MXPA06003912A - Promotor para la expresion transgenica epidermis-especifica en plantas. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con regiones promotoras bajo el control de las cuales se pueden expresar transgenes en plantas de una forma epidermis-especifica. La invencion tambien se relaciona con moleculas de acido nucleico recombinante que incluyen los promotores, para plantas transgenicas y celulas vegetales transformadas con estas moleculas de acido nucleico, y con los metodos para producir los mismos. La invencion ademas se relaciona con moleculas de acido nucleico incluyendo un promotor de acuerdo con la invencion y con las secuencias de acido nucleico o transgenes que suministran resistencia a patogenos, con plantas y celulas vegetales transformadas con estas moleculas de acido nucleico y con los metodos para producir los mismos.

Description

PROMOTOR PARA LA EXPRESIÓN TRANSGENICA EPIDERMIS-ESPECÍFICA EN PLANTAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con regiones promotoras, bajo cuyo control los transgenes se pueden expresar epidermis-específicamente en plantas. Además, la invención se relaciona con moléculas de ácido nucleico recombinante, que comprenden las regiones promotoras, y con plantas transgénicas y células vegetales que se han transformado por medio de las moléculas de ácido nucleico, asi como también con los métodos para su generación. Además, la presente invención se relaciona con moléculas de ácido nucleico que comprenden un promotor de acuerdo con la presente invención, y con las secuencias de ácido nucleico o transgenes, que son capaces de suministrar resistencia a patógenos, asi como también con plantas y células vegetales transformadas por medio de las moléculas de ácido nucleico, y con los métodos para su generación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Aquellas regiones de ADN de un gen, que se ubican en la dirección 5' del punto de inicio de la transcripción y mediante las cuales se determinan el punto de inicio y la frecuencia de inicio de la transcripción y de esta forma el nivel de expresión y el patrón de expresión del gen controlado, en general se denominan como promotores. La ARN polimerasa y los factores de transcripción específicos que activan la ARN polimerasa se unen a los promotores para iniciar la transcripción junto con el complejo de transcripción basal. La eficacia de los promotores con frecuencia se refuerza y . regula mediante secuencias de ADN adicionales, las secuencias reforzadoras, cuya posición, contrariamente a la posición de los promotores, no es fija. Estos elementos reguladores se pueden ubicar en la dirección 5', en la dirección 3', o en un intrón del gen que será expresado. En la tecnología de ADN recombinante, los promotores se insertan en los vectores de expresión para controlar la expresión de un transgén que normalmente no es el gen regulado naturalmente por el promotor. En la presente, la especificidad del promotor es de importancia primordial, la cual determina en cuál punto de tiempo, en cuáles tipos de tejido, y a qué intensidad se expresa un gen transferido por medio de ingeniería genética. En la propagación de plantas, con frecuencia se utiliza la tecnología de ADN recombinante para transferir propiedades ventajosas especificas a plantas útiles, lo cual se supone que conduce a un mayor rendimiento, por ejemplo por medio de la resistencia aumentada a patógenos, o a las propiedades mejoradas de los productos cosechados. En la presente, con frecuencia es conveniente que el gen transferido no se exprese en todas partes, sino que más bien únicamente en aquellos tejidos donde se desea la actividad transgénica, ya que la presencia del producto transgénico puede tener un efecto negativo sobre los procesos fisiológicos normales en algunos tejidos. De esta forma, por ejemplo, se podria mostrar que la sobre-expresión de una peroxidasa aniónica bajo el control del promotor 35S eficaz de manera omnipresente conduce al marchitamiento de las plantas transgénicas de tabaco, a medida que se presenta menos crecimiento de la raiz y por lo tanto también se desarrolla menos masa de la raíz (Lagrimini et al. (1997) The consequence of peroxidase overexpression in transgenic plants on root growth and development. Plant Mol Biol. 33 (5), S. 887-895) . La sobre-expresión de la peroxidasa spi2 bajo el control del promotor de ubiquitina igualmente eficaz de manera omnipresente conduce al desarrollo reducido del epitotíleo y el crecimiento longitudinal reducido en comparación con las plantas control (Elfsttand, M. et al. (2001) Overexpression of the endogenous peroxidase-li e gene spi2 in transgenic Norway spruce plants results in increased total peroxidase activity and reduced growth. Plant Cell Reports 20 (7), S. 596-603) . Sin importar los efectos negativos en los procesos fisiológicos, se supone con frecuencia que se evitarán en la propagación de la resistencia ya que el producto transgénico también está presente en las partes de la planta cosechada. Por lo tanto, durante los últimos años se han aislado los promotores que funcionan en tejidos ya sea específica o induciblemente . Los promotores tejido-específicos, por ejemplo, son promotores específicos de semillas, tubérculos y frutas. Los promotores inducibles se pueden activar, por ejemplo, por medio de inducción química, inducción de luz, u otros estímulos.

También es conveniente modular específicamente la expresión génica en la epidermis. La epidermis es el tejido terminal de los órganos sobre la tierra de plantas mayores. Como tales, las tareas de la epidermis son, por un lado, permitir el intercambio de agua y nutrientes de la planta y, por otro lado, evitar la invasión de patógenos en la planta. Estas funciones se podrían modular específicamente por medio de la expresión del gen alterado en la epidermis con el auxilio de los promotores adecuados y los genes controlados los últimos . En plantas dicotiledóneas ya se habían descrito promotores epidermis-específicos. De esta forma se podría mostrar que promotor del gen CER6- (CUT1-) proveniente de Arabi dopsi s , que codifica para una enzima condensadora en síntesis con cera, puede provocar la expresión epidermis-específica de un gen reportero de ß-glucuronidasa (Hooker et al. (2002), Significance of the expression of the CER6 condensing enzyme for cuticular wax production in Arabidopsis, Planta Physiol. 129(4), S. 1568-1580; Kunst et al. (2000), Expresión of the wax-specific condensing enzyme CUTÍ in Arabidopsis, Biochem. Soc. Transí 28 (6) , S. 651-654) .

Sin embargo, los promotores epidermis- específicos adecuados en plantas monocotiledóneas que son particularmente muy adecuados para la expresión de transgenes en monocotiledóneas en particular en poa cea e (céspedes aromáticos), actualmente no se podrían identificar exitosamente. Por lo tanto, los promotores constitutivos similares al promotor de ubiquitina proveniente del maiz se utilizó hasta la fecha para expresar proteínas en la epidermis (véase, por ejemplo, Oldach et al. (2001), Heterologous expression of genes mediating enhanced fungal resistance in transgenic wheat, Mol Plant Microbe Interact. 14(7), S. 832-838) . Sin embargo, esto puede conducir a efectos secundarios no deseados en las plantas transgénicas debido a la presencia del producto transgénico en otros tejidos u órganos distintos de la epidermis, como se describió anteriormente .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, el problema subyacente de la presente invención es proporcionar los medios que permitan una expresión epidermis-específica de genes en monocotiledóneas, de preferencia en plantas de cereal .

Este problema se resuelve por la provisión de las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones de la patente. De esta forma, la presente invención se relaciona con una región promotora que tiene especificidad para la epidermis de una planta, que comprende una primera secuencia que se origina del promotor del gen glutatión S-transferasa Al (GSTAl) y una segunda secuencia que se origina del intrón del gen WIRla. GSTAl se relaciona con genes según se describen en Dudler et al. (1991), A pathogen-induced wheat gene encodes a protein homologous to glutathione-S-transferases , Mol. Plant Microbe Interact . 4(1), S. 14-18. En particular, estos genes son genes provenientes de trigo; sin embargo, los mismos también pueden ser genes homólogos provenientes de otras plantas de cereal, en particular de cebada, que tienen un patrón de expresión comparable y un producto génico similar. IRla denota genes según se describen en Bull et al. (1992), Sequence and expression of a wheat gene that encodes a novel protein associated with pathogen defense, Mol. Plant Microbe Interact. 5(6), S. 516- DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De preferencia, la primera secuencia es la SEQ ID No .1 y la segunda secuencia es la SEQ ID No .2. Entre la primera y la segunda secuencia puede haber secuencias adicionales no traducidas que tengan una longitud de 10 pares de bases hasta 1000 pares de bases, de preferencia de 20 pares de bases hasta 800 pares de bases, en particular de preferencia de 30 pares de bases hasta 500 pares de bases, y de mayor preferencia entre 40 pares de bases y 300 pares de bases . En particular de preferencia, la región promotora de acuerdo con la presente invención es una región promotora seleccionada del grupo que consiste de a) regiones promotoras que comprenden la secuencia de ácido nucleico proporcionada en la SEQ ID No.3; b) regiones promotoras que comprenden una parte funcional de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en la SEQ ID No .3 o c) regiones promotoras que tienen una secuencia, que se hibrida bajo condiciones severas con la secuencia de ácido nucleico proporcionada en la SEQ ID No.3.

