CN100577807C - 用于植物中表皮特异性转基因表达的启动子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及启动子区，在其控制下转基因可以在植物中以表皮特异性的方式表达。本发明还涉及包含所述启动子的重组核酸分子，涉及转化有这些核酸分子的转基因植物和植物细胞，涉及产生它们的方法。本发明还涉及包括根据本发明的启动子的核酸分子和介导病原体抗性的核酸序列或转基因，涉及转化有这些核酸分子的植物和植物细胞，以及产生它们的方法。
Description
本发明涉及启动子区，在其控制下在植物中转基因可以以表皮特异性方式表达。另外，本发明还涉及包含所述启动子区的重组核酸分子、已经用所述核酸分子转化的转基因植物和植物细胞、以及它们的生产方法。另外，本发明涉及包含根据本发明的启动子的核酸分子、能够介导病原体抗性的核酸序列或转基因、以及用所述核酸分子转化的植物和植物细胞和它们的生产方法。
位于转录起始点上游并用以确定转录起始点和起始频率、因而确定受控基因的表达水平和表达模式的、基因的DNA区域，通常被称为启动子。RNA聚合酶和活化RNA聚合酶的特异性转录因子与启动子结合，以和基础转录复合体一起启动转录。启动子的效率经常由另外的DNA序列——增强子序列——增强和调节，与启动子的位置相反，这些序列的位置是不固定的。这些调节元件可以位于待表达基因的上游、下游或内含子中。
在重组DNA技术中，将启动子插入到表达载体中，以控制转基因的表达，所述转基因通常不是受启动子天然调节的基因。这里有实际意义的是启动子的特异性，其决定通过遗传工程转移的基因在何时、在何种类型的组织中、以何种强度表达。
在植物育种中，重组DNA技术经常用来将特定的有利特征转移至有用的植物，这被认为可以导致更高的产量，例如通过增加病原体抗性，或提高收获产品的特性。本文中，经常期望被转移的基因不被普遍表达，而只在期望有转基因活性的那些组织中表达，因为转基因产物的存在可能对某些组织中的正常生理过程具有负面影响。因此，例如，可以表明：在普遍有效的35S启动子控制下的阴离子过氧化物酶的过表达导致转基因烟草植物的萎蔫，因为更少出现根生长，并相应产生更少的根(Lagriminiet al.(1997)The consequence of peroxidase overexpression in transgenic plants onroot growth and development.Plant Mol Biol.33(5)，S.887-895)。与对照植物相比，在同样地普遍有效的泛素启动子控制下的spi2过氧化物酶的过表达导致上胚轴发育减弱和径向生长减弱(Elfstrand，M.et al.(2001)Overexpression of the endogenousperoxidase-like gene spi 2 in transgenic Norway spruce plants results in increasedtotal peroxidase activity and reduced growth.Plant Cell Reports 20(7)，S.596-603)。无论对生理过程的负面影响如何，经常认为转基因产物也存在于收获的植物部分中的抗性育种应被阻止。
因此，过去几年里已经分离了组织特异性或诱导性而发挥作用的启动子。组织特异性启动子例如是种子、块茎和果实特异性启动子。可诱导启动子例如可通过化学诱导、光诱导或其他刺激而活化。
还期望特异性调节表皮中的基因表达。表皮是高等植物地上器官的终端组织。那么，表皮的任务一方面是允许植物的水和营养物交换，另一方面是防止病原体侵入植物。可以通过借助合适的启动子和受启动子控制的基因的帮助，改变表皮内的基因表达而特异性调控这些功能。
已经描述了双子叶植物中的表皮特异性启动子。可以表明：来自阿布属(Arabidopsis)的CER6-(CUT1-)基因的启动子可以导致β-葡糖醛酸酶报告基因的表皮特异性表达，所述CER6-(CUT1-)基因编码蜡合成中的缩合酶(Hooker et al.(2002)，Significance of the expression of the CER6 condensing enzyme for cuticularwax production in Arabidopsis，Plant Physiol.129(4)，S.1568-1580；Kunst et al.(2000)，Expression of the wax-specific condensing enzyme CUT1 in Arabidopsis，Biochem.Soc.Trans.28(6)，S.651-654)。
但是，合适的单子叶植物的表皮特异性启动子至今还不能成功地得以鉴定，所述启动子尤其适合在单子叶植物中表达转基因，尤其是禾本科植物(poaceae)(白菖蒲sweet grass)。因此，一直使用诸如来自玉米的泛素启动子之类的组成性启动子，以在表皮中表达蛋白质(例如参见Oldach et al.(2001)，Heterologous expression ofgenes mediating enhanced fungal resistance in transgenic wheat，Mol Plant MicrobeInteract.14(7)，S.832-838)。但是，如上所述，由于转基因产物在表皮以外的其他组织或器官中的存在，这可以导致转基因植物中不期望的副作用。
因此本发明要解决的问题是提供使得在单子叶植物，优选在谷类植物中进行表皮特异性基因表达的方法。
通过提供在本发明权利要求中表征的实施方案解决了该问题。
因此，本发明涉及对植物表皮具有特异性的启动子区，包含来自谷胱甘肽-S-转移酶A1(GSTA1)基因启动子的第一序列和来自WIR1a基因内含子的第二序列。GSTA1涉及在下列文献中描述的基因：Dudler et al.(1991)，A pathogen-inducedwheat gene encodes a protein homologous to glutathione-S-transferases，Mol.PlantMicrobe Interact.4(1)，S.14-18。具体而言，这些基因是来自小麦的基因；但是它们也可以是来自其他谷类植物尤其是大麦的、具有相当表达模式和类似基因产物的同源基因，尤其是来自大麦的基因。WIR1a指下列文献中描述的基因：Bull et al.(1992)，Sequence and expression of a wheat gene that encodes a novel protein associated withpathogen defense，Mol.Plant Microbe Interact.5(6)，S.516-519。
优选的，第一序列是SEQ ID No.1，第二序列是SEQ ID No.2。
在第一序列和第二序列之间，还可以有长度为10bp-1000bp的非翻译序列，长度优选为20bp-800bp，尤其优选为30bp-500bp，最优选为40bp-300bp。
尤其优选的是，根据本发明的启动子区是选自下列的启动子区：
a)包含SEQ ID No.3所示核酸序列的启动子区；
b)包含SEQ ID No.3所示核酸序列的功能部分的启动子区；或
c)具有在严谨条件下与SEQ ID No.3所示核酸序列杂交的序列的启动子区。
在本发明的范围内，启动子区理解为包含编码序列(转基因)表达所需的调控序列的核酸序列。调控序列形成基因的决定编码序列表达、即具体的决定表达水平和模式的部分。调控序列具有至少一个序列基序，特异性转录因子和RNA聚合酶与所述基序结合，组装形成转录复合体，并有效启动受启动子区控制的核酸序列的转录。
根据本发明的启动子区基于下列发现：通过将来自小麦的GSTA1基因的启动子与来自小麦的WIR1a基因的内含子序列融合可以产生具有新特性的启动子。
在具有大肠杆菌β-葡糖醛酸酶(GUS)基因作为报告基因的小麦叶中进行的瞬时报告基因分析中，试验了WIR1a启动子和内含子与GST启动子的不同组合。令人惊奇的是，发现GST启动子和WIR1a内含子对报告基因活性具有协同作用。转录活性的增加与通过遍在性表达的35S启动子获得的转录活性相当。
在本发明的范围内，术语“表皮特异性”理解为位于根据本发明的启动子控制下的核酸序列在植物的茎(shoot)表皮中表达。从本发明的意义上说，具体而言，相对于其他细胞类型来说，如果根据本发明的启动子有利于外源基因在表皮中表达，并导致与在其他细胞类型中相比表达有明显增加，如至少2倍，优选至少5倍，尤其优选至少10倍，最优选至少50倍，则也称为具有表皮特异性。可以通过常规的原位检测技术测定表达水平。
术语“植物表皮”对本领域技术人员公知。补充信息可以在任何有关植物解剖学或植物生理学的书中查到，例如Strasburger，Lehrbuch der Botanik，35.edition2002，Spektrum Akademischer Verlag。
目前惊人地发现包含来自小麦的GSTA1基因调控序列和来自小麦的WIR1a基因内含子序列的启动子区导致位于其控制下的编码核酸序列的表皮特异性表达。
