KR20070020186A - 식물에서의 표피-특이적인 형질전환 발현을 위한 프로모터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그의 조절 형질전환 유전자가 식물에서 표피 특이적으로 발현될 수 있는 프로모터 영역에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 상기한 프로모터 영역를 포함하는 재조합 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자에 의하여 형질전환된 형질전환 식물과 식물세포, 뿐만 아니라 이들의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 더 상세하게는, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 핵산 분자, 및 병원체 저항성을 매개할 수 있는 핵산 서열 또는 형질전환 유전자, 뿐만 아니라 상기한 핵산 분자에 의하여 형질전환된 식물과 식물세포 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.

프로모터, 형질전환, 전사 복합체

Description

식물에서의 표피-특이적인 형질전환 발현을 위한 프로모터{PROMOTER FOR THE EPIDERMIS-SPECIFIC TRANSGENIC EXPRESSION IN PLANTS}

본 발명은 그의 조절 형질전환 유전자가 식물에서 표피 특이적으로 발현될 수 있는 프로모터 영역(promoter region)에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 상기한 프로모터 영역를 포함하는 재조합 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자에 의하여 형질전환된 형질전환 식물과 식물세포, 뿐만 아니라 이들의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 더 상세하게는, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 핵산 분자, 및 병원체 저항성을 매개할 수 있는 핵산 서열 또는 형질전환 유전자, 뿐만 아니라 상기한 핵산 분자에 의하여 형질전환된 식물과 식물세포 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.

유전자에 있어서, 전사 개시점(transcription initiation point)의 상류(upstream)에 위치하고, 전사의 개시점과 개시 빈도 및 이에 따라 제어되는 유전자의 발현 정도와 발현 패턴이 이에 의하여 결정되는 DNA 영역를 일반적으로 프로모터라 한다. RNA 중합효소와 RNA 중합효소를 활성화하는 특정 전사조절 인 자(transcription factor)들은 기본적인 전사 복합체(basal transcription complex)와 함께 전사를 개시하기 위하여 프로모터에 결합한다. 프로모터의 효율성은 부가적인 DNA 서열, 인핸서 서열(enhancer sequences), 상기 프로모터의 위치에 반대되는 이들의 위치에 의해 종종 상승되기도 하고 조절되며, 고정되어 있는 것이 아니다. 이들 조절 요소들은 발현되는 유전자의 상류(upstream), 하류(downstream), 또는 인트론(intron)에 위치할 수 있다.

재조합 DNA 기술에서, 프로모터는 통상적으로는 프로모터에 의해 자연적으로 조절되지 않는 유전자인 형질전환 유전자의 발현을 조절하기 위하여 발현 벡터에 삽입된다. 여기에서 실질적으로 중요한 점은 프로모터의 특이성(specificity)으로서, 이것이 유전공학에 의하여 전이되는 유전자의 발현 시점, 조직의 유형, 강도를 결정한다.

육종에서, 재조합 DNA 기술은 특정 유익한 특성을 유용한 식물에게 전달하기 위하여 자주 사용되었고, 이러한 식물은 예를 들면 병원체 저항성을 높여 더 높은 수확량을 유도하거나, 수확물의 개선된 특성을 유도하는 것으로 생각된다. 본 명세서에서, 형질 전환 산물은 몇몇 조직에서는 정상적인 생리과정에 나쁜 영향을 초래할 수 있기 때문에, 전이된 유전자는 어디에서나 발현되는 것이 아니라 형질전환 활성이 요구되는 조직들에서만 존재하는 것이 바람직하다. 따라서, 예를 들면 어디에서나 효과적인 35S 프로모터의 조절하에서 음이온성 과산화효소(anionic peroxidase)의 과발현(overexpression)은 뿌리의 생장 저하 및 뿌리의 질량 감소가 초래되어 형질전환 담배를 시들게 할 수도 있다(Lagrimini 등, (1997) The consequence of peroxidase overexpression in transgenic plants on root growth and development. Plant Mol Biol. 33 (5), S. 887-895). 상기와 같이 어디에서나 효과적인 유비퀴틴 프로모터(ubiquitin promoter)의 제어 하에서 spi2 과산화효소의 과발현은 대조군 식물에 비하여 상배축(epicotyl) 발생 및 길이 생장의 감소를 유발한다(Elfstrand, M. 등, (2001) Overexpression of the endogenous peroxidase-like gene spi2 in transgenic Norway spruce plants results in increased total peroxidase activity and reduced growth. Plant Cell Reports 20 (7), S. 596-603). 생리적인 과정에서의 부정적인 효과와는 관계없이, 형질전환 산물이 수확된 식물의 부분에도 존재하는 것은 저항성 육종을 방해하는 것으로 추정된다.

그러므로, 조직-특이적으로 또는 유도성으로 기능하는 프로모터가 수년 동안 분리되어 왔다. 조직-특이적 프로모터(Tissue-specific promoters)는, 예를 들면 씨-, 덩이줄기-, 열매-특이적인 프로모터이다. 유도성 프로모터(inducible promoter)는, 예를 들면 화학적 유도, 광 유도, 또는 다른 자극들에 의하여 활성화될 수 있다.

또한, 표피(epidermis)에서 유전자 발현을 특이적으로 조정하는 것이 바람직하다. 상기 표피는 고등 식물 중에서 지표 식물의 말단 조직(terminal tissue)이다. 표피 그 자체의 기능은 식물의 물과 양분을 교환하도록 하는 한편, 병원체가 식물로 들어오는 것을 막는 것이다. 이러한 기능은 적합한 프로모터와 후술하는 제어된 유전자들의 도움으로 표피에서의 변형된 유전자 발현을 통하여 특이적으로 조절될 수 있다.

표피-특이적인 프로모터는 쌍자엽 식물(dicotyledonous plants)에서 이미 설명되어 있다. 왁스 합성에서 축합 효소(condensing enzyme)를 암호화하는 아라비돕시스(Arabidopsis)의 CER6-(CUT1-) 유전자의 프로모터는 ß-글루큐로니데이즈 리포터 유전자(ß-glucuronidase reporter gene)의 표피-특이적 발현을 유발할 수 있다(Hooker 등 (2002), Significance of the expression oβf the CER6 condensing enzyme for cuticular wax production in Arabidopsis, Plant Phy-siol. 129(4), S. 1568-1580; Kunst 등 (2000), Expression of the wax-specific condensing enzyme CUT1 in Arabidopsis, Biochem. Soc. Trans. 28(6), S. 651-654).

그러나, 단자엽 식물(monocotyledonous plants)에서, 적절한 표피-특이적 프로모터로서 단자엽 식물(monocotyledon), 특히 벼과 식물(poaceae)(향기풀류)에서의 형질전환 유전자의 발현에 특히 적합한 프로모터는 아직까지 성공적으로 동정될 수 없었다. 그러므로, 옥수수(maize)로부터의 유비퀴틴 프로모터(ubiquitin promoter)와 같은 컨스티튜티브 프로모터(constitutive promoters)가 표피에서의 단백질 발현을 위하여 지금까지 사용되어 왔다(예를 들면, Oldach 등 (2001), Heterologous expression of genes mediating enhanced fungal resistance in transgenic wheat, Mol Plant Microbe Interact. 14(7), S. 832-838 참조). 그러나, 상기한 바와 같이, 이는 표피보다는 다른 조직이나 기관에서 형질전환 산물을 존재하도록 하기 때문에 형질전환 식물에서 바람직하지 않은 부작용을 초래할 수 있다.

따라서, 본 발명의 근본적인 문제는 단자엽 식물, 바람직하게는 곡류 식물(cereal plant)에서의 표피-특이적 유전자 발현을 하도록 하는 수단을 제공하는 것이다.

이러한 문제는 청구항으로 그 특성이 기술된 실시예의 제공으로 해결된다.

따라서, 본 발명은 글루타티온-S-트랜스퍼레이즈 A1(glutathione-S-transferase A1, GSTA1)의 유전자로부터 유래한 첫 번째 서열과, WIR1a 유전자의 인트론으로부터 유래한 두 번째 서열을 포함하는 식물 표피에 특이적인 프로모터 영역에 관한 것이다. GSTA1은 Dudlere 등(1991)의 "A pathogen-induced wheat gene encodes a protein homologous to glutathione-S-transferases, Mol. Plant Microbe Interact. 4(1), S. 14-18"에 기술되어 있는 유전자들에 관한 것이다. 특히, 이들 유전자는 밀에서 유래한다; 그러나, 그들은 또한 발현 패턴이 공통되고 비슷한 유전자 산물을 가지는 다른 곡류 식물, 특히 보리로부터의 상동 유전자(homologous gene)일 수도 있다. WIR1a는 Bull 등(1992)의 "Sequence and expression of a wheat gene that encodes a novel protein associated with pathogen defense, Mol. Plant Microbe Interact. 5(6), S. 516-519"에 기술되어 있는 것과 같은 유전자들을 표시한다.

바람직하게는, 첫 번째 서열은 서열번호　1이고 두 번째 서열은 서열번호　2이다.

첫 번째와 두 번째 서열 사이에는 10 내지 1000　bp, 바람직하게는 20　내지 800 bp, 특히 바람직하게는 30　내지 500　bp, 가장 바람직하게는 40　내지 300　bp를 가진 다른 비-번역 서열(non-translated sequence)이 존재할 수 있다.

특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로모터 영역는

a) 서열번호　3에서 제공되는 핵산 서열을 포함하는 프로모터 영역;

b) 서열번호　3에서 제공되는 핵산 서열의 기능부를 포함하는 프로모터 영역; 또는

c) 서열번호　3에서 제공되는 핵산 서열과 엄격한 조건에서 혼성화하는 서열을 가진 프로모터 영역

로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터 영역이다.

본 발명의 범위 내에서, 프로모터 서열은 코딩 서열(coding sequences)(형질전환 유전자)의 발현에 요구되는 조절 서열(regulatory sequences)을 포함하는 핵산 서열로 이해된다. 조절 서열은 코딩 서열의 발현, 즉, 특히 발현 정도 및 패턴을 결정하는 유전자 부분을 형성한다. 상기 조절 서열은 특정 전사 요소들과 RNA 중합효소가 전사 복합체를 형성하기 위하여 결합하고 조립되는 하나 이상의 서열 모티프(sequence motif)를 가지며, 프로모터 영역에 의해 제어된 핵산 서열의 전사를 효과적으로 개시한다.

본 발명에 따른 프로모터 영역는, GSTA1 유전자의 프로모터와 새로운 특성을 가진 프로모터가 밀의 GSTA1 유전자의 프로모터와 밀의 WIR1a 유전자의 인트론 서열을 결합함으로써 생성될 수 있다는 발견에 기초한 것이다.

리포터 유전자로서 E. coli의 β-글루큐로니데이즈(β-glucuronidase, GUS)를 가지는 밀 잎의 일시적 리포터 유전자 측정법(transient reporter gene assay)에서, WIR1a 프로모터와 인트론과 GST 프로모터의 다른 조합을 시험하였다. 놀랍게도, GST 프로모터와 WIR1a 인트론이 리포터 유전자의 활성에 상승적인 효과를 갖는다는 것이 밝혀졌다. 상기 전사 활성의 증가는 어디서나 발현되는 35S 프로모터에 의해 달성되는 전사 활성에 비길만하다.

