒体で溶解された状態となっている。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。
本発明の測定試薬における、エクソソームがその表面に有する第１抗原、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原としては、前述のエクソソームがその表面に有する第１抗原、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原がそれぞれ挙げられる。本発明の測定試薬における、エクソソームがその表面に有する第１抗原とエクソソームがその表面に有する第２抗原との組み合わせとしては、前述の第１抗原と第２抗原との組み合わせが挙げられる。
本発明の測定試薬における、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤としては、前述のエクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が挙げられる。本発明の測定試薬における、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の含量としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、通常、前述の水性媒体中、又は、前述の水性媒体で溶解された状態で、0.00005〜10.0%(w/v)となる含量であり、0.0001〜5.0%(w/v)となる含量が好ましく、0.0025〜1.0%(w/v)となる含量が特に好ましい。
本発明の測定試薬において、２種類以上の、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の組み合わせが含有されてもよい。
本発明の測定試薬において、２種類以上の、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の組み合わせが含有されてもよい。
本発明の測定試薬における、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片としては、例えば前述のエクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片がそれぞれ挙げられる。本発明の測定試薬における、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体と、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体との組み合わせとしては、前述の第１抗体と第２抗体との組み合わせが挙げられる。本発明の測定試薬における、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片の含量としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、通常、前述の水性媒体中、又は、前述の水性媒体で溶解された状態で通常0.01〜100μg/mLであり、0.03〜20μg/mLが好ましく、0.05〜10μg/mLが特に好ましい。
本発明の測定試薬における標識、競合物質としては、例えば前述の標識、競合物質がそれぞれ挙げられる。
３．測定キット
本発明のエクソソームの測定試薬は、保存、運搬、流通等の観点からキットの形態を取ることもできる。本発明の測定キットは、本発明のエクソソームの測定方法に用いられる。本発明のエクソソームの測定キットの具体的態様を以下に記す。
本発明のエクソソームの測定試薬は、保存、運搬、流通等の観点からキットの形態を取ることもできる。本発明の測定キットは、本発明のエクソソームの測定方法に用いられる。本発明のエクソソームの測定キットの具体的態様を以下に記す。
・測定キット１
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含有する第１試薬と、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含有する第２試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１試薬及び第２試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
該第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含有する第１試薬と、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含有する第２試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１試薬及び第２試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
該第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
・測定キット２
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含有する第１試薬と、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含有する第２試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第３試薬とを含む、キット
該第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含有する第１試薬と、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含有する第２試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第３試薬とを含む、キット
該第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
上記の測定キット１及び測定キット２において、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と、該第１抗体若しくは該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。
この場合、本発明の測定試薬には、該第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｆ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｆ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｆとｆの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ；
・エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体のFc領域と、該Fc領域に結合する抗体との組み合わせ。
この場合、本発明の測定試薬には、該第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｆ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｆ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｆとｆの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ；
・エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体のFc領域と、該Fc領域に結合する抗体との組み合わせ。
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｆ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｆ）が結合した不溶性担体とは同一の試薬に含まれても、別々の試薬に含まれてもよいが、別々の試薬に含まれることが好ましい。
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｆ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｆ）が結合した不溶性担体とが、別々の試薬に含まれている以下のキット、すなわち、測定キット３〜５も本発明のキットに含まれる。
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｆ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｆ）が結合した不溶性担体とが、別々の試薬に含まれている以下のキット、すなわち、測定キット３〜５も本発明のキットに含まれる。
・測定キット３
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｆ）が結合した、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｆ）が結合した不溶性担体、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含む第２試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１試薬及び第２試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｆ）が結合した、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｆ）が結合した不溶性担体、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含む第２試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１試薬及び第２試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