Dentro del alcance de la presente invención, se entiende que una región promotora será una secuencia de ácido nucleico que comprende las secuencias reguladoras requeridas para la expresión de una secuencia codificante (transgén) . Las secuencias reguladoras forman esa porción de un gen, que determina la expresión de una secuencia codificante, es decir, en particular el nivel y patrón de expresión. Las secuencias reguladoras tienen al menos motivo secuencial, donde los factores específicos de transcripción y la unión d*e la ARN polimerasa, se ensamblan para formar el complejo de transcripción, e iniciar eficazmente la transcripción de la secuencia de ácido nucleico controlada por la región promotora. Las regiones promotoras de acuerdo con la presente invención se basan en la observación de que los promotores que tienen propiedades novedosas se pueden generar al fusionar el promotor del gen GSTAl proveniente del trigo con las secuencias intrón del gen WIRla proveniente del trigo. En los análisis de genes reporteros transitorios en hojas de trigo que tienen un gen ß-glucuronidasa (GUS) proveniente de E . col i como el gen reportero, se probaron combinaciones diferentes del promotor WIRl y un intrón y el promotor GST. De manera sorprendente, se mostró que el promotor GST y el intrón IRla tienen un efecto sinérgico sobre la actividad del gen reportero. El aumento en la actividad transcripcional fue comparable a la actividad transcripcional lograda por medio del promotor 35S expresado de manera omnipresente. Dentro del alcance de la presente invención, el término "epidermis-específico" se debe entender para denotar que una secuencia de ácido nucleico, que está bajo el control de la región promotora de acuerdo con la presente invención, se expresa en la epidermis del retoño de plantas. En el sentido de la presente invención, también se proporciona una especificidad epidérmica, en particular, si la región promotora, de acuerdo con la presente invención, favorece la expresión de un gen extraño en la epidermis en comparación con otros tipos celulares y provoca un aumentó significativo, casi al doble, de preferencia al menos 5 veces, en particular de preferencia al menos 10 veces, y de mayor preferencia al menos 50 veces, la expresión en comparación con otros tipos celulares. El nivel de expresión se puede determinar por medio de técnicas convencionales para detección in si t u .

El término "epidermis de la planta" se conoce por alguien con experiencia en la técnica. La información complementaria se puede encontrar en cualquier libro sobre anatomía vegetal ó fisiología vegetal, tal como por ejemplo, en Strasburger, Lehrbuch der Botanik, 35. Edición 2002, Spektrum Akademischer Verlag. Actualmente se ha encontrado de manera sorprendente, que una región promotora, que comprende tanto secuencias reguladoras del gen GSTAl proveniente de trigo como secuencias intrón del gen WIRla proveniente de trigo, provoca la expresión epidermis-específica de una secuencia codificante de ácido nucleico que está bajo su control. Junto a una región promotora que tiene las secuencias de ácido nucleico representadas en la SEQ ID No.3, la presente invención también se relaciona con regiones promotoras que tienen porciones funcionales de la secuencia y que provocan la expresión epidermis-específica de una de las secuencias codificantes de ácido nucleico que las mismas controlan, en plantas. En este contexto, se debe entender que una "porción funcional" denota secuencias, en las cuales el complejo de transcripción, a pesar de una secuencia de ácido nucleico que se desvía ligeramente, todavía se puede unir y provocar la expresión epidermis-específica. Las porciones funcionales de una secuencia promotora también comprenden estas variantes promotoras, cuya actividad promotora se disminuye o refuerza en comparación con el tipo silvestre. En particular, también se debe entender por supuesto que una porción funcional denota variantes naturales o artificiales de la secuencia de la región promotora proporcionada en la SEQ ID No .3. Las mutaciones comprenden sustituciones, adiciones, supresiones, intercambios, y/o inserciones de uno o más residuos nucleotídicos . Dentro del alcance de la presente invención, las porciones funcionales de las regiones promotoras comprenden variantes de la SEQ ID No .3 que se presentan en la naturaleza, así como también las secuencias nucleotídicas artificiales, por ejemplo obtenidas por medio de síntesis química. En cualquier caso, el promotor utilizado contiene una caja TATA (posiciones 2163 a 2169 en las SEQ ID Nos. 1 y 3) y de preferencia también dos cajas CAAT (posiciones 1047 a 1051 ó 1895 a 1899 en las SEQ ID Nos. 1 y 3) . Además, el promotor contiene al menos uno, de preferencia al menos dos y tres, en particular de preferencia al menos cuatro, cinco y seis, y de mayor preferencia al menos siete u ocho de los siguientes motivos secuenciales: a) GTGGGGG b) ACGTGGA c) TCCACCT d) TATCCAT e) CATGCATG f) TGTAAAG g) CCTACCA h) AATAGTA De preferencia, los motivos secuenciales se ubican en las posiciones que corresponden a las siguientes posiciones en las SEQ. ID Nos. 1 y 3: - a) 185-191 y 217-223 pares de bases - b) 455-461 pares de bases - c) 508-514 pares de bases - d) 564 570 pares de bases - e) 1514-1521 pares de bases - f) 1520-1526 pares de bases - g) 1569-1575 pares de bases - h) 1610-1616 pares de bases La actividad promotora de las variantes de la región promotora se puede medir con el auxilio de genes marcadores, cuya secuencia codificante se encuentra bajo el control de la región promotora que será examinada. Los genes marcadores adecuados son, por ejemplo, el gen de ß-glucuronidasa (GÜS) proveniente de E . coli , un gen de fluorescencia como, por ejemplo, la proteína de fluorescencia verde (GFP) proveniente de Aequ ori a vi c t ori a , el gen de luciferasa proveniente de Ph o tin us pyra l i s del gen de ß-galactosidasa (lacZ) proveniente de E . col i . La actividad absoluta del promotor se determina por medio de la comparación con una planta tipo silvestre. La especificidad de tejidos o células se puede determinar fácilmente por medio de la comparación de las velocidades de expresión de los genes de marcadores mencionados anteriormente en los tejidos o células respectivos. La presente invención también se relaciona con regiones promotoras que tienen una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la secuencia de ácido nucleico proporcionada en la SEQ ID No .3 bajo condiciones severas. En el contexto de la presente invención, el término "hibridación bajo condiciones severas" significa que la hibridación se conduce in vi tro bajo condiciones, que son bastante severas para asegurar una hibridación específica. Estas condiciones de hibridación severas se conocen por alguien con experiencia en la técnica y se pueden tomar de la literatura (Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) . En general, "hibridar específicamente" significa que una molécula de preferencia se une a una secuencia nucleotídica específica bajo condiciones severas, si la secuencia está presente en la forma de una mezcla compleja de (por ejemplo total) ADN o ARN . El término "condiciones severas" en general denota las condiciones, bajo las cuales una secuencia de ácido nucleico de preferencia se unirá a su secuencia designada y con una magnitud considerablemente menor o nada con otras secuencias. Las condiciones severas dependen parcialmente de la secuencia y serán diferentes bajo circunstancias diferentes . Secuencias mayores específicamente se híbridas a temperaturas superiores. En general, las condiciones severas se seleccionan de tal forma que la temperatura se encuentra en aproximadamente 5°C debajo del punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una resistencia iónica constante definida y un valor definido de pH . La Tm es la temperatura (bajo la resistencia iónica definida, el valor de pH, y la concentración de ácido nucleico) , a los cuales el 50% de las moléculas complementarias para la secuencia designada se hibridan con la secuencia designada en un estado de equilibrio. Típicamente, las condiciones severas son aquellas, en donde la concentración de sal es al menos aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de iones de sodio (o cualquier otra sal) a un valor de pH de entre 7.0 y 8.3 y la temperatura es al menos 30°C para moléculas cortas (es decir, por ejemplo 10 a 50 nucleótidos) . Además, las condiciones severas se pueden alcanzar al agregar agentes desestabilizantes, como por ejemplo formamida. Las condiciones de hibridación severas adecuadas, por ejemplo, también se describen en Sambrook et al., vide supra. De esta forma, la hibridación por ejemplo, se puede presentar bajo las siguientes condiciones: - amortiguador de hibridación: 2 x SSC, 10 x solución de Denhardt (Fikoll 400 + PEG + BSA; proporción 1:1:1), 0,1% SDS, EDTA 5 mM, Na2HP0 50 mM, 250 µg/ml de ADN de esperma de arenque; 50 µg/ml de ARNt o amortiguador de fosfato de sodio 0.25 M pH 7,2, EDTA 1 mM, 7% de SDS a una temperatura de hibridación de 65°C a 68°C - amortiguador de lavado: 0.2 x SSC, 0,1% de SDS a una temperatura de lavado de 65°C a 68°C. De preferencia, estas variantes promotoras tienen una identidad de secuencia de al menos 50%, de preferencia al menos 70%, en particular de preferencia al menos 90%, y de mayor preferencia al menos 95% con la secuencia promotora proporcionada en la SEQ ID No.3 o porciones de la misma, respecto a la secuencia total de ADN mostrada en la SEQ ID No .3. De preferencia, la identidad secuencial de estas secuencias promotoras se determina por medio de la comparación con la secuencia de ácido nucleico determinada bajo la SEQ ID No .3. En caso de que dos secuencias de ácido nucleico de diferente longitud se comparen entre sí, la identidad secuencial se relaciona de preferencia con el porcentaje de los residuos nucleotídicos de secuencia más corta que son idénticos a los residuos nucleotídicos correspondientes de la secuencia mayor. Las identidades secuenciales se determinan convencionalmente vía programas de alineación diferentes, como por ejemplo CLUSTAL. En general, el experto en la técnica tiene a su disposición los algoritmos adecuados para determinar la identidad secuencial, por ejemplo también el programa, al que se puede tener acceso en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (por ejemplo, la liga "Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] ") . Los grados porcentuales de identidad proporcionados anteriormente para la SEQ ID No. 3 también se aplican a la primera y segunda secuencias de la región promotora de acuerd.o con la presente invención, que se muestra en las SEQ ID Nos. 1 y 2. En una modalidad preferida de la invención, la región promotora de acuerdo con la presente invención tiene la secuencia total de 25S2 nucleótidos, que se proporciona de conformidad con la SEQ ID No.3. La presente invención también se relaciona con los genes quiméricos de la región promotora de acuerdo con la presente invención y de una secuencia codificante, cuya expresión, la cual no se regula naturalmente por la región promotora de acuerdo con la presente invención, en el gen quimérico se regula por la región promotora de acuerdo con la presente invención, en enlace funcional, así como también con las moléculas de ácido nucleico recombinante que contienen el gen quimérico.