除了具有SEQ ID No.3所示核酸序列的启动子区之外，本发明还涉及具有所述序列的功能部分并导致其控制的编码核酸序列之一在植物中表皮特异性表达的启动子区。
在本文中，“功能部分”理解为尽管核酸序列稍有偏差、转录复合体仍能结合并导致表皮特异性表达的序列。启动子序列的功能部分还包含这样的启动子变体，其启动子活性与野生型相比降低或增强。具体而言，启动子部分当然还理解为SEQ IDNo.3中所示启动子区序列的天然或人工变体。突变包含一个或多个核苷酸残基的替换、增加、缺失、互换和/或插入。在本发明的范围内，启动子区的功能部分包含SEQID No.3的天然存在的变体，也包含人工核苷酸序列，例如通过化学合成获得的核苷酸序列。
无论如何，所用的启动子含有TATA盒(SEQ ID No.1和3中第2163位至2169位)，优选还含有两个CAAT盒(SEQ ID No.1和3中第1047位至1051位或第1895位至1899位)。另外，启动子还含有至少一个、优选至少2个和3个、尤其优选至少4个、5个和6个、最优选至少7个或8个下列序列基序：
a)GTGGGGG
b)ACGTGGA
c)TCCACCT
d)TATCCAT
e)CATGCATG
f)TGTAAAG
g)CCTACCA
h)AATAGTA
优选的，序列基序位于对应于SEQ ID No.1和3中下列位置的位置上：
-a)185-191 and 217-223bp
-b)455-461bp
-c)508-514bp
-d)564-570bp
-e)1514-1521bp
-f)1520-1526bp
-g)1569-1575bp
-h)1610-1616bp
启动子区变体的启动子活性可以借助标记基因进行测定，所述标记基因的编码序列位于待验证的启动子区的控制之下。合适的标记基因例如是来自大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因，荧光基因，例如来自水母(Aequoria victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)、来自北美萤火虫(Photinus pyralis)的荧光素酶基因或来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶(LacZ)基因。通过与野生型植物比较确定绝对启动子活性。通过比较各组织或细胞中上述标记基因的表达速率可以容易地确定组织或细胞特异性。
本发明还涉及具有在严谨条件下与SEQ ID No.3所示核酸序列杂交的核酸序列的启动子区。在本发明的上下文中，术语“在严谨条件下杂交”指杂交在体外、在足够严谨以确保特异性杂交的条件下进行。这种严谨杂交条件是本领域技术人员已知的，可以从文献中获取(Sambrook et al.(2001)，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，3.edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork)。
通常，“特异性杂交”指如果所述序列以(例如总)DNA或RNA的复杂混合物形式存在，分子在严谨条件下优先与特异性核苷酸序列杂交。术语“严谨条件”通常指核酸序列优先与其靶序列杂交、以更小的程度或根本不与其他序列杂交的条件。严谨条件部分依赖于序列，在不同情况下不同。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。通常，以这种方式选择严谨条件，使得温度位于特定序列在确定的恒定离子强度和确定的pH值时热熔点(Tm)以下约5℃。Tm是这样的温度(确定的离子强度、pH值和核酸浓度下)，在该温度下，平衡状态下与靶序列互补的分子中50％与靶序列杂交。典型的，对于短分子(即例如10-50个核苷酸)来说，严谨条件是这样的条件，其中盐浓度至少为约0.01-1.0M钠离子浓度(或任意其他盐)，pH值为7.0-8.3，温度至少为30℃。此外，通过加入去稳定剂如甲酰胺可以获得严谨条件。
合适的严谨杂交条件例如还描述在同上的Sambrook et al中。因此，杂交例如可在下列条件下发生：
-杂交缓冲液：2×SSC，10×Denhardt’s溶液(FikoII 400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)，0.1％SDS，5mM EDTA，50mM Na2HPO4，250μg/ml鲱精DNA；50μg/mltRNA或0.25M磷酸钠缓冲液pH 7.2，1mM EDTA，7％SDS，杂交温度为65℃-68℃。
-洗涤缓冲液：0.2×SSC，0.1％SDS，洗涤温度为65℃-68℃。
优选的，相对于SEQ ID No.3中所示总DNA序列，这些启动子变体与SEQ IDNo.3中所示启动子序列或其部分具有至少50％、优选至少70％、尤其优选至少90％、最优选至少95％的序列一致性。优选的，这些启动子序列的序列一致性通过与SEQ IDNo.3中所示核酸序列比较来确定。在不同长度的两个核酸序列相互比较时，序列一致性优选涉及与较长序列的对应核苷酸残基一致的较短序列中核苷酸残基的百分比。
序列一致性通常通过不同的比对程序如CLUSTAL来确定。通常，本领域的技术人员具有他自己安排的确定序列一致性的合适算法，例如还有可以从下列网址获得的程序：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST(例如链接“standardnucleotide-nucleotide BLAST[blastn])。
上述对SEQ ID No.3的一致性百分程度还应用于SEQ ID No.1和2中所示的根据本发明的启动子区的第一和第二序列。
在本发明的优选实施方案中，根据本发明的启动子区具有2552个核苷酸的总序列，称为SEQ ID No.3。
本发明还涉及根据本发明的启动子区的和编码基因的嵌合基因，所述编码序列的表达本来不受根据本发明的启动子区的调控，在嵌合基因中受根据本发明的启动子区的调控，还与含有所述嵌合基因的重组核酸分子可操作连接。
术语“表达受根据本发明的启动子区调控的核酸序列”指位于根据本发明的启动子区控制之下的核酸序列在启动子区有活性的那些细胞中的表达与野生型细胞中的表达相比可以增加至少5倍，优选至少10倍，特别优选至少50倍。
表达受根据本发明的核酸序列调控的核酸序列可以是转基因如抗性基因的编码区，所述抗性基因的表达产物期望位于表皮中。通过表达转基因，由转基因编码的基因产物的含量可以增加至少2倍，优选至少5倍，特别优选至少10倍，最优选至少50倍。
但是，根据本发明的启动子区也可以用于RNAi构建体中进行RNA干扰，以实现特定基因的表皮特异性沉默，所述特定基因的基因产物期望比通常情况下更小程度的存在于表皮中或根本不存在。当然，也可以使用根据本发明的启动子区通过经典的反义或共抑制构建体来实现后者。通过沉默构建体，内源基因的表达降低至少50％，优选至少70％，特别优选至少90％，特别优选至少95％。
在期望用于RNA干扰的构建体中，通常有回文DNA序列，其在转录之后形成双链RNA。通过dicer酶，所述双链RNA加工形成较短的RNA片段，该片段与内源RNA结合，在RISC(RNA诱导的沉默复合体)的辅助下导致内源RNA的降解(Hannon(2002)RNA interference，Nature，Bd.418，S.244-251)。
基因沉默构建体对内源基因表达的作用可以通过常规的分子生物学方法检测，这些方法是本领域技术人员公知的。因此，可以用Northern blot和RT-PCR方法验证RNA水平；通过Western blot分析、免疫荧光检测蛋白质，或者如果蛋白质是酶通过酶分析法检测。在本发明的范围内，术语“转基因”概括了基因产物要提供在表皮或要在基因沉默中抑制的那些基因。
优选的是，表达受根据本发明的启动子控制的核酸序列是介导病原体抗性的核酸分子，由于表皮是病原体侵入植物时必须克服的第一道屏障。
在本发明的范围内，术语“重组核酸分子”理解为含有根据本发明的嵌合基因或根据本发明的启动子、并能导致位于根据本发明的启动子区的控制下的核酸序列在植物细胞和植物中启动子依赖性表达的载体。在优选的实施方案中，根据本发明的重组核酸分子还含有转录终止序列。本文中，“转录终止序列”理解为位于编码序列的下游末端并导致RNA聚合酶终止转录的DNA序列。
另外，本发明涉及产生表皮特异性表达受根据本发明的启动子区调控的核酸序列的转基因植物的方法，包括下列步骤：
a)产生重组核酸分子，其中根据本发明的启动子区与编码序列可操作的连接，
b)将来自a)的重组核酸分子转移到植物细胞中，和
c)再生完全转化的植物，如果期望，繁殖植物。
为了准备将外源基因分别导入高等植物和其细胞，可以使用含大肠杆菌复制信号和选择转化细菌细胞的标记基因的大量克隆载体。这种载体的例子有pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。嵌合基因可以在适当限制性位点导入载体中。
