KR20220116173A - 밀의 게놈에의 dna 또는 돌연변이의 정확한 도입 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 게놈 편집 분야에 대한 것이고, 밀의 게놈 DNA에서 표적화된 정확한 변형의 원활한 도입 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 게놈 편집 분야에 대한 것이고, 밀의 게놈 DNA에서 표적화된 정확한 변형의 원활한 도입 방법에 관한 것이다.
밀은 세계적으로 가장 중요한 작물 중 하나이다. 2017년도에 세계적인 밀 생산량은 7억 3000만 톤이었고, 2019년도 생산량은 7억 6600만 톤으로 예측되어, 옥수수 다음으로 두번째로 가장 많이 생산되는 곡물이 되었다. 1960년도 이래로, 밀 및 다른 곡물의 세계적인 생산량은 3배가 되었고, 21세기 중반까지 추가로 증가할 것으로 예상된다. 세계적인 밀 수요는 세계 인구 증가 및 글루텐 단백질의 독특한 점탄성 및 부착성으로 인해 증가하고 있다.
밀 수율을 추가로 증가시키기 위해서는, 최근에 개발된 CRISPR Cas 기술을 이용하여 유전자 편집, 유전자 대체 또는 유전자 스태킹과 같은 기술이 밀에 적용되어야 한다.
그러나, 각각 4배체 및 6배체인 듀럼 및 브레드 밀의 배수성, 및 형질전환 및 재생에 관한 밀의 저항으로 인해, 이러한 기술의 적용이 번거롭다.
관련 기술분야에서 이중 가닥 DNA 파단을 유도함으로써 밀 게놈에의 InDel의 도입을 기재하는 공보가 거의 없으며, 어떠한 공보도 예를 들어 공여자 DNA를 사용하여 신규 유전자, 조절 요소, 구축물 등을 포함하는 유전자 편집 또는 신규 DNA 서열의 직접적이고 정확한 도입을 기재하지 않는다. 예를 들어 [Kumar et al. (2019) Molecular Biology Reports]를 참고한다.
[Svitashev et al (2015) Plant Physiology 169 pp 931-945]는 Cas9 뉴클레아제를 사용하여 표적 영역에 상동성인 대략 1kb DNA 단편에 5' 및 3' 연결된 공여자 DNA를 옥수수 식물의 게놈에 도입하는 것을 기재하며, 상동성 재조합 사건의 4.1% 효율을 주장한다.
[Li et al (2016) Nature Plants 2:16139]는 유전자 대체 또는 유전자 삽입 접근법을 위해 벼 식물의 게놈에 공여자 DNA를 도입하는 것을 기재하며, 공여자 DNA는 표적 영역에 상동성인 23개 염기 DNA 단편에 5' 및 3' 연결되며, 각각 2.0% 및 2.2% 효율을 주장한다. 그러나, 이들은 공여자 DNA의 삽입을 위해 상동성 재조합 (HR) 대신에 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)에 의존하여, 이는 삽입 부위 근처에서 예측 불가능한 InDel의 높은 백분율을 초래한다.
[Zhang et al. (2016) Nature Communications 7:12617, Zhang et al. (2017) Plant Journal 91, 99714-724, Howells et al (2018) BMC Plant Biology 18:215 및 Kumar et al (2019) Molecular Biology reporter 46, pp 3557-3569]는 모두 게놈 최적화를 위해 밀에서 Cas9 또는 Cpf1 뉴클레아제의 적용을 기재하지만, 이들 모두 공여자 DNA를 절단하지 않고 이중 가닥 파단의 유도에 의한 InDel의 도입을 기재하며, 이중 가닥 파단은 후속적으로 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ에 의해 복구되어, HR에 의한 공여자 DNA로부터의 서열을 밀 게놈에 도입되지 않는다. [Ran et al (2018) Plant Biotechnology Journal 16, pp 2088-2101]은 ZFN에 의해 유도된 DSB의 NHEJ에 의해 밀에서의 정밀 게놈 편집을 기재한다. 각각의 공여자 DNA는 특이적인 5' 오버행을 갖도록 생성되어, ZFN에 의해 생성된 DSB로 공여자 DNA의 오류가 없는 라이게이션을 용이하게 하였다. 이 전략은 내인성 AHAS 유전자와 프레임 내에서 새로운 AHAS 서열의 표적화된 삽입에 의해 AHAS 유전자에서 S653N 돌연변이의 도입을 가능하게 하여, 내인성 서열의 복제를 유도하였다. 이 전략은 또한 내인성 AHAS 서열을 새로운 AHAS 서열로 대체하기 위해 사용되었지만, AHAS 서열의 원활한 대체는 유도하지 않았다.
본 발명자들은 밀에서 상동성 재조합에 의한 내인성 서열의 원활한 대체를 기재한다.
CRISPR 기술을 이용하여 밀의 게놈의 표적 영역에 공여자 DNA의 효율적이고 신뢰할 수 있는 도입이 관련 기술분야에서 요구된다.
본 발명의 제1 실시양태는 하기 단계를 포함하는, 밀의 게놈의 표적 영역에 적어도 하나의 공여자 DNA 분자를 정확하게 도입하는 방법을 포함한다:
a. 밀 세포, 바람직하게는 미성숙 배아의 밀 세포에 하기를 도입하는 단계:
i. 적어도 하나의 공여자 DNA 분자 및
ii. 적어도 하나의 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제 및
iii. 적어도 하나의 단일 가이드 RNA (sgRNA) 또는 tracrRNA 및 crRNA, 및
b. 게놈의 상기 표적 영역에 상기 적어도 하나의 공여자 DNA를 도입할 수 있도록 밀 세포를 인큐베이션하는 단계, 및
c. 상기 표적 영역에서 공여자 DNA 분자의 서열을 포함하는 밀 세포를 선택하는 단계,
여기서 공여자 DNA는 표적 영역에서의 서열과 각각 적어도 80% 동일한 그의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 30개의 염기에 기능적으로 연결된다.
공여자 DNA는 예를 들어 밀 게놈의 표적 영역에 물리적으로 도입될 수 있거나 또는 폴리머라제에 대한 주형으로서 작용할 수 있다. 이는 밀 게놈 또는 표적 영역에 대해 이종성인 재조합 조절 요소, ORF 또는 발현 구축물을 포함하는 재조합 DNA일 수 있다. 이는 게놈에 부가되어 게놈 크기를 증가시킬 수 있거나, 또는 이는 공여자 DNA와 대략 동일한 길이인 표적 영역의 일부를 대체할 수 있다. 이는 대체된 게놈 DNA와 비교하여 단지 1개 또는 소수의 돌연변이를 포함하는 표적 영역의 대체된 게놈 DNA와 고도로 상동성인 서열을 포함할 수 있으며, 이로써 밀 게놈에 정확한 유전자 편집을 도입할 수 있다.
밀 세포는 브레드 밀 식물 (트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)), 일립계 밀 (티. 모노코쿰(T. monococcum)), 듀럼 밀 (티. 듀럼(T. durum)), 에머 밀 (티. 디코코이데스(T. dicoccoides)) 또는 임의의 다른 밀 종으로부터 유래될 수 있다. 이는 동종교배 밀, 잡종 밀 또는 랜드레이스일 수 있다.
밀 세포의 게놈에의 공여자 DNA의 도입을 가능하게 하는 밀 세포의 인큐베이션은 밀 세포의 생존력을 유지하는데 유리한 임의의 조건에서 일어날 수 있다. 온도는 예를 들어 사용되는 RNA 가이딩된 뉴클레아제에 따라 바람직하게는 20℃ 내지 32℃이다. Cas9와 관련하여, 온도는 바람직하게는 18℃ 내지 30℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 28℃, 가장 바람직하게는 22℃ 내지 26℃이다. Cas12a와 관련하여, 온도는 바람직하게는 22℃ 내지 32℃, 더욱 바람직하게는 24℃ 내지 30℃, 가장 바람직하게는 28℃ 내지 30℃이다.
세포는 바람직하게는 16h 명/8h 암 조건하에, 바람직하게는 약광 조건하에, 더욱 바람직하게는 암실에서 인큐베이션된다. 인큐베이션 시간은 상기 조건하에 1 일 내지 7 주, 바람직하게는 5 주 내지 7 주이다.
RNA 가이딩된 뉴클레아제는 각각 어닐링된 crRNA 및 tracrRNA 또는 단일 가이드 RNA에 의해 표적 부위로 가이딩된다. 표적 부위는 사용된 RNA 가이딩된 뉴클레아제에 대해 특이적인 PAM 서열에 인접해 있다.
RNA 가이딩된 뉴클레아제 대신에 2개의 RNA 가이딩된 닉카제가 이중 가닥 파단을 도입하기 위해 사용되는 경우, 적어도 2개의 어닐링된 crRNA 및 tracrRNA 또는 적어도 2개의 단일 가이드 RNA 또는 적어도 하나의 어닐링된 crRNA 및 tracrRNA 및 적어도 하나의 단일 가이드 RNA가 밀 세포에 도입되고, 이들 각각은 각각의 닉카제를 PAM 서열에 인접한 그의 표적 부위로 표적화시킨다.
한 실시양태에서, 공여자 DNA는 표적 영역에서의 서열과 각각 적어도 80% 동일한 그의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 30개의 염기에 기능적으로 연결되고, 바람직하게는 공여자 DNA는 그의 5' 및 3' 말단에서 이러한 서열에 기능적으로 연결된다. 바람직하게는, 공여자 DNA의 적어도 한 측에서, 바람직하게는 공여자 DNA의 양측에서의 서열은 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개의 염기를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 공여자 DNA의 적어도 한 측에서, 바람직하게는 공여자 DNA의 양측에서의 서열은 적어도 150개의 염기, 적어도 200개의 염기, 적어도 300개의 염기, 적어도 350개의 염기 또는 적어도 400개의 염기를 포함한다. 이들 염기는 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제에 의해 도입된 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및 3' 영역과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 바람직하게는 91%, 92%, 93% 또는 94% 동일하다. 더욱 바람직하게는, 이들 염기는 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제에 의해 도입된 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및 3' 영역과 적어도 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나 또는 99% 동일하다. 가장 바람직한 실시양태에서, 이들 염기는 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제에 의해 도입된 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및 3' 영역과 100% 동일하다.
한 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 30개의 염기는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 100% 동일하고, 공여자 DNA 또는 그의 서열은 게놈 DNA에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 40 또는 50개의 염기는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 적어도 98% 동일하다. 추가의 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 60 또는 70개의 염기는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 적어도 95% 동일하다. 바람직한 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 80 또는 90개의 염기는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 적어도 92% 동일하다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 100개의 염기는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 적어도 90% 동일하다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 150 또는 200개의 염기는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 적어도 85% 동일하다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 250, 300, 350 또는 400개는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 적어도 80% 동일하다.
본 발명의 한 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 단일 가닥이고, 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 이중 가닥이다. 한 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 10개 이하의 뉴클레오티드 길이이거나, 또 다른 실시양태에서, 이는 20, 30 40 또는 50개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 60, 70, 80, 90 또는 100개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 125, 150, 200, 300, 400 또는 500개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 또는 1500개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 또는 5000개 이하의 뉴클레오티드 길이이다.
한 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 밀 게놈의 표적 영역에 부가되고, 게놈 DNA를 대체하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 공여자 DNA 분자보다 짧거나, 그와 동일한 크기이거나 또는 그보다 긴 밀 게놈의 표적 영역에서의 서열을 대체한다.
한 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 밀 게놈의 표적 영역에 존재하지 않는 서열을 포함한다. 밀 게놈의 표적 영역에서 이러한 DNA 분자의 도입에 의해 조절 영역, 예컨대 프로모터, 인트론, 인핸서 또는 종결자를 포함할 수 있는 추가의 DNA가 밀 게놈에 부가되고, 이는 전사된 영역, 예컨대 ORF를 포함할 수 있거나 또는 비코딩 RNA, 예컨대 마이크로RNA 전구체, 긴 비코딩 RNA 등을 코딩할 수 있거나 또는 이는 하나 이상의 발현 구축물을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 밀 게놈의 표적 영역과 상동성인 서열을 포함하지만, 밀 게놈의 표적 영역에서 WT 서열과 상이한 하나 이상의 정확한 유전자 편집을 포함한다. 이러한 공여자 DNA 분자는 밀 게놈에서 상응하는 서열을 대체하여, 밀 게놈에 정확한 유전자 편집을 도입한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 하기 단계를 포함하는, 게놈의 표적 영역에서 공여자 DNA를 포함하는 밀 식물을 생성하는 방법을 포함한다:
a. 밀 세포, 바람직하게는 미성숙 밀 배아의 세포에 하기를 도입하는 단계:
i. 적어도 하나의 공여자 DNA 및
ii. 적어도 하나의 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제 및
iii. 적어도 하나의 단일 가이드 RNA (sgRNA) 또는 tracrRNA 및 crRNA, 및
b. 게놈의 표적 영역에 상기 적어도 하나의 공여자 DNA를 도입할 수 있도록 밀 세포를 인큐베이션하는 단계
c. 상기 표적 영역에서 공여자 DNA 분자의 서열을 포함하는 밀 세포를 선택하는 단계, 및
d. 상기 선택된 밀 세포로부터 밀 식물을 재생시키는 단계,
여기서 공여자 DNA는 표적 영역에서의 서열과 각각 적어도 80% 동일한 그의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 30개의 염기에 기능적으로 연결된다. 공여자 DNA는 예를 들어 밀 게놈의 표적 영역에 물리적으로 도입될 수 있거나 또는 폴리머라제에 대한 주형으로서 작용할 수 있다. 이는 밀 게놈 또는 표적 영역에 대해 이종성인 재조합 조절 요소, ORF 또는 발현 구축물을 포함하는 재조합 DNA일 수 있다. 이는 게놈에 부가되어 게놈 크기를 증가시킬 수 있거나, 또는 이는 공여자 DNA와 대략 동일한 길이인 표적 영역의 일부를 대체할 수 있다. 이는 대체된 게놈 DNA와 비교하여 단지 1개 또는 소수의 돌연변이를 포함하는 표적 영역의 대체된 게놈 DNA와 고도로 상동성인 서열을 포함할 수 있으며, 이로써 밀 게놈에 정확한 유전자 편집을 도입할 수 있다.
밀 세포는 브레드 밀 식물 (트리티쿰 아에스티붐), 일립계 밀 (티. 모노코쿰), 듀럼 밀 (티. 듀럼), 에머 밀 (티. 디코코이데스) 또는 임의의 다른 밀 종으로부터 유래될 수 있다. 이는 동종교배 밀, 잡종 밀 또는 랜드레이스일 수 있다.
밀 세포의 게놈에의 공여자 DNA의 도입을 가능하게 하는 밀 세포의 인큐베이션은 밀 세포의 생존력을 유지하는데 유리한 임의의 조건에서 일어날 수 있다. 온도는 예를 들어 사용되는 RNA 가이딩된 뉴클레아제에 따라 바람직하게는 20℃ 내지 32℃이다. Cas9와 관련하여, 온도는 바람직하게는 18℃ 내지 30℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 28℃, 가장 바람직하게는 22℃ 내지 26℃이다. Cas12a와 관련하여, 온도는 바람직하게는 22℃ 내지 32℃, 더욱 바람직하게는 24℃ 내지 30℃, 가장 바람직하게는 28℃ 내지 30℃이다.
세포는 바람직하게는 16h 명/8h 암 조건하에, 바람직하게는 약광 조건하에, 더욱 바람직하게는 암실에서 인큐베이션된다. 인큐베이션 시간은 상기 조건하에 1 일 내지 7 주, 바람직하게는 5 주 내지 7 주이다.
RNA 가이딩된 뉴클레아제는 각각 어닐링된 crRNA 및 tracrRNA 또는 단일 가이드 RNA에 의해 표적 부위로 가이딩된다. 표적 부위는 사용된 RNA 가이딩된 뉴클레아제에 대해 특이적인 PAM 서열에 인접해 있다.
RNA 가이딩된 뉴클레아제 대신에 2개의 RNA 가이딩된 닉카제가 이중 가닥 파단을 도입하기 위해 사용되는 경우, 적어도 2개의 어닐링된 crRNA 및 tracrRNA 또는 적어도 2개의 단일 가이드 RNA 또는 적어도 하나의 어닐링된 crRNA 및 tracrRNA 및 적어도 하나의 단일 가이드 RNA가 밀 세포에 도입되고, 이들 각각은 각각의 닉카제를 PAM 서열에 인접한 그의 표적 부위로 표적화시킨다.
한 실시양태에서, 공여자 DNA는 표적 영역에서의 서열과 각각 적어도 80% 동일한 그의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 30개의 염기에 기능적으로 연결되고, 바람직하게는 공여자 DNA는 그의 5' 및 3' 말단에서 이러한 서열에 기능적으로 연결된다. 바람직하게는, 공여자 DNA의 적어도 한 측에서, 바람직하게는 공여자 DNA의 양측에서의 서열은 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개의 염기를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 공여자 DNA의 적어도 한 측에서, 바람직하게는 공여자 DNA의 양측에서의 서열은 적어도 150개의 염기, 적어도 200개의 염기, 적어도 300개의 염기, 적어도 350개의 염기 또는 적어도 400개의 염기를 포함한다. 이들 염기는 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제에 의해 도입된 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및 3' 영역과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 바람직하게는 91%, 92%, 93% 또는 94% 동일하다. 더욱 바람직하게는, 이들 염기는 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제에 의해 도입된 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및 3' 영역과 적어도 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나 또는 99% 동일하다. 가장 바람직한 실시양태에서, 이들 염기는 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제에 의해 도입된 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및 3' 영역과 100% 동일하다.
한 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 30개의 염기는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 100% 동일하고, 공여자 DNA 또는 그의 서열은 게놈 DNA에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 40 또는 50개의 염기는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 적어도 98% 동일하다. 추가의 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 60 또는 70개의 염기는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 적어도 95% 동일하다. 바람직한 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 80 또는 90개의 염기는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 적어도 92% 동일하다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 100개의 염기는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 적어도 90% 동일하다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 150 또는 200개의 염기는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 적어도 85% 동일하다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 공여자 DNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 250, 300, 350 또는 400개는 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥 닉의 각각의 5' 및/또는 3' 영역과 적어도 80% 동일하다.
본 발명의 한 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 단일 가닥이고, 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 이중 가닥이다. 한 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 10개 이하의 뉴클레오티드 길이이거나, 또 다른 실시양태에서, 이는 20, 30 40 또는 50개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 60, 70, 80, 90 또는 100개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 125, 150, 200, 300, 400 또는 500개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 또는 1500개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 또는 5000개 이하의 뉴클레오티드 길이이다.
한 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 밀 게놈의 표적 영역에 부가되고, 게놈 DNA를 대체하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 공여자 DNA 분자보다 짧거나, 그와 동일한 크기이거나 또는 그보다 긴 밀 게놈의 표적 영역에서의 서열을 대체한다.
한 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 밀 게놈의 표적 영역에 존재하지 않는 서열을 포함한다. 밀 게놈의 표적 영역에서 이러한 DNA 분자의 도입에 의해 조절 영역, 예컨대 프로모터, 인트론, 인핸서 또는 종결자를 포함할 수 있는 추가의 DNA가 밀 게놈에 부가되고, 이는 전사된 영역, 예컨대 ORF를 포함할 수 있거나 또는 비코딩 RNA, 예컨대 마이크로RNA 전구체, 긴 비코딩 RNA 등을 코딩할 수 있거나 또는 이는 하나 이상의 발현 구축물을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 DNA 분자는 밀 게놈의 표적 영역과 상동성인 서열을 포함하지만, 밀 게놈의 표적 영역에서 WT 서열과 상이한 하나 이상의 정확한 유전자 편집을 포함한다. 이러한 공여자 DNA 분자는 밀 게놈에서 상응하는 서열을 대체하여, 밀 게놈에 정확한 유전자 편집을 도입한다.
추가의 실시양태에서, 밀 세포의 게놈에의 특이적인 서열의 정확한 도입, 또는 공여자 DNA를 포함하는 밀 식물 서열의 생성 방법을 위해, 단계 b. 후에 밀 세포를 선택 마커로도 지칭되는 선택 작용제를 포함하는 배지 상에서 인큐베이션한다.
음성 선택 마커는 살생물성 화합물, 예컨대 대사 억제제 (예를 들어, 2-데옥시글루코스-6-포스페이트, WO 98/45456), 항생제 (예를 들어, 카나마이신, G 418, 블레오마이신 또는 히그로마이신) 또는 제초제 (예를 들어, 포스피노트리신 또는 글리포세이트)에 대한 내성을 부여한다. 특히 바람직한 음성 선택 마커는 제초제에 대한 내성을 부여하는 것들이다. 이들 마커 중 일부는 마커로서 그들의 기능 외에도 생성된 식물에 제초제 내성 속성을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 언급될 수 있는 예는 다음과 같다:
- 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT; 비알로포스(Bialophos) 내성으로도 명명됨; bar; de Block et al. (1987) EMBO J 6:2513-2518; EP 0 333 033; US 4,975,374)
- 글리포세이트 (N-포스포노메틸 글리신)에 대한 내성을 부여하는 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS; US 5,633,435) 또는 글리포세이트 옥시도리덕타제 유전자 (US 5,463,175) (Shah et al. (1986) Science 233: 478)
- 글리포세이트 분해 효소 (글리포세이트 옥시도리덕타제; gox),
- 달라폰 불활성화 데할로게나제 (deh)
- 술포닐우레아- 및 이미다졸리논-불활성화 아세토락테이트 신타제 (예를 들어 S4 및/또는 Hra 돌연변이를 갖는 예를 들어 돌연변이된 ALS 변이체
- 브로목시닐 분해 니트릴라제 (bxn)
- 예를 들어 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 카나마이신- 또는 G418- 내성 유전자 (NPTII; NPTI) (Fraley et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:4803), 이는 항생제 카나마이신 및 관련 항생제 네오마이신, 파로모마이신, 겐타미신, 및 G418에 대한 내성을 부여하는 효소를 발현함,
- 2-데옥시글루코스에 대한 내성을 부여하는 2-데옥시글루코스-6-포스페이트 포스파타제 (DOGR1-유전자 산물; WO 98/45456; EP 0 807 836) (Randez-Gil et al. (1995) Yeast 11:1233-1240)
- 히그로마이신에 대한 내성을 매개하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT) (Vanden Elzen et al. (1985) Plant Mol Biol. 5:299).
- 디히드로폴레이트 리덕타제 (Eichholtz et al. (1987) Somatic Cell and Molecular Genetics 13, 67-76)
항생제에 대한 내성을 부여하는 박테리아 기원의 추가의 음성 선택가능한 마커 유전자에는 항생제 스펙티노마이신, 겐타마이신 아세틸 트랜스퍼라제, 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제 (SPT), 아미노글리코시드-3-아데닐 트랜스퍼라제 및 블레오마이신 내성 결정인자에 대한 내성을 부여하는 aadA 유전자가 포함된다 (Svab et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:197; Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86; Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171 (1986); Hayford et al. (1988) Plant Physiol. 86:1216).
음성 선택 마커, 예를 들어 효모 로도토룰라 그라실리스(Rhodotorula gracilis) (로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides))로부터의 다올 유전자 (EC: 1.4. 3.3: 진뱅크 수탁 번호: U60066) 및 이. 콜라이(E. coli) 유전자 dsdA (D-세린 데히드라타제 (D-세린 데아미나제) [EC: 4.3. 1.18; 진뱅크 수탁 번호: J01603)는 예를 들어 D-알라닌 및 D-세린과 같은 D-아미노산에 의해 부여된 독성 효과에 대한 내성을 추가로 부여할 수 있다 (WO 03/060133; Erikson et al. (2004) Nat Biotechnol. 22(4):455-8). 사용된 D-아미노산에 따라, D-아미노산 옥시다제 마커는 음성 선택 (예를 들어, D-알라닌 또는 D-세린과 조합될 때) 또는 대항 선택 (예를 들어, D-류신 또는 D-이소류신과 조합될 때)을 제공하는 이중 기능 마커로서 사용될 수 있다.
대안적으로, 양성 선택 마커가 본 발명의 방법에 적용될 수 있다. 이러한 양성 선택 마커는 형질전환되지 않은 것과 비교하여 형질전환된 식물에게 성장 이점을 부여한다. 시토키닌 생합성의 핵심 효소로서 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) (균주:PO22; 진뱅크 수탁 번호: AB025109)로부터의 이소펜테닐트랜스퍼라제와 같은 유전자는 형질전환된 식물의 재생을 용이하게 할 수 있다 (예를 들어, 시토키닌-무함유 배지에서 선택에 의해). 상응하는 선택 방법이 (Ebinuma et al. (2000a) Proc Natl Acad Sci USA 94:2117-2121; Ebinuma et al. (2000b) Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, In Molecular Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers)에 기재되어 있다. 형질전환되지 않은 것과 비교하여 형질전환된 식물에게 성장 이점을 부여하는 추가의 양성 선택 마커는 예를 들어 EP-A 0 601 092에 기재되어 있다. 성장 자극 선택 마커에는 글루쿠로니다제 (예를 들어 시토키닌 글루쿠로니드와 조합됨), 만노스-6-포스페이트 아이소머라제 (만노스와 조합됨), UDP-갈락토스-4-에피머라제 (예를 들어 갈락토스와 조합됨)가 포함될 수 있다 (그러나 이로 제한되지 않음).
대항 선택 마커는 상기 마커를 포함하는 정의된 결실된 서열을 갖는 유기체를 선택하는데 특히 적합하다 (Koprek et al. (1999) Plant J 19(6): 719-726). 대항 선택 마커에 대한 예에는 티미딘 키나제 (TK), 시토신 데아미나제 (Gleave et al. (1999) Plant Mol Biol. 40(2):223-35; Perera et al. (1993) Plant Mol. Biol 23(4): 793-799; Stougaard (1993) Plant J 3:755-761), 시토크롬 P450 단백질 (Koprek et al. (1999) Plant J 19(6): 719-726), 할로알칸 데할로게나제 (Naested (1999) Plant J 18:571-576), iaaH 유전자 산물 (Sundaresan et al. (1995) Gene Develop 9: 1797-1810), 시토신 데아미나제 codA (Schlaman and Hooykaas (1997) Plant J 11:1377-1385), 또는 tms2 유전자 산물 (Fedoroff and Smith (1993) Plant J 3:273- 289)이 포함된다.
본 발명의 방법에서, RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제는 임의의 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 닉카제일 수 있고, 바람직하게는 이들은 Cas 뉴클레아제 또는 Cas 닉카제이다. 숙련된 기술자는 관련 기술분야에 기재된 수많은 Cas 뉴클레아제 또는 Cas 닉카제를 알고 있다. 예를 들어, Cas9, Cas12a, Cas12b, CasX, CasY, C2c1, C2c3, C2c2, Cas12k 등.
