KR20210044795A - 고 처리량 대사 공학에서 CRISPRi의 응용 - Google Patents

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KR20210044795A KR1020217005661A KR20217005661A KR20210044795A KR 20210044795 A KR20210044795 A KR 20210044795A KR 1020217005661 A KR1020217005661 A KR 1020217005661A KR 20217005661 A KR20217005661 A KR 20217005661A KR 20210044795 A KR20210044795 A KR 20210044795A
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로섬 헨드릭 엠. 반
애런 밀러
폴 퍼코비치
쇼운 시카
케다 파텔
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지머젠 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 생체외에서 고 처리량 DNA 조립 반응을 위한 방법, 조성물 및 키트를 기술한다. 본 발명은 추가로 미리 확증된 CRISPR 프로토스페이서/프로토스페이서 인접 모티프 서열 조합을 포함하는 복제 태그 분절이 측면에 위치하는 모듈식 삽입체 DNA 부분을 포함하는 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 더 기술한다. CRISPRi 및 CRISPRa의 고 처리량 방법이 또한 개시된다.

Description

고 처리량 대사 공학에서 CRISPRi의 응용
본 발명은 생체외에서 유도된 유전자 서열 편집을 위해 사용되는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은, 특히, 개선된 DNA 복제, 올리고뉴클레오타이드의 조립 및 미생물의 개선을 위해 유도된 서열 편집 복합체를 사용하는 방법을 기술한다. 본 발명은 또한 돌연변이체 CRISPR 효소를 통해 숙주 세포의 발현을 조절하는 고 처리량 방법을 기술한다.
본 발명은 DARPA에 의해 수여된 계약 번호 HR0011-15-9-0014에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
생물학에서 중요한 관심 영역은 유전자 서열의 생체외 및 생체내 표적화된 변형이다. 사실, 학술적 및 상업적 유전자 연구의 가장 중요한 병목 중 하나는 새로운 유전체 구조체가 테스트 전에 생성되거나 나중에 변형될 수 있는 속도이었다. 본 발명은 또한 돌연변이 CRISPR 효소를 통해 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하는 고 처리량 방법을 기술한다.
제한 효소 부위 인식 또는 DNA 혼성화 및 증폭에 의존하는 현재 이용 가능한 복제 기술은 느리고, 신뢰성이 낮으며, 이후의 변형에 대해 다루기가 어려운 것으로 입증되었다. 덩어리진 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복체(CRISPR) 유전자 편집 시스템의 발견은 연구자들에게 유전자 변형을 위한 추가 경로를 제공했다. 그러나, 이러한 새로운 접근법은 높은 처리량의 모듈식 복제 응용분야에서는 비실용적이다.
예를 들어, 촉매 활성 또는 비활성화된 CRISPR 효소의 사용은 연구자들이 표적 유전자 발현 억제(CRISPRi) 또는 활성화(CRISPRa)를 수행할 수 있도록 한다. 그러나, 이러한 기술은 여전히 CRISPR 응용 프로그램의 기술적 제한에 영향을 받음으로 고 처리량이 응용에 최적화되어 있지 않다.
예를 들어, CRISPR 편집 위치는 종종 프로토스페이서 인접 모티프(PAMs)의 위치에 의해 제한된다. 새로운 CRISPR 가이드 RNA 디자인과 유전자 표적화는 시간과 비용이 많이들뿐만 아니라 효율성이 떨어지며 표적 외의 돌연변이 가능성이 있다.
따라서, 유전자 서열의 표적화된 변경 및 유전자 발현의 변형을 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 존재한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 이용하여 생체내 및 생체외 고 처리량 DNA 조립 반응을 위한 방법, 조성물 및 키트를 교시한다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 사전 확증된 CRISPR 프로토스페이스/ 프로토스페이스 인접 모티프(PAM) 서열 조합을 포함하는 tag 분절을 복제함으로써 측면으로 위치하는 모듈식 삽입 DNA 부분을 포함하는 CRISPR DNA 구조체를 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 CRISPR 엔도뉴클레아제로 DNA를 분해하는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 타입 II - 클래스 2 CRISPR 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9)로 DNA를 분해하는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 타입 V - 클래스 2 CRISPR 엔도뉴클레아제로 DNA를 분해하는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 Cpf1 엔도뉴클레아제로 DNA를 분해하는 것을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하는 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하고, 상기 다중 복제 부위는 a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각 cTAG는 i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하며; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및 b) 하나 이상의 DNA 삽입체 서열를 포함하며; i) 여기서 상기 cTAG의 각각은 하나 이상의 DNA 삽입체 서열의 각각의 주위의 플랭킹 위치(flanking positions)에 분포된다; 및 ii) 여기서 상기 DNA 삽입체 서열의 적어도 하나는 선택 