然后将获得的质粒用来转化大肠杆菌细胞。将转化的大肠杆菌细胞培养在适当的培养基中，随后收获并裂解，重新获得质粒。限制性分析、凝胶电泳和进一步的生物化学-分子生物学方法通常用作表征所获得质粒DNA的分析方法。每个操作后，可以将质粒DNA切割，从中获得的DNA片段可以与其他DNA序列连接。
如已经提到的，可以使用将DNA导入到植物宿主细胞中的各种技术，其中本领域的技术人员可以毫无困难地确定适合每种情况的方法。所述技术包括利用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciena)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化介质用T-DNA转化所述植物、原生质体融合、注射、电穿孔、分离的DNA向原生质体的直接基因转移、借助基因枪方法导入DNA以及其他可能的技术，这些技术目前已建立成熟多年，分别属于植物分子生物学和植物生物技术领域技术人员的常规技能。基因枪基因转移方法尤其用于单子叶植物。这里，本领域的技术人员可以发现有用的操作信息，例如在下列文献中：Vasil et al.(1992)Bio/Technology，10，S.667-674；Vasil et al.(1993)Bio/Technology，11，S.1153-1158；Nehra et al.(1994)Plant J.5，S.285-297；Becker et al.(1994)Plant J.，5，S.299-307；Altpeter et al.(1996)Plant CellReports 16，S.12-17；Ortiz et al.(1996)Plant Cell Reports 15，S.877-81；Rasco-Gauntet al.(2001)J.Exp.Bot.52；S.865-874。
在将DNA注射和电穿孔进入植物细胞的情况下，对所用质粒本身没有特别要求。这也适用于直接基因转移。可以使用简单的质粒，例如pUC衍生质粒。
但是，如果要从以这种方式转化的细胞再生整株植物，建议存在选择标记基因。标准的选择标记基因是本领域技术人员已知的，选择合适的标记并不是问题。
根据将所期望基因导入到植物细胞中的方法，可能需要其他的DNA序列。例如，如果Ti或Ri质粒用于转化植物细胞，必须将Ti或Ri质粒中所含的T-DNA的至少右侧边界(虽然经常是右侧边界和左侧边界)与要导入的基因连接，以形成旁侧区。如果农杆菌用于转化，要导入的基因必须克隆到特定的质粒中，确切说克隆到中间载体或二元载体中。由于和T-DNA中序列同源的序列，中间载体可以通过同源重组整合到农杆菌的Ti或Ri质粒中。所述质粒还含有转移T-DNA所必需的vir区。但是，中间载体不能在农杆菌中复制。借助辅助质粒，中间载体可以转移到根瘤农杆菌(接合)。然而，二元载体既能在大肠杆菌中复制，也能在农杆菌中复制。它们含有选择标记基因和连接子或多连接子(polylinker)，其外侧是右侧和左侧T-DNA边界区。它们可以直接转化到农杆菌中。作为宿主细胞的农杆菌应含有携带位于T-DNA内的嵌合基因的质粒，所述T-DNA转移到植物细胞中。也可存在其他的T-DNA。如此转化的农杆菌用于转化植物细胞。已经广泛研究了T-DNA在转化植物细胞中的用途，并充分描述在公知的研究论文中和植物转化手册中。在单子叶植物的情况下，必须应用改变的方案进行有效的农杆菌介导的基因转移，它们例如描述于下列文献中：Cheng et al.(1997)Plant Physiol.115，S.971-980；Khanna and Daggard(2003)PlantCell Reports 21，S.429-436；Wu et al.(2003)Plant Cell Reports 21，S.659-668；Hu etal.(2003)Plant Cell Reports 21，S.1010-1019。对于DNA向植物细胞中的转移，可以建议将植物外植体和根瘤农杆菌或发根农杆菌一起培养。然后可以在合适介质中从感染的植物材料(如叶片、茎节、根，以及原生质体或悬浮培养的植物细胞)再生整株植物，所述介质可以含有选择转化细胞的抗生素或生物杀灭剂。
导入的DNA一旦整合入植物细胞中，在那里通常是稳定的，并且还维持在原始转化细胞的后代中。导入的DNA通常含有选择标记，该选择标记介导转化的植物细胞对生物杀灭剂或抗生素如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素、氨甲蝶呤、草甘膦、链霉素、磺酰脲、庆大霉素或膦丝菌素等的抗性。各个选择的标记因此应该使得能够从缺少导入DNA的细胞中选择转化细胞。为此目的，替代性标记，如营养标记或筛选标记(如GFP，绿色荧光蛋白)也适合。选择标记当然也可以完全省略，但是相伴随也省略相当大的筛选必要性。在期望无标记转基因植物的情况下，本领域的技术人员也具有他自己安排的允许除去标记基因的策略，例如共转化或序列特异性重组酶。
从转基因植物细胞再生转基因植物使用已知的营养介质根据常规的再生方法进行。如此获得的植物可以通过常规方法验证，所述常规方法包括分子生物学方法如PCR、印迹分析，用于检测所导入的核酸序列存在和组织特异性，或用于检测受所述核酸序列影响的内源RNA和蛋白质，其中所述核酸分子的表达受根据本发明的启动子的控制。
另外，本发明涉及含有受根据本发明的启动子区控制的核酸序列并表皮特异性表达所述核酸序列的转基因植物。
优选的，根据本发明的植物是单子叶植物，尤其是谷类植物，如黑麦、玉米和燕麦，尤其优选小麦或大麦，以及所述植物的转基因部分和其转基因繁殖材料，如原生质体、植物细胞、愈伤组织、种子、块茎或插条，以及所述植物的转基因后代。但是，根据本发明的启动子区还可以用于其他的禾本科植物(sweet grass)，例如牧草(feed grass)，以产生表皮特异性表达转基因的相应植物。
产生上表皮蜡的基因也可以在根据本发明的表皮特异性启动子的控制下表达，以增加植物的干旱抗性。此外，产生花青素或其他UV吸收物质以增加UV抗性的基因也可以在根据本发明的启动子的控制下表达。如上面已经描述的，病原体抗性基因优选在根据本发明的启动子的控制下表达。
感染植物并因而负面影响植物代谢的细菌、病毒和真菌都称作植物病原体。
这些植物病原体有真菌，其导致霉病，谷类植物如小麦和大麦的褐变。依赖于感染的程度，这些疾病可以导致相当大的产量损失(可高达50％)。
传统上，上述和其他真菌性植物疾病通过杀真菌剂得以控制，所述杀真菌剂具有已知的缺点，如渗透到地下水中，并在食物链中积累。
但是，过去几年里，鉴定到了能够介导对特定因子或几种因子的抗性的几个基因。本文所用的术语“介导病原体抗性”指所述基因表达增加的植物与所述基因表达正常的植物相比感染特定病原体的易感性降低。其表达被病原体感染而活化的基因也是介导病原体抗性的基因。
这些基因中有过氧化物酶和草酸氧化酶。属于germin样蛋白家族的草酸氧化酶催化草酸的氧化，由此形成过氧化氢。过氧化氢起到杀伤微生物作用，能够增强细胞壁的木质化，从而防止害虫的入侵。此外，它在低浓度下还导致过敏性细胞死亡。过氧化物酶使用分子氧或过氧化氢以氧化并进而脱毒细胞基质。
植物表皮中草酸氧化酶和过氧化物酶的表达可介导对病原体的抗性，病原体例如包括霉菌、镰刀菌(fusarium spp.)、大麦云纹病菌(Rynchosporium secalis)和大麦网斑病菌(Pyrenophora teres)。能够介导对病原体抗性的其他基因有几丁质酶、Ag-AFP、GSTA1和WIR1a。
通过借助根据本发明的启动子区在转基因植物的表皮中表达编码所述酶的核酸序列，可以获得具有更高病原体抗性的植物。
与介导病原体抗性的基因相反，还有植物固有的促进病原体入侵的基因。其中有Mlo基因，其编码七次跨膜的受体，似乎促进霉病真菌向表皮的入侵。在这种情况下，干扰Mlo基因的表达是合适的，以防止真菌侵入植物。例如这可以借助上述的RNAi方法进行。干扰Mlo基因表达适于阻止霉病真菌侵入植物的事实在来自大麦叶段的体外测试中得以显示，所述大麦叶段用包被有Mlo-dsRNA的钨颗粒轰击(Schweizer et al.(2000)，Double-stranded RNA interferes with gene function at thesingle-cell level in cereals，The Plant Journal，24(6)，S.895-903)。但是，至今还没有显示出表皮特异性干扰转基因植物中的Mlo表达具有相同的作用。
介导病原体与植物相互作用并因而促进病原体侵入植物的其他植物基因例如是氨基酸或糖转运蛋白或转化酶。所述基因也适合用作基因沉默的靶标。因此，本发明涉及产生抗病原体的植物的方法，包括下列步骤：
a)产生重组核酸分子，其中根据本发明的启动子以与介导病原体抗性的核酸序列可操作连接的形式存在，
b)将a)的重组核酸分子转移到植物细胞中，和
c)再生完全转化的植物，如果期望，繁殖所述植物。
优选的，介导病原体抗性的核酸序列是过氧化物酶或草酸氧化酶基因的编码区或干扰内源Mlo RNA的序列。
下列实施例用来说明本发明，并不期望理解为限制性的。
附图说明