・測定キット４
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｆ）が結合した、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含む第２試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｆ）が結合した不溶性担体を含む第３試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１〜３試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｆ）が結合した、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含む第２試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｆ）が結合した不溶性担体を含む第３試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１〜３試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
・測定キット５
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｆ）が結合した、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含む第２試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｆ）が結合した不溶性担体を含む第３試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む第４試薬とを含む、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｆ）が結合した、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含む第２試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｆ）が結合した不溶性担体を含む第３試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む第４試薬とを含む、キット
また、競合法１に用いられる測定キットとして、以下の測定キット６、７が挙げられる。
・測定キット６
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、標識化競合物質を含む第２試薬とを含有し、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、第１試薬及び第２試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
該第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
・測定キット６
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、標識化競合物質を含む第２試薬とを含有し、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、第１試薬及び第２試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
該第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
・測定キット７
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、標識化競合物質を含む第２試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第３試薬とを含む、キット
該第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、標識化競合物質を含む第２試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第３試薬とを含む、キット
該第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
上記の測定キット６及び測定キット７において、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と、該第１抗体若しくは該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。
この場合、本発明の測定試薬には、該第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｇ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｇ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｇとｇの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ；
・エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体のFc領域と、該Fc領域に結合する抗体との組み合わせ。
この場合、本発明の測定試薬には、該第１抗体若しくは該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｇ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｇ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｇとｇの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ；
・エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体のFc領域と、該Fc領域に結合する抗体との組み合わせ。
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｇ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｇ）が結合した不溶性担体とは同一の試薬に含まれても、別々の試薬に含まれてもよいが、別々の試薬に含まれることが好ましい。
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｇ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｇ）が結合した不溶性担体とが、別々の試薬に含まれている以下のキット、すなわち、測定キット８〜１０も本発明のキットに含まれる。
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｇ）が結合した該第１抗体若しくは該抗体断片と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｇ）が結合した不溶性担体とが、別々の試薬に含まれている以下のキット、すなわち、測定キット８〜１０も本発明のキットに含まれる。
・測定キット８
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｇ）が結合した、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｇ）が結合した不溶性担体、及び、標識化競合物質を含む第２試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１試薬及び第２試薬の少なくとも１つに含まれる、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｇ）が結合した、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｇ）が結合した不溶性担体、及び、標識化競合物質を含む第２試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１試薬及び第２試薬の少なくとも１つに含まれる、キット
・測定キット９
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｇ）が結合した、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、標識化競合物質を含む第２試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｇ）が結合した不溶性担体を含む第３試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１〜３試薬の少なくとも１つに含まれる、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｇ）が結合した、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、標識化競合物質を含む第２試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｇ）が結合した不溶性担体を含む第３試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１〜３試薬の少なくとも１つに含まれる、キット
・測定キット１０
