CN113215138B - 一种热稳定性提高的蛋白酶k突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性提高的蛋白酶K突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明从林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)蛋白酶K分子结构入手，得热稳定性提高的突变体，将编码蛋白酶K野生型及其突变体基因与pPICZαA质粒连接构建重组表达载体，并将该重组表达载体转化至巴斯德毕赤酵母中构建重组工程菌进行异源分泌表达，采用高效的阳离子交换层析纯化蛋白即得野生型蛋白酶K(PRK‑WT)和突变型蛋白酶K(PRK‑T94Y、PRK‑7Y)，突变型蛋白酶在25℃、pH 6.0条件下保存12个月能够保留95％以上的活力。

Description

一种热稳定性提高的蛋白酶K突变体
技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的蛋白酶K突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
蛋白酶K是由林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)分泌的一种重要的丝氨酸蛋白酶，底物谱非常广泛且具有较高的蛋白水解活性。蛋白酶K不仅可用于生化实验，例如，在核酸提取中用于除去核酸中的DNA酶和RNA酶，在原位杂交中用于降解包围靶DNA的蛋白质、处理杂交前的样本，以提高检测的敏感性；还可以用于IVD生化检测试剂和分子诊断试剂。
早期商业化供应的蛋白酶K主要由林伯氏白色念球菌分泌获得。林伯氏白色念球菌生长缓慢，难以高密度培养，蛋白酶K的产量较低，林伯氏白色念球菌还会分泌其他的蛋白酶，增加了下游分离纯化的难度。后来罗氏诊断等公司利用毕赤酵母表达体系实现了蛋白酶K的分泌表达，提高了蛋白酶K的产量，降低了其纯化成本，同时提升了蛋白酶K的品质。
一般条件下，蛋白酶K使用的pH范围是7.5-9.0之间，在20-60℃之间蛋白酶K的活性都可以达到80％以上。蛋白酶K与其他蛋白酶的区别还在于该酶在含有Triton X-100、尿素、SDS、盐酸胍的环境中仍能稳定存在且具有活性，这一特性使它的应用很广泛。但野生型蛋白酶K在常温条件保存一年后，保留30-40％的活力。2020年新冠病毒爆发后，世界对用于分子诊断的蛋白酶K需求越来越大，野生型蛋白酶K在常温保存时的稳定性差导致其跨国低温长途运输成本很高。为了实现能够在常温长时间运输后酶活力保持不变，急需筛选出热稳定性大幅度提高的蛋白酶K。
现有改造蛋白酶K的方法主要是通过计算机的算法，将蛋白酶K氨基酸序列的一个或多个氨基酸进行取代后进行表征，再反馈给计算机算法，再形成变量集进行表征，再反馈给是计算机算法，如专利US8005620B2通过此方法筛选出了潜在24个氨基酸位点(N95C、P97S、S107D、S123A、E138A、M145F、Y151A、V167I、L180I、Y194S、A199S、K208H、A236V、R237N、P265S、V267I、S273T、G293A、L299C、I310K、K332R、S337N、P355S)。但经过国内外学者多年的验证，其中只有少数突变位点提高蛋白酶K的比活性，对进一步提高蛋白酶K热稳定性并无作用。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是现有的蛋白酶K在常温下保存一年之后，酶活仅能仅能保留30-40％。
[技术方案]
本发明提供一种蛋白酶K突变体，包括：信号肽、前导肽、成熟肽部分，是(a)或(b)或(c)：
(a)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，对第109位氨基酸进行了突变，
(b)在(a)的基础上，对前导肽经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有蛋白酶K活性的由(a)衍生的蛋白质；
(c)在(a)或(b)的基础上，成熟肽部分有97％序列同一性的、具有蛋白酶K活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质。
SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列来源于Tritirachium album Limber，其中，1-15位是信号肽序列(即MRLSVLLSLLPLALG)，16-105位是前导肽序列，106-384位是成熟肽序列。删除信号肽后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。前导肽在蛋白酶K酶原经转录翻译后在内质网处被切下，从而释放出蛋白酶K成熟肽。
在一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第109位苏氨酸突变为酪氨酸。
在一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第109位苏氨酸突变为酪氨酸、第166位酪氨酸突变为丙氨酸、第223位赖氨酸突变为组氨酸、第288位丝氨酸突变为苏氨酸、第308位甘氨酸突变为丙氨酸、第347位赖氨酸突变为精氨酸、第352位丝氨酸突变为天冬酰胺。
本发明提供一种蛋白酶K突变体，包括：前导肽、成熟肽部分，是下述(d)或(e)或(f)：
(d)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，对第94位氨基酸进行了突变，
(e)在(d)的基础上，对前导肽经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有蛋白酶K活性的由(d)衍生的蛋白质；
(f)在(d)或(e)的基础上，成熟肽部分有97％以上序列同一性的、具有蛋白酶K活性的由(d)或(e)衍生的蛋白质。
在一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，将第94位苏氨酸突变为酪氨酸。
在一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，将第94位苏氨酸突变为酪氨酸、第151位酪氨酸突变为丙氨酸、第208位赖氨酸突变为组氨酸、第273位丝氨酸突变为苏氨酸、第293位甘氨酸突变为丙氨酸、第332位赖氨酸突变为精氨酸、第337位丝氨酸突变为天冬酰胺。
本发明提供一种蛋白酶K突变体，包括：成熟肽部分，是下述(g)或(h)：
(g)在SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列的基础上，对第4位氨基酸进行了突变，
(h)在(g)的基础上，成熟肽部分有97％以上的相似度的、具有蛋白酶K活性的由(g)衍生的蛋白质。
在一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列的基础上，将第4位苏氨酸突变为酪氨酸。
在一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列的基础上，将第4位苏氨酸突变为酪氨酸、第61位酪氨酸突变为丙氨酸、第118位赖氨酸突变为组氨酸、第183位丝氨酸突变为苏氨酸、第203位甘氨酸突变为丙氨酸、第242位赖氨酸突变为精氨酸、第247位丝氨酸突变为天冬酰胺。
本发明还提供编码所述突变体(a)-(h)的基因。所述基因的核苷酸序列可以根据表达系统对密码子的偏好性进行优化。
在一种实施方式中，所述基因具有SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
本发明还提供携带所述蛋白酶K突变体成熟酶的多核苷酸序列。
本发明还提供携带所述蛋白酶K突变体基因的核酸构建体。
在一种实施方式中，所述核酸构建体为连接有蛋白酶K突变体基因的表达载体。
在一种实施方式中，所述表达载体上可含有表达元件，包括但不限于信号肽、启动子、复制子。
在一种实施方式中，所述表达载体可选：pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα或pPIC9K。
在一种实施方式中，所述表达载体为pPICZαA质粒。
在一种实施方式中，所述表达载体是将编码所述蛋白酶K突变体的基因连接至pPICZαA质粒的Eco RI和Not I之间构建获得的。
本发明还提供了包含上述重组表达载体的重组微生物细胞。
在一种实施方式中，所述微生物细胞包括细菌细胞或真菌细胞。
在一种实施方式中，所述细菌细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌；革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属；革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