또한, 새로운 Cas 뉴클레아제 또는 Cas 닉카제를 확인하는 방법은 (US9790490)에 기재되어 있으며, 숙련된 기술자는 아직 알려지지 않은 추가의 Cas 뉴클레아제 또는 Cas 닉카제를 단리할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, Cas 뉴클레아제 또는 Cas 닉카제는 Cas9 또는 Cas12a 뉴클레아제, 또는 Cas9 또는 Cas12a 닉카제, 또는 닉카제 활성, 예를 들어 FokI 닉카제에 융합된 dCas9 또는 dCas12a 융합 단백질이다 (US9200266).
본 발명의 방법의 추가의 실시양태에서, 적어도 하나의 뉴클레아제 또는 적어도 하나의 닉카제 또는 적어도 하나의 sgRNA 또는 적어도 하나의 crRNA 및 tracrRNA 중 적어도 하나는 핵산 분자에 의해 코딩되어 상기 세포에 도입된다. 상기 핵산 분자는 각각의 뉴클레아제, 닉카제, sgRNA, crRNA 및/또는 tracrRNA를 코딩하는 RNA 분자 또는 선형 DNA 분자일 수 있고, 바람직하게는 핵산 분자는 상기 적어도 하나의 뉴클레아제/닉카제 또는 적어도 하나의 sgRNA 또는 적어도 하나의 crRNA 및 tracrRNA를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 플라스미드이다.
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 뉴클레아제 또는 적어도 하나의 닉카제는 밀에서의 발현을 위해 최적화된 서열이다. 서열 최적화는 숙련된 기술자에게 공지된 기술이다. 임의의 주어진 DNA 또는 RNA 분자를 각각의 단백질이 발현되어야 하는 유기체의 바람직한 코돈 용법에 맞게 조정하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 일부 프로그램은 추가로 잠재 스플라이스 측의 돌연변이, RNA 폴딩의 감소 등을 가능하게 한다.
RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제 및 적어도 하나의 sgRNA 또는 적어도 하나의 crRNA 및 tracrRNA는 숙련된 기술자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 밀 세포에 도입될 수 있다. 아그로박테리움 매개된 형질전환, PEG, 지단백질 또는 다른 폴리펩티드를 사용하는 형질감염, 전기천공 또는 탄도적 방법, 예컨대 입자 충격과 같은 방법이 적용될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제 및 적어도 하나의 sgRNA 또는 적어도 하나의 crRNA 및 tracrRNA는 상기 세포의 외부에서 조립된 리보핵단백질 (RNP)로서 상기 세포에 도입된다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 공여자 DNA 및 crRNA/tracrRNA 또는 sgRNA의 조합은 표적 영역에의 공여자 DNA 분자의 효율적인 도입을 위해 미리 선택된다. 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 공여자 DNA 및 적어도 하나의 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제 및 적어도 하나의 단일 가이드 RNA (sgRNA) 또는 tracrRNA 및 crRNA는 DNA의 입자 충격 또는 아그로박테리움 매개된 도입을 이용하여 상기 세포에 도입된다.
바람직하게는, 적어도 하나의 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 적어도 하나의 RNA 가이딩된 닉카제는 핵 국재화 신호를 포함한다.
정의
약어: GFP - 녹색 형광 단백질, GUS - 베타-글루쿠로니다제, BAP - 6-벤질아미노퓨린; 2,4-D - 2,4-디클로로페녹시아세트산; MS - 무라쉬게(Murashige) 및 스쿠그(Skoog) 배지; NAA - 1-나프탈렌아세트산; MES, 2-(N-모르폴리노-에탄술폰산, IAA 인돌 아세트산; Kan: 카나마이신 술페이트; GA3 - 지베렐산; 티멘틴(Timentin)TM: 티카르실린 이나트륨 / 클라불라네이트 칼륨, microl: 마이크로리터.
본 발명이 특정한 방법 또는 프로토콜로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어가 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 목적이며, 첨부된 청구항에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 본원 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는다면 복수형을 포함한다는 것을 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "벡터"에 대한 언급은 하나 이상의 벡터들에 대한 언급이며, 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다. 용어 "약"은 대략, 거의, 그 즈음 또는 그 정도를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 명시된 수치 값의 상한 및 하한을 연장시킴으로써 해당 범위를 변형시킨다. 일반적으로, 용어 "약"은 20%, 바람직하게는 10%만큼 위로 또는 아래로 (높게 또는 낮게) 변동시킴으로써 명시된 값의 위 및 아래의 수치 값을 변형시키기 위해 본원에서 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단어 "또는"은 특정한 목록의 임의의 한 구성원을 의미하고, 해당 목록의 구성원의 임의의 조합을 또한 포함한다. 단어 "포함하다" 및 "포함하는"이 본 명세서 및 하기 청구항에서 사용될 때, 이들은 하나 이상의 명시된 특징, 정수, 성분 또는 단계의 존재를 구체화하기 위해 의도되지만, 이들은 그의 하나 이상의 다른 특징, 정수, 성분, 단계 또는 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 명확성을 위해, 본 명세서에서 사용된 특정한 용어들은 하기와 같이 정의되고 사용된다:
역평행: "역평행"은 본원에서 한 뉴클레오티드 서열에서는 5'-3' 방향으로 및 다른 뉴클레오티드 서열에서는 3'-5' 방향으로 진행하는 포스포디에스테르 결합을 갖는 상보성인 염기 잔기들 사이에서 수소 결합을 통해 쌍을 형성한 2개의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
안티센스: 용어 "안티센스"는 전사 또는 기능을 위해 그의 정상적인 배향에 대해 반전되어 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 따라서 숙주 세포 내에서 발현된 표적 유전자 mRNA 분자에 대해 상보성인 (예를 들어, 이는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍 형성을 통해 표적 유전자 mRNA 분자 또는 단일 가닥 게놈 DNA와 혼성화할 수 있음) 또는 표적 DNA 분자, 예를 들어 숙주 세포에 존재하는 게놈 DNA에 대해 상보성인 RNA 전사체를 발현한다.
코딩 영역: 본원에서 사용된 바와 같이, 구조 유전자와 관련하에 사용될 때 용어 "코딩 영역"은 mRNA 분자의 번역의 결과로서 초기 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 진핵생물에서는 코딩 영역이 개시제 메티오닌을 코딩하는 뉴클레오티드 삼중체 "ATG"에 의해 5'-측에 및 정지 코돈을 나타내는 3가지 삼중체 (즉, TAA, TAG, TGA) 중 하나에 의해 3'-측에 경계가 있다. 인트론을 함유하는 것 외에도, 유전자의 게놈 형태는 RNA 전사체에 존재하는 서열의 5'- 및 3'-말단 둘 다에 위치하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 이들 서열은 "플랭킹" 서열 또는 영역으로 지칭된다 (이들 플랭킹 서열은 mRNA 전사체에 존재하는 비번역 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치함). 5'-플랭킹 영역은 유전자의 전사를 제어하거나 또는 그에 영향을 미치는 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서를 함유할 수 있다. 3'-플랭킹 영역은 전사의 종결, 전사후 절단 및 폴리아데닐화를 지시하는 서열을 함유할 수 있다.
상보성인: "상보성인" 또는 "상보성"은 역평행 뉴클레오티드 서열에서 상보성인 염기 잔기들 사이에서 수소 결합 형성 시 (염기 쌍 형성 규칙에 의해) 서로 쌍을 형성할 수 있는 역평행 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 서열 5'-AGT-3'은 서열 5'-ACT-3'에 대해 상보성이다. 상보성은 "부분적인" 또는 "전체적인" 것일 수 있다. "부분적인" 상보성은 하나 이상의 핵산 염기가 염기 쌍 형성 규칙에 따라 매칭되지 않는 것이다. 핵산 분자들 사이의 "전체적인" 또는 "완전한" 상보성은 각각의 모든 핵산 염기가 염기 쌍 형성 규칙하에 또 다른 염기와 매칭되는 것이다. 핵산 분자 가닥들 사이의 상보성 정도는 핵산 분자 가닥들 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 대해 유의한 효과를 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 서열의 "보체"는 핵산 분자가 핵산 서열의 핵산 분자에 대해 전체적인 상보성을 나타내는 것인 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
공여자 DNA 분자: 본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "공여자 DNA 분자", "복구 DNA 분자" 또는 "주형 DNA 분자"는 모두 세포의 게놈에 도입되어야 하는 서열을 갖는 DNA 분자를 의미한다. 이는 상기 세포의 게놈의 표적 영역의 서열과 상동성 또는 동일성인 서열에 의해 5' 및/또는 3' 말단에서 플랭킹될 수 있다. 이는 각각의 세포에서 천연 발생이 아닌 서열, 예컨대 표적 영역에 도입되어야 하는 ORF, 비코딩 RNA 또는 조절 요소를 포함할 수 있거나, 또는 이는 유전자 편집인 적어도 하나의 돌연변이를 제외하고는 표적 영역에 대해 상동성인 서열을 포함할 수 있으며: 공여자 DNA 분자의 서열은 게놈에 부가될 수 있거나, 또는 이는 공여자 DNA 서열의 길이의 게놈에서 서열을 대체할 수 있다.
이중-가닥 RNA: "이중-가닥 RNA" 분자 또는 "dsRNA" 분자는 뉴클레오티드 서열의 센스 RNA 단편 및 뉴클레오티드 서열의 안티센스 RNA 단편을 포함하며, 이들 둘 다 서로 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하여, 센스 및 안티센스 RNA 단편이 쌍을 형성하고, 이중-가닥 RNA 분자를 형성할 수 있다.
내인성: "내인성" 뉴클레오티드 서열은 형질전환되지 않은 식물 세포의 게놈에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
증강된 발현: 식물 세포에서 핵산 분자의 발현을 "증강시키다" 또는 "증가시키다"는 본원에서 동등하게 사용되며, 본 발명의 방법을 적용한 후에 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 핵산 분자의 발현 수준이 상기 방법을 적용하기 전에 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 그의 발현 수준보다 또는 본 발명의 재조합 핵산 분자가 결여된 기준 식물과 비교하여 높은 것을 의미한다. 예를 들어, 기준 식물은 각각의 NEENA만이 결여된 동일한 구축물을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "증강된" 또는 "증가된"은 동의어이며, 본원에서 발현될 핵산 분자의 더 높은, 바람직하게는 유의하게 더 높은 발현을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단백질, mRNA 또는 RNA와 같은 작용제의 수준의 "증강" 또는 "증가"는 본 발명의 재조합 핵산 분자가 결여된, 예를 들어 본 발명의 NEENA 분자, 재조합 구축물 또는 재조합 벡터가 결여된, 실질적으로 동일한 조건하에 성장한 실질적으로 동일한 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에 비해 상기 수준이 증가한 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들어 표적 유전자에 의해 발현되는 preRNA, mRNA, rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA와 같은 작용제 및/또는 그에 의해 코딩되는 단백질 산물의 수준의 "증강" 또는 "증가"는 상기 수준이 본 발명의 재조합 핵산 분자가 결여된 세포 또는 유기체에 비해 50% 이상, 예를 들어 100% 이상, 바람직하게는 200% 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상, 훨씬 더 바람직하게는 10배 이상, 가장 바람직하게는 20배 이상, 예를 들어 50배 증가한 것을 의미한다. 증강 또는 증가는 숙련된 기술자에게 익숙한 방법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 핵산 또는 단백질 양의 증강 또는 증가는 예를 들어 단백질의 면역학적 검출에 의해 결정될 수 있다. 더욱이, 식물 또는 식물 세포에서 특이적인 단백질 또는 RNA를 측정하기 위해 단백질 검정, 형광, 노던 혼성화, 뉴클레아제 보호 검정, 역전사 (정량적인 RT-PCR), ELISA (효소-결합 면역흡착 검정), 웨스턴 블롯팅, 방사선 면역검정 (RIA) 또는 다른 면역검정 및 형광-활성화된 세포 분석 (FACS)과 같은 기술이 이용될 수 있다. 유도된 단백질 산물의 유형에 따라, 유기체 또는 세포의 표현형에 대한 그의 활성 또는 효과 또한 결정될 수 있다. 단백질 양을 결정하는 방법은 숙련된 기술자에게 공지되어 있다. 언급될 수 있는 예는 다음과 같다: 마이크로-뷰렛(micro-Biuret) 방법 (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5:218-222), 폴린-시오칼토(Folin-Ciocalteau) 방법 (Lowry OH et al. (1951) J Biol Chem 193:265-275) 또는 CBB G-250 흡수의 측정 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72:248-254). 단백질의 활성을 정량화하기 위한 한 예로서, 루시페라제 활성의 검출이 하기 실시예에 기재된다.
발현: "발현"은 세포에서 유전자 산물의 생합성, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 내인성 유전자 또는 이종성 유전자의 전사 및/또는 번역을 지칭한다. 예를 들어, 구조 유전자의 경우에, 발현은 구조 유전자의 mRNA로의 전사 및 임의적으로 mRNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 후속적인 번역을 수반한다. 다른 경우에, 발현은 RNA 분자를 보유하는 DNA의 전사만을 지칭할 수 있다.
발현 구축물: 본원에서 사용된 바와 같이, "발현 구축물"은 식물 또는 식물 세포의 적절한 부분에서 특정한 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 DNA 서열을 의미하고, 그가 도입될 식물 또는 식물 세포의 상기 부분에서 기능적인 프로모터를 포함하며, 이는 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되고, 이는 임의적으로 종결 신호에 작동가능하게 연결된다. 번역이 필요한 경우, 이는 또한 전형적으로 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역에 필요한 서열을 포함한다. 코딩 영역은 관심 단백질을 코딩할 수 있지만, 센스 또는 안티센스 방향에서 관심 기능적 RNA, 예를 들어 RNAa, siRNA, snoRNA, snRNA, 마이크로RNA, ta-siRNA 또는 임의의 다른 비코딩 조절 RNA를 또한 코딩할 수 있다. 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 구축물은 키메라일 수 있으며, 이는 그의 성분 중 하나 이상이 그의 다른 성분 중 하나 이상에 대해 이종성임을 의미한다. 발현 구축물은 또한 천연 발생이지만, 이종성 발현에 유용한 재조합 형태로 수득되었던 것일 수 있다. 그러나, 전형적으로, 발현 구축물은 숙주에 대해 이종성이며, 즉, 발현 구축물의 특정한 DNA 서열은 숙주 세포에서 천연 발생하지 않으며, 형질전환 사건에 의해 숙주 세포 또는 숙주 세포의 조상에 도입되었어야 했다. 발현 구축물에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있으며, 이는 숙주 세포가 일부 특정한 외부 자극에 노출되었을 때에만 전사를 개시한다. 식물의 경우, 프로모터는 또한 특정한 조직 또는 기관 또는 발달 단계에 대해 특이적일 수 있다.
외래: 용어 "외래"는 실험적 조작에 의해 세포의 게놈에 도입된 임의의 핵산 분자 (예를 들어, 유전자 서열)를 지칭하며, 도입된 서열이 일부 변형 (예를 들어, 점 돌연변이, 선택가능한 마커 유전자의 존재 등)을 함유하여, 천연 발생 서열에 비해 구별되는 한, 해당 세포에서 발견되는 서열을 포함할 수 있다.
기능적 연결: 용어 "기능적 연결" 또는 "기능적으로 연결된"은, 각각의 조절 요소가 그의 의도된 기능을 수행하여, 핵산 서열의 발현을 가능하게 하거나, 변형시키거나, 용이하게 하거나 또는 달리 영향을 미치도록 할 수 있는 방식으로, 예를 들어 조절 요소 (예를 들어 프로모터)와 발현될 상기 핵산 서열, 및 적절한 경우 추가의 조절 요소 (예를 들어, 종결자 또는 NEENA)의 순차적인 배열을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 동의어로서 단어 "작동가능한 연결" 또는 "작동가능하게 연결된"이 사용될 수 있다. 센스 또는 안티센스 RNA와 관련하여 핵산 서열의 배열에 따라 발현이 일어날 수 있다. 이를 위해, 화학적인 의미에서 직접적인 연결이 반드시 필요하지는 않다. 유전자 제어 서열, 예를 들어 인핸서 서열은 또한 더 멀리 떨어진 위치로부터 또는 실제로 다른 DNA 분자로부터 표적 서열에 대한 그들의 기능을 발휘할 수 있다. 바람직한 배열은 재조합적으로 발현될 핵산 서열이 프로모터로서 작용하는 서열 뒤에 위치하여, 두 서열이 서로 공유적으로 연결된 것이다. 프로모터 서열과 재조합적으로 발현될 핵산 서열 사이의 거리는 바람직하게는 200개 염기 쌍 미만, 특히 바람직하게는 100개 염기 쌍 미만, 매우 특히 바람직하게는 50개 염기 쌍 미만이다. 바람직한 실시양태에서, 전사 시작이 본 발명의 키메라 RNA의 원하는 시작과 동일하도록 하는 방식으로, 전사될 핵산 서열은 프로모터 뒤에 위치한다. 기능적 연결 및 발현 구축물은 예를 들어 (Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience; Gelvin et al. (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands) 기재된 통상적인 재조합 및 클로닝 기술에 의해 생성될 수 있다. 그러나, 예를 들어 제한 효소에 대한 특이적인 절단 부위를 갖는 링커로서, 또는 신호 펩티드로서 작용하는 추가의 서열 또한 두 서열 사이에 위치할 수 있다. 서열의 삽입은 또한 융합 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 조절 영역, 예를 들어 프로모터 및 발현될 핵산 서열의 연결로 이루어지는 발현 구축물은 벡터-통합된 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어 형질전환에 의해 식물 게놈에 삽입될 수 있다.
유전자: 용어 "유전자"는 유전자 산물 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 기능적 RNA)의 발현을 일부 방식으로 조절할 수 있는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 영역을 지칭한다. 유전자는 코딩 영역 (오픈 리딩 프레임, ORF)의 앞에 (상류) 및 뒤에 (하류) DNA의 비번역 조절 영역 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 리프레서 등) 뿐만 아니라, 적용가능한 경우, 개별 코딩 영역 (즉, 엑손) 사이에 개재 서열 (즉, 인트론)을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "구조 유전자"는 mRNA로 전사된 다음, 특이적인 폴리펩티드의 특징적인 아미노산 서열로 번역되는 DNA 서열을 의미한다.
"유전자 편집"은 본원에서 사용될 때 세포의 게놈의 특이적인 위치에서 특이적인 돌연변이의 도입을 의미한다. 유전자 편집은 더욱 진보된 기술을 적용하여, 예를 들어 CRISPR Cas 시스템 및 공여자 DNA, 또는 돌연변이 유발 활성에 연결된 CRISPR Cas 시스템, 예컨대 데아미나제를 이용하여 정확한 편집에 의해 도입될 수 있다 (WO15133554, WO17070632).
게놈 및 게놈 DNA: 용어 "게놈" 또는 "게놈 DNA"는 숙주 유기체의 유전가능한 유전 정보를 지칭한다. 상기 게놈 DNA는 핵의 DNA (염색체 DNA로도 지칭됨) 뿐만 아니라 색소체 (예를 들어, 엽록체) 및 다른 세포 소기관 (예를 들어, 미토콘드리아)의 DNA를 포함한다. 바람직하게는, 용어 게놈 또는 게놈 DNA는 핵의 염색체 DNA를 지칭한다.
이종성: 핵산 분자 또는 DNA와 관련하여 용어 "이종성"은 천연에서, 예를 들어 WT 식물의 게놈에서 작동가능하게 연결되지 않거나, 또는 천연에서, 예를 들어 WT 식물의 게놈에서 상이한 장소 또는 위치에서 작동가능하게 연결되는 제2 핵산 분자, 예를 들어 프로모터에 작동가능하게 연결되거나 또는 작동가능하게 연결되도록 조작된 핵산 분자를 지칭한다.
바람직하게는, 핵산 분자 또는 DNA, 예를 들어 NEENA와 관련하여 용어 "이종성"은 천연에서 작동가능하게 연결되지 않는 제2 핵산 분자, 예를 들어 프로모터에 작동가능하게 연결되거나 또는 작동가능하게 연결되도록 조작된 핵산 분자를 지칭한다.
그에 연결된 핵산 분자 및 하나 이상의 조절 핵산 분자 (예컨대 프로모터 또는 전사 종결 신호)를 포함하는 이종성 발현 구축물은 예를 들어 실험적 조작에 의해 기원하는 구축물이며, 여기서 a) 상기 핵산 분자, 또는 b) 상기 조절 핵산 분자 또는 c) 이들 둘 다 (즉 (a) 및 (b))는 그의 천연 (본래의) 유전 환경에 위치하지 않거나 또는 실험적 조작에 의해 변형되었고, 변형의 예는 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기의 치환, 부가, 결실, 역전 또는 삽입이다. 천연 유전 환경은 기원 유기체의 천연 염색체 로커스, 또는 게놈 라이브러리의 존재를 지칭한다. 게놈 라이브러리의 경우, 핵산 분자의 서열의 천연 유전 환경은 바람직하게는 적어도 부분적으로 유지된다. 환경은 적어도 한 측에서 핵산 서열을 플랭킹하고, 적어도 50 bp, 바람직하게는 적어도 500 bp, 특히 바람직하게는 적어도 1,000 bp, 매우 특히 바람직하게는 적어도 5,000 bp 길이의 서열을 갖는다. 천연 발생 발현 구축물, 예를 들어 프로모터와 상응하는 유전자의 천연 발생 조합물은 비천연의 합성 "인공적인" 방법, 예를 들어 돌연변이 유발에 의해 변형될 때 트랜스제닉 발현 구축물이 된다. 이러한 방법은 (US 5,565,350; WO 00/15815)에 기재되어 있다. 예를 들어, 이 분자의 천연 프로모터가 아닌 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 코딩하는 단백질은 프로모터에 대해 이종성인 것으로 고려된다. 바람직하게는, 이종성 DNA는 내인성이 아니거나 또는 그가 도입되는 세포와 천연적으로 회합되지 않지만, 또 다른 세포로부터 수득되었거나 또는 합성되었다. 이종성 DNA는 또한 일부 변형, 내인성 DNA 서열의 비천연 발생의 다중 카피, 또는 그에 물리적으로 연결된 또 다른 DNA 서열과 천연적으로 회합되지 않는 DNA 서열을 함유하는 내인성 DNA 서열을 포함한다. 일반적으로, 반드시 그런 것은 아니지만, 이종성 DNA는 그가 발현되는 세포에 의해 일반적으로 생성되지 않는 RNA 또는 단백질을 코딩한다.
고발현 프로모터: 본원에서 사용된 바와 같이, "고발현 프로모터"는 식물 또는 그의 일부에서 발현을 유발하는 프로모터를 의미하며, 각각의 프로모터의 제어하에 핵산 분자로부터 유래된 RNA의 축적 또는 합성 속도 또는 RNA의 안정성은 본 발명의 NEENA가 결여된 프로모터에 의해 유발된 발현에 비해 더 높으며, 바람직하게는 유의하게 더 높다. 바람직하게는, RNA의 양 및/또는 RNA 합성 속도 및/또는 RNA의 안정성은 본 발명의 NEENA가 결여된 프로모터에 비해 50% 이상, 예를 들어 100% 이상, 바람직하게는 200% 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상, 훨씬 더 바람직하게는 10배 이상, 가장 바람직하게는 20배 이상, 예를 들어 50배 증가한다.
혼성화: 본원에서 정의된 바와 같이 용어 "혼성화"는 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드 서열이 서로 어닐링되는 과정이다. 혼성화 과정은 전적으로 용액에서 발생할 수 있고, 즉, 상보성인 핵산 둘 다 용액 중에 있다. 혼성화 과정은 또한 매트릭스, 예컨대 자성 비드, 세파로스 비드 또는 임의의 다른 수지에 고정된 상보성인 핵산 중 하나에 의해 발생할 수 있다. 혼성화 과정은 추가로 고체 지지체, 예컨대 니트로-셀룰로스 또는 나일론 막에 고정되거나 또는 예를 들어 포토리쏘그래피에 의해 예를 들어 규질 유리 지지체에 고정된 상보성인 핵산 중 하나에 의해 발생할 수 있다 (후자는 핵산 어레이 또는 마이크로어레이로서 또는 핵산 칩으로서 공지되어 있음). 혼성화가 발생하게 하기 위해, 핵산 분자는 일반적으로 열적으로 또는 화학적으로 변성되어, 이중 가닥을 2개의 단일 가닥으로 용융시키고/거나 단일 가닥 핵산으로부터 헤어핀 또는 다른 이차 구조를 제거한다.
용어 "엄격성"은 혼성화가 일어나는 조건을 지칭한다. 혼성화의 엄격성은 온도, 염 농도, 이온 강도 및 혼성화 완충제 조성과 같은 조건에 의해 영향을 받는다. 일반적으로, 낮은 엄격성 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정한 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 30℃ 낮게 선택된다. 중간 엄격성 조건은 온도가 Tm보다 20℃ 낮을 때이고, 높은 엄격성 조건은 온도가 Tm보다 10℃ 낮을 때이다. 높은 엄격성 혼성화 조건은 전형적으로 표적 핵산 서열에 대해 높은 서열 유사성을 갖는 혼성화 서열을 단리하기 위해 이용된다. 그러나, 핵산은 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 서열마다 다를 수 있고, 여전히 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 따라서, 중간 엄격성 혼성화 조건은 때때로 이러한 핵산 분자를 확인하기 위해 필요할 수 있다.
"Tm"은 정의된 이온 강도 및 pH 하에 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭되는 프로브와 혼성화하는 온도이다. Tm은 용액 조건 및 프로브의 염기 조성 및 길이에 의존적이다. 예를 들어, 더 긴 서열은 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 혼성화의 최대 속도는 Tm보다 약 16℃ 내지 32℃ 낮을 때 수득된다. 혼성화 용액에서 1가 양이온의 존재는 두 핵산 가닥 사이의 정전기적 반발을 감소시켜, 혼성체 형성을 촉진시키고; 이 효과는 0.4M 이하의 나트륨 농도에서 볼 수 있다 (더 높은 농도에서는, 이 효과가 무시될 수 있음). 포름아미드는 DNA-DNA 및 DNA-RNA 듀플렉스의 용융 온도를 각각의 퍼센트 포름아미드에 대해 0.6 내지 0.7℃ 감소시키고, 비록 혼성화 속도가 저하될 지라도 50% 포름아미드의 첨가는 혼성화가 30 내지 45℃에서 수행될 수 있게 한다. 염기 쌍 미스매치는 듀플렉스의 혼성화 속도 및 열 안정성을 감소시킨다. 평균적으로 큰 프로브의 경우, Tm은 % 염기 미스매치당 약 1℃ 감소한다. Tm은 혼성체의 유형에 따라 하기 식을 이용하여 계산될 수 있다:
DNA-DNA 혼성체 (Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):
Tm= 81.5℃ + 16.6xlog[Na+]a + 0.41x%[G/Cb] - 500x[Lc]-1 - 0.61x% 포름아미드
DNA-RNA 또는 RNA-RNA 혼성체:
Tm= 79.8 + 18.5 (log10[Na+]a) + 0.58 (%G/Cb) + 11.8 (%G/Cb)2 - 820/Lc
올리고-DNA 또는 올리고-RNAd 혼성체:
<20개 뉴클레오티드의 경우: Tm= 2 (ln)
20-35개 뉴클레오티드의 경우: Tm= 22 + 1.46 (ln)
a 또는 다른 1가 양이온에 대해, 그러나 0.01-0.4 M 범위에서만 정확함.
b 30% 내지 75% 범위에서 %GC에 대해서만 정확함.
c L = 염기 쌍에서 듀플렉스의 길이.
d 올리고, 올리고뉴클레오티드; ln, 프라이머의 유효 길이 = 2x(G/C의 수)+(A/T의 수).
