CN102286512A - 一种基于位点特异性重组的多片段dna串联重组拼装方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程与合成生物学技术领域，具体为一种基于

BT1整合酶及其突变识别位点的多片段DNA串联重组拼装方法。本发明通过突变筛选和验证，提供十六对突变的整合酶识别序列，在此基础上，构建一整套相关载体，包括一个可实现大肠杆菌-天蓝色链霉菌穿梭的骨架载体，以及七个含有突变底物对用于DNA元件构建和筛选的TA克隆载体，并提供多个DNA片段体外串联重组反应的具体方法。本发明方法简单、快速并且高效，可用于多个DNA片段的快速串联重组拼装，通过转化大肠杆菌，实现串联产物的扩增。本方法可广泛用于合成生物学中标准模块和元件的组合与拼装。

Description

一种基于位点特异性重组的多片段DNA串联重组拼装方法

技术领域

本发明属于生物工程与合成生物学技术领域，具体为一种基于                                                BT1整合酶及其突变识别位点的多片段DNA串联重组拼装方法。

背景技术

“合成生物学(Synthetic Biology)”一词的提出由来已久，最早见于1911年第33卷《科学》杂志论文，在1911年7月8日《柳叶刀》的一篇书评中也出现了该词[1，2]。经过一个世纪生命科学的飞速发展，自2000后，“合成生物学”一词又重新见诸各学术杂志和报刊，并随着J. Craig Venter研究所于2008年和2010年分别全合成了生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)[3]和蕈状支原体(Mycoplasma mycoides)基因组[3]，并成功实现了在异源去核支原体细胞中的激活[3，4]，“合成生物学”逐渐进入公共视野，并引发了有关生命起源以及伦理的种种激烈争论。通过ISI-Web of Science检索，仅自2005以来[5]，已有七十六篇以合成生物学为主要论述对象的综述文章刊登。

基因组学和系统生物学相关理论技术的突破与创新，极大地促进了传统基因工程在规模和层次的升级，由此催生了合成生物学的快速发展。合成生物学的核心理念是人工设计与合成。通过已有的生物学信息，结合计算机程序模拟与预测，设计出期望的生物原件调控网络，并最终在生物学水平上完成所希望的目标。从简单的DNA序列化学合成出发(chemical synthesis)，到完整基因的合成(parts to genes)，到相互关联基因的组合与拼装(genes to pathways)，再到完整基因组的合成(pathways to genomes)并使其发挥生物学功能[6]，整个过程都渗透着设计的理念。就像电子工程师设计完成一个复杂电路一样，合成生物学家也期望将不同的生物元件进行组合与拼装，重建或者实现新的生物学功能。合成生物学的理念和技术方法将在廉价生物医药、清洁能源与化工、环境治理与保护、生物材料设计以及生物反恐等领域发挥重要的作用。

合成生物学的发展依赖于基础理论研究作为强大的后盾支撑，了解各生物元件的基本功能及其相互之间的作用是前提；另外，技术手段的创新也必不可少，比如如何将复杂系统高效率的组装到一起，并且能够方便对沉默的元件进行替换和组合？Roberta Kwok在Nature的专栏文章中指出了当前合成生物学发展在基础理论层面的五大障碍[7]：(1)很多生物元件功能未知(Many of the parts are undefined)；(2)已知部件组合之后的结果难料(The circuitry is unpredictable)；(3)生物网络的复杂性某种程度上是合成生命难以承受之重(The complexity is unwieldy)；(4)很多部件相互不兼容(Many parts are incompatible)；(5)变异可能使一切努力付诸东流(Variability crashes the system)。所有这些限制因素都需要大量的工作来排除种种失败的可能性，除去不必要的“垃圾”元件；筛选出可真正发挥作用的模块或者网络。这就需要非常高效的筛选方法来满足在生物学层面上的大量尝试，以及发展非常高效的基因拼接与替换等技术。

传统的DNA重组技术主要依赖于PCR扩增、限制性酶切和DNA连接，这也是目前基因工程操作的主要手段。随后也有一些不依赖连接反应的克隆(Ligation Independent Cloning, LIC)方法发展出来[8，9]；LIC主要依赖于PCR的退火和延伸，有的则需要在PCR末端加入接头，并设计相应的配接载体，对使用的DNA聚合酶也有一定的要求。In-Fusion^TM (Clontech)技术和Gateway^TM (Life Technologies)技术则分别基于短序列的同源重组[10]和噬菌体λ的位点特异性重组[11]。以上这些方法都比较适合于单个DNA片段的克隆，为满足合成生物学对多模块同时组装的需要，则需要发展多片段克隆技术。目前已有一些方法适合同一反应中进行多片段的克隆，比如多重Gateway^TM 系统(Multiple Gateway^TM System) [12]，Pairwise Selection Assembly (PSA) [13]，多重In-Fusion^TM技术[14]以及JCVI发展的恒温组装方法(‘Gibson’ isothermal assembly method) [3]等。这些方法目前都可以用于多个DNA片段的组装，然而都各有优缺点。为了更加便捷高效地在“基因到通路”以及“通路到基因组”水平上完成多模块组装，相应的技术方法和策略仍然亟待发展[6]。

我们建立了基于链霉菌噬菌

BT1的体外位点特异性重组系统[15]；并且鉴定了16对“不兼容(non-compatible)”重组位点对[16]，

BT1重组系统非常高效且精确，在不兼容位点对之间没有重组的发生[16]。考虑该系统的多项优势和特点，本发明利用该系统发展了一种体外多片段串联重组拼装的方法(Site-Specific Recombination based Tandem Assembly method, SSRTA)。具体选用抗肿瘤抗生素埃博霉素(epothilones)之生物合成基因簇作为对象。

1993年，默克公司(Merck Sharp and Dohme, MSD)开始一项从67000个合成化合物和70000个天然产物中筛选具有类似紫杉醇(Taxol)活性(通过稳定微管蛋白来抑制细胞分裂)之抗癌药物的计划[3]，由此发现了epothilone A & B的抗肿瘤活性，并于1995年发表了这一激动人心的结果[17]。埃博霉素生物合成基因簇由6个ORF构成，包含10个模块(module)，其中8个为聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)模块，1个为非核糖体多肽合酶(non-ribosomal peptide synthetase, NRPS)模块，还含有1个负载模块(loading module)。抗生素生物合成基因簇的模块化特点，为其进行组合生物合成以及作为发展多片段重组技术的模型，提供了天然的优势。本发明即利用埃博霉素生物合成基因簇作为对象，发展基于

BT1重组系统的多片段串联重组拼装方法。

发明内容

本发明的目的在于提出一种简单，高效，快速的体外多片段DNA串联重组拼装（SSRTA）方法。

本发明提出的SSRTA方法，是一种基于大型丝氨酸重组酶

BT1整合酶的多片段DNA串联重组拼装方法。本发明通过严格突变筛选和验证，提供十六对突变的整合酶识别序列，突变的底物对参与反应效率与野生型相当，且在同一体系中表现为不兼容，即可同时使用。在此基础上，以当前最具潜力的抗肿瘤药物埃博霉素生物合成基因簇的拼装为例，构建一整套相关载体，包括一个可实现大肠杆菌-天蓝色链霉菌穿梭的骨架载体，以及七个含有突变底物对用于DNA元件构建和筛选的TA克隆载体，并提供多个(本发明中分别示例了五个和七个)DNA片段体外串联重组反应的具体方法。

本发明首先提供一个重组克隆骨架质粒，该重组克隆骨架质粒基于突变整合位点序列构建，其序列如SEQ No.59所示，记为pZLE10。

本发明还提供所述重组克隆骨架质粒的相应元件，该相应元件包括attP ₀ 和attB ₁₅ 位点、大肠杆菌复制起始区域(ori-p15A)、噬菌体

C31的整合酶基因和attP位点、十一烷基灵菌红素(Red)生物合成基因簇中的启动子PredP、核糖体结合位点序列(RBS)、抗性基因、转录终止子以及接合转移起始位点。

本发明还提供基于突变整合位点序列所构建的重组克隆入门质粒，该质粒的序列为SEQ No.3、SEQ No.6、SEQ No.9、SEQ No.12、SEQ No.15、SEQ No.18或SEQ No.20所示，依次记为pTA0006、pTA0613、pTA1307、pTA0712、pTA1203、pTA0315和pTA1303。

本发明还提供所述质粒的相应元件，该相应元件包括质粒复制起始位点、抗药性基因以及位点特异性重组识别位点，依次为attB ₀ 和attP ₆ 、attB ₆ 和attP ₁₃ 、attB ₁₃ 和attP ₇ 、attB ₇ 和attP ₁₂ 、attB ₁₂ 和attP ₃ 、attB ₃ 和attP ₁₅ 、以及 attB ₁₃ 和attP ₃ 。 

本发明还提供所述质粒的构建方法，具体步骤如下： 

以引物PT1 (包含attB ₀ , SEQ No.1)和PTF (包含attP ₆ , SEQ No.2)扩增阿泊拉霉素（Aparamycin )抗性基因(aac(3)IV)，将获得的PCR片段通过TA克隆插入到pMD19-T (Takara)载体中，即得到pTA0006 (SEQ No.3)。 

通过相同的方法，获得其他“入门载体”：以引物PTB6 (包含attB ₆ , SEQ No.4)和PTP13 (包含attP ₁₃ , SEQ No.5)获得pTA0613(SEQ No.6)；以引物PTB13 (包含attB ₁₃ , SEQ No.7) 和PTP7 (包含attP ₇ , SEQ No.8) 获得pTA1307(SEQ No.9)；以引物PTB7 (包含attB ₇ , SEQ No.10) 和PTP12 (包含attP ₁₂ , SEQ No.11) 获得pTA0712(SEQ No.12)；以引物PTB12 (包含attB ₁₂ , SEQ No.13)和PTP3 (包含attP ₃ , SEQ No.14) 获得pTA1203(SEQ No.15)；以引物PTB3 (包含attB ₃ , SEQ No.16) 和PTP15 (包含attP ₁₅ , SEQ No.17) 获得pTA0315(SEQ No.18)；以引物PTB13 (包含attB ₁₃ , SEQ No.19)和PTP3 (包含attP ₃ , SEQ No.14) 获得pTA1303 (SEQ No.20)。

本发明还提供将目的片段克隆到入门载体的方法，具体步骤为：用限制性内切酶XcmI 消化入门载体，以TA克隆的方式插入目的片段。

本发明提出的体外多片段DNA串联重组拼装（SSRTA）方法。是基于前述质粒的，具体步骤如下： 

将各亚克隆线性化，小于10 kb的线性片段以琼脂糖凝胶分离后以试剂盒回收；大于10 kb的线性片段先以酚氯仿抽提后，再由乙醇沉淀回收。将线性片段和

BT1整合酶于30°C温育过夜(至少8小时)，缓冲体系为：10 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA 和 1 mM DTT，串联重组产物先以蛋白酶K灭活，再以酚氯仿抽提后乙醇沉淀回收，然后以脉冲场凝胶电泳分析。

本发明还提供一种基于突变整合位点对，在PCR引物5'端添加突变的整合位点，然后以PCR产物直接进行体外多片段串联重组的方法，该方法涉及的反应缓冲体系如前所述。 本发明提供的SSRTA方法简单、快速并且高效，可用于多个DNA片段的快速串联重组拼装，并通过转化大肠杆菌，实现串联产物的扩增。当前合成生物学飞速发展，迫切需要高效快捷的多片段DNA拼装方法；本发明提供的SSRTA方法的改造和延伸，能够高效快速的重构生物途径与网络；对该方法的进一步改造和优化，将使其在合成生物学中发挥重要的作用

下面对本发明内容进一步具体描述：

本发明以通过两步串联重组拼装，分别实现五个和七个DNA片段的重组，获得完整的埃博霉素生物合成基因簇为例。

1、“入门载体”的设计和构建。

本发明将该新发展的方法称为体外多片段串联重组拼装 (Site-Specific Recombination based Tandem Assembly method, SSRTA)；本方法的核心为BT1整合酶催化的高效体外位点特异性重组系统和16对不兼容(non-compatible)的底物位点。因为不同的位点对之间不能发生重组，所以可以在同一体系中使用不同的位点对，即可实现多个DNA片段的精确串联组装。如图1所示，不同颜色标记的底物之间不能发生重组，重组只在特定的(相同颜色)一对底物间进行，这种底物对底物严格控制的特性赋予了该系统高度的精确性。

抗生素生物合成基因簇中I型聚酮合酶(type I PKS )以模块形式存在，每一模块含独特的、非重复使用的功能域[18]。这一特点为组成生物合成提供了可能。埃博霉素含有噻唑环配基为侧链的16元大环内酯类抗生素，其生物合成基因簇由6个ORF构成，包含10个模块(module)，其中8个为聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)模块，1个为非核糖体多肽合酶(non-ribosomal peptide synthetase, NRPS)模块，1个为负载模块(loading module)。另外还含有一个P450 环氧化酶( epoxidase)基因(epoK)，负责12位和13位C的环氧化，形成三元杂环[3]；本发明中未克隆环氧化酶基因。

为从六个独立克隆出发，通过一步串联重组获得完整的埃博霉素生物合成基因簇，需要使用7对不兼容重组位点对。本发明选用了以下七对位点，编号为0、3、6、7、12、13和15，各编号对应的重组位点序列请见相应文献[16]。利用这七对位点，成功构建了七个“入门载体”，即pTA0006、pTA0613、pTA1307、pTA0712、pTA1203、pTA0315 和pTA1303(见具体实施方式)。对每个载体而言，重组位点中间为Apramycin抗性基因aac(3)IV，紧挨着重组位点内侧为一对XcmI识别位点；以XcmI酶切载体后，即可通过TA cloning把目的片段插入到载体而获得“入门克隆”(如图2A)。

除用于分步骤克隆埃博霉素生物合成基因的载体外，本发明还构建了可用于大肠杆菌中复制和链霉菌中进行表达的多功能骨架载体(如图2B)。该载体的attP ₀ 和attB ₁₅ 位点用于把完整的基因簇装配进来；然后在大肠杆菌复制扩增(ori-p15A)并进行验证；再通过噬菌体

C31的integrase和attP位点整合进入链霉菌基因组；最后通过十一烷基灵菌红素(Red)生物合成基因簇中的启动子PredP起始转录。核糖体结合位点序列(RBS)为PtipA启动子中的相应序列。

2、“入门克隆”的构建。

以纤维堆囊菌Sorangium cellulosum strain So0157-2[19]基因组DNA为模板，本发明通过高保真PCR扩增和分步酶切连接，获得了包含有埃博霉素生物合成相关全部基因的九个“入门克隆”(克隆详细步骤请见具体实施方式)，对每个克隆进行测序验证，并与其他两组不同菌株来源的埃博霉素生物合成基因簇序列进行比较分析(Sorangium cellulosum strain SMP44[20]和strain So ce90[21])。需要说明的是，多片段串联重组拼装也可以直接使用PCR产物进行，只需要在PCR引物的5’端加入相应的重组位点。然而考虑到埃博霉素生物合成基因簇的高GC%含量(69.5%)和测序验证的方便，我们采用了先行将PCR产物克隆进“入门载体”来获得“入门克隆”的方式，代替直接使用PCR产物作为串联底物。

九个“入门克隆”依次为： 

“入门克隆”名称	描述
		pTA0006-M0	包含loading module；epoA
pTA0613-M1	包含NRPS module；epoB
		pTA1307-M2	包含module 2；epoC
pTA0006-M3-aphII	包含module 3、部分module 4和抗性基因aphII；部分epoD
		pTA0613-M4	包含部分module 4和部分module 5；部分epoD
pTA1303-M5	包含部分module 5和部分module 6；部分epoD
		pTA0315-M6	包含部分module 6；部分epoD
pTA1203-epoE	包含module 7和module 8；epoE
		pTA0315-M9	包含module 9；epoF

3、epoD的串联重组拼装。

本发明首先测试SSRTA一次拼装5个DNA片段的能力(图3)。epoD大小为22 kb，将其大致均分到四个“入门载体”中，即pTA0006-M3-aphII (引入Kanamycin和Neomycin抗性基因aphII以方便筛选)、pTA0613-M4、pTA1303-M5和pTA0315-M6；分别线性化该四个“入门载体”和骨架载体pZLE10，线性化后的片段大小和位点分布如图4所示。