El término "secuencia de ácido nucleico, cuya expresión se regula por la región promotora de acuerdo con la presente invención" significa que la expresión de la secuencia de ácido nucleico bajo el control de la región promotora de acuerdo con la presente invención en aquellas células, en las cuales la región promotora es activa, se puede aumentar en al menos el factor cinco, de preferencia en al menos el factor 10, y en particular de preferencia al menos el factor 50 en comparación con las células tipo silvestre . La secuencia de ácido nucleico, cuya expresión se regula por la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, puede ser la región codificante de un transgén, por ejemplo un gen de resistencia, cuyo producto génico se desea en la epidermis. Por medio de la expresión del transgén, el contenido del producto génico codificado por el mismo se puede aumentar por al menos el factor 2, de preferencia por al menos el factor 5, en particular de preferencia por al menos el factor 10, y de mayor preferencia por al menos el factor 50. Sin embargo, la región promotora de acuerdo con la presente invención también se puede utilizar en las construcciones de ARNi para la interferencia de ARN con el fin de alcanzar la lentificación epidermis-específica de los genes específicos, cuyos productos génicos se supone que están presentes en la epidermis ,a un grado menor que el usual o nada. Por supuesto, lo último también se puede alcanzar por medio de las construcciones antisentido clásicas o de co-supresión con el uso de la región promotora de acuerdo con la presente invención. Por medio de las estructuras de lentificación, la expresión del gen endógeno se disminuye por al menos 50%, de preferencia por al menos 70%, en particular de preferencia por al menos 90%, y en particular de preferencia por al menos 95%. En una construcción, la cual se supone que se utilizará para la interferencia de ARN, usualmente existen secuencias de ADN palíndromo, que forman ARN de doble cadena después de la transcripción. Por medio de la enzima di cer, el ARN de doble cadena se procesa para formar porciones de ARN más cortas, que se unen a un ARN endógeno y provocan su degradación con el auxilio RiSC (complejo lentificador inducido por ARNA) (Hannon (2002) RNA int erférente , Nature, Bd. 418, S. 244-251) . El efecto de las construcciones lentificadoras génicas sobre la expresión del gen endógeno se puede detectar por medio de métodos biológicos moleculares convencionales, que son bien conocidos por alguien con experiencia en la técnica. De esta forma, los métodos de transferencia Northern y RT-PCR están disponibles para examinar el nivel de ARN; la proteína se puede detectar por medio de análisis de transferencia Western, inmunofluorescencias , o, con la condición de que la proteína sea una enzima, por medio de análisis enzimáticos. Dentro del alcance de la presente invención, el término "transgén" resume aquellos genes, cuyos productos génicos se supone serán proporcionados en la epidermis o se supone que se suprimirán en la lentificación génica. De preferencia, la secuencia de ácido nucleico, cuya expresión se encuentra bajo el control del promotor de acuerdo con la presente invención, es una secuencia de ácido nucleico que suministra resistencia a patógenos, ya que la epidermis es la primera banda, que tiene para ser vencida por un patógeno cuando está invadiendo la planta. Dentro del alcance de la presente invención, se debe entender que el término "molécula de ácido nucleico recombinante" denota un vector, que contiene un gen quimérico de acuerdo con la presente invención o una región promotora de acuerdo con la presente invención y que puede provocar la expresión dependiente del promotor de la secuencia de ácido nucleico, que se encuentra bajo el control de la región promotora de acuerdo con la presente invención, en células vegetales y plantas. En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la presente invención contiene adicionalmente las secuencias para la terminación de la transcripción. En la presente, se debe entender que las "secuencias para la terminación de la transcripción" denotan las secuencias de ADN que se ubican al final de la dirección 3' de una secuencia codificante y que provocan que la ARN polimerasa termine la transcripción. Además, la invención se relaciona con los métodos para la generación de plantas transgénicas con la expresión epidermis-específica de una secuencia de ácido nucleico, que se regula por la región promotora de acuerdo con la presente invención, que comprende los siguientes pasos: a) generar una molécula de ácido nucleico recombinante, en la cual la región promotora de acuerdo con la presente invención está presente en el enlace funcional con una secuencia codificante, b) transferir la molécula de ácido nucleico de a) a células vegetales y c) regenerar completamente las plantas transformadas y, si desea, propagar las plantas. Para la preparación de la introducción de genes extraños en plantas mayores y sus células, respectivamente, están disponibles muchos vectores de clonación que contienen una señal de replicación para E . coli y un gen marcador para seleccionar las células bacterianas transformadas. Los ejemplos de estos vectores son pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. El gen quimérico se puede introducir en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido obtenido luego se utiliza para transformar células de E . coli . Las células de E . col i transformadas se cultivan en un medio adecuado y se recolectaron y lisaron posteriomente y se volvió a obtener el plásmido. Los análisis de restricción, la electroforesises en gel, y los métodos biológicos bioquímico-moleculares adicionales en general se utilizan como los métodos de análisis para caracterizar el ADN del plásmido obtenido. Después de cada manipulación, el ADN del plásmido se puede escindir y los fragmentos de ADN obtenidos del mismo, se pueden enlazar con con otras secuencias de ADN . Como .ya mencionó, están disponibles una variedad de técnicas por introducir ADN en una célula hospedera vegetal, en donde alguien con experiencia en la técnica puede determinar el método adecuado en cada caso sin ninguna dificultad. Estas técnicas comprenden la transformación de células vegetales con T-ADN utilizando Agroba ct eri um t umefa ci ens o Agroba ct eri um rhi zogen es como el medio de transformación, la fusión de protoplastos , inyección, electroporación, transferencia génica directa del ADN aislado en los protoplastos, la introducción de ADN por medio de métodos biolísticos, así como también posibilidades adicionales, que han quedado bien establecidas durante varios años hasta la fecha y que pertenecen al repertorio normal de alguien con experiencia en la técnica de la biología molecular vegetal y la biotecnología vegetal, respectivamente. El método de transferencia génica biplística, en particular, se utiliza en plantas monocotiledóneas. Aquí, alguien con experiencia en la técnica puede encontrar información útil sobre la conducción, como por ejemplo en Vasil et al. (1992) Bio/Technology , 10, S., 667-674; Vasil et al. (1993) Bio/Technology, 11, S. 1153-1158; Nehra et al. (1994) Plant J. 5, S. 285-297; Becker et al. (1994) Planta J . , 5, S., 299- 307; Altpeter et al. (1996) Plant Cell Reports 16, S. 12-17; Ortiz et al. (1996) Plant Cell Reports 15, S., 877-81; Rasco-Gaunt et al. (2001) J. Exp. Bot . 52; S. 865-874. En el caso de inyección y electroporación de ADN en células vegetales, no se llevan a cabo ninguna de las demandas específicas sobre el plásmido utilizado. Esto también se aplica a la transferencia génica directa. Se pueden utilizar plásmidos simples, similares por ejemplo a derivados de pUC . Sin embargo, si se supone que plantas enteras se regenerarán a partir de células transformas de esta forma, es recomendable la presencia de un gen marcador seleccionable . Se conocen los marcadores de selección estándar por alguien con experiencia en la técnica y la selección de un marcador adecuado no representa ningún problema. De acuerdo con el método para introducir los genes deseados en la célula vegetal, se pueden requerir secuencias adicionales de ADN. Si se utiliza, por ejemplo, el plásmido Ti o Ri para transformar la célula vegetal, al menos el límite derecho, aunque con frecuencia el límite derecho e izquierdo, del T-ADN contenido en el plásmido Ti o Ri, se tiene que unir con los genes que se supone se introducirán para formar una región de flanqueo. Si se utilizan agrobacterias para la transformación, el ADN, que se supone se introducirá, se debe clonar en los plásmidos específicos, realmente ya sea en un intermediario o en un vector binario. Debido a las secuencias, que son homologas en el T-ADN, los vectores intermediarios se pueden integrar en el plásmido Ti o Ri de las agrobacterias por medio de recombinación homologa. El plásmido también contiene la región vir necesaria para transferencia del T-ADN. Sin embargo, los vectores intermediarios no se pueden replicar en agrobacterias. Por medio de un plásmido auxiliar, el vector intermediario se puede transferir a Agroba cteri um t umefa ci ens (conjugación) . Sin embargo, los vectores binarios se pueden replicar tanto en E . coli como en agrobacterias. Los mismos contienen un gen marcador de selección y un enlazante o polienlazante, que se enmarcan por la región límite derecha e izquierda del T-ADN. Los mismos se pueden transformar directamente en las agrobacterias. La agrobacteria que sirve como una célula hospedera debe contener un plásmido que porte el gen quimérico dentro del T-ADN, que se transfiere en la célula vegetal. Puede estar presente el T-ADN adicional. La agrobacteria transformada de esta forma se utiliza para la transformación de células vegetales. El uso de T-ADN para el transformado de células vegetales se ha examinado exhaustivamente y se describe de manera suficiente en los artículos de estudio en general conocidos y los manuales sobre transformación de vegetales. En el caso de plantas monocotiledóneas, se deben aplicar protocolos alterados para una transferencia génica eficaz suministrada por agrobacterias, según se describen, por ejemplo, en Cheng et al. (1997) Plant Physiol. 115, S. 971-980; Khanna y Daggard (2003) Plant Cell Reports 21, S. 429-436; Wu et al. (2003) Plant Cell Reports 21, S. 659-668; Hu et al. (2003) Plant Cell Reports 21, S. 1010-1019. Para la transferencia de ADN en la célula vegetal, las explantaciones vegetales se pueden cultivar prudentemente con Agroba cteri um tumefa ciens o Agroba cteri um rhi zogenes . Las plantas enteras se pueden regenerar a partir del material vegetal infectado (por ejemplo pedazos de hojas, segmentos de tallos, raíces, aunque también protoplastos o células vegetales cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección de células transformadas . Una vez que el ADN introducido se integra en el genoma de la célula vegetal, éste normalmente es estable y también se mantiene en la descendencia de la célula transformada originalmente. El ADN introducido normalmente contiene un marcador de selección, que suministra resistencia contra un biocida o un antibiótico como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina, metotrexato, glifosato, estreptomicina, sulfonilurea, gentamicina o fosfinotricina y otros en las células vegetales transformadas. Por lo tanto, el marcador seleccionado individualmente debe permitir la selección de células transformadas contra células que carecen del ADN introducido. Para este fin, también son adecuados marcadores alternativos, similares a marcadores nutritivos o marcadores de selección (similares a la GFP, proteína fluorescente verde) . Por supuesto, los marcadores de selección también se pueden omitir completamente, lo cual, sin embargo, se acompaña por una necesidad de selección comparativamente alta. En caso de que se deseen plantas transgénicas libres de marcadores, alguien con experiencia en la técnica también tiene sus estrategias de desecho, la cuales permiten eliminar el gen marcador después, por ejemplo mediante cotransformación o recombinasas secuencia- específicas . La regeneración de las plantas transgénicas a partir de células vegetales transgénicas se conduce de acuerdo con los métodos de regeneración convencionales utilizando medios nutritivos conocidos. Las plantas obtenidas de esta forma entonces se pueden examinar por medio de métodos convencionales, incluyendo métodos biológicos moleculares similares a PCR, análisis de transferencia para la presencia y específicaidad de tejidos de la secuencia de ácido nucleioco introducida, cuya expresión se controla por el promotor de acuerdo con la presente invención, o para los ARN endógenos y las proteínas influidas por la secuencia de ácido nucleico. Además, la invención se relaciona con plantas transgénicas que contienen una secuencia de ácido nucleico regulada por la región promotora de acuerdo con la presente invención y la expresión epidermis-específica de la secuencia de ácido nucleico. De preferencia, las plantas de acuerdo con la presente invención son monocotiledóneas, en particular plantas de cereal similares a centeno, maíz, y avenas, en particular de preferencia trigo o cebada, así como también las porciones transgénicas de las plantas y su material transgénico de propagación, similar a los protoplastos, células vegetales, callos, semillas, tubérculos o cortes, así como también la descendencia transgénica de las plantas. Sin embargo, la región promotora de acuerdo con la presente invención también se puede utilizar en otros poa cea e (céspedes aromáticos), similars por ejemplo, a los pastos para comer, para generar las plantas correspondientes que tienen la expresión de transgenes epidermis-específica. Los genes para la producción de ceras epicuticulares también se pueden expresar bajo el control del promotor epidermis-específico de acuerdo con la presente invención para aumentar la tolerancia a la sequedad de las plantas. Además, los genes para la producción de antocianinas u otras sustancias absorbentes de UV para aumentar la resistencia a UV también se pueden expresar bajo el control del promotor de acuerdo con la presente invención. Como resulta de lo anterior, los genes de resistencia a patógenos se expresan de preferencia bajo el control del promotor de acuerdo con la presente invención.