비특이적인 결합은 수많은 공지된 기술, 예를 들어 막을 단백질 함유 용액으로 차단, 혼성화 완충제에 이종성 RNA, DNA 및 SDS의 첨가, 및 Rnase로의 처리 중 어느 하나를 이용하여 제어될 수 있다. 관련이 없는 프로브의 경우, 일련의 혼성화는 (i) 어닐링 온도를 점진적으로 저하시키거나 (예를 들어 68℃에서 42℃로) 또는 (ii) 포름아미드 농도를 점진적으로 저하시키는 (예를 들어 50%에서 0%로) 것 중 하나를 변경시킴으로써 수행될 수 있다. 숙련된 기술자는 혼성화 동안에 변경될 수 있고, 엄격성 조건을 유지하거나 또는 변화시키는 다양한 파라미터를 알고 있다.
혼성화 조건 외에도, 혼성화의 특이성은 또한 전형적으로 혼성화 이후 세척의 기능에 따라 좌우된다. 비특이적인 혼성화로부터 생성된 백그라운드를 제거하기 위해, 샘플을 묽은 염 용액으로 세척한다. 이러한 세척의 결정적인 요인에는 최적 세척 용액의 이온 강도 및 온도가 포함되며: 염 농도가 낮고 세척 온도가 높을수록, 세척 엄격성이 높아진다. 세척 조건은 전형적으로 혼성화 엄격성에서 또는 그 아래에서 수행된다. 양성 혼성화는 백그라운드 신호의 적어도 2배인 신호를 제공한다. 일반적으로, 핵산 혼성화 검정 또는 유전자 증폭 검출 절차에 대한 적합한 엄격한 조건은 상기 설명된 바와 같다. 다소 엄격한 조건 또한 선택될 수 있다. 숙련된 기술자는 세척 동안에 변경될 수 있고, 엄격성 조건을 유지하거나 또는 변화시키는 다양한 파라미터를 알고 있다.
예를 들어, 50개 뉴클레오티드보다 긴 DNA 혼성체에 대한 전형적인 높은 엄격성 혼성화 조건은 65℃에서 1x SSC 중에서 또는 42℃에서 1x SSC 및 50% 포름아미드 중에서 혼성화, 이후 65℃에서 0.3x SSC 중에서 세척을 포함한다. 50개 뉴클레오티드보다 긴 DNA 혼성체에 대한 중간 엄격성 혼성화 조건의 예는 50℃에서 4x SSC 중에서 또는 40℃에서 6x SSC 및 50% 포름아미드 중에서 혼성화, 이후 50℃에서 2x SSC 중에서 세척을 포함한다. 혼성체의 길이는 혼성화 핵산에 대해 예상된 길이이다. 공지된 서열을 갖는 핵산이 혼성화되는 경우, 혼성체 길이는 서열을 정렬시키고, 본원에 기재된 보존된 영역을 확인함으로써 결정될 수 있다. 1xSSC는 0.15M NaCl 및 15mM 시트르산나트륨이고; 혼성화 용액 및 세척 용액은 5x 덴하르트(Denhardt) 시약, 0.5-1.0% SDS, 100 μg/ml 변성된 단편화된 연어 정자 DNA, 0.5% 피로인산나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 높은 엄격성 조건의 또 다른 예는 65℃에서 0.1 SDS 및 임의적으로 5x 덴하르트 시약, 100 μg/ml 변성된 단편화된 연어 정자 DNA, 0.5% 피로인산나트륨을 포함하는 0.1x SSC 중에서 혼성화, 이후 65℃에서 0.3x SSC 중에서 세척이다.
엄격성 수준을 정의하기 위해, [Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 and yearly updates)]를 참고할 수 있다.
"동일성": 2개 이상의 핵산 또는 아미노산 분자의 비교와 관련하여 사용될 때 "동일성"은 상기 분자의 서열이 특정한 정도의 서열 유사성을 공유하고, 서열이 부분적으로 동일한 것을 의미한다.
효소 변이체는 모 효소와 비교할 때 그들의 서열 동일성에 의해 정의될 수 있다. 서열 동일성은 보통 "% 서열 동일성" 또는 "% 동일성"으로 제공된다. 제1 단계에서 두 아미노산 서열 사이의 % 동일성을 결정하기 위해, 이들 두 서열 사이에서 쌍별 서열 정렬을 생성하며, 두 서열을 그들의 전체 길이에 걸쳐 정렬시킨다 (즉, 쌍별 전체 정렬). 정렬은 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch) 알고리즘을 실행하는 프로그램에 의해 (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453), 바람직하게는 프로그램 디폴트 파라미터 (갭 개방=10.0, 갭 연장=0.5 및 매트릭스=EBLOSUM62)에 의한 프로그램 "NEEDLE"을 이용하여 (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)) 생성된다. 본 발명의 목적을 위해 바람직한 정렬은 가장 높은 서열 동일성이 결정될 수 있는 해당 정렬이다.
하기 예시는 2개의 뉴클레오티드 서열을 설명하기 위해 의도되지만, 동일한 계산이 단백질 서열에 적용된다:
Seq A: AAGATACTG 길이: 9개 염기
Seq B: GATCTGA 길이: 7개 염기
따라서, 더 짧은 서열은 서열 B이다.
그들의 전체 길이에 걸쳐 두 서열을 나타내는 쌍별 전체 정렬을 생성하면 다음과 같다:
정렬에서 "I" 기호는 동일한 잔기를 나타낸다 (이는 DNA의 경우 염기 또는 단백질의 경우 아미노산을 의미함). 동일한 잔기의 수는 6개이다.
정렬에서 "-" 기호는 갭을 나타낸다. Seq B 내에서 정렬에 의해 도입된 갭의 수는 1개이다. Seq B의 경계에서 정렬에 의해 도입된 갭의 수는 2개이고, Seq A의 경계에서는 1개이다.
그들의 전체 길이에 걸쳐 정렬된 서열을 나타내는 정렬 길이는 10개이다.
본 발명에 따라 그의 전체 길이에 걸쳐 더 짧은 서열을 나타내는 쌍별 정렬을 생성하면 결과적으로 다음과 같다:
본 발명에 따라 그의 전체 길이에 걸쳐 서열 A를 나타내는 쌍별 정렬을 생성하면 결과적으로 다음과 같다:
본 발명에 따라 그의 전체 길이에 걸쳐 서열 B를 나타내는 쌍별 정렬을 생성하면 결과적으로 다음과 같다:
그의 전체 길이에 걸쳐 더 짧은 서열을 나타내는 정렬 길이는 8개이다 (더 짧은 서열의 정렬 길이에 고려되는 1개의 갭이 존재함).
따라서, 그의 전체 길이에 걸쳐 Seq A를 나타내는 정렬 길이는 9개일 것이다 (Seq A가 본 발명의 서열임을 의미함).
따라서, 그의 전체 길이에 걸쳐 Seq B를 나타내는 정렬 길이는 8개일 것이다 (Seq B가 본 발명의 서열임을 의미함).
두 서열을 정렬시킨 후, 제2 단계에서, 생성된 정렬로부터 동일성 값이 결정된다. 이 설명의 목적을 위해, 퍼센트 동일성은 %-동일성 = (동일한 잔기 / 그의 전체 길이에 걸쳐 본 발명의 각각의 서열을 나타내는 정렬 영역의 길이) *100. 따라서, 이 실시양태에 따른 두 아미노산 서열의 비교와 관련하여 서열 동일성은 동일한 잔기의 수를 그의 전체 길이에 걸쳐 본 발명의 각각의 서열을 나타내는 정렬 영역의 길이로 나누어서 계산된다. 이 값에 100을 곱하여 "%-동일성"을 제공한다. 상기 제공된 예시에 따라, %-동일성은 다음과 같다: Seq A가 본 발명의 서열인 경우 (6 / 9) * 100 = 66.7 %; Seq B가 본 발명의 서열인 경우 (6 / 8) * 100 =75%.
InDel은 NHEJ에 의한 DSB의 복구와 연관된 유기체의 게놈에서 염기의 무작위 삽입 또는 결실에 대한 용어이다. 이는 1 내지 10000개 염기 쌍 길이로 측정되는 작은 유전자 변형으로 분류된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이는 표적 부위 내에 또는 그 부근에서 (예를 들어 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 25 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp 또는 5 bp 미만 상류 및/또는 하류) 염기의 무작위 삽입 또는 결실을 지칭한다.
표적 DNA의 표적 부위에서 공여자 DNA 분자의 도입과 관련하여 용어 "도입하는", "도입" 등은 예를 들어 공여자 DNA 분자 또는 그의 일부를 표적 영역에 물리적으로 통합시킴으로써 표적 영역에 공여자 DNA 분자의 서열의 임의의 도입, 또는 공여자 DNA가 폴리머라제에 대한 주형으로 사용되는 것인 표적 영역에 공여자 DNA 분자의 서열 또는 그의 일부의 도입을 의미한다.
인트론: 유전자가 생성하는 단백질의 일부를 코딩하지 않고, 세포 핵으로부터 방출되기 전에 유저자로부터 전사되는 mRNA로부터 스플라이싱되는, 유전자 내의 DNA (개재 서열)의 섹션을 지칭한다. 인트론 서열은 인트론의 핵산 서열을 지칭한다. 따라서, 인트론은 코딩 서열 (엑손)을 따라 전사되지만, 성숙 mRNA의 형성 동안에 제거되는 이들 DNA 서열 영역이다. 인트론은 실제 코딩 영역 내에 또는 프리-mRNA (스플라이싱되지 않은 mRNA)의 5' 또는 3' 비번역 리더에 위치할 수 있다. 일차 전사체에서 인트론은 절단되고, 코딩 서열은 동시에 정확하게 라이게이션되어 성숙 mRNA를 형성한다. 인트론 및 엑손의 접합은 스플라이스 부위를 형성한다. 인트론의 서열은 GU로 시작하여, AG로 끝난다. 추가로, 식물에서, AU-AC 인트론의 2가지 예가 기재되었다: RecA-유사 단백질 유전자의 14번째 인트론 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 G5 유전자의 7번째 인트론은 AT-AC 인트론이다. 인트론을 함유하는 프리-mRNA는 다른 서열 외에도 인트론이 정확하게 스플라이싱되는데 필수적인 3개의 짧은 서열을 갖는다. 이들 서열은 5' 스플라이스 부위, 3' 스플라이스 부위, 및 분기점이다. mRNA 스플라이싱은 일차 mRNA 전사체에 존재하는 개재 서열 (인트론)의 제거, 및 엑손 서열의 연결 또는 라이게이션이다. 이는 개재 서열 (인트론)의 제거에 의해 동일한 RNA 상의 두 엑손을 연결시키는 시스-스플라이싱으로도 공지되어 있다. 인트론의 기능적 요소는 스플라이세오솜의 특이적인 단백질 성분에 의해 인식되고 결합되는 서열 (예를 들어 인트론의 말단에 있는 스플라이싱 컨센서스 서열)을 포함한다. 기능적 요소와 스플라이세오솜의 상호작용은 미성숙 mRNA로부터 인트론 서열의 제거 및 엑손 서열의 재연결을 일으킨다. 인트론은 충분하지는 않지만 인트론이 정확하게 스플라이싱되는데 필수적인 3개의 짧은 서열을 갖는다. 이들 서열은 5' 스플라이스 부위, 3' 스플라이스 부위 및 분기점이다. 분기점 서열은 식물에서 스플라이싱 및 스플라이스 부위 선택에 중요하다. 분기점 서열은 보통 3' 스플라이스 부위로부터 10-60개 뉴클레오티드 상류에 위치한다.
이소제닉: 이종성 DNA 서열의 존재 또는 부재에 의해 상이할 수 있다는 점을 제외하고는, 유전적으로 동일한 유기체 (예를 들어, 식물).
단리된: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 물질이 인간의 손에 의해 제거되었고, 그의 원래의 천연 환경으로부터 떨어져 존재하며, 따라서 천연 산물이 아님을 의미한다. 단리된 물질 또는 분자 (예컨대 DNA 분자 또는 효소)는 정제된 형태로 존재할 수 있거나 또는 비천연 환경, 예를 들어 트랜스제닉 숙주 세포에 존재할 수 있다. 예를 들어, 살아있는 식물에 존재하는 천연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니지만, 자연계에서 공존하는 물질 중 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/거나, 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물이 그의 원래의 환경의 일부가 아니라는 점에서 단리된 것이다. 바람직하게는, 용어 "단리된"은 "단리된 핵산 서열"에서와 같이 핵산 분자와 관련하여 사용될 때, 그의 천연 공급원에서 일반적으로 회합되는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 식별되고 분리된 핵산 서열을 지칭한다. 단리된 핵산 분자는 천연에서 발견되는 것과 상이한 형태 또는 설정으로 존재하는 핵산 분자이다. 대조적으로, 단리되지 않은 핵산 분자는 천연에서 존재하는 상태로 발견되는 핵산 분자, 예컨대 DNA 및 RNA이다. 예를 들어, 주어진 DNA 서열 (예를 들어, 유전자)은 숙주 세포 염색체에서 이웃 유전자에 근접하여 발견되고; RNA 서열, 예컨대 특이적인 단백질을 코딩하는 특이적인 mRNA 서열은 다수의 단백질을 코딩하는 수많은 다른 mRNA와의 혼합물로서 세포에서 발견된다. 그러나, 예를 들어 서열식별번호(SEQ ID NO): 1을 포함하는 단리된 핵산 서열은 예를 들어 핵산 서열이 천연 세포의 것과 상이한 염색체 또는 염색체외 위치에 있거나, 또는 천연에서 발견되는 것과 상이한 핵산 서열에 의해 달리 플랭킹된 것인 보통 서열식별번호: 1을 함유하는 세포에서의 이러한 핵산 서열을 포함한다. 단리된 핵산 서열은 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산 서열을 이용하여 단백질을 발현하는 경우, 핵산 서열은 센스 또는 코딩 가닥의 최소한 적어도 일부를 함유할 것이다 (즉, 핵산 서열은 단일-가닥일 수 있음). 대안적으로, 이는 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 함유할 수 있다 (즉, 핵산 서열은 이중-가닥일 수 있음).
최소 프로모터: 상류 활성화의 부재하에서는 불활성이거나 또는 크게 감소된 프로모터 활성을 갖는 프로모터 요소, 특히 TATA 요소. 적합한 전사 인자의 존재하에, 최소 프로모터는 전사를 허용하도록 기능한다.
비코딩: 용어 "비코딩"은 발현된 단백질의 일부 또는 전부를 코딩하지 않는 핵산 분자의 서열을 지칭한다. 비코딩 서열에는 인트론, 인핸서, 프로모터 영역, 3' 비번역 영역, 및 5' 비번역 영역이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
핵산 발현 증강 핵산 (NEENA): 용어 "핵산 발현 증강 핵산"은 NEENA가 기능적으로 연결된 프로모터의 제어하에 핵산의 발현을 증강시키기 위해 고유한 성질을 갖는 특이적인 서열의 서열 및/또는 핵산 분자를 지칭한다. 따라서, 프로모터 서열과는 달리, NEENA는 발현을 유도할 수 없다. NEENA에 기능적으로 연결된 핵산 분자의 발현을 증강시키는 기능을 수행하기 위해, NEENA 자체는 프로모터에 기능적으로 연결되어야 한다. 관련 기술분야에 공지된 인핸서 서열과는 달리, NEENA는 시스에서 작용하고, 발현될 핵산의 전사 시작 부위에 가깝게 위치해야 한다.
핵산 및 뉴클레오티드: 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드"는 천연 발생 또는 합성 또는 인공적인 핵산 또는 뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥, 센스 또는 안티센스 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 임의의 뉴클레오티드 유사체 및 이들의 중합체 또는 혼성체를 포함한다. 달리 나타내지 않는다면, 특정한 핵산 서열은 또한 함축적으로 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축퇴 코돈 치환) 및 상보성인 서열, 뿐만 아니라 명시적으로 나타낸 서열을 포함한다. 용어 "핵산"은 본원에서 "유전자", "cDNA, "mRNA", "올리고뉴클레오티드," 및 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환적으로 사용된다. 뉴클레오티드 유사체에는 염기, 당 및/또는 포스페이트의 화학적 구조에서 변형을 갖는 뉴클레오티드, 예컨대 비제한적으로 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 퓨린 변형, 시토신 엑소시클릭 아민에서의 변형, 5-브로모-우라실의 치환 등; 및 2'-위치 당 변형, 예컨대 비제한적으로 2'-OH가 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2, 또는 CN으로부터 선택된 기로 대체된 당-변형된 리보뉴클레오티드가 포함된다. 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)는 또한 비천연 요소, 예컨대 비천연 염기, 예를 들어 이노신 및 크산틴, 비천연 당, 예를 들어 2'-메톡시 리보스, 또는 비천연 포스포디에스테르 연결, 예를 들어 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트 및 펩티드를 포함할 수 있다.
핵산 서열: 문구 "핵산 서열"은 5'-말단에서 3'-말단으로 판독한 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 또는 이중-가닥 중합체를 지칭한다. 여기에는 염색체 DNA, 자가-복제 플라스미드, DNA 또는 RNA의 감염성 중합체, 및 주로 구조적 역할을 수행하는 DNA 또는 RNA가 포함된다. "핵산 서열"은 또한 뉴클레오티드를 나타내는 약어, 문자, 캐릭터 또는 단어의 연이은 목록을 지칭한다. 한 실시양태에서, 핵산은 보통 100개 미만의 뉴클레오티드 길이인 비교적 짧은 핵산인 "프로브"일 수 있다. 종종 핵산 프로브는 약 50개의 뉴클레오티드 길이 내지 약 10개의 뉴클레오티드 길이이다. 핵산의 "표적 영역"은 관심의 대상인 것으로 확인된 핵산의 일부이다. 핵산의 "코딩 영역"은 적절한 조절 서열의 제어하에 배치될 때 특정한 폴리펩티드 또는 단백질을 생성하도록 서열-특이적인 방식으로 전사되고 번역되는 핵산의 일부이다. 코딩 영역은 이러한 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩한다고 한다.
올리고뉴클레오티드: 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 그의 모방체의 올리고머 또는 중합체, 뿐만 아니라 유사하게 기능하는 비천연 발생 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 바람직한 성질, 예를 들어 증강된 세포 흡수, 핵산 표적에 대한 증강된 친화도, 및 뉴클레아제의 존재하에 증가된 안정성으로 인해 종종 바람직하다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 연결 (예를 들어, 포스포디에스테르) 또는 대체 연결에 의해 서로 공유적으로 커플링된 2개 이상의 핵단량체를 포함한다.
오버행: "오버행"은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 분자의 5'- 또는 3'-히드록실 말단 상의 비교적 짧은 단일-가닥 뉴클레오티드 서열이다 ("연장부", "돌출 말단," 또는 "점착성 말단"으로도 지칭됨).
식물: 이는 일반적으로 광합성이 가능한 임의의 진핵생물 단세포 또는 다세포 유기체 또는 세포, 조직, 기관, 부분 또는 번식 물질 (예컨대 종자 또는 과일)을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명의 목적을 위해 식물계의 고등 및 하등 식물의 모든 속 및 종을 포함한다. 일년생, 다년생, 단자엽 및 쌍자엽 식물이 바람직하다. 상기 용어에는 성숙한 식물, 종자, 새싹 및 묘목 및 이들의 유래된 부분, 번식 물질 (예컨대 종자 또는 미세포자), 식물 기관, 조직, 원형질체, 캘러스 및 다른 배양물, 예를 들어 세포 배양물, 및 기능적 또는 구조적 단위를 제공하기 위한 임의의 다른 유형의 식물 세포 그룹이 포함된다. 성숙한 식물은 묘목 단계를 넘어서 임의의 원하는 발달 단계에 있는 식물을 지칭한다. 묘목은 초기 발달 단계에 있는 어린 미성숙 식물을 지칭한다. 일년생, 이년생, 단자엽 및 쌍자엽 식물은 트랜스제닉 식물의 생성을 위한 바람직한 숙주 유기체이다. 유전자의 발현은 모든 관상용 식물, 유용한 또는 관상용 나무, 꽃, 절화, 관목 또는 잔디에서 추가로 유리하다. 언급될 수 있으나 예를 들어 비제한적인 식물은 속씨 식물, 선태류, 예를 들어 헤파티카에(Hepaticae) (우산이끼류) 및 뮤씨(Musci) (선류); 프테리도파이트(Pteridophyte), 예컨대 양치류, 호스테일 및 석송; 겉씨 식물, 예컨대 침엽수, 소철, 은행나무 및 그네타타에(Gnetatae); 조류, 예컨대 녹조류, 파에오파이세아에(Phaeophpyceae), 로도파이세아에(Rhodophyceae), 믹소파이세아에(Myxophyceae), 크산토파이세아에(Xanthophyceae), 바실라리오파이세아에(Bacillariophyceae) (규조류), 및 유글레노파이세아에(Euglenophyceae)이다. 식품 또는 사료 목적으로 사용되는 식물, 예컨대 콩과, 예컨대 완두콩, 알팔파 및 대두; 벼과, 예컨대 벼, 옥수수, 밀, 보리, 수수, 기장, 호밀, 트리티케일 또는 귀리; 산형과, 특히 다우쿠스(Daucus) 속, 매우 특히 캐로타 종 (당근) 및 아피움(Apium) 종, 매우 특히 그라베올렌스 둘세(Graveolens dulce) 종 (셀러리), 및 여러 다른 종; 가지과, 특히 리코페르시콘(Lycopersicon) 속, 매우 특히 에스쿨린툼(esculentum) 종 (토마토) 및 솔라눔(Solanum) 속, 매우 특히 투베로숨(tuberosum) 종 (감자) 및 멜론게나(melongena) 종 (가지), 및 여러 다른 종 (예컨대 담배); 및 캅시쿰(Capsicum) 속, 매우 특히 아누움(annuum) 종 (후추) 및 여러 다른 종; 콩과, 특히 글리신 속, 매우 특히 맥스(max) 종 (대두), 알팔파, 완투콩, 루체른, 콩 또는 땅콩 및 여러 다른 종; 및 겨자과 (브라시카카에(Brassicacae)), 특히 브라시카(Brassica) 속, 매우 특히 나푸스(napus) 종 (유지 종자 평지), 캄페스트리스(campestris) 종 (비트), 올레라세아 재배종 타스티에(oleracea cv Tastie) (양배추), 올레라세아 재배종 스노우볼 와이(oleracea cv Snowball Y) (콜리플라워) 및 올레라세아 재배종 엠퍼러(oleracea cv Emperor) (브로콜리); 및 아라비돕시스(Arabidopsis) 속, 매우 특히 탈리아나(thaliana) 종 및 여러 다른 종; 국화과, 특히 락투카(Lactuca) 속, 매우 특히 사티바(sativa) 종 (상추) 및 여러 다른 종; 엉거시과, 예컨대 해바라기, 만수국, 양상추 또는 금잔화 및 여러 다른 종; 박과, 예컨대 멜론, 호박/스쿼쉬 또는 주키니, 및 아마씨가 바람직하다. 목화, 사탕수수, 대마, 아마, 고추, 및 다양한 나무, 견과 및 와인 종이 추가로 바람직하다.
폴리펩티드: 용어 "폴리펩티드", "펩티드", "올리고펩티드", "폴리펩티드", "유전자 산물", "발현 산물" 및 "단백질"은 본원에서 연속하는 아미노산 잔기의 중합체 또는 올리고머를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
전단백질: 일반적으로 세포 소기관, 예컨대 엽록체에 대해 표적화되고, 여전히 그의 수송 펩티드를 포함하는 단백질.
표적 영역에서 공여자 DNA 분자의 도입과 관련하여 "정확한"은 공여자 DNA 분자 서열에 포함되지 않는 표적 영역의 변경되지 않은 DNA 서열과 비교하여 임의의 InDel, 복제 또는 다른 돌연변이없이 공여자 DNA 분자의 서열이 표적 영역에 도입되는 것을 의미한다.
일차 전사체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "일차 전사체"는 유전자의 미성숙 RNA 전사체를 지칭한다. "일차 전사체"는 예를 들어 인트론을 여전히 포함하고/거나, 폴리A 꼬리 또는 캡 구조는 아직 포함하지 않고/거나, 전사체로서 그의 정확한 기능을 위해 필요한 다른 변형, 예를 들어 트리밍 또는 편집이 누락되어 있다.