1)GSTA1启动子的核酸序列(SEQ ID No.1)
2)WIR1a内含子的核酸序列(SEQ ID No.2)
3)优选启动子区的核酸序列(SEQ ID No.3)
4)TAPERO(过氧化物酶)cDNA的核酸序列(SEQ ID No.4)
5)TAPERO表达载体pPS41
a)核酸序列(SEQ ID No.5)
b)载体图谱
6)germin 9f-2.8(草酸氧化酶)cDNA的核酸序列(SEQ ID No.6)
7)germin表达载体pPS24
a)核酸序列(SEQ ID No.7)
b)载体图谱
8)Mlo-RNAi构建体的序列(SEQ ID No.8)
9)Mlo-RNAi表达载体pWIR5-TaMlo RNAi
a)核酸序列(SEQ ID No.9)
b)载体图谱
10)pPS24转基因植物中的原位草酸氧化酶活性
将来自Bobwhite野生型植物(BW)和来自转基因株系No.157和No.170的叶横切，原位检测草酸氧化酶活性。左栏＝与草酸底物反应；右栏＝没有草酸底物的对照反应。深紫色着色指示转基因株系表皮中的草酸氧化酶活性。
11)检测pPS41转基因植物中的TAPERO转基因
a)Northern印迹
通过WIR3样品与来自携带pPS41构建体的T2代转基因小麦株系的Northern印迹膜的杂交，检测TAPERO RNA的积累。在每种情况下，分析了成体植物阶段中的4个选定株系的2个亚系和野生型(BW)。叶1＝顶叶。叶2-4＝叶龄增加。TaGer-4探针与一组胁迫诱导的小麦基因杂交，用于验证TAPERO过表达的多效性副作用。未发现明显的副作用。EtBr＝凝胶的加载对照，用溴化乙锭染色。
b)Western印迹
通过在携带pPS41构建体的T2代转基因小麦株系的Western印迹膜上进行抗体反应，检测TAPERO蛋白的积累。TAPERO转基因产物具有31kD的预期大小。在Bobwhite的叶3中可以观察到TAPERO基因的基础活性增加。叶1＝顶叶。考马斯染色＝凝胶的加载对照，用考马斯蓝R250染色。
12)检测表皮特异性转基因表达
A)通过Northern印迹分析
通过特异性探针检测携带pPS24或pPS41构建体的转基因植物叶表皮中草酸氧化酶(左)和TaPERO(右)mRNA的积累。W＝来自全叶的RNA。E＝来自叶表皮的RNA。EtBr＝用溴化乙锭染色的凝胶，作为加载对照；26S RNA＝印迹膜与针对26S核糖体RNA的探针随后杂交，作为加载对照。
B)通过实时逆转录PCR分析
测定转基因株系No.2013(转化有构建体pPS41)的全叶和表皮中TaPEROmRNA的浓度。数据通过组成性表达的对照基因UBC(泛素偶联酶)和GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶)进行标准化。在全叶中保留的表达来自未除去的叶上表皮和来自韧皮部(启动子的副活性)。
C)通过实时逆转录PCR分析
分析成体植物阶段中的野生型植物(Bobwhite)和转基因株系No.2013和No.2151(转化有pPS41构建体)。启动子强表达，尤其是在叶和穗中强表达。在茎和根中，转基因完全不表达，或仅弱表达。
13)检测pPS41转基因植物的霉菌抗性
切下成体植物的顶叶，在分离的叶测试中与Bobwhite野生型植物一同接种小麦霉菌。接种7天后，评价霉菌感染。示出了用T2和T3代植物进行的3次独立接种实验的平均值。亚系2088/2不表达TAPERO，不增加抗性。“非沉默”平均值＝除2088/2之外的所有株系和所有实验的平均值。
14)pPS41转基因植物的苗生长
T2代植物和Bobwhite野生型植物播种在一起，并在成体植物阶段拍照。
15)检测pWIR5-TaMlo-RNAi转基因植物的霉菌抗性
切下T2代成体植物的顶叶，在分离的叶测试中与Bobwhite野生型植物一同接种小麦霉菌。接种7天后，评价霉菌感染。每种情况下对每个株系测试了2个亚系。
实施例
在下面的实施例中，分子生物学常规方法如大肠杆菌转化、限制性消化、连接、DNA提取、PCR等是本领域中已知的，根据同上的Sambrook et al(2001)进行。对于所有的PCR反应，使用校正的Pwo聚合酶(Roche)。
1)从GSTA1启动子和WIR1a内含子产生启动子构建体(pPS18)
所述产生通过下列前体构建体：pPS1、pPS3、pPS15以多个步骤进行。所有构建体都含有GUS报告基因，因此它们能够直接在瞬时分析中进行测试。
pPS1：
用PstI从重组pBluescript克隆中切下WIR1a基因的1.9kb启动子片段，并克隆到GUS基因前的表达盒的PstI限制性位点中。表达盒基于pBluescript，含有GUS基因，和随后的小麦GSTA1基因的转录终止子。因为GUS基因和GSTA1转录终止子不再包含在使用的最终构建体中(参见实施例2)，省略了该表达盒的详细描述。所得的构建体含有翻译水平上的WIR1a::GUS融合体。
pPS3
使用接头引物5‘ATA TAT CTG CAG GGA GCC ACG GCC GTC CAC和5‘TAT CCC GGG CCC GTG CCT GGA CGG GAA，产生了约240bp的PCR片段，将其末端用SmaI和PstI切割(通过接头)。基因组WIR1a克隆用作PCR模板。PCR片段含有WIR1a的第一个外显子的后15个氨基酸和包括剪接位点接受体的内含子，连接到pPS1中，用PstI(部分)和SmaI切割，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化。所得的构建体包含翻译水平上的WIR1a::GUS融合体，该融合体在GUS基因之前具有WIR1内含子。另外，引入WIR1a的第一个外显子的第18-35位氨基酸的缺失，以防止WIR1a::GUS融合蛋白的分泌(通过除去信号肽)。
pPS15：
将WIR1a启动子置换为GSTA1启动子的PCR片段。为此目的，将pPS3用XhoI和SnaBI(部分)消化，通过琼脂糖凝胶电泳纯化载体带。通过用接头引物5‘ATA TAT CTC GAG TCT AGAACT AGT GGA TCC和5‘ATA TAT TAC GTA GTT TGT CCG TGA ACT TCA进行PCR，从GSTA1克隆扩增得到约2.3kb长度的GSTA1启动子片段，并用XhoI和SnaBI在末端切割。将PCR片段与凝胶洗脱的pPS3带连接，得到位于GSTA1启动子控制下的、含内含子的WIR1a基因片段和GUS的翻译水平上的融合体。
pPS18：
将pPS15用PstI和SnaBI(部分)消化，载体带通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并与双链寡核苷酸(5’GTA CACAGG GAG CTA GCT CTC GAA ACC TCG CTC GAA ACG CA和5’CAT GTG TCC GTC GAT CGA GAG CTT TGG AGC GAG CTT TGC GT)连接。这将位于翻译起点附近的WIR1a基因的部分替换为没有翻译起始密码子ATG的WIR1a基因的长42bp的5’UTR。所得的构建体含有位于GSTA1启动子控制下的、含内含子的WIR1a基因片段和GUS的转录水平上的融合体。
2)产生所用的构建体
a)表达载体pPS24(位于根据本发明的启动子控制下的草酸氧化酶表达)
将含有整个阅读框(ORF)的小麦gf-2.8基因(草酸氧化酶；Acc.No.M63223)的长745bp的HindIII/SphI片段亚克隆到植物表达盒pGY1中，产生构建体pGermin(描述在Schweizer等，1999)。为了这种克隆，将草酸氧化酶片段连接到中间载体中，以能够通过pGY1中的限制性位点BamHI和PstI连接片段。
将含有草酸氧化酶基因和CamV 35S终止子的长约1kb的SmaI/EcoRI片段从pGermin连接到经SmaI/EcoRI切割并经琼脂糖凝胶电泳纯化的载体pPS18中。所得的构建体含有位于GSTA1启动子控制下的、含内含子的WIR1a基因片段和草酸氧化酶基因的转录融合体。与pPS18相比，该构建体不再含有GSTA1转录终止子，而含有CamV35S基因的转录终止子。
b)表达载体pPS41(位于根据本发明的启动子控制下的TAPERO表达)
从pWIR3(含有CamV 35S启动子和TAPERO的转录融合体；Schweizer等，1999)，使用SmaI和PstI通过限制性消化分离长约1.2bp的TAPERO片段。
将TAPERO片段连接到经SmaI和PstI消化并经琼脂糖凝胶电泳纯化的载体pPS24中。这产生位于GstA1启动子控制下、含内含子的WIR1a基因片段和TAPERO基因(Acc.No.X56011)的转录融合体，其中草酸氧化酶基因被TAPERO基因替代。和pPS24一样，pPS41含有CamV 35S基因的转录终止子。
c)表达载体pWIR5-TaMlo-RNAi(位于根据本发明的启动子控制下的Mlo-RNAi构建体的表达)