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｇ）が結合した、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、標識化競合物質を含む第２試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｇ）が結合した不溶性担体を含む第３試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む第４試薬とを含む、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｇ）が結合した、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、標識化競合物質を含む第２試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｇ）が結合した不溶性担体を含む第３試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む第４試薬とを含む、キット
さらに、競合法２に用いられる測定キットとして、以下の測定キット１１、１２が挙げられる。
・測定キット１１
標識化された、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、競合物質を含む第２試薬とを含有し、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、第１試薬、第２試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
競合物質は不溶性担体に固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
・測定キット１１
標識化された、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、競合物質を含む第２試薬とを含有し、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、第１試薬、第２試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
競合物質は不溶性担体に固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
・測定キット１２
標識化された、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、競合物質を含む第２試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第３試薬とを含む、キット
競合物質は不溶性担体に固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
標識化された、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含む第１試薬と、競合物質を含む第２試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第３試薬とを含む、キット
競合物質は不溶性担体に固定化されている方が好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
上記の測定キット１１及び測定キット１２において、競合物質が固定化された不溶性担体は、試料と、競合物質との反応の反応液中で生成されてもよい。
この場合、本発明の測定試薬には、競合物質が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｈ）が結合した競合物質と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｈ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｈとｈの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ。
この場合、本発明の測定試薬には、競合物質が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｈ）が結合した競合物質と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｈ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｈとｈの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートトラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ。
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｈ）が結合した競合物質と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｈ）が結合した不溶性担体とは同一の試薬に含まれても、別々の試薬に含まれてもよいが、別々の試薬に含まれることが好ましい。
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｈ）が結合した競合物質と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｈ）が結合した不溶性担体とが、別々の試薬に含まれている以下のキット、すなわち、測定キット１３〜１５も本発明のキットに含まれる。
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｈ）が結合した競合物質と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｈ）が結合した不溶性担体とが、別々の試薬に含まれている以下のキット、すなわち、測定キット１３〜１５も本発明のキットに含まれる。
・測定キット１３
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｈ）が結合した競合物質を含む第１試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｈ）が結合した不溶性担体、及び、標識化された、該第１抗体若しくは該抗体断片を含む第２試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１試薬及び第２試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｈ）が結合した競合物質を含む第１試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｈ）が結合した不溶性担体、及び、標識化された、該第１抗体若しくは該抗体断片を含む第２試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１試薬及び第２試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
・測定キット１４
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｈ）が結合した競合物質を含む第１試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｈ）が結合した不溶性担体を含む第２試薬と、標識化された、該第１抗体若しくは該抗体断片を含む第３試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１〜３試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｈ）が結合した競合物質を含む第１試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｈ）が結合した不溶性担体を含む第２試薬と、標識化された、該第１抗体若しくは該抗体断片を含む第３試薬とを含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１〜３試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、キット
・測定キット１５
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｈ）が結合した競合物質を含む第１試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｈ）が結合した不溶性担体を含む第２試薬と、標識化された、該第１抗体若しくは該抗体断片を含む第３試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む第４試薬とを含む、キット
一組の親和性物質の組み合わせの一方（Ｈ）が結合した競合物質を含む第１試薬と、一組の親和性物質の組み合わせの他方（ｈ）が結合した不溶性担体を含む第２試薬と、標識化された、該第１抗体若しくは該抗体断片を含む第３試薬と、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む第４試薬とを含む、キット
本発明の測定キットの構成試薬は、凍結乾燥状態でも液状でもよい。凍結乾燥状態の構成試薬を使用する場合には、測定前に水性媒体で溶解して液状にして測定に供する。液状の構成試薬においては、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、標識化された該第１抗体若しくは該抗体断片、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片、競合物質、及び標識化競合物質は、水性媒体で溶解された状態となっている。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。