将线性化后的五个DNA片段与

BT1整合酶温育过夜，以蛋白酶K灭活终止反应，酚氯仿抽提后乙醇沉淀回收，脉冲场凝胶电泳分析结果。如图5所示，通过PFGE电泳清晰的检测到最终串联重组产物(final assembly)，大小为29.8 kb；在底物和最终产物之间，形成两个、三个和四个片段重组的中间体(intermediates)。

将回收纯化的串联重组产物电击转化E.coli strain DH10B，获得阳性克隆分别以PCR和酶切进行验证。如图6A所示，串联重组完成后，质粒上含有五个不同的attR接头序列(scar sequences)，其中有三个位于epoD内部(m3m4、m4m5与m5m6)。而epoD为一个完整的开放阅读框，所以必须将接头序列去除。我们设计了三对酶切位点用于去除scar sequences以保证EpoD的完整翻译，如图6A所示接头m3m4、m4m5和m5m6两侧分别为SnaBI、HpaI和NheI识别位点；以相应的酶切后自连即可获得完整的ORF。如图6B&C，我们分别去除了m4m5和m5m6之间的scar sequences，m3m4之间的抗性基因aphII留待下步串联筛选完成后去除。

分别去除m4m4和m5m6之间的scar sequences后，我们再次对全部五个接头序列进行PCR验证，确保pZLE10-epoD的正确；另外一方面质粒经过多轮传代，需要验证其在大肠杆菌的稳定性。如图7 A，五个接头PCR产物大小与预期完全一致。进一步以不同的酶切来验证，如图7B，以ApaI (lane 1)和HindIII & NheI (lane 2)分别酶切，带型与预期一致。

4、全长epothilones生物合成基因簇的拼装。

如上所示，SSRTA能够很好的完成5个片段的串联重组，我们进一步测试该方法能否实现7个片段的串联重组，以拼接出完整的埃博霉素生物合成基因簇。首先将六个分别含有epoA、epoB、epoC、epoD、epoE与epoF的“入门克隆”和骨架载体酶切线性化，线性化后的片段大小和位点分布如图8所示。7对位点间的重组示意如图9。

将线性化后的七个DNA片段与

BT1整合酶温育过夜，以蛋白酶K灭活终止反应，酚氯仿抽提后乙醇沉淀回收，脉冲场凝胶电泳分析结果。如图10A所示，通过PFGE电泳清晰的检测到最终串联重组产物(final assembly)，大小为62.4 kb；在系列底物和最终产物之间，形成两个、三个、四个、五个以及六个片段重组的中间体(intermediates)，显示为阶梯状条带。

重组产物转化大肠杆菌后挑取阳性克隆，将质粒以SnaBI酶切自连去除抗性基因aphII，即获得最终的目的克隆。如图10B，对10个重组接头处序列进行扩增验证，结果显示PCR产物大小与预期完全一致；如图10C，分别以HindIII (lane 1)和NdeI (lane 2)对最终目的克隆进行酶切验证，带型与预期一致。为确保质粒pZLE10-epo在拼装过程中接头部分序列的正确性，以及排除多轮传代引入突变的可能性，我们对最终的61 kb质粒(如图11)进行了测序；结果没有检测到任何突变。说明该方法具有非常高的准确性。 

本发明方法简单、快速并且高效，可用于多个DNA片段的快速串联重组拼装，通过转化大肠杆菌，实现串联产物的扩增。本方法可广泛用于合成生物学中标准模块和元件的组合与拼装。另外，目前完成生化鉴定的噬菌体编码大型丝氨酸重组已近十种，该方法可以很容易的拓展到其它位点特异性重组体系，并寻求多个SSRTAs系统的联合运用。

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附图说明

图1：基于

BT1整合系统的SSRTA原理。不同的模块两侧添加有精确设计的不兼容底物对，在模块内基因的上游添加突变的attB位点，下游添加突变的attP位点。将多个底物片段与整合酶温育后，只经过同一体系的一步反应，即可将多个DNA片段组装起来。不同颜色的箭头示意不同的重组位点对。

图2: 系列“入门载体”结构示意。(A) 七个串联重组“入门载体”结构示意图，构建过程请见具体实施方式。通过两端放置“首尾相接”的重组位点，藉此实现多片段之串联重组。(B) 多功能载体结构示意，该载体用于在大肠杆菌中复制扩增串联产物，还用于整合入链霉菌基因组来表达埃博霉素生物合成基因。各序列详细注释信息见具体实施方式。

图3：pZLE10-epoD的串联重组示意。五组重组反应同时分别发生于位点对attB ₀ /attP ₀ 、attB ₆ /attP ₆ 、attB ₁₃ /attP ₁₃ 、attB ₃ /attP ₃ 和attB ₁₅ /attP ₁₅ 之间。pTA0006-M3-aphII中引入attB ₇ ，pTA0315-M6中引入attP ₁₂ 用于下一轮串联重组。

图4：用于pZLE10-epoD串联重组的线性片段。以EcoRI和HindIII酶切pTA0006-M3-aphII 获得“Module 3”，酶切pTA0613-M4获得“Module 4”；酶切pTA0315-M6获得“Module 6”；以AseI酶切pTA1303-M5获得“Module 5”；pZLE10以EcoRI单酶切线性化。

图5：pZLE10-epoD串联重组产物以PFGE电泳分析。

图6：pZLE10-epoD结构示意与PCR验证接头去除。(A) 通过接头序列来对串联产物进行初步验证。PCR产物大小分别为322 bp (vm3, primers ES57/58), 1615 bp (m3m4, primers ES51/52), 295 bp (m4m5, primers ES53/54), 486 bp (m5m6, primers ES55/56) 和468 bp (m6v, primers ES59/60)。(B) m4m5之间scar sequences的去除(HpaI)，去除之后PCR产物大小减为177 bp。(C) m5m6之间scar sequences的去除(HheI)，去除之后PCR产物大小减为249 bp。

图7：pZLE10-epoD的PCR和酶切验证。(A) pZLE10-epoD五个接头序列的PCR验证；m4m4和m5m6之间的scar sequences已分别去除；PCR产物大小见图5.9。(B) 以ApaI (lane 1)和HindIII & NheI (lane 2)分别酶切验证pZLE10-epoD。

图8：用于pZLE10-epo串联重组的线性片段。pZLE10以EcoRI单酶切线性化。以EcoRI和HindIII酶切pTA0006-M0获得“epoA”，酶切pTA1203-epoE获得“epoE’”。以AseI酶切pTA0613-M1获得“epoB”；酶切pTA1307-M2获得“epoC”；酶切pTA0315-M9获得“epoF”。以XapI酶切pZLE10-epoD获得“epoD”。

图9：pZLE10-epo的串联重组示意。七组重组反应同时分别发生于位点对attB ₀ /attP ₀ 、attB ₆ /attP ₆ 、attB ₁₃ /attP ₁₃ 、attB ₇ /attP ₇ 、attB ₁₂ /attP ₁₂ 、attB ₃ /attP ₃ 和 between attB ₁₅ /attP ₁₅ 之间。反应完成后，最终产物质粒上带有7个attR位点，依次为attR ₀ 、attR ₆ 、attR ₁₃ 、attR ₇ 、attR ₁₂ 、attR ₃ 与attR ₁₅ 。

图10：pZLE10-epo的验证。(A) pZLE10-epo串联重组产物以PFGE电泳分析。(B) 通过接头序列来对阳性克隆进一步验证。PCR产物大小分别为467 bp (vm0, primers ES57/61), 420 bp (m0m1, primers ES62/63), 420 bp (m1m2, primers ES64/65), 386 bp (m2m3, primers ES66/58), 177 bp (m4m5, primers ES53/54), 249bp (m5m6, primers ES55/56), 277 bp (m6m7, primers ES59/67), 306 bp (m8m9, primers ES68/69)与411 bp (m9v, ES70/60)；将m3m4 (primers ES51/52) 之间的scar sequence通过SnaBI酶切自连去除之后，PCR产物大小由1615 bp缩小为181 bp。(C) 以HindIII (lane 1)和NdeI (lane 2)分别酶切验证pZLE10-epo。

图11：质粒pZLE10-epo图谱。除NheI外，其余显示的均为单酶切位点。

具体实施方式

1、“入门载体(entry vector)”的构建：

本发明构建了七个“入门载体”，即pTA0006、pTA0613、pTA1307、pTA0712、pTA1203、pTA0315 和pTA1303；质粒名称前两位数字代表attB突变编号，后两位数字代表attP突变编号，编号请见相应文献[16]。“入门载体”构建如下：以引物PT1 (包含（containing ） attB ₀ , SEQ No.1)和PTF (containing attP ₆ , SEQ No.2)扩增Aparamycin抗性基因(aac(3)IV)，将获得的PCR片段通过TA cloning插入到pMD19-T (Takara)载体中，即得到pTA0006 (如图1, SEQ No.3)。

通过相同的方法，获得其他“入门载体”：以引物PTB6 (containing attB ₆ , SEQ No.4)和PTP13 (containing attP ₁₃ , SEQ No.5)获得pTA0613(SEQ No.6)；以引物PTB13 (containing attB ₁₃ , SEQ No.7) 和PTP7 (containing attP ₇ , SEQ No.8) 获得pTA1307(SEQ No.9)；以引物PTB7 (containing attB ₇ , SEQ No.10) 和PTP12 (containing attP ₁₂ , SEQ No.11) 获得pTA0712(SEQ No.12)；以引物PTB12 (containing attB ₁₂ , SEQ No.13)和PTP3 (containing attP ₃ , SEQ No.14) 获得pTA1203(SEQ No.15)；以引物PTB3 (containing attB ₃ , SEQ No.16) 和PTP15 (containing attP ₁₅ , SEQ No.17) 获得pTA0315(SEQ No.18)；以引物PTB13 (containing attB ₁₃ , SEQ No.19)和PTP3 (containing attP ₃ , SEQ No.14) 获得pTA1303 (SEQ No.20). 所有的“入门载体”都筛选同一插入方向，如图1示意。

2、“入门克隆(entry clone)”的构建

整个埃博霉素生物合成基因簇被分为17块来进行PCR扩增。

具体克隆步骤为：为克隆epoA，以引物00a (SEQ No.21)和00b (SEQ No.22)扩增得大小为4289-bp DNA片段，通过TA-cloning插入到pTA0006即得到pTA0006-M0；为克隆epoB，以引物01a (SEQ No.23)和01b (SEQ No.24)扩增得大小为4256-bp DNA片段，通过TA-cloning插入到pTA0613即得到pTA0613-M1；为克隆epoC，以引物02a (SEQ No.25)和02b (SEQ No.26)扩增得大小为5525-bp DNA片段，通过TA-cloning插入到pTA1307即得到pTA1307-M2；为克隆module 3，以引物03a (SEQ No.27)和03b (SEQ No.28)扩增得大小为4766-bp DNA片段，通过TA-cloning插入到pTA0006即得到pTA0006-M3。Module 4分成两部分，M4a (3252-bp，primers 04a/ZE05, SEQ No.29 and No.30)和M4b (3220-bp, primers ZE06/04b, SEQ No.31 and No.32)；将PCR片段分别克隆到pTA0613，然后通过酶切连接组合起来得到pTA0613-M4。Module 5分成两部分，M5a (3607-bp, primers 05a/ZE07, SEQ No.33 and No.34)和M5b (2767-bp, primers ZE08/05b, SEQ No.35 and No.36)；将PCR片段分别克隆到pTA1303，然后通过酶切连接组合起来得到pTA1303-M5。Module 6分成两部分，M6a (2490-bp, primers 06a/ZE09, SEQ No.37 and No.38)和M6b (2611-bp, primers ZE10/06b, SEQ No.39 and No.40)；将PCR片段分别克隆到pTA0315，然后通过酶切连接组合起来得到pTA0315-M6。Module 7分成两部分，M7a (3506-bp, primers 07a/ZE11, SEQ No.41 and No.42)和M7b (2683-bp, primers ZE12/07b, SEQ No.43 and No.44)；将PCR片段分别克隆到pTA1203。Module 8分成两部分，M8a (2649-bp, primers 08a/ZE13, SEQ No.45 and No.46)和M8b (3188-bp, primers ZE14/08b, SEQ No.47 and No.48)；将PCR片段分别克隆到pTA1203。含有module 7和module 8的质粒通过酶切连接组合起来得到pTA1203-epoE。Module 9分成三部分，M9a (3088-bp, primers 09a/ZE15, SEQ No.49 and No.50)、M9b (2229-bp, primers ZE16/ ZE19, SEQ No.51 and No.52)和M9c (2443-bp, primers ZE20/09b, SEQ No.53 and No.54)；将PCR片段分别克隆到pTA0315，然后通过酶切连接组合起来得到pTA0315-M9。

所有“入门克隆”都挑选正确的方向并逐一测序验证。为方便后续串联的筛选，把一段含有aphII 基因(resistant to Kanamycin and Neomycin)的PCR片段(1338-bp, primers Oxj128R/Oxj129, SEQ No.55 and No.56)通过SpeI位点插入到pTA0006-M3中，得到pTA0006-M3-aphII。

表达载体的构建：

质粒pZLE10设计用来在大肠杆菌中复制并扩增串联重组产物；且可以通过噬菌体C31的位点特异性重组整合入链霉菌基因组并表达克隆的相关基因。该质粒构建如下：将PCR片段(1956-bp, primers ZE03/ZE04, SEQ No.57 and No.58)插入到pMD-19T vector (Takara)中得到过渡质粒，用XbaI和BglII酶切后得到一个1962-bp的DNA片段；用NheI和BglII酶切质粒T-Bxbatt1-Bxbatt2后得到一个4441-bp的DNA片段；将该两片段连接得到pZLE12。以XbaI酶切pZLE12得到大小为3713-bp的片段；以NheI和XbaI酶切pSET152得到大小为3402-bp的片段；两片段连接后即得到质粒pZLE10 (如图2B所示, SEQ No.59)。

3、体外多片段串联重组拼装体系

串联重组反应中使用的DNA分子均为线性。小于10 kb的线性片段以琼脂糖凝胶分离后以试剂盒回收；大于10 kb的线性片段先以酚氯仿抽提后再乙醇沉淀回收。串联拼装pZLE10-epoD时，将含有module 3、4、5和6的DNA片段，线性pZLE10和

BT1整合酶于30°C温育过夜(至少8小时)。缓冲体系为：10 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA and 1 mM DTT；整合酶的表达纯化和保存见相应文献[15]。串联重组产物先以蛋白酶K灭活，再以酚氯仿抽提后乙醇沉淀回收，然后以脉冲场凝胶电泳分析。同时以对串联接头部分的PCR来验证重组串联的发生与片段的正确性。重组产物通过电击转化大肠杆菌DH10B，电击条件为：25 μF capacitance, 1.8 kV/mm, and 200 Ohm resistance；以Apramycin和Neomycin进行筛选。获得的克隆先以引物ES53/54(SEQ No.60 and No.61)进行PCR验证，提取阳性克隆质粒；以全部接头引物PCR验证，再以酶切验证。正确克隆大量扩增提取质粒后保存和进行下一步串联重组反应。以同样的方法进行全长埃博霉素生物合成基因簇(pZLE10-epo) (SEQ No.62)的拼装。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  复旦大学

<120>  一种基于位点特异性重组的多片段DNA串联重组拼装方法

<130>  001

<160>  62   

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  66

<212>  DNA

<213>  

<400>  1

gaccaggttt ttgacgaaag tgatccagat gatccagctc tacactggtt catgtgcagc     60

tccatc                                                                66

 

<210>  2

<211>  77

<212>  DNA

<213>  

<400>  2

ggtgctgagt agtttcccat ggatcagtgt ccagagacaa caacccagca ctcgaatggc     60

tcagccaatc gactggc                                                    77

 