본 발명의 범위 내에서, "표피-특이적"이란 용어는 본 발명에 따른 프로모터 영역의 제어하에 있는 핵산 서열이 식물 가지의 표피에서 발현되는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명의 관점에서 표피-특이적은, 특히 본 발명에 따른 프로모터 영역가 다른 세포 유형에 비하여 표피에서의 외래 유전자 발현에 적합한지와, 다른 세포 유형에서의 발현에 비하여 적어도 2배, 바람직하게는 5배 이상, 특히 바람직하게는 10배 이상, 가장 바람직하게는 50배 이상으로 두드러진 증가를 유발하는지에 따라 주어진다. 발현 정도는 통상적인 인-시튜 관찰법(in situ detection techniques)을 통하여 결정될 수 있다.

"식물 표피"란 용어는, 당업자에게 알려져 있다. 보충적인 정보는 예를 들면 Strasburger, Lehrbuch der Botanik, 35. edition 2002, Spektrum Akademischer Verlag와 같은 식물 해부학이나 식물 생리학 책에 나타나 있다.

현재 놀랍게도, 밀의 GSTA1 유전자로부터의 조절 서열과 밀의 WIR1a 유전자로부터의 인트론 서열을 포함하는 프로모터 영역는 제어 상태에서 암호화 핵산 서열의 표피-특이적 발현을 유발하는 것으로 알려져 있다.

게다가, 서열번호　3으로 표시된 핵산 서열을 가지는 프로모터 영역인 본 발명은, 식물에서 상기 서열의 기능적 부분을 가지고 제어 상태에서 상기 암호화 핵산 서열 중의 하나의 표피-특이적 발현을 유발하는 프로모터 영역에 관한 것이다.

본 명세서에서, "기능적 부분"이란 약간 벗어난 핵산 서열임에도 불구하고 전사 복합체가 여전히 결합되어 표피-특이적 발현을 유발하는 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 또한, 프로모터 서열의 기능적 부분은 야생형(wild-type)에 비하여 프로모터 활성이 더 감소 되거나 더 상승되는 프로모터 변이체를 포함한다. 특히, 기능적 부분은 또한, 서열번호　3에서 제공되는 프로모터 영역 서열의 자연적 또는 인공적인 변이체를 표시하는 것으로 이해될 수도 있다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기가 치환, 첨가, 결실, 교환, 및/또는 삽입되는 것을 포함한다. 본 발명의 범위 내에서, 프로모터 영역의 기능적 부분은 서열번호　3의 자연적으로 발생하는 변이체 뿐만 아니라, 예를 들어 화학 합성으로 인해 얻어지는 인공적인 뉴클레오티드도 포함한다.

여하튼, 상기 프로모터는 TATA 박스(서열번호　1 및 3의 2163 내지 2169 위치) 및 바람직하게는 두 개의 CAAT 박스(서열번호　1 및 3의 1047 내지 1051 또는 1895 내지 1899 위치)를 포함한다. 더욱이, 상기 프로모터는 이하의 서열 모티프:

a) GTGGGGG

b) ACGTGGA

c) TCCACCT

d) TATCCAT

e) CATGCATG

f) TGTAAAG

g) CCTACCA

h) AATAGTA

를 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘 및 셋, 더욱 바람직하게는 적어도 넷, 다섯, 및 여섯, 및 가장 바람직하게는 적어도 일곱 또는 여덟 개 포함한다.

바람직하게는, 상기 서열 모티프는 서열번호　1 및 3의 하기 위치:

- a) 185-191 및 217-223　bp

- b) 455-461　bp

- c) 508-514　bp

- d) 564-570　bp

- e) 1514-1521　bp

- f) 1520-1526　bp

- g) 1569-1575　bp

- h) 1610-1616　bp

와 대응하는 위치에 있다.

상기 프로모터 영역의 변이체의 프로모터 활성은, 코딩 서열이 측정될 프로모터 영역의 제어하에 있는 마커 유전자를 이용하여 측정할 수 있다. 적합한 마커 유전자는, 예를 들면, E. coli의 β-글루큐로니데이즈(GUS) 유전자, Aequoria victoria의 그린 형광 단백질(GFP), Photinus pyralis의 루시페레이즈 유전자 또는 E. coli의 β-갈락토시데이즈(lacZ) 등과 같은 형광 유전자(fluorescence gene)이다. 순수한 프로모터 활성(promoter activity)은 야생형 식물과 비교하는 방법으로 결정된다. 조직이나 세포 특이성은 각각의 조직이나 세포에서 상기한 마커 유전자의 발현율과 비교하는 방법으로 결정된다.

본 발명은 또한, 엄격한 조건에서 서열번호　3에서 제공되는 핵산 서열과 혼성화(hybridizing)하는 핵산 서열을 가지는 프로모터 영역에 관한 것이다. 본 발명과 관련하여, "엄격한 조건에서 혼성화"라 함은 혼성화가 특정 혼성화를 보장하기에 충분할 만큼 엄격한 상태의 생체외(in vitro) 조건하에서 수행되는 것을 의미한다. 이러한 엄격한 혼성화 조건은 당업자에게 공지되어 있고, 문헌으로부터도 알 수 있다(Sambrook 등 (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

일반적으로, "특이적으로 혼성화"라 함은 엄격한 조건하에서 특정한 뉴클레오티드 서열에 우선적으로 결합하는 분자를 의미하며, 상기 서열은 DNA 또는 RNA의 복합 혼합물(예를 들면, 전부) 형태로 존재한다. "엄격한 조건"이란 용어는 일반적으로 핵산 서열이 그의 목표 서열(target sequence)에 우선적으로 결합하고, 다른 서열에는 비교적 적은 양 결합하거나 또는 전혀 결합하지 않는 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 부분적으로 서열-의존적이고, 다른 환경하에서는 달라질 수 있다. 보다 긴 서열은 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화 한다. 일반적으로, 엄격한 조건은, 온도를 규정 상수 이온력(defined constant ionic strength)과 규정된 pH 값에서 특정 서열의 열에 대한 녹는점(T_m) 이하 약 5℃에 두는 것과 같은 식으로 선별된다. T_m은 평형상태에서 목표 서열에 대한 상보적인 분자의 50%가 목표 서열과 혼성화하는 온도(규정된 이온력, pH 값, 및 핵산 농도)이다. 전형적으로, 엄격한 조건은 7.0과 8.3 사이의 pH 값에서 염 농도가 적어도 0.01 내지 1.0　M 나트륨 이온 농도(또는 다른 임의의 염)이고 짧은 분자(즉, 예를 들면 10 내지 50 뉴클레오티드)에 대한 온도가 적어도 30℃인 상태이다. 또한, 엄격한 조건은 포름아마이드와 같은 불안정화제(destabilizing agents)를 가함으로써 달성될 수 있다.

적절한 엄격한 혼성화 조건은, 예를 들면 Sambrook 등(위를 참조)에 기술되어 있다. 즉, 혼성화는 예를 들면, 하기와 같은 상태:

- 혼성화 버퍼: 혼성화 온도 65 내지 68℃에서 2　x　SSC, 10　x Denhardt's 용액(Fikoll 400 + PEG + BSA; 비율 1:1:1), 0.1%　SDS, 5　mM　EDTA, 50　mM Na₂HPO₄, 250　㎍/ml 청어 정자(herring sperm) DNA; 50　㎍/ml tRNA 또는 0.25　M 인산 나트륨(sodium phosphate) 버퍼 pH　7.2, 1　mM EDTA, 7%　SDS

- 세척 버퍼: 세척 온도 65 내지 68℃에서 0.2　x　SSC, 0.1%　SDS

에서 일어날 수 있다.

바람직하게는, 이러한 프로모터 변이체는 서열번호　3에서 제공되는 프로모터 서열 또는 서열번호　3에서 주어진 전체 DNA 서열에 관한 그들의 부분과 적어도 50%, 바람직하게는 70%, 특히 바람직하게는 90%, 그리고 가장 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 가진다. 바람직하게는, 이러한 프로모터 서열의 서열 동일성(sequence identity)은 서열번호　3에서 제공되는 핵산 서열과 비교함으로써 결정된다. 다른 길이의 두 핵산 서열의 경우에는, 상기 서열 동일성은 보다 긴 서열의 대응되는 핵산 잔기와 동일한 보다 짧은 서열의 핵산 잔기의 퍼센트와 관련된다.

서열 동일성은 CLUSTAL과 같은 다른 조정 프로그램을 통하여 통상적으로 정해진다. 일반적으로, 당업자들은 서열 동일성을 결정하기 위한 상기 프로그램과 같은 적절한 조정 방법을 갖고 있으며, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST(예를 들면, 링크 "standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]")에 접속할 수 있다.

상기에서 제공된 서열번호　3의 동일성 퍼센트 값은 서열번호　1 및 2에 나타난 본 발명에 따른 프로모터 영역의 첫 번째 및 두 번째 서열에도 적용된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 상기 프로모터 영역는 서열번호　3에서 제공되는 전체 2552 뉴클레오티드의 서열을 갖는다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 프로모터 영역 및 코딩 서열의 키메라 유전자(chimeric gene), 및 상기 키메라 유전자를 함유하는 재조합 핵산 분자에 관한 것인데, 여기서 코딩 서열의 발현은 키메라 유전자 내에서는 본 발명에 따른 프로모터 영역에 의해 자연적으로 조절되지 않고, 작동 결합(operative linkage) 내에서는 본 발명에 따른 프로모터 영역에 위해 조절된다.

"본 발명에 따른 프로모터 영역에 의해 발현이 조절되는 핵산 서열"이란, 프로모터 영역가 활성인 세포 내에서 본 발명에 따른 프로모터 영역의 조절하에 핵산 서열의 발현이, 야생형 세포와 비교하여 적어도 5 인자(factor), 바람직하게는 10 인자, 및 특히 바람직하게는 50 인자까지 증가될 수 있음을 의미한다.

본 발명에 따른 핵산 서열에 의해 그 발현이 조절되는 핵산 서열은, 예를 들면 유전자 산물이 표피 내에서 요구되는 저항성 유전자(resistance gene)인 형질전환 유전자(transgene)의 암호화 영역일 수 있다. 형질전환 유전자의 발현에 의해, 이에 의해 암호화되는 유전자 산물의 함량은, 적어도 2 인자, 바람직하게는 적어도 5 인자, 특히 바람직하게는 적어도 10 인자 및 가장 바람직하게는 적어도 50 인자까지 증가될 수 있다.

그러나, 본 발명에 따른 프로모터 영역는 또한, 유전자 산물이 정상보다 적은 함량으로 표피 내에 존재하거나 또는 전혀 없다고 추측되는 특정 유전자의 표피-특이적 무발현(epidermis-specific silencing)을 이루기 위해 RNA 간섭(RNA-interference)을 위한 RNAi 구조물(construct)에 사용될 수 있다. 물론, 후자는 또한 본 발명에 따른 프로모터 영역의 사용과 함께 전통적인 안티센스(antisense) 또는 공-억제 구조물(co-suppression construct)에 의해 이루어질 수 있다. 무발현 구조물에 의해, 내인성 유전자(endogenous gene)의 발현은 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 특히 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 까지 감소된다.