프로모터: 용어 "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 등가물이며, 본원에서 사용된 바와 같이, 관심 뉴클레오티드 서열에 라이게이션될 때 관심 뉴클레오티드 서열의 RNA로의 전사를 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 이러한 프로모터는 예를 들어 하기 공개 데이터베이스에서 확인할 수 있다: http://www.grassius.org/grasspromdb.html, http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php?topic=plantprom, http://ppdb.gene.nagoya-u.ac.jp/cgi-bin/index.cgi. 거기에 나열된 프로모터는 본 발명의 방법에 의해 다루어질 수 있으며, 본원에 참고로 포함된다. 프로모터는 관심 뉴클레오티드 서열의 전사 시작 부위 근접한 5'에 (즉, 상류) 위치하며, mRNA로의 전사를 제어하고, RNA 폴리머라제 및 전사 개시를 위한 다른 전사 인자의 특이적인 결합을 위한 부위를 제공한다. 상기 프로모터는 예를 들어 전사 시작 부위에 근접한 적어도 10 kb, 예를 들어 5 kb 또는 2 kb를 포함한다. 이는 전사 시작 부위에 근접한 적어도 1500 bp, 바람직하게는 적어도 1000 bp, 더욱 바람직하게는 적어도 500 bp, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 400 bp, 적어도 300 bp, 적어도 200 bp 또는 적어도 100 bp 또한 포함할 수 있다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 전사 시작 부위에 근접한 적어도 50 bp, 예를 들어 적어도 25 bp를 포함한다. 프로모터는 엑손 및/또는 인트론 영역 또는 5' 비번역 영역을 포함하지 않는다. 프로모터는 예를 들어 각각의 식물에 대해 이종성 또는 상동성일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열이 외래 종으로부터 기원하는 경우 또는 동일한 종으로부터이지만 그의 원래 형태로부터 변형된 경우에는, 이는 유기체 또는 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 "이종성"이다. 예를 들어, 이종성 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 프로모터가 유래된 것과 상이한 종으로부터의 코딩 서열, 또는 동일한 종으로부터인 경우 프로모터와 천연적으로 회합하지 않는 코딩 서열을 지칭한다 (예를 들어, 유전자 조작된 코딩 서열 또는 상이한 생태형 또는 품종으로부터의 대립유전자). 적합한 프로모터는 발현이 일어나야 하는 숙주 세포의 유전자로부터 또는 이 숙주 세포에 대한 병원체 (예를 들어, 식물 또는 식물 병원체, 예컨대 식물 바이러스)로부터 유래될 수 있다. 식물 특이적인 프로모터는 식물에서 발현을 조절하는데 적합한 프로모터이다. 이는 식물로부터 뿐만 아니라 식물 병원체로부터 유래될 수 있거나, 또는 이는 인간에 의해 설계된 합성 프로모터일 수 있다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 전사 속도는 유도제에 대한 반응으로 증가한다. 또한, 프로모터는 특이적인 조직 유형(들), 예컨대 잎, 뿌리 또는 분열 조직에서 연관된 코딩 영역을 전사하는 데에만 또는 우세하게 활성이도록 조직-특이적인 또는 조직 바람직한 방식으로 조절될 수 있다. 용어 "조직 특이적인"은 프로모터에 적용되는 경우 상이한 유형의 조직 (예를 들어, 뿌리)에서 동일한 관심 뉴클레오티드 서열의 발현이 상대적으로 부재할 때 관심 뉴클레오티드 서열에서 특이적인 유형의 조직 (예를 들어, 꽃잎)으로의 선택적인 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 프로모터의 조직 특이성은 예를 들어 리포터 유전자를 프로모터 서열에 작동가능하게 연결시켜 리포터 구축물을 생성하고, 리포터 구축물이 생성된 트랜스제닉 식물의 모든 조직에 통합되도록 리포터 구축물을 식물의 게놈에 도입하고, 트랜스제닉 식물의 상이한 조직에서 리포터 유전자의 발현을 검출함으로써 (예를 들어, mRNA, 단백질, 또는 리포터 유전자에 의해 코딩되는 단백질 활성을 검출함) 평가될 수 있다. 다른 조직에서 리포터 유전자의 발현 수준에 비해 하나 이상의 조직에서 더 높은 발현 수준의 리포터 유전자의 검출은 프로모터가 더 높은 발현 수준이 검출된 조직에 대해 특이적임을 나타낸다. 용어 "세포 유형 특이적인"은 프로모터에 적용되는 경우 동일한 조직 내의 상이한 유형의 세포에서 동일한 관심 뉴클레오티드 서열의 발현이 상대적으로 부재할 때 특이적인 유형의 세포에서 관심 뉴클레오티드 서열의 선택적인 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 용어 "세포 유형 특이적인"은 프로모터에 적용될 때 또한 단일 조직 내의 영역에서 관심 뉴클레오티드 서열의 선택적인 발현을 촉진시킬 수 있는 프로모터를 의미한다. 프로모터의 세포 유형 특이성은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 GUS 활성 염색, GFP 단백질 또는 면역조직화학 염색을 이용하여 평가될 수 있다. 용어 "구성적"은 프로모터 또는 프로모터로부터 유래된 발현과 관련하여 사용될 때, 프로모터가 식물 또는 식물의 일부의 실질적으로 전체 수명에 걸쳐 대부분의 식물 조직 및 세포에서 자극 (예를 들어, 열 충격, 화학물질, 빛 등)의 부재하에 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 전사를 지시할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 구성적 프로모터는 실질적으로 임의의 세포 및 임의의 조직에서 트랜스진의 발현을 지시할 수 있다.
프로모터 특이성: 용어 "특이성"은 프로모터에 대해 언급될 때 각각의 프로모터에 의해 부여된 발현 패턴을 의미한다. 특이성은 식물 또는 그의 일부의 조직 및/또는 발달 상태를 설명하고, 프로모터는 각각의 프로모터의 제어하에 핵산 분자의 발현을 부여한다. 프로모터의 특이성은 또한 환경 조건을 포함할 수 있으며, 환경 조건하에 프로모터가 활성화되거나 또는 하향조절될 수 있고, 예컨대 생물학적 또는 환경적 스트레스, 예컨대 추위, 가뭄, 상처 또는 감염에 의해 유도 또는 억제될 수 있다.
정제된: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "정제된"은 그들의 천연 환경으로부터 제거되거나, 단리되거나 또는 분리된 핵산 또는 아미노산 서열인 분자를 지칭한다. "실질적으로 정제된" 분자에는 천연적으로 회합되는 다른 성분이 적어도 60% 없고, 바람직하게는 적어도 75% 없고, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 없다. 정제된 핵산 서열은 단리된 핵산 서열일 수 있다.
재조합: 핵산 분자와 관련하여 용어 "재조합"은 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 핵산 분자를 지칭한다. 재조합 핵산 분자는 또한 천연에서는 존재하지 않지만, 변형되거나, 변화되거나, 돌연변이되거나 또는 인간에 의해 달리 조작된 분자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, "재조합 핵산 분자"는 천연 발생 핵산 분자로부터의 서열과 적어도 하나의 핵산에서 차이가 있는 비천연 발생 핵산 분자이다. "재조합 핵산 분자"는 또한 천연 발생이 아닌 핵산 분자의 서열을 해당 순서로 포함하는, 바람직하게는 작동가능하게 연결된 "재조합 구축물"을 포함할 수 있다. 상기 재조합 핵산 분자를 생성하기 위한 바람직한 방법은 클로닝 기술, 지정 또는 비지정 돌연변이 유발, 합성 또는 재조합 기술을 포함할 수 있다.
센스: 용어 "센스"는 표적 서열과 상보성인 또는 동일한 서열, 예를 들어 단백질 전사 인자에 결합하고 주어진 유전자의 발현에 관여하는 서열을 갖는 핵산 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직한 실시양태에 따라, 핵산 분자는 관심 유전자, 및 상기 관심 유전자의 발현을 가능하게 하는 요소를 포함한다.
유의한 증가 또는 감소: 측정 기술에서 고유한 오차 한계보다 큰, 예를 들어 효소 활성에서 또는 유전자 발현에서 증가 또는 감소, 바람직하게는 대조군 효소의 활성 또는 대조군 세포에서의 발현의 약 2배 이상 증가 또는 감소, 더욱 바람직하게는 약 5배 이상 증가 또는 감소, 및 가장 바람직하게는 약 10배 이상 증가 또는 감소.
소형 핵산 분자: "소형 핵산 분자"는 RNA 또는 DNA와 같이 핵산 또는 그의 유도체로 이루어진 분자로 이해된다. 이들은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 약 15 내지 약 30 bp, 예를 들어 15 내지 30 bp, 더욱 바람직하게는 약 19 내지 약 26 bp, 예를 들어 19 내지 26 bp, 훨씬 더 바람직하게는 약 20 내지 약 25 bp, 예를 들어 20 내지 25 bp이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 21 내지 약 24 bp, 예를 들어 21 내지 24 bp이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 소형 핵산 분자는 약 21 bp 내지 약 24 bp, 예를 들어 21 bp 내지 24 bp이다.
실질적으로 상보성인: 가장 넓은 의미에서, 기준 또는 표적 뉴클레오티드 서열과 관련하여 본원에서 뉴클레오티드 서열에 대해 사용될 때 용어 "실질적으로 상보성인"은 상기 기준 또는 표적 뉴클레오티드 서열의 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드 서열과 정확하게 상보성인 서열 사이에 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 또는 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 93%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 96%, 여전히 훨씬 더 바람직하게는 적어도 97% 또는 98%, 여전히 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99% 또는 가장 바람직하게는 100%의 동일성 백분율을 갖는 뉴클레오티드 서열을 의미한다 (후자는 이 맥락에서 용어 "동일한"과 동등함). 바람직하게는, 동일성은 상기 기준 서열에 대해 적어도 19개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 평가된다 (이후 달리 명시되지 않는다면). 서열 비교는 니들만 및 운쉬의 알고리즘을 기반으로 하여 유니버시티 오브 위스콘신(University of Wisconsin) GCG, GAP의 SEQWEB 적용에 의해 디폴트 GAP 분석을 이용하여 수행된다 (Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453; 상기 정의된 바와 같음). 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 "실질적으로 상보성인" 뉴클레오티드 서열은 낮은 엄격성 조건, 바람직하게는 중간 엄격성 조건, 가장 바람직하게는 높은 엄격성 조건하에 (상기 정의된 바와 같음) 기준 뉴클레오티드 서열과 혼성화한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표적 영역"은 예를 들어 표적 부위로부터 10개 염기, 20개 염기, 30개 염기, 40개 염기, 50개 염기, 60개 염기, 70개 염기, 80개 염기, 90개 염기, 100개 염기, 125개 염기, 150개 염기, 200개 염기 또는 500개 염기 또는 그 초과로 까까운 영역을 의미하거나, 또는 공여자 DNA 분자의 서열이 세포의 게놈에 도입되는 표적 부위를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표적 부위"는 재조합 기술, 예컨대 Zn-핑거, TALEN, 제한 효소, 귀소 엔도뉴클레아제, RNA-가이딩된 뉴클레아제, RNA-가이딩된 닉카제, 예컨대 CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 닉카제 등을 이용하여 이중 가닥 파단 또는 1개 또는 1쌍의 단일 가닥 파단 (닉)이 유도되는 게놈에서의 위치를 의미한다.
트랜스진: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스진"은 실험적 조작에 의해 세포의 게놈에 도입된 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 트랜스진은 "내인성 DNA 서열" 또는 "이종성 DNA 서열" (즉, "외래 DNA")일 수 있다. 용어 "내인성 DNA 서열"은 천연 발생 서열에 비해 일부 변형 (예를 들어, 점 돌연변이, 선택가능한 마커 유전자의 존재 등)을 함유하지 않는 한, 도입되는 세포에서 천연적으로 발견되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
트랜스제닉: 용어 트랜스제닉은 유기체에 대해 언급될 때 바람직하게는 관심 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 적합한 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자에 의해 형질전환된, 바람직하게는 안정하게 형질전환된 것을 의미한다.
벡터: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 게놈 통합된 벡터, 또는 "통합된 벡터"이며, 이는 숙주 세포의 염색체 DNA에 통합될 수 있다. 또 다른 유형의 벡터는 에피솜 벡터, 즉, 염색체외 복제할 수 있는 핵산 분자이다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 문맥상 달리 명확하지 않다면 상호교환적으로 사용된다. 시험관내 또는 생체내에서 본원에 기재된 바와 같이 RNA를 생성하도록 설계된 발현 벡터는 임의의 RNA 폴리머라제, 예컨대 미토콘드리아 RNA 폴리머라제, RNA pol I, RNA pol II, 및 RNA pol III에 의해 인식되는 서열을 함유할 수 있다. 이들 벡터는 본 발명에 따라 세포에서 원하는 RNA 분자를 전사하기 위해 사용될 수 있다. 식물 형질전환 벡터는 식물 형질전환 과정에서 적합한 벡터인 것으로 이해해야 한다.
야생형: 용어 "야생형", "천연" 또는 "천연 기원"은 유기체, 폴리펩티드, 또는 핵산 서열과 관련하여, 상기 유기체가 천연 발생이거나, 또는 변화되거나, 돌연변이되거나 또는 인간에 의해 달리 조작되지 않은 적어도 하나의 천연 발생 유기체에서 이용가능한 것을 의미한다.
실시예
화학물질 및 일반적인 방법
달리 나타내지 않는다면, 제한 소화, 아가로스 겔 전기영동, 핵산의 정제, 핵산의 라이게이션, 형질전환, 박테리아 세포의 선택 및 배양을 비롯하여 본 발명의 목적을 위해 수행된 클로닝 절차는 (Sambrook et al., 1989)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 재조합 DNA의 서열 분석은 생어(Sanger) 기술 (Sanger et al., 1977)을 이용하여 레이저 형광 DNA 시퀀서 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)에 의해 수행되었다. 달리 기재되지 않는다면, 화학물질 및 시약은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) (시그마 알드리치, 미국 세인트 루이스), 프로메가(Promega) (미국 위스콘신주 메디슨), 두케파(Duchefa) (네덜란드 할르렘) 또는 인비트로젠(Invitrogen) (미국 캘리포니아주 칼스바드)으로부터 수득하였다. 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) (미국 메사추세츠주 입스위치) 또는 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH) (독일 펜츠베르크)로부터 수득하였다. 올리고뉴클레오티드는 유로핀스 유로핀스 게노믹스(Eurofins Eurofins Genomics) (독일 에베르스베르크) 또는 통합된 DNA 기술 (미국 아이오와주 코랄빌)에 의해 합성되었다.
실시예 1: 이질육배체 밀에서 HDR-매개된 정확한 유전자 편집을 위한 최상의 gRNA 및 공여자 DNA 조합의 스크리닝
밀에서 정확한 유전자 편집을 위한 본 발명자들의 접근법은 먼저 편집된 묘목의 생성을 위해 사용되는 바람직한 gRNA/공여자 DNA 조합을 확인하기 위해 배반 캘러스 수준에서 상이한 gRNA/ 공여자 DNA 조합의 세트를 스크리닝하는 것을 기반으로 하였다.
이 실시예에서, 본 발명자들은 특이적인 단일 아미노산 치환 (I1781L)을 ACCase 유전자의 코딩 서열에 도입하기 위해, 본 발명자들이 5가지 상이한 gRNA/ 공여자 DNA 조합을 사전 스크리닝하였음을 설명한다. I1781L 치환을 위한 표적 코돈 근처의 5가지 상이한 표적 부위로 Cas9를 가이딩하는 5가지 상이한 gRNA를 설계하였다. 각각의 sgRNA 벡터 pBAY02528 (서열식별번호: 5), pBAY02529 (서열식별번호: 6), pBAY02530 (서열식별번호: 7), pBAY02531 (서열식별번호: 8) 및 pBAY02532 ((서열식별번호: 9)는 각각 표적 부위 TS1 서열 CTAGGTGTGGAGAACATACA-TGG, TS2 서열 GAAGGAGGATGGGCTAGGTG-TGG, TS3 서열 ATAGGCCCTAGAATAGGCAC-TGG, TS4 서열 CTCCTCATAGGCCCTAGAAT-AGG, TS5 CTATTGCCAGTGCCTATTCT-AGG에서 DSB의 생성을 위해 Cas9를 가이딩할 수 있는 gRNA의 발현을 위한 카세트를 포함한다. 3가지 공여자 DNA 벡터, pBAY02539 (서열식별번호: 13), pBAY02540 (서열식별번호: 14) 및 pBAY02541 (서열식별번호: 15)을 개발하였고, 각각은 원하는 돌연변이 (I1781L 치환)를 함유하는 트리티쿰 아에스티붐, 재배종 필더(Fielder) 서브게놈 B, ACCase 유전자의 803bp DNA 단편을 포함한다. 3가지 공여자 DNA는 공여자 DNA 및 원하는 돌연변이 (I1781L)를 갖는 편집된 대립유전자의 절단을 방지하기 위한 소수의 침묵 돌연변이에서만 상이하다. 각각의 공여자 DNA에서 3-bp (CTC) 코어 서열은 서브게놈 B의 WT ACCase 서열과 동일한 ~400-bp 좌측 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹되었다. Cas9 발현 pBAY02430 (서열식별번호: 1; 서열식별번호: 2)은 밀을 위해 최적화된 Cas9 뉴클레아제 코돈을 포함하고, pUbiZm 프로모터 및 3'35S 종결자의 제어하에 있었다. Cas9 뉴클레아제를 갖는 벡터, gRNA, 공여자 DNA의 플라스미드 DNA를 egfp-bar 융합 유전자를 함유하는 플라스미드 pIB26 (서열식별번호: 18)과 혼합하여, 포스피노트리신 (PPT)에 대해 선택하고, GFP 형광에 대해 스크리닝하였다.
2-3 mm 크기의 미성숙 배아를 밀 재배종 필더의 멸균된 이삭으로부터 단리하고, [Sparks and Jones (Cereal Genomics: Methods in Molecular biology, vol. 1099, Chapter 17)]에 기재된 바와 같이 PDS-1000/He 입자 전달 시스템을 이용하여 충격을 가하였다. 하기 DNA 혼합물을 충격을 위해 사용하였다:
1) pBAY02430 (Cas9), pBAY02539 (공여자 DNA-1), pBAY02528 (gRNA1), pIB26
2) pBAY02430 (Cas9), pBAY02539 (공여자 DNA-1), pBAY02529 (gRNA2), pIB26
3) pBAY02430 (Cas9), pBAY02540 (공여자 DNA-2), pBAY02530 (gRNA3), pIB26
4) pBAY02430 (Cas9), pBAY02540 (공여자 DNA-2), pBAY02531 (gRNA4), pIB26
5) pBAY02430 (Cas9), pBAY02540 (공여자 DNA-2), pBAY02532 (gRNA5), pIB26
6) pBAY02430 (Cas9), pBAY02541 (공여자 DNA-3), pBAY02530 (gRNA3), pIB26
7) pBAY02430 (Cas9), pBAY02541 (공여자 DNA-3), pBAY02531 (gRNA4), pIB26
8) pBAY02430 (Cas9), pBAY02541 (공여자 DNA-3), pBAY02532 (gRNA5), pIB26
[Ishida et al. (Agrobacterium Protocols: Volume 1, Methods in Moleclar Biology, vol. 1223, Chapter 15)]에 기재된 바와 같이, 충격을 받은 미성숙 배아를 며칠 동안 비-선택적인 캘러스 유도 배지로 옮긴 다음, PPT 함유 선택 배지로 옮겼다. 3 내지 4 주 후에, 게놈 DNA를 PCR 분석을 위해 개별 미성숙 배아의 배반 캘러스로부터 추출하였다. 하기 프라이머 쌍을 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭을 위해 설계하였다: 공여자 DNA pBAY02539 (서열식별번호: 13)의 경우 프라이머 쌍 HT-18-111 정방향 / HT-18-112 역방향, 공여자 DNA pBAY02540 (서열식별번호: 14) 및 공여자 DNA pBAY02541 (서열식별번호: 15)의 경우 프라이머 쌍 HT-18-113 정방향/ HT-18-112 역방향 (표 1). 정확한 유전자 편집 효율은 공여자 DNA-1 (pBAY02539) (서열식별번호: 13)이 gRNA1 pBAY02528 (서열식별번호: 5)과 조합되어 사용될 때 가장 높았고, 이 gRNA/공여자 DNA 조합에 의해 개별 미성숙 배아로부터 유래된 배반 캘러스의 13%가 예상된 크기의 증폭 산물인 편집 특이적인 PCR을 제공하였다 (표 2).
ACCase (I1781L) 돌연변이를 갖는 밀 식물의 생성을 위해, 본 발명자들은 DNA 혼합물 1) pBAY02430 (Cas9) (서열식별번호: 1; 서열식별번호: 2), pBAY02539 (공여자 DNA-1) (서열식별번호: 13), pBAY02528 (gRNA1) (서열식별번호: 5), pIB26 (서열식별번호: 18)에 의해 미성숙 밀 배아의 공동-충격을 수행하였고, 본 발명자들은 PPT에 대한 간접적인 선택을 통해 하나 이상의 동종 대립유전자에서 표적화된 AA 치환 (I1781L)을 갖는 밀 식물이 비교적 높은 성공률로 수득될 수 있음을 보여 주었다 (실시예 2 참고). 이는 이 실시예에 기재된 바와 같이 충격을 받은 미성숙 배아로부터의 배반 조직에서 정확한 HR-매개된 유전자 편집을 위한 상이한 gRNA/ 공여자 DNA 조합의 사전 스크리닝이 이질육배체 밀에서 동종 대립유전자 중 하나 이상에서 원하는 AA 변형을 갖는 밀 식물의 생성 가능성에 대한 양호한 예측을 가능하게 함을 입증한다.
표 1. 편집-특이적인 PCR (ACCaseI1781L)을 위한 프라이머
표 2. ACCaseI1781L 편집을 위한 상이한 gRNA/ 공여자 DNA 조합의 스크리닝: 편집 PCR에서 양성인 배반 조직 샘플 (ACCaseI1781L)의 수
실시예 2: Cas9 뉴클레아제에 의해 이질육배체 밀의 ACCase (아세틸-CoA 카르복실라제) 유전자에서 I1781L 돌연변이의 도입을 위한 상동성-의존적인 정확한 유전자 편집.
본 발명자들은 실시예 1에 기재된 바와 같이 이질육배체 밀에서 잠재적인 HR-매개된 정확한 유전자 편집 능력에 대해 Cas9 뉴클레아제 및 사전 스크리닝된 gRNA/공여자 DNA 조합을 이용함으로써, 원하는 돌연변이가 하나 이상의 동종 대립유전자의 표적 코돈에 도입될 수 있음을 입증하였다. sgRNA 벡터 pBAY02528 (서열식별번호: 5)은 표적 코돈에 걸쳐 위치하는 표적 부위 TS1 서열 CTAGGTGTGGAGAACATACA-TGG에서 DSB의 생성을 위해 Cas9 뉴클레아제를 가이딩하는 gRNA1의 발현을 위한 카세트를 포함한다. 공여자 DNA pBAY2539는 단백질 수준에서 I1781L 변화를 유도하는 표적 코돈에서 2개의 염기 치환 (ATA에서 CTC로)의 도입을 위해 설계되었다. 공여자 DNA는 원하는 돌연변이 (I1781L 치환)를 함유하는 트리티쿰 아에스티붐, 재배종 필더 서브게놈 B, ACCase 유전자의 803bp DNA 단편을 포함한다. 공여자 DNA는 또한 공여자 DNA 및 원하는 돌연변이 (I1781L)를 갖는 편집된 대립유전자의 절단을 방지하기 위해 일부 다른 침묵 돌연변이를 함유한다. 공여자 DNA에서 3-bp (CTC) 코어 서열은 서브게놈 B의 WT ACCase 서열과 동일한 ~400-bp 좌측 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹되었다.
2-3 mm 크기의 미성숙 배아를 밀 재배종 필더의 멸균된 이삭으로부터 단리하고, [Sparks and Jones (Cereal Genomics: Methods in Molecular biology, vol. 1099, Chapter 17)]에 기재된 바와 같이 PDS-1000/He 입자 전달 시스템에 의해 충격을 가하였다. 벡터 pBAY02430 (Cas9 뉴클레아제) (서열식별번호: 1; 서열식별번호: 2), pBAY02528 (gRNA) (서열식별번호: 5), pBAY02539 (공여자 DNA) (서열식별번호: 13)의 플라스미드 DNA를 플라스미드 pIB26 (서열식별번호: 18)과 혼합하였다. 벡터 pIB26 (서열식별번호: 18)은 35S 프로모터의 제어하에 egfp-bar 융합 유전자를 함유한다. [Ishida et al. (Agrobacterium Protocols: Volume 1, Methods in Molecular Biology, vol. 1223, Chapter 15)]에 기재된 바와 같이, 충격을 받은 미성숙 배아를 1-2 주 동안 비-선택적인 캘러스 유도 배지로 옮긴 다음, PPT 함유 선택 배지로 옮겼고, PPT 내성 캘러스를 선택하고, 새싹 형성을 위해 재생 배지로 옮겼다.
한 미성숙 배아로부터 발달된 모든 식물은 풀로서 처리되었다. 게놈 DNA를 풀링된 잎 샘플로부터 추출하였고, 프라이머 세트 (HT-18-111 정방향 (서열식별번호: 28) / HT-18-112 역방향 (서열식별번호: 29))는 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭을 위해 설계되었다. 이어서, 이 제1 편집 특이적인 PCR에서 예상된 PCR 단편을 제공하는 풀에서의 묘목을 개별 튜브로 옮기고, 프라이머 세트 HT-18-111 (서열식별번호: 28) /HT-18-112 (서열식별번호: 29)를 이용하는 PCR에 의해 및 딥 시퀀싱에 의해 추가로 분석하였다. 9가지 실험을 위해 총 337, 326, 415, 322, 350, 329, 261, 361 및 362개의 배아를 pBAY02430 (Cas9 뉴클레아제) (서열식별번호: 1; 서열식별번호: 2), pBAY02528 (gRNA) (서열식별번호: 5), pBAY02539 (공여자 DNA) (서열식별번호: 13) 및 pIB26 (서열식별번호: 18)의 플라스미드 DNA의 혼합물에 의해 충격을 가하였다. 이들 9가지 실험에서, 총 132, 172, 111, 177, 107, 166, 122, 244 및 279개의 미성숙 배아로부터 포스피노트리신 (PPT) 내성 새싹 재생 캘러스를 수득하였다. 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭은 8, 17, 15, 9, 16, 7, 6, 9 및 8개의 풀링된 잎 샘플에서 관찰되었다. 제2 편집 특이적인 PCR을 제1 편집 PCR에서 양성으로 평점된 8, 15, 15, 8, 16, 7, 6, 9 및 8개의 묘목 풀로부터 유래된 총 51, 62, 66, 33, 49, 25, 35, 42 및 31개의 개별 식물에 대해 수행하였고, 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭은 각각 6, 11, 8, 7, 10, 7, 4, 8 및 8개의 묘목 풀로부터 유래된 16, 28, 12, 25, 19, 19, 13, 21 및 12개의 개별 묘목에서 관찰되었다 (표 3). 각각의 묘목 풀이 단일 미성숙 배아로부터 유래되므로, 단일 미성숙 배아로부터 유래된 모든 묘목 (묘목 풀)은 독립적인 편집된 사건으로 고려되지만, 본 발명자들은 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 단일 미성숙 배아로부터 유래된 개별 새싹들 사이에서 다중 독립적인 편집된 사건이 있을 수 있음을 배제할 수 없다. 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 각각의 사건으로부터의 한 식물에 대해, 딥 시퀀싱을 수행하였다. 의도된 표적 부위를 둘러싸는 영역은 네스티드 PCR에 의해 Q5 고충실도 폴리머라제 (M0492L)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 제1 PCR을 위해 프라이머 쌍 HT-18-162 (서열식별번호: 34) / HT-18-112 (서열식별번호: 29)가 사용되었고; 이들 프라이머는 1736bp 단편의 증폭을 위해 공여자 DNA의 상동성 아암 외부에 위치하였다. NGS에 대한 386 bp 영역을 증폭시키기 위한 네스티드 PCR의 경우, 프라이머 쌍 HT-18-048 (서열식별번호: 19)/ HT-18-053 (서열식별번호: 21)이 사용되었다.