<210>  3

<211>  3703

<212>  DNA

<213>  

<400>  3

ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca     60

ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac    120

ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat    180

gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg    240

cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata    300

ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc    360

aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg    420

ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt    480

aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat cctctagtcg acgatgacca    540

ggtttttgac gaaagtgatc cagatgatcc agctctacac tggttcatgt gcagctccat    600

cagcaaaagg ggatgataag tttatcacca ccgactattt gcaacagtgc cgttgatcgt    660

gctatgatcg actgatgtca tcagcggtgg agtgcaatgt cgtgcaatac gaatggcgaa    720

aagccgagct catcggtcag cttctcaacc ttggggttac ccccggcggt gtgctgctgg    780

tccacagctc cttccgtagc gtccggcccc tcgaagatgg gccacttgga ctgatcgagg    840

ccctgcgtgc tgcgctgggt ccgggaggga cgctcgtcat gccctcgtgg tcaggtctgg    900

acgacgagcc gttcgatcct gccacgtcgc ccgttacacc ggaccttgga gttgtctctg    960

acacattctg gcgcctgcca aatgtaaagc gcagcgccca tccatttgcc tttgcggcag   1020

cggggccaca ggcagagcag atcatctctg atccattgcc cctgccacct cactcgcctg   1080

caagcccggt cgcccgtgtc catgaactcg atgggcaggt acttctcctc ggcgtgggac   1140

acgatgccaa cacgacgctg catcttgccg agttgatggc aaaggttccc tatggggtgc   1200

cgagacactg caccattctt caggatggca agttggtacg cgtcgattat ctcgagaatg   1260

accactgctg tgagcgcttt gccttggcgg acaggtggct caaggagaag agccttcaga   1320

aggaaggtcc agtcggtcat gcctttgctc ggttgatccg ctcccgcgac attgtggcga   1380

cagccctggg tcaactgggc cgagatccgt tgatcttcct gcatccgcca gaggcgggat   1440

gcgaagaatg cgatgccgct cgccagtcga ttggctgagc cattcgagtg ctgggttgtt   1500

gtctctggac actgatccat gggaaactac tcagcaccat ctctagtcga cctgcaggca   1560

tgcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac   1620

aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt   1680

gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc   1740

gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg   1800

ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt   1860

atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa   1920

gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc   1980

gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag   2040

gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt   2100

gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg   2160

aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg   2220

ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg   2280

taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac   2340

tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg   2400

gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt   2460

taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg   2520

tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc   2580

tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt   2640

ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt   2700

taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag   2760

tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt   2820

cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc   2880

gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc   2940

cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg   3000

ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac   3060

aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg   3120

atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc   3180

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact   3240

gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc   3300

aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat   3360

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc   3420

ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac   3480

tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa   3540

aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact   3600

catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg   3660

atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gtt                     3703

 

<210>  4

<211>  66

<212>  DNA

<213>  

<400>  4

gaccaggttt ttgacgaaac tgatccagat gatccagctc tacactggtt catgtgcagc     60

tccatc                                                                66

 

<210>  5

<211>  77

<212>  DNA

<213>  

<400>  5

ggtgctgagt agtttcccat ggatctgtgt ccagagacaa caacccagca ctcgaatggc     60

tcagccaatc gactggc                                                    77

 

<210>  6

<211>  3697

<212>  DNA

<213>  

<400>  6

gaccaggttt ttgacgaaac tgatccagat gatccagctc tacactggtt catgtgcagc     60

tccatcagca aaaggggatg ataagtttat caccaccgac tatttgcaac agtgccgttg    120

atcgtgctat gatcgactga tgtcatcagc ggtggagtgc aatgtcgtgc aatacgaatg    180

gcgaaaagcc gagctcatcg gtcagcttct caaccttggg gttacccccg gcggtgtgct    240

gctggtccac agctccttcc gtagcgtccg gcccctcgaa gatgggccac ttggactgat    300

cgaggccctg cgtgctgcgc tgggtccggg agggacgctc gtcatgccct cgtggtcagg    360

tctggacgac gagccgttcg atcctgccac gtcgcccgtt acaccggacc ttggagttgt    420

ctctgacaca ttctggcgcc tgccaaatgt aaagcgcagc gcccatccat ttgcctttgc    480

ggcagcgggg ccacaggcag agcagatcat ctctgatcca ttgcccctgc cacctcactc    540

gcctgcaagc ccggtcgccc gtgtccatga actcgatggg caggtacttc tcctcggcgt    600

gggacacgat gccaacacga cgctgcatct tgccgagttg atggcaaagg ttccctatgg    660

ggtgccgaga cactgcacca ttcttcagga tggcaagttg gtacgcgtcg attatctcga    720

gaatgaccac tgctgtgagc gctttgcctt ggcggacagg tggctcaagg agaagagcct    780

tcagaaggaa ggtccagtcg gtcatgcctt tgctcggttg atccgctccc gcgacattgt    840

ggcgacagcc ctgggtcaac tgggccgaga tccgttgatc ttcctgcatc cgccagaggc    900

gggatgcgaa gaatgcgatg ccgctcgcca gtcgattggc tgagccattc gagtgctggg    960

ttgttgtctc tggacacaga tccatgggaa actactcagc accaatcgtc gacctgcagg   1020

catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc   1080

acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga   1140

gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg   1200

tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg   1260

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg   1320

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga   1380

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg   1440

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag   1500

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc   1560

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ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt   1680

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gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc   1980

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cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt   2100

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ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc   3120

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc   3180

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<210>  7

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<212>  DNA

<213>  

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tccatc                                                                66

 

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<212>  DNA

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<212>  DNA

<213>  

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gtctctggac aaagatccat gggaaactac tcagcaccat ctctagtcga cctgcaggca   1560

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gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc   1740

gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg   1800

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tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg   2400

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atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc   3180

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact   3240

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aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat   3360

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc   3420

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aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact   3600

catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg   3660

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<210>  10

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<212>  DNA

<213>  

<400>  10

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tccatc                                                                66

 

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<212>  DNA

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<213>  

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ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac    120

ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat    180

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cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata    300

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ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt    480

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catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg   3660

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<210>  13

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<213>  

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attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat    300

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tcatgtgcag ctccatcagc aaaaggggat gataagttta tcaccaccga ctatttgcaa    540

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cttggactga tcgaggccct gcgtgctgcg ctgggtccgg gagggacgct cgtcatgccc    780

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cgagtgctgg gttgttgtct ctggacagcg atccatggga aactactcag caccatcgtc   1440

gacctgcagg catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg   1500

ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg   1560

tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc   1620

gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt   1680

gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct   1740

gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga   1800

taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc   1860

cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg   1920

ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg   1980

aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt   2040

tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt   2100

gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg   2160

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cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct   2340

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac   2400

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc   2460

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg   2520

ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta   2580

aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca   2640

atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc   2700

ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc   2760

tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc   2820

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tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc   3000

cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag   3060

ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt   3120

tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac   3180

tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg   3240

cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat   3300

tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc   3360

gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc   3420

tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa   3480

atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg   3540

tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg   3600

cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac   3660

ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc                              3695

 

<210>  16

<211>  39

<212>  DNA

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<210>  17

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<212>  DNA

<213>  

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ggtgctgagt agtttcccat ggatcggtgt ccagagacaa caacccagca ctcgaatggc     60

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<210>  18

<211>  3703

<212>  DNA

<213>  

<400>  18

ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca     60

ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac    120

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gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg    240

cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata    300

ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc    360

aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg    420

ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt    480

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ggtttttgac gaaagcgatc cagatgatcc agctctacac tggttcatgt gcagctccat    600

cagcaaaagg ggatgataag tttatcacca ccgactattt gcaacagtgc cgttgatcgt    660

gctatgatcg actgatgtca tcagcggtgg agtgcaatgt cgtgcaatac gaatggcgaa    720

aagccgagct catcggtcag cttctcaacc ttggggttac ccccggcggt gtgctgctgg    780

tccacagctc cttccgtagc gtccggcccc tcgaagatgg gccacttgga ctgatcgagg    840

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acgacgagcc gttcgatcct gccacgtcgc ccgttacacc ggaccttgga gttgtctctg    960

acacattctg gcgcctgcca aatgtaaagc gcagcgccca tccatttgcc tttgcggcag   1020

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caagcccggt cgcccgtgtc catgaactcg atgggcaggt acttctcctc ggcgtgggac   1140

acgatgccaa cacgacgctg catcttgccg agttgatggc aaaggttccc tatggggtgc   1200

cgagacactg caccattctt caggatggca agttggtacg cgtcgattat ctcgagaatg   1260

accactgctg tgagcgcttt gccttggcgg acaggtggct caaggagaag agccttcaga   1320

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cagccctggg tcaactgggc cgagatccgt tgatcttcct gcatccgcca gaggcgggat   1440

gcgaagaatg cgatgccgct cgccagtcga ttggctgagc cattcgagtg ctgggttgtt   1500

gtctctggac accgatccat gggaaactac tcagcaccat ctctagtcga cctgcaggca   1560

tgcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac   1620

aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt   1680

gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc   1740

gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg   1800

ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt   1860

atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa   1920

gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc   1980

gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag   2040

gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt   2100

gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg   2160

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tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg   2400

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taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg   2520

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tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt   2640

ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt   2700

taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag   2760

tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt   2820

cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc   2880

gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc   2940

cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg   3000

ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac   3060

aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg   3120

atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc   3180

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact   3240

gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc   3300

aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat   3360

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc   3420

ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac   3480

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aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact   3600

catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg   3660

atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gtt                     3703

 

210>  19

<211>  66

<212>  DNA

<213>  

<400>  19

gaccaggttt ttgacgaaac agatccagat gatccagctc tacactggtt catgtgcagc     60

tccatc                                                                66

 

<210>  20

<211>  3695

<212>  DNA

<213>  

<400>  20

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca     60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg    120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc    180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc    240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat    300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt    360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat    420

cctctagaga tgaccaggtt tttgacgaaa cagatccaga tgatccagct ctacactggt    480

tcatgtgcag ctccatcagc aaaaggggat gataagttta tcaccaccga ctatttgcaa    540

cagtgccgtt gatcgtgcta tgatcgactg atgtcatcag cggtggagtg caatgtcgtg    600

caatacgaat ggcgaaaagc cgagctcatc ggtcagcttc tcaaccttgg ggttaccccc    660

ggcggtgtgc tgctggtcca cagctccttc cgtagcgtcc ggcccctcga agatgggcca    720

cttggactga tcgaggccct gcgtgctgcg ctgggtccgg gagggacgct cgtcatgccc    780

tcgtggtcag gtctggacga cgagccgttc gatcctgcca cgtcgcccgt tacaccggac    840

cttggagttg tctctgacac attctggcgc ctgccaaatg taaagcgcag cgcccatcca    900

tttgcctttg cggcagcggg gccacaggca gagcagatca tctctgatcc attgcccctg    960

ccacctcact cgcctgcaag cccggtcgcc cgtgtccatg aactcgatgg gcaggtactt   1020

ctcctcggcg tgggacacga tgccaacacg acgctgcatc ttgccgagtt gatggcaaag   1080

gttccctatg gggtgccgag acactgcacc attcttcagg atggcaagtt ggtacgcgtc   1140

gattatctcg agaatgacca ctgctgtgag cgctttgcct tggcggacag gtggctcaag   1200

gagaagagcc ttcagaagga aggtccagtc ggtcatgcct ttgctcggtt gatccgctcc   1260

cgcgacattg tggcgacagc cctgggtcaa ctgggccgag atccgttgat cttcctgcat   1320

ccgccagagg cgggatgcga agaatgcgat gccgctcgcc agtcgattgg ctgagccatt   1380

cgagtgctgg gttgttgtct ctggacagcg atccatggga aactactcag caccatcgtc   1440

gacctgcagg catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg   1500

ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg   1560

tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc   1620

gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt   1680

gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct   1740

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taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc   1860

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ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg   1980

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actagtgcta gcgtggccgc gagccgctgc gg                                   32

 

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gctagcacag gcagcgcccc aaaggt                                          26

 

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ggcgtgctcc aaggcgataa                                                 20

 

 

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gggcgggctt ccgagatcct                                                 20

 

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ggtgctgagt agtttcccat ggatcgatgt ccagagacaa caacccagca ctctcaattg     60

cgctttcccg cacgcgcgag                                                 80

 

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cagagaaggg agcggacata tgacagaccg agaaggccag                           40

 

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accgagccac gagcagacca ag                                              22

 

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cacgcagcac gccttgtagc                                                 20

 

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actagtgcta gcggccaccg ccagccggtg ct                                   32

 

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gctagctcgc gcgaggcgct gcgagg                                          26

 

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agcaaggaag agcggagaaa c                                               21

 

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cggctacagg aaggtcatca a                                               21

 

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ctcaattgtc accaacgatc tgcgcgag                                        28

 

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cagagaaggg agcggacata tggcgaccac gaatgccggg a                         41

 

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cagagaaggg agcggacata tggcgaccac gaatgccggg a                         41

 

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cgagatcttg ggcgatggac                                                 20

 

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ggctgcgacc aacccgaaca                                                 20

 

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cccgagaaac gtgcctacct gg                                              22

 

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ctcaattgcg tgcctcgaac gccgggcct                                       29

 

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ggaagggcag cccaccta                                                   18

 

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ccccagagtc ccgctcag                                                   18

 

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agatctcatc agtgtggtcc gcctttc                                         27

 

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aaagttttgt cgtctttcc                                                  19

 

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catgtgcagc tccatcagca aaaggggatg ataagtttat caccaccgac tatttgcaac     60