RNA 간섭용으로 사용되는 것으로 추측되는 구조물에서, 일반적으로 전사에 이어 이중나선 RNA를 형성하는 팔린드롬(palindromic) DNA 서열이 있다. 다이서(dicer) 효소에 의해, 상기 이중나선 RNA는 내인성 RNA에 결합하는 보다 짧은 RNA 조각들을 형성하도록 처리되고, RISC(RNA-induced silencing complex)의 도움으로 이의 분해가 유발된다(Hannon(2002), RNA interference, Nature, Bd.418, S.244-251).

내인성 유전자의 발현에 대한 유전자 무발현 구조물의 효과는, 당업자에게 잘 알려진 통상적인 분자생물학 방법에 의해 감지될 수 있다. 따라서, 노던 블럿 및 RT-PCR 방법은 RNA 레벨을 조사하는데 이용되고; 단백질은 웨스턴 블럿 분석, 면역형광법에 의해 감지될 수 있으며, 또는 단백질은 효소 측정법(enzyme assay)에 의해 효소로 제공된다.

본 발명의 범위에서, "형질전환 유전자(transgene)"는 유전자 산물이 표피에 제공된다고 추측되거나 또는 유전자 무발현으로 억제된다고 추측되는 유전자를 요약한 용어이다.

바람직하게는, 발현이 본 발명에 따른 프로모터의 조절하에 있는 핵산 서열은, 병원체 저항성을 매개하는 핵산 서열이고, 따라서 표피는 식물로 침입할 때 병원체에 의해 극복되어야 하는 첫 번째 밴드이다.

본 발명의 범의 내에서, "재조합 핵산 분자(recombinant nucleic acid molecule)"는, 본 발명에 따른 프로모터 영역 또는 본 발명에 따른 키메라 유전자를 함유하고, 식물 세포 및 식물 내에서 본 발명에 따른 프로모터 영역의 조절하에 있는 핵산 서열의 프로모터-의존 발현을 유발할 수 있는 벡터를 의미하는 것이라 이해된다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 재조합 핵산 분자는 추가적으로 전사 종결 서열을 함유한다. 여기서, "전사 종결 서열(transcription termination sequence)"은 암호화 유전자의 하류 말단에 위치하고, RNA 중합효소가 전사를 종결하는 것을 유도하는 DNA 서열을 의미하는 것이라 이해된다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터 영역에 의해 조절되는 핵산 서열의 표피-특이적 발현으로 형질전환 식물을 생산하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:

a) 재조합 핵산 분자를 생성하는 단계 - 여기서 본 발명에 따른 프로모터 영역는 암호화 유전자와 작동 결합 내에 존재한다 - ;

b) a) 단계로부터의 핵산 분자를 식물 세포에 전달하는 단계; 및

c) 완전하게 형질전환된 식물을 재생하는, 원한다면 식물을 증식시키는 단계.

고등식물과 이들의 세포로 각각 외부 유전자를 도입하기 위해, 다수의 E.coli 용 복제 시그널을 함유하는 클로닝 벡터와 형질전환된 박테리아 세포를 선별하기 위한 마커 유전자가 이용될 수 있다. 이러한 벡터의 예는, pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC184 등이 있다. 키메라 유전자는 적당한 제한자리(restriction site)에 벡터로 도입될 수 있다.

수득된 플라즈미드는 이후 형질전환 E. coli 세포를 위해 사용된다. 형질전환된 E. coli는 적당한 배지에서 배양되고, 연속적으로 수확되며, 용해되어 플라즈미드가 재수득된다. 제한 분석, 겔 전기영동, 및 다른 생화학적-분자생물학적 방법이 일반적으로 수득된 플라즈미드 DNA를 특성화하기 위한 분석 방법으로 이용된다. 각 조작 후에, 플라즈미드 DNA는 절단될 수 있고, 수득된 DNA 단편들은 다른 DNA 서열에 연결될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 식물 숙주 세포에 DNA를 도입하기 위한 다양한 기술들이 이용될 수 있으며, 여기서 당업자는 어려움 없이 각 경우에 적합한 방법을 결정할 수 있다. 상기 기술들은, 형질전환 배지로서 에그로박테리움 튜메파신스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 에그로박테리움 리조진스(Agrobacterium rhizogenes)를 이용하여 T-DNA로의 식물 세포의 형질전환, 원형질 융합, 주입, 전기천공법(electroporation), 분리된 DNA의 원형질 내로의 직접 유전자 전달, 바이오리스틱(biolistic) 방법에 의한 DNA의 도입뿐만 아니라 몇 년 동안 잘 수립되고 각각 식물 분자 생물학 및 식물 생물공학 분야의 당업자의 기본적인 레퍼토리에 속하는 다른 가능성들을 포함한다. 바이오리스틱 유전자 전달 방법은, 특히 단자엽 식물에서 사용된다. 여기서, 당업자는 다음의 문헌들, 예를 들면 『바질 외(1992) Bio/Technology, 10, S. 667-674; 바질 외(1993) Bio/Technology, 11, S. 1153-1159; 네라 외(1994) Plant J. 5, S. 12-17; 오리츠 외(1996) Plant Cell Reports 15, S. 877-81; 라스코-가운트 외(2001) J. Exp. Bot. 52, S. 865-874』와 같은 문헌들에서 유용한 정보를 발견할 수 있다.

식물 세포로의 DNA 주입 및 전기천공의 경우에서는, 본질적으로 사용되는 플라즈미드에 어떠한 특별한 요구도 적용되지 않는다. 이것은 또한 직접 유전자 전달에도 적용된다. 예를 들면 pUC 유도체와 같은 단순 플라즈미드가 사용될 수 있다.

그러나, 완전한 식물이 이러한 방법으로 형질전환된 세포로부터 재생산된다면, 선별가능한 마커 유전자가 존재할 것을 권한다. 기본적인 선별 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 적합한 마커를 선택하는 것은 문제가 되지 않는다.

식물 세포로 원하는 유전자를 도입하는 방법에 의할 때, 추가적인 DNA 서열이 요구될 수 있다. 예를 들면, Ti 또는 Ri 플라즈미드가 식물 세포를 형질전환하는데 사용된다면, 종종 우측 및 좌측 영역(border)이지만, Ti 또는 Ri 플라즈미드 내에 함유된 T-DNA의 적어도 우측 영역이 도입될 유전자와 결합되어 측부 영역(flanking region)을 형성한다. 만일 에그로박테리아가 형질전환용으로 사용된다면, 도입될 DNA는 특정 플라즈미드, 실질적으로 중간 또는 이원 벡터(binary vector)로 클론되어야 한다. T-DNA 내 서열과 상응하는 서열로 인하여, 중간 벡터는 동종 재조합에 의해 에그로박테리아의 Ti 또는 Ri 플라즈미드로 통합될 수 있다. 상기 플라즈미드는 또한 T-DNA의 전달에 필요한 vir 영역를 함유한다. 그러나, 중간 벡터는 에그로박테리아 내에서 복제할 수 없다. 헬퍼 플라즈미드(helper plasmid)에 의해, 중간 벡터는 에그로박테리움 튜머파시엔스에 전달될 수 있다(접합). 그러나, 이원 벡터는 E. coli와 에그로박테리아 내에서 복제할 수 있다. 이들은 선별 마커 유전자와 우측 및 좌측 T-DNA 영역 영역에 의해 만들어진 링커(linker) 또는 폴리링커를 함유한다. 이들은 에그로박테리아 내로 직접적으로 형질전환될 수 있다. 숙주 세포로 공급되는 에그로박테리아는, 식물 세포 내로 전달되는 T-DNA 내에 키메라 유전자를 운반하는 플라즈미드를 함유한다. 추가적인 T-DNA가 존재할 수 있다. 이러한 방법으로 형질전환된 에그로박테리아는 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 식물 세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 사용은 집중적으로 연구되었고, 식물 형질전환에 대한 공지된 조사 논문과 매뉴얼에 충분하게 기재되어 있다. 단자엽 식물의 경우, 변형된 프로토콜이 효과적인 에그로박테리움-매개 유전자 전달을 위해 적용될 수 있으며, 이들은 예를 들면 『쳉 외(1997) Plant Physiol. 115, S. 971-980; 카나 및 다가르드(2003) Plant Cell Reports 21, S. 429--436; 우 외(2003) Plant Cell Reports 21, S. 659-668; 후 외(2003) Plant Cell Reports 21, S. 1010-1019』에 기재되어 있다. DNA를 식물 세포에 전달하기 위해, 식물 외식편은 에그로박테리움 튜메파시엔스 또는 에그로박테리움 리조진스와 함께 적절하게 배양될 수 있다. 완전한 식물은 형질전환된 세포의 선별을 위해 항생제 또는 살생물제(biocide)를 함유할 수 있는 적절한 배지 내에서 감염된 식물 재료(예를 들면, 잎 조각, 줄기 부분, 뿌리뿐만 아니라 원형질 또는 현탁-배양된 식물 세포)로부터 재생산될 수 있다.

도입된 DNA가 식물 세포의 게놈으로 통합되면, 정상적으로 안정되고 또한 최초 형질전환된 세포의 산물에서도 유지된다. 도입된 DNA는 일반적으로 카나마이신(kanamycin), G 418, 블레오마이신(bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 글라이포세이트(glyphosate), 스트렙토마이신(streptomycin), 설포닐우레아(sulfonylurea), 젠타마이신( gentamycin) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 항생제 또는 살생물제에 대하여 형질전환된 식물 세포에 저항성을 부여하는 선별 마커를 함유한다. 개별적으로 선별된 마커는 따라서 도입된 DNA가 결여된 세포에 대해 형질전환된 세포의 선별을 가능하게 한다. 때문에, 영양 마커(nutritive marker) 또는 스크리닝 마커(GFP, 녹색 형광 단백질 등)와 같은 대안 마커(alternative maker)가 또한 적합하다. 물론, 선별 마커는 또한 생략될 수 있으나, 상대적으로 높은 스크리닝 필요성을 수반한다. 마커가 없는 유전자 도입 식물을 원한다면, 당업자는 예를 들면, 공-형질전환(co-transformation) 또는 서열-특이적 재조합효소(sequence-specific recombinase)로 후에 마커 유전자를 제거하는 처리 방법을 수행할 수 있다.

형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물의 재생산은, 공지된 영양 배지를 이용하여 통상적인 재생산 방법에 따라 수행된다. 이러한 방법으로 수득된 식물은, 발현이 본 발명에 따른 프로모터에 의해 조절되는 도입된 핵산 서열의 존재 및 조직 특이성, 또는 상기 핵산 서열에 의해 영향받는 내인성 RNA 및 단백질을 위한 PCR, 블럿 분석과 같은 분자생물학적 방법을 포함하는 통상적인 방법에 의해 연구될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터 영역에 의해 조절되는 핵산 서열을 함유하고, 상기 핵산 서열을 표피-특이적으로 발현하는 형질전환 식물에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 식물은 단자엽 식물, 특히 호밀, 옥수수 및 귀리와 같은 곡류 식물, 특히 바람직하게는 밀 또는 보리, 뿐만 아니라 원형질체, 식물 세포, 캘러스(callus), 씨, 덩이줄기(tubers) 또는 자른 가지와 같은 상기 식물의 형질전환 부분 및 이들의 형질전환 전달 물질, 뿐만 아니라 상기 식물의 형질전환 산물이다. 그러나, 본 발명에 따른 프로모터 영역는, 형질전환 유전자의 표피-특이적 발현을 갖는 유사한 식물을 생산하기 위해, 풀(feed grasses)과 같은 다른 벼과(sweet grasses)에 사용될 수 있다.