Las bacterias, virus, y hongos, que infectan plantas y por lo tanto influyen negativamente en el metabolismo de la planta, entre otros, se denominan como patógenos vegetales. Entre estos patógeno vegetales se encuentran los hongos, entre otros, provocan enfermedades por moho y rompimiento del tallo en plantas de cereal como el trigo y cebada. Dependiendo del grado de infección, estas enfermedades pueden provocar considerables pérdidas de rendimiento (hasta 50%) . Tradicionalmente, las enfermedades de plantas mencionadas anteriormente y adicionalmente hongos se controlan por medio de fungicidas que tienen las desventajas conocidas, como la percolación en el agua subterránea y la acumulación en la cadena alimenticia . Durante los últimos años, sin embargo, se identificaron diversos genes que son capaces de suministrar resistencia contra un agente específico o contra varios agentes. El término "suministro de resistencia a patógenos", como se utiliza en la presente, significa que las plantas, en las cuales se aumenta la expresión de los genes, son menos susceptibles a las infecciones con patógenos específicos en comparación con las plantas, en las cuales es normal la expresión de los genes. Entre los genes, que suministran resistencia a patógenos, se encuentran estos genes, cuya expresión se activa por la infección con un patógeno. Entre estos genes se encuentran las peroxidasas y oxalato oxidasas. Las oxalato oxidasas, que pertenecen a la familia de proteínas similares a germina, catalizan la oxidación del oxalato, mediante la cual se forma peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno actúa como microbicida y puede reforzar la lignificación de las paredes celulares, con lo cual se evita la invasión de plagas. Además, a bajas concentraciones se puede provocar la muerte de células extremadamente sensibles. Las peroxidasas utilizan ya sea oxígeno molecular o peróxido de hidrógeno con el fin de oxidar y con esto destoxificar los sustratos celulares . Los patógenos, contra los cuales la expresión de las oxalato oxidasas y peroxidasas en la epidermis de las plantas puede suministrar resistencia, por ejemplo comprenden: moho, furasium spp., ryn chospori um secal i s y pyrenofo ta t eres . Los genes adicionales que son capaces de suministrar resistencia contra patógenos son quitinasas, Ag-AFP, GSTAl, y WIRla. Por medio de la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica para las enzimas en la epidermis de plantas transgénicas con el auxilio de la región promotora de acuerdo con la presente invención, se pueden obtener plantas que tengan resistencia aumentada a patógenos. En contraste con los genes que suministran resistencia a patógenos, también existen genes planta-inherentes, que estimulan la invasión de un patógeno. Entre aquellos se encuentra el gen Mío, que codifica para un receptor de siete transmembranas, que parece estimular la invasión del hongo de moho en la epidermis. En este caso, es adecuado interferir con la expresión del gen Mío para evitar la invasión de hongos en la planta. Por ejemplo, esto se puede conducir con el auxilio del método de ARNi descrito anteriormente. El hecho de que la interferencia con la expresión del gen Mío es adecuada para evitar la invasión del hongo de moho en la planta se mostró in vi t ro en segmentos de hojas de cebada, que se bombardean con' las partículas de tungsteno, que se habían recubierto con Mlo-dsARN (Schweizer et al. (2000), Double-stranded RNA inferieres with gene function at the single-cell level in cereals, The Plant Journal, 24 (6), S. 895- 903) . Sin embargo, hasta la fecha no se había podido mostrar que la interferencia epidermis-específica con la expresión de Mío en plantas transgénicas tiene el mismo efecto. Los genes vegetales adicionales que suministran la interacción de un patógeno con la planta y por lo tanto pueden estimular la invasión de patógenos en la planta, son, por ejemplo, transportadores o invertinas de aminoácidos o azúcares. Los genes también son adecuados como blancos para la lentificación génica. De esta forma, la presente invención se relaciona con los métodos para generar plantas resistentes a patógenos, que comprende los pasos de: a) generar una molécula de ácido nucleico recombinante, en la cual el promotor de acuerdo con la presente invención se presenta en un enlace funcional con una secuencia de ácido nucleico que suministra resistencia a patógenos, b) transferir la molécula de ácido nucleico recombinante de a) a células vegetales y c) regenerar completamente las plantas transformadas y, si se desea, propagar las plantas.