本発明の測定キットにおける、エクソソームがその表面に有する第１抗原、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原としては、前述の、エクソソームがその表面に有する第１抗原、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原がそれぞれ挙げられる。本発明の測定キットにおける、エクソソームがその表面に有する第１抗原とエクソソームがその表面に有する第２抗原との組み合わせとしては、前述の第１抗原と第２抗原との組み合わせが挙げられる。
本発明の測定キットにおける、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片としては、前述の、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断がそれぞれ挙げられる。本発明の測定キットにおける、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体と、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体との組み合わせとしては、前述の第１抗体と第２抗体との組み合わせが挙げられる。
本発明の測定キットの、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片の含量としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、通常、前述の水性媒体中、又は、前述の水性媒体で溶解された状態で通常0.01〜100μg/mLであり、0.03〜20μg/mLが好ましく、0.05〜10μg/mLが特に好ましい。
本発明の測定キットの、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片の含量としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、通常、前述の水性媒体中、又は、前述の水性媒体で溶解された状態で通常0.01〜100μg/mLであり、0.03〜20μg/mLが好ましく、0.05〜10μg/mLが特に好ましい。
本発明の測定キットの、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片の含量としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、通常、前述の水性媒体中、又は、前述の水性媒体で溶解された状態で通常0.01〜100μg/mLであり、0.03〜20μg/mLが好ましく、0.05〜10μg/mLが特に好ましい。
本発明の測定キットにおいて、標識、競合物質としては、前述の標識、競合物質がそれぞれ挙げられる。
本発明の測定キットにおける、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤としては、前述の、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が挙げられる。
本発明の測定キットの構成試薬における、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の含量としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、通常、前述の水性媒体中、又は、前述の水性媒体で溶解された状態で0.00005〜30.0%(w/v)となる含量であり、0.0001〜20.0%(w/v)となる含量が好ましく、0.0025〜10.0%(w/v)となる含量が特に好ましい。
本発明の測定キットにおいては、２種類以上の、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の組み合わせが含有されてもよい。
本発明の測定キットの構成試薬における、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の含量としては、本発明のエクソソームの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、通常、前述の水性媒体中、又は、前述の水性媒体で溶解された状態で0.00005〜30.0%(w/v)となる含量であり、0.0001〜20.0%(w/v)となる含量が好ましく、0.0025〜10.0%(w/v)となる含量が特に好ましい。
本発明の測定キットにおいては、２種類以上の、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の組み合わせが含有されてもよい。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
＜材料＞
リン酸水素二ナトリウム（リン酸緩衝液；関東化学社製）、リン酸二水素ナトリウム（リン酸緩衝液；関東化学社製）、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）、塩化マグネシウム（和光純薬工業社製）、MES（同仁化学研究所社製）、MOPS（同仁化学研究所社製）、Tween 20（関東化学社製）、ストレプトアビジン結合磁性粒子（Dynabeads MyOne Streptavidin C1；ダイナル社製）、ノニオンＨＳ−２４０（ＨＬＢ値：１７．９）、ノニオンＮＳ−２４０（ＨＬＢ値：１７．８）、ノニオンＨＳ−２２０（ＨＬＢ値：１６．２）、ノニオンＮＳ−２２０（ＨＬＢ値：１６．０）、ノニオンＨＳ−２１５（ＨＬＢ値：１５．０）、ノニオンＮＳ−２１５（ＨＬＢ値：１５．０）（以上、ＨＬＢ値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；日油社製）、ニューコール６１０、ニューコール７１４、ニューコール７２３、ニューコール７４０、ニューコール２６０９、ニューコール２６１４（以上、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル；日本乳化剤社製）、ニューコール７４０ＳＦ、ニューコール７２３ＳＦ（以上、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩；日本乳化剤社製）、トラックスＮ−７００Ｂ（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩；日油社製）、トリトンＸ−１００［ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（ＨＬＢ値：１３．５）；シグマ−アルドリッチ社製］、ノニデットＰ−４０［ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（ＨＬＢ値：１３．１）；シグマ−アルドリッチ社製］、BSA（オリエンタル酵母工業社製）、抗ヒトCD9モノクローナル抗体（クローン：A100-4）（医学生物学研究所社製）、抗ヒトCD63モノクローナル抗体（クローン：C047-1）（医学生物学研究所社製）、抗ヒトCD81モノクローナル抗体（クローン：A103-10）（医学生物学研究所社製）。
＜材料＞
リン酸水素二ナトリウム（リン酸緩衝液；関東化学社製）、リン酸二水素ナトリウム（リン酸緩衝液；関東化学社製）、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）、塩化マグネシウム（和光純薬工業社製）、MES（同仁化学研究所社製）、MOPS（同仁化学研究所社製）、Tween 20（関東化学社製）、ストレプトアビジン結合磁性粒子（Dynabeads MyOne Streptavidin C1；ダイナル社製）、ノニオンＨＳ−２４０（ＨＬＢ値：１７．９）、ノニオンＮＳ−２４０（ＨＬＢ値：１７．８）、ノニオンＨＳ−２２０（ＨＬＢ値：１６．２）、ノニオンＮＳ−２２０（ＨＬＢ値：１６．０）、ノニオンＨＳ−２１５（ＨＬＢ値：１５．０）、ノニオンＮＳ−２１５（ＨＬＢ値：１５．０）（以上、ＨＬＢ値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；日油社製）、ニューコール６１０、ニューコール７１４、ニューコール７２３、ニューコール７４０、ニューコール２６０９、ニューコール２６１４（以上、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル；日本乳化剤社製）、ニューコール７４０ＳＦ、ニューコール７２３ＳＦ（以上、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩；日本乳化剤社製）、トラックスＮ−７００Ｂ（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩；日油社製）、トリトンＸ−１００［ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（ＨＬＢ値：１３．５）；シグマ−アルドリッチ社製］、ノニデットＰ−４０［ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（ＨＬＢ値：１３．１）；シグマ−アルドリッチ社製］、BSA（オリエンタル酵母工業社製）、抗ヒトCD9モノクローナル抗体（クローン：A100-4）（医学生物学研究所社製）、抗ヒトCD63モノクローナル抗体（クローン：C047-1）（医学生物学研究所社製）、抗ヒトCD81モノクローナル抗体（クローン：A103-10）（医学生物学研究所社製）。
以下の表３に示す第１抗体と第2抗体との組合せを用いて、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液と、ビオチン結合第１抗体溶液と、アルカリホスファターゼ（ALP）標識第2抗体溶液と、からなるエクソソーム測定キットを作製した（表４〜表９）。
また、以下の表３に示す第１抗体と第2抗体との組合せを用いて、比較例1として、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合第１抗体溶液及びALP標識第2抗体溶液においてトリトンX-100を含む測定キット（測定キット1X〜6X）、ノニデット P-40を含む測定キット（測定キット1Y〜6Y）、界面活性剤の代わりにPBS［リン酸緩衝化生理食塩水（0.15 mol/L 塩化ナトリウムを含有する10 mmol/L リン酸緩衝液、pH7.2）］を含む測定キット（測定キット1Z〜6Z）も作製した（表４〜表９）。