에피큐티클층 왁스(epicuticular wax)의 생산을 위한 유전자는 또한 식물의 가뭄 저항성을 증가시키기 위해 본 발명에 따른 표피-특이적 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다. 또한, 안토시아닌(anthocyanin ) 또는 UV-저항성을 증가시키기 위한 다른 UV-흡수 물질의 생산을 위한 유전자는 또한 본 발명에 따른 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다. 상기에 이미 언급한 바와 같이, 병원체 저항성 유전자가 바람직하게는 본 발명에 따른 프로모터의 제어 하에서 발현된다.

식물을 감염시키고 이에 따라 식물의 대사에 부정적으로 영향을 미치는 박테리아, 바이러스 및 균류는, 특히 식물 병원체로서 언급된다.

이러한 식물 병원체 중에서도 특히 균은, 밀과 보리와 같은 곡류 식물의 흰가루병 및 줄기 파열을 유발한다. 감염 정도에 따라, 이러한 질병은 상당한 수율 손실(50% 까지)을 유발할 수 있다.

전통적으로, 상기 언급된 추가적인 식물 진균병은, 지하수로의 삼투와 먹이사슬 내 축적과 같은 알려진 단점을 가진 살균제에 의해 제어된다.

그러나, 지난 몇 년간, 특정한 약제 또는 몇몇 약제에 대한 저항성을 매개할 수 있는 몇몇 유전자들이 확인되었다. 본문에서 사용된 "병원체 저항성의 매개"는, 상기 유전자의 발현이 증가된 식물이 상기 유전자의 발현이 정상인 식물과 비교하여 특이 병원체로 감염되기 어려움을 의미한다. 병원체 저항성을 매개하는 유전자는 병원체로의 감염에 의해 이의 발현이 활성화되는 유전자들이다.

이러한 유전자들은 과산화수소 및 옥살레이트 산화효소(oxalate oxidase)이다. 저민-유사 단백질(germin-like protein) 과에 속하는 옥살레이트 산화효소는, 옥살레이트의 산화를 촉진시키고, 이에 따라 과산화수소(hydrogen peroxide)가 형성된다. 과산화수소는 살균제로 역할을 하며, 세포 벽의 리그닌화를 향상시킬 수 있어, 이에 따라 해충의 침입이 예방된다. 또한, 낮은 농도에서 과민성 세포사를 유발할 수 있다. 과산화효소는 산화하고 이에 따라 세포 기질을 해독하기 위해 분자 산소 또는 과산화수소 모두를 사용한다.

식물의 표피 내에서 옥살레이트 산화효소 및 과산화수소의 발현에 대한 저항성을 매개할 수 있는 병원체는, 예를 들면 흰곰팡이(mildew), 푸사리움 종(fusarium spp.), 린코스포리움 세칼리스(rynchosporium secalis) 및 파이레노포라 테레스(pyrenophora teres)를 포함한다. 병원체에 대한 저항성을 매개할 수 있는 다른 유전자들은, 키티네이즈(chitinases), Ag-AFP, GSTA1 및 WIR1a이다.

본 발명에 따른 프로모터 영역의 도움으로 형질전환 식물의 표피 내에서 상기 효소를 암호화하는 핵산 서열을 발현함으로써, 증가된 병원체 저항성을 갖는 식물을 얻을 수 있다.

병원체 저항성을 매개하는 유전자와는 대조적으로, 병원체의 침입을 촉진하는 식물-고유 유전자도 존재한다. 이들 중 Mlo 유전자가 있는데, 상기 유전자는 표피 내로 흰곰팡이 균의 침입을 촉진한다고 생각되는 7개의 막 수용체(transmembrane receptor)를 암호화한다. 이러한 경우, 식물로의 균 침입을 예방하기 위해서는 Mlo 유전자의 발현을 차단하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 이것은 상기 기재된 RNAi 방법의 보조로 수행될 수 있다. Mlo 유전자의 발현 차단이 식물내 흰곰팡이 균의 침입을 예방하는데 바람직하다는 사실은, Mlo-dsRNA로 코팅된 텅스텐 입자로 충격이 가해진 보리의 잎 단편 내의 생체외(in vitro) 실험으로 밝혀졌다(Schweizer et al. (2000), Double-stranded RNA interferes with gene function at the single-cell level in cereals, The Plant Journal, 24(6), S. 895-903). 그러나, 지금까지 형질전환 식물내에서 Mlo 발현으로의 표피-특이적 차단이 동일한 효과를 나타냄은 밝혀지지 않았다.

또한, 병원체와 식물의 상호작용을 매개하고 이에 따라 식물 내로의 병원체 침입을 촉진할 수 있는 식물 유전자는, 예를 들면 아미노산 또는 당 운반체(sugar transporter) 또는 인버테이즈(invertase)가 있다. 상기 유전자들은 또한 유전자 무발현을 위한 목표로 적합하다. 따라서, 본 발명은 병원체-저항성 식물을 생산하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 재조합 핵산 분자를 생성하는 단계 - 여기서 본 발명에 따른 프로모터는 병원체 저항성을 매개하는 핵산 서열과 작동 결합 내에 존재한다 - ;

b) a)로부터의 재조합 핵산 분자를 식물 세포에 전달하는 단계; 및

c) 전체적으로 형질변환된 식물을 재생하는, 원한다면 상기 식물을 증식시키는 단계.

바람직하게는 상기 핵산 서열 매개의 병원체 저항성은, 내인성의 Mlo-RNA를 손상시키는 산화효소 또는 옥살레이트 산화효소 유전자나 서열의 암호화 영역이다.

이하의 실시예는 본 발명의 예시적인 설명으로서, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 GSTA1 프로모터의 핵산 서열(서열번호　1)이다.

도 2는 WIR1a 인트론의 핵산 서열(서열번호　2)이다.

도 3은 선호되는 프로모터 영역의 핵산 서열(서열번호　3)이다.

도 4는 TAPERO(과산화효소) cDNA의 핵산 서열(서열번호 4)이다.

도 5는 TAPERO 발현 벡터 pPS41이다.

a) 핵산 서열(서열번호 5)

b) 벡터 지도(vector map)

도 6은 저민 9f-2.8(옥살레이트 산화효소) cDNA의 핵산 서열(서열번호　6)이다.

도 7은 저민 발현 벡터 pPS24이다.

a) 핵산 서열(서열번호　7)

b) 벡터 지도

도 8은 Mlo-RNAi 컨스트럭트의 서열(서열번호　8)이다.

도 9는 Mlo-RNAi 발현 벡터 pWIR5-TaMlo RNAi이다.

a) 핵산 서열(서열번호　9)

b) 벡터 지도

도 10은 pPS24 형질전환 식물에서 인-시튜의 옥살레이트 산화효소 활성에 관한 현미경 사진이다.

밥화이트(Bobwhite) 야생형 식물(BW)과 형질전환 라인 157번 및 170번으로부터의 잎을 크로스 컷하여 그 자리에서 옥살레이트 산화효소 활성을 측정하였다.

왼쪽 컬럼 = 옥살레이트 기질과 반응 ; 오른쪽 컬럼 = 옥살레이트 기질이 없는 대조 반응. 강한 보라색은 형질전환 라인 표피에서의 옥살레이트 산화효소 활성을 나타낸다.

도 11은 pPS41 형질전환 식물에서 TAPERO 형질전환 유전자 검출 사진이다.

a) 노던 블럿으로

WIR3 샘플을 pPS41 컨스트럭트를 갖는 T2 세대(T2 generation)의 형질전환 밀 라인으로부터의 노던 블럿과 혼성화함으로써 TAPERO RNA 집적을 검출하였다. 각각의 경우에, 4개의 선별된 라인과 야생형(BW)의 합 중 2개의 서브 라인은 성체 식물 단계(adult plant stage)에서 분석되었다. 잎 1 = 지엽(flag leaf). 잎　2 내지 4 = 점점 더 성숙. TaGer-4 프로브(probe)는 스트레스-유도 밀 유전자와 혼성화 하여 TAPERO 과발현의 다면발현(pleiotropic) 부작용을 시험하는데에 사용된다. 어떠한 중요한 부작용도 발견되지 않았다. EtBr = 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색된 겔의 로딩 컨트롤.

b) 웨스턴 블럿으로

항체를 pPS41 컨스트럭트를 갖는 T2 세대(T2 generation)의 형질전환 밀 라인의 웨스턴 블럿에 반응시킴으로써 TAPERO 단백질 집적을 검출. TAPERO 형질전환 산물은 31　kD의 크기를 갖는 것으로 예상되어 왔다. 밥화이트의 잎 3에서 TAPERO 유전자의 증가된 기초 활성이 관찰되었다. 잎 1 = 지엽. 쿠마시 염색(Coomassie stain) = 쿠마시 블루 R　250으로 염색된 겔의 로딩 컨트롤.

도 12는 표피-특이적인 형질전환 발현의 검출에 관한 사진 및 도표이다.

A) 노던 블럿 분석을 이용

특정 프로브를 이용하여 pPS24 또는 pPS41 컨스트럭트를 가지는 형질전환 식물의 잎 표피에서 옥살레이트 산화효소(왼쪽) 및 TaPERO(오른쪽) mRNA의 집적을 검출. W = 전체 잎의 RNA. E = 잎 표피의 RNA. EtBr = 로딩 컨트롤로서 에티디움 브로마이드로 염색된 겔; 26S RNA = 로딩 컨트롤로서 26S ribosomal RNA에 대한 프로브와 상기 블럿의 연이은 혼성화.

B) 실시간 역 PCR 분석을 이용

형질전환 라인 2013번(컨스트럭트 pPS41으로 형질전환된)의 잎과 표피 전체에서의 TaPERO mRNA 농도가 결정되었다. 상기 데이터는 구조적으로 발현된 대조 유전자 UBC(유비퀴틴-접합 효소) 및 GAPDH(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)에 의해 표준화되었다. 잎 전체에 아직 남아있는 발현은 제거되지 않은 상부 잎 표피와 체관부에서 나온 것이다(상기 프로모터의 부활성(side activity )).

C) 실시간 역 PCR 분석을 이용

야생형(밥화이트) 및 형질전환 라인 2013번과 2151번(컨스트럭트 pPS41으로 형질전환된)가 성체 식물 단계에서 분석되었다. 상기 프로모터는 특히 잎과 이삭에서 강하게 발현된다. 줄기와 뿌리에서는, 형질전환 유전자가 전혀 발현되지 않거나 매우 약하게 발현된다.

도 13은 pPS41 형질전환 식물의 흰가루병 저항성(mildew resistance) 시험에 관한 도표이다.

성체식물의 지엽을 잘라내어 밥화이트 야생형 식물과 함께 분리된 잎 검정으로 밀 흰가루병을 접종하였다. 접종 후 7일 후에, 흰가루병 감염을 평가하였다. T2 및 T3 세대의 식물을 가지는 3개의 독립된 시험구로부터 평균값을 나타내었다. 서브 라인 2088/2는 어떠한 TAPERO도 발현하지 않고, 저항성이 증가되지 않았다. "non-silenced" 평균값 = 2088/2를 제외한 모든 라인과 모든 시험의 평균값.

도 14는 pPS41 형질전환 식물의 발아 생장(Shoot growth) 사진이다.