본 발명자들은 총 리드 수의 비율로서 공여자 DNA에 의해 지시되는 표적 코돈에서 원하는 돌연변이 (AA 치환)의 존재에 대한 증거를 나타내는 서열 리드의 백분율을 계산함으로써 편집 빈도를 평가하였다. 이들 데이터는 표 4에 요약되며, 59회 독립적인 사건으로부터 64개의 묘목에 대한 총 리드 수를 기반으로 하여 원하는 돌연변이 (I1781L 치환)를 갖는 정확하게 편집된 리드의 % 및 WT 리드의 %를 나타낸다. 충격을 받지 않은 미성숙 배아로부터 유래된 묘목 TMTA0136-Ctrl0001-01$002로부터의 대조군 샘플은 예상되는 바와 같이 ~100% WT 리드 및 정확하게 편집된 리드 없음을 나타내었다.
이들 딥 시퀀싱 분석 데이터는 이질육배체 밀에서 천연 ACCase 유전자의 1 내지 4개의 대립유전자의 상동성 재조합 (HR)에 의한 정확한 유전자 편집을 나타내었다.
공여자 DNA에 의해 지시되는 원하는 AA 치환 및 추가의 침묵 돌연변이 도입을 일으키는 HR-매개된 정확한 공여자는 클로닝된 PCR 단편의 생어 시퀀싱에 의해 추가로 확인되었다. 딥 시퀀싱에 의해 분석된 이들 사건 중 11개에서, 프라이머 쌍 HT-18-162 정방향 (서열식별번호: 34) / HT-18-112 (서열식별번호: 29) 역방향에 의한 표적 영역에 대한 PCR 증폭, 클로닝 및 생어 시퀀싱을 서브게놈 특징분석을 위해 수행하였다. 사건당 52 내지 96개의 클론을 시퀀싱하였다. 이들 데이터는 표 5에 요약되어 있으며, 정확하게 편집된 대립유전자(들)을 갖는 식물은 가장 흔하게는 NHEJ-유래된 InDel을 갖는 대립유전자(들) 및 때때로 또한 WT 대립유전자(들)을 함유한다. 이들 T0 식물을 종자 생성을 위해 온실로 옮겼다. 상이한 서브게놈에 정확한 편집된 대립유전자를 갖는 독립적인 사건으로부터의 식물을 교배하여, 예를 들어 ACCase 유전자의 3개의 상동성 카피 모두에서 원하는 AA 변형을 갖는 식물을 생성할 수 있고, NHEJ-유래된 Indel을 갖는 원치 않는 대립유전자는 자손 분리에 의해 제거될 수 있다.
표 3. 편집 PCR 분석을 기반으로 하는 ACCase I1781L 편집된 묘목의 수
* 각각의 잎 풀은 하나의 미성숙 배아로부터 유래된다
표 4. 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 독립적인 사건으로부터 개별 묘목의 아세틸-CoA 카르복실라제 표적 로커스 (ACCase I1781L)에서 정확하게 편집된 리드 퍼센트 (%)
표 5. 클로닝된 PCR 단편의 생어 시퀀싱에 의한 독립적인 사건으로부터의 11개의 T0 식물에서 ACCase 로커스 유전자형. 정확한 편집은 공여자 DNA에 의해 지시된 원하는 AA 치환 및 추가의 침묵 돌연변이를 갖는 정확하게 편집된 ACCase 대립유전자의 존재를 나타내고, InDel은 NHEJ 돌연변이의 존재를 나타내고, WT는 WT 천연 ACCase 서열의 존재를 나타낸다. 정확한 편집, WT, InDel 앞의 숫자는 ACCase 대립유전자의 3가지 상이한 버전이 확인된 빈도를 나타낸다.
실시예 3: 쌍을 형성한 Cas9 닉카제에 의해 이질육배체 밀의 ACCase (아세틸-CoA 카르복실라제) 유전자에서 I1781L 돌연변이의 도입을 위한 상동성-의존적인 정확한 유전자 편집.
하기 실시예는 쌍을 형성한 Cas9 닉카제에 의해 이질육배체 밀의 ACCase (아세틸-CoA 카르복실라제) 유전자에서 I1781L 돌연변이의 도입을 위한 상동성-의존적인 정확한 유전자 편집을 기재한다. Cas9 닉카제 및 2개의 sgRNA를 사용하여 SpCas9 닉카제를 반대쪽 가닥에서 서로 근접하고 표적 코돈 ACCase I1781 및 공여자 DNA에 근접하게 있는 2개의 표적 부위 (TS1, T2)로 유도함으로써, 원하는 돌연변이를 표적 코돈에 효율적으로 도입할 수 있다. Cas9 닉카제 발현 벡터 pBay02734 (서열식별번호: 3; 서열식별번호: 4)를 구축하였다. RuvC 도메인 내의 위치 10에서 아스파르트산에서 알라닌으로의 돌연변이 (D10A 돌연변이)에 의한 Cas9 닉카제는 밀에 대해 코돈 최적화되었고, pUbiZm 프로모터 및 3'35S 종결자의 제어하에 있다. 3가지 밀 서브게놈 A, B 및 D 상의 모든 유전자 카피를 표적화하고, 표적 코돈에 걸쳐 있는 32 bp 3' 오버행을 생성하기 위해 2가지 sgRNA를 설계하였다. sgRNA 벡터 pBAY02528 (서열식별번호: 5)은 표적 부위 TS1 서열 CTAGGTGTGGAGAACATACA-TGG에서 닉의 생성을 위해 Cas9 닉카제를 가이딩할 수 있는 gRNA1의 발현을 위한 카세트를 포함한다. sgRNA 벡터 pBAY02531은 표적 부위 TS2 서열 CTCCTCATAGGCCCTAGAAT-AGG를 표적화하는 gRNA2의 발현을 위한 카세트를 포함한다. 공여자 DNA pBAY02540 (서열식별번호: 14)은 단백질 수준에서 I1781L 변화를 유도하는 표적 코돈에서 2개의 염기 치환 (ATA에서 CTC로)의 도입을 위해 설계되었다. 공여자 DNA는 원하는 돌연변이 (I1781L 치환)를 함유하는 트리티쿰 아에스티붐, 재배종 필더 서브게놈 B, ACCase 유전자의 803bp DNA 단편을 포함한다. 공여자 DNA는 또한 공여자 DNA 및 원하는 돌연변이 (I1781L)를 갖는 편집된 대립유전자의 절단을 방지하기 위해 일부 다른 침묵 돌연변이를 함유한다. 공여자 DNA에서 3-bp (CTC) 코어 서열은 서브게놈 B의 WT ACCase 서열과 동일한 ~400-bp 좌측 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹되었다.
2-3 mm 크기의 미성숙 배아를 밀 재배종 필더의 멸균된 이삭으로부터 단리하고, [Sparks and Jones (Cereal Genomics: Methods in Molecular biology, vol. 1099, Chapter 17)]에 기재된 바와 같이 PDS-1000/He 입자 전달 시스템을 이용하여 충격을 가하였다. 벡터 pBAY02734 (Cas9 닉카제) (서열식별번호: 3; 서열식별번호: 4), pBAY02528 (gRNA1) (서열식별번호: 5), pBAY02531 (gRNA2), pBAY02540 (공여자 DNA) (서열식별번호: 14)의 플라스미드 DNA를 플라스미드 pIB26 (서열식별번호: 18)과 혼합하였다. 벡터 pIB26 (서열식별번호: 18)은 35S 프로모터의 제어하에 egfp-bar 융합 유전자를 함유한다. [Ishida et al. (Agrobacterium Protocols: Volume 1, Methods in Molecular Biology, vol. 1223, Chapter 15)]에 기재된 바와 같이, 충격을 받은 미성숙 배아를 1-2 주 동안 비-선택적인 캘러스 유도 배지로 옮긴 다음, PPT 함유 선택 배지로 옮기고, PPT 내성 캘러스를 선택하고, 새싹 형성을 위해 재생 배지로 옮겼다.
하나의 미성숙 배아로부터 발달한 모든 식물은 풀로서 처리되었다. 게놈 DNA를 풀링된 잎 샘플로부터 추출하였고, 프라이머 세트 (HT-18-113 정방향 / HT-18-112 역방향)는 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭을 위해 설계되었다. 이어서, 이 제1 편집 특이적인 PCR에서 예상된 PCR 단편을 제공하는 풀에서의 묘목을 개별 튜브로 옮기고, 프라이머 세트 HT-18-113/HT-18-112를 이용하는 PCR에 의해 및 딥 시퀀싱에 의해 추가로 분석하였다. 6가지 실험을 위해 총 358, 423, 365, 355, 409 및 395개의 배아를 pBAY02734 (Cas9 닉카제) (서열식별번호: 3; 서열식별번호: 4), pBAY02528 (gRNA1) (서열식별번호: 5), pBAY02531 (gRNA2), pBAY02540 (공여자 DNA) (서열식별번호: 14) 및 pIB26 (서열식별번호: 18)의 플라스미드 DNA의 혼합물에 의해 충격을 가하였다. 이들 6가지 실험에서, 포스피노트리신 (PPT) 내성 새싹 재생 캘러스는 총 195, 163, 192, 181, 268 및 190개의 미성숙 배아로부터 수득되었다. 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭은 13, 6, 44, 22, 21 및 22개의 풀링된 잎 샘플에서 관찰되었다. 제2 편집 특이적인 PCR은 제1 편집 PCR에서 양성으로 평점된 11, 5, 39, 17, 16 및 20개의 묘목 풀로부터 유래된 총 45, 20, 258, 64, 94, 93개의 개별 식물에서 수행되었다. 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭은 각각 11, 5, 33, 14, 12 및 17개의 묘목 풀로부터 유래된 22, 18, 93, 41, 18 및 35개의 개별 새싹에서 관찰되었다 (표 6). 각각의 묘목 풀이 단일 미성숙 배아로부터 유래되므로, 단일 미성숙 배아로부터 유래된 모든 묘목 (묘목 풀)이 독립적인 편집된 사건으로 고려되지만, 본 발명자들은 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 단일 미성숙 배아로부터 유래된 개별 새싹들 사이의 다중 독립적인 편집된 사건이 있을 수 있음을 배제할 수 없다. 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 각각의 사건으로부터의 한 식물에 대해, 딥 시퀀싱을 수행하였다. 의도된 표적 부위를 둘러싸는 영역을 네스티드 PCR에 의해 Q5 고충실도 폴리머라제 (M0492L)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 제1 PCR을 위해 프라이머 쌍 HT-18-162/ HT-18-112가 사용되었고; 이들 프라이머는 1736bp 단편의 증폭을 위해 공여자 DNA의 상동성 아암 외부에 위치하였다. NGS에 대한 386 bp의 영역을 증폭시키기 위한 네스티드 PCR의 경우, 프라이머 쌍 HT-18-048/ HT-18-053이 사용되었다.
본 발명자들은 총 리드 수의 비율로서 표적 코돈에서 원하는 I1781L 돌연변이의 존재에 대한 증거를 나타내는 서열 리드의 백분율을 계산함으로써 편집 빈도를 평가하였다. 이들 데이터는 표 7에 요약되며, 모두 독립적인 사건으로부터 유래된 57개의 묘목에 대해, 총 리드 수, 원하는 돌연변이 (I1781L 치환)을 갖는 리드의 %, 공여자 DNA에 존재하는 원하는 돌연변이 및 모든 침묵 돌연변이를 갖는 리드의 %, 및 WT 리드의 %를 나타낸다. 이들 딥 시퀀싱 분석 데이터는 이질육배체 밀에서 천연 ACCase 유전자의 1 내지 4개의 대립유전자가 원하는 I1781L 치환을 함유함을 나타내었다. 이들 데이터는 추가로 원하는 AA 치환을 갖는 식물에서 복구 DNA로부터 모든 침묵 돌연변이가 항상 도입된 것은 아니었음을 나타낸다. 침묵 돌연변이는 표적 부위 TS2 (gRNA2) 주위에 위치하였다. 이들 데이터는 추가로 원하는 편집 (I1781L)을 갖는 대립유전자(들)을 갖는 식물의 ~50% (28/57)가 NHEJ-유래된 InDel을 갖는 리드를 함유하지 않음을 나타낸다. 다른 50%에서 NHEJ-유래된 InDel을 갖는 리드의 수는 때때로 매우 낮다. 대조적으로 CRISPR/Cas 닉카제 대신에 CRISPR/Cas9 뉴클레아제를 사용함으로써, 하나 이상의 정확하게 편집된 대립유전자를 갖는 사건의 98-100% 또한 NHEJ-유래된 InDel을 갖는 대립유전자(들)을 함유한다 (표 4).
닉카제를 사용하여 정확하게 편집된 대립유전자를 갖는 사건에서 Indel을 갖는 대립유전자의 부재는 정확한 편집을 위해 밀 서브게놈 (A,B,D) 식물 동형접합성 (HH), 반접합성 (Hh) 및 WT (hh) 중 하나 이상에 대해 정확하게 편집된 대립유전자(들)의 성능 영향의 용량 효과를 연구하는 것을 더 용이하게 만들 것이고, 추가의 성능 평가를 위해 T1 세대에서 이미 이용가능하였을 것이다. 상이한 서브게놈에서 정확한 편집된 대립유전자를 갖는 독립적인 사건으로부터의 식물을 교배하여, 예를 들어 표적 유전자의 3개의 상동성 카피 모두에서 원하는 AA 변형을 갖는 식물을 생성할 수 있다.
표 6. 편집 PCR 분석을 기반으로 하여 Cas9 쌍을 형성한 닉카제의 사용에 의해 ACCase I1781L 편집된 묘목의 수
표 7. 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 독립적인 사건으로부터의 개별 묘목의 아세틸-CoA 카르복실라제 표적 로커스 (ACCase I1781L)에서 정확하게 편집된 리드 퍼센트 (%)
실시예 4: Cas9 뉴클레아제에 의해 이질육배체 밀의 ACCase (아세틸-CoA 카르복실라제) 유전자에서 A2004V 돌연변이의 도입을 위한 상동성-의존적인 정확한 유전자 편집.
실시예 1에 기재된 바와 같이 이질육배체 밀에서 잠재적인 HR-매개된 정확한 유전자 편집 능력에 대한 Cas9 뉴클레아제 및 사전 스크리닝된 gRNA/공여자 DNA 조합을 이용함으로써, 본 발명자들은 표적화된 DSB의 HR-매개된 공여자에 의해 및 PPT에 대한 내성에 대한 간접적인 선택을 통해 ACCase 유전자의 하나 이상의 대립유전자에서 원하는 아미노산 치환 A2004V를 갖는 편집된 밀 식물을 복구하였다. sgRNA 벡터 pBAY02524 (서열식별번호: 10)는 표적 GCT 코돈의 상류 가까이에 위치하는 표적 부위 TS 서열 TTCCTCGTGCTGGGCAAGTC-TGG에서 DSB의 생성을 위해 Cas9 뉴클레아제를 가이딩하는 gRNA의 발현을 위한 카세트를 포함한다. 공여자 DNA pBAY02536 (서열식별번호: 16)은 단백질 수준에서 A2004 변화를 유도하는 표적 코돈에서 2개의 염기 치환 (GCT에서 GTC로)의 도입을 위해 설계되었다. 공여자 DNA는 원하는 돌연변이 (A2004V 치환)를 함유하는 트리티쿰 아에스티붐, 재배종 필더 서브게놈 B, ACCase 유전자의 787bp DNA 단편을 포함한다. 공여자 DNA는 또한 공여자 DNA 및 원하는 돌연변이 (A2004V)를 갖는 편집된 대립유전자의 절단을 방지하기 위해 일부 다른 침묵 돌연변이를 함유한다. 공여자 DNA에서 3-bp (GTC) 코어 서열은 서브게놈 B의 WT ACCase 서열과 동일한 ~390-bp 좌측 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹되었다.
2-3 mm 크기의 미성숙 배아를 밀 재배종 필더의 멸균된 이삭으로부터 단리하고, [Sparks and Jones (Cereal Genomics: Methods in Molecular biology, vol. 1099, Chapter 17)]에 기재된 바와 같이 PDS-1000/He 입자 전달 시스템을 이용하여 충격을 가하였다. 벡터 pBAY02430 (Cas9 뉴클레아제) (서열식별번호: 1; 서열식별번호: 2), pBAY02524 (gRNA) (서열식별번호: 10), pBAY02536 (공여자 DNA) (서열식별번호: 16)의 플라스미드 DNA를 플라스미드 pIB26 (서열식별번호: 18)과 혼합하였다. 벡터 pIB26 (서열식별번호: 18)은 35S 프로모터의 제어하에 egfp-bar 융합 유전자를 함유한다. [Ishida et al. (Agrobacterium Protocols: Volume 1, Methods in Molecular Biology, vol. 1223, Chapter 15)]에 기재된 바와 같이, 충격을 받은 미성숙 배아를 1-2 주 동안 비-선택적인 캘러스 유도 배지로 옮긴 다음, PPT 함유 선택 배지로 옮기고, PPT 내성 캘러스를 선택하고, 새싹 형성을 위해 재생 배지로 옮겼다.
하나의 미성숙 배아로부터 발달한 모든 식물은 풀로서 처리되었다. 게놈 DNA를 풀링된 잎 샘플로부터 추출하였고, 프라이머 쌍 (HT-18-101 정방향 (서열식별번호: 25)/ HT-18-102 역방향 (서열식별번호: 26))은 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭을 위해 설계되었다. 이어서, 이 제1 편집 특이적인 PCR에서 예상된 PCR 단편을 제공하는 풀에서의 묘목을 개별 튜브로 옮기고, 프라이머 세트 HT-18-101 정방향 (서열식별번호: 25)/ HT-18-102 역방향 (서열식별번호: 26)을 이용하는 PCR에 의해 및 딥 시퀀싱에 의해 추가로 분석하였다. 4가지 실험을 위해 총 382, 424, 401 및 375개의 배아를 pBAY02430 (Cas9 뉴클레아제) (서열식별번호: 1; 서열식별번호: 2), pBAY02524 (gRNA1) (서열식별번호: 10), pBAY02536 (공여자 DNA-1) 및 pIB26 (서열식별번호: 18)의 플라스미드 DNA의 혼합물에 의해 충격을 가하였다. 이들 4 실험에서, 포스피노트리신 (PPT) 내성 새싹 재생 캘러스를 총 107, 326, 341 및 300개의 미성숙 배아로부터 수득하였다. 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭은 2, 28, 7 및 5개의 풀링된 잎 샘플에서 관찰되었다. 제2 편집 특이적인 PCR은 제1 편집 PCR에서 양성으로 평점된 2, 27, 6 및 5개의 묘목 풀로부터 유래된 총 14, 259, 29 및 40개의 개별 식물에 대해 수행되었고, 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭은 각각 2, 23, 3 및 6개의 묘목 풀로부터 유래된 7, 58, 7 및 7개의 개별 묘목에서 관찰되었다 (표 8). 각각의 묘목 풀이 단일 미성숙 배아로부터 유래되므로, 단일 미성숙 배아로부터 유래된 모든 묘목 (묘목 풀)이 독립적인 편집된 사건으로 고려되지만, 본 발명자들은 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 단일 미성숙 배아로부터 유래된 개별 새싹들 사이의 다중 독립적인 편집된 사건이 있을 수 있음을 배제할 수 없다. 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 독립적인 사건으로부터의 식물에 대해, 딥 시퀀싱을 수행하였다. 제1 PCR을 위해 프라이머 쌍 HT-18-101 (서열식별번호: 25)/ HT-18-110 (서열식별번호: 27)이 사용되었고; 이들 프라이머는 1313bp 단편의 증폭을 위해 공여자 DNA의 상동성 아암의 외부에 위치하였다. NGS에 대한 348 bp 영역을 증폭시키기 위한 네스티드 PCR의 경우, 프라이머 쌍 HT-18-051 (서열식별번호: 20)/ HT-18-054 (서열식별번호: 22)가 사용되었다. 이들 데이터는 본 발명자들이 AA 치환 A2004V를 갖는 정확하게 편집된 1 또는 2개의 대립유전자를 갖는 식물을 복구하였음을 나타낸다 (표 9).
표 8.
표 9. 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 독립적인 사건으로부터의 개별 묘목의 아세틸-CoA 카르복실라제 표적 로커스 (ACCase A2004V)에서 정확하게 편집된 리드 퍼센트 (%)
실시예 5: Cas9 뉴클레아제에 의해 이질육배체 밀의 ALS (아세토락테이트 신타제) 유전자에서 ALSW548L 돌연변이의 도입을 위한 상동성-의존적인 정확한 유전자 편집.
실시예 3에 기재된 바와 같이 이질육배체 밀에서 잠재적인 HR-매개된 정확한 유전자 편집 능력에 대해 Cas9 뉴클레아제 및 사전 스크리닝된 gRNA/공여자 DNA 조합을 사용함으로써, 본 발명자들은 표적화된 DSB의 HR-매개된 공여자에 의해 및 PPT에 대한 내성에 대한 간접적인 선택에 의해 ALS 유전자의 하나 이상의 대립유전자에서 원하는 아미노산 치환 W548L을 갖는 편집된 밀 식물을 복구하였다. 본 발명자들은 2가지 적절한 sgRNA 벡터를 확인하였다. sgRNA 벡터 pBAY02533 (서열식별번호: 11) 및 pBAY02535 (서열식별번호: 12)는 각각 표적 부위 TS 서열 GAACAACCAGCATCTGGGAA-TGG 및 ATCTGGGAATGGTGGTGCAG-TGG에서 DSB의 생성을 위해 Cas9 뉴클레아제를 가이딩하는 gRNA의 발현을 위한 카세트를 포함한다. 공여자 DNA pBAY02542 (서열식별번호: 17)는 단백질 수준에서 W548L 변화를 유도하는 표적 코돈에서 2개의 염기 치환 (TGG에서 CTC로)의 도입을 위해 설계되었다. 공여자 DNA는 원하는 돌연변이 (W548L 치환)를 함유하는 트리티쿰 아에스티붐, 재배종 필더 서브게놈 D, ALS 유전자의 805bp DNA 단편을 포함한다. 공여자 DNA는 또한 공여자 DNA 및 원하는 돌연변이 (W548L)를 갖는 편집된 대립유전자의 절단을 방지하기 위해 일부 다른 침묵 돌연변이를 함유한다. 공여자 DNA에서 3-bp (CTC) 코어 서열은 서브게놈 D의 WT ALS 서열과 동일한 ~400-bp 좌측 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹되었다.
2-3 mm 크기의 미성숙 배아를 밀 재배종 필더의 멸균된 이삭으로부터 단리하고, [Sparks and Jones (Cereal Genomics: Methods in Molecular biology, vol. 1099, Chapter 17)]에 기재된 바와 같이 PDS-1000/He 입자 전달 시스템을 이용하여 충격을 가하였다. 벡터 pBAY02430 (Cas9 뉴클레아제) (서열식별번호: 1; 서열식별번호: 2), pBAY02533 (gRNA) (서열식별번호: 11) 또는 pBAY02535 (gRNA) (서열식별번호: 12), pBAY02542 (공여자 DNA) (서열식별번호: 17)의 플라스미드 DNA를 플라스미드 pIB26 (서열식별번호: 18)과 혼합하였다. 벡터 pIB26 (서열식별번호: 18)은 35S 프로모터의 제어하에 egfp-bar 융합 유전자를 함유한다. [Ishida et al. (Agrobacterium Protocols: Volume 1, Methods in Molecular Biology, vol. 1223, Chapter 15)]에 기재된 바와 같이, 충격을 받은 미성숙 배아를 1-2 주 동안 비-선택적인 캘러스 유도 배지로 옮긴 다음, PPT 함유 선택 배지로 옮기고, PPT 내성 캘러스를 선택하고, 새싹 형성을 위해 재생 배지로 옮겼다.
하나의 미성숙 배아로부터 발달한 모든 식물은 풀로서 처리되었다. 게놈 DNA를 풀링된 잎 샘플로부터 추출하였고, 프라이머 쌍 (HT-18-135 정방향 (서열식별번호: 32) / HT-18-136 역방향 (서열식별번호: 33))은 편집된 ALS 유전자의 특이적인 증폭을 위해 설계되었다. 이어서, 이 제1 편집 특이적인 PCR에서 예상된 PCR 단편을 제공하는 풀에서의 묘목을 개별 튜브로 옮기고, 프라이머 쌍 HT-18-135 정방향 (서열식별번호: 32) / HT-18-136 역방향 (서열식별번호: 33)을 이용하는 PCR에 의해 및 딥 시퀀싱에 의해 추가로 분석하였다. 4가지 실험을 위해 총 325, 467, 385 및 339개의 배아를 pBAY02430 (Cas9 뉴클레아제) (서열식별번호: 1; 서열식별번호: 2), pBAY02533 (gRNA) (서열식별번호: 11) 또는 pBAY02535 (서열식별번호: 12) 및 pBAY02542 (공여자 DNA) (서열식별번호: 17) 및 pIB26 (서열식별번호: 18)의 플라스미드 DNA의 혼합물에 의해 충격을 가하였다. 이들 4가지 실험에서, 포스피노트리신 (PPT) 내성 새싹 재생 캘러스는 각각 총 235, ~258, 112 및 164개의 미성숙 배아로부터 수득되었다. 편집된 ALS 유전자의 특이적인 증폭은 10, 11, 3 및 4개의 풀링된 잎 샘플에서 관찰되었다. 제2 편집 특이적인 PCR은 제1 편집 PCR에서 양성으로 평점된 10, 11, 3 및 3개의 묘목 풀로부터 유래된 총 53, 71, 27 및 13개의 개별 식물에 대해 수행되었고, 편집된 ALS 유전자의 특이적인 증폭은 각각 4, 7, 3 및 2개의 묘목 풀로부터 유래된 14, 25, 12 및 4개의 개별 묘목에서 관찰되었다 (표 10). 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 독립적인 사건으로부터의 수많은 식물에 대해, 딥 시퀀싱을 수행하였다. 제1 PCR을 위해 프라이머 쌍 HT-18-130 (서열식별번호: 31) / HT-18-136 (서열식별번호: 33)이 사용되었고; 이들 프라이머는 1278bp 단편의 증폭을 위해 공여자 DNA의 상동성 아암의 외부에 위치하였다. NGS에 대한 320 bp의 영역을 증폭시키기 위한 네스티드 PCR의 경우, 프라이머 쌍 HT-18-065 (서열식별번호: 23)/ HT-18-066 (서열식별번호: 24)이 사용되었다. 이들 데이터는 본 발명자들이 원하는 AA 치환 W548L을 갖는 정확하게 편집된 1 또는 2개의 대립유전자를 갖는 식물을 복구하였음을 나타내었다. 10% 미만의 정확한 편집 %를 갖는 묘목은 키메라인 것으로 고려된다 (예를 들어 TMTA0158-0107-B01-01$001, TMTA0183-0055-B01-01$001) (표 11).
표 10. 편집 PCR 분석을 기반으로 하는 ALS W548L 편집된 묘목의 수
표 11. 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 독립적인 사건으로부터의 개별 묘목의 아세토락테이트 신타제 유전자 (ALS W548L)에서 정확하게 편집된 리드 퍼센트 (%)
실시예 6: Cas9 뉴클레아제에 의해 및 직접적인 선택에 의해 이질육배체 밀의 ACCase (아세틸-CoA 카르복실라제) 유전자에서 I1781L 돌연변이의 도입을 위한 상동성-의존적인 정확한 유전자 편집.