また、以下の表３に示す第１抗体と第2抗体との組合せを用いて、比較例1として、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合第１抗体溶液及びALP標識第2抗体溶液においてトリトンX-100を含む測定キット（測定キット1X〜6X）、ノニデット P-40を含む測定キット（測定キット1Y〜6Y）、界面活性剤の代わりにPBS［リン酸緩衝化生理食塩水（0.15 mol/L 塩化ナトリウムを含有する10 mmol/L リン酸緩衝液、pH7.2）］を含む測定キット（測定キット1Z〜6Z）も作製した（表４〜表９）。
＜ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液＞
市販のストレプトアビジン結合磁性粒子（Dynabeads MyOne Streptavidin C1）を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.225 mg/mL
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
市販のストレプトアビジン結合磁性粒子（Dynabeads MyOne Streptavidin C1）を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.225 mg/mL
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
＜ビオチン結合第１抗体溶液＞
Biotin Labeling Kit-NH2 (同仁化学研究所社製)を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、抗CD9モノクローナル抗体をビオチンで標識し、ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体（ビオチン結合第1抗体）を調製した。同様の方法を用いて、ビオチン結合抗CD63モノクローナル抗体（ビオチン結合第1抗体）およびビオチン結合抗CD81モノクローナル抗体（ビオチン結合第1抗体）を調製した。
得られたビオチン結合第1抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液、ビオチン結合抗CD63モノクローナル抗体溶液、ビオチン結合抗CD81モノクローナル抗体溶液を調製した。
・ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1％(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
・ビオチン結合抗CD63モノクローナル抗体溶液
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD63モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1％(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
・ビオチン結合抗CD81モノクローナル抗体溶液
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD81モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1％(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
Biotin Labeling Kit-NH2 (同仁化学研究所社製)を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、抗CD9モノクローナル抗体をビオチンで標識し、ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体（ビオチン結合第1抗体）を調製した。同様の方法を用いて、ビオチン結合抗CD63モノクローナル抗体（ビオチン結合第1抗体）およびビオチン結合抗CD81モノクローナル抗体（ビオチン結合第1抗体）を調製した。
得られたビオチン結合第1抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液、ビオチン結合抗CD63モノクローナル抗体溶液、ビオチン結合抗CD81モノクローナル抗体溶液を調製した。
・ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1％(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
・ビオチン結合抗CD63モノクローナル抗体溶液
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD63モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1％(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
・ビオチン結合抗CD81モノクローナル抗体溶液
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD81モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1％(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
＜ALP標識第2抗体溶液＞
Alkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2(同仁化学研究所社製)を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、抗CD9モノクローナル抗体をALPで標識し、ALP標識抗CD9モノクローナル抗体（ALP標識第2抗体）を作製した。同様の方法を用いて、ALP標識抗CD63モノクローナル抗体（ALP標識第2抗体）およびALP標識抗CD81モノクローナル抗体（ALP標識第2抗体）を調製した。得られたALP標識第2抗体を用いて、以下の組成からなるALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液, ALP標識抗CD63モノクローナル抗体溶液, ALP標識抗CD81モノクローナル抗体溶液を調製した。
・ALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ALP標識抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
・ALP標識抗CD63モノクローナル抗体溶液
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ALP標識抗CD63モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
・ALP標識抗CD81モノクローナル抗体溶液
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ALP標識抗CD81モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
Alkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2(同仁化学研究所社製)を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、抗CD9モノクローナル抗体をALPで標識し、ALP標識抗CD9モノクローナル抗体（ALP標識第2抗体）を作製した。同様の方法を用いて、ALP標識抗CD63モノクローナル抗体（ALP標識第2抗体）およびALP標識抗CD81モノクローナル抗体（ALP標識第2抗体）を調製した。得られたALP標識第2抗体を用いて、以下の組成からなるALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液, ALP標識抗CD63モノクローナル抗体溶液, ALP標識抗CD81モノクローナル抗体溶液を調製した。
・ALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ALP標識抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
・ALP標識抗CD63モノクローナル抗体溶液
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ALP標識抗CD63モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
・ALP標識抗CD81モノクローナル抗体溶液
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ALP標識抗CD81モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
界面活性剤 （表４〜表９に記載の界面活性剤の濃度）
(1) エクソソームの測定方法
協和メデックス株式会社所属の健常人ボランティアより末梢血を採取し、当該末梢血から遠心分離（2000rpm、20分間、25℃）により血清（以下、健常人血清という）を調製した。