T2 세대의 식물을 밥화이트 야생형 식물과 함께 심어서 성체 식물 단계에서 촬영하였다.

도 16은 pWIR5-TaMlo-RNAi 형질전환 식물의 흰가루병 저항성 시험에 관한 도표이다.

T2 세대의 성체 식물 지엽을 잘라내어 밥화이트 야생형 식물과 함께 분리된 잎 검정으로 밀 흰가루병을 접종하였다. 접종 후 7일 후에, 흰가루병 감염을 평가하였다. 각 경우에 라인당 두 개의 서브 라인을 검사하였다.

이하의 실시예에서, E.　 coli 형질전환(transformation), 제한효소 처리(restriction digestion), 라이게이션(ligation), DNA 추출(DNA extraction), PCR과 같은 분자생물학적인 기초 방법은 Sambrook 등(2001)(위를 참조)에 따라 행해진다. 모든 PCR 반응에서, 교정 Pwo 중합효소(proofreading Pwo polymerase)(Roche)가 사용되었다.

[실시예 1] GSTA1 프로모터와 WIR1a 인트론으로부터 프로모터 컨스트럭트의 생성(pPS18)

생성은 다음의 전구체(precursor) 컨스트럭트(construct): pPS1, pPS3, pPS15를 통하여 여러 단계로 수행된다. 모든 컨스트럭트가 GUS 리포터 유전자를 함유하고 있어서, 일시적 측정법(transient assay)으로 직접 평가할 수 있었다.

pPS1:

WIR1a 유전자의 1.9　kb 프로모터 단편을 PstI으로 재조합 pBluescript 클론으로부터 절단하여, GUS 유전자 앞의 발현 카세트(expression cassette)의 PstI 제한 위치(restriction site)에 클로닝하였다. 상기 발현 카세트는 pBluescript에 기초하며, GSTA1 유전자의 전사 터미네이터에 이웃한 GUS 유전자를 포함하였다. GUS 유전자와 GSTA1 전사 터미네이터는 사용된 최종 컨스트럭트(실시예 2 참조)에는 더 이상 함유되어 있지 않기 때문에, 이 발현 카세트의 상세한 설명은 생략한다. 상기 결과 컨스트럭트는 번역의 WIR1a::GUS 융합을 포함한다.

pPS3:

어댑터 프라이머(adaptor primer) 5' ATA TAT CGT CAG GGA GCC ACG GCC GTC CAC 및 5' TAT CCC GGG CCC GTG CCT GGA GAA를 가진 약 240 bp의 PCR 단편을 생성하여 이것의 끝을 SmaI과 PstI로 절단하였다(어댑터를 통하여). 게놈 WIR1a 클론이 PCR 주형(template)으로 제공되었다. 상기 PCR 단편은 WIR1a의 첫 번째 엑손과 스플라이스 사이트 수용체(splice site acceptor)를 포함하는 인트론의 최종 15개의 아미노산을 함유하며, pPS1로 연결되고, PstI(부분적으로)와 SmaI로 절단되며, 아가로오즈 겔 전기영동을 통하여 정제되었다. 수득된 컨스트럭트는 GUS 유전자 앞의 WIR1 인트론을 가진 번역의 WIR1a::GUS 융합을 함유하였다. 또한, WIR1a::GUS 융합 단백질의 분비를 방지하기 위하여 WIR1a의 첫 번째 엑손의 아미노산 18번 내지 35번을 결실(deletion)되도록 하였다(시그널 펩타이드를 제거함으로써).

pPS15:

WIR1a 프로모터를 GSTA1 프로모터의 PCR 단편으로 대체하였다. 이 말단의 pPS3이 XhoI과 SnaBI로 (부분적으로) 분해되고, 벡터 밴드는 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제되었다. 약 2.3　kb 길이의 GSTA1 프로모터 단편은 게놈의 GSTA1 클론으로부터 어댑터 프라이머(adaptor primer) 5' ATA TAT CTC GAG TCT AGA ACT AGT GGA TCC 및 5' ATA TAT TAC GTA GTT TGT CCG TGA ACT TCA를 가진 PCR을 통하여 증폭되고, XhoI 및 SnaBI로 말단이 절단되었다. 상기 PCR 단편은 겔-용출된 pPS3 밴드로 연결되고, 그 결과 GSTA1 프로모터의 제어 하에서 인트론-함유 단편과 GUS를 번역 융합(translational fusion)한다.

pPS18:

pPS15는 PstI과 SnaBI으로 (부분적으로) 분해되었고, 상기 벡터 밴드는 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제되었으며, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드(5' GTA CAC AGG CAG CTA GCT CTC GAA ACC TCG CTC GAA ACG CA와 5' CAT GTG TCC GTC GAT CGA GAG CTT TGG AGC GAG CTT TGC GT)와 연결되었다. 이것은 번역 개시 코돈인 ATG 없이 WIR1a 유전자의 5'UTR의 42 bp를 가진 번역 개시(번역 개시의 46　bp 상류 내지 53　bp 하류) 주변에 위치한 WIR1a 유전자 부분을 대체하였다. 상기의 수득된 컨스트럭트는 GSTA1 프로모터의 제어 하에서 WIR1a 유전자 단편을 함유한 인트론의 GUS와의 전사 융합(transcriptional fusion)을 함유한다.

[실시예 2] 사용된 컨스트럭트의 생성

a) 발현 벡터 pPS24(본 발명에 따른 프로모터의 제어 하에서의 옥살레이트 산화효소 발현)

전체 오픈리딩프레임(ORF)을 함유하는 밀 gf-2.8 유전자(옥살레이트 산화효소; Acc. No. M63223)의 745　bp 길이의 HindIII/SphI 단편이, 결과적으로 컨스트럭트 pGermin(Schweizer 등(1999)에 기재됨)으로 되는 식물 발현 카세트 pGY1로 서브 클로닝되었다. 이 클로닝 때문에, 옥살레이트 산화효소 단편은 pGY1에서 제한자리 BamHI 및 PstI를 통하여 상기 단편을 연결할 수 있도록 하기 위하여 중간 벡터로 연결된다.

옥살레이트 산화효소 유전자와 CamV 35S 터미네이터를 함유한 약 1　kb 길이의 SmaI/EcoRI 단편인, pGermin으로부터, SmaI/EcoRI-절단된 벡터 pPS18로 연결되고, 아가로오즈 겔 전기영동에 의하여 정제된다. 상기 수득된 컨스트럭트는 GSTA1 프로모터의 제어 하에서 인트론-함유하는 WIR1a 유전자 단편과 옥살레이트 산화효소의 전사 융합을 포함하였다. pPS18과 비교하여, 상기 컨스트럭트는 GSTA1 전사 터미네이터를 더 이상 함유하지 않고, CamV 35S 유전자의 전사 터미네이터를 포함하였다.

b) 발현 벡터 pPS41(본 발명에 따른 프로모터의 제어 하에서 TAPERO의 발현)

pWIR3(CamV 35S 프로모터와 TAPERO의 전사 융합을 함유; Schweizer 등(1999))으로부터, 약 1.2　kb 길이의 TAPERO 단편이 SmaI and PstI를 이용한 제한효소 처리를 통하여 분리되었다.

TAPERO 단편은 SmaI 및 PstI로 (부분적으로) 분해된 벡터 pPS24로 연결되며, 아가로오즈 겔 전기영동을 통하여 정제되었다. 이것은 GstA1 프로모터의 제어 하에서 인트론-함유 WIR1a 유전자 단편과 TAPERO 유전자(Acc. No. X56011)의 전사 융합을 초래하며, 여기에서 옥살레이트 산화효소 유전자는 TAPERO 유전자로 치환되었다. pPS24와 같이, pPS41도 CamV 35S 유전자의 전사 터미네이터를 함유한다.

c) 발현 벡터 pWIR5-TaMlo-RNAi(본 발명에 따른 프로모터의 제어 하에서 Mlo-RNAi 컨스트럭트의 발현)

첫째, 보리의 Mla1 저항성 유전자의 세 번째 인트론은 벡터 pGEM Teasy로 서브 클로닝되었고, EcoRI 및 PstI을 이용하여 분리되었으며, EcoRI- 및 PstI-절단된 벡터 pBSw41(부분적인 TaMlo1 cDNA에서 유래한 pBluescript, 그녀의 논문 범위 내에서 Candace Elliott에 의해 클로닝 됨; GenBank accession No. AF361933)로 연결되었다.

이 컨스트럭트로부터, TaMlo1 유전자의 코딩 서열의 부분을 함께 가지는 Mla1 인트론은 약 1.55　kb PstI/MscI 단편(=　단편　1)으로서 분리되었다. 이와 유사하게, 약 450 bp의 단편이 올리고뉴클레오티드 T3(pBluescript의 기본적인 시퀀 싱 프라이머) 및 TaMlo1-1(5' GTC GCA TGC CTG TCC ACA CGA AAT GTG C 3', SphI, 밑줄친 부분은 제한자리임)를 가진 플라스미드 pBSw41로부터 PCR을 통하여 증폭되었다. 결과적으로, 상기 PCR 단편은 제한효소 PstI 및 SphI에 의하여 분해되었다(=　단편　2). 상기 벡터 pPS24(프로모터 + 옥살레이트 산화효소, 상기 참조)는 SmaI와 SphI, 및 절단된 옥살레이트 산화효소 유전자로 제한효소 처리되었고, 폐기되었다. 그 결과, 상기한 단편 1과 단편 2는 maI/SphI-절단된 벡터 pPS24로 삼요소 라이게이션(three-component ligation)되었다. 이 라이게이션에서, MscI 및 SmaI-절단된 요소의 말단은 양립가능하며, 따라서 이들은 평활 말단(blunt ends)이라고도 부른다. 상기 수득된 컨스트럭트(pTaMlo1 RNAi)는 약 300　bp의 TaMlo1 뿐만 아니라 Mla1 인트론에 의해 분리된 "역반복 구조(inverted repeats)"로서 150　bp 폴리링커/어댑터를 함유한다. 이 전사 단위의 제어는 GSTA1 프로모터가 담당한다.

주석: 역사적 이유로 본 명세서에 TaMlo1으로 언급된 유전자는 이후 TaMloA1라 불리운다(Elliott 등, 2002). Mol. Plant Microbe Interact. 15: 1069-1077 (2002).

[실시예 3] 밀 식물의 형질전환

밀(cv. 밥화이트)을 단일 조건(10　h/d, 약 600　μE)에서 낮 동안에는 15℃ 및 밤 동안에는 12℃에서 40일 동안 파이토챔버(phytochamber)에서, 이어서 적어도 6시간 동안 18/16℃ 온실 및 명기(photoperiod)에서 키웠다. 이삭은 즉시 이용되 거나, 4℃에서 5일까지 저장된다. 이삭으로부터 얻은 영과(caryopses)를 70% 에탄올로 2분 동안, 이어서 5%　차아염소산 나트륨(sodium hypochlorite) 용액/ 0.1% Tween　20에서 15 내지 20분 동안 표면 살균한 다음, 최종적으로 멸균 액체 비데스트(sterile aqua bidest)로 세척하였다.