De preferencia, la secuencia de ácido nucleico que suministra resistencia a patógenos es la región codificante de un_ gen de peroxidasa u oxalato oxidasa o una secuencia, que interfieren con el Mío ARN endógeno. Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención y se supone que no se deben interpretar como limitantes.

Figuras : 1) secuencia de ácido nucleico del promotor GSTAl (SEQ ID No.l) 2) secuencia de ácido nucleico del intrón WIRla (SEQ ID No.2) 3) secuencia de ácido nucleico de la región promotora preferida (SEQ ID No.3) 4) secuencia de ácido nucleico del ADNc TAPERO (peroxidasa) (SEQ ID No.4) 5) vector pPS41 para la expresión de TAPERO a) secuencia de ácido nucleico (SEQ ID No.5) b) vector ap 6) secuencia de ácido nucleico del ADNc germin 9f-2.8 (oxalato oxidasa) (SEQ ID No.6) 7) vector pPS24 para la expresión de germin a) secuencia de ácido nucleico (SEQ ID No.7) b) vector map 8) secuencia de la construcción Mlo-ARNi (SEQ ID No.8) 9) ARNi del vector pWIR5-TaMlo para la expresión de Mlo-ARNi a) secuencia de ácido nucleico (SEQ ID No.9) b) vector map 10) actividad de la oxalato oxidasa in si t u en plantas transgénicas pPS24 Hojas provenientes de plantas tipo silvestre Bobwhite (BW) y provenientes de las líneas transgénicas No.157 y No.170 se recortaron y se detectó la actividad de la oxalato oxidasa in si t u . Columna izquierda = reacción con el sustrato de oxalato; columna derecha = reacción control sin el sustrato de oxalato. La coloración violeta intenso indica la actividad de oxalato oxidasa en la epidermis de las líneas transgénicas. 11) detección del transgén TAPERO en plantas transgénicas pPS41 a) en la transferencia Northern Detección de la acumulación del ARN de TAPERO por medio de la hibridación de una muestra WIR3 para transferencias Northern provenientes de líneas transgénicas de trigo de la generación T2, que portan la construcción pPS41. En cada caso, 2 sublíneas de 4 líneas seleccionadas más el tipo silvestre (BW) se analizaron en la etapa adulta de las plantas. Hoja 1 = hoja señalizadora. Hojas 2 a 4 = envejecimiento cada vez mayor. La solución de ensayo TaGer-4 hibrida a un grupo de genes de trigo inducidos por tensión y se utilizó para probar los efectos secundarios pleiotrópicos de la sobre-expresión de TAPERO. No se encontró ningún efecto secundario significativo. EtBr = control de carga de los geles, teñidos con bromuro de etidio. b) en la transferencia Western Detección de la acumulación de la proteína TAPERO por medio de la reacción con anticuerpos sobre las transferencias Western de líneas de trigo transgénico de la generación de T2, que portan la construcción pPS41. El producto transgénico TAPERO tiene el tamaño esperado de 31 kD. En Bobwhite, la hoja 3, se puede observar una actividad basal aumentada del gen TAPERO. Hoja 1 = hoja señalizadora. Tinción Coomassie = control de carga de los geles, teñidos con azul Coomassie R 250. 12) detección de la expresión transgénica epidermis -específica A) por medio de análisis de transferencia Northern Detección de la acumulación de ARNm de la oxalato oxidasa (izquierda) y TaPERO (derecha) en la epidermis de la hoja de plantas transgénicas, que portan la construcción pPS24 o pPS41, por medio de soluciones de ensayo específicas. W = ARN proveniente de una hoja entera. E = ARN proveniente de la epidermis de la hoja. EtBr = gel teñido con bromuro de etidio como el control de carga; ARN 26S = hibridación después de la transferencia con una solución de ensayo contra el ARN ribosómico 26S como el control de carga. B) por medio del análisis de PCR inversa en tiempo real Se determinó la concentración del ARNm de TaPERO en la hoja entera y la epidermis de la línea transgénica No. 2013 (transformada con la construcción pPS41) . Los datos se normalizaron por medio de los genes control UBC expresados constitutivamente (enzima de conjugación con ubiquitina) y GAPDH ( gliceraldehído fosfato deshidrogenasa) . La expresión que permanece en la hoja entera proviene de la epidermis de la hoja superior no retirada y del floema (actividad secundaria del promotor) . C) por medio del análisis de PCR inversa en tiempo real Las plantas tipo silvestre (Bobwhite) y las líneas transgénicas No.2013 y No. 2151 (transformadas con la construcción pPS41) se analizaron en la etapa adulta de la planta. El promotor se expresó de manera importante, en particular, en las hojas y espinas. En los tallos y raíces, el transgén no se expresó o sólo débilmente. 13) examen de la resistencia al moho de las plantas transgénicas de pPS41 La hoja señalizadora de plantas adultas se cortó y se inoculó con moho del trigo en un análisis de hojas desprendidas junto con las plantas Bobwhite tipo silvestre. 7 días después de la inoculación, se evaluó la infección por moho. Se muestran los valores medios provenientes de 3 experimentos de inoculación independientes con plantas de la generación T2 y T3. La sublínea 2088/2 no expresa ningún TAPERO y no tuvo resistencia aumentada. Valor medio "sin lentificar" = valor medio de todas las líneas excepto 2088/2 y todos los experimentos. 14) activación del crecimiento de las plantas transgénicas pPS41 Las plantas de la generación T2 se mostraron junto con las plantas Bobwhite tipo silvestre y se fotografiaron en la fase adulta de las plantas. 15) examen de la resistencia al moho de las plantas transgénicas pWIR5-TaMlo-ARNi La hoja señalizadora de plantas adultas de la generación T2 se cortó y se inoculó con moho del trigo en un análisis con hojas desprendidas junto con las plantas Bobwhite tipo silvestre. 7 días después de la inoculación, se evaluó la infección de moho. En cada caso se probaron 2 sublíneas por línea.