表４〜表９記載の各キットを用いて、以下の手順により試料中のエクソソームを測定した。健常人血清(10 μL)又はPBS（0濃度試料）（10 μL)に、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液(30 μL)、ビオチン結合第１抗体溶液(30 μL)、及び、ALP標識第2抗体溶液(30 μL)を加えて攪拌し、37 ℃で10分間反応させた。磁性粒子を磁力で集めて、磁性粒子以外の反応溶液を除去すると共に、洗浄液［0.075% Tween 20、0.2 mmol/L 塩化マグネシウム、0.3 mol/L塩化ナトリウム、を含む0.005 mol/L MOPS緩衝液（pH7.3）］で磁性粒子を5回洗浄した。その後、9-［（4-クロロフェニルチオ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］-10-メチルアクリダン・二ナトリウム塩（LumigenTM APS-5）を主成分とする発光基質液(100 μL)を加えて攪拌し、生じた発光量（RLU）を測定した。
協和メデックス株式会社所属の健常人ボランティアより末梢血を採取し、当該末梢血から遠心分離（2000rpm、20分間、25℃）により血清（以下、健常人血清という）を調製した。
表４〜表９記載の各キットを用いて、以下の手順により試料中のエクソソームを測定した。健常人血清(10 μL)又はPBS（0濃度試料）（10 μL)に、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液(30 μL)、ビオチン結合第１抗体溶液(30 μL)、及び、ALP標識第2抗体溶液(30 μL)を加えて攪拌し、37 ℃で10分間反応させた。磁性粒子を磁力で集めて、磁性粒子以外の反応溶液を除去すると共に、洗浄液［0.075% Tween 20、0.2 mmol/L 塩化マグネシウム、0.3 mol/L塩化ナトリウム、を含む0.005 mol/L MOPS緩衝液（pH7.3）］で磁性粒子を5回洗浄した。その後、9-［（4-クロロフェニルチオ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］-10-メチルアクリダン・二ナトリウム塩（LumigenTM APS-5）を主成分とする発光基質液(100 μL)を加えて攪拌し、生じた発光量（RLU）を測定した。
(2) 各測定キットにおける測定感度の比較
上記(1)により得られた各測定キットにおける発光量（健常人血清の発光量；0濃度試料の発光量）を用いて、S/N比を算出した。S/N比とは、免疫測定における測定感度を評価する指標の１つであり、0濃度試料を測定した際に得られるシグナル（ノイズ［noise］）に対する、既知濃度試料を測定した際に得られるシグナル（signal）の比を示している。S/N比は以下の式により算出することができる。
S/N比＝［健常人血清の発光量］／［0濃度試料の発光量］
その後、各測定キットにおけるS/N比を比較するため、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合第１抗体溶液及びALP標識第2抗体溶液においてPBSを含む測定キット（測定キット1Z〜6Z）を用いた際のS/N比を基準（100%）として、各測定キットにおけるS/N比を算出し、測定感度相対値(%)とした。その結果を、表４〜表９に示す。ここで、測定感度相対値(%)が大きいほど測定感度が高いことを示し、測定感度相対値(%)が100％を越えた場合、界面活性剤を含まない測定キットと比べて測定感度が高いことを示している。
上記(1)により得られた各測定キットにおける発光量（健常人血清の発光量；0濃度試料の発光量）を用いて、S/N比を算出した。S/N比とは、免疫測定における測定感度を評価する指標の１つであり、0濃度試料を測定した際に得られるシグナル（ノイズ［noise］）に対する、既知濃度試料を測定した際に得られるシグナル（signal）の比を示している。S/N比は以下の式により算出することができる。
S/N比＝［健常人血清の発光量］／［0濃度試料の発光量］
その後、各測定キットにおけるS/N比を比較するため、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合第１抗体溶液及びALP標識第2抗体溶液においてPBSを含む測定キット（測定キット1Z〜6Z）を用いた際のS/N比を基準（100%）として、各測定キットにおけるS/N比を算出し、測定感度相対値(%)とした。その結果を、表４〜表９に示す。ここで、測定感度相対値(%)が大きいほど測定感度が高いことを示し、測定感度相対値(%)が100％を越えた場合、界面活性剤を含まない測定キットと比べて測定感度が高いことを示している。
表４〜表９から明らかなように、実施例１の、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含む測定キット（測定キット1A〜1P、測定キット2A〜2M、測定キット3A〜3L、測定キット4A〜4M、測定キット5A〜5M、測定キット6A〜6M）を用いて血清中のエクソソームを測定した場合、すなわち、抗原抗体反応において当該界面活性剤が存在する場合、比較例１の測定キットを用いて血清中のエクソソームを測定した場合、すなわち、抗原抗体反応において当該界面活性剤が存在しない場合と比べて、エクソソームの測定感度が高いことが判明した。
以下のストレプトアビジン結合磁性粒子溶液と、ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液と、ALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液と、からなるエクソソーム測定キット1a〜1gを作製した。
＜ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液＞
実施例１と同じ磁性粒子（Dynabeads MyOne Streptavidin C1）を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.225 mg/mL
ノニオンNS-240 表１０記載の濃度
実施例１と同じ磁性粒子（Dynabeads MyOne Streptavidin C1）を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.225 mg/mL
ノニオンNS-240 表１０記載の濃度
＜ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液＞
実施例１で作製したビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ノニオンNS-240 表１０記載の濃度
実施例１で作製したビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ノニオンNS-240 表１０記載の濃度
＜ALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液＞
実施例１で作製したALP標識抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ALP標識抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ノニオンNS-240 表１０記載の濃度
実施例１で作製したALP標識抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ALP標識抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ノニオンNS-240 表１０記載の濃度
実施例３の測定キット1a〜1g、及び、比較例１の測定キット1Zのそれぞれの測定キットを用いて、実施例２と同様の方法で、PBSで2倍希釈した健常人血清中、及びPBS（0濃度試料）中のエクソソームを測定し、抗原抗体反応におけるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルであるノニオン NS-240の濃度を検討した。得られた各測定キットにおける発光量から、実施例２の(2)の方法に従い、測定感度相対値(%)を算出した。その結果を表１０に示す。
表１０から明らかなように、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液、ALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液においてノニオン NS-240を含む測定キットを用いて血清中のエクソソームを測定した場合、すなわち、抗原抗体反応においてノニオン NS-240が0.0025〜1.0%で存在する場合、比較例１の測定キット1Zを用いて血清中のエクソソームを測定した場合、すなわち、抗原抗体反応においてノニオン NS-240が存在しない場合と比べて、エクソソームの測定感度が高いことが判明した。
以下のストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液、ALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液からなるエクソソーム測定キット2a〜2fを作製した。
＜ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液＞
実施例１と同じ磁性粒子（Dynabeads MyOne Streptavidin C1）を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.225 mg/mL
トラックスN-700B 表１１記載の濃度
実施例１と同じ磁性粒子（Dynabeads MyOne Streptavidin C1）を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.225 mg/mL
トラックスN-700B 表１１記載の濃度
＜ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液＞
実施例１で作製したビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
トラックスN-700B 表１１記載の濃度