在一种实施方式中，所述真菌细胞包括但不限于酵母细胞，例如毕赤酵母细胞、假丝酵母细胞、多型汉逊酵母细胞、球拟酵母细胞、裂殖酵母细胞和克鲁维酵母细胞。
在一种实施方式中，所述重组微生物以巴斯德毕赤酵母为宿主。
在一种实施方式中，所述重组微生物以毕赤酵母X-33为宿主。
在一种实施方式中，所述重组微生物以毕赤酵母X-33为宿主，以pPICZαA质粒为表达载体，表达SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
本发明还提供制备所述蛋白酶K突变体的方法，例如，使用本领域已知的定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等方法来制备本发明的蛋白酶K突变体。
本发明还提供利用重组微生物细胞表达蛋白酶K突变体的方法，是将所述重组微生物细胞在适宜的条件下繁殖并使其表达编码蛋白酶K突变体的基因，从而从重组微生物细胞培养物中分离得到蛋白酶K突变体。
在一种实施方式中，以巴斯德毕赤酵母X-33为宿主、以pPICZαA为表达载体，获得重组毕赤酵母，培养该重组毕赤酵母使其表达蛋白酶K突变体。进一步地，可将重组毕赤酵母接种至培养基中，培养至OD为5～10，用终浓度为5mL/L的甲醇在25℃诱导24～72h。进一步地，所述培养基含有微生物生长所必需的碳源、氮源和无机盐。进一步地，所述培养基为YP培养基或YPD培养基。进一步地，所述方法还对发酵液离心，收集上清液后纯化蛋白。
在一种实施方式中，纯化所述蛋白酶K突变体的树脂为Ni亲和层析树脂或阳离子交换层析树脂。
在一种实施方式中，所述纯化包括如下步骤：
①将重组毕赤酵母的发酵液上清液用赛多利斯(Sartorius)切向流超滤系统超滤浓缩至蛋白浓度为5mg/mL，并将蛋白所在的溶液体系置换成上样buffer；所述上样buffer含有10mM醋酸钠(NaAc),25mM NaCl,pH为5.0；
②将阳离子交换层析柱用上样buffer进行平衡；
③按1ml/min的流速进行蛋白上样，并收集流穿液；
④用洗杂液一进行洗杂，洗10个柱体积并且收集洗杂液；所述洗杂液一含有10mMNaAc,25mM NaCl，pH为5.0；
⑤用洗杂液二进行洗杂，洗10个柱体积并且收集洗杂液；所述洗杂液二含有10mMNaAc,50mM NaCl，pH为5.0；
⑥用洗脱液进行洗脱，洗脱5个柱体积，并收集洗脱液；所述洗脱液含有10mMNaAc,100mM NaCl,pH为5.0。
本发明还提供一种提高蛋白酶K热稳定性的方法，所述方法是将林伯氏白色念球菌来源的蛋白酶K成熟肽的第94位苏氨酸突变为酪氨酸；或者，第94位苏氨酸突变为酪氨酸、第151位酪氨酸突变为丙氨酸、第208位赖氨酸突变为组氨酸、第273位丝氨酸突变为苏氨酸、第293位甘氨酸突变为丙氨酸、第332位赖氨酸突变为精氨酸、第337位丝氨酸突变为天冬酰胺。
本发明还提供含有所述蛋白酶K突变体的组合物。
在一种实施方式中，所述组合物还含有酶的保护剂或用于延迟酶分解的物质。
本发明还提供蛋白酶K突变体在分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和/或肽键中的应用。例如，用于分子诊断试剂，特别适用于分子诊断的核酸提取步骤。
[有益效果]
(1)本发明将蛋白酶K突变体的与pPICZαA质粒连接，成功构建了重组表达载体pPICZαA-PRK；
(2)本发明将重组表达载体电转化至毕赤酵母感受态细胞中，成功构建用于蛋白酶K突变体和蛋白酶K野生型表达的基因工程菌；
(3)本发明提供的蛋白酶K突变体具有良好的pH稳定性：25℃下，在pH 4.5-10.5的pH范围内孵育16h都能保持85％以上的活力；
(4)本发明提供的蛋白酶K突变体具有很好的热稳定性，在25℃、pH 6.0条件下保存12个月，野生型、单突变体T94Y、组合突变体T94Y/Y151A/K208H/S273T/G293A/K332R/S337N(即PRK-7Y)突变体的残余酶活分别为33.7％，99.1％，95.3％；
(5)本发明提供的蛋白酶K突变体PRK-7Y相比野生型蛋白酶K，稳定性和比活力均有大幅度提高，蛋白比酶活大于45U/mg，60℃半衰期大于35min以上。
附图说明
图1：蛋白酶K重组表达载体示意图；
图2：突变体T94Y、T94Y/Y151A/K208H/S273T/G293A/K332R/S337N，野生型的比活性和半衰期的比较。
具体实施方式
技术术语
蛋白酶K：术语“蛋白酶K(proteinase K)”是指如酶命名法所定义的EC 3.4.21.14类中的酶。出于本发明的目的，根据具体实施方式中提及的方法确定蛋白酶K活性。在一方面，本发明的蛋白酶K突变体具有SEQ ID NO.1所示蛋白酶K活性的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，所述多核苷酸直接规定了蛋白酶K变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，所述可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
表达：术语“表达”包括涉及蛋白酶K或蛋白酶K突变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，所述分子包含编码本发明的蛋白酶K变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
改善的热稳定性：术语“改善的热稳定性”意指与相对于亲本蛋白酶K有所改善的蛋白酶K突变体的特征。
成熟肽：术语“成熟肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，本发明中所述成熟肽即为蛋白酶K成熟酶，是SEQ ID NO.8所示氨基酸序列。本领域中已知，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
突变体基因：意指编码突变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的蛋白酶K的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码所述蛋白酶K的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最基本地，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码本发明的蛋白酶K突变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
复制起点：术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
母本或母本蛋白酶K：术语“母本”或“母本蛋白酶K”意指进行改变以产生本发明的蛋白酶K突变体的蛋白酶K。本发明所述母本即SEQ ID NO.1所对应的氨基酸序列。所述母本蛋白酶K可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段，或者可以是合成产生的。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
稳定性：本发明的蛋白酶K变体的热稳定性可以表示为在暴露于不同测试条件期间或之后，所述蛋白酶K的残余活性或残余性能。可以相对于母本蛋白酶K(例如，如SEQ IDNO.1所示的母本蛋白酶K)的已知活性或性能。
突变体：意指具有蛋白酶K活性的、在一个或多个(例如若干个)位置包含改变(即取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的突变体母本具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的多肽氨基酸序列，并在SEQ ID NO.2第94位发生取代，所取代的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列；在此基础上，可同时发生第151、208、273、293、332和337位发生取代，例如将第151位酪氨酸突变为丙氨酸，并将第208位赖氨酸突变为组氨酸，并将第273位丝氨酸突变为苏氨酸，并将第293位甘氨酸突变为丙氨酸，并将第332位赖氨酸突变为精氨酸，并将第337位丝氨酸突变为天冬酰胺。本发明的蛋白酶K突变体的活性为母本蛋白酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。
野生型蛋白酶K：术语“野生型”蛋白酶K意指由见于自然界中的天然存在的微生物(如细菌、酵母或丝状真菌)表达的蛋白酶K。