Ejemplos : En los siguientes ejemplos, se condujeron los métodos estándar biológicos moleculares similares a transformación de E . col i , digestión por restricción, ligación, extracción de ADN, PCR, etc., como se conocen en la técnica, según Sambrook et al. (2001), vide supra. Para todas las reacciones de PCR, se utilizaron correcciones de pruebas de la polimerasa Pwo (Roche ) . 1) Generación de la construcción promotora proveniente del promotor GSTAl y el intrón (PPS18) de WIRla La generación se condujo en varios pasos vía las siguientes construcciones precursoras: pPSl, pPS3, pPS15. Todas las construcciones contuvieron el gen reportero GUS, de tal forma que se pudieran probar directamente en un análisis transitorio. pPSl: Un fragmento promotor de 1.9 kb del gen WIRla se cortó de un clon pBluescript recombinante por medio de PstI y se clonó en el sitio de restricción Ps tl de un cásete de expresión antes que gen GUS. El cásete de expresión se basó en pBluescript y contuvo el gen GUS seguido por el terminador de la transcripción del gen GSTAl de trigo. Debido a que el gen GUS y el terminador de la transcripción GSTAl ya no estuvieron contenidos en las construcciones finales utilizadas (véase el Ejemplo 2), se omite una descripción detallada de este cásete de expresión. La construcción resultante contuvo una fusión de WIRla::GUS traduccional. pPS3: Con los cebadores adaptadores 5' ATA TAT CTG CAG GGA GCC ACG GCC GTC CAC y 5' TAT CCC GGG CCC GTG CCT GGA CGG GAA, se generó un fragmento de PCR de aproximadamente 240 pares de bases y sus extremos se cortaron con Sma l y Ps tl (vía el Adaptador) . El clon WIRla genómico sirvió como el molde de PCR. El fragmento de PCR contuvo los últimos 15 aminoácidos del primer exón de WIRla y el intrón que incluye el aceptor de la zona de unión exón-intrón, y se ligó en pPSl, se cortó con PstI (parcialmente) y Sma l se purificó por medio de electroforesis en gel de agarosa. La estructura resultante contuvo una fusión WIRla::GUS traduccional con el intrón WIR1 antes del gen GUS. Además, se introdujo una supresón de los aminoácidos Nos. 18-35 del primer exón de WIRla para evitar la secreción de la proteína de fusión WlRla::GUS (mediante la eliminación del péptido señalado pPS15 : El promotor WIRla se reemplazó por un fragmento de PCR del promotor GSTAl. Con este fin, pPS3 se digirió (parcialmente) con Xhol y Sna l y la banda del vector se purificó por medio de electroforesis en gel de agarosa. El fragmento del promotor GSTAl de aproximadamente 2.3 kb de longitud se amplificó por medio de PCR con los cebadores adaptadores 5' ATA TAT CTC GAG TCT AGA ACT AGT GGA TCC y 5' ATA TAT TAC GTA GTT TGT CCG TGA ACT TCA del clon GSTA1 genómico y se cortó en los extremos con Xhol y SnaBl . El fragmento de PCR se ligó con la banda pPS3 eluida con gel, dando por resultado en una fusión traduccional del fragmento génico WIRla que contiene intrones con GUS bajo el control del promotor GSTAl. pPS18 : pPSl5 se digirió (parcialmente) con Ps tl y SnaBl , la banda del vector se purificó por medio de electroforesis en gel de agarosa y se ligó con un oligonucleótido de doble cadena (5' GTA CAC AGG CAG CTA GCT CTC GAA ACC TCG CTC GAA ACG CA más 5 ' CAT GTG TCC GTC GAT CGA GAG CTT TGG AGC GAG CTT TGC GT) . Esto reemplazó la porción del gen WIRla ubicado alrededor del inicio de la traducción (46 pares de bases en la dirección 5' a 53 pares de bases en la dirección 3' del inicio de la traducción) con 42 pares de bases del 5'UTR del gen WIRla sin el codón para el inicio de la traducción ATG . La construcción resultante contuvo una fusión transcripcional del fragmento génico WIRla que contiene intrones con GUS bajo el control del promotor GSTAl. 2) Generación de las construcciones utilizadas a) vector de expresión pPS24 (expresión de oxalato oxidasa bajo el control del promotor que acuerdo con la presente invención) Un fragmento Hindl l l / Sphl de 745 pares de bases de longitud del gen Gf-2.8 de trigo (oxalato oxidasa; No. de acceso M63223) que contiene el marco de lectura abierta total (ORF) se subclonó en el cásete de expresión vegetal pGYl, que dio por resultado en la construcción pGermin (descrita en Schweizer et al., 1999) . Para esta clonación, el fragmento de oxalato oxidasa se ligó en un vector intermediario para que tuviera la capacidad de ligar el fragmento por medio de los sitios de restricción BamEl y Ps tl en pGYl . A partir de pGermin, un fragmento S.maI/.EcoRI de aproximadamente 1 kb de longitud que contuvo el gen de oxalato oxidasa y el terminador CamV 35S, se ligó en el vector pPSld, fue un corte Smal / EcoRl y se purificó por medio de electroforesis en gel de agarosa. La construcción resultante contuvo una fusión transcripcional del fragmento génico WIRla que contiene intrones con el gen de oxalato oxidasa bajo el control el promotor GSTAl. Comparado con pPS18, la construcción ya no contuvo el terminador de la transcripción GSTAl, sino que el terminador de la transcripción del gen Cam V 35S. b) vector de expresión pPS41 (expresión TAPERO bajo el control del promotor de acuerdo con la presente invención) A partir de pWIR3 (que contiene una fusión transcripcional del promotor Cam V 35S y TAPERO; Schweizer et al., 1999), se aisló un fragmento TAPERO de aproximadamente 1.2 kb de longitud utilizando Sisal y PstI mediante digestión de restricción. El fragmento TAPERO se ligó en el vector pPS24 que se digirió (parcialmente) con Smal y Ps tl y se purificó por medio de electroforesis en gel de agarosa. Esto dio por resultado en una fusión transcripcional del fragmento génico WIRla que contiene intrones con el gen TAPERO (No. de acceso X56011) bajo el control del promotor GstAl, en el cual el gen de oxalato oxidasa se sustituyó por el gen TAPERO. Al igual que pPS24, pPS41 contiene el terminador de la transcripción del gen CamV 35S. c) vector expresión pWIR5-TaMlo-ARNi (expresión de la construcción Mlo-ARNi bajo el control del promotor de acuerdo con la presente invención) En primer lugar, el tercer intrón del gen de resistencia Mla l proveniente de cebada (aproximadamente 1.1 kb ) , que se subclonó en el vector pGEM Teasy, se aisló por medio de EcoRl y Ps ti y se ligó en el vector pBSw41 (derivado pBluescript con el ADNc de TaMl ol parcial, clonado por Candace Elliott dentro del alcance de su disertación; No. de acceso GenBank AF361933) que también fue un corte EcoRl y Ps tl . A partir de esta construcción, el intrón Mla l junto con una porción de la secuencia codificante del gen TaMl ol se aisló como un fragmento Ps t l /Ms cl de aproximadamente 1.55 kb (= fragmento 1) . Paralelo a esto, se amplificó un fragmento de aproximadamente 450 pares de bases por medio de PCR a partir del plásmido pBSw41 con los oligonucleótidos T3 (cebador de secuenciación estándar para pBluescript) y TaMlol-1 (5' GTC GCA TGC CTG TCC ACÁ CGA AAT GTG C 3 ' , Sphl , sitio de restricción subrayado) . Posteirormente , el fragmento de PCR se digirió por medio de las enzimas de restricción PstI y Sphl ( = fragmento 2) . El vector pPS24 (promotor + oxalato oxidasa, véase anteriormente) se abrió por medio de la digestión de restricción con Smal y Sphl y el fragmento génico de oxalato oxidasa, que se cortó, se desechó. Acto seguido, los fragmentos 1 y 2 descritos anteriormente se ligaron en el vector pPS24 de corte Sma l I Sphl en un ligación de tres componentes. En esta ligación, los extremos de los componentes de corte scl y Smal son compatibles, ambos se denominan extremos romos. La construcción resultante (ARNi de pTaMlol) contiene aproximadamente 300 pares de bases del gen TaMl ol , así como también' una secuencia polienlazante/adaptadora de aproximadamente 150 pares de bases como "repeticiones invertidas", separadas por el intrón Mlal . El control de esta unidad de transcripción está sujeto al promotor GSTAl. Anotación: El gen denominado en la presente como TaMl ol por razones históricas se denominó más tarde TaMl oAl (Elliott et al., 2002) . Mol. Plant Microbe Interact. 15: 1069-1077 (2002) . 3) Transformación de las plantas de trigo Se dejaron germinar plantas de trigo ( cv . Bobwhite) en fitocá aras durante 40 días a 15°C durante el día y 12°C durante la noche bajo condiciones de días cortos (10 h/d, aproximadamente 600 µE) y posteriormente en un invernadero a 18/16°C y un fotoperiodo de al menos 16 h. Las espinas ya sea se utilizaron inmediatamente o se almacenaron durante 5 días a 4°C. Los cariopses tomados de la espina se esterilizaron superficialmente durante 2 minutos con 70% de etanol y luego durante 15 a 20 minutos en 5% de solución de hipoclorito de sodio/0.1% de Tween 20 y finalmente se lavaron cuatro veces con agua estéril bidestilada. Los embriones verdes que tienen un tamaño de 0.5 a 1.5 mm se prepararon fuera de los cariopses bajo condiciones estériles y se colocaron en medio para inducción de callos en placas de Petri con su scutellum orientado hacia arriba (el medio básico de acuerdo con Murashige Skoog (1962) con 2 mg/1 2,4-D, 40 g de maltosa monohidratada, 500 mg/1 de L-glutamina, 100 mg/1 de hidrolizado de caseína, 5 µM de CUS04 y 0.25% de fitagel) . Los cuitivos se incubaron en la oscuridad a 25°C. La transformación biolística se condu o de cinco a siete días después de aislar los embriones. Cuatro a seis horas antes del borbardeo de partículas, los embriones que ya estaban en proliferación se transfirieron a un nuevo medio que tuvo un potencial reducido de agua (como anteriormente, suplementado con manitol 0.3 M) y se incubaron en la oscuridad a 25°C. El plásmido pAHC20 (Christensen y Quail 1996) , que contiene el gen bar que codifica para fosfinotricina acetiltransferasa , se mezcló en una proporción molar de 1:1 con un vector que será cotransformado . En total, lOµl de la solución de ADN del plásmido se precipitaron luego sobre las partículas de 25 µl de 60 mg/1 de la suspensión dorada. Para un bombardeo, se aplicaron 30 µg de partículas en 5 µl de etanol sobre un microportador . El bombardeo se condujo de acuerdo con las especificaciones del fabricante de DuPont PDS-1000/He. Doce a 16 horas después del bombardeo de partículas, las explantaciones se transfirieron al nuevo medio para inducción de callos (al igual que para el precultivo de embriones) y se incubaron durante 10 días en la oscuridad a 25°C. Los callos luego se transfirieron al medio de diferenciación (el medio básico de acuerdo con Murashige y Skoog (1962) con 20 g/l de sacarosa, CuS04 5 µM, 0.25% de fitagel y 3 mg/1 de bialafos) y se incubaron con un fotoperiodo de 16 h a 200 µE y 25°C.