ACCase 유전자에서 I1781L 돌연변이의 도입을 위해 충격을 받은 미성숙 배아를 플라스미드 DNA pBAY02430 (Cas9) (서열식별번호: 1; 서열식별번호: 2), pBAY02528 (gRNA) (서열식별번호: 5) 및 공여자 DNA pBAY02539 (서열식별번호: 13)의 혼합물에 의해 충격을 가하였다. 충격을 받은 미성숙 배아를 1-2 주 동안 비-선택적인 캘러스 유도 배지로 옮긴 다음, 200 및 300nM 퀴잘로포프를 갖는 선택 배지로 옮겼다. 프라이머 쌍 HT-18-111 정방향 (서열식별번호: 28) / HT-18-112 역방향 (서열식별번호: 29)을 이용하는 편집 특이적인 PCR에서 양성인 퀴잘로포프 내성 라인을 복구하였다. 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 독립적인 사건으로부터의 수많은 식물에 대해, 딥 시퀀싱을 수행하였다. 이들 NGS 데이터는 이들 식물이 원하는 AA 치환 I1781L을 갖는 하나 이상의 정확하게 편집된 대립유전자를 함유함을 추가로 확인시켜 준다.
실시예 7: CRISPR/Cas9 성분의 RNP-매개된 전달에 의해 이질육배체 밀의 ACCase (아세틸-CoA 카르복실라제) 유전자에서 I1781L 돌연변이의 도입을 위한 상동성-의존적인 정확한 유전자 편집
CRISPR/Cas9 RNP 복합체를 생성하기 위해, Cas9 단백질 (알트-알(Alt-R)® S.p. Cas9 뉴클레아제 V3, IDT) 및 sgRNA (알트-알® CRISPR-Cas9 crRNA XT 및 알트-알® CRISPR-Cas9 tracrRNA, IDT)를 IDT의 프로토콜에 따라 사전 혼합하였다 (www.idtdna.com). sgRNA는 ACCase에서 표적 코돈에 걸쳐 위치하는 서열 CTAGGTGTGGAGAACATACA-TGG를 표적화하도록 설계되었다.
[Svitashev et al. 2016]에 기재된 바와 같이, 2-3 mm 크기의 미성숙 배아를 PDS-1000/He 입자 전달 시스템을 이용하여 RNP 및 공여자 DNA pBay02539 (서열식별번호: 13)의 혼합물에 의해 충격을 가하였다. 충격을 받은 미성숙 배아를 2 주 동안 비-선택적인 캘러스 유도 배지로 옮긴 다음, 200nM 퀴잘로포프를 갖는 선택 배지로 옮겼다. 2가지 실험을 위해 총 298 및 302개의 배아를 RNP 및 공여자 DNA pBAY02539 (서열식별번호: 13)의 혼합물에 의해 충격을 가하였다. 이들 2가지 실험으로부터 퀴잘로포프 내성 라인이 16 및 9개의 미성숙 배아로부터 수득되었고, 이들 25개의 라인에 대해 프라이머 쌍 HT-18-111 정방향 (서열식별번호: 28) / HT-18-112 역방향 (서열식별번호: 29)을 이용하는 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭이 관찰되었다.
편집 PCR에서 양성으로 평점된 9가지 독립적인 사건에 대해, 1개의 식물 / 사건으로 딥 시퀀싱을 수행하였다. 의도된 표적 부위를 둘러싸는 영역을 네스티드 PCR에 의해 Q5 고충실도 폴리머라제 (M0492L)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 제1 PCR을 위해 프라이머 쌍 HT-18-162 (서열식별번호: 34) / HT-18-112 (서열식별번호: 29)가 사용되었고; 이들 프라이머는 1736bp 단편의 증폭을 위해 공여자 DNA의 상동성 아암 외부에 위치하였다. NGS에 대한 386 bp의 영역을 증폭시키기 위한 네스티드 PCR의 경우, 프라이머 쌍 HT-18-048 (서열식별번호: 19)/ HT-18-053 (서열식별번호: 21)이 사용되었다. 본 발명자들은 총 리드 수의 비율로서 공여자 DNA에 의해 지시되는 표적 코돈에서 원하는 돌연변이 AA 치환 (ACCase I1781L)의 존재에 대한 증거를 나타내는 서열 리드의 백분율을 계산함으로써 편집 빈도를 평가하였다. 이들 데이터는 본 발명자들이 원하는 AA 치환 I1781L을 갖는 정확하게 편집된 1 내지 3개의 대립유전자를 갖는 식물을 복구하였음을 나타내었다 (표 12).
표 12. 제2 편집 PCR에서 양성으로 평점된 독립적인 사건으로부터의 개별 묘목의 아세틸-CoA 카르복실라제 표적 로커스 (ACCase I1781L)에서 정확하게 편집된 리드 퍼센트 (%)
실시예 8: Cas12a 뉴클레아제에 의해 이질육배체 밀의 ACCase (아세틸-CoA 카르복실라제) 유전자에서 I1781L 돌연변이의 도입을 위한 상동성-의존적인 정확한 유전자 편집.
Cas12a 발현 벡터 pBas03568 (서열식별번호: 38; 서열식별번호: 39)은 밀에 대해 코돈 최적화되고 pUbiZm 프로모터 및 3'nos 종결자의 제어하에 있는 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) ND2006으로부터의 Lb Cas12a 뉴클레아제를 포함한다. LbCas12a 뉴클레아제 (pBas03568) gRNA pBas03609 (서열식별번호: 41) 및 공여자 DNA (pBas03253 (서열식별번호: 42))를 갖는 벡터의 플라스미드 DNA를 egfp-bar 융합 유전자를 함유하는 플라스미드 pIB26 (서열식별번호: 18)과 혼합하였다. sgRNA 벡터 pBas03609는 표적 부위 서열 5'-(TCCA)CACCTAGCCCATCCTCCTTCCCC-3'에서 DSB의 생성을 위해 LbCas12 뉴클레아제를 가이딩하는 gRNA의 발현을 위한 카세트를 포함한다. 공여자 DNA pBas03253은 단백질 수준에서 I1781L 변화를 유도하는 표적 코돈에서 2개의 염기 치환 (ATA에서 CTC로)의 도입을 위해 설계되었다. 공여자 DNA는 원하는 돌연변이 (I1781L 치환)를 함유하는 트리티쿰 아에스티붐, 재배종 필더 서브게놈 B, ACCase 유전자의 803bp DNA 단편을 포함하였다. 공여자 DNA는 또한 공여자 DNA 및 원하는 돌연변이 (I1781L)를 갖는 편집된 대립유전자의 절단을 방지하기 위해 일부 다른 침묵 돌연변이를 함유하였다. 공여자 DNA에서 3-bp (CTC) 코어 서열은 서브게놈 B의 WT ACCase 서열과 동일한 ~400-bp 좌측 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹되었다.
충격을 받은 미성숙 배아를 1-2 주 동안 비-선택적인 캘러스 유도 배지로 옮긴 다음, PPT를 갖는 선택 배지 (간접적인 선택) 또는 200nM 퀴잘로포프를 갖는 선택 배지로 옮겼다. 선택에서 생존한 식물은 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭을 위해 프라이머 쌍 HT-19-022 / HT-18-112)을 이용하는 PCR에 의해 추가로 분석되었다. 편집 PCR에서 양성으로 평점된 식물에 대해, 딥 시퀀싱을 수행하였다. 제1 PCR을 위해 프라이머 쌍 HT-18-162/ HT-18-112가 사용되었고; 이들 프라이머는 1736bp 단편의 증폭을 위해 공여자 DNA의 상동성 아암 외부에 위치하였다. 네스티드 PCR의 경우, 프라이머 쌍 18-048/ HT-18-053이 사용되었다.
딥 시퀀싱 분석 데이터는 이질육배체 밀에서 천연 ACCase 유전자의 1 내지 2개의 대립유전자 및 NHEJ-유래된 InDel 대립유전자를 갖는 1개 이상의 대립유전자의 상동성 재조합 (HR)에 의한 정확한 유전자 편집을 나타내었다 (표 13).
표 13. LbCas12a 뉴클레아제에 의해 편집된 식물의 아세틸-CoA 카르복실라제 표적 로커스 (ACCase I1781L)에서 정확하게 편집된 리드 퍼센트 (%).
실시예 9: 닉 사이의 거리가 더 큰, 쌍을 형성한 Cas9 닉카제에 의해 이질육배체 밀의 ACCase (아세틸-CoA 카르복실라제) 유전자에서 I1781L 돌연변이의 도입을 위한 상동성-의존적인 정확한 유전자 편집.
이 실험을 위해, 45nt 또는 136 nt의 2개의 닉 부위 사이의 거리를 갖는 반대쪽 가닥 상의 표적 부위로 SpCas9 닉카제를 유도하는 gRNA를 설계하였다. 서로 136 nt 거리에서 반대쪽 가닥 상에 닉을 생성하기 위해 미성숙 배아를 Cas9 닉카제 벡터 pBas02734 (서열식별번호: 3; 서열식별번호: 4), 공여자 DNA pBas04096 (서열식별번호: 35) 및 gRNA 벡터 쌍 pBay02528 (서열식별번호: 5) 및 pBas04093 (서열식별번호: 37)에 의해 공동-충격을 가하거나, 또는 배아를 서로 45 nt 거리에서 반대쪽 가닥 상에 닉을 각각 생성하는 Cas9 닉카제 벡터 pBas02734 (서열식별번호: 3; 서열식별번호: 4), 공여자 DNA pBay02544 (서열식별번호: 36) 및 gRNA 벡터 쌍 pBay02529 (서열식별번호: 6) 및 pBay02531 (서열식별번호: 8)에 의해 공동-충격을 가하였다. 충격 후에, 미성숙 배아를 2 주 동안 비-선택적인 캘러스 유도 배지로 옮긴 다음, 200nM 퀴잘로포프를 갖는 선택 배지로 옮겼다. 퀴잘로포프 내성 식물을 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭에 대해 프라이머 세트 (HT-18-113 정방향 / HT-18-112 역방향)를 사용하는 PCR에 의해 추가로 분석하였다. 편집 PCR에서 양성으로 평점된 식물에 대해, 딥 시퀀싱을 수행하였다. 딥 시퀀싱을 위해 의도된 표적 부위를 둘러싸는 영역을 네스티드 PCR에 의해 Q5 고충실도 폴리머라제 (M0492L)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 제1 PCR을 위해 프라이머 쌍 HT-18-162/ HT-18-112가 사용되었고; 이들 프라이머는 1736bp 단편의 증폭을 위해 공여자 DNA의 상동성 아암 외부에 위치하였다. 네스티드 PCR을 위해, 프라이머 쌍 18-048/ HT-18-053이 사용되었다. 표 14의 이들 데이터는, 심지어 닉 사이의 거리가 더 크더라도, NHEJ-유래된 InDel을 갖는 대립유전자가 없는 하나의 정확하게 편집된 대립유전자를 갖는 식물을 확인하는 것이 가능하다는 것을 나타내었다.
표 14. 쌍을 형성한 Cas9 닉카제에 의해 편집된 퀴잘로포프 내성 식물의 아세틸-CoA 카르복실라제 표적 로커스 (ACCase I1781L)에서 정확하게 편집된 리드 퍼센트 (%)
실시예 10: Cas12a 뉴클레아제에 의해 이질육배체 밀의 ACCase (아세틸-CoA 카르복실라제) 유전자에서 I1781L 돌연변이의 도입을 위한 상동성-의존적인 정확한 유전자 편집.
Cas12a 발현 벡터 pBas03568 (서열식별번호: 38; 서열식별번호: 39)는 밀에 대해 코돈 최적화되고 pUbiZm 프로모터 및 3'nos 종결자의 제어하에 있는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006으로부터의 Lb Cas12a 뉴클레아제를 포함한다. LbCas12a 뉴클레아제 (pBas03568), gRNA pBas03609 (서열식별번호: 41) 및 공여자 DNA (pBas03253 (서열식별번호: 42))를 갖는 벡터의 플라스미드 DNA를 egfp-bar 융합 유전자를 함유하는 플라스미드 pIB26 (서열식별번호: 18)과 혼합하였다. sgRNA 벡터 pBas03609는 표적 부위 서열 5'-(TCCA)CACCTAGCCCATCCTCCTTCCCC-3'에서 DSB의 생성을 위해 LbCas12 뉴클레아제를 가이딩하는 gRNA의 발현을 위한 카세트를 포함한다. 공여자 DNA pBas03253은 단백질 수준에서 I1781L 변화를 유도하는 표적 코돈에서 2개의 염기 치환 (ATA에서 CTC로)의 도입을 위해 설계되었다. 공여자 DNA는 원하는 돌연변이 (I1781L 치환)를 함유하는 트리티쿰 아에스티붐, 재배종 필더 서브게놈 B, ACCase 유전자의 803bp DNA 단편을 포함한다. 공여자 DNA는 또한 공여자 DNA 및 원하는 돌연변이 (I1781L)를 갖는 편집된 대립유전자의 절단을 방지하기 위해 일부 다른 침묵 돌연변이를 함유한다. 공여자 DNA에서 3-bp (CTC) 코어 서열은 서브게놈 B의 WT ACCase 서열과 동일한 ~400-bp 좌측 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹되었다.
충격을 받은 미성숙 배아를 1-2 주 동안 비-선택적인 캘러스 유도 배지로 옮긴 다음, PPT를 갖는 선택 배지 (간접적인 선택) 또는 200nM 퀴잘로포프를 갖는 선택 배지로 옮겼다. 선택에서 생존한 식물은 편집된 ACCase 유전자의 특이적인 증폭에 대해 프라이머 쌍 HT-19-022 / HT-18-112)을 사용하는 PCR에 의해 추가로 분석되었다. 편집 PCR에서 양성으로 평점된 식물에 대해, 딥 시퀀싱을 수행하였다. 제1 PCR을 위해 프라이머 쌍 HT-18-162/ HT-18-112가 사용되었고; 이들 프라이머는 1736bp 단편의 증폭을 위해 공여자 DNA의 상동성 아암 외부에 위치하였다. 네스티드 PCR의 경우, 프라이머 쌍 18-048/ HT-18-053이 사용되었다.
딥 시퀀싱 분석 데이터는 이질육배체 밀에서 천연 ACCase 유전자의 1 내지 2개의 대립유전자 및 NHEJ-유래된 InDel 대립유전자를 갖는 1개 이상의 대립유전자의 상동성 재조합 (HR)에 의한 정확한 유전자 편집을 나타내었다 (표 15).
표 15. LbCas12a 뉴클레아제에 의해 편집된 식물의 아세틸-CoA 카르복실라제 표적 로커스 (ACCase I1781L)에서 정확하게 편집된 리드 퍼센트 (%)
SEQUENCE LISTING
<110> BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
<120> Precise introduction of DNA or Mutations into the Genome of Wheat
<130> 190629WO01
<160> 42
<170> According Wipo Std 25
<210> 1
<211> 9155
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02430] comprising a modified Cas9 from Streptococ
cus pyogenes: NLS signals at both termini, optimized for u
se in wheat
<400> 1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatcctgc 420
aggcccgggt taattaagcg gccgcctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct 480
agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac 540
acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat 600
aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt 660
tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt 720
ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc 780
cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt 840
tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta 900
gtttttttat ttaataattt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa 960
caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata 1020
atgccagcct gttaaacgcc gtcgatcgac gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag 1080
cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac 1140
ccctctcgag agttccgctc caccgttgga cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc 1200
gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac 1260
cggcagctac gggggattcc tttcccaccg ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt 1320
aataaataga caccccctcc acaccctctt tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca 1380
cacacacaac cagatctccc ccaaatccac ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg 1440
ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatgctta 1500
gggcccggta gttctacttc tgtccatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg 1560
tgctactagc gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact 1620
tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg 1680
atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca 1740
atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt 1800
gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattctgt ttcaaactac 1860
ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa 1920
ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta 1980
ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg 2040
cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta 2100
ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat 2160
ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat 2220
gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa 2280
acaagtatgt tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag 2340
ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc 2400
ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc aggaccatgg cacccaagaa 2460
gaagaggaag gtgggcatcc acggcgtccc agcagcaatg gacaagaagt actccatcgg 2520
cctcgacatc ggcaccaaca gcgtcggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 2580
aagcaagaag ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccgtcac tccatcaaga agaacctcat 2640
cggcgccctc ctcttcgact caggtgagac ggccgaggcg acaaggttga agaggacggc 2700
aagaagaagg tacacaagaa ggaagaacag gatctgctac ctccaggaga tcttcagcaa 2760
cgagatggcc aaggtggatg acagcttctt ccaccggcta gaggagagct tcttggtgga 2820
ggaggacaag aagcatgaga ggcatcccat cttcggcaac atcgtcgacg aggtggccta 2880
ccatgagaag taccccacca tctaccatct ccgcaagaag ctggtggact caacggacaa 2940
ggccgacctc cgcctcatct acctcgcctt ggcccacatg atcaagttca gaggccactt 3000
cctcatcgag ggcgacctca accctgacaa cagcgatgtg gacaagctct tcatccagct 3060
ggtgcagacc tacaaccagc tctttgagga gaaccccatc aacgcctccg gcgtcgacgc 3120
caaggccatc ctctcggcaa ggttgagcaa gtcaagaagg ctggagaacc tcatcgctca 3180
gctccccggc gagaagaaaa atggcctctt cggcaacctc atcgccttga gcctcggcct 3240
cacccccaac ttcaagtcaa actttgacct cgccgaggat gccaagctcc agctctccaa 3300
ggacacctac gacgacgacc tcgacaacct cctcgcccag atcggcgacc agtacgccga 3360
cctcttcctc gccgccaaga acctctcaga tgccatcctc ctgagcgaca tcctccgcgt 3420
caacaccgag atcaccaagg cgccgctctc cgcctccatg atcaagaggt atgatgagca 3480
ccatcaagat ctcaccctcc tcaaggcctt ggtgaggcag cagctacctg agaagtacaa 3540
ggagatcttc ttcgaccaga gcaagaatgg ctacgccggc tacatcgacg gcggcgcctc 3600
ccaagaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcttggag aagatggatg gcaccgagga 3660
gctactggtg aagctcaaca gagaagatct cctcaggaag cagaggacct tcgacaacgg 3720
cagcatccct caccagatcc accttggtga gctccatgcc atcttgagaa ggcaagaaga 3780
cttctacccc ttcctcaagg acaacaggga gaagatcgag aagatattga cattcaggat 3840
cccctactac gtcggaccct tggcaagagg caactcaagg ttcgcctgga tgacaaggaa 3900
gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt tgaggaggtg gtggacaagg gcgcctcagc 3960
tcagagcttc atcgagagga tgaccaactt cgacaagaac ctccccaacg agaaggtgct 4020
ccccaagcac agcctcctct acgagtactt caccgtctac aatgagctca ccaaggtcaa 4080
gtacgtcacc gagggcatga ggaagccggc cttcctctca ggagagcaga agaaggccat 4140
cgtcgacctc ctcttcaaga ccaacaggaa ggtcaccgtc aagcagctca aggaggacta 4200
cttcaagaag atcgagtgct tcgactctgt ggagatctcc ggcgtggagg acaggttcaa 4260
cgcctccctc ggcacctacc atgatctcct gaagatcatc aaggacaagg acttcctcga 4320
caacgaggag aacgaggaca tcttagaaga catcgtcctc accctcaccc tcttcgagga 4380
cagggagatg atcgaggaga ggctcaagac ctatgctcac ctctttgatg acaaggtgat 4440
gaagcagctc aagagaagaa ggtacaccgg ctggggccgc ctctcaagga agctcatcaa 4500
cggcatcagg gacaagcaga gcggcaagac catcctcgac ttcctcaaga gcgatggctt 4560
cgccaacagg aacttcatgc agctcatcca tgatgacagc ttgaccttca aggaggacat 4620
ccagaaggct caagtctccg gccaaggaga ttccctccat gagcacatcg ccaacctcgc 4680
cggctcaccg gccatcaaga agggcatcct ccagaccgtc aaggtggtgg atgagctggt 4740
gaaggtgatg ggccgtcaca agccggagaa catcgtcatc gagatggcaa gggagaacca 4800
gaccacccag aagggccaga agaactcaag ggagaggatg aagaggattg aagaaggcat 4860
caaggagctc ggcagccaga tcctcaagga gcaccctgtg gagaacaccc agctacagaa 4920
cgagaagctc tacctctact acctccagaa tggccgtgac atgtacgtcg accaagagct 4980
ggacatcaac aggttgagcg actacgacgt cgaccacatc gtcccccaga gcttcctcaa 5040
ggatgacagc atcgacaaca aggtgctgac aagatcagac aagaaccgtg gcaagagcga 5100
caatgtcccc tccgaggagg tggtgaagaa gatgaagaac tactggaggc agctcctcaa 5160
cgccaagctc atcacccaga ggaagttcga caacctcacc aaggctgaaa gaggaggcct 5220
ctcagagctg gacaaggccg gcttcatcaa gaggcagctg gtggagacaa ggcagatcac 5280
caagcatgtt gctcagatcc ttgattcaag gatgaacacc aagtacgacg agaacgacaa 5340
gctcatcagg gaggtcaagg tcatcaccct caagagcaag ctggtgtccg acttcaggaa 5400
ggacttccag ttctacaagg tgagggagat caacaactac caccatgctc atgatgccta 5460
cctcaacgcc gtggtgggca ccgccctcat caagaagtac cccaagctgg agtcagagtt 5520
cgtctacggc gactacaagg tgtatgatgt gaggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 5580
gatcggcaag gccaccgcca agtacttctt ctactcaaac atcatgaact tcttcaagac 5640
cgagatcacc ctcgccaacg gcgagatcag gaagaggccg ctcattgaga caaatggtga 5700
gactggtgag atcgtctggg acaagggccg agacttcgcc accgtgagga aggtgctctc 5760
catgcctcaa gtcaacatcg tcaagaagac cgaggtgcag accggaggct tctcaaagga 5820
gagcatcctc cccaagagga actctgacaa gctgatcgca aggaagaagg actgggaccc 5880
caagaagtac ggcggctttg attcaccaac ggtggcctac tccgtgctgg tggtggccaa 5940
ggtggagaag ggcaagagca agaagctcaa gagcgtcaag gagctcctcg gcatcaccat 6000
catggagaga tcatccttcg agaagaaccc catcgacttc cttgaggcca agggctacaa 6060
ggaggtgaag aaggacctca tcatcaagct ccccaagtac agcctcttcg agctggagaa 6120
tggccgcaag aggatgctgg catcagctgg agagctccag aagggcaacg agctggccct 6180
cccaagcaag tacgtgaact tcctctacct cgcctcccac tacgagaagc tcaagggctc 6240
accagaagac aatgagcaga agcagctctt cgtggagcag cacaagcact acctcgacga 6300
gatcatcgag cagatctccg agttctccaa gagggtgatc ctcgccgacg ccaacctcga 6360
caaggtgctc tcagcctaca acaagcaccg tgacaagccc atcagggagc aagctgagaa 6420
catcatccac ctcttcaccc tcaccaacct cggcgccccg gcggccttca agtacttcga 6480
caccaccatc gaccgcaaga ggtacacctc aaccaaggag gtgcttgatg ccaccttgat 6540
ccaccagagc atcaccggcc tctacgagac aaggatcgac ctctcccagc tcggcggcga 6600
caagaggccg gcggccacca agaaggccgg ccaagccaag aagaagaagt gattgctagc 6660
acgcgttgga cacgctgaaa tcaccagtct ctctctacaa atctatctct ctctattttc 6720
tccataataa tgtgtgagta gttcccagat aagggaatta gggttcctat agggtttcgc 6780
tcatgtgttg agcatataag aaacccttag tatgtatttg tatttgtaaa atacttctat 6840
caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa tccagtacta aaatccagat cggcgcgcca 6900
tcccaatggc gcgccgagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 6960
ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 7020
tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 7080
gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 7140
gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 7200
gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 7260
taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 7320
cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 7380
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 7440
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 7500
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 7560
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 7620
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 7680
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 7740
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 7800
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 7860
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 7920
tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 7980
ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 8040
aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 8100
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 8160
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 8220
tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 8280
agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 8340
taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 8400
tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 8460
cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 8520
ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 8580
tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 8640
tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 8700
cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 8760
tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 8820
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 8880
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 8940
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 9000
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 9060
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 9120
ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 9155
<210> 2
<211> 1401
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Modified Cas9 from Streptococcus pyogenes: NLS signals at
both termini, optimized for use in wheat (encoded by Seq-I
D 1 pos 2447 to 6649)
<400> 2
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser
20 25 30
Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys
35 40 45
Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu
50 55 60
Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg
65 70 75 80
Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile
85 90 95
Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp
100 105 110
Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys
115 120 125
Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala
130 135 140
Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val
145 150 155 160
Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala
165 170 175
His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn
180 185 190
Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr
195 200 205
Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp
210 215 220
Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly
245 250 255
Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn
260 265 270
Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr
275 280 285
Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
290 295 300
Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser
305 310 315 320
Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala
325 330 335
Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu
340 345 350
Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe
355 360 365
Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala
370 375 380
Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met
385 390 395 400
Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu
405 410 415
Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His
420 425 430
Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro
435 440 445
Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg
450 455 460
Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala
465 470 475 480
Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu
485 490 495
Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met
500 505 510
Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His
515 520 525
Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val
530 535 540
Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu
545 550 555 560
Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val
565 570 575
Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe
580 585 590
Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu
595 600 605
Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu
610 615 620
Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu
625 630 635 640
Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr
645 650 655
Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg
660 665 670
Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg
675 680 685
Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly
690 695 700
Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr
705 710 715 720
Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser
725 730 735
Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys
740 745 750
Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met
755 760 765
Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn
770 775 780
Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg
785 790 795 800
Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His
805 810 815
Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr
820 825 830
Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn
835 840 845
Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu
850 855 860
Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn
865 870 875 880
Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met
885 890 895
Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg
900 905 910
Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu
915 920 925
Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile
930 935 940
Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr
945 950 955 960
Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys
965 970 975
Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val
980 985 990
Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala
995 1000 1005
Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu
1010 1015 1020
Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1025 1030 1035 1040
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr
1045 1050 1055
Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly
1060 1065 1070
Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu
1075 1080 1085
Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu
1090 1095 1100
Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly
1105 1110 1115 1120
Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu
1125 1130 1135
Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp
1140 1145 1150
Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys
1155 1160 1165
Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr
1170 1175 1180
Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu
1185 1190 1195 1200
Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro
1205 1210 1215
Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala
1220 1225 1230
Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys
1235 1240 1245
Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly
1250 1255 1260
Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1265 1270 1275 1280
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg
1285 1290 1295
Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn
1300 1305 1310
Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His
1315 1320 1325
Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe
1330 1335 1340
Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu
1345 1350 1355 1360
Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg
1365 1370 1375
Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys
1380 1385 1390
Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1395 1400
<210> 3
<211> 9155
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02734] comprising a modified Cas9 from Streptococ
cus pyogenes with D10A mutation: NLS signals at both termi
ni, optimized for use in wheat
<400> 3
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatcctgc 420
aggcccgggt taattaagcg gccgcctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct 480
agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac 540
acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat 600
aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt 660
tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt 720
ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc 780
cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt 840
tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta 900
gtttttttat ttaataattt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa 960
caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata 1020
atgccagcct gttaaacgcc gtcgatcgac gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag 1080
cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac 1140
ccctctcgag agttccgctc caccgttgga cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc 1200
gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac 1260
cggcagctac gggggattcc tttcccaccg ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt 1320
aataaataga caccccctcc acaccctctt tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca 1380
cacacacaac cagatctccc ccaaatccac ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg 1440
ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatgctta 1500
gggcccggta gttctacttc tgtccatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg 1560
tgctactagc gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact 1620
tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg 1680
atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca 1740
atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt 1800
gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattctgt ttcaaactac 1860
ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa 1920
ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta 1980
ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg 2040
cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta 2100
ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat 2160
ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat 2220
gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa 2280
acaagtatgt tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag 2340
ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc 2400
ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc aggaccatgg cacccaagaa 2460
gaagaggaag gtgggcatcc acggcgtccc agcagcaatg gacaagaagt actccatcgg 2520
cctcgccatc ggcaccaaca gcgtcggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 2580
aagcaagaag ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccgtcac tccatcaaga agaacctcat 2640
cggcgccctc ctcttcgact caggtgagac ggccgaggcg acaaggttga agaggacggc 2700
aagaagaagg tacacaagaa ggaagaacag gatctgctac ctccaggaga tcttcagcaa 2760
cgagatggcc aaggtggatg acagcttctt ccaccggcta gaggagagct tcttggtgga 2820
ggaggacaag aagcatgaga ggcatcccat cttcggcaac atcgtcgacg aggtggccta 2880
ccatgagaag taccccacca tctaccatct ccgcaagaag ctggtggact caacggacaa 2940
ggccgacctc cgcctcatct acctcgcctt ggcccacatg atcaagttca gaggccactt 3000
cctcatcgag ggcgacctca accctgacaa cagcgatgtg gacaagctct tcatccagct 3060
ggtgcagacc tacaaccagc tctttgagga gaaccccatc aacgcctccg gcgtcgacgc 3120
caaggccatc ctctcggcaa ggttgagcaa gtcaagaagg ctggagaacc tcatcgctca 3180
gctccccggc gagaagaaaa atggcctctt cggcaacctc atcgccttga gcctcggcct 3240
cacccccaac ttcaagtcaa actttgacct cgccgaggat gccaagctcc agctctccaa 3300
ggacacctac gacgacgacc tcgacaacct cctcgcccag atcggcgacc agtacgccga 3360
cctcttcctc gccgccaaga acctctcaga tgccatcctc ctgagcgaca tcctccgcgt 3420
caacaccgag atcaccaagg cgccgctctc cgcctccatg atcaagaggt atgatgagca 3480
ccatcaagat ctcaccctcc tcaaggcctt ggtgaggcag cagctacctg agaagtacaa 3540
ggagatcttc ttcgaccaga gcaagaatgg ctacgccggc tacatcgacg gcggcgcctc 3600
ccaagaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcttggag aagatggatg gcaccgagga 3660
gctactggtg aagctcaaca gagaagatct cctcaggaag cagaggacct tcgacaacgg 3720
cagcatccct caccagatcc accttggtga gctccatgcc atcttgagaa ggcaagaaga 3780
cttctacccc ttcctcaagg acaacaggga gaagatcgag aagatattga cattcaggat 3840
cccctactac gtcggaccct tggcaagagg caactcaagg ttcgcctgga tgacaaggaa 3900
gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt tgaggaggtg gtggacaagg gcgcctcagc 3960
tcagagcttc atcgagagga tgaccaactt cgacaagaac ctccccaacg agaaggtgct 4020
ccccaagcac agcctcctct acgagtactt caccgtctac aatgagctca ccaaggtcaa 4080
gtacgtcacc gagggcatga ggaagccggc cttcctctca ggagagcaga agaaggccat 4140
cgtcgacctc ctcttcaaga ccaacaggaa ggtcaccgtc aagcagctca aggaggacta 4200
cttcaagaag atcgagtgct tcgactctgt ggagatctcc ggcgtggagg acaggttcaa 4260
cgcctccctc ggcacctacc atgatctcct gaagatcatc aaggacaagg acttcctcga 4320
caacgaggag aacgaggaca tcttagaaga catcgtcctc accctcaccc tcttcgagga 4380
cagggagatg atcgaggaga ggctcaagac ctatgctcac ctctttgatg acaaggtgat 4440
gaagcagctc aagagaagaa ggtacaccgg ctggggccgc ctctcaagga agctcatcaa 4500
cggcatcagg gacaagcaga gcggcaagac catcctcgac ttcctcaaga gcgatggctt 4560
cgccaacagg aacttcatgc agctcatcca tgatgacagc ttgaccttca aggaggacat 4620
ccagaaggct caagtctccg gccaaggaga ttccctccat gagcacatcg ccaacctcgc 4680
cggctcaccg gccatcaaga agggcatcct ccagaccgtc aaggtggtgg atgagctggt 4740
gaaggtgatg ggccgtcaca agccggagaa catcgtcatc gagatggcaa gggagaacca 4800
gaccacccag aagggccaga agaactcaag ggagaggatg aagaggattg aagaaggcat 4860
caaggagctc ggcagccaga tcctcaagga gcaccctgtg gagaacaccc agctacagaa 4920
cgagaagctc tacctctact acctccagaa tggccgtgac atgtacgtcg accaagagct 4980
ggacatcaac aggttgagcg actacgacgt cgaccacatc gtcccccaga gcttcctcaa 5040
ggatgacagc atcgacaaca aggtgctgac aagatcagac aagaaccgtg gcaagagcga 5100
caatgtcccc tccgaggagg tggtgaagaa gatgaagaac tactggaggc agctcctcaa 5160
cgccaagctc atcacccaga ggaagttcga caacctcacc aaggctgaaa gaggaggcct 5220
ctcagagctg gacaaggccg gcttcatcaa gaggcagctg gtggagacaa ggcagatcac 5280
caagcatgtt gctcagatcc ttgattcaag gatgaacacc aagtacgacg agaacgacaa 5340
gctcatcagg gaggtcaagg tcatcaccct caagagcaag ctggtgtccg acttcaggaa 5400
ggacttccag ttctacaagg tgagggagat caacaactac caccatgctc atgatgccta 5460
cctcaacgcc gtggtgggca ccgccctcat caagaagtac cccaagctgg agtcagagtt 5520
cgtctacggc gactacaagg tgtatgatgt gaggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 5580
gatcggcaag gccaccgcca agtacttctt ctactcaaac atcatgaact tcttcaagac 5640
cgagatcacc ctcgccaacg gcgagatcag gaagaggccg ctcattgaga caaatggtga 5700
gactggtgag atcgtctggg acaagggccg agacttcgcc accgtgagga aggtgctctc 5760
catgcctcaa gtcaacatcg tcaagaagac cgaggtgcag accggaggct tctcaaagga 5820
gagcatcctc cccaagagga actctgacaa gctgatcgca aggaagaagg actgggaccc 5880
caagaagtac ggcggctttg attcaccaac ggtggcctac tccgtgctgg tggtggccaa 5940
ggtggagaag ggcaagagca agaagctcaa gagcgtcaag gagctcctcg gcatcaccat 6000
catggagaga tcatccttcg agaagaaccc catcgacttc cttgaggcca agggctacaa 6060
ggaggtgaag aaggacctca tcatcaagct ccccaagtac agcctcttcg agctggagaa 6120
tggccgcaag aggatgctgg catcagctgg agagctccag aagggcaacg agctggccct 6180
cccaagcaag tacgtgaact tcctctacct cgcctcccac tacgagaagc tcaagggctc 6240
accagaagac aatgagcaga agcagctctt cgtggagcag cacaagcact acctcgacga 6300
gatcatcgag cagatctccg agttctccaa gagggtgatc ctcgccgacg ccaacctcga 6360
caaggtgctc tcagcctaca acaagcaccg tgacaagccc atcagggagc aagctgagaa 6420
catcatccac ctcttcaccc tcaccaacct cggcgccccg gcggccttca agtacttcga 6480
caccaccatc gaccgcaaga ggtacacctc aaccaaggag gtgcttgatg ccaccttgat 6540
ccaccagagc atcaccggcc tctacgagac aaggatcgac ctctcccagc tcggcggcga 6600
caagaggccg gcggccacca agaaggccgg ccaagccaag aagaagaagt gattgctagc 6660
acgcgttgga cacgctgaaa tcaccagtct ctctctacaa atctatctct ctctattttc 6720
tccataataa tgtgtgagta gttcccagat aagggaatta gggttcctat agggtttcgc 6780
tcatgtgttg agcatataag aaacccttag tatgtatttg tatttgtaaa atacttctat 6840
caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa tccagtacta aaatccagat cggcgcgcca 6900
tcccaatggc gcgccgagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 6960
ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 7020
tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 7080
gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 7140
gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 7200
gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 7260
taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 7320
cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 7380
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 7440
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 7500
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 7560
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 7620
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 7680
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 7740
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 7800
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 7860
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 7920
tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 7980
ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 8040
aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 8100
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 8160
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 8220
tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 8280
agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 8340
taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 8400
tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 8460
cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 8520
ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 8580
tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 8640
tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 8700
cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 8760
tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 8820
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 8880
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 8940
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 9000
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 9060
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 9120
ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 9155
<210> 4
<211> 1401
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Modified Cas9 from Streptococcus pyogenes with D10A mutati
on. NLS signals at both termini, optimized for use in whea
t (is encoded by Seq-ID 3 pos 2447 to 6649)
<400> 4
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser
20 25 30
Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys
35 40 45
Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu
50 55 60
Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg
65 70 75 80
Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile
85 90 95
Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp
100 105 110
Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys
115 120 125
Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala
130 135 140
Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val
145 150 155 160
Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala
165 170 175
His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn
180 185 190
Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr
195 200 205
Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp
210 215 220
Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly
245 250 255
Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn
260 265 270
Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr
275 280 285
Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
290 295 300
Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser
305 310 315 320
Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala
325 330 335
Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu
340 345 350
Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe
355 360 365
Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala
370 375 380
Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met
385 390 395 400
Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu
405 410 415
Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His
420 425 430
Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro
435 440 445
Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg
450 455 460
Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala
465 470 475 480
Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu
485 490 495
Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met
500 505 510
Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His
515 520 525
Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val
530 535 540
Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu
545 550 555 560
Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val
565 570 575
Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe
580 585 590
Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu
595 600 605
Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu
610 615 620
Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu
625 630 635 640
Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr
645 650 655
Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg
660 665 670
Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg
675 680 685
Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly
690 695 700
Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr
705 710 715 720
Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser
725 730 735
Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys
740 745 750
Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met
755 760 765
Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn
770 775 780
Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg
785 790 795 800
Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His
805 810 815
Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr
820 825 830
Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn
835 840 845
Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu
850 855 860
Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn
865 870 875 880
Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met
885 890 895
Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg
900 905 910
Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu
915 920 925
Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile
930 935 940
Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr
945 950 955 960
Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys
965 970 975
Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val
980 985 990
Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala
995 1000 1005
Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu
1010 1015 1020
Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1025 1030 1035 1040
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr
1045 1050 1055
Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly
1060 1065 1070
Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu
1075 1080 1085
Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu
1090 1095 1100
Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly
1105 1110 1115 1120
Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu
1125 1130 1135
Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp
1140 1145 1150
Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys
1155 1160 1165
Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr
1170 1175 1180
Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu
1185 1190 1195 1200
Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro
1205 1210 1215
Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala
1220 1225 1230
Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys
1235 1240 1245
Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly
1250 1255 1260
Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1265 1270 1275 1280
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg
1285 1290 1295
Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn
1300 1305 1310
Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His
1315 1320 1325
Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe
1330 1335 1340
Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu
1345 1350 1355 1360
Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg
1365 1370 1375
Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys
1380 1385 1390
Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1395 1400
<210> 5
<211> 3120
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02528] comprising a synthetic sequence encoding a
guide RNA targeting the ACCase gene in wheat
<400> 5
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggaac 420
ttaattaaaa aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc 480
cttattttaa cttgctattt ctagctctaa aactgtatgt tctccacacc tagcaagtct 540
gatgcagcaa gcgagtttat aaaccggtca gaactctgct ggacaggcga ggtgggacta 600
aactaagagg aactgctgcg ttgctctccc caatcgtgaa cacgtcgacc acccgacaaa 660
agcccgatca tgcgggccta aaagcccagc gctagaccgt tgctgaactc acgtgggctg 720
catctcacta tgcgacccag atcagtgaga gctagagggc agttatcttc agctctctcg 780
tagttcctct gatcaatatt cctagttcga ttccctccta gcagtgagta acaatgtgct 840
ccttgataaa tataaatgtg ttgagcacca gaactgtcag aataacgggc ttggtccctg 900
cagggttcca tcccaatggc gcgccgagct tggctcgagc atggtcatag ctgtttcctg 960
tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 1020
aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 1080
ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 1140
gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 1200
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 1260
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 1320
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 1380
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 1440
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 1500
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 1560
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 1620
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 1680
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 1740
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta 1800
tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 1860
aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 1920
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 1980
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 2040
ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 2100
acagttagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat 2160
caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt 2220
tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac 2280
aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga 2340
cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagtt tatgcatttc tttccagact tgttcaacag 2400
gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg 2460
attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa 2520
tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag 2580
gatattcttc taatacctgg aatgctgttt tcccagggat cgcagtggtg agtaaccatg 2640
catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc 2700
agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca 2760
gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc 2820
cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc 2880
gcggcctaga gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat actcttcctt tttcaatatt 2940
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 3000
aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 3060
aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 3120
<210> 6
<211> 3119
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02529] comprising a synthetic sequence encoding a
guide RNA targeting the ACCase gene in wheat
<400> 6
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggaac 420
ttaattaaaa aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc 480
cttattttaa cttgctattt ctagctctaa aaccacctag cccatcctcc ttccaagtct 540
gatgcagcaa gcgagtttat aaaccggtca gaactctgct ggacaggcga ggtgggacta 600
aactaagagg aactgctgcg ttgctctccc caatcgtgaa cacgtcgacc acccgacaaa 660
agcccgatca tgcgggccta aaagcccagc gctagaccgt tgctgaactc acgtgggctg 720
catctcacta tgcgacccag atcagtgaga gctagagggc agttatcttc agctctctcg 780
tagttcctct gatcaatatt cctagttcga ttccctccta gcagtgagta acaatgtgct 840
ccttgataaa tataaatgtg ttgagcacca gaactgtcag aataacgggc ttggtccctg 900
cagggttcat cccaatggcg cgccgagctt ggctcgagca tggtcatagc tgtttcctgt 960
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 1020
agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 1080
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 1140
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 1200
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 1260
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 1320
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 1380
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 1440
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 1500
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 1560
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 1620
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 1680
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 1740
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 1800
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 1860
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 1920
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 1980
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 2040
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 2100
cagttagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat caggattatc 2160
aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt 2220
ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa catcaataca 2280
acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac 2340
gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagttt atgcatttct ttccagactt gttcaacagg 2400
ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga 2460
ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat 2520
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atattcttct aatacctgga atgctgtttt cccagggatc gcagtggtga gtaaccatgc 2640
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gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc attggcaacg ctacctttgc catgtttcag 2760
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aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga 3060
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<210> 7
<211> 3117
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02530] comprising a synthetic sequence encoding a
guide RNA targeting the ACCase gene in wheat
<400> 7
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<211> 3117
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02531] comprising a synthetic sequence encoding a
guide RNA targeting the ACCase gene in wheat
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<211> 3119
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02532] comprising a synthetic sequence encoding a
guide RNA targeting the ACCase gene in wheat
<400> 9
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<211> 3119
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02524] comprising a synthetic sequence encoding a
guide RNA targeting the ACCase gene in wheat
<400> 10
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ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat 2520
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atattcttct aatacctgga atgctgtttt cccagggatc gcagtggtga gtaaccatgc 2640
atcatcagga gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga ggcataaatt ccgtcagcca 2700
gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc attggcaacg ctacctttgc catgtttcag 2760
aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag attgtcgcac ctgattgccc 2820
gacattatcg cgagcccatt tatacccata taaatcagca tccatgttgg aatttaatcg 2880
cggcctagag caagacgttt cccgttgaat atggctcata ctcttccttt ttcaatatta 2940
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 3000
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga 3060
aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 3119
<210> 11
<211> 3120
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02533] comprising a synthetic sequence encoding a
guide RNA targeting the ALS gene in wheat
<400> 11
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggaac 420
cctgcaggga ccaagcccgt tattctgaca gttctggtgc tcaacacatt tatatttatc 480
aaggagcaca ttgttactca ctgctaggag ggaatcgaac taggaatatt gatcagagga 540
actacgagag agctgaagat aactgccctc tagctctcac tgatctgggt cgcatagtga 600
gatgcagccc acgtgagttc agcaacggtc tagcgctggg cttttaggcc cgcatgatcg 660
ggcttttgtc gggtggtcga cgtgttcacg attggggaga gcaacgcagc agttcctctt 720
agtttagtcc cacctcgcct gtccagcaga gttctgaccg gtttataaac tcgcttgctg 780
catcagactt ggaacaacca gcatctggga agttttagag ctagaaatag caagttaaaa 840
taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttttttttaa 900
ttaagttcca tcccaatggc gcgccgagct tggctcgagc atggtcatag ctgtttcctg 960
tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 1020
aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 1080
ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 1140
gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 1200
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 1260
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 1320
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 1380
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 1440
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 1500
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 1560
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 1620
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 1680
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 1740
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tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 1860
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aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 1980
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 2040
ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 2100
acagttagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat 2160
caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt 2220
tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac 2280
aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga 2340
cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagtt tatgcatttc tttccagact tgttcaacag 2400
gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg 2460
attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa 2520
tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag 2580
gatattcttc taatacctgg aatgctgttt tcccagggat cgcagtggtg agtaaccatg 2640
catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc 2700
agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca 2760
gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc 2820
cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc 2880
gcggcctaga gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat actcttcctt tttcaatatt 2940
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 3000
aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 3060
aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 3120
<210> 12
<211> 3120
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02535] comprising a synthetic sequence encoding a
guide RNA targeting the ALS gene in wheat
<400> 12
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
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ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggaac 420
cctgcaggga ccaagcccgt tattctgaca gttctggtgc tcaacacatt tatatttatc 480
aaggagcaca ttgttactca ctgctaggag ggaatcgaac taggaatatt gatcagagga 540
actacgagag agctgaagat aactgccctc tagctctcac tgatctgggt cgcatagtga 600
gatgcagccc acgtgagttc agcaacggtc tagcgctggg cttttaggcc cgcatgatcg 660
ggcttttgtc gggtggtcga cgtgttcacg attggggaga gcaacgcagc agttcctctt 720
agtttagtcc cacctcgcct gtccagcaga gttctgaccg gtttataaac tcgcttgctg 780
catcagactt gatctgggaa tggtggtgca ggttttagag ctagaaatag caagttaaaa 840
taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttttttttaa 900
ttaagttcca tcccaatggc gcgccgagct tggctcgagc atggtcatag ctgtttcctg 960
tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 1020
aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 1080
ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 1140
gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 1200
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aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 1320
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 1380
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 1440
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 1500
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 1560
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 1620
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 1680
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aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 2040
ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 2100
acagttagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat 2160
caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt 2220
tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac 2280
aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga 2340
cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagtt tatgcatttc tttccagact tgttcaacag 2400
gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg 2460
attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa 2520
tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag 2580
gatattcttc taatacctgg aatgctgttt tcccagggat cgcagtggtg agtaaccatg 2640
catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc 2700
agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca 2760
gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc 2820
cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc 2880
gcggcctaga gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat actcttcctt tttcaatatt 2940
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 3000
aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 3060
aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 3120
<210> 13
<211> 3455
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02539] comrising a donor DNA for precise editing
of ACCase [I1781] in wheat
<400> 13
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggaac 420
ggcgcgccat gtattctcag ggatgtaagc aacgggtctg tcaggtgggt ccaaagattt 480
tgtaatagga agaggtccac caatgttggc aggaacatag ctgagccacc tcaatatatt 540
agatacacct tcaaggtcat ctgaaactgt cagatggaca acaccgtttg tcgccataat 600
tttggggcca cccaactgca tgtgggagct gtaaacttcc cggccaagaa gcttgttcaa 660
ggcagagaac ccagttagga taatgggctg gtcagtacgc tgtatgcacc gtatgccaag 720
tcgagcaaga tatgctccta ttccaacagt ccgtccagtc acaaatgtaa gcgtaaatgt 780
ctcctcatag gccctagaat aggcactggc aatagcagca cttccatgga ggttctcgac 840
gcccaaccca tcctccttcc ccacaacaga atcgataacc cacctaattt caccattatc 900
aagctgcatc ttgtgcgcta taacagaagt gctaatacga gcatggtctt cttcagtcag 960
ataaatgtac tgaaacccac gttcagggct gccatcatca gaccatccaa cacggaagca 1020
agattttact tcatctgcta tgccgatccg agcaccagag tttgctgcca agtagatgag 1080
aggaagcttc ctctcacaag ctaggttggt aacagtttca aaaaatgcat cttcccttgg 1140
accaaacgat ccagctctaa aagtaatatc atttgcgatg acaacaatct gcctgccatt 1200
gggatattca ggagtggaca tgtccaagat cttaattaag ttccatccca atggcgcgcc 1260
gagcttggct cgagcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 1320
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ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 1440
ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 1500
ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 1560
agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 1620
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 1680
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 1740
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caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 1980
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taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 2100
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cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 2220
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 2280
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 2340
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 2400
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt tagaaaaact catcgagcat 2460
caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg 2520
tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta 2580
tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa 2640
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gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac 2880
tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc 2940
tgttttccca gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg 3000
cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt 3060
aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt 3120
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cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 3420
ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 3455
<210> 14
<211> 3455
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02540] comrising a donor DNA for precise editing
of ACCase [I1781L] in wheat
<400> 14
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggaac 420
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cgtattagca cttctgttat agcgcacaag atgcagcttg ataatggtga aattaggtgg 780
gttatcgatt ctgttgtggg gaaggaggat gggctaggtg tggagaacct ccatggaagt 840
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gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 1800
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caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg 2520
tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta 2580
tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa 2640
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ttgaatatgg ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 3300
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<210> 15
<211> 3455
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02541] comrising a donor DNA for precise editing
of ACCase [I1781L] in wheat
<400> 15
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
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agatacacct tcaaggtcat ctgaaactgt cagatggaca acaccgtttg tcgccataat 600
tttggggcca cccaactgca tgtgggagct gtaaacttcc cggccaagaa gcttgttcaa 660
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tcgagcaaga tatgctccta ttccaacagt ccgtccagtc acaaatgtaa gcgtaaatgt 780
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accaaacgat ccagctctaa aagtaatatc atttgcgatg acaacaatct gcctgccatt 1200
gggatattca ggagtggaca tgtccaagat cttaattaag ttccatccca atggcgcgcc 1260
gagcttggct cgagcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 1320
tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 1380
ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 1440
ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 1500
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catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 1680
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ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 3455
<210> 16
<211> 3439
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02536] comrising a donor DNA for precise editing
of ACCase [A2004V] in wheat
<400> 16
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tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggaac 420
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gcatgtattc tcagggatgt aagcaacggg tctgtcaggt gggtccaaag attttgtaat 1140
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gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 1380
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tccatgttgg aatttaatcg cggcctagag caagacgttt cccgttgaat atggctcata 3240
ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 3300
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gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt 3420
atcacgaggc cctttcgtc 3439
<210> 17
<211> 3457
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [02542] comrising a donor DNA for precise editing
of ALS gene [W548Li] n wheat
<400> 17
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
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ttgggttacc agctgcagct ggcgctgctg tggccaaccc aggtgttaca gttgttgaca 720
ttgatggtga tggtagtttc ctcatgaaca ttcaggagtt ggcgttgatc cgcattgaga 780
acctcccagt gaaggtgatg atattgaaca accagcatct cggcatggtc gtccagctcg 840
aggataggtt ttacaaggcc aatcgggcgc acacatacct tggcaaccca gaaaatgaga 900
gtgagatata tccagatttt gtgacgattg ctaaaggatt caacgttcca gcagttcgag 960
tgacgaagaa gagcgaagtc actgcagcaa tcaagaagat gcttgagacc ccagggccat 1020
acttgttgga tatcatagtc ccgcatcagg agcacgtgct gcctatgatc ccaagcggtg 1080
gtgctttcaa ggacatgatc atggagggtg atggcaggac ctcgtactga aatttcgacc 1140
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gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 2400
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttagaaaaa ctcatcgagc 2460
atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc 2520
cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg 2580
tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca 2640
aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc 2700
aaaagtttat gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca 2760
aaatcactcg catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat 2820
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actgccagcg catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat 2940
gctgttttcc cagggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa 3000
tgcttgatgg tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct 3060
gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc 3120
ttcccataca atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta 3180
tacccatata aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctagagca agacgtttcc 3240
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tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 3360
cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 3420
acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 3457
<210> 18
<211> 6635
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid [pIB26] comrising a muated bar gene
<400> 18
gtgcaccata cctgcaggca attggccgct gtaccatgca tgatctggat tttagtactg 60
gattttggtt ttaggaatta gaaattttat tgatagaagt attttacaaa tacaaataca 120
tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat gagcgaaacc ctataggaac cctaattccc 180
ttatctggga actactcaca cattattatg gagaaaatag agagagatag atttgtagag 240
agagactggt gatttcagcg tgtccaagct tgctagagtc gcggccgctt cagatctcgg 300
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cgtcatgcca gttcccgtgc ttgaagccgg ccgcccgcag catgccgcgg ggggcatatc 420
cgagcgcctc gtgcatgcgc acgctcgggt cgttgggcag cccgatgaca gcgaccacgc 480
tcttgaagcc ctgtgcctcc agggacttca gcaggtgggt gtagagcgtg gagcccagtc 540
ccgtccgctg gtggcggggg gagacgtaca cggtcgactc ggccgtccag tcgtaggcgt 600
tgcgtgcctt ccaggggccc gcgtaggcga tgccggcgac ctcgccgtcc acctcggcga 660
cgagccaggg atagcgctcc cgcagacgga cgaggtcgtc cgtccactcc tgcggttcct 720
gcggctcggt acggaagttg accgtgcttg tctcgatgta gtggttgacg atggtgcaga 780
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ccagctcgac caggatgggc accaccccgg tgaacagctc ctcgcccttg ctcaccatgg 1560
ttttggttta ataagaagag aaaagagttc ttttgttatg gctgaagtaa tagagaaatg 1620
agctcgagtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata gaggaagggt cttgcgaagg 1680
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gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct caatagccct 1980
ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac 2040
catgttgacg aagattttct tcttgtcatt gagtcgtaaa agactctgta tgaactgttc 2100
gccagtcttc acggcgagtt ctgttagatc ctcgatctga atttttgact ccatgtatgg 2160
tgcatatggc gcgccataga tccgtcaatt ctcactcatt aggcacccca ggctttacac 2220
tttatgcttc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga 2280
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agtcgcctaa ggtcactatc agctagcaaa tatttcttgt caaaaatgct ccactgacgt 2520
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cccatgatca tgtggattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg 2640
gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg 2700
ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc 2760
ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct 2820
tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa 2880
gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg 2940
gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa 3000
gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat 3060
gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg 3120
cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc 3180
atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac 3240
cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg 3300
gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc 3360
tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag 3420
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gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc 3540
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agtatctacg acacaccgag cggcgaacta ataacgctca ctgaagggaa ctccggttcc 4020
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agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 4440
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 4500
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 4560
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 4620
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 4680
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 4740
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 4800
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 4860
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 4920
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 4980
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 5040
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 5100
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 5160
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 5220
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 5280
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 5340
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 5400
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 5460
ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 5520
gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 5580
agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 5640
ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 5700
ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 5760
gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 5820
ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 5880
tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 5940
tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 6000
cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 6060
tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 6120
gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 6180
tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 6240
ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 6300
attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 6360
cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 6420
taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg 6480
gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg 6540
ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc 6600
ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgaga 6635
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-048
<400> 19
atgatggcag ccctgaacg 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-051
<400> 20
ggcatgttcg acaaagacag 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-053
<400> 21
caactgcatg tgggagctg 19
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-054
<400> 22
acaattgttg acccagcctg 20
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-065
<400> 23
gttacagttg ttgacattga tgg 23
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-066
<400> 24
aagtatggcc ctggggtctc 20
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-101
<400> 25
ctattgccag tgcctattct agg 23
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-102
<400> 26
gtgacgctgt ccgggaacca c 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-110
<400> 27
ctgcttgcca cttacacctc 20
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-111
<400> 28
gttgggcgtc gagaacctc 19