agtgccgttg atcgtgctat gatcgactga tgtcatcagc ggtggagtgc aatgtcgtgc    120

aatacgaatg gcgaaaagcc gagctcatcg gtcagcttct caaccttggg gttacccccg    180

gcggtgtgct gctggtccac agctccttcc gtagcgtccg gcccctcgaa gatgggccac    240

ttggactgat cgaggccctg cgtgctgcgc tgggtccggg agggacgctc gtcatgccct    300

cgtggtcagg tctggacgac gagccgttcg atcctgccac gtcgcccgtt acaccggacc    360

ttggagttgt ctctgacaca ttctggcgcc tgccaaatgt aaagcgcagc gcccatccat    420

ttgcctttgc ggcagcgggg ccacaggcag agcagatcat ctctgatcca ttgcccctgc    480

cacctcactc gcctgcaagc ccggtcgccc gtgtccatga actcgatggg caggtacttc    540

tcctcggcgt gggacacgat gccaacacga cgctgcatct tgccgagttg atggcaaagg    600

ttccctatgg ggtgccgaga cactgcacca ttcttcagga tggcaagttg gtacgcgtcg    660

attatctcga gaatgaccac tgctgtgagc gctttgcctt ggcggacagg tggctcaagg    720

agaagagcct tcagaaggaa ggtccagtcg gtcatgcctt tgctcggttg atccgctccc    780

gcgacattgt ggcgacagcc ctgggtcaac tgggccgaga tccgttgatc ttcctgcatc    840

cgccagaggc gggatgcgaa gaatgcgatg ccgctcgcca gtcgattggc taggtctagc    900

ggagtgtata ctggcttact atgttggcac tgatgagggt gtcagtgaag tgcttcatgt    960

ggcaggagaa aaaaggctgc accggtgcgt cagcagaata tgtgatacag gatatattcc   1020

gcttcctcgc tcactgactc gctacgctcg gtcgttcgac tgcggcgagc ggaaatggct   1080

tacgaacggg gcggagattt cctggaagat gccaggaaga tacttaacag ggaagtgaga   1140

gggccgcggc aaagccgttt ttccataggc tccgcccccc tgacaagcat cacgaaatct   1200

gacgctcaaa tcagtggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc   1260

ctggcggctc cctcgtgcgc tctcctgttc ctgcctttcg gtttaccggt gtcattccgc   1320

tgttatggcc gcgtttgtct cattccacgc ctgacactca gttccgggta ggcagttcgc   1380

tccaagctgg actgtatgca cgaacccccc gttcagtccg accgctgcgc cttatccggt   1440

aactatcgtc ttgagtccaa cccggaaaga catgcaaaag caccactggc agcagccact   1500

ggtaattgat ttagaggagt tagtcttgaa gtcatgcgcc ggttaaggct aaactgaaag   1560

gacaagtttt ggtgactgcg ctcctccaag ccagttacct cggttcaaag agttggtagc   1620

tcagagaacc ttcgaaaaac cgccctgcaa ggcggttttt tcgttttcag agcaagagat   1680

tacgcgcaga ccaaaacgat ctcaagaaga tcatcttatt aatcagataa aatatttcta   1740

gagtcgacct gcagcccaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa   1800

aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt   1860

aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa   1920

tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcataaat   1980

tccccaatgt caagcacttc cggaatcggg agcgcggccg atgcaaagtg ccgatcaaca   2040

taacgatctt tgtagaaacc atcggcgcag ctatttaccc gcaggacata tccacgccct   2100

cctacatcga agctgaaagc acgagattct tcgccctgcg agagctgcat caggtcggag   2160

acgctgtcga acttttcgat cagaaacttc tcgacagacg tagatcaggc ttcccgggtg   2220

tctcgctacg ccgctacgtc ttccgtgccg tcctgggcgt cgtcttcgtc gtcgtcggtc   2280

ggcggcttcg cccacgtgat cgaagcgcgc ttctcgatgg gcgttccctg ccccctgccc   2340

gtagtcgact tcgtgacaac gatcttgtct acgaagagcc cgacgaacac gcgcttgtcg   2400

tctactgacg cgcgccccca ccacgactta gggccggtcg ggtcagcgtc ggcgtcttcg   2460

gggaaccatt ggtcaagggg aagcttcggg gcttcggcgg cttcaagttc ggcaagccgc   2520

tcttccgccc cttgctgccg gagcgtcagc gctgcctgtt gcttccggaa gtgcttcctg   2580

ccaacgggtc cgtcgtacgc gcctgccgcg cggtcttcgt acagctcttc aagggcgttc   2640

agggcgtcgg cgcgctccgc aacaaggttc gcccgttcgc cgctcttctc aggcgcctca   2700

gtgagcttgc cgaagcgtcg ggcggcttcc cacagaagcg ccaacgtctc ttcgtcgcct   2760

tcggcgtgcc tgatcttgtt gaagatgcgt tccgcaacga acttgtcgag tgccgccatg   2820

ctgacgttgc acgtgccttc gtgctgccca ggtgcggacg ggtcgaccac cttccggcga   2880

cggcagcggt aagagtcctt gatcgattct tccccgcgct tcgaagtcat gacggcgcca   2940

cactcgcagt acagcttgtc catggcggac agaatggctt gcccccggga aagccccttg   3000

ccgcgccccc tgccgtccaa ccacgcctga agctcatacc actcagcggg ctcgatgatc   3060

ggtccgcaat caagctcgac cggccggagc gtgatcgggt cgcgctgaat gcggtaaccc   3120

tcaatcttcg tggtcggcgt gccgtccggc ttcttcttgt agatcacctc agcggcgaag   3180

cccgcaatac gcgggtcccg aaggattcgc ataacggttg ccgggtccca ggcgcttgaa   3240

gcggtcttct tcccaatcgt ctcgccccgg gtcggcacgg cgtcagcgtc catgcgctta   3300

caaagccccg tgatgctgcc cgggtgaatg gcggcttgac tgcccggctt gaagggaagg   3360

tgtttgtgcg tcttgatctc acgccaccac caccggatta cgtcgggctc gaactcgaag   3420

ggtccggtaa ggggagtggt cgagtgcgca agcttgttga tgacgacatt gaccattcgg   3480

ccgttgcgcg tgatctcctt cgtctccgaa acaagctcga agccgtaagg cgccttcccg   3540

ccgacgtacc cgcccaattc gcgctgaagg ttcttcgtgt cgagaatctt cgccgacttc   3600

agcgaagatt ctttgtgcga cgcgtcgagc cgcataatca ggtgaatcag gtccatgacg   3660

tttccctgcc ggaagacgcc ttcctgagtg gaaacaatcg tcacgcccag ggcgagcaat   3720

tccgagacaa tcggaatcgc gtccatgacc ttcaggcgcg agaagcgcga cacgtcatag   3780

acaatgatca tgttgagccg cccggcgcgg cattcgttca ggatgcgttc gaactccggg   3840

cgctccgccg tcccgaacgc cgacgtgccc ggcgcttcgc tgaaatgccc gacgaacctg   3900

aaccggcccc cgtcgcgctc gacttcgcgc tgaaggtcgg ccgccttgtc ttcgttggcg   3960

ctacgctgtg tcgctgggct tgctgcgctc gaattttcgc gctcgcgcga ctgacggtcg   4020

taagcacccg cgtacgtgtc caccccggtc acaacccctt gtgtcatgtc ggcgacccta   4080

cgcccccaac tgagagaact caaaggttac cccagttggg gcactactcc cgaaaaccgc   4140

ttctgacctg ggaaaacgtg aagccccggg gcatccgctg agggttgccg ccggggcttc   4200

ggtgtgtccg tcagtacggg ccatagaggg gcgtcgtgta acccacccag ggcgattgct   4260

ccggcacggg gaagccgcgc cacgccttcg ggacgtctgg aatcgctaga gcttgcatgc   4320

ctgcaggtcg acggatcttt tccgctgcat aaccctgctt cggggtcatt atagcgattt   4380

tttcggtata tccatccttt ttcgcacgat atacaggatt ttgccaaagg gttcgtgtag   4440

actttccttg gtgtatccaa cggcgtcagc cgggcaggat aggtgaagta ggcccacccg   4500

cgagcgggtg ttccttcttc actgtccctt attcgcacct ggcggtgctc aacgggaatc   4560

ctgctctgcg aggctggccg gctaccgccg gcgtaacaga tgagggcaag cggatggctg   4620

atgaaaccaa gccaaccagg aagggcagcc cacctatcaa ggtgtactgc cttccagacg   4680

aacgaagagc gattgaggaa aaggcggcgg cggccggcat gagcctgtcg gcctacctgc   4740

tggccgtcgg ccagggctac aaaatcacgg gcgtcgtgga ctatgagcac gtccgcgagc   4800

tggcccgcat caatggcgac ctgggccgcc tgggcggcct gctgaaactc tggctcaccg   4860

acgacccgcg cacggcgcgg ttcggtgatg ccacgatcct cgccctgctg gcgaagatcg   4920

aagagaagca ggacgagctt ggcaaggtca tgatgggcgt ggtccgcccg agggcagagc   4980

catgactttt ttagccgcta aaacggccgg ggggtgcgcg tgattgccaa gcacgtcccc   5040

atgcgctcca tcaagaagag cgacttcgcg gagctggtga agtacatcac cgacgagcaa   5100

ggcaagaccg atccccgggg acctgcaggt cgactctagc tagagattag atctcatcag   5160

tgtggtccgc ctttcctggg tggatcgttc gcccaacgcc gccccggccc gagggtgtcg   5220

gtgtcggtca gggacgcggc ggcgttgcga cgctccggca agtctggggc gctgcgctga   5280

cggcccgctg acggttggct gacccccggg gcgggacgcc cgccgggcgg ggccgcggtc   5340

agtgagccgt cagcgcccgg tcaggggccc cggccagact cggtgcggcc ggggggcccg   5400

gattcactcc ccacacctgc cggccggcaa accgtccatc acgcgaggag cacacacgtg   5460

gtttcccgtc tccgccgccg caccaggccc accgcacacc gcggccgctc cgcgggcgga   5520

tcccggtgct gggttgttgt ctctggacag tgatccatgg gaaactactc agcacctacg   5580

ccccgccctg ccactcatcg cagtactgtt gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga   5640

agccatcaca gacggcatga tgaacctgaa tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt   5700

gcgtataata tttgcccatg gtgaaaacgg gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt   5760

ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg gattggctga gacgaaaaac atattctcaa   5820

taaacccttt agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata   5880

tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag   5940

tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt   6000

ctttcattgc catacggaat tccggatgag cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa   6060

aggccggata aaacttgtgc ttatttttct ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca   6120

gctgaacggt ctggttatag gtacattgag caactgactg aaatgcctca aaatgttctt   6180

tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg tatatccagt gatttttttc tccattttag   6240

cttccttagc tcctgaaaat ctcgataact caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt   6300

cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt   6360

tggcccaggg cttcccggta tcaacaggga caccaggatt tatttattct gcgaagtgat   6420

cttccgtcac aggtatttat tcggcgcaaa gtgcgtcggg tgatgctgcc aacttactga   6480

tttagtgtat gatggtgttt ttgaggtgct ccagtggctt ctgtttctat cagctgtccc   6540

tcctgttcag ctactgacgg ggtggtgcgt aacggcaaaa gcaccgccgg acatcagcgc   6600

tagaccaggt ttttgacgaa accgatccag atgatccagc tcggcgccgc agccgtcgtc   6660

gccgccggtg tcccgctggt cgcccttccc gccgcccgcg cggacgatcg ggggcaccac   6720

acccccgagg tccccgggaa cccggccgcg tccggcgccc ccgccgcctt cgacgagatc   6780

ccgcaaaagc ggcctttgac tccctgcaag cctcagcgac cgaatatatc ggttatgcgt   6840

gggcgatggt tgttgtcatt gtcggcgcaa ctatcggtat caagctgttt aagaaattca   6900

cctcgaaagc aagctgataa accgatacaa ttaaaggctc cttttggagc cttttttttt   6960

ggagattttc aacgtgaaaa aattattatt cgcaattcct ttagttgttc ctttctattc   7020

tcactccgct gaaactgttg aaagttgttt agcaaaacct catacagaaa attcatttac   7080

taacgtctgg aaagacgaca aaactttatc tctag                              7115

 

<210>  60

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<212>  DNA

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atggtagcca tcgcagcgtc                                                 20

 

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<212>  DNA

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catgtgcagc tccatcagca aaaggggatg ataagtttat caccaccgac tatttgcaac     60

agtgccgttg atcgtgctat gatcgactga tgtcatcagc ggtggagtgc aatgtcgtgc    120

aatacgaatg gcgaaaagcc gagctcatcg gtcagcttct caaccttggg gttacccccg    180

gcggtgtgct gctggtccac agctccttcc gtagcgtccg gcccctcgaa gatgggccac    240

ttggactgat cgaggccctg cgtgctgcgc tgggtccggg agggacgctc gtcatgccct    300

cgtggtcagg tctggacgac gagccgttcg atcctgccac gtcgcccgtt acaccggacc    360

ttggagttgt ctctgacaca ttctggcgcc tgccaaatgt aaagcgcagc gcccatccat    420

ttgcctttgc ggcagcgggg ccacaggcag agcagatcat ctctgatcca ttgcccctgc    480

cacctcactc gcctgcaagc ccggtcgccc gtgtccatga actcgatggg caggtacttc    540

tcctcggcgt gggacacgat gccaacacga cgctgcatct tgccgagttg atggcaaagg    600

ttccctatgg ggtgccgaga cactgcacca ttcttcagga tggcaagttg gtacgcgtcg    660

attatctcga gaatgaccac tgctgtgagc gctttgcctt ggcggacagg tggctcaagg    720

agaagagcct tcagaaggaa ggtccagtcg gtcatgcctt tgctcggttg atccgctccc    780

gcgacattgt ggcgacagcc ctgggtcaac tgggccgaga tccgttgatc ttcctgcatc    840

cgccagaggc gggatgcgaa gaatgcgatg ccgctcgcca gtcgattggc taggtctagc    900

ggagtgtata ctggcttact atgttggcac tgatgagggt gtcagtgaag tgcttcatgt    960

ggcaggagaa aaaaggctgc accggtgcgt cagcagaata tgtgatacag gatatattcc   1020

gcttcctcgc tcactgactc gctacgctcg gtcgttcgac tgcggcgagc ggaaatggct   1080

tacgaacggg gcggagattt cctggaagat gccaggaaga tacttaacag ggaagtgaga   1140

gggccgcggc aaagccgttt ttccataggc tccgcccccc tgacaagcat cacgaaatct   1200

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ctggcggctc cctcgtgcgc tctcctgttc ctgcctttcg gtttaccggt gtcattccgc   1320

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tccaagctgg actgtatgca cgaacccccc gttcagtccg accgctgcgc cttatccggt   1440

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ggtaattgat ttagaggagt tagtcttgaa gtcatgcgcc ggttaaggct aaactgaaag   1560

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aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa   1920

tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcataaat   1980

tccccaatgt caagcacttc cggaatcggg agcgcggccg atgcaaagtg ccgatcaaca   2040

taacgatctt tgtagaaacc atcggcgcag ctatttaccc gcaggacata tccacgccct   2100

cctacatcga agctgaaagc acgagattct tcgccctgcg agagctgcat caggtcggag   2160

acgctgtcga acttttcgat cagaaacttc tcgacagacg tagatcaggc ttcccgggtg   2220

tctcgctacg ccgctacgtc ttccgtgccg tcctgggcgt cgtcttcgtc gtcgtcggtc   2280

ggcggcttcg cccacgtgat cgaagcgcgc ttctcgatgg gcgttccctg ccccctgccc   2340

gtagtcgact tcgtgacaac gatcttgtct acgaagagcc cgacgaacac gcgcttgtcg   2400

tctactgacg cgcgccccca ccacgactta gggccggtcg ggtcagcgtc ggcgtcttcg   2460

gggaaccatt ggtcaagggg aagcttcggg gcttcggcgg cttcaagttc ggcaagccgc   2520

tcttccgccc cttgctgccg gagcgtcagc gctgcctgtt gcttccggaa gtgcttcctg   2580

ccaacgggtc cgtcgtacgc gcctgccgcg cggtcttcgt acagctcttc aagggcgttc   2640

agggcgtcgg cgcgctccgc aacaaggttc gcccgttcgc cgctcttctc aggcgcctca   2700

gtgagcttgc cgaagcgtcg ggcggcttcc cacagaagcg ccaacgtctc ttcgtcgcct   2760

tcggcgtgcc tgatcttgtt gaagatgcgt tccgcaacga acttgtcgag tgccgccatg   2820

ctgacgttgc acgtgccttc gtgctgccca ggtgcggacg ggtcgaccac cttccggcga   2880

cggcagcggt aagagtcctt gatcgattct tccccgcgct tcgaagtcat gacggcgcca   2940

cactcgcagt acagcttgtc catggcggac agaatggctt gcccccggga aagccccttg   3000

ccgcgccccc tgccgtccaa ccacgcctga agctcatacc actcagcggg ctcgatgatc   3060

ggtccgcaat caagctcgac cggccggagc gtgatcgggt cgcgctgaat gcggtaaccc   3120

tcaatcttcg tggtcggcgt gccgtccggc ttcttcttgt agatcacctc agcggcgaag   3180

cccgcaatac gcgggtcccg aaggattcgc ataacggttg ccgggtccca ggcgcttgaa   3240

gcggtcttct tcccaatcgt ctcgccccgg gtcggcacgg cgtcagcgtc catgcgctta   3300

caaagccccg tgatgctgcc cgggtgaatg gcggcttgac tgcccggctt gaagggaagg   3360

tgtttgtgcg tcttgatctc acgccaccac caccggatta cgtcgggctc gaactcgaag   3420

ggtccggtaa ggggagtggt cgagtgcgca agcttgttga tgacgacatt gaccattcgg   3480

ccgttgcgcg tgatctcctt cgtctccgaa acaagctcga agccgtaagg cgccttcccg   3540

ccgacgtacc cgcccaattc gcgctgaagg ttcttcgtgt cgagaatctt cgccgacttc   3600

agcgaagatt ctttgtgcga cgcgtcgagc cgcataatca ggtgaatcag gtccatgacg   3660

tttccctgcc ggaagacgcc ttcctgagtg gaaacaatcg tcacgcccag ggcgagcaat   3720

tccgagacaa tcggaatcgc gtccatgacc ttcaggcgcg agaagcgcga cacgtcatag   3780

acaatgatca tgttgagccg cccggcgcgg cattcgttca ggatgcgttc gaactccggg   3840

cgctccgccg tcccgaacgc cgacgtgccc ggcgcttcgc tgaaatgccc gacgaacctg   3900

aaccggcccc cgtcgcgctc gacttcgcgc tgaaggtcgg ccgccttgtc ttcgttggcg   3960

ctacgctgtg tcgctgggct tgctgcgctc gaattttcgc gctcgcgcga ctgacggtcg   4020

taagcacccg cgtacgtgtc caccccggtc acaacccctt gtgtcatgtc ggcgacccta   4080

cgcccccaac tgagagaact caaaggttac cccagttggg gcactactcc cgaaaaccgc   4140

ttctgacctg ggaaaacgtg aagccccggg gcatccgctg agggttgccg ccggggcttc   4200

ggtgtgtccg tcagtacggg ccatagaggg gcgtcgtgta acccacccag ggcgattgct   4260

ccggcacggg gaagccgcgc cacgccttcg ggacgtctgg aatcgctaga gcttgcatgc   4320

ctgcaggtcg acggatcttt tccgctgcat aaccctgctt cggggtcatt atagcgattt   4380

tttcggtata tccatccttt ttcgcacgat atacaggatt ttgccaaagg gttcgtgtag   4440

actttccttg gtgtatccaa cggcgtcagc cgggcaggat aggtgaagta ggcccacccg   4500

cgagcgggtg ttccttcttc actgtccctt attcgcacct ggcggtgctc aacgggaatc   4560

ctgctctgcg aggctggccg gctaccgccg gcgtaacaga tgagggcaag cggatggctg   4620

atgaaaccaa gccaaccagg aagggcagcc cacctatcaa ggtgtactgc cttccagacg   4680

aacgaagagc gattgaggaa aaggcggcgg cggccggcat gagcctgtcg gcctacctgc   4740

tggccgtcgg ccagggctac aaaatcacgg gcgtcgtgga ctatgagcac gtccgcgagc   4800

tggcccgcat caatggcgac ctgggccgcc tgggcggcct gctgaaactc tggctcaccg   4860

acgacccgcg cacggcgcgg ttcggtgatg ccacgatcct cgccctgctg gcgaagatcg   4920

aagagaagca ggacgagctt ggcaaggtca tgatgggcgt ggtccgcccg agggcagagc   4980

catgactttt ttagccgcta aaacggccgg ggggtgcgcg tgattgccaa gcacgtcccc   5040

atgcgctcca tcaagaagag cgacttcgcg gagctggtga agtacatcac cgacgagcaa   5100

ggcaagaccg atccccgggg acctgcaggt cgactctagc tagagattag atctcatcag   5160

tgtggtccgc ctttcctggg tggatcgttc gcccaacgcc gccccggccc gagggtgtcg   5220

gtgtcggtca gggacgcggc ggcgttgcga cgctccggca agtctggggc gctgcgctga   5280

cggcccgctg acggttggct gacccccggg gcgggacgcc cgccgggcgg ggccgcggtc   5340

agtgagccgt cagcgcccgg tcaggggccc cggccagact cggtgcggcc ggggggcccg   5400

gattcactcc ccacacctgc cggccggcaa accgtccatc acgcgaggag cacacacgtg   5460

gtttcccgtc tccgccgccg caccaggccc accgcacacc gcggccgctc cgcgggcgga   5520

tcccggtgct gggttgttgt ctctggacag tgatccagat gatccagctc tcagagaagg   5580

gagcggacat atggcggatc gtcccatcga gcgcgcagcc gaagatccga ttgcgatcgt   5640

cggagcgggt tgccgtctgc ccggcggcgt gatcgatctg agcgggttct ggacgctcct   5700

cgagggctcg cgcgacaccg tcgggcaagt ccccgcagaa cgctgggatg cagcagcgtg   5760

gtttgatccc gacctcgatg ccccggggaa gacgcccgtt acgcgcgcat ctttcctgag   5820

cgacgtagcc tgcttcgacg cccccttctt cggcatctcg cctcgcgaag cgctgcggat   5880

ggaccctgca catcgactct tgctggaggt gtgctgggag gcgctggaga acgccgcgat   5940

cgctccatcg gcgctcgtcg gtacggaaac gggagtgttc atcgggatcg gcccgtccga   6000

gtatgaggcc gcgctgccgc gagcgacggc gtccgcagag atcgacgctc atggcgggct   6060

ggggacgatg cccagcgtcg gagcgggccg aatctcgtat gtcctcgggc tgcgagggcc   6120

gtgtgtcgcg gtggatacgg cctattcgtc ctcgctcgtg gccgttcatc tggcctgtca   6180

gagcttgcgc tccggggaat gctccacggc cctggctggt ggggtatcgc tgatgttgtc   6240

gccgagcacc ctcgtgtggc tctcgaagac ccgcgcgctg gccacggacg gtcgctgcaa   6300

ggcgttttcg gcggaggccg atgggttcgg acgaggcgaa gggtgcgccg tcgtggtcct   6360

caagcggctc agtggagccc gcgcggacgg cgatcggata ttggcggtga ttcgaggatc   6420

cgcgatcaat cacgacggag cgagcagcgg tctgaccgtg ccgaacggga gctcccaaga   6480

aatcgtgctg aaacgggccc tggcggacgc aggctgcgcc gcgtcttcgg tgggttatgt   6540

cgaggcacac ggcacgggca cgacgcttgg tgaccccatc gaaatccaag cgctgaatgc   6600

ggtatacggc ctcgggcgag acgtcgccac gccgctgctg atcgggtcgg tgaagaccaa   6660

ccttggccat cctgagtatg cgtcggggat cactgggctg ctgaaggtcg tcttggccct   6720

tcagcacggg cagattcctg cgcacctcca cgcgcaggcg ctgaaccccc ggatctcatg   6780

gggtgatctt cggctgaccg tcacgcgcgc ccggacaccg tggccggact ggaatacgcc   6840

gcgacgggcg ggggtgagct cgttcggcat gagcgggacc aacgcgcatg tggtgctgga   6900

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gctgtcggca aggaccgcgg cagccctgga tgcacacgcg gcgcggctgc gcgaccatct   7020

ggagacctac ccttcgcagt gtctgggcga tgtggcgttc agtctggcga cgacgcgcag   7080

cgcgatggag caccggctcg cggtggcggc gacgtcgagc gaggggctgc gggcagccct   7140

ggacgctgcg gcgcagggac agacgccgcc cggtgtggtg cgcggtatcg ccgattcctc   7200

acgcggcaag ctcgcctttc tcttcaccgg acagggggcg cagacgctgg gcatgggccg   7260

tgggctgtac gatgtatggc ccgcgttccg cgaggcgttc gacctgtgcg tgaggctgtt   7320

caaccaggag ctcgatcggc cgctccgcga ggtgatgtgg gccgaaccgg ccagcgtcga   7380

cgccgcgctg ctcgaccaga cagccttcac ccagccggcg ctgttcacct tcgagtatgc   7440

gctcgccgcg ctgtggcggt cgtggggcat agagccggag ttggtcgctg gccatagcat   7500

cggtgagctg gtggctgcct gcgtggcggg cgtgttctcg cttgaggacg cggtgttcct   7560

ggtggctgcg cgcgggcgcc tgatgcaggc gctgccggcc ggcggggcga tggtgtcgat   7620

cgcggcgccg gaggccgatg tggctgctgc ggtggcgccg cacgcagcgt cggtgtcgat   7680

cgccgcggtc aacggtccgg accaggtggt catcgcgggc gccgggcaac ccgtgcatgc   7740

gatcgcggcg gcgatggccg cgcgcggggc gcgaaccaag gcgctccacg tctcgcatgc   7800

gttccactca ccgctcatgg ccccgatgct ggaggcgttc gggcgtgtgg ccgagtcggt   7860

gagctaccgg cggccgtcga tcgtcctggt cagcaatctg agcgggaagg ctggcacaga   7920

cgaggtgagc tcgccgggct attgggtgcg ccacgcgcga gaggtggtgc gcttcgcgga   7980

tggagtgaag gcgctgcacg cggccggtgc gggcaccttc gtcgaggtcg gtccgaaatc   8040

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gcccacgtac ccttggcagc gcgagcgcta ctggatcgac acgaaagccg acgacgcggc   8280

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ggagaaggtc gaggccgccg gcgaccgtcc gttccggctc gagatcgatg agccaggcgt   8460

gcttgatcac ctggtgcttc gggtcacgga gcggcgcgcc cctggtctgg gcgaggtcga   8520

gatcgccgtc gacgcggcgg ggctcagctt caatgatgtc cagctcgcgc tgggcatggt   8580

gcccgacgac ctgccgggaa agcccaaccc tccgctgctg ctcggaggcg agtgcgccgg   8640

gcgcatcgtc gccgtgggcg agggcgtgaa cggccttgtg gtgggccaac cggtcatcgc   8700

cctttcggcg ggagcgtttg ctacccacgt caccacgtcg gctgcgctgg tgctgcctcg   8760

gcctcaggcg ctctcggcga ccgaggcggc cgccatgccc gtcgcgtacc tgacggcatg   8820

gtacgcgctc gacagaatag cccgccttca gccgggggag cgggtgctga tccacgcggc   8880

gaccggcggg gtcggtctcg ccgcggtgca gtgggcgcag cacgtcggag ccgaggtcca   8940

tgcgacggcc ggcacgcccg agaagcgcgc ccacctggag tcgctgggcg tgcggtatgt   9000

gagcgattcc cgctcggacc ggttcgtcgc cgacgtgcgc gcgtggacgg gcggcgaggg   9060

agtagacgtc gtgctcaact cgctttcggg cgagctggtc gacaagagtt tgaatctcct   9120

gcgatcgcac ggccggtttg tggagctcgg caagcgcgac tgttacgcgg ataaccagct   9180

cgggctgcgg ccgttcctgc gcaatctctc cttctcgctg gtggatctcc gggggatgat   9240

gctcgagcgg ccggcgcggg tccgtgcgct cttcgaggag ctcctcggcc tgatcgcggc   9300

aggcgtgttc acccctcccc ccatcgcgac gctcccgatc gctcgtgtcg ccgatgcgtt   9360

ccggagcatg gcgcaggcgc agcatcttgg gaagctcgta ctcacgctgg gtgacccgga   9420

cgtccagatc cgtattccga cccacgcagg cgccggcccg tccaccgggg atcgggacct   9480

gctcgacagg ctcgcgtcag ctgcgccggc cgcgcgcgcg gcggcgctgg aggcgttcct   9540

ccgtacgcag gtctcgcagg tgctgcgcac gcccgaaatc aaggtcggcg cggaggcgct   9600

gttcacccgc ctcggcatgg actcgctcat ggccgtggag ctgcgcaatc gtatcgaggc   9660

gagcctcaag ctgaagctgt cgacgacgtt cctgtccacg tcccccaata tcgccttgtt   9720

gacccaaaac ctgctggatg ctctcgccac agctctctcc ttggagcggg tggcggcgga   9780

gaacctacgg gcaggcgtgc aaagcgactt cgtctcatcg ggcgcagatc aagactggga   9840

aatcattgcc ctcaattgag agtgctgggt tgttgtctct ggacactgat ccagatgatc   9900

cagctctcag agaagggagc ggacatatga cgatcaatca gcttctgaac gagctcgagc   9960

accagggtat caagctggcg gccgatgggg agcgcctcca gatacaggcc cccaagaacg  10020

ccctgaaccc gagcctgctc gctcgaatct ccgagcacaa aagcacgatc ctgacgatgc  10080

tccgtcagag actccccgca gagtccatcg tgcccgcccc agccgagcgg cacgttccgt  10140

ttcctctcac agacatccaa ggatcctact ggctgggtcg gacaggagcg tttacggtcc  10200

ccagcgggat ccacgcctat cgcgaatacg actgtgcgga tctcgacgtg gcgaggctga  10260

gccgcgcctt tcggaaagtc gtcgcgcggc acgacatgct tcgggcccac acgctgcccg  10320

acatgatgca ggtgatcgag cctaaagtcg acgccgacat cgagatcatc gatctgcgcg  10380

ggctcgaccg gagcacgcgg gaagcgaggc tcgtatcgtt gcgagatgcg atgtcgcacc  10440

gcatctatga caccgagcgc cctccgctct atcacgtcgt cgccgttcgg ctggacgagc  10500

ggcaaacccg tctcgtgctc agcatcgatc tcattaacgt tgacctaggc agcctgtcca  10560

tcatcttcaa ggactggctc agcttctacg aagatcccga gacctctctc cctgtcctgg  10620

agctctcgta ccgcgactat gtactcgcgc tggagtctcg caagaagtct gaggcgcatc  10680

aacgatcgat ggattactgg aagcggcgca tcgccgagct cccacctccg ccgatgctcc  10740

cgatgaaggc cgatccatct accctgaagg agatccgctt ccggcacacg gagcaatggc  10800

tgccgtcgga ctcctggagt cgattgaagc ggcgtgtcgg ggagcgcggg ctgaccccga  10860

cgggcgtcat cctggctgca ttttccgagg tgatcgggcg ctggagcgcg agcccccggt  10920

ttacgctcaa cataacgctc ttcaaccggc tacccgtcca tccgtgcgtg aacgatatca  10980

ccggggactt cacgtcgatg gttctcctgg acatcgacac cactcgcgac aagagcttcg  11040

aacaacgcgc taagtgtatt caaaagcagc tatgggaggc gatggatcac tgcgacgtga  11100

gcggtatcga ggtccagcga gaggccgccc gggtcctggg gatccaacga ggcgcattgt  11160

tccccgtagt gctcacgagc gcgctcaacc agcaagtcgt cggtgtcacc tcgctgcaga  11220

ggctcggcac tccggtgtac accagcacgc agactcctca gctgctgctg gatcatcagc  11280

tctacgagca cgatggggac ctcgtcctcg cgtgggacat cgtcgacgga gtgttcccgc  11340

ccgaccttct ggacgacatg ctcgaagcgt acgtcgctct tctccggcgg ctcactgagg  11400

aaccatgggg tgaacagatg cgctgttcgc ttccgcctgc ccagctagaa gcgcgggcga  11460

gcgcaaacga gaccaacgcg ctgctgagcg agcatacgct gcacggcctg ttcgcggcgc  11520

gggtcgagca gctgcctatg cagctcgccg tggtgtcggc gcgcaagacg ctcacgtacg  11580

aagagctttc gcgccgttcg cggcgatttg gcgcgcggct gcgcgagcag ggggcacgcc  11640

cgaacacatt ggtcgcggtg gtgatggaga aaggctggga gcaggttgtc gcggttctcg  11700

cggtgctcga gtcaggcgcg gcctacgtgc cgatcgatgc cgacctaccg gcggagcgta  11760

tccactacct cctcgatcat ggtgaggtaa agctcgtgct gacgcagcca tggctggatg  11820

gtaaactgtc atggccgccg gggatccagc ggctgctcgt gagcgaggcc ggcgtcgaag  11880

gcgacggcga ccagcttccg atgatgccca ttcagacacc ttcggatctc gcgtatgtca  11940

tctacacctc gggatccaca gggttgccca agggggtgat gatcgatcat cggggtgccg  12000

tcaacaccat cctggacatc aacgagcgct tcgaaatagg gcccggagac agagtgctgg  12060

cgctctcctc gctgagcttc gatctctcgg tctatgatgt gttcgggatc ctggcggcgg  12120

gcggtacgat cgtggtgccg gacgcgtcca agctgcgcga tccggcgcat tgggcagagt  12180

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tcgagcattc cgagggtcgc cccgattcgc tcgctaggtc tctgcggctt tcgctgctga  12300

gcggcgactg gatcccggtg ggcctgcctg gcgagctcca gaccatcagg cccggcgtgt  12360

cggtgatcag cctgggcggg gccaccgaag cgtcgatctg gtccatcggg tacccagtga  12420

tgaacgtcga tccatcgtgg gcgagcatcc cctacggccg tccgctgcgc aaccagacgt  12480

tccacgtgct cgatgaggcg ctcgaaccgc gcccggtctg ggttccgggg caactctaca  12540

ttggcggggt cggactggca ctgggctact ggcgcgatga agagaagacg cgcaagagct  12600

tcctcgtaca ccccgagacc ggggagcgcc tttacaagac cggcgatctg ggccgctacc  12660

tgcccgatgg aaacatcgag ttcatggggc gggaggacaa ccaaatcaag cttcgcggat  12720

accgcgttga gctcggggaa atcgaggaaa cgctcaagtc gcatccgaac gtacgcgacg  12780

cggtgattgt gcccgtcggg aacgacgcgg cgaacaagct ccttctagcc tatgtggtcc  12840

cggaaggcac acggagacgc gctgccgagc aggacgcgag cctcaagacc gagcggatcg  12900

acgcgagagc acacgccgcc gaagcggacg gcttgagcga cggcgagagg gtgcagttca  12960

agctcgctcg acacggactc cggagggatc tggacggaaa gcccgtcgtc gatctgaccg  13020

ggctggttcc gcgggaggcg gggctggacg tctacgcgcg tcgccgtagc gtccgaacgt  13080

tcctcgaggc cccgattcca tttgttgaat tcggccgatt cctgagctgc ctgagcagcg  13140

tggagcccga cggcgcggcc cttcccaaat tccgttatcc atcggctggc agcacgtacc  13200

cggtgcagac ctacgcgtac gccaaatccg gccgcatcga gggcgtggac gagggcttct  13260

attattacca cccgttcgag caccgtttgc tgaaggtctc cgaacacggg atcgagcgcg  13320

gagcgcacgt tccgcaaaac ttcgacgtgt tcgatgaagc ggcgttcggt ctcctgttcg  13380

tgggcaggat cgatgccatc gagtcgctgt atggatcgtt gtcacgagaa ttctgcctgc  13440

tggaggccgg atatatggcg cagctcctga tggagcaggc gccttcctgc aatatcggcg  13500

tctgcccggt gggtcaattc aattttgaac aggttcggcc ggttctcgac ctgcggcgtt  13560

cggacgttta cgtgcacggc atgctgggtg ggcgggtaga cccgcggcag ttccaggtct  13620

gtacgctcgg tcaggattcc tcaccgaggc gcgtcacgac gcgcggcgcc cctcctggcc  13680

gcgatcagca cttcgccgat atccttcgcg acttcttgag gaccaaacta cccgagtata  13740

tggtgcctac agtcttcgtg gagctcgatg cgttgccgct gacgtccaac ggcaaggtcg  13800

atcgtaaggc cctgcgcgag cggaaggata cctcatcgcc gcggcattcg gagcacacgg  13860

cgccacggga cgccttggag gagatcctcg tcgcggtcgt acgggaggtg ctcgggctgg  13920

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agcggacgaa catgcaggac cgagtggagg cccggcgcaa gggcaggaga cgtagcaatt  14160

gagagtgctg ggttgttgtc tctggacaca gatccagatg atccagctcc agagaaggga  14220

gcggacatat ggaagaacaa gattcctccg caatcgcagt catcggcatg tcgggccgat  14280

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tgcagcgctt ctccgagcag gagctcgcgg cgtccggagt cgaccccgcg ctggtgctgg  14400

acccgagcta cgtccgggcg ggcagcgtgc tggaagatgt cgaccggttc gacgctgctt  14460

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ccgagatggg gctgcagtac ggccctgcct tccaggggat tgctgagcta tggcggggtg  17460