Después de 2 semanas, la transferencia de los callos sin broncear para el medio de regeneración (el medio básico según Murashige y Skoog (1962) con 20 g/l de sacarosa, 0.25% de fitagel y 4 mg/1 de bialafos) y se condujo una incubación adicional con un fotoperiodo de 16 h a 200 µE y 25°C. Después de otras 2 semanas, los retoños crecidos se adelgazaron, se transfirieron a tubos de cultivo que contienen el medio de regeneración y se cultivaron adicionalmente con un fotoperiodo de 16 h a 200 µE y 25°C. La identificación de los regenerados transgénicos se dirigió por medio de la prueba de actividad PAT de los extractos de hojas de acuerdo con Spencer et al. (1990) o por medio de la amplificación de las secuencias transgén-específicas a partir del ADN genómico de las plantas candidato y/o transferencia Southern con el uso de una solución de ensayo correspondiente. Dependiendo de la calidad del material básico, la eficacia de transformación del método sumada a 0.5 a 3 plantas transgénicas por 100 embriones cultivados. 4) Actividad de oxalato oxidasa in si t u en plantas que tienen la construcción pPS24 Los segmentos de hojas de plantas Bobwhite silvestre o de plantas de trigo transgénico pPS24 de la generación T3 se infiltraron al vacío con la solución para detección de oxalato oxidasa (ácido oxálico 2.5 mM, EDTA libre 3.5 mM, 0.6 mg/ml de 4-cloro-1-naftoi , 50 µg/ml de peroxidasa de rábano picante, 20% de etanol v/v, ajustado a pH 4.0 por medio de base Tris) y se incubaron durante la noche a +37°C. Después de la eliminación de la solución para detección, las hojas se incubaron durante otras 24 h a +4°C en H20. Posteriormente, las hojas se desmenuzaron manualmente en segmentos delgados y se redujeron a tamaño microscópico. Se conjudo una microscopía con luz de contraste en fase en un Zeiss Axiofot a un aumento de 100 veces. Las células con la expresión de oxalato oxidasa tienen paredes celulares teñidas de color violeta. 5) Detección del transgén TAPERO en plantas transgénicas pPS41 por medio de análisis de transferencia Northern Las hojas de plantas Bobwhite y de las plantas transgénicas pPS41 de la generación T2 (aproximadamente 1 g de peso en fresco en cada caso, FW) , ambos en la fase de hojas señalizadoras, se homogeneizaron en nitrógeno líquido hasta que se formó un polvo fino. El polvo se agregó a 3 ml de amortiguador extracción de ARN (Tris 0.5 M Cl pH 8.0; Na-EDTA 0.25 M; 5% (p/v) SDS) y 1.5 ml de fenol saturado con el amortiguador (tubos de plástico de 15 ml ) y se agitó bien. Los extractos se sometieron a centrifugación durante 30 min a 4000 rpm-5000 rpm, 20°C (balanceo, Heraeus Varifuge) . Se agregaron 1.5 ml de cloroformo (sin drenar el sobrenadante) y el tubo se invirtió varias veces. Los extractos se volvieron a centrifugar durante 30 min a 4000 rpm-5000 rmp, 20°C, y el sobrenadante se vació cuidadosamente en un nuevo tubo (tubo de plástico de 15 ml ) . El ARN se precipitó al agregar 3 ml de LiCl 6 M (durante la noche, 4°C) . El ARN precipitado se centrifugó durante 30 min a 12,500 rpm, 4°C (rotor fijo, Hermle Z360K) se extrajeron los granulos de ARN en 500-1000 µl de 70% de etanol (el ARN no se disolvió) y se transfirió a tubos Eppendorf . Las muestras se sometieron a centrifugación durante 10 min a 14,000 rpm, 4°C (rotor fijo, Eppendorf Centrifuge 5417R), y el sobrenadante se extrajo por filtración. Los granulos de ARN se secaron durante 5 min a 37°C, se extrajeron en 100 µl hasta 200 µl TE, y se disolvieron durante 5 a 10 min a 75°C. Se conducjo la desnaturalización en electroforesis en gel de agarosa del ARN en geles que contienen formaldehído y la transferencia a membranas de nylon (Hybond N, Amersham) de acuerdo con los protocolos estándar (Sambrook et al., vide supra) . Se aplicaron por muestra 10 µg de ARN. El etiquetado de la solución de ensayo radiactivo con 32P-dCTP se condujo de acuerdo con el método de etiquetado aleatorio utilizando un equipo (Roche) . La hibridación se condujo durante la noche a 65°C en amortiguador CHURCH (fosfato de Na 0.5 M pH 7.2; 1% (p/v) BSA; 7% (p/v) SDS; Na2ETDA 1 mM) . Las transferencias se lavaron dos veces durante 15 min en solución de lavado (0.1 x SSC; 0.1 5 p/v) SDS) a 65°C y posteriormente se expusieron durante 16 a 48 h contra pantallas formadoras de imágenes con fósforo. Las pantallas expuestas se examinaron por medio de un dispositivo formador de imágenes con fósforo (FujiFil FLA 3000) y se exportaron como archivos de imagen en formato TIFF. 6) Detección del transgén TAPERO en plantas transgénicas pPS41 por medio de análisis de transferencia Western Las puntas de las hojas de plantas Bobwhite y de plantas transgénicas pPS41 de la generación T2, ambas en etapa de hoja señalizadota, se homogeneizaron en amortiguador IWF (fosfato de Na 32 mM; citrato 84 mM; pH 2.8; polivinilpolipirrolidona con punta de espátula) . Los homogenatos se sometieron a centrif gación durante 15 min a 13,000 rpm y 4°C. Los sobrenadantes se mezclaron con 0.5 g/ml de acetato de amonio y las proteínas solubles en ácido se precipitaron durante la noche a 4°C. Las proteínas se sometieron a centrifugación durante 30 min a 13,000 rpm y 4°C. Los granulos de proteína se extrajeron en 50 µg/1 de amortiguador para re-suspensión con FG (Tris-Cl 50 mM pH 7.5; 20% (v/v) de glicerol) . Se agregaron 5 µl del amortiguador de muestra concentrado 4 veces a 20 µl de la muestra y las muestras se mezclaron con (1-5 µl) de solución Tris saturada hasta que el color de azul bromofenol cambió a azul. Para cada línea, 12.5 µl de la muestra hervida se separaron en electroforesis en gel de poliacrilamida SDS desnaturalizada (15% de gel de separación) de acuerdo con un método estándar utilizando equipo mini-gel por Bio-Rad . Después de la electroforesis, los geles ya sea se tiñeron con Coomassie (como el control de carga) o se transfirieron de acuerdo con un método estándar a una membrana de nitrocelulosa (transferencia) . De acuerdo con un método estándar, las membranas se incubaron con un primer anticuerpo policlonal (dilución 1:2000) que se dirigió contra la proteína Prx8 proveniente de cebada (una proteína homólogo para TAPERO) , seguida por el segundo anticuerpo (dilución 1:2000), que se dirigió contra anticuerpos de conejo y a los cuales se acopló la fosfatasa alcalina. Las bandas de la proteína TAPERO se detectaron por medio de la actividad de fosfatasa alcalina localizada (soluciones para tinción BCIP/NBT; tabletas prefabricadas (Roche) ) . 7) Detección de la expresión transgénica epidermis-específica por medio de análisis de transferencia Northern y análisis de PCR en tiempo real La extracción de ARN y el análisis de transferencia Northern se condujeron como se describió en el Ejemplo 5. El análisis de PCR en tiempo real se condujo por medio de un dispositivo LightCycler® (Roche, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