0.5 내지 1.5　mm 크기의 미발달 배아는 멸균 상태에서 영과로부터 준비되고, 상층부에 그들의 배반을 가지는 페트리 접시에서 캘러스 유도 배지(callus-inducing medium)(Murashige Skoog (1962)에 따른 2　mg/l 2,4-D, 40　g 말토오스 모노하이드레이트(maltose monohydrate), 500　mg/l L-글루타민, 100　mg/l 카제인 하이드롤리세이트(casein hydrolysate), 5 μM CuSO₄ 및 0.25% 피타겔(phytagel)을 가진 기본 배지) 위에 놓여 진다. 배양은 25℃의 어두운 곳에서 행해진다.

바이오리스틱 형질전환(biolistic transformation)은 배아를 분리하고 난 다음 5 내지 7일 후에 행해진다. 유전자총 이용법(particle bombardment)에 앞선 4 내지 6시간 전에, 이미 증식하는 배아를 환원된(상기와 같이 0.3　M 만니톨로 보충된) 새로운 배지로 옮기고 25℃의 어두운 곳에서 배양하였다.

bar-유전자를 코딩하는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼레이즈( phosphinothricin acetyltransferase)를 함유하는 플라스미드 pAHC20(Christensen 및 Quail 1996)를 이와 함께 형질전환되는 벡터와 1:1의 몰비로 혼합하였다. 그런 다음, 10　㎕ 플라스미드 DNA 용액이 60　mg/l 금 현탁액의 25㎕의 입자로 침전되었다. 하나의 충격(bombardment)에서, 5　㎕ 에탄올에서 30㎍ 입자가 미세 운반 체(micro carrier)로 사용된다. 충격은 DuPont PDS-1000/He의 제조 설명에 따라서 수행된다.

입자 충격 후 12 내지 16시간이 지난 다음에, 상기 이식체(explant)를 새로운 캘러스-유도 배지로 옮기고(배아의 전배양(pre-culture)을 위한 것 같음), 25℃의 어두운 곳에서 10일 동안 배양하였다.

그 후, 캘러스는 다른 배지(20　g/l 수크로오스, 5　μM CuSO₄, 0.25%　파타겔 및 3　mg/l 비아라포스(bialaphos)를 포함하는 Murashige 및 Skoog (1962)에 따른 기본 배지)로 옮겨지고, 200 μE 및 25℃에서 16시간의 광주기(photoperiod)로 배양되었다.

2주 후에, 그을리지 않은 캘러스들을 재생 배지 (20　g/l 수크로오스, 0.25% 피타겔 및 4　mg/l 비아라포스를 포함하는 Murashige 및 Skoog (1962)에 따른 기본 배지)로 이동시키고 200 μE 및 25℃에서 16시간의 광주기로 더 배양시켰다.

또다시 2주 후에, 자란 싹을 솎아내고, 재생 배지를 함유하는 배양 튜브로 옮긴 다음, 200 μE 및 25℃에서 16시간의 광주기로 더 배양시켰다.

형질전환 재생물의 확인은 Spencer 등 (1990)에 따른 잎 추출물의 PAT 활성 시험에 의하거나 후보 식물(candidate plants)의 게놈 DNA로부터 형질전환 유전자-특이적 서열을 증폭시키거나 및/또는 대응되는 프로브를 이용하는 서던 블럿을 통하여 이루어진다.

기본 물질의 양에 따라, 상기 방법의 형질변환 효율은 배양된 배아 100 당 0.5 내지 3의 형질전환 식물에 달하였다.

[실시예 4] pPS24 컨스트럭트를 가지는 식물의 인-시튜의 옥살레이트 산화효소 활성

밥화이트 야생형 식물 또는 T3 세대의 pPS24 형질전환 밀 식물의 잎 조각을 옥살레이트 산화효소 검출 용액(2.5　mM 옥살산, 3.5　mM 유리 EDTA, 0.6　mg/ml 4-클로로-1-나프톨, 양고추냉이(horseradish)로부터의 50　㎍/ml 과산화효소, 20%　v/v　에탄올, Tris 염기로 pH　4.0로 조정됨)으로 채워진 베큠(vacuum)에 스며들게 하고, +37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 검출 용액을 제거한 다음, 상기 잎을 물에서 +4℃ 24시간 동안 더 배양하였다. 그 후에, 상기 잎을 손으로 잘라 얇은 조각으로 만들어 현미경으로 관찰하였다. 위상차 광학 현미경(Phase contrast light microscopy)은 Zeiss Axiophot로 100 배 배율에서 수행하였다. 옥살레이트 산화효소를 발현하는 세포는 보라색으로 염색된 세포벽을 가진다.

[실시예 5] 노던 블럿 분석을 통한 pPS41 형질전환 식물에서의 TAPERO 형질전환 유전자 검출

지엽 상태의 밥화이트 식물 및 T2 세대(각 경우의 생체중은 약 1g)의 pPS41 형질전환 식물의 잎을 미세한 분말이 형성될 때까지 액체 질소에서 균질화시켰다. 상기 분말을 RNA 추출 버퍼(RNA extraction buffer)(0.5　M Tris　Cl pH　8.0; 0.25　M Na-EDTA; 5%　(w/v)　SDS) 및 1.5　ml 버퍼 포화된 페놀(buffer-saturated phenol)(15　ml 플라스틱 튜브)에 가하고 잘 흔들어 주었다. 상기 추출물을 4000 내지 5000　rpm, 20℃에서 30분 동안 원심분리하였다(swing out, Heraeus Varifuge). 1.5 ml 클로로포름을 가하고(상층액을 없애지 않고) 상기 튜브를 여러번 뒤집어 주었다. 상기 추출물을 4000 내지 5000　rpm, 20℃에서 30분 동안 다시 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 새로운 튜브(15　ml 플라스틱 튜브)에 부었다. 상기 RNA는 6　M LiCl을 3　ml 가하면 침전된다(overnight, 4℃). 상기 침전된 RNA를 12,500　rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리 하고(고정된 로터(fixed rotor), Hermle Z360K), 상기 RNA 펠릿(pellets)을 70% 에탄올 500 내지 1000 ㎕에 넣고(RNA가 용해되지 않음) 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)로 옮겼다. 상기 샘플을 14,000　rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여(고정된 로터, Eppendorf Centrifuge 5417R), 그 상층액을 제거하였다. 상기 RNA 펠릿을 37℃에서 5분 동안 건조시키고, 100　내지 200 ㎕의 TE에 두고, 75℃에서 5 내지 10분 동안 용해시켰다. 포름알데히드-함유 겔에서 RNA의 변성 아가로오스 겔 전기영동 및 나일론 막(Hybond N, Amersham)으로의 이동은 기본적인 처리방법(Sambrook 등, 위를 참조)에 따라 수행되었다. 샘플마다 10 ㎍ RNA가 적용되었다.

³²P-dCTP로 표지된 방사성 프로브는 키트(Roche)를 이용한 랜텀 프라임 표지법에 따라 행해졌다. 혼성화는 처치 버퍼(CHURCH buffer)(0.5 M Na　포스페이트 pH 7.2; 1　% (w/v) BSA; 7　% (w/v) SDS; 1　mM Na₂ETDA)에서 65℃로 하루밤 동안 행해졌다. 얼룩은 65℃ 세정용액(0.1　x　SSC; 0.1　5 (w/v) SDS)에서 15분 동안 두 번 세 정하였고, 이어서 포스포리메이저 스크린(phosphorimager screens)에 16 내지 48시간 노출시켰다. 노출된 스크린은 포스포리메이저 장치를 통하여 검사되어(후지필름 FLA 3000) TIFF 형식의 이미지 파일로 전해졌다.

[실시예 6] 웨스턴 블럿을 통한 pPS41 형질전환 식물에서의 TAPERO 형질전환 유전자 검출

지엽 상태의 밥화이트 식물 및 T2 세대의 pPS41 형질전환 식물의 잎 말단을 IWF 버퍼(32　mM Na-포스페이트; 84　mM 시트레이트; pH　2.8; 스파툴라 팁 폴리비닐폴리피롤리돈(spatula tip polyvinylpolypyrrolidone))에서 균질화시켰다. 상기 균질물℃을 13,000 rpm 및 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층액은 0.5　g/ml 암모늄 아세테이트와 혼합되고, 산에 용해되는 단백질은 4℃에서 하루밤 동안 침전시켰다.

상기 단백질을 13,000　rpm 및 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 상기 단백질 펠릿을 FG 리서스펜젼 버퍼(50　mM Tris-Cl pH　7.5; 20% (v/v) 글리세롤) 50　㎕/g에 두었다. 5 ㎕ 4배 농축된 SDS 샘플 버퍼를 20 ㎕ 샘플에 가하고, 상기 샘플을 (1~5　㎕) 포화된 Tris 용액과 브롬페놀의 색이 푸르게 될 때까지 혼합하였다. 12.5 ㎕ 끓인 샘플은 각 레인에서 Bio-Rad의 미니-겔 장치를 이용하는 기본적인 방법에 따라 변성 SDS　폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(15% 분리 겔)으로 분리된다.

전기영동 후에, 상기 겔은 쿠마시-염색(로딩 컨트롤로서)되거나, 기본적인 방법에 따라 니트로셀룰로오스 막(얼룩진)으로 옮겨진다. 기본적인 방법에 따라, 상기 막은 첫 번째 다클론성 항체(polyclonal antibody)(1:2000 희석)인 보리의 Prx8 단백질에서 유도된 항체(TAPERO와 유사한 단백질)로 접종되고, 이어서 두 번째 항체(1:20000 희석)인 토끼 항체에서 유도되고 알칼린 포스파테이즈가 결합된 항체로 접종된다. 상기 TAPERO 단백질 밴드는 국부적인 알칼린 포스파테이즈 활성(BCIP/NBT staining solutions; prefabricated tablets (Roche))에 의해 검출된다.

[실시예 7] 노던 블럿 및 실시간 PCR 분석을 통한 표피-특이적인 형질전환 발현의 검출

RNA 추출 및 노던 블럿 분석은 실시예 5에서와 같이 수행되었다. 실시간 PCR 분석은 LightCycler^® 장치(Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 수행되었다.

[실시예 8] pPS41 또는 pWIR5-TaMlo-RNAiMildew 형질전환 식물의 흰가루병 저항성

저항성 시험을 위하여, 성체 pPS41 또는 pWIR5-TaMlo-RNAi 형질전환 식물을 사용하였는데, 이들 식물은 온실에서 자란것으로서 지엽이 신선하게 발달되어 있었다. 동시에 자란 야생형 식물 cv. 밥화이트가 대조군 역할을 하였다. 상기 지엽의 위쪽 반을 잘라서 20　x　20　cm의 큰 폴리카보네이트 접시에서 0.5% (w/v) 20　ppm 벤즈이미다졸과 혼합된 피토아가(phytoagar) 위에 펼쳤다. 하나의 형질전환 서브 라인(각 20 잎)과 밥화이트 야생형(각 6 잎)을 각 접시에 펼쳤다. 접종 배지에서 4개의 강하게 접종된 밀 잎을 탑(tower)으로 불어서 상기 잎 조각을 흰가루병 배종으로 접종하였다. 5분 후에, 상기 접시는 제거되고, 봉합되어, 직사광선에서 20℃에서 접종되었다. 접종 7일 후에, 종류 평가 시스템(class evaluation system)(Schweizer 등, 1995)을 사용하여 흰가루병 감염을 평가하였다. 저항성은 각각의 대응하는 피토아가 플레이트(phytoagar plate)에 위치한 대조군 잎을 참고하여 측정되었다.