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ctgtggagtc accgcacacc accgccgatt ctgctgtcga gatcgaggag atgtcgcagg  19680

acgatctgac gcagttgatc gcagctaaat tcaaggcgct taccaattga ggtgctgggt  19740

tgttgtctct ggacaaagat ccagatgatc cagctctcag agaagggagc ggacatatga  19800

ctactcgcgg tcctacggca cagcagaatc cgctgaaaca agcggccatc atcattcagc  19860

ggctggagga gcggctcgct gggctcgcac aggcggagct ggaacggacc gagccgatcg  19920

ccatcgtcgg tatcggctgc cgcttccctg gcggcgcgga cgctccggaa gcgttttggg  19980

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tggttccggc cgacgtcgat ttcgtggaat gccacgggac cgggacggcg ctgggcgacc  25320

cgatcgaggt gcgggcgctg agcgacgtgt acgggcaagc ccgccctgcg gaccgaccgc  25380

tgatcctggg agccgccaag gccaaccttg ggcacatgga gcccgcggcg ggcctggccg  25440

gcttgctcaa ggcggtgctc gcgctggggc aagagcaaat accagcccag ccggagctgg  25500

gcgagctcaa cccgctcttg ccgtgggagg cgctgccggt ggcggtggcc cgcgcagcgg  25560

tgccgtggcc gcgcacggac cggccgcgct tcgcgggggt gagctcgttc gggatgagcg  25620

gaacgaacgc gcacgtggtg ctggaagagg cgccggcggt ggagctgggg cctgccgcgc  25680

cggagcgctc ggcggagctt ctggtgctgt cgggcaagag cgagggggcg ctcgacgcgc  25740

aggcggcgcg gctgcgcgag cacctggaca tgcacccgga gctcgggctc ggggacgtgg  25800

cgttcagcct ggcgacgacg cgcagcgcga tgaaccaccg gctcgcggtg gcggtgacgt  25860

cgcgcgaggg gctgctggcg gcgctctcgg ccgtggcgca ggggcagacg ccgccggggg  25920

cggcgcgctg catcgcgagc tcgtcgcgcg gcaagctggc gttgctgttc accggacagg  25980

gcgcgcagac gccgggcatg ggccgggggc tttgcgcggc gtggccagcg ttccgggagg  26040

cgttcgaccg gtgcgtggcg ctgttcgacc gggagctgga ccgcccgctg cgcgaggtga  26100

tgtgggcgga gccggggagc gccgagtcgt tgctgctcga ccagacggcg ttcacccagc  26160

ccgcgctctt cacggtggag tacgcgctga cggcgctgtg gcggtcgtgg ggcgtagagc  26220

cggagctggt ggctgggcat agcgccgggg agctggtggc ggcgtgcgtg gcgggggtgt  26280

tctcgctgga agatggggtg aggctcgtgg cggcgcgcgg gcggctgatg caggggctct  26340

cggcgggcgg cgcgatggtg tcgctcggag cgccggaggc ggaggtggcc gcggcggtgg  26400

cgccgcacgc ggcgtcggtg tcgatcgcgg cggtcaatgg gccggagcag gtggtgatag  26460

cgggcgtgga gcgagcggtg caggcgatcg cggcggggtt cgcggcgcgc ggcgtgcgca  26520

ccaagcggct gcatgtctcg cacgcgtccc actcgccgct gatggaaccg atgctggagg  26580

agttcgggcg ggtggcggcg tcggtgacgt accggcggcc aagcgtttcg ctggtgagca  26640

acctgagcgg gaaggtggtc acggacgagc tgagcgcgcc gggctactgg gtgcggcacg  26700

tgcgggaggc ggtgcgcttc gcggacgggg tgaaggcgct gcacgaagcc ggcgcgggga  26760

cgttcctcga agtgggcccg aagccgacgc tgctcgggct gttgccagcc tgcctgccgg  26820

agacggagcc gacgctgctg gcgtcgttgc gcgccgggcg cgaggaggct gcgggggtgc  26880

tcgaggcgct gggcaggctg tgggccggcg gcggctcggt cagctggccg ggcgtcttcc  26940

ccacggctgg gcggcgggtg ccgctgccga cctatccgtg gcagcggcag cggtactggc  27000

ccgacatcga gcctgacagc cgtcgccacg cagccgcgga tccgacccaa ggctggttct  27060

atcgcgtgga ctggccggag atacctcgca gcctccagaa atcagaggag gcgagccgcg  27120

ggagctggct ggtattggcg gataagggtg gagtcggcga ggcggtcgct gcagcgctgt  27180

cgacacgtgg acttccatgc gtcgtgatcc atgcgccggc agagacatcc gcgaccgccg  27240

agctggtgac cgaggctgcc ggcggtcgaa gcgattggca ggtagtgctc tacctgtggg  27300

gtctggacgc cgtcgtcggt gcggaggcgt cgatcgatga gatcggcgac gcgacccgtc  27360

gtgctaccgc gccggtgctc ggcttggctc ggtttctgag caccgtgtct tgttcgcccc  27420

gactctgggt cgtgacccgg ggggcatgca tcgttggcga cgagcctgcg atcgcccctt  27480

gtcaggcggc gttatggggc atgggccggg tggcggcgct cgagcatccc ggggcctggg  27540

gcgggctcgt ggacctggat ccccgagcga gcccgcccca agccagcccg atcgacggcg  27600

agatgctcgt caccgagcta ttgtcgcagg agaccgagga tcagctcgcc ttccgccatg  27660

ggcgccggca cgcggcacgg ctggtggctg ccccgccaca ggggcaagcg gcaccggtgt  27720

cgctgtctgc ggaggcgagc tacctggtga cgggaggcct cggtgggctg ggcctgatcg  27780

tggcccagtg gctggtggag ctgggagcgc ggcacttggt gctgaccagc cggcgcgggt  27840

tgcccgaccg gcaggcgtgg cgcgagcagc agccgcctga gatccgcgcg cggatcgcag  27900

cggtcgaggc gctggaggcg cggggtgcac gggtgaccgt ggcagcggtg gacgtggccg  27960

acgtcgaacc gatgacagcg ctggtttcgt cggtcgagcc cccgctgcga ggggtggtgc  28020

acgccgctgg cgtcagcgtc atgcgtccac tggcggagac ggacgagacc ctgctcgagt  28080

cggtgctccg tcccaaggtg gccgggagct ggctgctgca ccggctgctg cacggccggc  28140

cgctcgacct gttcgtgctg ttctcgtcgg gcgcagcggt gtggggtagc catagccagg  28200

gtgcgtacgc ggcggccaac gctttcctcg acgggctcgc gcatcttcgg cgttcgcaat  28260

cgctgcctgc gttgagcgtc gcgtggggtc tgtgggccga gggaggcatg gcggacgcgg  28320

aggctcatgc acgtctgagc gacatcgggg ttctgcccat gtcgacgtcg gcagcgttgt  28380

cggcgctcca gcgcctggtg gagaccggcg cggctcagcg cacggtgacc cggatggact  28440

gggcgcgctt cgcgccggtg tacaccgctc gagggcgtcg caacctgctt tcggcgctgg  28500

tcgcagggcg cgacatcatc gcgccttccc ctccggcggc agcaacccgg aactggcgtg  28560

gcctgtccgt tgcggaagcc cgcgtggctc tgcacgagat cgtccatggg gccgtcgctc  28620

gggtgctggg cttcctcgac ccgagcgcgc tcgatcctgg gatggggttc aatgagcagg  28680

gcctcgactc gttgatggcg gtggagatcc gcaacctcct tcaggctgag ctggacgtgc  28740

ggctttcgac gacgctggcc tttgatcatc cgacggtaca gcggctggtg gagcatctgc  28800

tcgtcgatgt actgaagctg gaggatcgca gcgacaccca gcatgtttgg tcgttggcgt  28860

cagacgagcc catcgccatc gtgggagccg cctgccgctt cccgggcggg gtggaggacc  28920

tggagtccta ctggcagctg ttggccgagg gcgtggtggt cagcgccgag gtgccggccg  28980

accggtggga tgcggcggac tggtacgacc ctgatccgga gatcccaggc cggacttacg  29040

tgaccaaagg cgccttcctg cgcgatttgc agagattgga tgcgaccttc ttccgcatct  29100

cgcctcgcga ggcgatgagc ctcgacccgc agcagcggtt gctcctggag gtaagctggg  29160

aggcgctcga gagcgcgggt atcgctccgg atacgctgcg agatagcccc accggggtgt  29220

tcgtgggtgc ggggcccaat gagtactaca cgcagcggct gcgaggcttc accgacggag  29280

cggcagggct gtacggcggc accgggaaca tgctcagcgt tacggctgga cggctgtcgt  29340

ttttcctggg tctgcacggc ccgacgctgg ccatggatac ggcgtgctcg tcatccctgg  29400

tcgcgctgca cctcgcctgc cagagcctgc gactgggcga gtgcgatcaa gcgctggttg  29460

gcggggtcaa cgtgctgctc gcgccggaga ccttcgtgct gctctcacgg atgcgcgcgc  29520

tttcgcccga cgggcggtgc aagacgttct cggccgacgc ggacggctac gcgcggggcg  29580

aggggtgcgc cgtggtggtg ctcaagcggc tgcgcgatgc gcagcgcgcc ggcgactcca  29640

tcctggcgct gatccgggga agcgcggtga accacgacgg cccgagcagc gggctgaccg  29700

tgcccaacgg accggcccag caagcattgc tgcgccaggc gctttcgcaa gcaggcgtgt  29760

ctccggtcga cgttgatttt gtggagtgtc acgggacagg gacggcgctg ggcgacccga  29820

tcgaggtgca ggcgctgagc gaggtgtatg gtccagggcg ctccggggat cgaccgctgg  29880

tgctgggggc cgtcaaggcc aacgtcgcgc atctggaggc ggcatccggc ttggccagcc  29940

tgctcaaggc cgtgcttgcg ctgcggcacg agcagatccc ggcccagccg gagctgggcg  30000

agctcaaccc gcacttgccg tggaacacgc tgccggtggc ggtgccacgt aatgcggtgc  30060

cgtgggggcg cggcgcacgc ccgcgtcggg ccggcgtgag cgcgttcggg ttgagcggaa  30120

ccaacgtgca tgtcgtgctg gaggaggcac cggaggtgga gccggcgccc gcggcgccgg  30180

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cggaacggct ctcggcgcac ctgtccgcgc acccggagct gagcctcggc gacgtggcgt  30300

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tcgaccggtg cgtggcgctc ttcgatcggg agatcgacca gcctctgcgc gaggtgatgt  30600

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cgctcgaaga tgcggtgagg ttggtggccg cgcgcgggcg gctgatgcag gcgctacccg  30840

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gcgccgaggt acaggtgctc gccctcggcg cgacgttcgc ggcgcgtggg atacgcacga  31020

agaggctcgc cgtctcccat gcgttccact cgccgctcat ggatccgatg ctggaagact  31080

tccagcgggt cgctgcgacg atcgcgtacc gcgcgccgga ccgcccggtg gtgtcgaatg  31140

tcaccggcca cgtcgcaggc cccgagatcg ccacgcccga gtattgggtc cggcatgtgc  31200

gaagcgccgt gcgcttcggc gacggggcaa aggcgttgca tgccgcgggt gccgccacgt  31260

tcgtcgagat tggcccgaag ccggtcctgc tcgggctgtt gccagcgtgc ctcggggaag  31320

cggacgcggt cctcgtgccg tcgctacgcg cggaccgctc ggaatgcgag gtggtcctcg  31380

cggcgctcgg ggcttggtat gcctgggggg gtgcgctcga ctggaagggc gtgttccccg  31440

atggcgcgcg ccgcgtggct ctgcccatgt atccatggca gcgtgagcgc cattggatgg  31500

acctcacccc gcgaagcgcc gcgcctgcag ggatcgcagg tcgctggccg ctggctggtg  31560

tcgggctctg catgcccggc gctgtgttgc accacgtgct ctcgatcgga ccacgccatc  31620

agcctttcct cggtgatcac ctcgtgtttg gcaaggtggt ggtgcccggc gcctttcatg  31680

tcgcggtgat cctcagcatc gccgccgagc gctggcccga gcgggcgatc gagctgacag  31740

gcgtggagtt cctgaaggcc atcgcgatgg agcccgacca ggaggtcgag ctccacgccg  31800

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cggagaccga acgccgatgg acgacccacg cccgcggtcg ggtgcagccg acagacggcg  31920

cgcccggcgc gttgccgcgc ctcgaggtgc tggaggaccg cgcgatccag cccctcgact  31980

tcgccggatt cctcgacagg ttatcggcgg tgcggatcgg ctgggggccg ctttggcgat  32040

ggctgcagga cgggcgcgtc ggcgacgagg cctcgcttgc caccctcgtg ccgacctatc  32100

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gcctgctggc aacccggagc gagccggagg acgacgggac gcccccgctg ccgttcgccg  32220