首先，将亚克隆到载体pGEM Teasy中的来自大麦的Mla1抗性基因的第3内含子(约1.1kb)借助EcoRI和PstI分离，并连接到也经EcoRI和PstI切割的载体pBSw41(pBluescript衍生物，具有部分TaMlo1 cDNA，其由Candace Elliott在她论文范围内克隆；GenBank登记号AF361933)中。
从该构建体中分离Mla1内含子和TaMlo1基因的部分编码序列，作为长约1.55kb的PstI/MscI片段(＝片段1)。与此平行，用寡核苷酸T3(pBluescript的标准测序引物)和TaMlo-1(5′GTC GCA TGC CTG TCC ACA CGA AAT GTG C 3′，SphI，带下划线的为限制性位点)通过PCR从质粒pBSw41扩增约450bp的片段。然后，通过限制酶PstI和SphI消化PCR片段(＝片段2)。通过用SmaI和SphI进行限制性消化打开载体pPS24(启动子+草酸氧化酶，见上文)，弃去切下的草酸氧化酶基因片段。然后将上述的片段1和片段2以三组分连接法连接到SmaI/SphI切割的载体pPS24中。在该连接中，MscI和SmaI切割组分的末端是相容的，因为二者都是所谓的平末端。所得的构建体(pTaMlo1 RNAi)含有约300bp的TaMlo1基因，以及约150bp的多连接子/接头序列作为“反向重复”，由Mla1内含子隔开。该转录单位受GSTA1启动子的控制。
注：本文称作TaMlo1的基因由于历史原因后来称作TaMloA1(Elliott et al.，2002).Mol.Plant Microbe Interact.15：1069-1077(2002)。
3)小麦植物的转化
小麦植物(cv.Bobwhite)在短日条件(10h/d，约600μE)下种植在植物棚(phytochamber)中40天，白天为15℃，晚上为12℃；然后种植在18/16℃的温室中，光照期为至少16h。穗立即使用，或可于4℃保存长达5天。将取自穗的颖果用70％的乙醇表面消毒2分钟，然后在5％次氯酸钠/0.1％Tween 20中表面消毒15-20分钟，最后用无菌蒸馏水(aqua bidest)洗涤4次。
在无菌条件下从颖果制备大小为0.5-1.5mm的未成熟胚，并盾片(scutellum)朝上放置到培养皿中诱导愈伤组织的培养基上(根据Murashige Skoog(1962)的基本培养基，并具有2mg/l 24-D，40g一水合麦芽糖，500mg/l L-谷氨酰胺，100mg/L酪蛋白水解物，5μM CuSO4和0.25％植物凝胶)。培养物于25℃避光培养。
分离胚后5-7天进行基因枪转化。粒子轰击之前4-6小时，将已经增殖的胚转移到具有更低水势的新培养基(如上所述，补充有0.3M甘露醇)，并于25℃避光培养。
将含有编码膦丝菌素乙酰转移酶的bar基因的质粒pAHC20(Christensen andQuail，1996)以1∶1的摩尔比与待共转化的载体混合。总共将10μl质粒DNA溶液沉淀到25μl 60mg/l金悬液的颗粒上。对于一次轰击，将存在于5μl乙醇中的30μg颗粒涂覆到微载体上。根据Dupont PDS-1000/He的制造商说明进行轰击。
粒子轰击后12-16小时，将外植体转移至新的诱导愈伤组织的培养基(与胚的预培养一样)，并于25℃避光培养10天。
然后将愈伤组织转移至分化培养基(根据Murashige Skoog(1962)的基本培养基，还具有20g/l蔗糖，5μM CuSO4，0.25％植物凝胶和3mg/l bialaphos)，于25℃和200μE在16小时光照期进行培养。
2周后，将未变成褐色的愈伤组织转移到再生培养基(根据Murashige Skoog(1962)的基本培养基，还具有20g/l蔗糖，0.25％植物凝胶和4mg/l bialaphos)，于25℃和200μE在16小时光照期进行进一步培养。
另外2周后，疏剪长出的苗，转移到含再生培养基的培养管中，于25℃和200μE在16小时光照期进一步培养。
通过根据Spencer等(1990)对叶提取物的PAT活性测试鉴定转基因再生体，或通过从候选植物的基因组DNA扩增转基因特异性序列和/或使用相应的探针进行Southern印迹来鉴定转基因再生体。
取决于基础材料的质量，该方法的转化效率为0.5-3个转基因植物/100个培养的胚。
4)具有pPS24构建体的植物中原位草酸氧化酶活性
使Bobwhite野生型植物或T3代pPS24转基因小麦植物的叶段在真空中渗入草酸氧化酶检测溶液(2.5mM草酸，3.5mM游离EDTA，0.6mg/ml 4-氯-1-萘酚，50μg/ml辣根过氧化物酶，20％v/v乙醇，用Tris碱调至pH4.0)，并于+37℃孵育过夜。除去检测溶液后，将叶在水中于+4℃下再孵育24h。然后，将叶人工横切成薄片，进行显微观察。在Zeiss Axiophot中以100倍放大进行相差光学显微镜观察。具有草酸氧化酶表达的细胞的细胞壁染成紫色。
5)通过Northern印迹分析检测pPS41转基因植物中的TAPERO转基因
处于顶叶阶段的Bobwhite植物和T2代pPS41转基因植物的叶(每种情况下约1g鲜重，FW)在液氮中匀浆，直至形成细粉末。将粉末加到3ml RNA提取缓冲液(0.5M Tris Cl pH 8.0；0.25M Na-EDTA；5％(w/v)SDS)和1.5ml缓冲液饱和的酚(15ml塑料管)中，并充分振荡。将提取物在20℃下于4000rpm-5000rpm离心30分钟(旋转式，Heraeus Varifuge)，加入1.5ml氯仿(不吸取上清液)，将管颠倒数次。将提取物再在20℃下于4000rpm-5000rpm离心30分钟，将上清液小心倾倒入新的管(15ml塑料管)。通过加入3ml的6M LiCl沉淀RNA(过夜，4℃)。将沉淀的RNA在4℃下于12,500rpm离心30分钟(固定转头，Hermle Z360K)，将RNA沉淀取到500-1000μl的70％乙醇中(RNA不溶解)，并转移到Eppendorf管中。将样品在4℃于14,000rpm离心10分钟(固定转头，Eppendorf Centrifuge 5417R)，并将上清液取出。将RNA沉淀于37℃干燥5分钟，取到100μl-200μl的TE中，于75℃溶解5-10分钟。根据标准方案(Sambrook et al.，同上)进行RNA在含甲醛的凝胶中的变性琼脂糖凝胶电泳，并转移至尼龙膜(Hybond N，Amersham)。每个样品使用10μg RNA。使用试剂盒(Roche)根据随机引物标记法用α32P-dCTP进行放射性探针标记。在CHURCH缓冲液(0.5M磷酸钠，pH 7.2；1％(w/v)BSA；7％(w/v)SDS；1mM Na2ETDA)中于65℃进行杂交过夜。将印迹膜在65℃的洗涤溶液(0.1×SSC；0.15w/v)SDS)中洗涤两次，每次15分钟，随后曝光于磷成像屏(phosporimager screen)。用磷成像仪(FujiFilm FLA3000)扫描曝光的屏，输出为TIFF格式的图像文件。
6)通过Western印迹分析检测pPS41转基因植物中的TAPERO转基因
处于顶叶阶段的Bobwhite植物和T2代pPS41转基因植物的叶尖在IWF缓冲液中匀浆(32mM磷酸钠；84mM柠檬酸盐，pH 2.8；药匙尖(spatula tip)聚乙烯吡咯烷酮)。将匀浆物在4℃于13,000rpm离心15分钟。将上清液与0.5g/ml醋酸铵混合，于4℃沉淀酸溶性蛋白质。
将蛋白质在4℃于13,000rpm离心30分钟。将蛋白质沉淀取到50μl/g FG-重悬缓冲液(50mM Tris-Cl pH 7.5；20％(v/v)甘油)中。将5μl 4倍浓缩的SDS样品缓冲液加到20μl样品中，并将样品与(1-5μl)饱和的Tris溶液混合，直到溴酚蓝的颜色变蓝。对于每个泳道，使用Bio-Rad的mini-gel装置根据标准方法在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(15％分离胶)中分离12.5μl煮沸的样品。
在电泳后，凝胶或者考马斯染色(作为加载对照)，或根据标准方法转移到硝酸纤维素膜上(印迹)。根据标准方法，将膜与抗大麦Prx8蛋白(与TAPERO同源的蛋白质)的第一多克隆抗体(稀释度1∶2000)孵育，然后与抗兔抗体并偶联碱性磷酸酶的第二抗体(稀释度1∶2000)孵育。通过定位碱性磷酸酶活性(BCIP/NBT染色溶液，预制片(Roche))检测TAPERO蛋白带。
7)通过Northern印迹分析和实时PCR分析检测表皮特异性转基因表达
如实施例5所述进行RNA提取和Northern印迹分析。用
仪(Roche，Mannheim，德国)根据制造商的说明进行实时PCR分析。
8)pPS41或pWIR5-TaMlo-RNAi转基因植物中的霉菌抗性
对于抗性测试，使用种植在温室中并具有完全发育的新长出的顶叶的成体pPS41或pWIR5-TaMlo-RNAi转基因小麦植物。同时种植的野生型植物cv.Bobwhite用作对照。切下顶叶的顶上一半，铺到20×20cm大聚碳酸酯皿中混有20ppm苯并咪唑的0.5％(w/v)植物琼脂上。每个皿铺一个转基因亚系(每个20片叶)和Bobwhite野生型(每个6片叶)。通过将4个强接种的小麦叶的孢子吹到塔中使叶段在接种培养基中接种霉菌孢子。5分钟后，将皿取出，密封，在间接日光下于20℃孵育。接种7天后，使用经典的评价系统评价霉菌感染(Schweizer et al.，1995)。参照处于各植物琼脂板上的对照叶计算抗性。