문헌:

Christensen 및 Quail (1996) Transgenic Res. 5: 213-218.

Elliott 등, (2002). Molecular Plant Microbe Interactions 15: 1069-1077.

Murashige 및 Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15: 473-497.

Schweizer, P., Valleian-Bindschedler, L., and Moinger, E. (1995). Heat-induced resistance in barley to the powdery mildew fungus Erysiphe graminis f.sp. hordei, Physiological and Molecular Plant Pathology 47, 51-66.

Schweizer, P., Pokorny, J., Abderhalden, O., 및 Dudler, R. (1999). A transient assay system for the functional assessment of defense-related genes in wheat, Mol Plant-Microbe Interact 12, 647-654.

Spencer 등. (1990) TAG 79: 625-631.

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<210> 6 <211> 746 <212> DNA <213> Triticum sp. <400> 6 agcttattac atagcaagca tggggtactc caaaacccta gtagctggcc tgttcgcaat 60 gctgttacta gctccggccg tcttggccac cgacccagac cctctccagg acttctgtgt 120 cgccgacctc gacggcaagg cggtctcggt gaacgggcac acgtgcaagc ccatgtcgga 180 ggccggcgac gacttcctct tctcgtccaa gttggccaag gccggcaaca cgtccacccc 240 gaacggctcc gccgtgacgg agctcgacgt ggccgagtgg cccggtacca acacgctggg 300 tgtgtccatg aaccgcgtgg actttgctcc cggaggcacc aacccaccac acatccaccc 360 gcgtgccacc gagatcggca tcgtgatgaa aggtgagctt ctcgtgggaa tccttggcag 420 cctcgactcc gggaacaagc tctactcgag ggtggtgcgc gccggagaga cgttcctcat 480 cccacggggc ctcatgcact tccagttcaa cgtcggtaag accgaggcct ccatggtcgt 540 ctccttcaac agccagaacc ccggcattgt cttcgtgccc ctcacgctct tcggctccaa 600 cccgcccatc ccaacgccgg tgctcaccaa ggcactccgg gtggaggcca gggtcgtgga 660 acttctcaag tccaagtttg ccgctgggtt ttaatttcta ggagccttcc ctgaaatgat 720 aattatataa ttccatatat gcatgc 746 <210> 7 <211> 6452 <212> DNA <213> Triticum sp. <400> 7 ctaaattgta 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ggcaaggcgg tctcggtgaa cgggcacacg 3420 tgcaagccca tgtcggaggc cggcgacgac ttcctcttct cgtccaagtt ggccaaggcc 3480 ggcaacacgt ccaccccgaa cggctccgcc gtgacggagc tcgacgtggc cgagtggccc 3540 ggtaccaaca cgctgggtgt gtccatgaac cgcgtggact ttgctcccgg aggcaccaac 3600 ccaccacaca tccacccgcg tgccaccgag atcggcatcg tgatgaaagg tgagcttctc 3660 gtgggaatcc ttggcagcct cgactccggg aacaagctct actcgagggt ggtgcgcgcc 3720 ggagagacgt tcctcatccc acggggcctc atgcacttcc agttcaacgt cggtaagacc 3780 gaggcctcca tggtcgtctc cttcaacagc cagaaccccg gcattgtctt cgtgcccctc 3840 acgctcttcg gctccaaccc gcccatccca acgccggtgc tcaccaaggc actccgggtg 3900 gaggccaggg tcgtggaact tctcaagtcc aagtttgccg ctgggtttta atttctagga 3960 gccttccctg aaatgataat tatataattc catatatgca tgcctgcagg catgcccgct 4020 gaaatcacca gtctctctct acaaatctat ctctctctat aataatgtgt gagtagttcc 4080 cagataaggg aattagggtt cttatagggt ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc 4140 cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac 4200 caaaatccag gggtaccgag ctcgaattct agtctacgcg gccgcgagct ccagcttttg 4260 ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 4320 gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 4380 agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 4440 tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 4500 aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 4560 cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 4620 atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 4680 taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 4740 aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 4800 tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 4860 gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 4920 cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 4980 cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 5040 atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 5100 tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 5160 ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 5220 acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 5280 aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 5340 aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 5400 tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 5460 cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 5520 catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 5580 ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 5640 aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 5700 ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 5760 caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 5820 attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 5880 agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 5940 actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 6000 ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 6060 ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 6120 gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 6180 atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 6240 cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 6300 gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 6360 gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 6420 ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 6452 <210> 8 <211> 1939 <212> DNA <213> Triticum sp. <400> 8 ccactgtcca cacgaaatgt gccatctgaa acgcgttctg gaacagcgtc aggtgtatga 60 agaagaggac ccagtcgggg cggtggaacc agaagaactt gttgctgggc tcgaccacgg 120 gtgccccctt gatgacgctc gaccggtcct ggatctccag ggccatctcc atgatgatca 180 tctctagctt ggttccaaca cacaagagga tgatgagagg gatgaaagaa acccaggtga 240 gtgtgccgat cccgtcgata tcaaggaaga gggtgaggat cgccacagcc cacagcggga 300 ggctgcgaaa agaggccaaa tgtgtcaaga tcatgcaaca aggaccagca ggggcaaaga 360 ccatgacgca gcaaactgat agtattgtat catatggaag ctaagcaata tcatatggag 420 cctgacgaca ctcgtgccga attcgattcg tgaatttcta gagaacaaaa ggtatgcatc 480 aatttagaaa aaagtacact attatgtgat gtttgtttcc tatgctagtg gaacggatta 540 gaattttttt ttcattaagg tcacctttac tggcataagc agttcacact aaacggtaaa 600 ccttataggt gaaaattttc aggcatatat atatatatat atatatatat atgtttgatt 660 ctttccggct taacaaaata attagcaagt acttcttgtt gcatttgttc caacggctga 720 atttattggc atcggtccaa gaaatccatc taaatgtttt acatttcacc aaagtgtgtg 780 tcatgacaga tgtaacaaat aataaaccaa aaggagagga aggaaagagg aagataaatg 840 ttacaaaaat ttaaatcaaa cttatttcta cctttctcct tacctaccca gtttaaaaac 900 acatattata ttttaaagag aggcaacatg cgccaaaggc tacccttgaa aattcctaaa 960 atattgtaca tttgactgat gaccaaacaa aaagttaaat tgtctcttcc ttatcacatt 1020 atatttccat gcatgccttt ttctggaaac ttactatcag caaaatttag atgaaaggat 1080 aatgccacat aatttcagtc tccaagagat ttgttagttg tcatatatta aattggtggg 1140 ccaatctatt cctgggtctt tttatgtatc tacttgacca tttgaacttc tgtagttaat 1200 tgtattctat gaatgatcac tcatccaaaa acttgttatt tgtgttttac tctgttgaat 1260 cttgaatatt tattcatttt gttcatcata cgattggagg cccataatag atgcttaatg 1320 agagtaagat tatcgatctc caaacacatg cttcttacta gtgttgaata tatacccttt 1380 tagatgtata gttcaaccca tagattcata tgaccctcag ctttctgatg tgtatgtatg 1440 accttacact gacactctga actaatgtag gtatcttgtc ctgcaggaat tcggcacgag 1500 tgtcgtcagg ctccatatga tattgcttag cttccatatg atacaatact atcagtttgc 1560 tgcgtcatgg tctttgcccc tgctggtcct tgttgcatga tcttgacaca tttggcctct 1620 tttcgcagcc tcccgctgtg ggctgtggcg atcctcaccc tcttccttga tatcgacggg 1680 atcggcacac tcacctgggt ttctttcatc cctctcatca tcctcttgtg tgttggaacc 1740 aagctagaga tgatcatcat ggagatggcc ctggagatcc aggaccggtc gagcgtcatc 1800 aagggggcac ccgtggtcga gcccagcaac aagttcttct ggttccaccg ccccgactgg 1860 gtcctcttct tcatacacct gacgctgttc cagaacgcgt ttcagatggc acatttcgtg 1920 tggacaggca tgcgactgg 1939 <210> 9 <211> 7633 <212> DNA <213> Triticum sp. <400> 9 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 660 gccccccctc gagtctagaa ctagtggatc cccgacgccg aagtggagcc gacagccccc 720 aggtcccaag ccctcggcag actagatcac tagccctgga tcggcgaggt gactggatga 780 cgagcagcac ctggtctggc gggtgttggg cgagtagaac caggggcgat ggcgacgcgc 840 tgaccttctc ccctcaccgg cgatctgctc cttctgggtg ggggtcgccg gctgacgttc 900 tgttgcgggg tgggggtcgc cggctggcgt tctgctgcgg ggtgggagtc gccgaccggc 960 gtgctgctgc taggacaatc ggtgaggcca gttaggtgct agccgatcga ttggcgaaga 1020 gatccgagtc ctggggagat cagtgaggcc aggtgctatt tggcctatca attggccagg 1080 ttctgggaac ggggcgtggc gtgatcaacg aggtgctagg ctgctagcta gggaactgga 1140 tcctggaacg tggaggaggc aagtccggta tgctaagtac tttaactttc cttcttcaca 1200 tccacctgat tcagattatt ttgatctaaa ttaacttgca aaaaatatat gtgtgatatc 1260 catctactat aattgcttac aatcaaaatt atatgtgatt ttttttagtt tagaagattt 1320 atatgcacag taaatctgaa tgttcttcac atgcatgatt tagtttaact ttaaagagtt 1380 atactaacta gtcttgataa agagatcttt tggagcaaca ccaaacctcg tgaggtgttt 1440 tgcctacgga aaggttgtgc tatgtaatga ttattattag gatcaaagtt gtaggataaa 1500 cgtaaaacct tctcgatgta tcttttatac aacattgtag tttagttata tatggagaga 1560 gtgatttaac actttgtgtt taagagtaga ataagttatt ccacactcta gccaaacgaa 1620 ctatttggca aatatctcgc tagctggtga gagccagagc cgtggaaagt ctgtcttgct 1680 attaaggcac aagcatcaaa caggaacatt tagagccatg gaaaagtgat gtgtcgccta 1740 ccaatgggcc aactgctagc gatgtaataa tagcatccaa gttgattttt tatagaacat 1800 gcaaggcgtt ggcaagtggg aaaatgattg atcgctggca agcttaactc tcggaactta 1860 tagcattcaa ctgaatcaga acaaagatta aaaaaaaata catttccatc gatagtgaaa 1920 aattattcaa ttgagtgaca acgaaaatca tattggaatg tacatttact tgttgatttt 1980 aaattagagg catttttcta ccttttttag ttaataagat atgcatatac ccacccttag 2040 tgttttcgag acaacgagag ggcacattgc ttttggtgct accatctctc tcaagcctca 2100 aataagttgt gcggacacga ttatcttccc gcgttggaat atcgtggcct ggtagagcta 2160 gcgaaaaatc ttccatgttg gaatatgtcg gcagccggat agccgccatg catgtaaagt 2220 ctcttttacc tttacacttg ctcaagtgac actgtatgtc gcctaccact tgctaaatca 2280 atgggccaac tgctagcgac gtaatagtag caagttgatt tacagtgttt tgctacagtt 2340 ctctgacttt gtttcttcat tttagactag ctgactactg tcgcttacct gccttccctt 2400 ctccacgtta gaggatccag ttctgatatt gagacctcga cgatgggagg aagggcgcga 2460 tcgatgtgga gtaatttgaa tttcaaatct atctatctgg ggtatattgg tccttcaccg 2520 atgtttgggg ggctgtcgga aattggttcc gcgatctaca aaagtgaatg gagggagtag 2580 ttgtttctcc aatccgtacc aacgcacgtg tttctaacta gtacttactt ccttcgcacc 2640 acaatatgga atagagggag tatcgataaa ctaacaaaga tgattactta cccggtttaa 2700 atgattcaag agctcattta atttggcact catcatttca tatatctttt ttggtagaaa 2760 tgaaataaag cagatctaga cactagctaa aaagtcgatg tagccttgtt atttccttgg 2820 gccacgcggg ccgggtgtgg tgctccctgc tctgtgtata aatggagatc aacatccaag 2880 gcctcctccc acacacacac gctacagagc agagcagagt cttgctccag tatctgccct 2940 ctcctgcctg cctgtagagc atccatcacg tgaagttcac ggacaaacta cgtacacagg 3000 cagctagctc tcgaaacctc gctcgaaacg cacctgcaga tcgctctctt cgtcgtcgtc 3060 gccgcgatca tcatcaacag ctccgtctgc cttggagcca cggccgtcca cgacgccgcc 3120 gcctcaggtc agtcgtcgga cggtgtccgt tcatttcctc cccatttttg taattgatta 3180 acttgttata catgctgacc tcgacctgct gaataacgtc cgtccatggt ttcccgtcca 3240 ggcaccccgg gccactgtcc acacgaaatg tgccatctga aacgcgttct ggaacagcgt 3300 caggtgtatg aagaagagga cccagtcggg gcggtggaac cagaagaact tgttgctggg 3360 ctcgaccacg ggtgccccct tgatgacgct cgaccggtcc tggatctcca gggccatctc 3420 catgatgatc atctctagct tggttccaac acacaagagg atgatgagag ggatgaaaga 3480 aacccaggtg agtgtgccga tcccgtcgat atcaaggaag agggtgagga tcgccacagc 3540 ccacagcggg aggctgcgaa aagaggccaa atgtgtcaag atcatgcaac aaggaccagc 3600 aggggcaaag accatgacgc agcaaactga tagtattgta tcatatggaa gctaagcaat 3660 atcatatgga gcctgacgac actcgtgccg aattcgattc gtgaatttct agagaacaaa 3720 aggtatgcat caatttagaa aaaagtacac tattatgtga tgtttgtttc ctatgctagt 3780 ggaacggatt agaatttttt tttcattaag gtcaccttta ctggcataag cagttcacac 3840 taaacggtaa accttatagg tgaaaatttt caggcatata tatatatata tatatatata 3900 tatgtttgat tctttccggc ttaacaaaat aattagcaag tacttcttgt tgcatttgtt 3960 ccaacggctg aatttattgg catcggtcca agaaatccat ctaaatgttt tacatttcac 4020 caaagtgtgt gtcatgacag atgtaacaaa taataaacca aaaggagagg aaggaaagag 4080 gaagataaat gttacaaaaa tttaaatcaa acttatttct acctttctcc ttacctaccc 4140 agtttaaaaa cacatattat attttaaaga gaggcaacat gcgccaaagg ctacccttga 4200 aaattcctaa aatattgtac atttgactga tgaccaaaca aaaagttaaa ttgtctcttc 4260 cttatcacat tatatttcca tgcatgcctt tttctggaaa cttactatca gcaaaattta 4320 gatgaaagga taatgccaca taatttcagt ctccaagaga tttgttagtt gtcatatatt 4380 aaattggtgg gccaatctat tcctgggtct ttttatgtat ctacttgacc atttgaactt 4440 ctgtagttaa ttgtattcta tgaatgatca ctcatccaaa aacttgttat ttgtgtttta 4500 ctctgttgaa tcttgaatat ttattcattt tgttcatcat acgattggag gcccataata 4560 gatgcttaat gagagtaaga ttatcgatct ccaaacacat gcttcttact agtgttgaat 4620 atataccctt ttagatgtat agttcaaccc atagattcat atgaccctca gctttctgat 4680 gtgtatgtat gaccttacac tgacactctg aactaatgta ggtatcttgt cctgcaggaa 4740 ttcggcacga gtgtcgtcag gctccatatg atattgctta gcttccatat gatacaatac 4800 tatcagtttg ctgcgtcatg gtctttgccc ctgctggtcc ttgttgcatg atcttgacac 4860 atttggcctc ttttcgcagc ctcccgctgt gggctgtggc gatcctcacc ctcttccttg 4920 atatcgacgg gatcggcaca ctcacctggg tttctttcat ccctctcatc atcctcttgt 4980 gtgttggaac caagctagag atgatcatca tggagatggc cctggagatc caggaccggt 5040 cgagcgtcat caagggggca cccgtggtcg agcccagcaa caagttcttc tggttccacc 5100 gccccgactg ggtcctcttc ttcatacacc tgacgctgtt ccagaacgcg tttcagatgg 5160 cacatttcgt gtggacaggc atgcgactgg gcatgcccgc tgaaatcacc agtctctctc 5220 tacaaatcta tctctctcta taataatgtg tgagtagttc ccagataagg gaattagggt 5280 tcttataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg tatttgtatt 5340 tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca ggggtaccga 5400 gctcgaattc tagtctacgc ggccgcgagc tccagctttt gttcccttta gtgagggtta 5460 attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 5520 acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 5580 gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 5640 tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 5700 cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 5760 gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 5820 aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 5880 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 5940 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 6000 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 6060 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 6120 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 6180 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 6240 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 6300 tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 6360 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 6420 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 6480 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 6540 ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 6600 tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 6660 agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 6720 gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 6780 ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 6840 gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 6900 cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 6960 acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 7020 cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 7080 cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 7140 ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 7200 tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 7260 atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 7320 tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 7380 actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 7440 aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 7500 ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 7560 ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 7620 cgaaaagtgc cac 7633 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor primer <400> 10 atatatctgc agggagccac ggccgtccac 30 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor primer <400> 11 tatcccgggc ccgtgcctgg acgggaa 27 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor primer <400> 12 atatatctcg agtctagaac tagtggatcc 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor primer <400> 13 atatattacg tagtttgtcc gtgaacttca 30 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 14 gtacacaggc agctagctct cgaaacctcg ctcgaaacgc a 41 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 15 catgtgtccg tcgatcgaga gctttggagc gagctttgcg t 41