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ggtcgcaggc attcggtgtc tcgagcttcg tgctggtcga cgaaactggc gaggtggtcg  32340

ctgaggtgga gggatttgtt tgccgccggg cgccgcgaga ggtgttcctg cggcaggagt  32400

cgggcgcgtc gactgcagcc ttgtaccgcc tcgactggcc cgaagcgccc ttgcccgatg  32460

cgcctgcgga acggatggag gagagctggg tcgtggtggc agcacctggc tcggagatgg  32520

ccgtggcgct cgcaacacgg ctcaaccgct gcgtcctcgc cgaaccccaa ggcctcgaga  32580

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cagctgacgt tctgttgcgg gagctcggtc gcgctgacga cgagacccag gtggttttcc  32940

gttccggaaa gcgccgcgta gggcggctgg tcaaagcgac aacccccgaa gggctcttgg  33000

tccctgacgc agaatcctat cgactggagg ctgggcagaa gggcacattg gaccagctcc  33060

gcctcgcgcc ggcacagcgc cgggcacctg gcccgggcga ggtcgagatc aaggtaaccg  33120

cctcggggct caacttccgg accgtcctcg ctgtgctggg aatgtatccg ggcgacgctg  33180

ggccgatggg cggagattgt gccggtatcg tcacggcggt gggccagggg gtgcaccacc  33240

tctcggtcgg cgatgctgtc atgacgctgg ggacgttgca tcgattcgtc acggtcgacg  33300

cgcggctggt ggtccggcag cctgcagggc tgactcccgc gcaggcagct acggtgccgg  33360

tcgcgttcct gacggcctgg ctcgctctgc acgacctggg gaatctgcag cgcggcgagc  33420

gggtgctgat ccatgctgcg gccggcggtg tgggcatggc cgcggtgcaa atcgcccgat  33480

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tgggcgtgcc gcgcacgcac atcgccagct cgcggacgct ggagtttgct gagacgttcc  33600

ggcaggtcac cggcggccgg ggcgtggacg tggtgctcaa cgcgctggcc ggcgagttcg  33660

tggacgcgag cctgtccctg ctgtcgacga gcgggcggtt cctcgagatg ggcaagaccg  33720

acatacggga tcgagccgcg gtcgcggcgg cgcatcccgg tgttcgctat cgggtattcg  33780

acatcctgga gctcgctccg gatcgaactc gagagatcct cgagcgcgtg gtcgagggct  33840

ttgctgcggg acatctgcgc gcattgccgg tgcatgcgtt cgcgatcacc aaggccgagg  33900

cagcgtttcg gttcatggcg caagcgcggc atcagggcaa ggtcgtgctg ctgccggcgc  33960

cctccgccgc gcccttggcg ccgacgggca ccgtactgct gaccggtggg ctgggagcgt  34020

tggggctcca cgtggcccgc tggctcgccc agcagggcgt gccgcacatg gtgctcacag  34080

gtcggcgggg cctggatacg ccgggcgctg ctaaagccgt cgcggagatc gaagcgctcg  34140

gcgctcgggt gacgatcgcg gcgtcggatg tcgccgatcg gaatgcgctg gaggctgtgc  34200

tccaggccat tccggcggag tggccgttac agggcgtgat ccatgcagcc ggagcgctcg  34260

atgatggtgt gcttgatgag cagaccaccg accgcttctc gcgggtgctg gcaccgaagg  34320

tgactggcgc ctggaatctg catgagctca cggcgggcaa cgatctcgct ttcttcgtgc  34380

tgttctcctc catgtcgggg ctcttgggct cggccgggca gtccaactat gcggcggcca  34440

acaccttcct cgacgcgctg gccgcgcatc ggcgggccga aggcctggcg gcgcagagcc  34500

tcgcgtgggg cccatggtcg gacggaggca tggcagcggg gctcagcgcg gcgctgcagg  34560

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ggcaggcgct ggctcggccg gaaacgcagc tcggggcgat gtcgctcgac gtgcgtgcgg  34680

caagccaagc ttcgggagcg gcagtgccgc ctgtgtggcg cgcgctggtg cgcgcggagg  34740

cgcgccatgc ggcggctggg gcgcaggggg cattggccgc gcgcgttggg gcgctgcccg  34800

aggcgcgtcg cgccgacgag gtgcgcaagg tcgtgcaggc cgagatcgcg cgcgtgcttt  34860

catggagcgc cgcgagcgcc gtgcccgtcg atcggccgct gtcggacttg ggcctcgact  34920

cgctcacggc ggtggagctg cgcaacgtgc tcggccagcg ggtgggtgcg acgctgccgg  34980

cgacgctggc attcgatcac ccgacggtcg acgcgctcac gcgctggctg ctcgataagg  35040

tcctggtcgt ggccgagccg agcgtatcgc ccgcaaagtc gtcgccgcag gtcgccctcg  35100

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agtcgttttg gcggctgctc gaagagggca gcgatgccgt cgtcgaggtg ccgcatgagc  35220

gatgggacat cgacgcgttc tatgatccgg atccggatgt gcgcggcaag atgacaacac  35280

gctttggcgg cttcctgtcc gatatcgacc ggttcgagcc ggccttcttc ggcatctcgc  35340

cgcgcgaagc gacgacgatg gatccgcagc agcggctgct cctggagacg agctgggagg  35400

cgttcgagcg cgccgggatt ttgcccgagc ggctgatggg cagcgatacc ggcgtgttcg  35460

tggggctctt ctaccaggag tacgctgcgc tcgccggcgg catcgaggcg ttcgatggct  35520

atctaggcac cggcaccacg gccagcgtcg cctcgggcag gatctcttat gtgctcgggc  35580

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tggcctgcca ggcgctgcgg cggggcgagt gttcggtggc gctggccggc ggcgtggcgc  35700

tgatgctcac gccggcgacg ttcgtggagt tcagccggct gcgaggcctg gctcccgacg  35760

gacggtgcaa gagcttctcg gccgcagccg acggcgtggg gtggagcgaa ggctgcgcca  35820

tgctcctgct caaaccgctt cgcgatgcgc agcgcgatgg ggatccgatc ctggcggtga  35880

tccgcggcac cgcggtgaac caggatgggc gcagcaacgg gctgacggcg cccaacggat  35940

cgtcgcagca agaggtgatc cgtcgggccc tggagcaggc ggggctggct ccggcggacg  36000

tcagctacgt cgagtgccac ggcaccggca cgacgttggg ggaccccatc gaagtgcagg  36060

ccctgggcgc cgtgctggca caggggcgac cctcggaccg gccgctcgtg atcgggtcgg  36120

tgaagtccaa tatcggacat acgcaggctg cggcgggcgt ggccggtgtc atcaaggtgg  36180

cgctggcgct cgagcgcggg cttatcccga ggagcctgca tttcgacgcg cccaatccgc  36240

acattccgtg gtcggagctc gccgtgcagg tggccgccaa acccgtcgaa tggacgagaa  36300

acggcgtgcc gcgacgagcc ggggtgagct cgtttggcgt cagcgggacc aacgcgcacg  36360

tggtgctgga ggaggcgcca gcggcggcgt tcgcgcccgc ggcggcgcgt tcagcggagc  36420

ttttcgtgct gtcggcgaag agcgccgcgg cgctggacgc gcaggcggcg cggctttcgg  36480

cgcatgtcgt tgcgcacccg gagctcggcc tcggcgacct ggcgttcagc ctggcgacga  36540

cccgcagccc gatgacgtac cggctcgcgg tggcggcgac ctcgcgcgag gcgctgtctg  36600

cggcgctcga cacagcggcg caggggcagg cgccgcccgc agccgctcgc ggccacgcta  36660

gcacaggcag cgccccaaag gtggttttcg tctttcctgg ccagggctcc cagtggctgg  36720

gcatgggcca aaagctcctc tcggaggagc ccgtcttccg cgacgcgctc tcggcgtgtg  36780

accgagcgat tcaggccgaa gccggctggt cgctgctcgc cgagctcgcg gccgatgaga  36840

ccacctcgca gctcggccgc atcgacgtgg tgcagccggc gctgttcgcg atcgaggtcg  36900

cgctgtcggc gctgtggcgg tcgtggggcg tcgagccgga tgcagtggta ggccacagca  36960

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tcatctgccg gcgcagcctg ctgctgcggc ggatcagcgg ccaaggcgag atggcggtcg  37080

tcgagctttc cctggccgag gccgaggcag cgctcctggg ctacgaagac cggctcagcg  37140

tggcggtgag caacagcccg cgatcgacgg tgctggcggg cgagccggca gcgctcgcag  37200

aggtgctggc gatccttgcc gcaaaggggg tgttctgccg tcgagtcaag gtggacgtcg  37260

ccagccacag cccacagatc gacccgctgc gcgacgagct attggcagca ttgggcgagc  37320

tcgagccgcg acaagcgacc gtgacgatgc gctcgacggt gacgagcacg atcgtggcgg  37380

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tggggtcgtt gcggcgtgga caggacgagc gcctgtccat gttggaggcg ctgggagcgc  37620

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tgcgctcgac ggtgacgggc ggggtgattg cgggtccgga gctcggagcg agctactggg  44040

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gccccacgct gttcatcgag atgagcccgc acccgatcct ggtgccgccc ctggacgaga  44160

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acgagcggtg ctggatcgag gtcgagcctg aagcccgccg cctcgccgca gccgacccca  44400

ccaaggactg gttctaccgg acggactggc ccgaggtgcc ccgcgccgcc ccgaaatcgg  44460

agacagctca tgggagctgg ctgctgttgg ccgacagggg tggggtcggt gaggcggtcg  44520

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ccaccgtcgc cgagcaggta tccgaagctg ccagtcgccg aaacgactgg cagggagtcc  44640

tctacctgtg gggcctcgac gccgtcgtcg atgctggggc atcggccgac gacgtcagcg  44700

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tcgaggggct ggaagcgcag ggcgcgcggg tgaccgtggc agcggtggat gtcgccgagg  45300

ccgatcccat gacggcgctg ctggccgcca tcgagccccc gttgcgcggg gtggtgcacg  45360

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cgcgcggcgc gcgcccgcgt cgtgcaggcg tgagcgcttt cggcctgagc gggaccaacg  47460

cgcatgtggt gttggaggag gcgccggcgg tggagcctgg ggccgcggcc cccgagcgcg  47520

cagcggagct gttcgtcctg tcggcgaaga gcgtggcggc gctggatgcg caggcagccc  47580

ggctgcggga tcacctggag aagcatgtcg agcttggcct cggcgatgtg gcgttcagcc  47640

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cgctgcgagg ggcgctttcg gccgcagcgc aggggcacac gccgccggga gctgtgcgtg  47760

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gcttcgctgc ggcggcgcga gcgctgctgg aaggtggccc cacgctgttc atcgagatga  48600

gcccgcaccc gatcctggtg ccgcccctgg acgagatcca gacggcggtc gagcaagggg  48660

gcgctgcggt gggctcgctg cggcgagggc aggacgagcg cgcgacgctg ctggaggcgc  48720

tggggacgct gtgggcgtcc ggctatccgg tgagctgggc tcggctgttc cccgcgggcg  48780

gcaggcgggt tccgctgccg acctatccct ggcagcacga gcggtactgg atcgaggaca  48840

gcgtgcatgg atcgaagccc tcgctgcggc ttcggcagct tcgcaacggc gccacggacc  48900

atccgctgct cggggcttca ttgctcgtct cggcgcgacc cggagctcac ttgtgggagc  48960

aagcgctgag cgacgagagg ctgtcctatc tttcggaaca tagggtccat ggcgaagccg  49020

tgttgccaag cgcggcgtat gtagagatgg cgctcgccgc cggcgtagat ctctatggca  49080

cggcgacgct ggtgctggag cagctggcgc tcgagcgagc cctcgccgtg ccttccgaag  49140

gcggacgcat cgtgcaagtg gccctcagcg aagaagggcc cggtcgggcc tcattccagg  49200

tatcgagtcg tgaggaggca ggtagaagct gggtgcggca cgccacgggg cacgtgtgta  49260

gcgaccagag ctcagcagtg ggagcgttga aggaagctcc gtgggagatt caacagcgat  49320

gtccgagcgt cctgtcgtcg gaggcgctct atccgctgct caacgagcac gccctcgact  49380

atggtccctg cttccagggt gtggagcagg tgtggctcgg cacgggggag gtgctcggcc  49440

gggtacgctt gccagaagac atggcatcct caagtggcgc ctatcggatt catcccgcct  49500

tcttggatgc atgttttcaa gtgctgaccg cgctgctcac cacgccggaa tccatcgata  49560

ttcggaggcg gctgacggat ctccacgaac cggatctccc gcggtccagg gctccggtga  49620

atcaagcggt gagtgacacc tggctgtggg acgccgcgct ggacggtgga cggcgccaga  49680

gcgcgagcgt gcccgtcgag ctggtgctcg gcagcttcca tgcgaagtgg gaggtcatgg  49740

agcgcctcgc gcaggcgtac atcatcgaca ctctccgcat atgggacgtc ttctgcgctg  49800

ctggagagcg tcacacgata gacgagttgc tcgtcaggct tcaaatctct gtcggctaca  49860

ggaaggtcat caagcgatgg atggatcacc ttgtcgcgat cggcgtcctc gtaggggacg  49920

gagagcattt tgtgagctct cagccgctgc cggagcctga tttggcggcg gtgctcgagg  49980

aggccgggag ggtgttcgcc gacctcccag tcctacttga gtggtgcaag tttgccgggg  50040

aacggctcgc ggacgtattg accggtaaga cgctcgcgct cgagatcctc ttccctggtg  50100

gctcgttcga tatggcggag cgaatctatc aagattcgcc catcgcccgt tactcgaacg  50160

gcatcgtgcg cggtgtcgtc gagtcggcgg cgcgggtggt agcaccgtcg ggaatgttca  50220

gcatcttgga gatcggagca gggacgggcg cgaccaccgc caccgtcctc ccggtgttgc  50280

tgcctgaccg gacagagtac cattttaccg atgtttctcc gctcttcctt gctcgtgcgg  50340

agcaaaaatt tcgagatcat ccattcctga agtatggcat tctggatatc gaccaggagc  50400

cagctggcca gggatacgca catcagaagt tcgacgtcat cgtcgcggcc aacgtcatcc  50460

atgcgacccg cgatataaga gccacggcga agcgtctcct gtcgttgctc gcgcccggag  50520

gccttctggt gctggtcgag ggcacagggc atccgatctg gttcgatatc accacgggat  50580

tgattgaggg gtggcagaag tacgaagatg atcttcgtac cgaccatccg ctcctgcctg  50640

ctcggacctg gtgtgacctc ctgcgccggg taggctttgc ggacgccgtg agtctgccag  50700

gcgacggatc tccggcgggg atcctcggac agcacgtgat cctctcgcgc gcgccgggca  50760

tagcaggagc cgcctgtgac agttccggtg agtcggcgac cgaatcgccg gccgcgcgtg  50820

cagtacggca ggaatgggcc gatggctccg ctgacgtcgt ccatcggatg gcgttggaga  50880

gaatgtactt ccaccgccgg ccgggccggc aggtctgggt ccacggtcga ttgcgtaccg  50940

gtggagacgc gttcacgaag gcgctcgctg gagatctgct cctgttcgac gacaccgggc  51000

aggtcgtggc agaggttcag gggcttcgcc tgccgcagct cgaggcttct gctttcgcgc  51060

cgcgggaccc gcgggaagag tggttgtacg cgttggaatg gcagcgcaaa gaccctatac  51120

cagaggctcc ggcagccgcg tcttcttcct ccgcgggggc ttggctcgtg ctgatggacc  51180

agggcgggac aggcgctgcg ctcgtatcgc tgctggaagg gcgaggcgag gcgtgcgtgc  51240

gcgtcatcgt gggtacggaa tacgcctgcc tcgcgccggg gctgtatcaa gtcgatccgg  51300

cgcagtcaga tggctttcat accctgctcc gcgatgcatt cggcgaggac cggatttgtc  51360

gcgcggtagt gcatatgtgg agccttgatg cgacggcagc aggggagagg acgacagggg  51420

agtcgcttca ggccgatcaa ctcctgggga gcctgagcgc gctttctctg gtgcaggcgc  51480

tggtgcgccg gaggtggcgc aacatgccgc gactttggct cttgacccgc gccgtgcatg  51540

cggtgggcgc ggaggacgca gcggcctcgg tggcgcaggc gccggtgtgg ggcctcggtc  51600

ggacgctcgc gctcgagcat ccagagctgc ggtgcacgct cgtggacgtg aacccggcgc  51660

cgtctccaga ggacgcagct gcactggcgg tggagctcgg ggcgagcgac agagaggacc  51720

agatcgcatt gcgctcggat ggccgctacg tggcgcgcct cgtgcggagc tccttttccg  51780

gcaagcctgc tacggatcgc ggcatccggg cggacggcag ttatgtgatc accgatggca  51840

tggggagagt ggggctctcg gttgcgcaat ggatggtgat gcagggggcc cgccatgtgg  51900

tgctcgtgga tcgcggcggc gcttccgagg cctcccggga tgccctccgg tccatggccg  51960

aggctggcgc ggaggtgcag atcgtggagg ccgacgtggc tcggcgcgac gatgtcgctc  52020

ggctcctctc gaagatcgaa ccgtcgatgc cgccgcttcg ggggatcgtg tacgtggacg  52080

ggaccttcca ggtcgactcc tcgatgctgg agctggatgc ccatcgcttc aaggagtgga  52140

tgtatcccaa ggtgctcgga gcgtggaacc tgcacgcgct gaccagggat agatcgctgg  52200

acttcttcgt cctgtactcc tcgggcacct cgcttctggg cttgcccgga caggggagcc  52260

gcgccgccgg tgacgccttc ttggacgcca tcgcgcatca ccggtgtagg ctgggcctta  52320

cagcgatgag catcaactgg ggattgctct tcgaagcatc atcgccggcg accccgaacg  52380

acggcggagc acggctcgaa taccggggga tggaaggtct cacgctggag cagggagcgg  52440

cggcgctcgg gcgcttgctc gcacaaccca gggcgcaggt aggggtgatg cggctgaatc  52500

tgcgccagtg gctggatttc tatcccaatg cggcccgatt ggcgctgtgg gcggagttga  52560

tgaaggagcg tgaccgcgcc gaccgaggcg cgtcgaacgc atcgaacctg cgcgaggcgc  52620

tgcagagcgg caggcccgaa gatcgtcagt tgattctgga gaagcacttg agcgagctgt  52680

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tcggcatgga ctcgctgata ggcctggagc tccgcaaccg catcgaggcc gcgctcggca  52800