文献：
Christensen and Quail(1996)Transgenic Res.5：213-218.
Elliott et al.，(2002).Molecular Plant Microbe Interactions 15：1069-1077.
Murashige and Skoog(1962)Physiologia Plantarum 15：473-497.
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Spencer et al.(1990)TAG 79：625-631.
序列表
<110>植物遗传学与作物培养研究所
<120>用于植物中表皮特异性转基因表达的启动子
<130>I7469
<140>PCT/EP2004/011214
<141>2004-10-07
<150>DE10346611.8
<151>2003-10-07
<160>15
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2198
<212>DNA
<213>小麦属(Triticum sp.)
<400>1
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ccctggatcg gcgaggtgac tggatgacga gcagcacctg gtctggcggg tgttgggcga 120
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ctaactagta cttacttcct tcgcaccaca atatggaata gagggagtat cgataaacta 1980
acaaagatga ttacttaccc ggtttaaatg attcaagagc tcatttaatt tggcactcat 2040
catttcatat atcttttttg gtagaaatga aataaagcag atctagacac tagctaaaaa 2100
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<212>DNA
<213>小麦属(Triticum sp.)
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<212>DNA
<213>小麦属(Triticum sp.)
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gaggccaggg tcgtggaact tctcaagtcc aagtttgccg ctgggtttta atttctagga 3960
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gaaatcacca gtctctctct acaaatctat ctctctctat aataatgtgt gagtagttcc 4080
cagataaggg aattagggtt cttatagggt ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc 4140
cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac 4200
caaaatccag gggtaccgag ctcgaattct agtctacgcg gccgcgagct ccagcttttg 4260
ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 4320
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 4380
agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 4440
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 4500
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 4560
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 4620
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 4680
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 4740
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 4800
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 4860
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 4920
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 4980
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 5040
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 5100
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 5160
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 5220
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 5280
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 5340
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 5400
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 5460
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 5520
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 5580
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 5640
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 5700
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 5760
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 5820
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 5880
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 5940
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 6000
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 6060
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 6120
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 6180
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 6240
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 6300
gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 6360
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 6420
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 6452
<210>8
<211>1939
<212>DNA
<213>小麦属(Triticum sp.)
<400>8
ccactgtcca cacgaaatgt gccatctgaa acgcgttctg gaacagcgtc aggtgtatga 60
agaagaggac ccagtcgggg cggtggaacc agaagaactt gttgctgggc tcgaccacgg 120
gtgccccctt gatgacgctc gaccggtcct ggatctccag ggccatctcc atgatgatca 180
tctctagctt ggttccaaca cacaagagga tgatgagagg gatgaaagaa acccaggtga 240
gtgtgccgat cccgtcgata tcaaggaaga gggtgaggat cgccacagcc cacagcggga 300
ggctgcgaaa agaggccaaa tgtgtcaaga tcatgcaaca aggaccagca ggggcaaaga 360
ccatgacgca gcaaactgat agtattgtat catatggaag ctaagcaata tcatatggag 420
cctgacgaca ctcgtgccga attcgattcg tgaatttcta gagaacaaaa ggtatgcatc 480
aatttagaaa aaagtacact attatgtgat gtttgtttcc tatgctagtg gaacggatta 540
gaattttttt ttcattaagg tcacctttac tggcataagc agttcacact aaacggtaaa 600
ccttataggt gaaaattttc aggcatatat atatatatat atatatatat atgtttgatt 660
ctttccggct taacaaaata attagcaagt acttcttgtt gcatttgttc caacggctga 720
atttattggc atcggtccaa gaaatccatc taaatgtttt acatttcacc aaagtgtgtg 780
tcatgacaga tgtaacaaat aataaaccaa aaggagagga aggaaagagg aagataaatg 840
ttacaaaaat ttaaatcaaa cttatttcta cctttctcct tacctaccca gtttaaaaac 900
acatattata ttttaaagag aggcaacatg cgccaaaggc tacccttgaa aattcctaaa 960
atattgtaca tttgactgat gaccaaacaa aaagttaaat tgtctcttcc ttatcacatt 1020
atatttccat gcatgccttt ttctggaaac ttactatcag caaaatttag atgaaaggat 1080
aatgccacat aatttcagtc tccaagagat ttgttagttg tcatatatta aattggtggg 1140
ccaatctatt cctgggtctt tttatgtatc tacttgacca tttgaacttc tgtagttaat 1200
tgtattctat gaatgatcac tcatccaaaa acttgttatt tgtgttttac tctgttgaat 1260
cttgaatatt tattcatttt gttcatcata cgattggagg cccataatag atgcttaatg 1320
agagtaagat tatcgatctc caaacacatg cttcttacta gtgttgaata tatacccttt 1380
tagatgtata gttcaaccca tagattcata tgaccctcag ctttctgatg tgtatgtatg 1440
accttacact gacactctga actaatgtag gtatcttgtc ctgcaggaat tcggcacgag 1500
tgtcgtcagg ctccatatga tattgcttag cttccatatg atacaatact atcagtttgc 1560
tgcgtcatgg tctttgcccc tgctggtcct tgttgcatga tcttgacaca tttggcctct 1620
tttcgcagcc tcccgctgtg ggctgtggcg atcctcaccc tcttccttga tatcgacggg 1680
atcggcacac tcacctgggt ttctttcatc cctctcatca tcctcttgtg tgttggaacc 1740
aagctagaga tgatcatcat ggagatggcc ctggagatcc aggaccggtc gagcgtcatc 1800
aagggggcac ccgtggtcga gcccagcaac aagttcttct ggttccaccg ccccgactgg 1860
gtcctcttct tcatacacct gacgctgttc cagaacgcgt ttcagatggc acatttcgtg 1920
tggacaggca tgcgactgg 1939
<210>9
<211>7633
<212>DNA
<213>小麦属(Triticum sp.)
<400>9
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 660
gccccccctc gagtctagaa ctagtggatc cccgacgccg aagtggagcc gacagccccc 720
aggtcccaag ccctcggcag actagatcac tagccctgga tcggcgaggt gactggatga 780
cgagcagcac ctggtctggc gggtgttggg cgagtagaac caggggcgat ggcgacgcgc 840
tgaccttctc ccctcaccgg cgatctgctc cttctgggtg ggggtcgccg gctgacgttc 900
tgttgcgggg tgggggtcgc cggctggcgt tctgctgcgg ggtgggagtc gccgaccggc 960
gtgctgctgc taggacaatc ggtgaggcca gttaggtgct agccgatcga ttggcgaaga 1020
gatccgagtc ctggggagat cagtgaggcc aggtgctatt tggcctatca attggccagg 1080
ttctgggaac ggggcgtggc gtgatcaacg aggtgctagg ctgctagcta gggaactgga 1140
tcctggaacg tggaggaggc aagtccggta tgctaagtac tttaactttc cttcttcaca 1200
tccacctgat tcagattatt ttgatctaaa ttaacttgca aaaaatatat gtgtgatatc 1260
catctactat aattgcttac aatcaaaatt atatgtgatt ttttttagtt tagaagattt 1320
atatgcacag taaatctgaa tgttcttcac atgcatgatt tagtttaact ttaaagagtt 1380
atactaacta gtcttgataa agagatcttt tggagcaaca ccaaacctcg tgaggtgttt 1440
tgcctacgga aaggttgtgc tatgtaatga ttattattag gatcaaagtt gtaggataaa 1500
cgtaaaacct tctcgatgta tcttttatac aacattgtag tttagttata tatggagaga 1560
gtgatttaac actttgtgtt taagagtaga ataagttatt ccacactcta gccaaacgaa 1620
ctatttggca aatatctcgc tagctggtga gagccagagc cgtggaaagt ctgtcttgct 1680
attaaggcac aagcatcaaa caggaacatt tagagccatg gaaaagtgat gtgtcgccta 1740
ccaatgggcc aactgctagc gatgtaataa tagcatccaa gttgattttt tatagaacat 1800
gcaaggcgtt ggcaagtggg aaaatgattg atcgctggca agcttaactc tcggaactta 1860
tagcattcaa ctgaatcaga acaaagatta aaaaaaaata catttccatc gatagtgaaa 1920
aattattcaa ttgagtgaca acgaaaatca tattggaatg tacatttact tgttgatttt 1980
aaattagagg catttttcta ccttttttag ttaataagat atgcatatac ccacccttag 2040
tgttttcgag acaacgagag ggcacattgc ttttggtgct accatctctc tcaagcctca 2100
aataagttgt gcggacacga ttatcttccc gcgttggaat atcgtggcct ggtagagcta 2160
gcgaaaaatc ttccatgttg gaatatgtcg gcagccggat agccgccatg catgtaaagt 2220
ctcttttacc tttacacttg ctcaagtgac actgtatgtc gcctaccact tgctaaatca 2280
atgggccaac tgctagcgac gtaatagtag caagttgatt tacagtgttt tgctacagtt 2340
ctctgacttt gtttcttcat tttagactag ctgactactg tcgcttacct gccttccctt 2400
ctccacgtta gaggatccag ttctgatatt gagacctcga cgatgggagg aagggcgcga 2460
tcgatgtgga gtaatttgaa tttcaaatct atctatctgg ggtatattgg tccttcaccg 2520
atgtttgggg ggctgtcgga aattggttcc gcgatctaca aaagtgaatg gagggagtag 2580
ttgtttctcc aatccgtacc aacgcacgtg tttctaacta gtacttactt ccttcgcacc 2640
acaatatgga atagagggag tatcgataaa ctaacaaaga tgattactta cccggtttaa 2700
atgattcaag agctcattta atttggcact catcatttca tatatctttt ttggtagaaa 2760
tgaaataaag cagatctaga cactagctaa aaagtcgatg tagccttgtt atttccttgg 2820
gccacgcggg ccgggtgtgg tgctccctgc tctgtgtata aatggagatc aacatccaag 2880
gcctcctccc acacacacac gctacagagc agagcagagt cttgctccag tatctgccct 2940
ctcctgcctg cctgtagagc atccatcacg tgaagttcac ggacaaacta cgtacacagg 3000
cagctagctc tcgaaacctc gctcgaaacg cacctgcaga tcgctctctt cgtcgtcgtc 3060
gccgcgatca tcatcaacag ctccgtctgc cttggagcca cggccgtcca cgacgccgcc 3120
gcctcaggtc agtcgtcgga cggtgtccgt tcatttcctc cccatttttg taattgatta 3180
acttgttata catgctgacc tcgacctgct gaataacgtc cgtccatggt ttcccgtcca 3240
ggcaccccgg gccactgtcc acacgaaatg tgccatctga aacgcgttct ggaacagcgt 3300
caggtgtatg aagaagagga cccagtcggg gcggtggaac cagaagaact tgttgctggg 3360
ctcgaccacg ggtgccccct tgatgacgct cgaccggtcc tggatctcca gggccatctc 3420
catgatgatc atctctagct tggttccaac acacaagagg atgatgagag ggatgaaaga 3480
aacccaggtg agtgtgccga tcccgtcgat atcaaggaag agggtgagga tcgccacagc 3540
ccacagcggg aggctgcgaa aagaggccaa atgtgtcaag atcatgcaac aaggaccagc 3600
aggggcaaag accatgacgc agcaaactga tagtattgta tcatatggaa gctaagcaat 3660
atcatatgga gcctgacgac actcgtgccg aattcgattc gtgaatttct agagaacaaa 3720
aggtatgcat caatttagaa aaaagtacac tattatgtga tgtttgtttc ctatgctagt 3780
ggaacggatt agaatttttt tttcattaag gtcaccttta ctggcataag cagttcacac 3840