実施例１で作製したビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
トラックスN-700B 表１１記載の濃度
＜ALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液＞
実施例１で作製したALP標識抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ALP標識抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
トラックスN-700B 表１１記載の濃度
実施例１で作製したALP標識抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ALP標識抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
トラックスN-700B 表１１記載の濃度
実施例５の測定キット2a〜2f、及び、比較例１の測定キット1Zのそれぞれのキットを用いて、実施例２と同様の方法で、PBSで2倍希釈した健常人血清中、及びPBS（0濃度試料）中のエクソソームを測定し、抗原抗体反応におけるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩であるトラックスN-700Bの濃度を検討した。得られた各測定キットにおける発光量から、実施例２の(2)の方法に従い、測定感度相対値(%)を算出した。その結果を表１１に示す。
表１１から明らかなように、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液、ALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液においてトラックスN-700Bを含む測定キットを用いて血清中のエクソソームを測定した場合、すなわち、抗原抗体反応においてトラックスN-700Bが0.005〜1.0%で存在する場合、比較例１の測定キット1Zを用いて血清中のエクソソームを測定した場合、すなわち、抗原抗体反応においてトラックスN-700Bが存在しない場合と比べて、エクソソームの測定感度が高いことが判明した。
以下のストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液、ALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液からなるエクソソーム測定キット3a〜3gを作製した。
＜ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液＞
実施例１と同じ磁性粒子（Dynabeads MyOne Streptavidin C1）を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.225 mg/mL
ニューコール740 表１２記載の濃度
実施例１と同じ磁性粒子（Dynabeads MyOne Streptavidin C1）を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.225 mg/mL
ニューコール740 表１２記載の濃度
＜ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液＞
実施例１で作製したビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ニューコール740 表１２記載の濃度
実施例１で作製したビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ニューコール740 表１２記載の濃度
＜ALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液＞
実施例１で作製したALP標識抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ALP標識抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ニューコール740 表１２記載の濃度
実施例１で作製したALP標識抗CD9モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液を調製した。
MES（pH6.5） 0.05 mol/L
ALP標識抗CD9モノクローナル抗体 75 ng/mL
BSA 0.1%(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ニューコール740 表１２記載の濃度
実施例７の測定キット3a〜3g、及び、比較例１の測定キット1Zのそれぞれのキットを用いて、実施例２と同様の方法で、PBSで2倍希釈した健常人血清中、及びPBS（0濃度試料）中のエクソソームを測定し、抗原抗体反応におけるポリオキシエチレン多環フェニルエーテルであるニューコール740の濃度を検討した。得られた各測定キットにおける発光量から、実施例２の(2)の方法に従い、測定感度相対値(%)を算出した。その結果を表１２に示す。
表１２から明らかなように、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合抗CD9モノクローナル抗体溶液、ALP標識抗CD9モノクローナル抗体溶液においてニューコール740を含む測定キットを用いて血清中のエクソソームを測定した場合、すなわち、抗原抗体反応においてニューコール740が0.0025〜1.0%で存在する場合、比較例１の測定キット1Zを用いて血清中のエクソソームを測定した場合、すなわち、抗原抗体反応においてニューコール740が存在しない場合と比べて、エクソソームの測定感度が高いことが判明した。
本発明により、がん等の臨床診断に有効で、簡便、かつ、高感度な、試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キットが提供される。
Claims (17)
- 試料中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いて測定する方法であって、抗原抗体反応を、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする、試料中のエクソソームの測定方法。
- 以下の工程（１）〜（３）を含み、工程（１）及び／又は工程（２）の反応が、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する水性媒体中で行われる、請求項１記載の方法。
（１）試料と、エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片とを、水性媒体中で反応させ、該第１抗体若しくは該抗体断片と、該エクソソームと、からなる免疫複合体１を生成させる工程；
（２）エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を、水性媒体中で、前記工程（１）で生成した免疫複合体１と反応させ、該第１抗体若しくは該抗体断片と、該エクソソームと、該第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２を生成させる工程；
（３）前記工程（２）で生成した免疫複合体２を測定する工程。 - エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である請求項１又は２記載の方法。
- ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、ＨＬＢ値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である請求項３記載の方法。
- ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である請求項３又は４記載の方法。
- 第１抗原及び第２抗原のうち少なくとも一方が、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１からなる群より選択される抗原である、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
- エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有することを特徴とする、試料中のエクソソームの測定試薬。
- エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である請求項７記載の試薬。
- ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、ＨＬＢ値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である請求項８記載の試薬。
- ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である請求項８又は９記載の試薬。
- 第１抗原及び第２抗原のうち少なくとも一方が、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１からなる群より選択される抗原である、請求項７〜１０のいずれかに記載の試薬。
- エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含有する第１試薬、及び、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含有する第２試薬を含み、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が第１試薬、及び、第２試薬の少なくとも１つの試薬に含まれる、試料中のエクソソームの測定キット。