Claims (26)

1. 유전자 GSTA1의 프로모터에서 유래한 첫 번째 서열; 및

   유전자 WIR1a의 인트론에서 유래한 두 번째 서열

   을 포함하는 식물 표피에 대한 특이성을 가지는 프로모터 영역.
2. 제1항에 있어서,

   상기 첫 번째 서열은 서열번호 1이고, 상기 두 번째 서열은 서열번호 2인 것을 특징으로 하는

   프로모터 영역.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   a) 서열번호　3에서 제공되는 핵산 서열을 포함하는 프로모터 영역;

   b) 서열번호　3에서 제공되는 핵산 서열의 기능부를 포함하는 프로모터 영역; 또는

   c) 서열번호　3에서 제공되는 핵산 서열과 엄격한 조건에서 혼성화하는 서열을 가진 프로모터 영역

   로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로모터 영역.
4. 코딩 서열과의 작동 결합에서 제1항 내지 제3항 중 어느 하나에 따른 프로모터 영역를 포함하는 것을 특징으로 하는

   키메라 유전자.
5. 제4항에 있어서,

   상기 유전자의 발현이 표피에서 코딩 서열에 의해 암호화되는 단백질의 수율을 증가시키는 것을 특징으로 하는

   키메라 유전자.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서,

   상기 코딩 영역은 저항성 유전자로부터 유래한 것을 특징으로 하는

   키메라 유전자.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서,

   상기 코딩 서열이 과산화효소 또는 옥살레이트 산화효소를 암호화하는 것을 특징으로 하는

   키메라 유전자 또는 재조합 핵산 분자.
8. 제4항에 있어서,

   상기 유전자의 발현은 표피에서 대응하는 내인성 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는

   키메라 유전자.
9. 제8항에 있어서,

   상기 코딩 서열은 안티센스 배향인 것을 특징으로 하는

   키메라 유전자.
10. 제8항에 있어서,

    상기한 내인성 유전자의 발현 억제는 RNA-간섭으로 인한 것임을 특징으로 하는

    키메라 유전자.
11. 제8항 내지 제10항 중 어느 하나에 있어서,

    상기 발현이 억제되는 유전자는 Mlo-유전자인 것을 특징으로 하는

    키메라 유전자.
12. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나에 따른 프로모터 영역; 또는

    제4항 내지 제11항 중 어느 하나에 따른 키메라 유전자

    를 포함하는 재조합 핵산 분자.
13. 제12항에 있어서,

    상기 분자는 전사 종결 서열을 더 포함하는

    재조합 핵산 분자.
14. a) 제12항 또는 제13항에 따른 재조합 핵산 분자를 생성하는 단계;

    b) a)로부터의 재조합 핵산 분자를 식물 세포에 전달하는 단계; 및

    c) 전체적으로 형질변환된 식물을 재생하는, 원한다면 상기 식물을 증식시키는 단계

    를 포함하는 형질전환 유전자를 표피 특이적으로 발현하는 형질전환 식물을 생성하는 방법.
15. 제12항 또는 제13항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하거나 제14항의 방법에 따라 생성되고,

    원형질체, 식물 세포, 캘러스, 씨, 덩이줄기 또는 자른 가지와 같은, 상기 식물의 형질전환 부분과 형질전환 전달 물질, 및 상기 식물의 형질전환 산물을 포함하는

    형질전환 식물.
16. 제15항에 있어서,

    상기 식물이 단자엽 식물인

    형질전환 식물.
17. 제16항에 있어서,

    상기 식물이 벼과 식물인

    형질전환 식물.
18. 제17항에 있어서,

    상기 식물이 밀 또는 보리인

    형질전환 식물.
19. 식물의 형질전환 유전자의 표피 특이적 발현을 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프로모터 영역의 용도.
20. 제19항에 있어서,

    상기 형질전환 유전자가 저항성 유전자인

    용도.
21. a) 제12항 또는 제13항에 따른 재조합 핵산 분자를 생성하는 단계;

    b) a)로부터의 재조합 핵산 분자를 식물 세포에 전달하는 단계; 및

    c) 전체적으로 형질변환된 식물을 재생하는, 원한다면 상기 식물을 증식시키는 단계

    를 포함하는 형질전환 식물에서 병원체 저항성을 증가시키는 방법.
22. 제12항 또는 제13항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하거나 제21항의 방법에 따라 생성되고,

    원형질체, 식물 세포, 캘러스, 씨, 덩이줄기 또는 자른 가지와 같은, 상기 식물의 형질전환 부분과 형질전환 전달 물질, 및 상기 식물의 형질전환 산물을 포함하는

    형질전환 식물.
23. 제22항에 있어서,

    상기 식물이 단자엽 식물인

    형질전환 식물.
24. 제23항에 있어서,

    상기 식물이 벼과 식물인

    형질전환 식물.
25. 제24항에 있어서,

    상기 식물이 밀 또는 보리인

    형질전환 식물.
26. 제22항 내지 제25항 중 어느 하나에 있어서,

    흰가루병에 대한 증가된 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물.

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