tcaccgtgcc ggcgaccctg ctatggacct accctaccgt agcagctctg agcgggaact  52860

tgctagacat tctgtttccg aacgccggcg cgacccacgc tccggccacc gagcgggaga  52920

agagcttcga gaacgatgcc gcagatctcg aggctctgct gggtatgacg gacgagcaga  52980

aggacgcgtt gctcgccgaa aagctggcgc agctcgcgca gatcgttggt gacaattgag  53040

gtgctgggtt gttgtctctg gacagcgatc cagatgatcc agctccagag aagggagcgg  53100

acatatggcg accacgaatg ccgggaagct tgagcatgcc cttctgctca tggacaagct  53160

tgcgaaaaag aacgcgtctt tggagcaaga gcggaccgag ccgatcgcca tcataggcat  53220

tggctgccgc ttccccggcg gagcggacac tccggaggca ttctgggagc tgctcgactc  53280

aggccgagac gcggtccagc cgctcgaccg gcgctgggcg ctggtcgggg tccatcccag  53340

tgaggaggtg ccgcgctggg ccggactgct caccgaggcg gtggacggct tcgacgccgc  53400

gttctttggc acctcgcctc gggaggcgcg gtcgctcgat cctcagcaac gtctgctgct  53460

ggaggtcacc tgggaagggc tcgaggacgc cggcatcgca ccccggtccc tcgacggcag  53520

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acggttgtct tatacgctag ggctgcaggg accctgcctg accgtcgaca cggcctgctc  53700

gtcgtcgctc gtggccatcc accttgcctg ccgcagcctg cgcgctcgcg agagcgatct  53760

cgcgctggcg ggaggcgtca acatgctcct ttcgtccaag acgatgataa tgctggggcg  53820

catccaggcg ctgtcgcccg atggccactg ccggacattc gacgcctcgg ccaacgggtt  53880

cgtccgtggg gagggctgcg gtatggtcgt gctcaaacgg ctctccgacg cccagcgaca  53940

tggcgatcgg atctgggctc tgatccgggg ttcggccatg aatcaggatg gccggtcgac  54000

agggttgatg gcacccaatg tgctcgctca ggaggcgctc ttgcgcgagg cgctgcagag  54060

cgctcgcgtc gacgccgggg ccattggtta tgtcgagacc cacggaacgg ggacctcgct  54120

cggcgacccg atcgaggtcg atgcgctgcg cgccgtgatg gggccggcgc gggccgatgg  54180

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ccatttccac acgctcaatc cgcggatccg gatcgagggg accgcgctcg cgctggcgac  54360

ggagccggtg ccgtggccgc gggcgggccg accgcgcttc gcgggggtga gcgcgttcgg  54420

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ggcgacgccg gggcgctcag cagagctttt ggtgctgtcg gcgaagagcg ccgccgcgct  54540

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ggcgacctcg cgcgaggcgc tgcgaagcgc gctggaggtt gcggcgcagg ggcagacccc  54720

ggcaggcgcg gcgcgcggca gggccgcttc ctcgcccggc aagctcgcct tcctgttcgc  54780

cgggcagggc gcgcaggtgc cgggcatggg ccgtgggttg tgggaggcgt ggccggcgtt  54840

ccgcgagacc ttcgaccggt gcgtcacgct cttcgaccgg gagctccatc agccgctctg  54900

cgaggtgatg tgggccgagc cgggcagcag caggtcgtcg ttgctggacc agacggcgtt  54960

cacccagccg gcgctctttg cgctggagta cgcgctggcc gcgctcttcc ggtcgtgggg  55020

cgtggagccg gagctcgtcg ctggccatag cctcggcgag ctggtggccg cctgcgtggc  55080

gggtgtgttc tccctcgagg acgccgtgcg cttggtggtt gcgcgcggcc ggttgatgca  55140

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cgcggtggcg ccgcacgcag cgtcggtgtc gatcgcggca gtcaatgggc cggagcaggt  55260

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gctggaggcg ctccggcggg tggcggagtc ggtgacgtat cggcggcctt cgatggcgct  55440

ggtgagcaac ctgagcggga agccctgcac ggatgaggtg tgcgcgccgg gttactgggt  55500

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tgcgggcatc ttcgtcgagg tgggcccgaa gccggcgctg ctcggccttt tgccggcctg  55620

cctgccggat gccaggccgg tgctgctgcc agcgtcgcgc gccgggcgtg acgaggctgc  55680

gagcgcgctg gaggcgctgg gtgggttctg ggtcgtcggt ggatcggtca cctggtcggg  55740

agtcttccct tcgggcggac ggcgggtacc gctgccaacc tatccctggc agcgcgagcg  55800

ttactggatc gaagcgccgg tcgatggtga ggcggacggc atcggccgtg ctcaggcggg  55860

gggccacccc cttctgggtg aagtcttttc cgtgtcgacc catgccgatc tgcgcctgtg  55920

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ggtcgtgttt cctcgcgccg ggtacctgga gatggcgctg tcgtcggggg ccgagatctt  56040

gggcgatgga ccgatccagg tcacggatgt ggtgctcatc gagacgctga ccttcgcggg  56100

cgatacggcg gtaccggtcc aggtggtgac gaccgaggag cgaccgggac ggctacggtt  56160

ccagatagcg agtcgggggc cgggtgaacg tcgcgcgtcc ttccggatcc acgcccgcgg  56220

cgtgctgcgc cgggtcgggc gcgccgagac cccggcgagg ttggacctcg ccgccctgcg  56280

cgcccggctt catgccgccg tgcccgctgc ggctacctat ggggcgctcg ccgagatggg  56340

gcttcgatac ggcccggcgt tgcgggggct cgccgagctg tggcggggtg agggcgaggc  56400

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ggtgctgctg gacgcgtgcg tccaaatgat tgttggcgcg ttcgccgatc gcgatgaggc  56520

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gctatggtgc catgcgcgcg tcgtgagcga tggtcaacag gcccccagcc ggtggagcgc  56640

cgactttgag ttgatggacg gtacgggcgc ggtggtcgcc gaggtctccg ggctggtggt  56700

ggagcggctt gctagcggtg tacgccggcg cgaagcagac gactggttcc tggagctgga  56760

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cgtgcacgcc acgggggacg acacgagcgc cgcaggaatg cgcgcgctcc tggccaacgc  56940

gttcgacggc caggccccga cggccgtggt gcacctcagc agcctcgacg ggggcggcca  57000

gctcgacccg gggctcgggg cgcagggcgc gctcgacgcg ccccggagcc cagatgtcga  57060

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agccctggtc ggcatggacc tccgaaatgc gccgcggctg tggctcttga cccgcggggc  57180

tcaggcggcc gccgccggcg acgtctccgt ggtgcaagcg ccgctgttgg ggctgggccg  57240

caccatcgcc ttggagcacg ccgagctgcg ctgtatcagc gtcgacctcg atccagccca  57300

gcctgaaggg gaagccgatg ctttgctggc cgagctactt gcagatgatg ccgaggagga  57360

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acccggcgcg ctggaccaac tggtgctccg ggccacgggg cggcgcgctc ctggtccggg  57540

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gggcgttgct cccaatgacc tgcctggaga agaaatcgag ccgtcggtgc tcggacgcga  57660

gtgcgccggg cgcatcgtcg ctgtgggcga gggcgtgaac ggccttgtgg tgggccagcc  57720

ggtgatcgcc cttgcggcgg gagtatttgc tacccatgtc accacctcgg ccacgctggt  57780

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cggcgagggt gtggacgtcg tgctcgactc gctttcgggc gagcacatcg acaagagcct  58140

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cacgcagcct gggctgccgc cgctcctacg gaatttttcc ttctcgcagg tggacttgcg  58260

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ctatgccgca gccaacgctt tcctcgacgc cctttcgcat caccgaaggg cgcagggcct  59040

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ggtctcgcat gtgctgcgtc tccctgaagg caagatcgag gtggatgccc cgctctcgag  59460

catgggcatg gactcgctga tgagcctgga gctgcgcaac cgcatcgagg ctgcgctggg  59520

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ggcaagcgcc ggttcgttcg tccacgtcct ccgctttcgt cctgtcgtta agccgcgggc  59700

tcgtctcttc tgctttcacg gttctggcgg ctcgcccgag ggcttccgtt cctggtcgga  59760

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cgtggagctc gccagtcgtt ccggcgcacc ggctccgctg gccgttttca cgttgggcgg  60000

cagcttgatc tcttcttcag agatcacccc ggagatggag accgacataa tagccaagct  60060

cttcttccga aatgccgcgg gtttcgtgcg atccacccaa caagttcagg ccgatgctcg  60120

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gcccgtgaag atcgcggtcc ctatcgtcgc catcgccggc tcggacgatg tgatcgtgcc  60240

tccaagcgac gttcaggatc tacaatctcg caccacggag cgcttctata tgcatctcct  60300

tcccggagat cacgagtttc tcgtcgatcg aagtcgcgag atcatgcaca tcgtcgactc  60360

gcatctcaat ccgctgctcg ccgcgaagac gacgtcgtca ggcccggcgt tcgaggcacg  60420

caattgaggt gctgggttgt tgtctctgga caccgatcca gatgatccag ctcggcgccg  60480

cagccgtcgt cgccgccggt gtcccgctgg tcgcccttcc cgccgcccgc gcggacgatc  60540

gggggcacca cacccccgag gtccccggga acccggccgc gtccggcgcc cccgccgcct  60600

tcgacgagat cccgcaaaag cggcctttga ctccctgcaa gcctcagcga ccgaatatat  60660

cggttatgcg tgggcgatgg ttgttgtcat tgtcggcgca actatcggta tcaagctgtt  60720

taagaaattc acctcgaaag caagctgata aaccgataca attaaaggct ccttttggag  60780

cctttttttt tggagatttt caacgtgaaa aaattattat tcgcaattcc tttagttgtt  60840

cctttctatt ctcactccgc tgaaactgtt gaaagttgtt tagcaaaacc tcatacagaa  60900

aattcattta ctaacgtctg gaaagacgac aaaactttat ctctag                 60946

 

Claims (8)

1.一个重组克隆骨架质粒，其特征在于为基于突变整合位点序列构建，其序列为SEQ No.59所示，记为pZLE10。

2.如权利要求1所述重组克隆骨架质粒的构建方法，其特征在于具体步骤为：将PCR片段插入到pMD-19T vector 中得到过渡质粒，用XbaI和BglII酶切，得到一个1962-bp的DNA片段；再用NheI和BglII酶切质粒T-Bxbatt1-Bxbatt2，得到一个4441-bp的DNA片段；将该两片段连接得到pZLE12；以XbaI酶切pZLE12得到大小为3713-bp的片段；以NheI和XbaI酶切pSET152得到大小为3402-bp的片段；两片段连接后即得到质粒pZLE10 ；其中，所述PCR片段为1956-bp, 序列为SEQ No.57 和 SEQ No.58。 

3.如权利要求1所述重组克隆骨架质粒的相应元件，其特征在于包括attP ₀ 和attB ₁₅ 位点、大肠杆菌复制起始区域(ori-p15A)、噬菌体                                                

C31的整合酶基因和attP位点、十一烷基灵菌红素(Red)生物合成基因簇中的启动子PredP、核糖体结合位点序列(RBS)、抗性基因、转录终止子以及接合转移起始位点。

4.基于突变整合位点序列所构建的重组克隆入门质粒，其特征在于其序列为SEQ No.3、SEQ No.6、SEQ No.9、SEQ No.12、SEQ No.15、SEQ No.18或SEQ No.20所示，依次记为pTA0006、pTA0613、pTA1307、pTA0712、pTA1203、pTA0315和pTA1303。

5.如权利要求3所述质粒的相应元件，其特征在于包括质粒复制起始位点、抗药性基因以及位点特异性重组识别位点，依次为attB ₀ 和attP ₆ 、attB ₆ 和attP ₁₃ 、attB ₁₃ 和attP ₇ 、attB ₇ 和attP ₁₂ 、attB ₁₂ 和attP ₃ 、attB ₃ 和attP ₁₅ 、以及 attB ₁₃ 和attP ₃ 。 

6.如权利要求3所述质粒的构建方法，其特征在于具体步骤如下： 

以引物PT1 和PTF扩增阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV，将获得的PCR片段通过TA克隆插入到pMD19-T 载体中，即得到pTA0006，序列为 SEQ No.3；其中，引物PT1 包含attB ₀ , 序列为SEQ No.1，引物PTF 包含attP ₆ , 序列为SEQ No.2；

通过相同的方法，获得其他“入门载体”：

以引物PTB6和PTP13获得pTA0613，序列为SEQ No.6；其中，引物PTB6 包含attB ₆ , 序列为SEQ No.4，引物PTP13 包含attP ₁₃ , 序列为 SEQ No.5；

以引物PTB13 和PTP7 获得pTA1307，序列为SEQ No.9；其中，引物PTB13 包含attB ₁₃ , 序列为SEQ No.7)，引物PTP7 包含attP ₇ , 序列为SEQ No.8；

以引物PTB7 和PTP12 获得pTA0712，序列为SEQ No.12；其中，引物PTB7 包含attB ₇ , 序列为SEQ No.10，引物PTP12 包含attP ₁₂ , 序列为SEQ No.11；

以引物PTB12和PTP3获得pTA1203，序列为SEQ No.15；其中，引物PTB12 包含attB ₁₂ , 序列为SEQ No.13，引物PTP3 包含attP ₃ , 序列为SEQ No.14；

以引物PTB3和PTP15获得pTA0315，序列为SEQ No.18；其中，引物PTB3 包含attB ₃ , 序列为SEQ No.16，引物PTP15 包含attP ₁₅ , 序列为SEQ No.17；

以引物PTB13和PTP3获得pTA1303 ，序列为SEQ No.20；其中，引物PTB13 包含attB ₁₃ , 序列为SEQ No.19，引物PTP3 包含attP ₃ , 序列为 SEQ No.14。

7.一种将目的片段克隆到入门载体的方法，其特征在于具体步骤为：用限制性内切酶XcmI 消化入门载体，以TA克隆的方式插入目的片段。

8.一种体外多DNA片段一步串联重组拼装的方法，其特征在于基于如权利要求1所述三重组克隆骨架质粒和权利要求3所述的入门质粒，具体步骤如下： 

将各亚克隆线性化，小于10 kb的线性片段以琼脂糖凝胶分离后以试剂盒回收；大于10 kb的线性片段先以酚氯仿抽提后再乙醇沉淀回收；将线性片段和

BT1整合酶于30°C温育过夜，缓冲体系为：10 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA 和 1 mM DTT，串联重组产物先以蛋白酶K灭活，再以酚氯仿抽提后乙醇沉淀回收，然后以脉冲场凝胶电泳分析。

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