取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置94处的苏氨酸突变为酪氨酸表示为“T94Y”。多个突变通过符号(“/”)分开，例如或“T94Y/Y151A/K208H/S273T/G293A/K332R/S337N”代表在第94位苏氨酸突变为酪氨酸、第151位酪氨酸突变为丙氨酸、第208位赖氨酸突变为组氨酸、第273位丝氨酸突变为苏氨酸、第293位甘氨酸突变为丙氨酸、第332位赖氨酸突变为精氨酸、第337位丝氨酸突变为天冬酰胺。
发酵液：“发酵液”是指由细胞发酵产生的、未经回收或经过回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。所述发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的内容物。例如，所述发酵液包含被微生物利用后的培养基成分以及可通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)后存在的细胞碎片。
下述实施方式所涉及的序列：
林伯氏白色念球菌来源的野生型蛋白酶K的完整蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，序列第1到15位氨基酸为该蛋白的信号肽序列，第16到105位氨基酸为前导肽序列，第106到384位氨基酸是成熟肽序列，前导肽在蛋白酶K酶由核糖体转录翻译后在内质网处被切下，从而释放出蛋白酶K成熟肽。
不含有信号肽的蛋白酶K的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
不含有信号肽、前导肽的蛋白酶K的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
根据毕赤酵母密码子偏好性优化的编码SEQ ID NO.2所示蛋白酶K的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在SEQ ID NO.2所示蛋白酶K的基础上将第94位苏氨酸突变为酪氨酸的蛋白酶K突变体T94Y的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码该突变T94Y的基因的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
在SEQ ID NO.2所示蛋白酶K的基础上将第94位苏氨酸突变为酪氨酸、第151位酪氨酸突变为丙氨酸，并将第208位赖氨酸突变为组氨酸，并将第273位丝氨酸突变为苏氨酸，并将第293位甘氨酸突变为丙氨酸，并将第332位赖氨酸突变为精氨酸，并将第337位丝氨酸突变为天冬酰胺的蛋白酶K突变体T94Y/Y151A/K208H/S273T/G293A/K332R/S337N(简写为PRK-7Y)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码该突变体PRK-7Y的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在SEQ ID NO.2所示蛋白酶K的基础上，为了将第94位苏氨酸突变为其他氨基酸设计的引物如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:22所示。
下述实施方式所涉及的培养基
YPD培养基(g/L)：酵母浸提物10，蛋白胨20，葡萄糖20。
YP培养基(g/L)：酵母浸提物10，蛋白胨20。
蛋白酶K活性的测定方法
(1)酶活定义
单位酶活定义为：在37℃、pH 8.0条件下，每分钟水解酪蛋白生成1μmol酪氨酸所需的酶量；
(2)试剂准备
试剂I：即底物：1％牛奶乳酪蛋白溶液。将1g牛奶乳酪蛋白溶于50mL 0.1M pH 8.0的磷酸钠盐溶液，于65-70℃水域孵育15min搅拌溶解，自来水冷却，用氢氧化钠调节pH8.0，定容100mL。
试剂II：即TCA溶液：0.1M三氯乙酸、0.2M乙酸钠，0.3M乙酸。将1.64g三氯乙酸、1.64g乙酸钠、1.724mL乙酸混合，用HCl调节pH 4.03，定容100mL。
试剂III：即0.4M碳酸钠溶液。将4.24g碳酸钠溶解于100mL水中。
试剂IV：用水5倍稀释的福林酚试剂。
试剂V：酶稀释液：0.1M磷酸钠盐溶液，pH 8.0。
试剂VI：酪氨酸溶液：1μg/mL酪氨酸，0.2M HCI溶解。
(3)酶活测定
①0.5mL试剂I，于37℃孵育10min，加入0.5mL酶液，混匀，37℃反应10min；
②加入1mL试剂II终止反应，混匀，继续孵育30min；
③离心反应液；
④取0.5mL上清液，加入2.5mL 0.4M试剂III，0.5mL试剂IV，混匀后37℃孵育30min；
⑤660nm测定OD 1；空白对照组：0.5mL试剂V代替酶液，测定OD 2；
⑥0.5mL试剂VI，2.5mL试剂III，0.5mL试剂IV，混匀后37℃孵育30min。660nm测定OD 3；空白对照组：0.5mL 0.2M HCI代替试剂VI，测值为OD 4。
酶活计算公式为：
Figure BDA0003097736180000091
Weight activity(U/mg)＝Volume activity×1/C
2：反应液总体积(mL)；
0.5：酶液体积(mL)；
10：反应时间(min)；
df：稀释倍数；
181.2：酪氨酸分子量；
C：酶浓度(mg/mL)。
(4)蛋白酶K的半衰期的测定
取20mM磷酸钠缓冲液，加入实施例4中得到的浓度为1mg/mL的酶液分别置于60℃温度下水浴0min、20min、40min、60min、80min，测定残留酶活。制作孵育时间和残余酶活的曲线，并计算出半衰期。
多核苷酸的实施方式
本发明提供了编码蛋白酶K的分离的多核苷酸。在某些方面，本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体。在某些方面，本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的表达载体。在某些方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些方面，本发明还涉及产生蛋白酶K的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述蛋白酶K的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收所述蛋白酶K。
核酸构建体的实施方式
本发明还涉及包含编码本发明的蛋白酶K的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸的核酸构建体，所述一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
可选地，可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供蛋白酶K的表达。本领域技术人员可根据需要在多核苷酸插入载体之间对控制序列进行合适的操作，利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的操作。
可选地，控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达所述多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导蛋白酶K变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
表达载体的实施方式
本发明还涉及包含编码本发明的蛋白酶K的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包括一个或多个合适的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码蛋白酶K变体的多核苷酸。可选地，可以通过将多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的载体中以表达所述多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，可使编码序列与控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可经重组DNA操作方法制备获得的的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择可取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可选地，载体可以在被引入宿主细胞中后被整合到基因组中，并与其整合的一个或多个染色体一起复制。
可选地，载体具有便于选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
可选地，载体含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中，或在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
可选地，为了自主复制，载体还可以包含复制起点。所述复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含所述基因的质粒或载体的构建。
可选地，可以将多个拷贝的蛋白酶K突变体的多核苷酸插入宿主细胞中以增加蛋白酶K突变体的产生。或将多核苷酸序列整合到宿主细胞基因组中的多拷贝位点以增加的拷贝数目。
在上述实施方式中，用于连接以上所述的元件来构建本发明的重组表达载体的方法或操作均是本领域普通技术人员熟知的。
宿主细胞的实施方式
宿主细胞可以是能够用于蛋白酶K重组生产的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
蛋白酶K的生产方法
本发明还涉及生产本发明的蛋白酶K的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述蛋白酶K的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收所述蛋白酶K。
使用本领域已知的方法在适合于产生蛋白酶K的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许蛋白酶K表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。如果蛋白酶K变体被分泌到营养介质中，则所述蛋白酶K可以直接从培养基中回收。如果蛋白酶K没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
可以使用本领域已知的对蛋白酶K特异的方法检测蛋白酶K。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。
可以使用本领域已知的方法回收蛋白酶K。例如，可以通过常规程序从营养介质中回收蛋白酶K，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化蛋白酶K以获得基本上纯的蛋白酶K，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取。
在可替代的方面，没有回收蛋白酶K，而是将表达蛋白酶K的本发明的宿主细胞用作所述蛋白酶K的来源。
发酵液配制品或细胞组合物的实施方式
本发明还涉及包含本发明的蛋白酶K多肽的发酵液配制品或细胞组合物。所述发酵液产物进一步包含在发酵过程产生的成分，例如细胞(包括含有编码本发明的突变体基因的宿主细胞)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、灭活或失活了的细胞和/或细胞碎片以及灭菌后的全培养液。
在一些实施例中，发酵液含有被细胞利用后的培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一些实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含发酵过程代谢产生的第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且所述第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。
在一方面，组合物含有一种或多种酶的保护剂或延迟酶分解的物质。
在一些实施例中，这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。
如本文所述的全培养液或细胞组合物通常以液体形式存在，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
组合物的实施方式
本发明还涉及包括本发明的蛋白酶K的组合物。
这些组合物可以包含本发明的蛋白酶K作为主要酶组分，例如，单组分组合物。可替代地，组合物可以包含多种酶活性，例如选自由以下组成的组的一种或多种(例如，若干种)酶：蛋白酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶。
实施例1：蛋白酶突变位点的确定
根据蛋白酶K三维晶体结构，通过理性设计，确定SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第94位氨基酸作为关键位点。本发明通过结构辅助的Consensus Concept方法设计了蛋白酶K的单点突变体，获得热稳定性显著提高的蛋白酶K突变体。Consensus Concept理论可以总结为：在某蛋白质的同源序列比对结果中，某一位点出现频率较高的氨基酸残基有利于该蛋白质的热稳定化；如果待改造蛋白质该位点不是此氨基酸残基，则可以考虑将该位点突变成该氨基酸残基以提升其热稳定性；由各个位点出现频率最高的氨基酸组成的蛋白质序列称为该蛋白家族的consensus sequence，一般认为与祖先序列最为接近，因此具有较好的热稳定性。将已有的蛋白酶K结构信息和统计信息结合到Consensus Concept中来，在筛选突变位点及突变方式时考虑以下因素：①氨基酸残基是否位于蛋白质表面，②氨基酸残基是否远离活性中心、底物或辅基结合位点，③突变是否破坏现有螺旋、氢键、盐桥，④突变是否能引入新的作用力形式等，使得Consensus Concept的应用成功率超过50％。即基于三维结构的Consensus Concept理论。具体步骤如下：
①在NCBI数据库中其中Blast(Basic Local Alignment Search Tool)工具中搜索和蛋白酶K氨基酸序列相似度高于30％的所有序列，并删除重复序列；
②同源比对结果显示及Consensus Sequence生成：
进入Pfam数据库主页(http://pfam.xfam.org/)，在SEQUENCE SEARCH工具中输入蛋白酶K的氨基酸序列进行搜索。服务器直接反馈该蛋白整个家族的氨基酸序列比对结果，并将各个位点的各类氨基酸丰度以柱状图形式显示；该网站也可以自动生成该蛋白家族的consensus sequence；
使用Clustalx软件完成多序列比对工作，并通过ESPript 3.0在线软件完成结果显示consensus sequence；
通过Consensus Maker v2.0.0软件可以在线生成文本形式的consensussequence；
③蛋白酶K氨基酸序列提交至SWISS-MODEL服务器，通过Similarity Searches功能查找与该序列同源性较高且具有已知结构的蛋白质序列作为同源建模的模板。将目的蛋白序列和同源结构的pdb文件提交至ESyPred3D Web Server 1.0服务器，调整参数设置，根据能量最小原理，完成同源建模，以pdb文件形式输出目的蛋白酶K的建模结构；
④蛋白酶K的建模结构用Discovery Studio或PyMOL软件分析步骤②中的consensus sequence，筛选出位于蛋白质表面且氨基酸远离活性中心和辅酶结合位点，并且该位点处的氨基酸和蛋白酶K原序列有较大的理化性质差异，如电荷差异、极性强弱、空间位阻大小等；
结果分析：Consensus Sequence结果显示蛋白酶K的94位氨基酸在丝氨酸蛋白酶中为酪氨酸的概率达到87.3％；经过同源建模显示蛋白酶K的94位苏氨酸远离活性中心和Ca2+结合中心，并且T94位于蛋白酶K的外表面，苏氨酸突变为酪氨酸可能增加了与附近氨基酸之前的氢键。
实施例2：携带编码蛋白酶K突变体的核苷酸序列的重组表达载体的构建
如实施例1所述，确定以SEQ ID NO.2所示序列为基础，设计如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4所示的突变体，即：单突变体T94Y、组合突变体T94Y/Y151A/K208H/S273T/G293A/K332R/S337N，具体步骤如下：
将SEQ ID NO.2的氨基酸序列进行反转录后按照毕赤酵母密码子进行优化得到核苷酸序列SEQ ID NO.5；将SEQ ID NO.3的氨基酸序列进行反转录后按照毕赤酵母密码子进行优化得到核苷酸序列SEQ ID NO.6；将SEQ ID NO.4的氨基酸序列进行反转录后按照毕赤酵母密码子进行优化得到核苷酸序列SEQ ID NO.7；分别将SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7插入到pPICZαA载体的EcoR I和Not I之间即形成野生型蛋白酶K和突变体蛋白酶K的重组表达载体。
如图1所示，PRK表示SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的序列，插入到pPICZαA载体的EcoR I和Not I酶切位点之间形成重组表达载体。
实施例3表达蛋白酶K突变体的重组微生物细胞的构建
将实施例2构建的重组表达载体经过BglII线性化后，通过电转化的方式转化到毕赤酵母中，获得表达蛋白酶K野生型和突变体的重组菌株，分别命名为PRK-WT(用于表达野生型蛋白酶K)、PRK-T94Y(用于表达突变体T94Y)、PRK-7Y(用于表达组合突变体T94Y/Y151A/K208H/S273T/G293A/K332R/S337N)，其表达出的蛋白酶K的蛋白质的氨基酸酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
实施例4：蛋白酶K的表达
将实施例3构建的重组工程菌接种于含20mL YPD液体培养基的试管中，于30℃，培养24h至菌浓为OD600＝5-10；将培养物以体积比1:100的比例接种于含100mL YPD液体培养基的锥形瓶中，30℃振荡培养24h至菌浓为OD600＝35-40；将培养物静置3-4h后，倒掉上清液后用100mL YP液体培养基重悬；加入0.5％(v/v)甲醇，25℃诱导表达24h-72h，每隔24h向培养基中加入0.5％(v/v)甲醇进行诱导；4℃，5000rpm，离心5min，收集离心上清。
用阳离子交换层析进行蛋白酶K的纯化，步骤如下：①将离心收集得到的发酵离心上清液进行超滤浓缩蛋白浓度为5mg/mL，并且上样缓冲液(上样缓冲液：10mM NaAC,25mMNaCl,pH5.0)进行置换；②将阳离子交换层析柱用上样缓冲液进行平衡；③按1ml/min的流速进行蛋白上样，并收集流穿液；④用洗杂液一(10mM NaAC、25mM NaCl、pH5.0)进行洗杂，洗10个柱体积并且收集洗杂液；⑤用洗杂液二(10mM NaAC、50mM NaCl、pH5.0)进行洗杂，洗10个柱体积并且收集洗杂液；⑥用洗脱液(10mM NaAC、100mM NaCl、pH5.0)进行洗脱，洗脱5个柱体积，并收集洗脱液，即得纯化后的酶；⑦用洗柱液(10mM NaAC、500mM NaCl、pH5.0)冲洗，冲洗10个柱体积；⑧10倍柱体积的超纯水进行冲洗层析柱；⑨20％的乙醇保存阳离子交换层析柱。
蛋白酶K突变体和蛋白酶K野生型的比活力和半衰期的比较
检测SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示序列的突变体和SEQ ID NO.2所示序列的野生型蛋白酶K的比酶活和半衰期，结果如表1所示。
表1各突变体和野生型比酶活和半衰期的比较
Figure BDA0003097736180000151
对比例1：
设计SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:22所示的引物，以重组质粒pPICZαA-PRK-WT为模板进行全质粒PCR，得到相应的突变体质粒，将第94位苏氨酸突变为其他氨基酸。将重组质粒参照实施例3、4的方法转入宿主并表达得到蛋白酶K突变体。测定突变体的比酶活和半衰期，结果如表2所示。
PRK-T94G-F:GCTCAAGGTAACGCCCCTTGGGGTCTT(SEQ ID NO:9)
PRK-T94G-R:GGCGTTACCTTGAGCAGCGTTGATAGT(SEQ ID NO:10)
PRK-T94S-F:GCTCAATCTAACGCCCCTTGGGGTCTT(SEQ ID NO:11)
PRK-T94S-R:GGCGTTAGATTGAGCAGCGTTGATAGT(SEQ ID NO:12)
PRK-T94A-F:GCTCAAGCTAACGCCCCTTGGGGTCTT(SEQ ID NO:13)
PRK-T94A-R:GGCGTTAGCTTGAGCAGCGTTGATAGT(SEQ ID NO:14)
PRK-T94R-F:GCTCAAAGAAACGCCCCTTGGGGTCTT(SEQ ID NO:15)
PRK-T94R-R:GGCGTTTCTTTGAGCAGCGTTGATAGT(SEQ ID NO:16)
PRK-T94E-F:GCTCAAGAAAACGCCCCTTGGGGTCTT(SEQ ID NO:17)
PRK-TT94E-R:GGCGTTTTCTTGAGCAGCGTTGATAGT(SEQ ID NO:18)
PRK-T94F-F:GCTCAATTCAACGCCCCTTGGGGTCTT(SEQ ID NO:19)
PRK-T94F-R:GGCGTTGAATTGAGCAGCGTTGATAGT(SEQ ID NO:20)
PRK-T94W-F:GCTCAATGGAACGCCCCTTGGGGTCTT(SEQ ID NO:21)
PRK-T94W-R:GGCGTTCCATTGAGCAGCGTTGATAGT(SEQ ID NO:22)
表2
94位氨基酸 突变体名称 比酶活(U/mg) 60℃孵育的半衰期(min)
T PRK-WT 29.8 10.8
Y PRK-T94Y 31.3 42.6
G PRK-T94G 9.2 -
S PRK-T94S 5.6 -
A PRK-T94A 15.7 10.9
R PRK-T94R 10.4 -
E PRK-T94E 29.7 30.2
F PRK-T94F 26.9 35.7
W PRK-T94W 20.3 29.9
注：“-”表示蛋白极容易沉淀无法测出蛋白半衰期
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉瀚海新酶生物科技有限公司
<120> 一种热稳定性提高的蛋白酶K突变体
<130> BAA210664A
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 384
<212> PRT
<213> Tritirachium album Limber
<400> 1
Met Arg Leu Ser Val Leu Leu Ser Leu Leu Pro Leu Ala Leu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala Arg
20 25 30
Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly Ser
35 40 45
Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys Pro
50 55 60
Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu Asp
65 70 75 80
Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr Ile
85 90 95
Glu Gln Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gln Thr Asn Ala Pro
100 105 110
Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr Tyr
115 120 125
Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile Asp
130 135 140
Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gln Met
145 150 155 160
Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
165 170 175
His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys
180 185 190
Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly Gln
195 200 205
Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp Phe Val Ala Ser Asp Lys Asn
210 215 220
Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly
225 230 235 240
Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ser Ser
245 250 255
Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg
260 265 270
Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Ser
275 280 285
Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu
290 295 300
Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly
305 310 315 320
Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala
325 330 335
Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly Lys Thr Thr Ala Ala Ser
340 345 350
Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn
355 360 365
Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln Ala
370 375 380
<210> 2
<211> 369
<212> PRT
<213> Tritirachium album Limber
<400> 2
Ala Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys
35 40 45
Pro Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu
50 55 60
Asp Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Gln Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gln Thr Asn Ala
85 90 95
Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile
115 120 125
Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gln
130 135 140
Met Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg Asp Gly Asn Gly His Gly
145 150 155 160
Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys
165 170 175
Lys Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly
180 185 190
Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp Phe Val Ala Ser Asp Lys
195 200 205
Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly
210 215 220
Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ser
225 230 235 240
Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala
245 250 255
Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala
260 265 270
Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val
275 280 285
Leu Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly
290 295 300
Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val
305 310 315 320
Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly Lys Thr Thr Ala Ala
325 330 335
Ser Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser
340 345 350
Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln
355 360 365
Ala
<210> 3
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ala Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys
35 40 45
Pro Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu
50 55 60
Asp Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Gln Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gln Tyr Asn Ala
85 90 95
Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile
115 120 125
Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gln
130 135 140
Met Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg Asp Gly Asn Gly His Gly
145 150 155 160
Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys
165 170 175
Lys Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly
180 185 190
Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp Phe Val Ala Ser Asp Lys
195 200 205
Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly
210 215 220
Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ser
225 230 235 240
Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala
245 250 255
Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala
260 265 270
Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val
275 280 285
Leu Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly
290 295 300
Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val
305 310 315 320
Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly Lys Thr Thr Ala Ala
325 330 335
Ser Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser
340 345 350
Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln
355 360 365
Ala
<210> 4
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ala Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys
35 40 45
Pro Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu
50 55 60
Asp Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Gln Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gln Tyr Asn Ala
85 90 95
Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile
115 120 125
Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gln
130 135 140
Met Val Lys Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Asp Gly Asn Gly His Gly
145 150 155 160
Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys
165 170 175
Lys Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly
180 185 190
Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp Phe Val Ala Ser Asp His
195 200 205
Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly
210 215 220
Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ser
225 230 235 240
Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala
245 250 255
Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala
260 265 270
Thr Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val
275 280 285
Leu Asp Ile Phe Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly
290 295 300
Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val
305 310 315 320
Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly Arg Thr Thr Ala Ala
325 330 335
Asn Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser
340 345 350
Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln
355 360 365
Ala
<210> 5
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctccagctg ttgaacaacg atctgaggct gctccattga tcgaagctag aggtgaaatg 60
gtcgccaaca agtacatcgt caagttcaaa gagggttccg ctttgtctgc tttggacgct 120
gctatggaaa aaatctctgg taagccagac cacgtctaca agaacgtttt ctctggtttc 180
gctgctaccc tggacgagaa catggttaga gttttgagag cccatccaga cgtcgagtac 240
attgaacaag acgccgttgt tactatcaac gctgctcaaa ctaacgcccc ttggggtctt 300
gctagaattt cttctacttc cccaggtact tccacctact actacgatga atctgctggt 360
cagggttcct gtgtttacgt tatcgacact ggtatcgagg cttctcaccc agaatttgaa 420
ggtagagccc agatggtcaa gacttactac tactcctcca gagatggtaa cggtcacggt 480
actcattgtg ctggtactgt tggttccaga acttacggtg ttgccaagaa aacccagctg 540
ttcggtgtta aggttctgga cgataacggt tccggtcagt actccactat tatcgctggt 600
atggacttcg ttgcctccga caagaacaac agaaactgtc caaagggtgt tgtcgcctct 660
ttgtctcttg gtggtggtta ctcttcttcc gttaactctg ctgctgctag attgcagtcc 720
tccggtgtta tggttgctgt tgctgctggt aacaacaacg ctgacgctag aaactactct 780
ccagcttctg aaccatccgt ctgtacagtt ggtgcttctg acagatacga cagaagatcc 840
tccttctcca actacggttc cgtcttggat attttcggtc ctggaacttc catcctgtcc 900
acttggattg gtggttccac tagatccatt tccggtactt ctatggctac tccacacgtt 960
gctggattgg ctgcttactt gatgactctg ggtaagacta ctgctgcttc cgcctgtaga 1020
tatatcgctg acactgctaa caagggtgac ctgtccaaca ttccattcgg tactgttaac 1080
ctgctggcct acaacaacta ccaagct 1107
<210> 6
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctccagctg ttgaacaacg atctgaggct gctccattga tcgaagctag aggtgaaatg 60
gtcgccaaca agtacatcgt caagttcaaa gagggttccg ctttgtctgc tttggacgct 120
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ggtagagccc agatggtcaa gacttactac tactcctcca gagatggtaa cggtcacggt 480
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ttcggtgtta aggttctgga cgataacggt tccggtcagt actccactat tatcgctggt 600
atggacttcg ttgcctccga caagaacaac agaaactgtc caaagggtgt tgtcgcctct 660
ttgtctcttg gtggtggtta ctcttcttcc gttaactctg ctgctgctag attgcagtcc 720
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ccagcttctg aaccatccgt ctgtacagtt ggtgcttctg acagatacga cagaagatcc 840
tccttctcca actacggttc cgtcttggat attttcggtc ctggaacttc catcctgtcc 900
acttggattg gtggttccac tagatccatt tccggtactt ctatggctac tccacacgtt 960
gctggattgg ctgcttactt gatgactctg ggtaagacta ctgctgcttc cgcctgtaga 1020
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ctgctggcct acaacaacta ccaagct 1107
<210> 7
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gctccagctg ttgaacaacg atctgaggct gctccattga tcgaagctag aggtgaaatg 60
gtcgccaaca agtacatcgt caagttcaaa gagggttccg ctttgtctgc tttggacgct 120
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actcattgtg ctggtactgt tggttccaga acttacggtg ttgccaagaa aacccagctg 540