B) resistencia al moho en plantas transgénicas pPS41 o pWIR5-TaMlo-ARNi Para la prueba de resistencia, se utilizaron plantas transgénicas adultas de trigo pPS41 o pWIR5-TaMlo-ARNi que habían crecido en el invernadero y tuvieron una hoja señalizadota recién crecida desarrollada totalmente. De manera simultánea las plantas tipo silvestre crecidas cv. Bobwhite sirvieron como controles. La mitad apical de la hoja señalizadora se cortó y se distribuyó en 0.5% (p/v) de fitoagar, que se mezcló con 20 ppm de benzimidazol en placas de policarbonato de 20 x 20 centímetro de largo. Se distribuyó por placa una sublinea transgénica (de 20 hojas cada una) más el tipo silvestre Bobwhite (6 hojas cada una) . Los segmentos de hojas se inocularon con esporas de moho un medio de inoculación por medio de esporas flotando de 4 hojas de trigo bastantes inoculadas en la torre. Después de 5 min, se retiraron las placas, se sellaron, y se incubaron a 20°C en luz de día indirecta. Siete días después de la inoculación, se evaluó la infección por moho utilizando un sistema de evaluación clásico (Schweizer et al., 1995) . La resistencia se calculó con referencia a las hojas control ubicadas en cada placa de fitoagar respectiva .

Literatura : Christensen y Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218. Elliott et al., (2002) . Molecular Plant Microte Interactions 15: 1069-1077. Murashige y Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15: 473-497. Schweizer, P., Vallélian-Bindschedler , L., y Mdsinger, E., (1995) . Heat-induced resistance in barley to the powdery mildew fungus Erysiphe gramin i s f.sp. hordei , Physiological and Molecular Plant Pathology 4 7, 51-66. Schweizer, P., Pokorny, J., Abderhalden, O., y Dudler, R., (1999) . A transient assay system for the functional assessment of defense-related genes in wheat, Mol Plant-Microbe Interact 12 , 647-654. Spencer et al. (1990) TAG 79: 625-631.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES 1. Una región promotora que tiene especificidad para la epidermis de una planta, que comprende una primera secuencia que se origina del promotor génico del gen GSTA1 y una segunda secuencia que se origina del intrón del gen WIRla.
2. 2. La región promotora según la reivindicación 1,, caracterizada porque la primera se cuencia es la SEQ ID No.l y la segunda secuencia es la SEQ ID No. 2.
3. 3. La región promotora según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de a) regiones promotoras que comprenden la secuencia de ácido nucleico proporcionada en la SEQ ID No.3, b) regiones promotoras que comprenden una porción funcional de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en la SEQ ID No. 3. y c) regiones promotoras que tienen una secuencia, que se hibrida bajo condiciones severas con la secuencia de ácido nucleico proporcionada en la SEQ ID No .3.
4. 4. Un gen quimérico, caracterizado porque contiene una región promotora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en enlace funcional con una secuencia codificante .
5. 5. El gen quimérico según la reivindicación 4, caracterizado porque su expresión da por resultado en un rendimiento aumentado de la proteína codificada por la secuencia codificante en la epidermis .
6. 6. El gen quimérico según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque la región codificante se origina de un gen de resistencia.
7. 7. El gen quimérico o la molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque la secuencia codificante codifica para una peroxidasa o una oxalato oxidasa.
8. El gen quimérico según la reivindicación caracterizado porque su expresión suprime la expresión del gen endógeno correspondiente en la epidermis .
9. 9. El gen quimérico según la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia codificante está en orientación antisentido.
10. 10. El gen quimérico según la reivindicación caracterizado porque la supresión de la expresión del gen endógeno resulta de la interferencia con ARN.
11. 11. El gen quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque el gen cuya expresión se suprime es el gen Mío.
12. 12. La molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende una región promotora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un gen quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11.
13. 13. La molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 12, que comprende además secuencias para la terminación de la transcripción.
14. 14. Un método para generar plantas transgénicas con la expresión epidermis-específica de un transgén, que comprende los pasos de: a) generar una molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 12 ó 13, b) transferir la molécula de ácido nucleico recombinante de a) a células vegetales y c) regenerar completamente las plantas transformadas y, si desea, propagar las plantas.
15. 15. Las plantas transgénicas, que contienen una molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 12 ó 13 o generadas de acuerdo con un método según la reivindicación 14, así como también las porciones transgénicas de las plantas y su material transgénico de propagación, como los protoplastos, células vegetales, callos, semillas, tubérculos o cortes, así como también la descendencia transgénica de la planta.
16. 16. Las plantas transgénicas según la reivindicación 15, en donde las plantas son plantas monocotiledóneas .
17. 17. Las plantas transgénicas según la reivindicación 16, en donde las plantas son poa cea e .
18. 18. Las plantas transgénicas según la reivindicación 17, en donde las plantas son trigo o cebada .
19. 19. El uso de una región promotora según una de las reivindicaciones 1 a 3 para la expresión epidermis-específica de transgenes en plantas.
20. 20. El uso según la reivindicación 19, en donde el transgén es un gen de resistencia.
21. 21. Un método para aumentar la resistencia a patógenos en plantas transgénicas, que comprende los pasos de: a) generar una molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 12 ó 13, b) transferir la molécula de ácido nucleico recombinante de a) a células vegetales y c) regenerar completamente las plantas transformadas y, si desea, propagar las plantas.
22. 22. Las plantas transgénicas con resistencia aumentada a patógenos, que contiene una molécula de ácido nucleico recombinante según una de las reivindicaciones 12 a 13 o generadas de acuerdo con un método según la reivindicación 21, así como también las porciones transgénicas de las plantas • y su material transgénico de propagación, como protoplastos, células vegetales, callos, semillas, tubérculos o cortes, así como también la descendencia transgénica de la planta.
23. 23. Las plantas transgénica según la reivindicación 22, en donde las plantas son plantas monocotiledóneas .
24. 24. Las plantas transgénicas según la reivindicación 23, en donde las plantas son poa cea e .
25. 25. Las plantas transgénicas según la reivindicación 24, en donde las plantas son trigo o cebada .
26. 26. Las plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, caracterizadas porque las mismas exhiben una resistencia aumentada contra el moho.