- エクソソームがその表面に有する第１抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を含有する第１試薬、エクソソームがその表面に有する第２抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片を含有する第２試薬、及び、エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する第３試薬を含む、試料中のエクソソームの測定キット。
- エクソソームを破壊しない、芳香環を有するポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体である請求項１２又は１３記載のキット。
- ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル誘導体が、ＨＬＢ値が１４以上２０以下であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩である請求項１４記載のキット。
- ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、又は、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩である請求項１４又は１５記載のキット。
- 第１抗原及び第２抗原のうち少なくとも一方が、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１からなる群より選択される抗原である、請求項１２〜１６のいずれかに記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018023870 | 2018-02-14 | ||
| JP2018023870 | 2018-02-14 | ||
| PCT/JP2019/005026 WO2019159944A1 (ja) | 2018-02-14 | 2019-02-13 | 試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2019159944A1 true JPWO2019159944A1 (ja) | 2021-03-04 |
| JP7281092B2 JP7281092B2 (ja) | 2023-05-25 |
Family
ID=67618973
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020500506A Active JP7281092B2 (ja) | 2018-02-14 | 2019-02-13 | 試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キット |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7281092B2 (ja) |
| WO (1) | WO2019159944A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4067472A4 (en) * | 2019-12-23 | 2023-12-27 | Fujirebio Inc. | METHOD FOR OBTAINING EXTRACELLULAR VESICLES AND BLOOD COLLECTION TUBE |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012039395A1 (ja) * | 2010-09-24 | 2012-03-29 | 和光純薬工業株式会社 | small RNAの取得方法 |
| WO2013094307A1 (ja) * | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ochiya Takahiro | エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置 |
| JP2014526032A (ja) * | 2011-06-07 | 2014-10-02 | カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス エス．アー．エール．エル． | 癌に対する循環バイオマーカー |
| WO2015068772A1 (ja) * | 2013-11-06 | 2015-05-14 | Jsr株式会社 | 分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、キット及び液状組成物 |
| JP2018130085A (ja) * | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Jsr株式会社 | 保存安定化剤、安定化方法、保存方法、添加剤、単離方法、及び回収効率改善剤 |
-
2019
- 2019-02-13 WO PCT/JP2019/005026 patent/WO2019159944A1/ja active Application Filing
- 2019-02-13 JP JP2020500506A patent/JP7281092B2/ja active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012039395A1 (ja) * | 2010-09-24 | 2012-03-29 | 和光純薬工業株式会社 | small RNAの取得方法 |
| JP2014526032A (ja) * | 2011-06-07 | 2014-10-02 | カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス エス．アー．エール．エル． | 癌に対する循環バイオマーカー |
| WO2013094307A1 (ja) * | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ochiya Takahiro | エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置 |
| WO2015068772A1 (ja) * | 2013-11-06 | 2015-05-14 | Jsr株式会社 | 分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、キット及び液状組成物 |
| JP2018130085A (ja) * | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Jsr株式会社 | 保存安定化剤、安定化方法、保存方法、添加剤、単離方法、及び回収効率改善剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019159944A1 (ja) | 2019-08-22 |
| JP7281092B2 (ja) | 2023-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5557450B2 (ja) | 測定対象成分の免疫測定法 | |
| EP2919011B1 (en) | Method and kit for measuring component to be assayed in specimen | |
| US20190376961A1 (en) | Method for Measuring Fibroblast Growth Factor-23 and Reagent Therefor | |
| JP7281092B2 (ja) | 試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キット | |
| JP2022058732A (ja) | 線維芽細胞増殖因子－２３の測定方法、測定試薬及び測定キット | |
| JP7201961B2 (ja) | 試料中のエクソソームの破壊方法及び破壊用試薬 | |
| JP2017142241A (ja) | 検体中のステロイドホルモンの測定方法 | |
| JP7084590B2 (ja) | 脂質異常症治療が必要な被検者の選別方法及び選別用試薬 | |
| JP2007225603A (ja) | 試料中の測定対象物の免疫測定方法および免疫測定試薬 | |
| JP5902714B2 (ja) | 検体中の測定対象物の連続的免疫測定法における非特異反応抑制方法 | |
| WO2017159473A1 (ja) | 慢性腎臓病患者における高リン血症の発症のしやすさを試験する方法 | |
| JP2015212237A (ja) | 新規ペプチドおよびその使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20200520 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20210602 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211208 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220914 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220926 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221214 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230413 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230426 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7281092 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |