PL244825B1 - Mutant proteinazy K Tritirachium album i jej zymogenu, plazmid ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i sposób wytwarzania dojrzałej formy mutanta proteinazy K - Google Patents

Mutant proteinazy K Tritirachium album i jej zymogenu, plazmid ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i sposób wytwarzania dojrzałej formy mutanta proteinazy K Download PDF

Info

Publication number
PL244825B1
PL244825B1 PL439656A PL43965621A PL244825B1 PL 244825 B1 PL244825 B1 PL 244825B1 PL 439656 A PL439656 A PL 439656A PL 43965621 A PL43965621 A PL 43965621A PL 244825 B1 PL244825 B1 PL 244825B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ala
sequence
proteinase
ser
gly
Prior art date
Application number
PL439656A
Other languages
English (en)
Other versions
PL439656A1 (pl
Inventor
Robert Brodzik
Arkadiusz Popinigis
Justyna LEIBNER-CISZAK
Justyna Leibner-Ciszak
Dominik Ziętkowski
Krzysztof Kur
Original Assignee
Blirt Spolka Akcyjna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Blirt Spolka Akcyjna filed Critical Blirt Spolka Akcyjna
Priority to PL439656A priority Critical patent/PL244825B1/pl
Priority to PCT/PL2022/050084 priority patent/WO2023096513A1/en
Publication of PL439656A1 publication Critical patent/PL439656A1/pl
Publication of PL244825B1 publication Critical patent/PL244825B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21064—Peptidase K (3.4.21.64)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast

Abstract

W niniejszym zgłoszeniu ujawniono mutanta zymogenu proteinazy K z Tritirachium album zawierającego mutację zwiększającą wydajność ekspresji w komórkach drożdżowych oraz ułatwiającą dezaktywację dojrzałej proteinazy K w warunkach stresowych oraz sposób jego otrzymywania.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są mutant proteinazy K Tritirachium album i jej zymogenu, plazmid ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i sposób wytwarzania dojrzałej formy mutanta proteinazy K.
Proteinaza K (E.C. 3.4.21.64), proteaza serynowa, jest enzymem proteolitycznym syntetyzowanym przez komórki pleśni Tritirachium album (Engyodontium album) ATCC 22625. Jej analogi znaleźć można także w komórkach bakterii np. Serratia sp., Pseudoalteromonas sp., Alteromonas sp., Thermus sp., Vibrio sp. i in.
W zależności od źródła, z którego pochodzą, enzymy te różnią się masą cząsteczkową, długością domeny C-terminalnej, wartościami optymalnej temperatury i pH działania, a także zapotrzebowaniem na jony metali niezbędne dla aktywności enzymu lub/i stabilizowania jego struktury. Aktywność enzymów z rodziny proteinaz K zazwyczaj wzrasta, gdy w buforze reakcyjnym znajdują się czynniki denaturujące jak SDS czy mocznik. Jony wapnia zabezpieczają natomiast proteinazę K przed autoprotolizą.
Enzymy te posiadają zdolność katalizowania reakcji hydrolizy wiązań peptydowych, wykazując przy tym szerokie spektrum substratowe, dlatego wykorzystuje się je głównie w procesach izolacji DNA i innych zastosowaniach biologii molekularnej, jak również w przypadku usuwania zanieczyszczeń białkowych z materiałów niebiałkowych.
Proteinaza K jest znanym od dawna enzymem, izolowanym z płynu pohodowlanego pleśni Tritirachium album. Proces produkcji jest jednak długotrwały i charakteryzuje się niską wydajnością produkcji na 1 litr płynu pohodowlanego. Podjęto również próby konstrukcji bakteryjnych układów ekspresyjnych umożliwiających produkcję proteinazy K w postaci ciał inkluzyjnych, lecz problem renaturacji białka uniemożliwił otrzymanie jego znacznych ilości (Gunkel, F. A. and Gassen, H. G. (1989) Eur. J. Biochem. Vol. 179(1), 185-194; Samal, B. B. et al. (1996) Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 379, 95-104).
Z patentu EP1360283 znana jest także metoda produkcji proteinazy K w układach drożdżowych, w postaci fuzji translacyjnej zymogenu z peptydem sygnalnym alfa faktora Saccharomyces cerevisiae. W tym przypadku autokatalityczna aktywacja zymogenu do formy aktywnej białka następuje w czasie sekrecji lub w płynie pohodowlanym, lecz może również następować przedwcześnie przez co nie jest procesem ściśle kontrolowanym.
Z patentu PL 213045 znany jest mutant zymogenu proteinazy K z Tritirachium album zawierający sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez proteazę Kex2 umieszczoną pomiędzy propeptydem, a sekwencją białka o aktywności dojrzałej proteinazy K. Taka modyfikacja zymogenu, (tj. nieaktywnej enzymatycznie formy białka) prowadząca do kontrolowanego odcinania propeptydu (tj. części białka pełniącego rolę wewnętrznego czaperonu) w komórkach drożdży i uzyskania dojrzałej formy proteinazy K lub jej mutanta (tj. białka o aktywności dojrzałej proteinazy K) umożliwia wydajną produkcję enzymu w gospodarzu drożdżowy, w szczególności komórkach rekombinantowego szczepu Pichia pastoris.
Pomimo znanych rozwiązań, nadal poszukuje się nowych, wydajnych układów pozwalających na efektywną i tanią biosyntezę enzymów z rodziny proteineaz K. Od bardzo wielu lat trwają prace nad konstrukcją układu pozwalającego na wydajną biosyntezę i łatwą izolację enzymu posiadającego aktywność proteinazy K. Celem wynalazku jest dostarczenie takiego układu pozwalającego na wydajną produkcję białka o aktywności proteinazy K oraz nowych mutantów proteinazy K, które mogą być wykorzystane dla uzyskania takiego pożądanego układu.
Kolejnym celem wynalazku jest uzyskanie nowego białka o aktywności proteolitycznej zbliżonej do aktywności proteinazy K, które będzie jednak mogło być łatwo inaktywowane w celu uniknięcia niepożądanej aktywności proteolitycznej mieszaniny reakcyjnej uzyskiwanej po zakończeniu reakcji proteolizy. W przypadku wykorzystywania proteinazy K jako odczynnika mającego za zadanie usunięcie wszelkich białek, np. w trakcie oczyszczania kwasów nukleinowych, pozostawanie w końcowym produkcie zanieczyszczenia enzymem o aktywność proteinazy jest bardzo niepożądane. Dlatego uzyskanie białka poddającego się łatwiejszej inaktywacji niż dzika proteinaza K jest bardzo pożądane.
Nieoczekiwanie określony powyżej złożony efekt techniczny został osiągnięty w niniejszym wynalazku.
Nieoczekiwanie określony powyżej cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest mutant zymogenu proteinazy K z Tritirachium album zawierający na C-końcu mutację zwiększającą wydajność ekspresji w komórkach drożdżowych oraz ułatwiającą dezaktywację dojrzałej proteinazy K w warunkach stresowych, przy czym mutacją tą jest dodatkowa reszta Gly znajdująca się na C-końcu.
Korzystnie, mutant zymogenu proteinazy K z Tritirachium album według wynalazku posiada sekwencję przedstawioną jako sekwencja nr 9.
Nieoczekiwanie, zaproponowana w wynalazku modyfikacja zymogenu zwiększa wydajność produkcji enzymu w komórkach drożdżowych, zwłaszcza Pichia pastoris zgodnie z opisanym przykładem 9.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest mutant dojrzałej proteinazy K z Tritirachium album zawierający na C-końcu mutację zwiększająca wydajność ekspresji w komórkach drożdżowych oraz ułatwiającą dezaktywację dojrzałej proteinazy K w warunkach stresowych, przy czym mutacją tą jest dodatkowa reszta Gly znajdująca się na C-końcu. Korzystnie, posiada on sekwencję przedstawioną jako sekwencję nr 22.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA zawierająca sekwencję kodującą mutanta zymogenu proteinazy K według wynalazku jak zdefiniowano powyżej albo jego fragment. Korzystnie, posiada ona sekwencję nr 8.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja oligonukleotydów o symbolach ProtK-G-F i ProtK-G-R służących do otrzymywania sekwencji DNA kodującej mutanta zymogenu proteinazy K według wynalazku zdefiniowanego powyżej albo jego fragment wybrana spośród sekwencji: sekwencja nr 6 i 7.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest plazmid ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą mutanta zymogenu proteinazy K według wynalazku zdefiniowanego powyżej, zgodnie z opisem w przykładzie 4. Korzystnie, plazmid według wynalazku posiada sekwencję wybraną spośród sekwencji: sekwencja nr 16.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest rekombinantowy szczep drożdżowy transformowany dowolnym plazmidem według wynalazku zdefiniowanym powyżej, zgodnie z opisem w przykładzie 6. Korzystnie szczep drożdży według wynalazku może być otrzymany z jednego ze znanych szczepów drożdży wybranych spośród Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Yarrovia sp., lub Kluyveromyces sp., korzystnie wybranego spośród szczepów Pichia pastoris.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania białka o aktywności proteinazy K Tritirachium album charakteryzujący się tym, że prowadzi się hodowlę komórek drożdży transformowanych plazmidem ekspresyjnym kodującym mutanta zymogenu proteinazy K z Tritirachium album zawierającego na C-końcu mutację zwiększającą wydajność ekspresji w komórkach drożdżowych oraz ułatwiającą dezaktywację dojrzałej proteinazy K w warunkach stresowych, przy czym mutacją tą jest dodatkowa reszta Gly znajdująca się na C-końcu, a następnie uzyskiwane białko izoluje się i oczyszcza z płynu pohodowlanego.
Korzystnie prowadzi się hodowlę komórek drożdży według wynalazku zdefiniowanych powyżej, korzystnie w temperaturze około 28 do 30°C, korzystnie na pożywce zawierającej jako źródło węgla glicerol lub metanol, przy czym indukuje się ekspresję zmodyfikowanego genu proteinazy K metanolem. Równie korzystnie, białko o aktywności proteinazy K Tritirachium album izoluje się z płynu pohodowlanego metodą chromatografii oddziaływań hydrofobowych lub metodą chromatografii na złożu hydroksyapatytu, a następnie oczyszcza się prowadząc dializę wobec roztworu węglanu amonu, po czym suszy się ze stanu zamrożenia zgodnie z opisem w przykładzie 9.
Skonstruowano układ ekspresyjny pozwalający na wydajną biosyntezę dojrzałej formy zmodyfikowanej proteinazy K Tritirachium album ATCC 22625 w komórkach Pichia pastoris. Gen kodujący zymogen zmodyfikowanego białka, przedstawiony w sekwencji nr 8, został namnożony na drodze PCR na matrycy sekwencji genu kodującego dziką wersje białka przedstawionym w sekwencji nr 5, zgodnie z opisem w przykładzie 2 i zsekwencjonowany. Z namnożonej sekwencji usunięto sekwencję nukleotydową kodującą peptyd sygnałowy, przedstawiony w sekwencji 2, a pozostawiono sekwencję DNA kodującą propeptyd dzikiego białka, zgodnie z sekwencją nr 3, stabilizujący zymogen proteinazy K przed przedwczesną aktywację do formy dojrzałej, aktywnie enzymatycznie białka (Wolfgang Ebeling, et al, Proteinase K from Tritirachium album Limber, Eur. J Biochem. 47,91-97,1974). Dodatkowo dodano resztę aminokwasową glicyny na C-końcu dojrzałego białka, co nieoczekiwanie, zwiększyło efektywność autolizy dojrzałej formy zmutowanego białka w warunkach stresowych, w podwyższonym stężeniu surfaktanta. Taka modyfikacja dzikiego białka pozwoliła na wydajną inaktywację enzymu w odpowiednich warunkach buforowych, zgodnie z opisem w przykładzie 10, co jest szczególnie korzystną właściwością, umożliwiającą na łatwą inaktywację enzymu, w procesach oczyszczania kwasów nukleinowych, gdzie wymagana jest wysoka jakość i czystość preparatów DNA i RNA pozbawionych zanieczyszczeń białkowych, bez stosowania dodatkowych czynników chemicznych czy fizycznych, które mogą uszkadzać izolowane preparaty kwasów nukleinowych.
Uzyskany w wynalazku szczep ekspresyjny Pichia pastoris/pD912-ProtK-G, zgodnie z opisem w przykładzie 6, umożliwia otrzymywania funkcjonalnej zmodyfikowanej proteinazy K Tritirachium album w znacznych ilościach, a ponadto pozwala na produkcję zmodyfikowanego enzymu, który nie odbiega aktywnością od enzymu izolowanego ze szczepu dzikiego. Produkowane dojrzałe zmutowane białko Proteinazy K, przedstawione w sekwencji 22, nie różni się w znaczącym stopniu aktywnością od białka izolowanego z Tritirachium album mimo obecności dodatkowej reszty aminokwasowej glicyny na C-końcu dojrzałego białka.
Realizację wynalazku stanowi także sekwencja DNA plazmidu ekspresyjnego o symbolu pD912-ProtK i sekwencji 21 otrzymana w wyniku amplifikacji DNA, zgodnie z opisem w przykładzie 7, z zastosowaniem starterów o sekwencji 18 i symbolu ProtK-G-out-F oraz o sekwencji 19 i symbolu ProtK-G-out-R, która zawiera fragment DNA o sekwencji 20 kodującej sekwencję aminokwasową identyczną ze zmutowaną wersją proteinazy K ale pozbawionej dodatkowej reszty aminokwasowej glicyny na C-końcu dojrzałego białka, zgodnie z sekwencją 17.
Realizację wynalazku stanowi rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris/pD912-ProtK, zgodnie z opisem w przykładzie 8, który stanowią komórki drożdży Pichia pastoris BG10 zawierający gen kodujący zmodyfikowaną proteinazę K Tritirachium album, przedstawiony w sekwencji 20.
Realizację wynalazku stanowi także sekwencja DNA plazmidu ekspresyjnego o symbolu pPink_HC-ProtK-WT i sekwencji 11 otrzymana w wyniku syntezy de novo DNA i klonowania do wektora o symbolu pPink_HC i sekwencji 10, zgodnie z opisem w przykładzie 1. Uzyskany plazmid ekspresyjny pPink_HC-ProtK-WT zawiera fragment DNA o sekwencji 5 i symbolu ProtK-WT kodujący sekwencję aminokwasową dzikiej wersji proteinazy K Tritirachium album. Zawierającej natywny peptyd sygnałowy proteinazy K (sekwencja 2) wraz z natywnym propeptydem (sekwencja 3).
Realizację wynalazku stanowi rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia Pink/pPink_HC-ProtK-WT, zgodnie z opisem w przykładzie 5, który stanowią komórki drożdży Pichia Pink (ThermoFisher, nr kat. A11150) zawierający gen kodujący dziką wersję proteinazy K Tritirachium album, przedstawiony w sekwencji 1.
Realizację wynalazku stanowi również sposób wytwarzania zmodyfikowanej proteinazy K Tritirachium album, zgodnie z opisem w przykładzie 9, polegający na zewnątrzkomórkowej produkcji enzymu przez komórki rekombinantowego szczepu drożdży w pożywkach płynnych wzbogaconych o jony wapnia (Ca2+) charakteryzujący się tym, że prowadzi się hodowlę komórek szczepu drożdży o symbolu Pichia Pink/pPink_HC-ProtK-WT lub Pichia pastoris/pD912-ProtK lub Pichia pastoris/pD912- ProtK-G w temperaturze 28-30°C, indukuje ekspresję genu kodującego dziką lub zmodyfikowaną proteinazę K metanolem, a następnie izoluje się i oczyszcza białko z płynu pohodowlanego na drodze chromatografii oddziaływań hydrofobowych, po czym oczyszczony enzym suszy się ze stanu zamrożenia. Można tutaj również zastosować metodę oczyszczania chromatograficznego na złożu w postaci hydroksyapatytu.
Dzięki wykorzystaniu wynalazku uzyskuje się układ ekspresyjny umożliwiający wydajną produkcję zmodyfikowanej proteinazy K Tritirachium album (ProtK-G) w rekombinantowych komórkach drożdży Pichia pastoris/pD912-ProtK-G, która jest o około 10% wyższa w porównaniu z poziomem ekspresji natywnej proteinazy (ProtK) prowadzonej w tych samych warunkach, w tym samym układzie ekspresyjnym w rekombinantowym szczepie Pichia pastoris/pD912-ProtK i aż o około 30% w porównaniu do ekspresji w dzikiej wersji proteinazy K w szczepie Pichia Pink/pPink_HC-ProtK-WT. Szczep Pichia Pink ™ to komercyjny system ekspresyjny oferowany przez firmę Thermo Fisher, USA do wysok owydajnej produkcji białek rekombinantowych w układzie drożdżowym Pichia Pink.
W wyniku realizacji wynalazku uzyskano szczep ekspresyjny Pichia pastoris/pD912-ProtK-G, który okazał się najbardziej wydajny w produkcji proteinazy K Tritirachium album w układzie rekombinantowym spośród testowanych systemów w trakcie realizacji wynalazku. Przy zachowaniu 10% różnicy wydajności i przeskalowaniu procesu do produkcyjnej skali 1000L, możliwe jest w ten sposób wytworzenie ponad 260 g białka więcej na proces.
Opis rycin i sekwencji:
Ryc. 1 - przedstawia schemat plazmidu ekspresyjnego o sekwencji 11 i symbolu pPink_HC-ProtK-WT kodującego dziką wersję proteinazy K.
Ryc. 2 - przedstawia schemat plazmidu ekspresyjnego o sekwencji 16 (lub 21) i symbolu pD912-ProtK-G (lub pD912-ProtK) kodującego rekombinantową wersję proteinazy K ze zmutowanym C-końcem (lub wersję dziką dojrzałego białka).
Ryc. 3 - Porównanie wydajności ekspresji proteinazy K Tritirachium album w trzech szczepach ekspresyjnych: Pichia Pink/pPink_HC-ProtK-WT, Pichia pastoris/pD912-ProtK-G oraz Pichia pastoris/pD912-ProtK.
Ryc. 4 - Porównanie stabilności białka rekombinantowej wersji ProtK-G oraz natywnej ProtK_WT w warunkach typowych podczas oczyszczania kwasów nukleinowych oraz warunkach stresowych, z podwyższoną ilością surfaktanta do 1%. Na żelach SDS-PAGE pokazano stabilność rekombinantowej wersji ProtK-G oraz natywnej ProtK_WT po 30 min. inkubacji w warunkach typowych dla izolacji DNA i/lub RNA (panel lewy) lub w warunkach stresowych z podwyższonych stężeniem surfaktanta (panel środkowy). Na panelu z prawej pokazano oba białka po dodatkowej inkubacji 30 min. w warunkach stresowych. Oba białka, ProtK-G i ProtK-WT nie ulegają autolizie w warunkach typowych dla izolacji kwasów nukleinowych i pozostają na podobnym poziomie, natomiast w warunkach stresowych, białko rekombinantowej ProtK-G ulega szybszej i wydajniejszej degradacji w porównaniu do wersji dzikiej, ProtK-WT.
Tabela 1. Porównanie wydajności efektywność fermentacji proteinazy K Tritirachium album w trzech szczepach ekspresyjnych: Pichia Pink/pPink_HC-ProtK-WT, Pichia pastoris/pD912-ProtK-G oraz Pichia pastoris/pD912-ProtK. Fermentacja drożdży prowadzona była w przy użyciu tego samego protokołu w tych samych warunkach dla wszystkich układów ekspresyjnych. Po zakończeniu hodowli mierzona była ilość biomasy komórek w brzeczce pofermentacyjnej po oddzieleniu pożywki pofermentacyjnej przez wirowanie, przedstawiona w gramach osadu w 1 litrze hodowli. Zawartość proteinazy K w pożywce pofermentacyjnej po oddzieleniu komórek mierzona była densytometrycznie oraz metodą HPLC. Porównano względną wydajność trzech układów ekspresyjnych przyjmując jako 100% układ najbardziej wydajny, Pichia pastoris/pD912-ProtK-G.
Sekwencja 1 - przedstawia sekwencję aminokwasową białka dzikiego proteinazy K Tritirachium album o symbolu ProtK-WT
Sekwencja 2 - przedstawia sekwencję aminokwasową peptydu sygnałowego z dzikiego białka proteinazy K Tritirachium album o symbolu ProtK-WT SP
Sekwencja 3 - przedstawia sekwencję aminokwasową propeptydu dzikiego białka proteinazy K Tritirachium album o symbolu ProtK-WT propeptyd
Sekwencja 4 - przedstawia sekwencję aminokwasową fragmentu aktywnego enzymatycznie białka dojrzałej proteinazy K Tritirachium album o symbolu ProtK-WT mature
Sekwencja 5 - przedstawia sekwencję nukleotydową genu o długości 1173 nukleotydów kodującego wersję białka dzikiej proteinazy K Tritirachium album o symbolu ProtK-WT
Sekwencja 6 - przedstawia sekwencję oligonukleotydu o długości 41 nukleotydów o symbolu ProtK-G-F użytego w reakcji PCR do amplifikacji sekwencji 8
Sekwencja 7 - przedstawia sekwencję oligonukleotydu o długości 41 nukleotydów o symbolu ProtK-G-R użytego w reakcji PCR do amplifikacji sekwencji 8
Sekwencja 8 - przedstawia sekwencję nukleotydową genu o długości 1139 nukleotydów kodującego fragment propeptydu i peptyd białka dojrzałego wersji rekombinantowej proteinazy K Tritirachium album o symbolu pro-ProtK-G
Sekwencja 9 - przedstawia sekwencję aminokwasową o długości 370 aminokwasów propeptydu i peptydu fragmentu aktywnego enzymatycznie białka dojrzałej rekombinantowej proteinazy K Tritirachium album o symbolu pro-ProtK-G.
Sekwencja 10 - przedstawia sekwencję nukleotydową wektora ekspresyjnego pPink_HC o długości 7667 nukleotydów zakupionego z firmy Thermo Fisher, USA, nr kat. A11152 zawierającego promotora AOX1 Saccharomyces cerevisiae indukowalnego przez metanol
Sekwencja 11 - przedstawia sekwencję nukleotydową wektora ekspresyjnego pPink_HC-ProtKWT o długości 8805 nukleotydów o symbolu pPink_HC-ProtK-WT zawierającego sekwencję 5 pod kontrolą promotora AOX1 Saccharomyces cerevisiae indukowalnego przez metanol
Sekwencja 12 - przedstawia sekwencję aminokwasową białka rekombinantowej wersji proteinazy K Tritirachium album o symbolu ProtK-G i długości 460 aminokwasów ze zmodyfikowanym C-końcem białka
Sekwencja 13 - przedstawia 90 aminokwasową sekwencję peptydu sygnałowego z białka alpha factor Saccharomyces cerevisiae o symbolu ProtK-G SP
PL 244825 Β1
Sekwencja 14 - przedstawia sekwencję nukleotydową genu o długości 1324 nukleotydów kodującego wersję rekombinantową białka proteinazy K Tritirachium album o symbolu ProtK-G
Sekwencja 15 - przedstawia sekwencję nukleotydową wektora ekspresyjnego pD912 o długości 3837 nukleotydów zakupionego z firmy ATUM, USA, nr kat. 867858d1 zawierającego promotora Α0Χ1 Saccharomyces cerevisiae indukowalnego przez metanol
Sekwencja 16 - przedstawia sekwencję nukleotydową wektora ekspresyjnego pD912-ProtK-G o długości 4928 nukleotydów o symbolu pD912-ProtK-G zawierającego sekwencję 14 pod kontrolą promotora ΑΟΧ1 Saccharomyces cerevisiae indukowalnego przez metanol
Sekwencja 17 - przedstawia sekwencję aminokwasową białka rekombinantowej wersji proteinazy K Tritirachium album o symbolu ProtK i długości 459 aminokwasów z natywnym C-końcem białka (bez dodanego aminokwasu glicyny w pozycji 460)
Sekwencja 18 - przedstawia sekwencję oligonukleotydu o długości 59 nukleotydów o symbolu ProtK-G-out-F użytego w reakcji POR do amplifikacji sekwencji 20
Sekwencja 19 - przedstawia sekwencję oligonukleotydu o długości 36 nukleotydów o symbolu ProtK-G-out- użytego w reakcji POR do amplifikacji sekwencji 20
Sekwencja 20 - przedstawia sekwencję nukleotydową genu o długości 1324 nukleotydów kodującego wersję rekombinantową białka proteinazy K Tritirachium album o symbolu ProtK (G460stop)
Sekwencja 21 - przedstawia sekwencję nukleotydową wektora ekspresyjnego pD912-ProtK o długości 4928 nukleotydów o symbolu pD912-ProtK zawierającego sekwencję 20 pod kontrolą promotora ΑΟΧ1 Saccharomyces cerevisiae indukowalnego przez metanol
Sekwencja 22 - przedstawia sekwencję aminokwasową fragmentu aktywnego enzymatycznie białka dojrzałej rekombinowanej proteinazy K Tritirachium album o symbolu ProtK-G maturę
Przykład 1. Otrzymywanie sekwencji DNA genu kodującego dziką proteinazę K Tritirachium album o sekwencji 1 i symbolu ProtK-WT.
W celu otrzymania DNA genu kodującego białko dzikiej proteinazy K o Sekwencji 1 i symbolu ProtK-WT zawierającego peptyd sygnałowy o Sekwencji 2 i symbolu ProtK-WT SP, propeptyd o Sekwencja 3 i symbolu ProtK-WT propeptyd oraz dojrzały aktywny enzymatycznie polipeptyd proteinazy K o Sekwencji 4 i symbolu ProtK-WT maturę, zaprojektowano sekwencję DNA w oparciu o sekwencję białkową proteinazy K dostępną w bazie danych UniProtKB numer P06873 (https://www.uniprot.org/uniprot/P06873). Sekwencję DNA kodującą dziką proteinazę K uzyskano poprzez odwrotną translację sekwencji po li peptyd owej nr 1 o symbolu ProtK-WT. Zaprojektowana sekwencja DNA została zoptymalizowana pod kątem wydajnej ekspresji w drożdżach Pichia pastoris. Dodatkowo, by umożliwić klonowanie do wektora ekspresyjnego, zaprojektowano miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne EcoRI i Kpnl, odpowiednio na 5- i 3- końcach. Synteza genu de novo została zlecona do firmy GeneART (https://www.thermofisher.com/pl/en/home/life-science/cloninq/qene-synthesis/qeneart-qene-svnthesis.html). Sekwencja DNA uzyskanego genu o symbolu ProtK-WT przedstawiona została jako Sekwencja 5.
Przykład 2. Otrzymywanie sekwencji DNA genu kodującego fragment rekombinantowej proteinazy K Tritirachium album z dołączonym na C-końcu białka aminokwasu glicyny o sekwencji 8 i symbolu pro-ProtK-G.
W celu otrzymania fragmentu DNA genu o sekwencji 8 i symbolu pro-ProtK-G kodującego fragment rekombinantowej proteinazy K Tritirachium album z dołączonym na C-końcu białka aminokwasu glicyny o Sekwencji 9 i symbolu pro-ProtK-G, otrzymany w Przykładzie 1 fragment DNA o Sekwencji 5 i symbolu ProtK-WT amplifikuje się w reakcji PCR stosując dwa startery oligonukleotydowe o Sekwencji 6 i symbolu ProtK-G-F oraz o Sekwencji 7 i symbolu ProtK-G-R przy użyciu kitu do amplifikacji zakupionego od firmy New England Biolabs, Inc., nr kat. 50-995-156 w warunkach rekomendowanych przez producenta. Dodatkowo, by umożliwić klonowanie fragmentu DNA o Sekwencji 8 i symbolu pro-ProtK-G do wektora ekspresyjnego, użyte w reakcji PCR, oligonukleotydy zawierają miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Sapl. Otrzymany, fragment DNA o Sekwencji 8 i symbolu pro-ProtK-G, wytrąca się etanolem i wykorzystuje się do klonowania do wektora ekspresyjnego.
Przykład 3. Otrzymywanie plazmidu ekspresyjnego o sekwencji 11 i symbolu pPink_HC-ProtK-WT zawierającego gen kodujący sekwencję polipeptydową dzikiej proteinazę K Tritirachium album o sekwencji 1 i symbolu ProtK-WT.
W celu otrzymania plazmidu ekspresyjnego o Sekwencji 11 i symbolu pPink_HC-ProtK-WT, oczyszczony na drodze precypitacji etanolowej fragment DNA o Sekwencji 1 i symbolu ProtK-WT, uzyskany w Przykładzie 1 trawi się enzymami restrykcyjnymi EcoRI i KpnI, a następnie liguje się z DNA wektora plazmidowego o Sekwencji 10 i symbolu pPink_HC zakupionym w Thermo Fisher, USA, nr kat. A11152 trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi.
Mieszaniną ligacyjną transformuje się do komórek kompetentnych Escherichia coli TOP10F i wysiewa na szalki Petriego z podłożem LA (1% pepton K; 0,5% ekstrakt drożdżowy; 1 % NaCl; 1,5% agar) zawierającym 100 μg/ml ampicyliny. W wyniku izolacji plazmidowego DNA z otrzymanych kolonii bakteryjnych uzyskuje się plazmid ekspresyjny o Sekwencji 11 i symbolu pPink_HC-ProtK-WT zawierający gen o sekwencji 5 i symbolu ProtK-WT kodujący dziką wersję proteinazy K Tritirachium album o sekwencji 1 i symbolu ProtK-WT. Mapa plazmidu o sekwencji 11 i symbolu pPink_HC-ProtK-WT przedstawiona jest na Rycinie 1.
Przykład 4. Otrzymywanie plazmidu ekspresyjnego o sekwencji 16 i symbolu pD912-ProtK-G zawierającego gen o sekwencji 14 i symbolu ProtK-G kodującego sekwencję polipeptydową rekombinantowej proteinazy K Tritirachium album o sekwencji 12 i symbolu ProtK-G.
Otrzymany w przykładzie 2 fragment DNA o sekwencji 8 i symbolu pro-ProtK-G trawi się enzymem restrykcyjnym Sapl, a następnie liguje się z DNA wektora plazmidowego o Sekwencji 15 i symbolu pD912 zakupionym w firmie ATUM, Newark, USA, nr kat. 867858d1, trawionym tym samym enzymem restrykcyjnym. W wyniku ligacji fragmentu DNA o sekwencji 8 i symbolu pro-ProtK-G z DNA wektora pD912 o Sekwencji 15 powstaje połączenie we właściwej ramce odczytu (fuzja translacyjna) sekwencji 8 o symbolu pro-ProtK-G z peptydem sygnałowym znajdującym się na wektorze pD912 o sekwencji 13 i symbolu ProtK-G SP.
Mieszaniną ligacyjną transformuje się do komórek kompetentnych Escherichia coli TOP10F i wysiewa na szalki Petriego z podłożem LA (1% pepton K; 0,5% ekstrakt drożdżowy; 1 % NaCl; 1,5% agar) zawierającym 25 μg/ml zeozyny. W wyniku izolacji plazmidowego DNA z otrzymanych kolonii bakteryjnych uzyskuje się plazmid ekspresyjny o Sekwencji 16 i symbolu pD912-ProtK-G zawierający gen o sekwencji 14 i symbolu ProtK-G kodujący rekombinantową proteinazę K Tritirachium album o sekwencji 12 i symbolu ProtK-G. Mapa plazmidu o sekwencji 16 i symbolu pD912-ProtK-G przedstawiona jest na Rycinie 2.
Przykład 5. Otrzymywanie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia Pink/pPink_HC-ProtK-WT
W celu uzyskania rekombinantowego szczepu Pichia Pink/pPink_HC-ProtK-WT wykonuje się transformację komórek drożdży Pichia Pink liniową formą DNA plazmidu ekspresyjnego o sekwencji 11 i symbolu pPink_HC-ProtK-WT uzyskaną przez uprzednie trawienie DNA plazmidu o sekwencji 11 i symbolu pPink_HC-ProtK-WT enzymem restrykcyjnym Spel (Thermo Fisher, nr kat. ER1251). Selekcję pozytywnych klonów komórek drożdży Pichia Pink wykonuje się na podłożu selekcyjnym PAD, zgodnie z zaleceniami dostawcy komórek Pichia Pink (ThermoFisher, nr kat. A11150, wersja instrukcji MAN0000717). Obecność wbudowanego rekombinantowego genu ProtK-WT do genomu drożdży o symbolu Pichia Pink/pPink_HC-ProtK-WT potwierdza się przez amplifikację PCR z użyciem oligonukleotydów jak w przykładzie 2 na matrycy genomowego DNA izolowanego z komórek drożdży.
Przykład 6. Otrzymywanie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris/pD912-ProtK-G
W celu uzyskania rekombinantowego szczepu Pichia pastoris/pD912-ProtK-G wykonuje się transformację komórek drożdży Pichia pastoris szczep BG10 (ATUM, USA nr kat. PPS-9010) liniową formą DNA plazmidu ekspresyjnego o sekwencji 16 i symbolu pD912-ProtK-G uzyskaną przez uprzednie trawienie DNA plazmidu o sekwencji 16 i symbolu pD912-ProtK-G enzymem restrykcyjnym Pmel (Thermo Fisher, nr kat. ER1342). Selekcję pozytywnych klonów komórek drożdży Pichia pastoris/pD912-ProtK-G wykonuje się na podłożu selekcyjnym YPDS z dodatkiem 200 pg/ml zeocyny a następnie przesiewa się na podłoże YPD z dodatkiem 200 pg/ml zeocyny, zgodnie z zaleceniami dostawcy komórek Pichia pastoris szczep BG10 (ATUM, USA). Obecność wbudowanego rekombinantowego genu ProtK-G do genomu drożdży o symbolu Pichia pastoris/pD912-ProtK-G potwierdza się przez amplifikację PCR z użyciem oligonukleotydów jak w przykładzie 2 na matrycy genomowego DNA izolowanego z komórek drożdży.
Przykład 7. Otrzymywanie plazmidu ekspresyjnego o sekwencji 21 i symbolu pD912-ProtK zawierającego gen o sekwencji 20 i symbolu ProtK kodującego sekwencję polipeptydową rekombinantowej proteinazy K Tritirachium album o sekwencji 17 i symbolu ProtK.
Otrzymany zgodnie z przykładem 4 plazmid ekspresyjny o sekwencji 16 i symbolu pD912-ProtK-G zawierający gen o sekwencji 14 i symbolu ProtK-G kodujący sekwencję polipeptydową rekombinantowej proteinazy K Tritirachium album o sekwencji 12 i symbolu ProtK-G używa się jako matrycy w procesie PCR do uzyskania wektora ekspresyjnego o sekwencji 21 i symbolu pD912-ProtK zawierającego gen o sekwencji 20 i symbolu ProtK kodujący sekwencję polipeptydową rekombinantowej proteinazy K Tritirachium album o sekwencji 17 i symbolu ProtK. Jako startery w procesie PCR stosuje dwa oligonukleotydy, jeden o Sekwencji 18 i symbolu ProtK-G-out-F oraz drugi, o Sekwencji 19 i symbolu ProtK-G-out-R przy użyciu kitu do amplifikacji zakupionego od firmy New England Biolabs, Inc., nr kat. 50-995-156, w warunkach rekomendowanych przez producenta.
Mieszaninę PCR inkubuje się z enzymem restrykcyjnym DpnI (Thermo Fisher, nr kat. ER1701) i transformuje się do komórek kompetentnych Escherichia coli DH5(alpha) a następnie wysiewa na szalki Petriego z podłożem LA (1% pepton K; 0,5% ekstrakt drożdżowy; 1% NaCl; 1,5% agar) zawierającym 25 μg/ml zeozyny. W wyniku izolacji plazmidowego DNA z otrzymanych kolonii bakteryjnych uzyskuje się plazmid ekspresyjny o Sekwencji 21 i symbolu pD912-ProtK zawierający gen o sekwencji 20 i symbolu ProtK kodujący rekombinantową proteinazę K Tritirachium album o sekwencji 17 i symbolu ProtK. Mapa plazmidu o sekwencji 21 i symbolu pD912-ProtK przedstawiona jest na Rycinie 2.
Przykład 8. Otrzymywanie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris/pD912-ProtK
W celu uzyskania rekombinantowego szczepu Pichia pastoris/pD912-ProtK- wykonuje się transformację komórek drożdży Pichia pastoris szczep BG10 (ATUM, USA nr kat. PPS-9010) liniową formą DNA plazmidu ekspresyjnego o sekwencji 21 i symbolu pD912-ProtK uzyskaną przez uprzednie trawienie DNA plazmidu o sekwencji 21 i symbolu pD912-ProtK enzymem restrykcyjnym Pmel (Thermo Fisher, nr kat. ER1342). Selekcję pozytywnych klonów komórek drożdży Pichia pastoris/pD912-ProtK wykonuje się na podłożu selekcyjnym YPDS z dodatkiem 200 pg/ml zeocyny a następnie przesiewa się na podłoże YPD z dodatkiem 200 pg/ml zeocyny, zgodnie z zaleceniami dostawcy komórek Pichia pastoris szczep BG10 (ATUM, USA). Obecność wbudowanego rekombinantowego genu ProtK-G do genomu drożdży o symbolu Pichia pastoris/pD912- ProtK potwierdza się przez amplifikację PCR z użyciem oligonukleotydów jak w przykładzie 2 na matrycy genomowego DNA izolowanego z komórek drożdży.
Przykład 9. Otrzymywanie proteinazy K Tritirachium album oraz porównanie wydajności ekspresji rekombinowanej (ProtK-G) oraz dzikiej wersji (ProtK-WT lub ProtK) proteinazy K przy wykorzystaniu odpowiednio komórek Pichia pastoris/pD912-ProtK-G, Pichia Pink/pPink_HC-ProtK-WT lub komórek Pichia pastoris/pD912-ProtK.
Uzyskane, odpowiednio w przykładach 5, 6 lub 8, szczepy ekspresyjne Pichia Pink/pPink_HC -ProtK-WT, Pichia pastoris/pD912-ProtK-G lub Pichia pastoris/pD912-ProtK produkujące odpowiednio rekombinantową (ProtK-G), natywną (ProtK-WT) lub wersję dziką dojrzałego polipeptydu proteinazy K, hoduje się w pożywce MGY przez 18-20 godzin w temperaturze 30°C, do uzyskania gęstości komórek mierzonej spektrofotometrycznie przy długości fal 600 nm, OD600 większego niż 2. Następnie uzyskanym inokulum zaszczepia się pożywkę BSM w stalowym reaktorze o objętości roboczej 20 dm3, zawierającą 2% glicerolu jako źródło węgla i prowadzi się hodowlę w 30°C przez 46-48 godzin, dodając glicerolu jako źródła węgla. Po uzyskaniu odpowiedniej gęstości komórek, hodowlę indukuje się do ekspresji genu zmodyfikowanej lub natywnej proteiny K poprzez dodanie metanolu. Hodowlę prowadzi się przez kolejne 3-4 dni (72-96 h) dodając metanol jako źródło węgla i induktora ekspresji genu. Na zakończenie hodowli oraz z próbek pobranych w trakcie hodowli, komórki drożdży oddziela się od płynu pohodowlanego poprzez wirowanie. Zawartość proteinazy K w pożywce pofermentacyjnej, po oddzieleniu komórek, w pożywce pohodowlanej analizowana jest na żelu SDS-PAGE i/lub metodą HPLC.
Białko z pożywki pohodowlanej, po oddzieleniu biomasy drożdżowej przy pomocy wirowania lub za pomocą filtracji stycznej z użyciem kasety filtracyjnej o porach o wielkości 0,2 mikrometra, oczyszczane jest metodą chromatografii oddziaływań hydrofobowych z wykorzystaniem złoża np. Phenyl Sepharose HS (Cytiva nr kat. 17097399) lub metodą chromatografii na złożu hydroksyapatytu, a następnie oczyszcza się prowadząc dializę wobec roztworu węglanu amonu, po czym suszy się ze stanu zamrożenia uzyskując aktywnie enzymatycznie końcowy produkt.
Porównanie poziomu ekspresji w czasie hodowli, po 2, 3 oraz 4 dniach od indukcji w szczepach Pichia Pink/pPink_HC-ProtK-WT, Pichia pastoris/pD912-ProtK-G i Pichia pastoris/pD912-ProtK przedstawiona jest na rycinie 3. Wydajność ekspresji rekombinowanej proteinazy K (ProtK-G) w szczepie Pichia pastoris/pD912-ProtK-G jest wyższa o około 10% w porównaniu z poziomem ekspresji natywnej proteinazy (ProtK) w tym samym układzie ekspresyjnym w szczepie Pichia pastoris/pD912-ProtK i aż o około 30% w porównaniu do ekspresji w szczepie Pichia Pink/pPink_HC-ProtK-WT. Szczep Pichia Pink ™ to komercyjny system ekspresyjny oferowany przez firmę Thermo Fisher, USA zoptymalizowany do wysokowydajnej produkcji białek rekombinantowych w układzie drożdżowym Pichia Pink. Mimo użycia zoptymalizowanego gospodarza ekspresyjnego, produkcja białka w natywnej sekwencji była o 30% niższa w porównaniu do dzikich komórek Pichia pastoris, przy użyciu tego samego protokołu wytwórczego.
Szczep ekspresyjny Pichia pastoris/pD912-ProtK-G okazał się najbardziej wydajny do produkcji proteinazy K Tritirachium album. Przy zachowaniu 10% różnicy wydajności i przeskalowaniu procesu do produkcyjnej skali 1000L, można w ten sposób wytworzyć o 260 g białka więcej z jednej fermentacji.
Przykład 10. Możliwość szybszej dezaktywacji i usuwania proteinazy K o zmodyfikowanej sekwencji, ProtK-G względem natywnej proteinazy K, ProtK-WT w procesie oczyszczania kwasów nukleinowych.
Proteinaza K z Tritirachium album, jak endopeptydaza o szerokim spektrum działania i bardzo wysokiej aktywności specyficznej, ma szerokie zastosowanie podczas izolacji kwasów nukleinowych (DNA i RNA) bez naruszania ich struktury do wytrawiania białek, włączając DNazy i RNazy i inne białka oddziałujące z kwasami nukleinowymi, które zmniejszają czystość końcowych preparatów DNA lub RNA. Proteinaza K zachowuje wysoką aktywność w szerokim spektrum warunków buforowych i jest dodatkowo aktywowana przez dodatek niewielkiej ilości surfaktanta SDS, w zakresie 0,1-0,5%. Efektywne wytrawienie zanieczyszczeń białkowych, włącznie z dodaną w procesie izolacji proteinazą K, jest warunkiem uzyskania wysokiej jakości preparatów DNA lub RNA a wszelkie pozostałości białkowe podczas procesu oczyszczania, negatywnie wpływają na jakość oczyszczanych próbek. Jest to niezwykle istotne w przygotowywaniu próbek używanych do sekwencjonowania, diagnostyki z użyciem qPCR, gdzie zanieczyszczenia białkowe w przygotowanych próbkach powodować mogą zafałszowanie uzyskiwanych wyników.
Dla wykazania możliwości wydajnej dezaktywacji i usuwania proteinazy K w procesie oczyszczania DNA i/lub RNA, w wariancie proteinazy K będącym przedmiotem niniejszego wynalazku, porównano aktywność obu wariantów (ProtK-G o sekwencji nr 12 i ProtK-WT o sekwencji nr 1) w warunkach typowych podczas procesu oczyszczania kwasów nukleinowych (inkubacja w 10 mM Tris-HCl pH7.5, 37°C) bez czynnika stresującego, jak i w warunkach stresowych, z dodatkiem 1% SDS (inkubacja w 10 mM Tris-HCl pH7.5,1% SDS, 37°C).
Nieoczekiwanie, okazało się, że wersja rekombinantowa proteinazy K, tj. ProtK-G traci aktywność w szybszym tempie w warunkach stresowych w porównaniu do wersji dzikiej, tj. ProtK-WT, co pozwala na łatwiejsze usuwanie pozostałości proteinazy K po etapie wytrawiania białek oddziałujących z kwasami nukleinowymi podczas izolacji DNA i/lub RNA, w przeciwieństwie do białka natywnego, ProtK-WT. Wyniki porównania obu białek w warunkach inkubacji standardowych i stresowych przedstawione są na rycinie 4. Zdolność do trawienia wykazywana przez mutanta po inkubacji w warunkach stresowych pozostaje na poziomie zaledwie 1,9%, w porównaniu z 69,7% wyjściowej aktywności. Białko referencyjne, ProtKWT utrzymuje ponad 30% zdolność do trawienia, po inkubacji w takich samych warunkach z surfaktantem.
Uzyskane wyniki sugerują, że w odpowiednich warunkach (1% surfaktant) możliwa jest prawie całkowita inaktywacja enzymu w wariancie zmutowanym, ProtK-G, według niniejszego zgłoszenia bez użycia dedykowanego odczynnika/inhibitora [Pefabloc® SC] czy drastycznego podwyższania temperatury, jak w przypadku innych rekombinantów proteinazy K i produktów dostępnych rynkowo znanych ze stanu techniki wynikających ze zgłoszeń patentowych EP3670655A1 [New England Biolabs Termolabilna Proteinaza K], czy WO2019170809A1 [Arctic Zymes Proteinaza]. Dodatek 1% jonowego związku powierzchniowo czynnego (surfaktant, laurylosiarczanu sodu- SDS) oraz 30 minutowa inkubacja w podwyższonej temperaturze 37°C, powoduje spadek aktywności zmutowanej proteinazy K, ProtK-G wg niniejszego wynalazku niemal do zera w przeciwieństwie do wariantu natywnego, ProtK-WT.
Daje to możliwość łatwej inaktywacji enzymu, zwłaszcza w procesach oczyszczania kwasów nukleinowych, gdzie wymagana jest wysoka czystość preparatów DNA i RNA, bez stosowania dodatkowych czynników chemicznych czy fizycznych, które mogą uszkadzać izolowane preparaty kwasów nukleinowych.
PL 244825 Β1
SEQUENCE LISTING <110> Blirt S.A.
<120> Mutant proteinazy K Tritirachium album i jej zymogenu, plazmid ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i sposub wytwarzania dojrzalej formy mutanta proteinazy K <130> PK/8738/RW <160> 22 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 384 <212> PRT <213> Tritirachium album <400> 1
Met Arg Leu Ser Val Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser Ser Leu Gly Ala
1015
Pro Ala Val Glu Gin Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala Arg 20 2530
Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly Ser 35 4045
Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys Pro 50 5560
Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu Asp 65 70 7580
Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr Ile 85 9095
Glu Gin Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gin Thr Asn Ala Pro
100 105110
Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr Tyr
115 120125
PL 244825 Β1
Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly
130 135
Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile Asp
140
Thr Gly Ile Glu Ala Ser His
145 150
Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gin Met
155 160
Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser
165
Arg Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
170 175
His Cys Ala Gly Thr Val Gly
180
Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys
185 190
Thr Gin Leu Phe Gly Val Lys
195
Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly Gin
205
Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly
210 215
Asp Phe Val Ala Ser Asp Lys Asn
220
Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly
225 230
Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly
235 240
Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn
245
Ala Ala Ala Arg Leu Gin Ser Ser
250 255
Gly Val Met Val· Ala Val Ala
260
Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg
265 270
Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu
275
Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Ser
285
Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser
290 295
Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu
300
Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr
305 310
Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly
315 320
Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly
325
Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala
330 335
Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met 340
Leu Gly Lys Thr Thr Ala Ala Ser
345 350
PL 244825 Β1
Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr
355 360
Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn
365
Ile Pro Phe Gly Thr Val· Asn Leu
370 375
Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gin Ala
380 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Tritirachium album <400> 2
Met Arg Leu Ser Val Leu Leu Ser 1 5 <210> 3 <211> 90 <212> PRT <213> Tritirachium album <400> 3
Ala Pro Ala Val Glu Gin Arg Ser 1 5
Leu Leu Pro Ser Ser Leu Gly
15
Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala
15
Arg Gly Glu Met Val Ala Asn Lys 20
Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly 25 30
Ser Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala
40
Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys 45
Pro Asp His Val Tyr Lys Asn Val
55
Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu 60
Asp Glu Asn Met Val Arg Val Leu 65 70
Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr 75 80
Ile Glu Gin Asp Ala Val Val Thr 85
Ile Asn <210> 4 <211> 279
PL 244825 Β1 <212> PRT <213> Tritirachium <400> 4
Ala Ala Gin Thr Asn 1 5 album
Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr
15
Ser Pro Gly Thr Ser
Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gin Gly 25 30
Ser Cys Val· Tyr Val 35
Ile Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu 40 45
Phe Glu GTy Arg ATa
Gin Met Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg
60
Asp GTy Asn GTy His 65
Gly Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg
75 80
Thr Tyr GTy Val· Ala
Lys Lys Thr Gin Leu Phe Gly Val Lys Val Leu 90 95
Asp Asp Asn Gly Ser
100
Gly Gin Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp
105 110
Phe Val· Ala Ser Asp
115
Lys Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val
120 125
Ala Ser Leu Ser Leu
130
Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala
135 140
ATa ATa Arg Leu Gin 145
Ser Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly
150 155 160
Asn Asn Asn Ala Asp
165
Ala Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser
170 175
Val Cys Thr Val· GTy
180
Ala Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe
185 190
Ser Asn Tyr Gly Ser
195
Val Leu Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile
200 205
PL 244825 Β1
Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly Ser Thr Arg Ser
210215
Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala
225 230235
Gly Lys Thr Thr Ala Ala Ser Ala Cys Arg Tyr
245250
Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn Ile Pro Phe Gly
260265
Ala Tyr Asn Asn Tyr Gin Ala
275 <210> 5 <211> 1173 <212> DNA <213> Tritirachium album <400> 5 gaattcgaaa cgatgagact ctccgtcctc ctctccctcc 60 ccagctgttg aacaaagatc tgaagctgct ccattgatcg 120 gctaacaagt acatcgttaa gttcaaagag ggttctgctt 180 atggaaaaga tctctggtaa gccagaccac gtttacaaga 240 gctactttgg acgagaacat ggttagagtt ttgagagctc 300 gagcaagacg ctgttgttac tatcaacgct gctcagacta 360 agaatttctt ctacttcccc aggtacttcc acttactact 420 ggttcctgtg tttacgttat cgacactggt attgaggctt 480
Ile Ser Gly Thr Ser 220
Tyr Leu Met Thr Leu 240
Ile Ala Asp Thr Ala 255
Thr Val Asn Leu Leu 270 tcccctcgag tctgggcgct aggctagagg tgaaatggtt tgtcagcttt ggacgctgct acgttttctc cggtttcgct acccagacgt tgagtacatt acgctccatg gggtttggct acgacgaatc tgctggtcag cccacccaga atttgagggt agagctcaga tggttaagac ttactattac tcctccagag atggtaacgg tcacggtact 540
PL 244825 Β1 cattgtgctg gtactgttgg ttccagaact tacggtgttg ctaagaaaac 600 ggtgttaagg ttttggacga caacggttcc ggtcagtact ccactattat 660 gacttcgttg cttccgacaa gaacaacaga aactgtccaa agggtgttgt 720 tctttgggtg gtggttactc ttcttccgtt aactctgctg ctgctagatt 780 ggtgttatgg ttgctgttgc tgctggtaac aacaacgctg acgctagaaa 840 gcttctgaac catccgtttg tacagttggt gcttctgaca gatacgacag 900 ttctccaact acggttccgt tttggacatt ttcggtcctg gaacttccat 960 tggattggtg gttccactag atccatttcc ggtacttcta tggctactcc 1020 ggattggctg cttacttgat gactttgggt aagactactg ctgcttctgc 1080 atcgctgaca cagctaacaa gggtgacttg tccaacatcc cattcggtac 1140 ttggcttaca acaactacca ggcttaaggt acc
1173 tcagttgttc tgctggtatg tgcttccttg gcagtcctcc ctactctcca aagatcctcc cttgtccact acacgttgct ttgtagatat tgttaacttg <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer ProtK-G-F <400> 6 caggcgctct tctatggctc cagctgttga acaaagatct g 41 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> artificial
PL 244825 Β1 <220>
<223> primer ProtK-G-R <400> 7 gcagcgctct tctaccagcc tggtagttgt tgtaagccaa c 41 <210> 8 <211> 1139 <212> DNA <213> artificial· <220>
<223> pro-ProtK-G DNA <400> 8 caggcgctct tctatggctc cagctgttga acaaagatct gaagctgctc cattgatcga 60 ggctagaggt gaaatggttg ctaacaagta catcgttaag ttcaaagagg gttctgcttt 120 gtcagctttg gacgctgcta tggaaaagat ctctggtaag ccagaccacg tttacaagaa 180 cgttttctcc ggtttcgctg ctactttgga cgagaacatg gttagagttt tgagagctca 240 cccagacgtt gagtacattg agcaagacgc tgttgttact atcaacgctg ctcagactaa 300 cgctccatgg ggtttggcta gaatttcttc tacttcccca ggtacttcca cttactacta 360 cgacgaatct gctggtcagg gttcctgtgt ttacgttatc gacactggta ttgaggcttc 420 ccacccagaa tttgagggta gagctcagat ggttaagact tactattact cctccagaga 480 tggtaacggt cacggtactc attgtgctgg tactgttggt tccagaactt acggtgttgc 540 taagaaaact cagttgttcg gtgttaaggt tttggacgac aacggttccg gtcagtactc 600 cactattatt gctggtatgg acttcgttgc ttccgacaag aacaacagaa actgtccaaa 660 gggtgttgtt gcttccttgt ctttgggtgg tggttactct tcttccgtta actctgctgc 720 tgctagattg cagtcctccg gtgttatggt tgctgttgct gctggtaaca acaacgctga 780
PL 244825 Β1
cgctagaaac tactctccag 840 cttctgaacc atccgtttgt acagttggtg cttctgacag
atacgacaga agatcctcct 900 tctccaacta cggttccgtt ttggacattt tcggtcctgg
aacttccatc ttgtccactt 960 ggattggtgg ttccactaga tccatttccg gtacttctat
ggctactcca cacgttgctg 1020 gattggctgc ttacttgatg actttgggta agactactgc
tgcttctgct tgtagatata 1080 tcgctgacac agctaacaag ggtgacttgt ccaacatccc
attcggtact gttaacttgt 1139 tggcttacaa caactaccag gctggtagaa gagcgctgc
<210> 9 <211> 370 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> pro-ProtK-G protein <400> 9
Ala Pro Ala Val· Glu Gin Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala
1015
Arg Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly 20 2530
Ser Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys 35 4045
Pro Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu 50 5560
Asp Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr 65 70 7580
Ile Glu Gin Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gin Thr Asn Ala 85 9095
PL 244825 Β1
Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser
100
Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr
110
Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly
115 120
Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile
125
Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His
130 135
Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gin
140
Met Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser
145 150
Arg Asp Gly Asn Gly His Gly
155 160
Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly
165
Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys
170 175
Lys Thr Gin Leu Phe Gly Val Lys
180
Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly
190
Gin Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly
195 200
Asp Phe Val Ala Ser Asp Lys
205
Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly
210 215
Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly
220
Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn 225 230
Ala Ala Ala Arg Leu Gin Ser
235 240
Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala
245
Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala
250 255
Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu
260
Ser Val Cys Thr Val Gly Ala
270
Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser
275 280
Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val 285
Leu Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr
290 295
Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly
300
Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val
305 310 315 320
PL 244825 Β1
Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly 325330
Ser Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn 340345
Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala 355360
Ala Gly
370 <210> 10 <211> 7667 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> pPink_HC plasmid <400> 10 agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt 60 gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg 120 tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc 180 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa 240 acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg 300 tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca 360 agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca 420 gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa 480 ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca 540
Lys Thr Thr Ala Ala 335
Lys Gly Asp Leu Ser 350
Tyr Asn Asn Tyr Gin 365 ttgccatccg acatccacag atacactagc agcagaccgt acttttgcca tcgaaaaacc ttccttctat taggctacta gcgaggttca tgtttgttta ctccagatga gggctttctg aaactgacag tttaaacgct gatgaactaa gtttggttcg aaagtcggca taccgtttgt
PL 244825 Β1 cttgtttggt 600 ctctatcgct 660 ttttggatga
720 gctgatagcc
780 atataaacag 840 actttcataa
900 caacttgaga 960 aaggcctcag
1020 gtaattagtt 1080 ggaaggagtt
1140 gtattaagaa
1200 gcatgtaaca
1260 atttgcaagc 1320 ttctaggagg 1380 agaccgtgat 1440 acatcgacgg
1500 ttctcactgt
1560 ctggaatcaa 1620 attgattgac tctgaacccc ttatgcattg taacgttcat aaggaagctg ttgcgactgg agatcaaaaa gtaccggccg atgtcacgct agacaacctg cgttatttat ttatactgaa tggatccgcg aggccagcta tcttgatgat atcattcaaa agagattgag gatatatcct gaatgctcaa ggtgcacctg tctccacatt gatcaaaatt ccctgtctta ttccaattga acaactaatt gccatttaaa tacattcacg aagtctaggt atttcaaatt aaccttgctt gccgccttcc ggccgaatga ggtttttcac gatgaggagg catgtcaaca ttaccagaga aaataatctc tgccgaaacg gtatgcttcc taactgttct aacctttttt caagcttttg attcgaaacg tacaggcccc ccctcctccc ccctatttat tttctttttt gagaaggttt aaactctcat ttgttgaggc ctgctaagca ctatcgccaa cagatgctct caatcgaact attaatgctt caaatgggga aagattctgg aacccctact tttatcatca attttaacga gaattccgga ttttcctttg acatccgctc tttttttaat ttctgtacaa tgggacgctc ggattctcag cgctagcagg cattaatgct gttagctgcc aaagagagtt aatcaaggat agcgcagtct aacacccgct tgggaatact tgacagcaat ttattagctt cttttaacga ccggcatgcc tcgatatcat taaccgaaaa agttatgtta acgcgtgtac gaaggcttta gtaataggta ctcaatatca gcgcaagacc aaatgtgatg caagacagaa aagtacttgc
PL 244825 Β1 aaaaggaaca 1680 atgaaaaggc 1740 ggactatggc
1800 aggcattaga 1860 aagaattagc
1920 tagaaactgt 1980 acaccatcca
2040 ctggaatctt
2100 ttgctccaag 2160 tcgaagcaca 2220 ctacttccaa 2280 aattagagtt 2340 agaccacccg
2400 aagcagaaca
2460 tatcagctga 2520 tgatttcgaa 2580 tctctgctca
2640 gtatcaaggc 2700 tttgatcaag gctgcttttg ttatgatgga gttcttgaaa ggtaatggtt gcacaaggac aaagaaagct cggagttgag gccccacaat tgtaagagcc caccaacgct ttgtagaaga attggctcgt aaagttagag cactaaaccg aggttgcgat tagaacacca tatcattgca cacaacattt tttggagaag agaggcaatt gatcgtccat gtgagatcac aatatctgtc caaatattag atgttcctat tctggtcact ataactggtc attatgctca gccttagaaa aagatgggtc tacattctag ttggttggag attttaaaac cagagaatga ggtgctggtg cggtgacaaa agaatggatt ttgtagtgga tgtatgccga tggaaggcga atattgtgta ctgaaaacac tgtctgatgg atacaatcga tgccaatgcc atgttttggg cacccggtgc atatcaacat aagaatcaac ttatcatggg agtttggtgt ccagatatgc gtgctgctca gtctcagggt tccatatctg gtctaaagag gaagtttgct agtattctcc tgctccggcc tgtgaagact agaacttctt tgcatgtgta actagatttc tgctgaaaaa ttctgtatat aataggatct ccacttacca ttcagactct tccattcgaa ctttgaagcc tcttccagga atagaatcta ttgaagtccc gacatcagta ccttttgtta tacccaaccg agagttaatg ttcccaggcg gtaaatgaga acatctcagt accaaactat tctcacgggg ctgtacggaa tccatgttgg tccagtactg gatctacctg gttactattg gctagtagag atggttgctg
PL 244825 Β1 ccatgactcc 2760 actcgctaca 2820 acaacgccac 2880 ggcaaaagga 2940 ccaacttgga
3000 gttttttaat
3060 attttaaagg
3120 ataggcatta
3180 cctcatgtgc
3240 taaccattta
3300 tgactcatga
3360 tagcctatga
3420 aagcagatac
3480 cacagtcctg 3540 ttaacgcctc
3600 ttcttgcttg
3660 tcccccagaa
3720 cttctggaaa 3780 gttgccagtc ctcgattgtc caatgccgct aatgtccaag atctgaaggg agatgtatat ttcggtagaa ttatagattg ggcgcgccag cctgtagcgt aaaatatctg gtgtaagtga acccttcagc agacagttcc atctggctta aaagtgcgaa aaataatcaa aagaactgaa attggtgttc caaatgccta ctgttggcca tatatgaatg tatgaatcct ataatagtac atttgtcctc ggtaatattt gccataatgg atttcttttc gatttcttct tagtcatctt agaatccttt taatctttac tatcaagctt gaatggtgac gactgggcct gggcaccaga ctgtcaaggg gaggtgttcc tcaggatttt caatggagac atttgaagaa acgtaactta caaaaagttg accctgcacc ccaaacggtt cctcttcgcg gacagatcat gcaacagatt ctggatattg cccatttaca accaacagtt accgttgaca ttagagggtg caagcgcaac ctctacgttg tgtggctacg aggtacaatt cgaagtgttg tcgtctttga tctattccat gttagagcct tggaggaact tctcaattac aaagctcaag cacccttgag attttggaac tgaagaatga agttcatcca cagaaactcc ggtacacctt ctgaagttga ttcclggtat gatggtgtag gttgctatca gaccacaaat gggaaggcat atttagtatt tcataatttt ggcagttttg ttgcaaagag tatatactac ggcatcttct cccaactctc gcaactaaca tcgccaaagt atcagacttc cagtccaagt tatgggacat ccccttggtg tcctcgtcta
PL 244825 Β1 agtggtggtg
3840 gaaagaaaac
3900 atcgtggctt
3960 gttgatgact
4020 aagatcagta
4080 attcaaggcc
4140 aagctgaaag
4200 gccaggccga
4260 tctccataca
4320 ttactagtta
4380 cccagaggta
4440 aaagacaggg
4500 tgtgagccca
4560 atgcatcttg
4620 ttcagatcca
4680 ctcataggag
4740 tcgtacgatg
4800 ggtgtcgctt
4860 ccataggata tgaaagatgt ttgacaatgt cggacgaagc aagtggtatt aaacgttcac aacatattct cctcattgca tgttctatat aatccgacaa aaactatcga ccgagcacgt ccagtaccac tgtcagaagt ttttcccagc aattggaagg gaaaatcgat accttcaagc catctcgtac tttgcaactt ttatcaaaga tattcttgag tgacaataaa ctctaatatt gaaaggagac ccctttcaac tgactatcta caacaacaaa agaggacgac catgctggta ggttgatcgt cagtggaaca aggaaccgtc agaaaagaga ggacacatgt cggaggtgga gattgtatta ccggaagcag ttccaggtaa aaatattata actgttccct ggtcaggaag atcttccaag atctatcgtc gacttccaag atcatcacac aattatgcta gatttggcca ttattgactg ttgagaccaa tccggtgctc ggtgtttatg attgccttaa attgtctacg agtactttga ctttgatgtt ttggaaacgt agacaagaga actatgaaca ggtatgaaaa ctgttccctc atttgagaac ttgttggtgc atcctattgc agcaattgaa gaaatgatat tggagagatt acaagactcg cgaaggtaag cgggggccgt gaacaatggt attctgaccc accaaaaact gttcgacacg ttctctatcc agaagtggaa gaaagatatt ccatgttcgc tcaaagggta tgtcaatcct ttcacctgaa tggaactctt gtcgtctttg taaccgtgtg ttctcatgtg cttcgatgct agcaatgcaa aggacactgg cgtcaaggac ctatgacgag
PL 244825 Β1 tacatcgaaa
4920 atctggaccg
4980 tgaacggagg
5040 catggtcata
5100 gagccggaag
5160 ttgcgttgcg
5220 gaatcggcca
5280 tcactgactc
5340 cggtaatacg 5400 gccagcaaaa 5460 gcccccctga 5520 gactataaag
5580 ccctgccgct
5640 atagctcacg
5700 tgcacgaacc 5760 ccaacccggt
5820 gagcgaggta
5880 ctagaaggac 5940 ccatgaacaa ataggttggc acgtaagtag gctgtttcct cataaagtgt ctcactgccc acgcgcgggg gctgcgctcg gttatccaca ggccaggaac cgagcatcac ataccaggcg taccggatac ctgtaggtat ccccgttcag aagacacgac tgtaggcggt agtatttggt aatgagatcc cagagacgag gaatttatgg gtgtgaaatt aaagcctggg gctttccagt agaggcggtt gtcgttcggc gaatcagggg cgtaaaaagg aaaaatcgac tttccccctg ctgtccgcct ctcagttcgg cccgaccgct ttatcgccac gctacagagt atctgcgctc aacaataaca aatcaaagtg tttggccata gttatccgct gtgcctaatg cgggaaacct tgcgtattgg tgcggcgagc ataacgcagg ccgcgttgct gctcaagtca gaagctccct ttctcccttc tgtaggtcgt gcgccttatc tggcagcagc tcttgaagtg tgctgaagcc ccatcttgga aatccgaaga atggcctagc cacaattcca agtgagctaa gtcgtgccag gcgctcttcc ggtatcagct aaagaacatg ggcgtttttc gaggtggcga cgtgcgctct gggaagcgtg tcgctccaag cggtaactat cactggtaac gtggcctaac agttaccttc ggctgagaaa aaacgatcaa ttggcgtaat cacaacatac ctcacattaa ctgcattaat gcttcctcgc cactcaaagg tgagcaaaag cataggctcc aacccgacag cctgttccga gcgctttctc ctgggctgtg cgtcttgagt aggattagca tacggctaca ggaaaaagag
PL 244825 Β1 ttggtagctc
6000 agcagcagat
6060 ggtctgacgc
6120 aaaggatctt
6180 tatatgagta
6240 cgatctgtct
6300 tacgggaggg
6360 cggctccaga
6420 ctgcaacttt
6480 gttcgccagt
6540 gctcgtcgtt
6600 gatcccccat
6660 gtaagttggc
6720 tcatgccatc
6780 aatagtgtat
6840 cacatagcag
6900 caaggatctt
6960 cttcagcatc 7020 ttgatccggc tacgcgcaga tcagtggaac cacctagatc aacttggtct atttcgttca cttaccatct tttatcagca atccgcctcc taatagtttg tggtatggct gttgtgcaaa cgcagtgtta cgtaagatgc gcggcgaccg aactttaaaa accgctgttg ttttactttc aaacaaacca aaaaaaggat gaaaactcac cttttaaatt gacagttacc tccatagttg ggccccagtg ataaaccagc atccagtcta cgcaacgttg tcattcagct aaagcggtta tcactcatgg ttttctgtga agttgctctt gtgctcatca agatccagtt accagcgttt ccgctggtag ctcaagaaga gttaagggat aaaaatgaag aatgcttaat cctgactccc ctgcaatgat cagccggaag ttaattgttg ttgccattgc ccggttccca gctccttcgg ttatggcagc ctggtgagta gcccggcgtc ttggaaaacg cgatgtaacc ctgggtgagc cggtggtttt tcctttgatc tttggtcatg ttttaaatca cagtgaggca cgtcgtgtag accgcgagac ggccgagcgc ccgggaagct tacaggcatc acgatcaagg tcctccgatc actgcataat ctcaaccaag aatacgggat ttcttcgggg cactcgtgca aaaaacagga tttgtttgca ttttctacgg agattatcaa atctaaagta cctatctcag ataactacga ccacgctcac agaagtggtc agagtaagta gtggtgtcac cgagttacat gttgtcagaa tctcttactg tcattctgag aataccgcgc cgaaaactct cccaactgat aggcaaaatg
PL 244825 Β1 ccgcaaaaaa 7080 aatattattg
7140 tttagaaaaa
7200 tctaagaaac 7260 ttcgtctcgc 7320 cggtcacagc 7380 cgggtgttgg
7440 gagtgcacca
7500 ggcgccattc
7560 cgctattacg
7620 cagggttttc
7667 gggaataagg aagcatttat taaacaaata cattattatc gcgtttcggt ttgtctgtaa cgggtgtcgg tatgcggtgt gccattcagg ccagctggcg ccagtcacga gcgacacgga cagggttatt ggggttccgc atgacattaa gatgacggtg gcggatgccg ggctggctta gaaataccgc ctgcgcaact aaagggggat cgttgtaaaa aatgttgaat gtctcatgag gcacatttcc cctataaaaa aaaacctctg ggagcagaca actatgcggc acagatgcgt gttgggaagg gtgctgcaag cgacggccag actcatactc cggatacata ccgaaaagtg taggcgtatc acacatgcag agcccgtcag atcagagcag aaggagaaaa gcgatcggtg gcgattaagt tgaattg ttcctttttc tttgaatgta ccacctgacg acgaggccct ctcccggaga ggcgcgtcag attgtactga taccgcatca cgggcctctt tgggtaacgc <210> 11 <211> 8805 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> pPink_HC-ProtK-WT plasmid <400> 11 agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60 gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120 tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240
PL 244825 Β1 acaccatgac 300 tttccgaatg 360 agtgtggggt 420 gtcttggaac 480 ttgaaatgct 540 cttgtttggt 600 ctctatcgct 660 ttttggatga
720 gctgatagcc 780 atataaacag 840 actttcataa
900 caacttgaga 960 ctccgtcctc 1020 tgaagctgct 1080 gttcaaagag
1140 gccagaccac 1200 ggttagagtt 1260 tatcaacgct 1320 tttattagcc caacaagctc caaatagttt ctaatatgac aacggccagt attgattgac tctgaacccc ttatgcattg taacgttcat aaggaagctg ttgcgactgg agatcaaaaa ctctccctcc ccattgatcg ggttrtgctt gtttacaaga ttgagagctc gctcagacta tgtctatcct cgcattacac catgttcccc aaaagcgtga tggtcaaaaa gaatgctcaa ggtgcacctg tctccacatt gatcaaaatt ccctgtctta ttccaattga acaactaatt tcccctcgag aggctagagg tgtcagcttt acgttttctc acccagacgt acgctccatg ggcccccctg ccgaacatca aaatggccca tctcatccaa gaaacttcca aaataatctc tgccgaaacg gtatgcttcc taactgttct aacctttttt caagcttttg attcgaaacg tctgggcgct tgaaatggtt ggacgctgct cggtttcgct tgagtacatt gggtttggct gcgaggttca ctccagatga aaactgacag gatgaactaa aaagtcggca attaatgctt caaatgggga aagattctgg aacccctact tttatcatca attttaacga gaattcgaaa ccagctgttg gctaacaagt atggaaaaga gctactttgg gagcaagacg agaatttctt tgtttgttta gggctttctg tttaaacgct gtttggttcg taccgtttgt agcgcagtct aacacccgct tgggaatact tgacagcaat ttattagctt cttttaacga cgatgagact aacaaagatc acatcgttaa tctctggtaa acgagaacat ctgttgttac ctacttcccc
PL 244825 Β1 aggtacttcc 1380 cgacactggt 1440 ttactattac
1500 ttccagaact 1560 caacggttcc 1620 gaacaacaga 1680 ttcttccgtt 1740 tgctggtaac 1800 tacagttggt 1860 tttggacatt 1920 atccatttcc
1980 gactttgggt 2040 gggtgacttg 2100 ggcttaaggt
2160 aattagttat
2220 aaggagttag
2280 attaagaacg 2340 acttactact attgaggctt tcctccagag tacggtgttg ggtcagtact aactgtccaa aactctgctg aacaacgctg gcttctgaca ttcggtcctg ggtacttcta aagactactg tccaacatcc accggccggc gtcacgctta acaacctgaa ttatttatat acgacgaatc cccacccaga atggtaacgg ctaagaaaac ccactattat agggtgttgt ctgctagatt acgctagaaa gatacgacag gaacttccat tggctactcc ctgcttctgc cattcggtac catttaaata cattcacgcc gtctaggtcc ttcaaatttt tgctggtcag atttgagggt tcacggtact tcagttgttc tgctggtatg tgcttccttg gcagtcctcc ctactctcca aagatcctcc cttgtccact acacgttgct ttgtagatat tgttaacttg caggcccctt ctcctcccac ctatttattt tctttttttt ggttcctgtg agagctcaga cattgtgctg ggtgttaagg gacttcgttg tctttgggtg ggtgttatgg gcttctgaac ttctccaact tggattggtg ggattggctg atcgctgaca ttggcttaca ttcctttgtc atccgctcta tttttaatag ctgtacaaac tttacgttat tggttaagac gtactgttgg ttttggacga cttccgacaa gtggttactc ttgctgttgc catccgtttg acggttccgt gttccactag cttacttgat cagctaacaa acaactacca gatatcatgt accgaaaagg ttatgttagt gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat 2400
PL 244825 Β1 ttgcaagctg 2460 ctaggaggag
2520 accgtgattc
2580 atcgacggat
2640 ctcactgtag
2700 ggaatcaaga
2760 aaggaacatt 2820 gaaaaggcgc 2880 actatggctt
2940 gcattagagt 3000 gaattagcgg
3060 gaaactgtgc
3120 accatccaaa
3180 ggaatcttcg
3240 gctccaaggc 3300 gaagcacatg 3360 acttccaaca
3420 ttagagtttt 3480 gatccgcggc gccagctagg ttgatgatgg cattcaaaga agattgagca tatatccttt tgatcaagca tgcttttgtt atgatggaag tcttgaaaga taatggttgt acaaggacaa agaaagctca gagttgagat cccacaattc taagagccat ccaacgctat gtagaagagc cgccttccaa ccgaatgatt tttttcacct tgaggaggct tgtcaacaca accagagaca caacatttcg tggagaagag aggcaatttt tcgtccattg gagatcactg tatctgtcat aatattagct gttcctattg tggtcactat aactggtctg tatgctcaat cttagaaaca actctcatgg gttgaggccg gctaagcaca atcgccaagt gatgctctaa atcgaactaa gtgacaaagt aatggatttc gtagtggagt tatgccgaga gaaggcgaag attgtgtatg gaaaacactg tctgatggag acaatcgatg ccaatgccac gttttgggtg cccggtgctt attctcaggt ctagcaggct ttaatgctgc tagctgccaa agagagttca tcaaggataa ctcagggtat catatctgtt ctaaagagga agtttgctcc tattctccta ctccggccag tgaagacttt aacttcttgt catgtgtaac tagatttcac ctgaaaaatc ctgtatatct aataggtatt caatatcaag gcaagaccac atgtgatgtt agacagaact gtacttgcaa agaatctaat gaagtcccgg catcagtaag ttttgttaaa cccaaccgta agttaatgac cccaggcgct aaatgagatt atctcagttc caaactatct tcacggggaa gtacggaaag
PL 244825 Β1 accacccgat 3540 gcagaacaaa 3600 tcagctgaca 3660 atttcgaaag 3720 tctgctcata 3780 atcaaggcta 3840 atgactccgt 3900 tcgctacact 3960 aacgccacca 4020 caaaaggaaa 4080 aacttggaat 4140 tttttaatag
4200 tttaaaggtt 4260 aggcattatt 4320 tcatgtgcgg 4380 accatttacc
4440 actcatgaaa 4500 tggctcgtaa agttagagta ctaaaccgtt gttgcgatat gaacaccaca tcattgcagg tgccagtcat cgattgtcca atgccgctct tgtccaagta ctgaagggta atgtatatat cggtagaaat atagattggg cgcgccaggc tgtagcgtat aatatctgga gatgggtcat cattctagaa ggttggagtt tttaaaacag gagaatgacc tgctggtggt tggtgttcct aatgcctaga gttggccatc tatgaatgca tgaatcctat aatagtacac ttgtcctcca taatatttac cataatggcc ttcttttccc tttcttctga atcaacataa gaatcaaccc atcatgggtt tttggtgttc agatatgcct gctgctcatc gtcaagggct ggtgttcctg aggattttag atggagaccg ttgaagaatc gtaacttatc aaaagttggt cctgcacctg aaacggtttc tcttcgcgaa cagatcatca taggatcttc acttaccatc cagactctga cattcgaagt ttgaagccgc ttccaggaat ctacgttgga tggctacggt gtacaattga aagtgttggg gtctttgaat tattccattc tagagcctgg gaggaacttt tcaattacta agctcaaggg cccttgagcc catgttggaa cagtactgta tctacctgtg tactattgtc tagtagaggt ggttgctgcc tggtgtagac tgctatcaac ccacaaatgg gaaggcatcc ttagtattgt ataattttat cagttttgat gcaaagagcc tatactacta catcttcttg caactctcta gcctatgagt gtaagtgata gtcatcttgc aacagattat tttggaacgc aactaacaaa 4560
PL 244825 Β1 gcagatacac 4620 cagtcctgag
4680 aacgcctcat
4740 cttgcttgaa
4800 ccccagaaaa
4860 tctggaaaaa
4920 tggtggtgcc
4980 aagaaaactg
5040 cgtggctttt
5100 tgatgactcg
5160 gatcagtaaa
5220 tcaaggccaa
5280 gctgaaagaa
5340 caggccgacc
5400 tccatacatg
5460 actagttaaa
5520 cagaggtaaa
5580 agacagggcc 5640 ccttcagcag acagttccta ctggcttata agtgcgaaga ataatcaaga gaactgaagg ataggataca aaagatgttt gacaatgttt gacgaagcta gtggtatttg acgttcacct catattctga tcattgcacc ttctatattg tccgacaaca actatcgaag gagcacgtca aatcctttct atctttaccc tcaagcttac atggtgacac ctgggccttt gcaccagaca tctcgtacga tgcaacttcc atcaaagatt ttcttgagaa acaataaaac ctaatattgg aaggagacat ctttcaacat actatctaga acaacaaaat aggacgacaa tgctggtaga ggatattgtg catttacaag caacagttca cgttgacagg agagggtgct agcgcaactt ttgtattaag ggaagcagct ccaggtaatt atattataag tgttccctac tcaggaaggg cttccaagct ctatcgtcat cttccaagtt catcacacat ttatgctaag tttggccaga aagaatgatc ttcatccaat gaaactccca tacaccttta gaagttgacc cctggtattc tactttgaac ttgatgttgt ggaaacgttt acaagagaag tatgaacaga tatgaaaacc gttccctctc ttgagaactg gttggtgctt cctattgctg caattgaagt aatgatatta gccaaagtca cagacttctt gtccaagttt tgggacattc ccttggtgct ctcgtctaag caaaaactga tcgacacgat ctctatccgt aagtggaaaa aagatattat atgttcgcaa aaagggtagc tcaatccttc cacctgaatt gaactcttcc cgtctttgaa accgtgtgtg
PL 244825 Β1 tgagcccacc 5700 gcatcttgtg
5760 cagatccatt
5820 cataggagaa
5880 gtacgatgga
5940 tgtcgcttac
6000 catcgaaacc
6060 ctggaccgat
6120 aacggaggac
6180 tggtcatagc
6240 gccggaagca
6300 gcgttgcgct
6360 atcggccaac
6420 actgactcgc 6480 gtaatacggt
6540 cagcaaaagg
6600 ccccctgacg
6660 ctataaagat
6720 agtaccacgg tcagaagtca ttcccagcag ttggaaggag aaatcgatgg cttcaagccg atgaacaaaa aggttggcca gtaagtagga tgtttcctgt taaagtgtaa cactgcccgc gcgcggggag tgcgctcggt tatccacaga ccaggaaccg agcatcacaa accaggcgtt ttgatcgttt gtggaacatt gaaccgtctc aaaagagagg acacatgtat gaggtggaat tgagatccaa gagacgagaa atttatggtt gtgaaattgt agcctggggt tttccagtcg aggcggtttg cgttcggctg atcaggggat taaaaaggcc aaatcgacgc tccccctgga attgactgtg gagaccaaac cggtgctccg tgtttatgcg tgccttaaga tgtctacgat caataacacc tcaaagtgaa tggccataat tatccgctca gcctaatgag ggaaacctgt cgtattgggc cggcgagcgg aacgcaggaa gcgttgctgg tcaagtcaga agctccctcg gagagatttt aagactcgct aaggtaagag ggggccgtag acaatggtcg tctgacccct atcttggagg tccgaagaaa ggcctagctt caattccaca tgagctaact cgtgccagct gctcttccgc tatcagctca agaacatgtg cgtttttcca ggtggcgaaa tgcgctctcc ctcatgtgat tcgatgcttt caatgcaact gacactggtc tcaaggacgg atgacgagta ctgagaaaat acgatcaatg ggcgtaatca caacatacga cacattaatt gcattaatga ttcctcgctc ctcaaaggcg agcaaaaggc taggctccgc cccgacagga tgttccgacc
PL 244825 Β1 ctgccgctta 6780 agctcacgct 6840 cacgaacccc
6900 aacccggtaa 6960 gcgaggtatg
7020 agaaggacag 7080 ggtagctctt 7140 cagcagatta
7200 tctgacgctc 7260 aggatcttca 7320 tatgagtaaa 7380 atctgtctat 7440 cgggagggct
7500 gctccagatt 7560 gcaactttat 7620 tcgccagtta 7680 tcgtcgtttg
7740 tcccccatgt 7800 ccggatacct gtaggtatct ccgttcagcc gacacgactt taggcggtgc tatttggtat gatccggcaa cgcgcagaaa agtggaacga cctagatcct cttggtctga ttcgttcatc taccatctgg tatcagcaat ccgcctccat atagtttgcg gtatggcttc tgtgcaaaaa gtccgccttt cagttcggtg cgaccgctgc atcgccactg tacagagttc ctgcgctctg acaaaccacc aaaaggatct aaactcacgt tttaaattaa cagttaccaa catagttgcc ccccagtgct aaaccagcca ccagtctatt caacgttgtt attcagctcc agcggttagc ctcccttcgg taggtcgttc gccttatccg gcagcagcca ttgaagtggt ctgaagccag gctggtagcg caagaagatc taagggattt aaatgaagtt tgcttaatca tgactccccg gcaatgatac gccggaaggg aattgttgcc gccattgcta ggttcccaac tccttcggtc gaagcgtggc gctccaagct gtaactatcg ctggtaacag ggcctaacta ttaccttcgg gtggtttttt ctttgatctt tggtcatgag ttaaatcaat gtgaggcacc tcgtgtagat cgcgagaccc ccgagcgcag gggaagctag caggcatcgt gatcaaggcg ctccgatcgt gctttctcat gggctgtgtg tcttgagtcc gattagcaga cggctacact aaaaagagtt tgtttgcaag ttctacgggg attatcaaaa ctaaagtata tatctcagcg aactacgata acgctcaccg aagtggtcct agtaagtagt ggtgtcacgc agttacatga tgtcagaagt
PL 244825 Β1 aagttggccg 7860 atgccatccg
7920 tagtgtatgc 7980 catagcagaa 8040 aggatcttac
8100 tcagcatctt 8160 gcaaaaaagg 8220 tattattgaa 8280 tagaaaaata 8340 taagaaacca
8400 cgtctcgcgc 8460 gtcacagctt 8520 ggtgttggcg
8580 gtgcaccata
8640 cgccattcgc
8700 ctattacgcc 8760 cagtgttatc taagatgctt ggcgaccgag ctttaaaagt cgctgttgag ttactttcac gaataagggc gcatttatca aacaaatagg ttattatcat gtttcggtga gtctgtaagc ggtgtcgggg tgcggtgtga cattcaggct agctggcgaa actcatggtt ttctgtgact ttgctcttgc gctcatcatt atccagttcg cagcgtttct gacacggaaa gggttattgt ggttccgcgc gacattaacc tgacggtgaa ggatgccggg ctggcttaac aataccgcac gcgcaactgt agggggatgt atggcagcac ggtgagtact ccggcgtcaa ggaaaacgtt atgtaaccca gggtgagcaa tgttgaatac ctcatgagcg acatttcccc tataaaaata aacctctgac agcagacaag tatgcggcat agatgcgtaa tgggaagggc gctgcaaggc tgcataattc caaccaagtc tacgggataa cttcggggcg ctcgtgcacc aaacaggaag tcatactctt gatacatatt gaaaagtgcc ggcgtatcac acatgcagct cccgtcaggg cagagcagat ggagaaaata gatcggtgcg gattaagttg tcttactgtc attctgagaa taccgcgcca aaaactctca caactgatct gcaaaatgcc cctttttcaa tgaatgtatt acctgacgtc gaggcccttt cccggagacg cgcgtcagcg tgtactgaga ccgcatcagg ggcctcttcg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattg 8805
PL 244825 Β1 <210> 12 <211> 460 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> ProtK-G protein <400> 12
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe
5
Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn 20
Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin 25 30
Ile Pro Ala Gtu Ala Val Ile 35
Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 45
Asp Vat Ala Val· Leu Pro Phe
55
Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala
70
Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala
Ala Met Ala Pro Ala Val Glu Gin
95
Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu
100
Glu Ala Arg Gly Glu Met Val Ala
105 110
Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe
115
Glu Gly Ser Ala Leu Ser Ala Leu
125
Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile
130 135
Gly Lys Pro Asp His Val Tyr Lys
140
Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala
145 150
Thr Leu Asp Glu Asn Met Val Arg
155 160
Val Leu Arg Ala His Pro Asp
165
Glu Tyr Ile Glu Gin Asp Ala Val
170 175
PL 244825 Β1
Val· Thr Ile Asn Ala Ala Gin Thr
180
Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg
190
Ile Ser Ser Thr Ser Pro GTy Thr
195 200
Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser
205
Ala Gly Gin Gly Ser Cys Vat Tyr
210 215
Ile Asp Thr Gly Ile Glu Ala
220
Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg
225 230
Gin Met Wat Lys Thr Tyr Tyr
235 240
Tyr Ser Ser Arg Asp Gly Asn Gly
245
Gly Thr His Cys Ala Gly Thr
250 255
Val· Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val·
260
Lys Lys Thr Gin Leu Phe Gly
270
VaT Lys Val Leu Asp Asp Asn Gly
275 280
Gly Gin Tyr Ser Thr Ile Ile
285
Ala Gly Met Asp Phe VaT Ala Ser
290 295
Lys Asn Asn Arg Asn Cys Pro
300
Lys Gly Val· Val· Ala Ser Leu Ser 305 310
Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser
315 320
Val· Asn Ser Ala Ala Ala Arg Leu
325
Ser Ser Gly Val· Met Val· Ala
330 335
Val· Ala Ala Gly Asn Asn Asn Ala
340
Ala Arg Asn Tyr Ser Pro Ala
350
Ser Glu Pro Ser Val· Cys Thr Val·
355 360
Ala Ser Asp Arg Tyr Asp Arg
365
Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly
370 375
Val Leu Asp Ile Phe Gly Pro
380
Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly Ser Thr Arg Ser Ile
385 390 395 400
PL 244825 Β1
Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr
405
His Val Ala Gly Leu Ala Ala Tyr
410 415
Leu Met Thr Leu Gly Lys Thr
420
Ala Ala Ser Ala Cys Arg Tyr Ile
425 430
Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly
435
Leu Ser Asn Ile Pro Phe Gly Thr
445
Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn
450 455
Tyr Gin Ala Gly
460 <210> 13 <211> 90 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> ProtK-G SP protein <400> 13
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe 1 5
Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn 20
Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile
Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe
55
Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala
70
Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala 85
Ala Met <210> 14 <211> 1380
PL 244825 Β1 <212> DNA <213> artificial· <220>
<223> ΡΓΟΐΚ-G DNA <400> 14 atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc 60 cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc 120 tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa 180 aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga 240 tctctcgaga aaagagaggc cgaagctatg gctccagctg ttgaacaaag 300 gctccattga tcgaggctag aggtgaaatg gttgctaaca agtacatcgt 360 gagggttctg ctttgtcagc tttggacgct gctatggaaa agatctctgg 420 cacgtttaca agaacgtttt ctccggtttc gctgctactt tggacgagaa 480 gttttgagag ctcacccaga cgttgagtac attgagcaag acgctgttgt 540 gctgctcaga ctaacgctcc atggggtttg gctagaattt cttctacttc 600 tccacttact actacgacga atctgctggt cagggttcct gtgtttacgt 660 ggtattgagg cttcccaccc agaatttgag ggtagagctc agatggttaa 720 tactcctcca gagatggtaa cggtcacggt actcattgtg ctggtactgt 780 acttacggtg ttgctaagaa aactcagttg ttcggtgtta aggttttgga 840 tccggtcagt actccactat tattgctggt atggacttcg ttgcttccga 900 agaaactgtc caaagggtgt tgttgcttcc ttgtctttgg gtggtggtta 960 attggctgcc agttatcggt ctccactaac agagggtgtc atctgaagct taagttcaaa taagccagac catggttaga tactatcaac cccaggtact tatcgacact gacttactat tggttccaga cgacaacggt caagaacaac ctcttcttcc
PL 244825 Β1 gttaactctg 1020 aacaacaacg
1080 ggtgcttctg
1140 attttcggtc
1200 tccggtactt
1260 ggtaagacta 1320 ttgtccaaca 1380 ctgctgctag ctgacgctag acagatacga ctggaacttc ctatggctac ctgctgcttc tcccattcgg attgcagtcc aaactactct cagaagatcc catcttgtcc tccacacgtt tgcttgtaga tactgttaac tccggtgtta ccagcttctg tccttctcca acttggattg gctggattgg tatatcgctg ttgttggctt tggttgctgt aaccatccgt actacggttc gtggttccac ctgcttactt acacagctaa acaacaacta tgctgctggt ttgtacagtt cgttttggac tagatccatt gatgactttg caagggtgac ccaggctggt <210> 15 <211> 3837 <212> DNA <213> artificial· <220>
<223> pD912 plasmid <400> 15 gctcttcagg ttaaaggggc ggccgctcaa gaggatgtca gaatgccatt tgcctgagag 60 atgcaggctt catttttgat acttttttat ttgtaaccta tatagtatag gatttttttt 120 gtcattttgt ttcttctcgt acgagcttgc tcctgatcag cctatctcgc agcagatgaa 180 tatcttgtgg taggggtttg ggaaaatcat tcgagtttga tgtttttctt ggtatttccc 240 actcctcttc agagtacaga agattaagtg aaaccttcgt ttgtgcggat ccttcagtaa 300 tgtcttgttt cttttgttgc agtggtgagc cattttgact tcgtgaaagt ttctttagaa 360 tagttgtttc cagaggccaa acattccacc cgtagtaaag tgcaagcgta ggaagaccaa 420 gactggcata aatcaggtat aagtgtcgag cartggcagg tgatcttctg aaagtttcta 480
PL 244825 Β1 ctagcagata 540 cgcgtcctac 600 ggttgtcgat 660 cagttccaac 720 gcgaacaaat 780 acacaataag 840 attttctaga 900 ggactaaacc 960 tggtgctgtt 1020 ctttgccggt 1080 tgtgccagac
1140 gtggtctgag 1200 cggtgaacag 1260 tttcgtcgca 1320 ttagttttat 1380 ctatccaaaa
1440 taagcttttt 1500 agatccagta taaccttcgc tccgcgtaag aatctttgta taagagataa cgttcatatc gtgttgttac atggctaaac gagttctgga gttgtacgtg aacactctgg gtcgtgtcta ccctggggtc gaagaacagg tgtatgtata gtcctatctt atgctgttct gtcatgcata attcgttggt catgcatacc atattagagc tctcgaaacc cgctgggtga tttatacttc tcacctctgc ctgatagact acgacgttac catgggtatg ccaacttccg gtgagtttgc actaacaatt cggatgtttt atcaagccag ctcttttttt tggcaacaat ccagtttgtt caaggacgcc acttcattgt gcgacttcaa ctttctcgct cggctcgtat tgttccagtc cggtttctcc cctgttcatc ggttcgtggt tgatgcatct actgcgtgat gacaccttac attatctatt caatctatgt cccttcggta gtaccgtgtg gttatcgatc tgttgcaatt gttgcgcttg acgccaatat ttaaaaaatt aatacgacaa ctgactgctc cgtgacttcg tccgcagttc ctggacgaac ggtccagcta ccagctggta gattatttag tatgccctta ccgcgaacgt taattatacc gatctaagaa aacgtgacaa ccaagtgagc aaagtaaaat gatgtgcggc atccgaaaaa ggtgtaagga gtgatgttgc tagaggacga aggaccaggt tgtacgctga tgaccgagat actgcgtgca agagtattta tattctgtaa caactaaaaa ttgcatccac agattctcct gccaaatttt gcataatcct ttacaacatg gctatatggg agcacttagc 1560
PL 244825 Β1 gccctccaaa 1620 gtgctctctt 1680 cggccttatc
1740 ggatctgatt 1800 ggatcttctt 1860 ccgctaccag
1920 actggcttca
1980 caccacttca
2040 gtggctgctg
2100 ccggataagg
2160 cgaacgacct 2220 cccgaaggga 2280 acgagggagc 2340 ctctgacttg
2400 gccagcaacg
2460 tttcctgcgg
2520 atgatgacat
2580 acactgaaaa 2640 acccatattg tttattaaag gtgggaccac accttagctg gagatccttt cggtggtttg gcagagcgca agaactctgt ccagtggcga cgcagcggtc acaccgaact gaaaggcgga ttccaggggg agcgtcgatt cggccttttt tacccagatc ttggatttgg atacacagtt cctacgcatg agaagctcta attgcctgaa caggtaccac ttttctgcgc tttgccggat gataccaaat agcaccgcct taagtcgtgt gggctgaacg gagataccta caggtatccg aaacgcctgg tttgtgatgc acggttcctg caattcccgc ttgactcatg attattcatt tataggtgtt tatcggagaa ttggtttgcc tgagcgtcag gtaatctgct caagagctac actgttcttc acatacctcg cttaccgggt gggggttcgt cagcgtgagc gtaagcggca tatctttata tcgtcagggg gccttttgct tttgactgcc ttggtattgt taaataacat ttttccacaa gcttctgtgg ccggaagatt accccgtaga gcttgcaaac caactctttt tagtgtagcc ctctgctaat tggactcaag gcacacagcc tatgagaaag gggtcggaac gtcctgtcgg ggcggagcct ggccttttgc tgaaatctcc gaaatagacg ccaaagacga tattttctct ccgttatatt ggggaaactt aaagatcaaa aaaaaaacca tccgaaggta gtagttaggc cctgttacca acgatagtta cagcttggag cgccacgctt aggagagcgc gtttcgccac atggaaaaac tcacatgttc atcgcctaca cagatcggga aaggttgaat
PL 244825 Β1 gaaacctttt 2780 caggagggga 2760 tcaacaccca
2820 tcattccaat
2880 gcccccctgg
2940 cgaacatcac
3000 aatggcccaa
3060 ctcatccaag
3120 aaacttccaa
3180 aataatctca
3240 gccgaaacgc
3300 tatgcttcca
3360 aactgttcta
3420 accttttttt
3480 aagcttttga
3540 ttgaaagaat
3600 ctcctctgca 3660 tgccatccga tacactagca cttttgccat tccttctatt cgaggttcat tccagatgag aactgacagt atgaactaag aagtcggcat ttaatgctta aaatggggaa agattctggt acccctactt ttatcatcat ttttaacgac tccgaaacga ttggctgccc catccacagg gcagaccgtt cgaaaaacca aggctactaa gtttgtttat ggctttctga ttaaacgctg tttggttcgt accgtttgtc gcgcagtctc acacccgctt gggaatactg gacagcaata tattagctta ttttaacgac tgagattccc ctgttaacac tccattctca gcaaacgcag gcccagttat caccatgact ttccgaatgc gtgtggggtc tcttggaacc tgaaatgcta ttgtttggta tctatcgctt tttggatgat ctgatagcct tataaacaga ctttcataat aacttgagaa atctattttc taccactgaa cacataagtg gacctccact tgggcttgat ttattagcct aacaagctcc aaatagtttc taatatgaca acggccagtt ttgattgacg ctgaaccccg tatgcattgt aacgttcatg aggaagctgc tgcgactggt gatcaaaaaa accgctgtct gacgagactg ccaaacgcaa cctcttctcc tggagctcgc gtctatcctg gcattacacc atgttcccca aaagcgtgat ggtcaaaaag aatgctcaaa gtgcacctgt ctccacattg atcaaaattt cctgtcttaa tccaattgac caactaatta tgttcgctgc ctcaaattcc agctgaagca gttatcggtt actctgacct tgagggtgat ttcgacgtcg ctgttttgcc 3720
PL 244825 Β1 tttctctaac tccactaaca acggtttgtt gttcattaac accactatcg 3780 tgctaaggaa gagggtgtct ctctcgagaa aagagaggcc gaagctatgt 3837 <210> 16 <211> 4928 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> pD912-ProtK-G plasmid <400> 16 aacatccaaa gacgaaaggt tgaatgaaac ctttttgcca tccgacatcc 60 tctcacacat aagtgccaaa cgcaacagga ggggatacac tagcagcaga 120 cgcaggacct ccactcctct tctcctcaac acccactttt gccatcgaaa 180 gttattgggc ttgattggag ctcgctcatt ccaattcctt ctattaggct 240 tgactttatt agcctgtcta tcctggcccc cctggcgagg ttcatgtttg 300 aatgcaacaa gctccgcatt acacccgaac atcactccag atgagggctt 360 gggtcaaata gtttcatgtt ccccaaatgg cccaaaactg acagtttaaa 420 gaacctaata tgacaaaagc gtgatctcat ccaagatgaa ctaagtttgg 480 tgctaacggc cagttggtca aaaagaaact tccaaaagtc ggcataccgt 540 tggtattgat tgacgaatgc tcaaaaataa tctcattaat gcttagcgca 600 cgcttctgaa ccccggtgca cctgtgccga aacgcaaatg gggaaacacc 660 atgattatgc attgtctcca cattgtatgc ttccaagatt ctggtgggaa 720 cttccattgc gaagagc acaggtccat ccgttgcaaa aaccagccca actaacacca tttatttccg tctgagtgtg cgctgtcttg ttcgttgaaa ttgtcttgtt gtctctctat cgctttttgg tactgctgat
PL 244825 Β1 agcctaacgt 780 acagaaggaa 840 ataattgcga
900 gagaagatca 960 ttttcaccgc 1020 ctgaagacga 1080 gtgatttcga
1140 ttaacaccac 1200 aggccgaagc 1260 ctagaggtga 1320 cagctttgga
1380 ttttctccgg 1440 cagacgttga
1500 ctccatgggg 1560 acgaatctgc 1620 acccagaatt 1680 gtaacggtca 1740 agaaaactca 1800 tcatgatcaa gctgccctgt ctggttccaa aaaaacaact tgtcttgttc gactgctcaa cgtcgctgtt tatcgcttcc tatggctcca aatggttgct cgctgctatg tttcgctgct gtacattgag tttggctaga tggtcagggt tgagggtaga cggtactcat gttgttcggt aatttaactg cttaaacctt ttgacaagct aattattgaa gctgcctcct attccagctg ttgcctttct attgctgcta gctgttgaac aacaagtaca gaaaagatct actttggacg caagacgctg atttcttcta tcctgtgttt gctcagatgg tgtgctggta gttaaggttt ttctaacccc tttttttatc tttgatttta agaattccga ctgcattggc aagcagttat ctaactccac aggaagaggg aaagatctga tcgttaagtt ctggtaagcc agaacatggt ttgttactat cttccccagg acgttatcga ttaagactta ctgttggttc tggacgacaa tacttgacag atcattatta acgactttta aacgatgaga tgcccctgtt cggttactct taacaacggt tgtctctctc agctgctcca caaagagggt agaccacgtt tagagttttg caacgctgct tacttccact cactggtatt ctattactcc cagaacttac cggttccggt caatatataa gcttactttc acgacaactt ttcccatcta aacactacca gaccttgagg ttgttgttca gagaaaagag ttgatcgagg tctgctttgt tacaagaacg agagctcacc cagactaacg tactactacg gaggcttccc tccagagatg ggtgttgcta cagtactcca
PL 244825 Β1 ctattattgc 1860 gtgttgttgc 1920 ctagattgca 1980 ctagaaacta
2040 acgacagaag
2100 cttccatctt
2160 ctactccaca
2220 cttctgcttg
2280 tcggtactgt
2340 caagaggatg
2400 tatttgtaac
2460 tgctcctgat 2520 cattcgagtt 2580 gtgaaacctt
2640 agccattttg
2700 acccgtagta 2760 gagcactggc 2820 tggtatggac ttccttgtct gtcctccggt ctctccagct atcctccttc gtccacttgg cgttgctgga tagatatatc taacttgttg tcagaatgcc ctatatagta cagcctatct tgatgttttt cgtttgtgcg acttcgtgaa aagtgcaagc aggtgatctt ttcgttgctt ttgggtggtg gttatggttg tctgaaccat tccaactacg attggtggtt ttggctgctt gctgacacag gcttacaaca atttgcctga taggattttt cgcagcagat cttggtattt gatccttcag agtttcttta gtaggaagac ctgaaagttt ccgacaagaa gttactcttc ctgttgctgc ccgtttgtac gttccgtttt ccactagatc acttgatgac ctaacaaggg actaccaggc gagatgcagg tttgtcattt gaatatcttg cccactcctc taatgtcttg gaatagttgt caagactggc ctactagcag caacagaaac ttccgttaac tggtaacaac agttggtgct ggacattttc catttccggt tttgggtaag tgacttgtcc tggttaaagg cttcattttt tgtttcttct tggtaggggt ttcagagtac tttcttttgt ttccagaggc ataaatcagg ataagatcca tgtccaaagg tctgctgctg aacgctgacg tctgacagat ggtcctggaa acttctatgg actactgctg aacatcccat ggcggccgct gatacttttt cgtacgagct ttgggaaaat agaagattaa tgcagtggtg caaacattcc tataagtgtc gtagtcatgc atatggcaac aatgtaccgt gtggatctaa gaacgcgtcc tactaacctt cgcattcgtt 2880
PL 244825 Β1 ggtccagttt 2940 acccaaggac 3000 agcacttcat
3060 accgcgactt
3120 tgactttctc 3180 ttccggctcg
3240 tgctgttcca
3300 actcggtttc
3360 taccctgttc
3420 atgggttcgt
3480 ccgtgatgca
3540 tgcactgcgt
3600 attgacacct 3660 tttattatct 3720 cagcaatcta 3780 tttcccttcg
3840 cctttacaac
3900 atgtataggt 3960 gttgttatcg gcctgttgca tgtgttgcgc caaacgccaa gctttaaaaa tataatacga gtcctgactg tcccgtgact atctccgcag ggtctggacg tctggtccag gatccagctg tacgattatt atttatgccc tgtccgcgaa gtataattat atggctatat gttttttcca atcaacgtga attccaagtg ttgaaagtaa tatgatgtgc attatccgaa caaggtgtaa ctcgtgatgt tcgtagagga ttcaggacca aactgtacgc ctatgaccga gtaactgcgt tagagagtat ttatattctg cgtcaactaa accttgcatc gggagcactt caatattttc caaggttgtc agccagttcc aatgcgaaca ggcacacaat aaaattttct ggaggactaa tgctggtgct cgactttgcc ggttgtgcca tgagtggtct gatcggtgaa gcatttcgtc ttattagttt taactatcca aaataagctt cacagattct agcgccctcc tctgtgctct gattccgcgt aacaatcttt aattaagaga aagcgttcat agagtgttgt accatggcta gttgagttct ggtgttgtac gacaacactc gaggtcgtgt cagccctggg gcagaagaac tattgtatgt aaagtcctat tttatgctgt cctgccaaat aaaacccata ctttttatta aagcatgcat gtaatattag taatctcgaa atccgctggg tactttatac aactcacctc ggactgatag gtgacgacgt tggcatgggt ctaccaactt gtcgtgagtt aggactaaca atacggatgt cttatcaagc tctctctttt tttgcataat ttgcctacgc aagagaagct
PL 244825 Β1 ctatatcgga 4020 gaattggttt
4080 cactgagcgt
4140 cgcgtaatct
4200 gatcaagagc
4260 aatactgttc
4320 cctacatacc
4380 tgtcttaccg
4440 acggggggtt
4500 ctacagcgtg
4560 ccggtaagcg
4620 tggtatcttt
4680 tgctcgtcag
4740 ctggcctttt
4800 cgctttgact
4860 atgttggtat
4920 atttaaat
4928 gaagcttctg gccccggaag cagaccccgt gctgcttgca taccaactct ttctagtgta tcgctctgct ggttggactc cgtgcacaca agctatgaga gcagggtcgg atagtcctgt gggggcggag gctggccttt gcctgaaatc tgtgaaatag tggccgttat attggggaaa agaaaagatc aacaaaaaaa ttttccgaag gccgtagtta aatcctgtta aagacgatag gcccagcttg aagcgccacg aacaggagag cgggtttcgc cctatggaaa tgctcacatg tccatcgcct acgcagatcg attcggcctt cttggatctg aaaggatctt ccaccgctac gtaactggct ggccaccact ccagtggctg ttaccggata gagcgaacga cttcccgaag cgcacgaggg cacctctgac aacgccagca ttctttcctg acaatgatga ggaacactga atcgtgggac attaccttag cttgagatcc cagcggtggt tcagcagagc tcaagaactc ctgccagtgg aggcgcagcg cctacaccga ggagaaaggc agcttccagg ttgagcgtcg acgcggcctt cggtacccag catttggatt aaaatacaca cacattgcct ctgcaggtac tttttttctg ttgtttgccg gcagatacca tgtagcaccg cgataagtcg gtcgggctga actgagatac ggacaggtat gggaaacgcc atttttgtga tttacggttc atccaattcc tggttgactc gttattattc <210> 17 <211> 459
PL 244825 Β1 <212> PRT <213> Tritirachium <400> 17
Met Arg Phe Pro Ser
5 album
Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
15
Ala Leu Ala Ala Pro
Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin 25 30
Ile Pro Ata GTu ATa 35
Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 40 45
Asp Val· Ata Val Leu
Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
60
Phe Ile Asn Thr Thr 65
Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg 85
Glu Ala Glu Ala Met Ala Pro Ala Val Glu Gin 90 95
Arg Ser Glu Ala ATa
100
Pro Leu Ile Glu Ala Arg Gly Glu Met Val Ala
105 110
Asn Lys Tyr Ile Val
115
Lys Phe Lys Glu Gly Ser Ala Leu Ser Ala Leu
120 125
Asp Ata Ala Met Glu
130
Lys Ile Ser Gly Lys Pro Asp His Val Tyr Lys
135 140
Asn Val Phe Ser Gly 145
Phe Ala Ala Thr Leu Asp Glu Asn Met Val Arg
150 155 160
Val· Leu Arg Ala His
165
Pro Asp Val Glu Tyr Ile Glu Gin Asp Ala Val
170 175
Val Thr Ile Asn Ala
180
Ala Gin Thr Asn Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg
185 190
Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser
195 200 205
PL 244825 Β1
Ala Gly
210
Gin Gly
Ser Cys
Ser His
225
Pro Glu
Phe Glu
230
Tyr Ser
Ser Arg
Asp Gly 245
Val· Gly
Ser Arg
260
Thr Tyr
Val Tyr 215
Gly Arg
Asn Gly
Gly Val
Val Ile
Ala Gin
His Gly
250
Ala Lys 265
Asp Thr
220
Met Val
235
Thr His
Lys Thr
Gly Ile
Lys Thr
Cys Ala
Gin Leu
270
Glu Ala
Tyr Tyr
240
Gly Thr
255
Phe Gly
Val Lys
Val Leu
275
Asp Asp
Asn Gly
280
Ser Gly
Gin Tyr
Ser Thr
285
Ile Ile
Ala Gly
290
Met Asp
Phe Val
Ala Ser 295
Asp Lys
Asn Asn
300
Arg Asn
Cys Pro
Lys Gly
305
Val Val
Ala Ser
310
Leu Ser
Leu Gly
Gly Gly 315
Tyr Ser
Ser Ser
320
Val· Asn
Ser Ala
Ala Ala 325
Arg Leu
Gin Ser
330
Ser Gly
Val Met
Val Ala 335
Val· Ala
Ala Gly
340
Asn Asn
Asn Ala
Asp Ala 345
Arg Asn
Tyr Ser
350
Pro Ala
Ser Glu
Pro Ser
355
Val Cys
Thr Val
360
Gly Ala
Ser Asp
Arg Tyr 365
Asp Arg
Arg Ser
370
Ser Phe
Ser Asn
Tyr Gly
375
Ser Val
Leu Asp
380
Ile Phe
Gly Pro
Gly Thr
385
Ser Ile
Leu Ser
390
Thr Trp
Ile Gly
Gly Ser 395
Thr Arg
Ser Ile
400
Ser Gly
Thr Ser
Met Ala 405
Thr Pro
His Val
410
Ala Gly
Leu Ala
Ala Tyr 415
PL 244825 Β1
Leu Met Thr Leu Gty Lys Thr Thr Ala Ala Ser 420425
Ata Asp Thr Ata Asn Lys Gty Asp Leu Ser Asn 435440
Val· Asn Leu Leu Ata Tyr Asn Asn Tyr Gin Ata 450455
Ala Cys Arg Tyr Ile 430
Ile Pro Phe Gly Thr 445 <210> 18 <211> 59 <212> DNA <213> artificiat <220>
<223> ProtK-G-out-F primer <400> 18 gcttacaaca actaccaggc ttgataaagg ggcggccgct 59 caagaggatg tcagaatgc <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> artificiat <220>
<223> ProtK-G-out-R primer <400> 19 gccgcccctt tatcaagcct ggtagttgtt gtaagc 36 <210> 20 <211> 1380 <212> DNA <213> Tritirachium album <400> 20 atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg 60 cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc 120 tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc 180 cctcctctgc attggctgcc cagctgaagc agttatcggt ctttctctaa ctccactaac
PL 244825 Β1 aacggtttgt 240 tctctcgaga
300 gctccattga 360 gagggttctg 420 cacgtttaca 480 gtttlgagag
540 gctgctcaga
600 tccacttact
660 ggtattgagg
720 tactcctcca
780 acttacggtg
840 tccggtcagt
900 agaaactgtc
960 gttaactctg 1020 aacaacaacg 1080 ggtgcttctg 1140 attttcggtc
1200 tccggtactt 1260 tgttcattaa aaagagaggc tcgaggctag ctttgtcagc agaacglttt ctcacccaga ctaacgctcc actacgacga cttcccaccc gagatggtaa ttgctaagaa actccactat caaagggtgt ctgctgctag ctgacgctag acagatacga ctggaacttc ctatggctac caccactatc cgaagctatg aggtgaaatg tttggacgct ctccggtttc cgttgagtac atggggtttg atctgctggt agaatttgag cggtcacggt aactcagttg tattgctggt tgttgcttcc attgcagtcc aaactactct cagaagatcc catcttgtcc tccacacgtt gcttccattg gctccagctg gttgctaaca gctatggaaa gctgctactt attgagcaag gctagaattt cagggttcct ggtagagctc actcattgtg ttcggtgtta atggacttcg ttgtctttgg tccggtgtta ccagcttctg tccttctcca acttggattg gctggattgg ctgctaagga ttgaacaaag aglacatcgt agatctctgg tggacgagaa acgctgttgt ctlctacttc gtgtttacgt agatggttaa ctggtactgt aggttttgga ttgcttccga gtggtggtta tggttgctgt aaccatccgt actacggttc gtggttccac ctgcttactt agagggtgtc atctgaagct taagttcaaa taagccagac catggttaga tactatcaac cccaggtact tatcgacact gacttactat tggttccaga cgacaacggt caagaacaac ctcttcttcc tgctgctggt ttgtacagtt cgttttggac tagatccatt gatgactttg
PL 244825 Β1 ggtaagacta ctgctgcttc tgcttgtaga tatatcgctg acacagctaa 1320 ttgtccaaca tcccattcgg tactgttaac ttgttggctt acaacaacta 1380 caagggtgac ccaggcttga <210> 21 <211> 4928 <212> DNA <213> artificial· <220>
<223> pD912-ProtK plasmid <400> 21 aacatccaaa gacgaaaggt tgaatgaaac ctttttgcca tccgacatcc 60 tctcacacat aagtgccaaa cgcaacagga ggggatacac tagcagcaga 120 cgcaggacct ccactcctct tctcctcaac acccactttt gccatcgaaa 180 gttattgggc ttgattggag ctcgctcatt ccaattcctt ctattaggct 240 tgactttatt agcctgtcta tcctggcccc cctggcgagg ttcatgtttg 300 aatgcaacaa gctccgcatt acacccgaac atcactccag atgagggctt 360 gggtcaaata gtttcatgtt ccccaaatgg cccaaaactg acagtttaaa 420 gaacctaata tgacaaaagc gtgatctcat ccaagatgaa ctaagtttgg 480 tgctaacggc cagttggtca aaaagaaact tccaaaagtc ggcataccgt 540 tggtattgat tgacgaatgc tcaaaaataa tctcattaat gcttagcgca 600 cgcttctgaa ccccggtgca cctgtgccga aacgcaaatg gggaaacacc 660 atgattatgc attgtctcca cattgtatgc ttccaagatt ctggtgggaa 720 acaggtccat ccgttgcaaa aaccagccca actaacacca tttatttccg tctgagtgtg cgctgtcttg ttcgttgaaa ttgtcttgtt gtctctctat cgctttttgg tactgctgat agcctaacgt tcatgatcaa aatttaactg ttctaacccc tacttgacag caatatataa 780
PL 244825 Β1 acagaaggaa 840 ataattgcga 900 gagaagatca 960 ttttcaccgc 1020 ctgaagacga 1080 gtgatttcga 1140 ttaacaccac 1200 aggccgaagc 1260 ctagaggtga 1320 cagctttgga 1380 ttttctccgg 1440 cagacgttga
1500 ctccatgggg
1560 acgaatctgc
1620 acccagaatt 1680 gtaacggtca
1740 agaaaactca 1800 ctattattgc 1860 gctgccctgt ctggttccaa aaaaacaact tgtcttgttc gactgctcaa cgtcgctgtt tatcgcttcc tatggctcca aatggttgct cgctgctatg tttcgctgct gtacattgag tttggctaga tggtcagggt tgagggtaga cggtactcat gttgttcggt tggtatggac cttaaacctt ttgacaagct aattattgaa gctgcctcct attccagctg ttgcctttct attgctgcta gctgttgaac aacaagtaca gaaaagatct actttggacg caagacgctg atttcttcta tcctgtgttt gctcagatgg tgtgctggta gttaaggttt ttcgttgctt tttttttatc tttgatttta agaattccga ctgcattggc aagcagttat ctaactccac aggaagaggg aaagatctga tcgttaagtt ctggtaagcc agaacatggt ttgttactat cttccccagg acgttatcga ttaagactta ctgttggttc tggacgacaa ccgacaagaa atcattatta acgactttta aacgatgaga tgcccctgtt cggttactct taacaacggt tgtctctctc agctgctcca caaagagggt agaccacgtt tagagttttg caacgctgct tacttccact cactggtatt ctattactcc cagaacttac cggttccggt caacagaaac gcttactttc acgacaactt ttcccatcta aacactacca gaccttgagg ttgttgttca gagaaaagag ttgatcgagg tctgctttgt tacaagaacg agagctcacc cagactaacg tactactacg gaggcttccc tccagagatg ggtgttgcta cagtactcca tgtccaaagg
PL 244825 Β1 gtgttgttgc 1920 ctagattgca
1980 ctagaaacta
2040 acgacagaag
2100 cttccatctt
2160 ctactccaca
2220 cttctgcttg
2280 tcggtactgt
2340 caagaggatg
2400 tatttgtaac
2460 tgctcctgat 2520 cattcgagtt
2580 gtgaaacctt
2640 agccattttg
2700 acccgtagta 2760 gagcactggc 2820 atatggcaac
2880 ggtccagttt
2940 ttccttgtct gtcctccggt ctctccagct atcctccttc gtccacttgg cgttgctgga tagatatatc taacttgttg tcagaatgcc ctatatagta cagcctatct tgatgttttt cgtttgtgcg acttcgtgaa aagtgcaagc aggtgatctt aatgtaccgt gttgttatcg ttgggtggtg gttatggttg tctgaaccat tccaactacg attggtggtt ttggctgctt gctgacacag gcttacaaca atttgcctga taggattttt cgcagcagat cttggtattt gatccttcag agtttcttta gtaggaagac ctgaaagttt gtggatctaa atcaacgtga gttactcttc ctgttgctgc ccgtttgtac gttccgtttt ccactagatc acttgatgac ctaacaaggg actaccaggc gagatgcagg tttgtcattt gaatatcttg cccactcctc taatgtcttg gaatagttgt caagactggc ctactagcag gaacgcgtcc caaggttgtc ttccgttaac tggtaacaac agttggtgct ggacattttc catttccggt tttgggtaag tgacttgtcc ttgataaagg cttcattttt tgtttcttct tggtaggggt ttcagagtac tttcttttgt ttccagaggc ataaatcagg ataagatcca tactaacctt gattccgcgt tctgctgctg aacgctgacg tctgacagat ggtcctggaa acttctatgg actactgctg aacatcccat ggcggccgct gatacttttt cgtacgagct ttgggaaaat agaagattaa tgcagtggtg caaacattcc tataagtgtc gtagtcatgc cgcattcgtt aagcatgcat
PL 244825 Β1 acccaaggac 3000 agcacttcat
3060 accgcgactt
3120 tgactttctc
3180 ttccggctcg
3240 tgctgttcca
3300 actcggtttc
3360 taccctgttc 3420 atgggttcgt 3480 ccgtgatgca 3540 tgcactgcgt
3600 attgacacct 3660 tttattatct
3720 cagcaatcta
3780 tttcccttcg 3840 cctttacaac
3900 atgtataggt
3960 ctatatcgga 4020 gcctgttgca tgtgttgcgc caaacgccaa gctttaaaaa tataatacga gtcctgactg tcccgtgact atctccgcag ggtctggacg tctggtccag gatccagctg tacgattatt atttatgccc tgtccgcgaa gtataattat atggctatat gttttftcca gaagcttctg attccaagtg ttgaaagtaa tatgatgtgc attatccgaa caaggtgtaa ctcgtgatgt tcgtagagga ttcaggacca aactgtacgc ctatgaccga gtaactgcgt tagagagtat ttatattctg cgtcaactaa accttgcatc gggagcactt caatattttc tggccgttat agccagttcc aatgcgaaca ggcacacaat aaaattttct ggaggactaa tgctggtgct cgactttgcc ggttgtgcca tgagtggtct gatcggtgaa gcatttcgtc ttattagttt taactatcca aaataagctt cacagattct agcgccctcc tctgtgctct attcggcctt aacaatcttt aattaagaga aagcgttcat agagtgttgt accatggcta gttgagttct ggtgttgtac gacaacactc gaggtcgtgt cagccctggg gcagaagaac tattgtatgt aaagtcctat tttatgctgt cctgccaaat aaaacccata ctttttatta atcgtgggac gtaatattag taatctcgaa atccgctggg tactttatac aactcacctc ggactgatag gtgacgacgt tggcatgggt ctaccaactt gtcgtgagtt aggactaaca atacggatgt cttatcaagc tctctctttt tttgcataat ttgcctacgc aagagaagct cacattgcct
PL 244825 Β1 gaattggttt
4080 cactgagcgt
4140 cgcgtaatct
4200 gatcaagagc
4260 aatactgttc
4320 cctacatacc
4380 tgtcttaccg
4440 acggggggtt
4500 ctacagcgtg 4560 ccggtaagcg 4620 tggtatcttt
4680 tgctcgtcag
4740 ctggcctttt
4800 cgctttgact
4860 atgttggtat
4920 atttaaat
4928 gccccggaag cagaccccgt gctgcttgca taccaactct ttctagtgta tcgctctgct ggttggactc cgtgcacaca agctatgaga gcagggtcgg atagtcctgt gggggcggag gctggccttt gcctgaaatc tgtgaaatag attggggaaa agaaaagatc aacaaaaaaa ttttccgaag gccgtagtta aatcctgtta aagacgatag gcccagcttg aagcgccacg aacaggagag cgggtttcgc cctatggaaa tgctcacatg tccatcgcct acgcagatcg cttggatctg aaaggatctt ccaccgctac gtaactggct ggccaccact ccagtggctg ttaccggata gagcgaacga cttcccgaag cgcacgaggg cacctctgac aacgccagca ttctttcctg acaatgatga ggaacactga attaccttag cttgagatcc cagcggtggt tcagcagagc tcaagaactc ctgccagtgg aggcgcagcg cctacaccga ggagaaaggc agcttccagg ttgagcgtcg acgcggcctt cggtacccag catttggatt aaaatacaca ctgcaggtac tttttttctg ttgtttgccg gcagatacca tgtagcaccg cgataagtcg gtcgggctga actgagatac ggacaggtat gggaaacgcc atttttgtga tttacggttc atccaattcc tggttgactc gttattattc <210> 22 <211> 280 <212> PRT <213> Tritirachium album
PL 244825 Β1 <400> 22
Ala Ala Gin Thr Asn Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr 15 1015
Ser Pro Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gin Gty 20 2530
Ser Cys Val Tyr Vat Ile Asp Thr Gty Ile Glu Ala Ser His Pro Gtu 35 4045
Phe Gtu Gly Arg Ala Gin Met Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg
5560
Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ata Gly Thr Val Gly Ser Arg 65 70 7580
Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Thr Gtn Leu Phe Gly Val Lys Val Leu 85 9095
Asp Asp Asn Gty Ser Gty Gtn Tyr Ser Thr Ile Ite Ala Gty Met Asp
100 105110
Phe Vat Ala Ser Asp Lys Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Vat Vat
115 120125
Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala
130 135140
Ala Ata Arg Leu Gin Ser Ser Gly Vat Met Val Ala Val Ata Ala Gty
145 150 155160
Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg Asn Tyr Ser Pro Ata Ser Glu Pro Ser
165 170175
Val Cys Thr Val Gly Ala Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe
180 185190
Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu Asp Ile Phe Gty Pro Gly Thr Ser Ile
195 200205
PL 244825 Β1
Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser
210 215220
Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu
225 230 235240
Gly Lys Thr Thr Ala Ala Ser Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala
245 250255
Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu
260 265270
Ala Tyr Asn Asn Tyr
275
Gin Ala Gly
280

Claims (14)

1. Mutant zymogenu proteinazy K z Tritirachium album zawierający na C-końcu mutację zwiększającą wydajność ekspresji w komórkach drożdżowych oraz ułatwiającą dezaktywację dojrzałej proteinazy K w warunkach stresowych, przy czym mutacją tą jest dodatkowa reszta Gly znajdująca się na C-końcu.
2. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako sekwencja nr 12.
3. Mutant dojrzałej proteinazy K z Tritirachium album zawierający na C-końcu mutację zwiększającą wydajność ekspresji w komórkach drożdżowych oraz ułatwiającą dezaktywację dojrzałej proteinazy K w warunkach stresowych, przy czym mutacją tą jest dodatkowa reszta Gly znajdująca się na C-końcu.
4. Mutant według zastrz. 3, znamienny tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako sekwencja nr 22.
5. Sekwencja DNA zawierająca sekwencję kodującą mutanta zymogenu proteinazy K jak określono w zastrz. 1 lub 2 albo jego fragment.
6. Sekwencja DNA według zastrz. 5 znamienna tym, że posiada sekwencję nr 8.
7. Sekwencja oligonukleotydu służącego do otrzymywania sekwencji DNA kodującej mutanta zymogenu proteinazy K jak określono w zastrz. 1 lub 2 albo jego fragment wybrana spośród sekwencji nr 6 i 7.
8. Plazmid ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą mutanta zymogenu proteinazy K jak określono w zastrz. 1 lub 2.
9. Plazmid według zastrz. 8, znamienny tym, że posiada sekwencję wybraną spośród sekwencji nr 16.
10. Rekombinantowy szczep drożdżowy transformowany plazmidem wybranym z grupy obejmującej plazmid jak określono w zastrz. od 8 do 9.
11. Szczep drożdży według zastrz. 10, znamienny tym, że został otrzymany z jednego ze znanych szczepów drożdży wybranych spośród Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Yarrovia sp., lub Kluyveromyces sp., korzystnie wybranego spośród szczepów Pichia pastoris.
12. Sposób otrzymywania białka o aktywności proteinazy K Tritirachium album, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek drożdży transformowanych plazmidem ekspresyjnym kodującym mutanta zymogenu proteinazy K z Tritirachium album zawierającego na C-końcu
PL 244825 Β1 mutację zwiększającą wydajność ekspresji w komórkach drożdżowych oraz ułatwiającą dezaktywację dojrzałej proteinazy K w warunkach stresowych, przy czym mutacją tą jest dodatkowa reszta Gly znajdująca się na C-końcu, a następnie uzyskiwane białko izoluje się i oczyszcza z płynu hodowlanego.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek drożdży jak określono w zastrz. 11, korzystnie w temperaturze około 28 do 30°C, korzystnie na pożywce zawierającej jako źródło węgla glicerol lub metanol, przy czym indukuje się ekspresję zmodyfikowanego genu proteinazy K metanolem.
14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że białko o aktywności proteinazy K Tritirachium album izoluje się z płynu pohodowlanego metodą chromatografii oddziaływań hydrofobowych lub metodą chromatografii na złożu hydroksyapatytu, a następnie oczyszcza się prowadząc dializę wobec roztworu węglanu amonu, po czym suszy się ze stanu zamrożenia.
PL439656A 2021-11-26 2021-11-26 Mutant proteinazy K Tritirachium album i jej zymogenu, plazmid ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i sposób wytwarzania dojrzałej formy mutanta proteinazy K PL244825B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL439656A PL244825B1 (pl) 2021-11-26 2021-11-26 Mutant proteinazy K Tritirachium album i jej zymogenu, plazmid ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i sposób wytwarzania dojrzałej formy mutanta proteinazy K
PCT/PL2022/050084 WO2023096513A1 (en) 2021-11-26 2022-11-25 Tritirachium album proteinase k mutant and its zymogen, expression plasmid, recombinant pichia pastoris strain and method of producing the mature form of proteinase k mutant

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL439656A PL244825B1 (pl) 2021-11-26 2021-11-26 Mutant proteinazy K Tritirachium album i jej zymogenu, plazmid ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i sposób wytwarzania dojrzałej formy mutanta proteinazy K

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL439656A1 PL439656A1 (pl) 2023-05-29
PL244825B1 true PL244825B1 (pl) 2024-03-11

Family

ID=84520096

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL439656A PL244825B1 (pl) 2021-11-26 2021-11-26 Mutant proteinazy K Tritirachium album i jej zymogenu, plazmid ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i sposób wytwarzania dojrzałej formy mutanta proteinazy K

Country Status (2)

Country Link
PL (1) PL244825B1 (pl)
WO (1) WO2023096513A1 (pl)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2803907C3 (de) 1978-01-30 1982-09-23 Gewerkschaft Eisenhütte Westfalia, 4670 Lünen Lösbare Gelenkverbindung für den untertägigen Bergbau und ihre Verwendung an einem Strebausbaugestell
DE10105911A1 (de) 2001-02-09 2002-08-14 Roche Diagnostics Gmbh Expression der rekombinanten Proteinase K aus Tritirachium album in Hefe
PL213045B1 (pl) * 2008-02-08 2013-01-31 Kur Jozef Sachadyn Pawel Dna Gdansk Ii Spolka Cywilna Mutant proteinazy K, sposób jego otrzymywania oraz sekwencje i szczepy wykorzystywane w tym sposobie
CN102839165B (zh) * 2012-09-26 2014-12-10 金普诺安生物科技（苏州）有限公司 基因突变型重组蛋白酶k及其工业化生产方法
GB201803654D0 (en) 2018-03-07 2018-04-25 Arcticzymes As Thermolabile proteinases
CN109280656B (zh) * 2018-10-23 2021-06-15 大连博格林生物科技有限公司 重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1及制备方法
US10633644B1 (en) 2018-12-20 2020-04-28 New England Biolabs, Inc. Proteinases with improved properties
CN113215138B (zh) * 2021-06-02 2022-11-22 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 一种热稳定性提高的蛋白酶k突变体

Also Published As

Publication number Publication date
PL439656A1 (pl) 2023-05-29
WO2023096513A1 (en) 2023-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102147005B1 (ko) Fad2 성능 유전자좌 및 표적화 파단을 유도할 수 있는 상응하는 표적 부위 특이적 결합 단백질
KR102274445B1 (ko) 게놈 삽입을 위한 방법
US20030162265A1 (en) Dna joining method
CN110734900B (zh) 一种胞嘧啶碱基编辑工具及其用途
CN112204147A (zh) 基于Cpf1的植物转录调控系统
CN101827938A (zh) 涉及rt1基因、相关的构建体和方法的具有改变的根构造的植物
CN101815432A (zh) 涉及编码核苷二磷酸激酶(ndk)多肽及其同源物的基因的用于修改植物根构造的方法
CN112921054B (zh) 一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用
CN101918560B (zh) 在氮限制条件下具有改变的农学特性的植物以及涉及编码lnt2多肽及其同源物的基因的相关构建体和方法
CN101868545B (zh) 具有改变的根构造的植物、涉及编码富含亮氨酸重复序列激酶(llrk)多肽及其同源物的基因的相关构建体和方法
KR102287880B1 (ko) 세포에서 이중 가닥 dna의 표적 부위를 변형시키기 위한 방법
CN112513072A (zh) 慢病毒载体转化的t-rapa细胞在改善溶酶体贮积症中的应用
KR101203817B1 (ko) 재조합 아데노바이러스를 위한 포장 세포
PL244825B1 (pl) Mutant proteinazy K Tritirachium album i jej zymogenu, plazmid ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i sposób wytwarzania dojrzałej formy mutanta proteinazy K
US6730481B2 (en) Primers-attached vector elongation (PAVE): a 5′-directed cDNA cloning strategy
CN111378626B (zh) 一种cho细胞系、构建方法、重组蛋白表达系统、应用
CN110452893B (zh) 一种高保真CRISPR/AsCpf1突变体的构建及其应用
CN110305901A (zh) 一种基于人tlr4基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用
CN100577807C (zh) 用于植物中表皮特异性转基因表达的启动子
KR101816067B1 (ko) 수소 생산이 억제된 클로스트리디움 타이로부티쿰 균주 및 이의 용도
CA2402321C (en) Dna joining method
KR102194368B1 (ko) 미생물의 유전체를 개량하기 위한 변이 균주, 이의 제조방법 및 이를 이용한 미생물의 유전체 개량 방법
KR20230011965A (ko) 외인성 단백질의 생산을 위한 변형된 사상균
CN114703161A (zh) 聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用
WO1998049320A1 (en) SECRETED α-AMYLASE AS A REPORTER GENE