taaacggtaa accttatagg tgaaaatttt caggcatata tatatatata tatatatata 3900
tatgtttgat tctttccggc ttaacaaaat aattagcaag tacttcttgt tgcatttgtt 3960
ccaacggctg aatttattgg catcggtcca agaaatccat ctaaatgttt tacatttcac 4020
caaagtgtgt gtcatgacag atgtaacaaa taataaacca aaaggagagg aaggaaagag 4080
gaagataaat gttacaaaaa tttaaatcaa acttatttct acctttctcc ttacctaccc 4140
agtttaaaaa cacatattat attttaaaga gaggcaacat gcgccaaagg ctacccttga 4200
aaattcctaa aatattgtac atttgactga tgaccaaaca aaaagttaaa ttgtctcttc 4260
cttatcacat tatatttcca tgcatgcctt tttctggaaa cttactatca gcaaaattta 4320
gatgaaagga taatgccaca taatttcagt ctccaagaga tttgttagtt gtcatatatt 4380
aaattggtgg gccaatctat tcctgggtct ttttatgtat ctacttgacc atttgaactt 4440
ctgtagttaa ttgtattcta tgaatgatca ctcatccaaa aacttgttat ttgtgtttta 4500
ctctgttgaa tcttgaatat ttattcattt tgttcatcat acgattggag gcccataata 4560
gatgcttaat gagagtaaga ttatcgatct ccaaacacat gcttcttact agtgttgaat 4620
atataccctt ttagatgtat agttcaaccc atagattcat atgaccctca gctttctgat 4680
gtgtatgtat gaccttacac tgacactctg aactaatgta ggtatcttgt cctgcaggaa 4740
ttcggcacga gtgtcgtcag gctccatatg atattgctta gcttccatat gatacaatac 4800
tatcagtttg ctgcgtcatg gtctttgccc ctgctggtcc ttgttgcatg atcttgacac 4860
atttggcctc ttttcgcagc ctcccgctgt gggctgtggc gatcctcacc ctcttccttg 4920
atatcgacgg gatcggcaca ctcacctggg tttctttcat ccctctcatc atcctcttgt 4980
gtgttggaac caagctagag atgatcatca tggagatggc cctggagatc caggaccggt 5040
cgagcgtcat caagggggca cccgtggtcg agcccagcaa caagttcttc tggttccacc 5100
gccccgactg ggtcctcttc ttcatacacc tgacgctgtt ccagaacgcg tttcagatgg 5160
cacatttcgt gtggacaggc atgcgactgg gcatgcccgc tgaaatcacc agtctctctc 5220
tacaaatcta tctctctcta taataatgtg tgagtagttc ccagataagg gaattagggt 5280
tcttataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg tatttgtatt 5340
tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca ggggtaccga 5400
gctcgaattc tagtctacgc ggccgcgagc tccagctttt gttcccttta gtgagggtta 5460
attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 5520
acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 5580
gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 5640
tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 5700
cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 5760
gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 5820
aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 5880
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 5940
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 6000
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 6060
ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 6120
cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 6180
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 6240
actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 6300
tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 6360
gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 6420
ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 6480
cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 6540
ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 6600
tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 6660
agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 6720
gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 6780
ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 6840
gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 6900
cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 6960
acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 7020
cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 7080
cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 7140
ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 7200
tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 7260
atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 7320
tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 7380
actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 7440
aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 7500
ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 7560
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 7620
cgaaaagtgc cac 7633
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>接头引物
<400>10
atatatctgc agggagccac ggccgtccac 30
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>接头引物
<400>11
tatcccgggc ccgtgcctgg acgggaa 27
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>接头引物
<400>12
atatatctcg agtctagaac tagtggatcc 30
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>接头引物
<400>13
atatattacg tagtttgtcc gtgaacttca 30
<210>14
<211>41
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>14
gtacacaggc agctagctct cgaaacctcg ctcgaaacgc a 41
<210>15
<211>41
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>15
catgtgtccg tcgatcgaga gctttggagc gagctttgcg t 41
Claims (28)
1.具有植物表皮特异性的启动子区，包含来源于基因GSTA1启动子的第一序列和来源于基因WIR1a内含子的第二序列。
2.根据权利要求1的启动子区，其特征在于第一序列是SEQ ID No.1，第二序列是SEQ ID No.2。
3.根据权利要求1或2的启动子区，其特征在于它选自：
a)包含SEQ ID No.3所示核酸序列的启动子区，
b)包含SEQ ID No.3所示核酸序列的功能部分的启动子区，和
c)具有在严谨条件下与SEQ ID No.3所示核酸序列杂交的序列的启动子区。
4.嵌合基因，其特征在于它含有与编码序列可操作连接的根据权利要求1-3中任意一项的启动子区。
5.根据权利要求4的嵌合基因，其特征在于它的表达导致表皮中由所述编码序列编码的蛋白质的产量增加。
6.根据权利要求5的嵌合基因，其特征在于编码区来源于抗性基因。
7.根据权利要求5或6的嵌合基因，其特征在于编码序列编码过氧化物酶或草酸氧化酶。
8.根据权利要求4的嵌合基因，其特征在于它的表达抑制表皮中相应内源基因的表达。
9.根据权利要求8的嵌合基因，其特征在于编码序列是反义取向的。
10.根据权利要求8的嵌合基因，其特征在于对内源基因表达的抑制由RNA干扰引起。
11.根据权利要求8-10中任意一项的嵌合基因，其特征在于表达受抑制的基因是Mlo基因。
12.重组核酸分子，包含根据权利要求1-3中任意一项的启动子区或根据权利要求4-11中任意一项的嵌合基因。
13.根据权利要求12的重组核酸分子，还包含转录终止序列。
14.产生具有表皮特异性表达转基因的转基因植物的方法，包括下列步骤：
a)产生根据权利要求12或13的重组核酸分子，
b)将a)的重组核酸分子转移到植物细胞中，和
c)再生完全转化的植物，如果期望，繁殖植物。
15.根据权利要求14的方法，其中所述植物是单子叶植物。
16.根据权利要求15的方法，其中所述植物是禾本科植物。
17.根据权利要求16的方法，其中所述植物是小麦或大麦。
18.根据权利要求1-3中任意一项的启动子区在植物中表皮特异性表达转基因的用途。
19.根据权利要求18的用途，其中所述的转基因是抗性基因。
20.增加转基因植物中病原体抗性的方法，包括下列步骤：
a)产生根据权利要求12或13的重组核酸分子，
b)将a)的重组核酸分子转移到植物细胞中，和
c)再生完全转化的植物，如果期望，繁殖所述植物。
21.根据权利要求20的方法，其中所述植物是单子叶植物。
22.根据权利要求21的方法，其中所述植物是禾本科植物。
23.根据权利要求22的方法，其中所述植物是小麦或大麦。
24.根据权利要求20-23中任意一项的方法，其特征在于它们表现出对霉菌的更高抗性。
25.转基因植物细胞，其包含根据权利要求12或13的重组核酸分子。
26.根据权利要求25的转基因植物细胞，其中所述细胞是单子叶植物细胞。
27.根据权利要求26的转基因植物细胞，其中所述细胞是禾本科植物细胞。
28.根据权利要求27的转基因植物细胞，其中所述细胞是小麦或大麦细胞。
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