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-112
<400> 29
acttgcccag cacgaggaac 20
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-113
<400> 30
gctaggtgtg gagaacctc 19
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-130
<400> 31
gatgcatggc actgtgtatg c 21
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-135
<400> 32
ggcatggtcg tccagctc 18
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-136
<400> 33
cagaaaggaa ccagcacact g 21
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer HT-18-162
<400> 34
gttccttccc cttgcatc 18
<210> 35
<211> 3496
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid [04096] comrising a donor DNA for precise editing
of ACCase gene [I1781L] in wheat
<400> 35
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggctt 420
ttggcggaat gatcaattgc cctcgtttat tgcaccgctg atttccggtg ggcatattaa 480
ccgatcttgg acatgtccac tcctgaatat cccaatggca ggcagattgt tgtcatcgca 540
aatgatatta cttttagagc tggatcgttt ggtccaaggg aagatgcatt ttttgaaact 600
gttaccaacc tagcttgtga gaggaagctt cctctcatct acttggcagc aaactctggt 660
gctcggatcg gcatagcaga tgaagtaaaa tcttgcttcc gtgttggatg gtctgatgat 720
ggcagccctg aacgtgggtt tcagtacatt tatctgactg aagaagatca tgctcgtatt 780
agcacttctg ttatagcgca caagatgcag cttgataatg gtgaaatccg ctgggttatc 840
gattctgttg tggggaagga ggatgggcta ggtgtggaga acctccatgg aagtgctgct 900
attgccagtg cctattctag ggcctatgag gagacattta cgcttacatt tgtgactgga 960
cggactgttg gaataggagc atatcttgct cgacttggca tacggtgcat acagcgtact 1020
gatcagccca ttatcctaac tgggttctct gccttgaaca agcttcttgg ccgggaagtt 1080
tacagctccc acatgcagtt gggtggcccc aaaattatgg cgacaaacgg tgttgtccat 1140
ctgacagttt cagatgacct tgaaggtgta tctaatatat tgaggtggct cagctatgtt 1200
cctgccaaca ttggtggacc tcttcctatt acaaaatctt tggacccacc tgacagaccc 1260
gttgcttaca tccctgagaa tacatatccc aatggcgcgc cgagcttggc tcgagcatgg 1320
tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc 1380
ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg 1440
ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc 1500
ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact 1560
gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 1620
atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 1680
caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 1740
cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 1800
taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 1860
ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 1920
tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 1980
gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 2040
ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 2100
aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 2160
agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 2220
agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 2280
cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 2340
gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 2400
atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 2460
gagtaaactt ggtctgacag ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta 2520
ttcatatcag gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa 2580
aactcaccga ggcagttcca taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact 2640
cgtccaacat caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag 2700
aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca aaagtttatg catttctttc 2760
cagacttgtt caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa 2820
ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga 2880
caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata 2940
ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc agggatcgca 3000
gtggtgagta accatgcatc atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc 3060
ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta 3120
cctttgccat gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt 3180
gtcgcacctg attgcccgac attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc 3240
atgttggaat ttaatcgcgg cctagagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcatactc 3300
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 3360
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3420
ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 3480
acgaggccct ttcgtc 3496
<210> 36
<211> 3490
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid [02544] comrising a donor DNA for precise editing
of ACCase gene [I1781L] in wheat
<400> 36
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatccaag 420
ctcggcgcgc cattgggatg gcgcgccatg tattctcagg gatgtaagca acgggtctgt 480
caggtgggtc caaagatttt gtaataggaa gaggtccacc aatgttggca ggaacatagc 540
tgagccacct caatatatta gatacacctt caaggtcatc tgaaactgtc agatggacaa 600
caccgtttgt cgccataatt ttggggccac ccaactgcat gtgggagctg taaacttccc 660
ggccaagaag cttgttcaag gcagagaacc cagttaggat aatgggctgg tcagtacgct 720
gtatgcaccg tatgccaagt cgagcaagat atgctcctat tccaacagtc cgtccagtca 780
caaatgtaag cgtaaatgtc tcctcatagg cgcggctata cgcactcgca atagcaacac 840
ttccatggag gttctcgacg cccaacccat cctccttccc cacaacagaa tcgataaccc 900
acctaatttc accattatca agctgcatct tgtgcgctat aacagaagtg ctaatacgag 960
catggtcttc ttcagtcaga taaatgtact gaaacccacg ttcagggctg ccatcatcag 1020
accatccaac acggaagcaa gattttactt catctgctat gccgatccga gcaccagagt 1080
ttgctgccaa gtagatgaga ggaagcttcc tctcacaagc taggttggta acagtttcaa 1140
aaaatgcatc ttcccttgga ccaaacgatc cagctctaaa agtaatatca tttgcgatga 1200
caacaatctg cctgccattg ggatattcag gagtggacat gtccaagatc ttaattaaat 1260
cccaatacgc gtcaattcaa tcccaatggc gcgccgagct tggctcgagc atggtcatag 1320
ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 1380
ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 1440
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 1500
cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 1560
ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 1620
ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 1680
gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1740
gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1800
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1860
accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 1920
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 1980
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 2040
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 2100
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca 2160
gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 2220
tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 2280
acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 2340
cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 2400
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 2460
acttggtctg acagttagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata 2520
tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca 2580
ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca 2640
acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca 2700
ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagtt tatgcatttc tttccagact 2760
tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta 2820
ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta 2880
caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca 2940
cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt tcccagggat cgcagtggtg 3000
agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat 3060
tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg 3120
ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca 3180
cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg 3240
gaatttaatc gcggcctaga gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat actcttcctt 3300
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 3360
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 3420
gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 3480
ccctttcgtc 3490
<210> 37
<211> 3155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid [04093] comrising a donor DNA for precise editing
of ACCase gene [I1781L] in wheat
<400> 37
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatgatga 420
gaccgaggtc gtgatgtctg aagtacgcca atacatctat ggcatcggta cgcagtgacc 480
aagcccgtta ttctgacagt tctggtgctc aacacattta tatttatcaa ggagcacatt 540
gttactcact gctaggaggg aatcgaacta ggaatattga tcagaggaac tacgagagag 600
ctgaagataa ctgccctcta gctctcactg atctgggtcg catagtgaga tgcagcccac 660
gtgagttcag caacggtcta gcgctgggct tttaggcccg catgatcggg cttttgtcgg 720
gtggtcgacg tgttcacgat tggggagagc aacgcagcag ttcctcttag tttagtccca 780
cctcgcctgt ccagcagagt tctgaccggt ttataaactc gcttgctgca tcagacttga 840
cccagttagg ataatgggcg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 900
gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttttatccca atggcgcgcc 960
gagcttggct cgagcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 1020
tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 1080
ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 1140
ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 1200
ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 1260
agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 1320
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 1380
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 1440
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 1500
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 1560
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 1620
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 1680
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 1740
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 1800
taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 1860
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 1920
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 1980
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 2040
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 2100
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt tagaaaaact catcgagcat 2160
caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg 2220
tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta 2280
tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa 2340
aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa 2400
aagtttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa 2460
atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac 2520
gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac 2580
tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc 2640
tgttttccca gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg 2700
cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt 2760
aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt 2820
cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata 2880
cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg 2940
ttgaatatgg ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 3000
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 3060
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 3120
ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 3155
<210> 38
<211> 8853
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid [03568] comrising an expression unit for a modifie
d Cpf1 (LbCas12a) gene optimized for use in wheat
<400> 38
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gggcccggcc ggccgcgatc 420
gcgcggccgc ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat 480
tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc 540
agtttatcta tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt 600
actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa 660
ggacaattga gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt 720
tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca 780
tccatttagg gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt 840
attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat 900
aatttagata taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag 960
aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa 1020
acgccgtcga tcgacgagtc taacggacac caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg 1080
ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc 1140
cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc ggagcggcag 1200
acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc ctcctctcac ggcaccggca gctacggggg 1260
attcctttcc caccgctcct tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa atagacaccc 1320
cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac acaaccagat 1380
ctcccccaaa tccacccgtc ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt cctccccccc 1440
cccccctctc taccttctct agatcggcgt tccggtccat gcttagggcc cggtagttct 1500
acttctgtcc atgtttgtgt tagatccgtg tttgtgttag atccgtgcta ctagcgttcg 1560
tacacggatg cgacctgtac gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca gtgtttctct 1620
ttggggaatc ctgggatggc tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc atgatttttt 1680
ttgtttcgtt gcatagggtt tggtttgccc ttttccttta tttcaatata tgccgtgcac 1740
ttgtttgtcg ggtcatcttt tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga tgtggtctgg 1800
ttgggcggtc gttctagatc ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt ggatttatta 1860
attttggatc tgtatgtgtg tgccatacat attcatagtt acgaattgaa gatgatggat 1920
ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat gcatatacag 1980
agatgctttt tgttcgcttg gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc gttcattcgt 2040
tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat tttggaactg 2100
tatgtgtgtg tcatacatct tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa tatcgatcta 2160
ggataggtat acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg catatgcagc 2220
atctattcat atgctctaac cttgagtacc tatctattat aataaacaag tatgttttat 2280
aattattttg atcttgatat acttggatga tggcatatgc agcagctata tgtggatttt 2340
tttagccctg ccttcatacg ctatttattt gcttggtact gtttcttttg tcgatgctca 2400
ccctgttgtt tggtgttact tctgcagcca tggcgcccaa gaagaagagg aaggtgggca 2460
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ccaagaccct ccgcttcaag gccatccccg tcggcaagac ccaggagaac atcgacaaca 2580
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tcgacgtcta caacgccatc atcggcggct tcgtcaccga gtcaggtgag aagatcaagg 3240
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ccggcatctt cgtgaagaac ggcccggcca tctcaaccat ctccaaggac atcttcggcg 3540
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aggccgtggt gaccgagaag tacgaggacg accgccgcaa gagcttcaag aagatcggca 3660
gcttctcact ggagcagctc caggagtacg ccgacgccga cctctccgtg gtggagaagc 3720
tgaaggagat catcatccag aaggtggacg agatctacaa ggtgtacggc agctctgaga 3780
agctcttcga cgccgacttc gtcctggaga agagcctcaa gaagaacgac gccgtggtgg 3840
ccatcatgaa ggacctcctc gactcagtca agagcttcga gaactacatc aaggccttct 3900
tcggcgaggg caaggagaca aaccgcgacg agagcttcta cggcgacttc gtcctcgcct 3960
atgacatcct cctcaaggtg gaccacatct acgacgccat caggaactac gtcacccaga 4020
agccctactc aaaggacaag ttcaagctct acttccagaa cccccagttc atgaggggct 4080
gggacaagga caaggagact gactaccgcg ccaccatcct ccgctacggc tcaaagtact 4140
acctcgccat catggacaag aagtacgcca agtgcctcca gaagatcgac aaggatgatg 4200
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agatctacaa gaacggcacc ttcaagaagg gtgacatgtt caacctcaac gactgccaca 4380
agctgatcga cttcttcaag gacagcatct caaggtaccc caagtggagc aacgcctacg 4440
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aggagcaagg ctacaaggtg agcttcgagt ccgcctccaa gaaggaggtg gacaagctgg 4560
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agaagaccac caccctctcc tacgacgtct acaaggacaa gaggttctca gaagaccagt 4860
acgagctcca catccccatc gccatcaaca agtgccccaa gaacatcttc aagatcaaca 4920
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gcgagaggaa cctcctctac atcgtggtgg tggacggcaa gggcaacatc gtggagcagt 5040
actccttgaa cgagatcatc aacaacttca acggcatcag gatcaagacc gactaccact 5100
cactccttga caagaaggag aaggagaggt tcgaggcccg gcaaaattgg acaagcatcg 5160
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accagatcac caacaagttt gagagcttca agagcatgtc aacccagaac ggcttcatct 5460
tctacatccc ggcctggctc acctccaaga tcgacccctc caccggcttc gtcaacctcc 5520
tcaagaccaa gtacacctcc atagccgaca gcaagaagtt catctcctcc ttcgaccgca 5580
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ggaccgacgc cgactacatc aagaagtgga agctctacag ctacggcaac cgcatcagga 5700
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cctacaagga gctcttcaac aagtacggca tcaactacca gcaaggtgac atcagggcgc 5820
tcctatgcga gcagagcgac aaggccttct actcctcctt catggccctc atgagcttga 5880
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tcctccccaa gaacgccgac gccaacggcg cctacaacat cgccaggaag gtgctctggg 6060
ccatcggcca gttcaagaag gccgaggatg agaagctgga caaggtgaag atcgccatct 6120
caaacaagga gtggctggag tacgcccaga cctccgtcaa gcacaagagg ccggcggcca 6180
ccaagaaggc cggccaggcc aagaagaaga agggcagcta cccctacgac gtccccgact 6240
acgcctaccc ctacgacgtc cccgactacg cctaccccta cgacgtcccc gactacgcct 6300
aattgctagc acgcgtcgaa gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat 6360
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atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag 6480
tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata 6540
aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatccctg caggcccggg ttaattaaat 6600
ttaaatggcg cgccagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 6660
atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 6720
cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 6780
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cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 7080
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tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 7560
ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 7620
aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 7680
aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 7740
aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 7800
gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 7860
gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 7920
caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 7980
ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 8040
attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 8100
ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 8160
gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 8220
ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 8280
tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 8340
gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 8400
cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 8460
gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 8520
tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 8580
ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 8640
gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 8700
tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 8760
catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct 8820
ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtc 8853
<210> 39
<211> 1290
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified Cpf1 (LbCas12a) [03568]
<400> 39
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Met Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys
20 25 30
Thr Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile
35 40 45
Asp Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr
50 55 60
Lys Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn
65 70 75 80
Asp Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser
85 90 95
Leu Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu
100 105 110
Asn Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly
115 120 125
Asn Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile
130 135 140
Leu Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser
145 150 155 160
Phe Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu
165 170 175
Asn Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys
180 185 190
Ile Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu
195 200 205
Lys Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu
210 215 220
Lys Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu
225 230 235 240
Phe Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala
245 250 255
Ile Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu
260 265 270
Asn Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro
275 280 285
Lys Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu
290 295 300
Ser Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val
305 310 315 320
Phe Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys
325 330 335
Lys Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly
340 345 350
Ile Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile
355 360 365
Phe Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp
370 375 380
Asp Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp
385 390 395 400
Asp Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln
405 410 415
Leu Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys
420 425 430
Glu Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser
435 440 445
Ser Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys
450 455 460
Lys Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val
465 470 475 480
Lys Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu
485 490 495
Thr Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp
500 505 510
Ile Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val
515 520 525
Thr Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn
530 535 540
Pro Gln Phe Met Arg Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg
545 550 555 560
Ala Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp
565 570 575
Lys Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn
580 585 590
Gly Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys
595 600 605
Met Leu Pro Arg Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn
610 615 620
Pro Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys
625 630 635 640
Gly Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe
645 650 655
Lys Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe
660 665 670
Asn Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg
675 680 685
Glu Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys
690 695 700
Lys Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln
705 710 715 720
Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu
725 730 735
His Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln
740 745 750
Ile Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu
755 760 765
Lys Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn
770 775 780
Lys Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val
785 790 795 800
Tyr Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro
805 810 815
Ile Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu
820 825 830
Val Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile
835 840 845
Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys
850 855 860
Gly Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe
865 870 875 880
Asn Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys
885 890 895
Glu Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn
900 905 910
Ile Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile
915 920 925
Cys Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu
930 935 940
Asn Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr
945 950 955 960
Gln Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp
965 970 975
Lys Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln
980 985 990
Ile Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly
995 1000 1005
Phe Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser
1010 1015 1020
Thr Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala Asp
1025 1030 1035 1040
Ser Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val Pro Glu
1045 1050 1055
Glu Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe Ser Arg Thr
1060 1065 1070
Asp Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Tyr Gly Asn Arg
1075 1080 1085
Ile Arg Ile Phe Arg Asn Pro Lys Lys Asn Asn Val Phe Asp Trp Glu
1090 1095 1100
Glu Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Leu Phe Asn Lys Tyr Gly
1105 1110 1115 1120
Ile Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg Ala Leu Leu Cys Glu Gln Ser
1125 1130 1135
Asp Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe Met Ala Leu Met Ser Leu Met Leu
1140 1145 1150
Gln Met Arg Asn Ser Ile Thr Gly Arg Thr Asp Val Asp Phe Leu Ile
1155 1160 1165
Ser Pro Val Lys Asn Ser Asp Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr
1170 1175 1180
Glu Ala Gln Glu Asn Ala Ile Leu Pro Lys Asn Ala Asp Ala Asn Gly
1185 1190 1195 1200
Ala Tyr Asn Ile Ala Arg Lys Val Leu Trp Ala Ile Gly Gln Phe Lys
1205 1210 1215
Lys Ala Glu Asp Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn
1220 1225 1230
Lys Glu Trp Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys His Lys Arg Pro
1235 1240 1245
Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser Tyr
1250 1255 1260
Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr
1265 1270 1275 1280
Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1285 1290
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HT-19-022
<400> 40
ggctaggagt cgaaaacctc 20
<210> 41
<211> 2918
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid [03609] comprising a synthetic sequence encoding a
CRISPR/Cas12a crRNA molecule for Cas12a-induced plant gen
ome targeting of an ACCase in wheat
<400> 41
gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg 60
agagaaaccc aattgggtac cgagctccct gcaggaagct taattaagat gagaccgagg 120
tcgtgatgtc tgaagtacgc caatacatct atggcatcgg tacgcagtga ccaagcccgt 180
tattctgaca gttctggtgc tcaacacatt tatatttatc aaggagcaca ttgttactca 240
ctgctaggag ggaatcgaac taggaatatt gatcagagga actacgagag agctgaagat 300
aactgccctc tagctctcac tgatctgggt cgcatagtga gatgcagccc acgtgagttc 360
agcaacggtc tagcgctggg cttttaggcc cgcatgatcg ggcttttgtc gggtggtcga 420
cgtgttcacg attggggaga gcaacgcagc agttcctctt agtttagtcc cacctcgcct 480
gtccagcaga gttctgaccg gtttataaac tcgcttgctg catcagactt gtaatttcta 540
ctaagtgtag atcacctagc ccatcctcct tcccctttta ttttttggcg cgccacctgc 600
tagcgctcgc ttggatccga attcaaacct gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 660
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 720
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 780
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 840
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 900
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 960
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 1020
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 1080
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 1140
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 1200
tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 1260
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 1320
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 1380
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 1440
gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 1500
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 1560
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 1620
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 1680
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 1740
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gccggaattg ccagctgggg cgccctctgg 1800
taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg 1860
gcgcagggga tcaagatctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca 1920
agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg 1980
ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg 2040
cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc 2100
agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt 2160
cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc 2220
atcccacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca 2280
tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc 2340
acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg 2400
gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct 2460
cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc 2520
tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc 2580
tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta 2640
cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt 2700
ctgatccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca 2760
tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg 2820
atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag 2880
cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtca 2918
<210> 42
<211> 3455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid [03253] comrising a donor DNA for precise editing
of ACCase gene [I1781L] in wheat
<400> 42
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggaac 420
ggcgcgccat gtattctcag ggatgtaagc aacgggtctg tcaggtgggt ccaaagattt 480
tgtaatagga agaggtccac caatgttggc aggaacatag ctgagccacc tcaatatatt 540
agatacacct tcaaggtcat ctgaaactgt cagatggaca acaccgtttg tcgccataat 600
tttggggcca cccaactgca tgtgggagct gtaaacttcc cggccaagaa gcttgttcaa 660
ggcagagaac ccagttagga taatgggctg gtcagtacgc tgtatgcacc gtatgccaag 720
tcgagcaaga tatgctccta ttccaacagt ccgtccagtc acaaatgtaa gcgtaaatgt 780
ctcctcatag gccctagaat aggcactggc aatagcagca cttccatgga ggttttcgac 840
tcctagccca tcctccttcc ccacaacaga atcgataacc cacctaattt caccattatc 900
aagctgcatc ttgtgcgcta taacagaagt gctaatacga gcatggtctt cttcagtcag 960
ataaatgtac tgaaacccac gttcagggct gccatcatca gaccatccaa cacggaagca 1020
agattttact tcatctgcta tgccgatccg agcaccagag tttgctgcca agtagatgag 1080
aggaagcttc ctctcacaag ctaggttggt aacagtttca aaaaatgcat cttcccttgg 1140
accaaacgat ccagctctaa aagtaatatc atttgcgatg acaacaatct gcctgccatt 1200
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gagcttggct cgagcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 1320
tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 1380
ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 1440
ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 1500
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agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 1620
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gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 1800
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 1860
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 1920
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 1980
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 2040
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 2100
taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 2160
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 2220
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 2280
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caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg 2520
tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta 2580
tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa 2640
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aagtttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa 2760
atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac 2820
gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac 2880
tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc 2940
tgttttccca gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg 3000
cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt 3060
aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt 3120
cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata 3180
cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg 3240
ttgaatatgg ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 3300
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 3360
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 3420
ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 3455
Claims (13)
- 하기 단계를 포함하는, 밀의 게놈의 표적 영역에 적어도 하나의 공여자 DNA 분자를 정확하게 도입하는 방법이며:
a. 밀 세포에 하기를 도입하는 단계:
i. 적어도 하나의 공여자 DNA 분자 및
ii. 적어도 하나의 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제 및
iii. 적어도 하나의 단일 가이드 RNA (sgRNA) 또는 tracrRNA 및 crRNA, 및
b. 게놈의 상기 표적 영역에 상기 적어도 하나의 공여자 DNA를 도입할 수 있도록 밀 세포를 인큐베이션하는 단계, 및
c. 상기 표적 영역에서 공여자 DNA 분자의 서열을 포함하는 밀 세포를 선택하는 단계,
여기서 공여자 DNA는 표적 영역에서의 서열과 각각 적어도 80% 동일한 그의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 30개의 염기에 기능적으로 연결되는 것인 방법. - 하기 단계를 포함하는, 게놈의 표적 영역에서 공여자 DNA를 포함하는 밀 식물을 생성하는 방법이며:
a. 밀 세포에 하기를 도입하는 단계:
i. 적어도 하나의 공여자 DNA 및
ii. 적어도 하나의 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제 및
iii. 적어도 하나의 단일 가이드 RNA (sgRNA) 또는 tracrRNA 및 crRNA, 및
b. 게놈의 표적 영역에 상기 적어도 하나의 공여자 DNA를 도입할 수 있도록 밀 세포를 인큐베이션하는 단계,
c. 상기 표적 영역에서 공여자 DNA 분자의 서열을 포함하는 밀 세포를 선택하는 단계, 및
d. 상기 선택된 밀 세포로부터 밀 식물을 재생시키는 단계,
여기서 공여자 DNA는 표적 영역에서의 서열과 각각 적어도 80% 동일한 그의 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 30개의 염기에 기능적으로 연결되는 것인 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b. 후에 밀 세포를 선택 작용제를 포함하는 배지 상에서 인큐베이션하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제가 Cas 뉴클레아제 또는 Cas 닉카제인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 뉴클레아제 또는 Cas 닉카제가 Cas9 또는 Cas12a 뉴클레아제 또는 Cas9 또는 Cas12a 닉카제인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레아제 또는 적어도 하나의 닉카제 또는 적어도 하나의 sgRNA 또는 적어도 하나의 crRNA 및 tracrRNA 중 적어도 하나가 핵산 분자에 의해 코딩되어 상기 세포에 도입되는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 핵산 분자가 상기 적어도 하나의 뉴클레아제/닉카제 또는 적어도 하나의 sgRNA 또는 적어도 하나의 crRNA 및 tracrRNA를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 플라스미드인 방법.
- 제6항에 있어서, 핵산이 RNA 분자인 방법.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레아제 또는 적어도 하나의 닉카제가 밀에서의 발현을 위해 최적화된 서열인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제 및 적어도 하나의 sgRNA 또는 적어도 하나의 crRNA 및 tracrRNA가 상기 세포의 외부에서 조립된 리보핵단백질 (RNP)로서 상기 세포에 도입되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 공여자 DNA 및 crRNA/tracrRNA 또는 sgRNA의 조합이 표적 영역에의 공여자 DNA 분자의 효율적인 도입을 위해 미리 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 공여자 DNA 및 적어도 하나의 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 RNA 가이딩된 닉카제 및 적어도 하나의 단일 가이드 RNA (sgRNA) 또는 tracrRNA 및 crRNA가 DNA의 입자 충격 또는 아그로박테리움 매개된 도입을 이용하여 상기 세포에 도입되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 RNA 가이딩된 뉴클레아제 또는 적어도 하나의 RNA 가이딩된 닉카제가 핵 국재화 신호를 포함하는 것인 방법.
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