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tatatcgctg acactgctaa caagggtgac ctgtccaaca ttccattcgg tactgttaac 1080
ctgctggcct acaacaacta ccaa 1104
<210> 8
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ala Ala Gln Thr Asn Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr
1 5 10 15
Ser Pro Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly
20 25 30
Ser Cys Val Tyr Val Ile Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu
35 40 45
Phe Glu Gly Arg Ala Gln Met Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg
50 55 60
Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg
65 70 75 80
Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu
85 90 95
Asp Asp Asn Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp
100 105 110
Phe Val Ala Ser Asp Lys Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val
115 120 125
Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala
130 135 140
Ala Ala Arg Leu Gln Ser Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly
145 150 155 160
Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser
165 170 175
Val Cys Thr Val Gly Ala Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe
180 185 190
Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile
195 200 205
Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser
210 215 220
Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu
225 230 235 240
Gly Lys Thr Thr Ala Ala Ser Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala
245 250 255
Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu
260 265 270
Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln Ala
275
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gctcaaggta acgccccttg gggtctt 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggcgttacct tgagcagcgt tgatagt 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gctcaatcta acgccccttg gggtctt 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggcgttagat tgagcagcgt tgatagt 27
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gctcaagcta acgccccttg gggtctt 27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggcgttagct tgagcagcgt tgatagt 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gctcaaagaa acgccccttg gggtctt 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggcgtttctt tgagcagcgt tgatagt 27
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gctcaagaaa acgccccttg gggtctt 27
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggcgttttct tgagcagcgt tgatagt 27
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gctcaattca acgccccttg gggtctt 27
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggcgttgaat tgagcagcgt tgatagt 27
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gctcaatgga acgccccttg gggtctt 27
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggcgttccat tgagcagcgt tgatagt 27

Claims (9)

1.一种蛋白酶K突变体，包括：前导肽、成熟肽部分，其特征在于，所述突变体是在SEQID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，将第94位苏氨酸突变为酪氨酸；
或者，将第94位苏氨酸突变为谷氨酸，
或者，将第94位苏氨酸突变为苯丙氨酸，
或者，将第94位苏氨酸突变为色氨酸，
或者，将第94位苏氨酸突变为酪氨酸、第151位酪氨酸突变为丙氨酸、第208位赖氨酸突变为组氨酸、第273位丝氨酸突变为苏氨酸、第293位甘氨酸突变为丙氨酸、第332位赖氨酸突变为精氨酸和第337位丝氨酸突变为天冬酰胺。
2.编码权利要求1所述蛋白酶K突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的核酸构建体。
4.一种重组毕赤酵母，其特征在于，以毕赤酵母为宿主，表达权利要求1所述的蛋白酶K突变体。
5.产生权利要求1所述蛋白酶K突变体的方法，其特征在于，将重组微生物细胞在适宜的条件下繁殖并使其表达编码蛋白酶K突变体的基因，从而从重组微生物细胞培养物中分离得到蛋白酶K突变体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将权利要求4所述的重组毕赤酵母在培养基中培养，用诱导剂诱导蛋白酶K的表达。
7.含有权利要求1所述的蛋白酶K突变体的组合物。
8.一种提高蛋白酶K热稳定性的方法，其特征在于，将第94位苏氨酸突变为酪氨酸；
或者，将第94位苏氨酸突变为谷氨酸，
或者，将第94位苏氨酸突变为苯丙氨酸，
或者，将第94位苏氨酸突变为色氨酸，
或者，将第94位苏氨酸突变为酪氨酸、第151位酪氨酸突变为丙氨酸、第208位赖氨酸突变为组氨酸、第273位丝氨酸突变为苏氨酸、第293位甘氨酸突变为丙氨酸、第332位赖氨酸突变为精氨酸和第337位丝氨酸突变为天冬酰胺。
9.权利要求1所述的蛋白酶K突变体在分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和/或肽键中的应用，其特征在于，用于制备分子诊断试剂或用于分子诊断的核酸提取步骤。
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