마커를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 원형이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 선형이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 유기체의 게놈에 통합된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 상기 별개의 cTAG의 적어도 하나는 적어도 2개의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, CRISPR 랜딩 부위의 적어도 하나는 Cas9 엔도뉴클레아제를 위한 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, CRISPR 랜딩 부위의 적어도 하나는 RNA 또는 DNA 유도 뉴클레아제, 예를 들어, Cpf1 엔도뉴클레아제를 위한 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 상기 별개의 cTAG의 적어도 하나는 희귀(≥8 염기 길이) 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 "메가모듈식(MegaModular)" 구조체로 지칭한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 핵산 분자를 제조하는 방법을 교시하며, 상기 방법은 a) 다음을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계: i) 복수의 DNA 삽입체 부분, 여기서 각각의 DNA 삽입체 부분은 2개의 복제 태그(cTAGs)에 인접하고, 각각의 cTAG는 1) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함한다; ii) 복수의 DNA 삽입체 부분의 적어도 2개에 존재하는 상기 cTAGs의 적어도 하나를 표적으로 하는 하나 이상의 CRISPR 복합체, 각각의 CRISPR 복합체는 1) CRISPR 엔도뉴클레아제, 및 2) 상기 표적화된 cTAG의 하나에 상기 CRISPR 엔도뉴클레아제를 모집할 수 있는 가이드 RNA 또는 가이드 RNAs를 포함하며; 여기서 혼합물은 오버행 말단을 생성하기 위해 복수의 DNA 삽입체 부분의 적어도 2개에서 표적화된 cTAG(s)의 분해를 허용하는 조건하에서 배양된다, 및 b) 양립 가능한 오버행 말단의 혼성화 및 혼성화된 말단의 공유 결합을 허용하는 조건에서 (a)에서 생성된 분해 생성물을 배양하는 단계를 포함하며; 생성된 재조합 핵산 분자는 상기 방법에서 결찰된 최초 삽입체 부분의 완전한 cTAG 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 핵산 분자의 제조 방법을 교시하며, CRISPR 엔도뉴클레아제는 Cpf1이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 핵산 분자를 제조하는 방법을 교시하며, CRISPR 엔도뉴클레아제는 DNA 또는 RNA 유도 엔도뉴클레아제, 예를 들어, Cas9이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 핵산 분자를 제조하는 방법을 교시하며, 상기 방법은 i) 결찰 전에 CRISPR 복합체로부터 분해된 cTAG 서열을 분리하는 단계 또는 ii) 결찰 전에 CRISPR을 불활성화시키는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 핵산 분자를 제조하는 방법을 교시하며, 분리 단계는 DNA 정제 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 핵산 분자의 제조 방법을 교시하며, 불활성화 단계는 상기 CRISPR 복합체의 열 또는 화학적 불활성화를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 핵산 분자를 제조하는 방법을 교시하며, 복수의 DNA 삽입체 부분의 각각에 대한 2개의 cTAG는 cTAG 쌍을 형성하고, 상기 cTAG 쌍은 상기 방법에서 결찰된 DNA 삽입체 부분의 모든 다른 cTAG 쌍으로부터 독특하다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 핵산 분자를 제조하는 방법을 교시하며, 각 cTAG 쌍에서 cTAGs의 적어도 하나는 상이한 cTAG 쌍에서 적어도 하나의 다른 cTAG와 동일하다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열 편집 방법을 교시하며 상기 방법은 a) 다음을 반응에 도입하는 단계: i) 본 발명의 모듈식 CRISPR DNA 구조체; ii) 대체 DNA 삽입체 부분, 상기 대체 DNA 삽입체 부분은 제 1 및 제 2 삽입체 cTAG가 측면에 위치되며; 1) 제 1 삽입체 cTAG는 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 별개의 cTAGs의 하나의 확증된 CRISPR 랜딩 부위(들)를 포함하고, 제 2 삽입체 cTAG는 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 다른 별개의 cTAG의 확증된 CRISPR 랜딩 부위(들)를 포함한다; 및 iii) 각각 제 1 및 제 2 삽입체 cTAG를 표적으로하는 제 1 및 제 2 CRISPR 복합체, 각각의 CRISPR 복합체는 1) CRISPR 엔도뉴클레아제 및 2) 상기 표적화된 삽입체 cTAGs의 하나에 상기 CRISPR 엔도뉴클레아제를 모집할 수 있는 가이드 RNA를 포함하며; 상기 제 1 및 제 2 CRISPR 복합체는 상기 제 1 및 제 2 삽입체 cTAG 및 상응하는 별개의 cTAG를 절단하여 오버행 말단을 생성한다, 및 b) 양립 가능한 오버행 말단의 혼성화 및 혼성화된 말단의 공유 결합을 허용하는 조건하에서 (a)에서 생성된 분해된 cTAGs로 대체 DNA 삽입체 부분 및 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 배양하는 단계를 포함하며; 여기서 생성된 편집된 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 상기 방법에서 결찰된 최초의 삽입체 부분의 완전한 cTAG 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열 편집 방법을 교시하며, 단계(b)의 반응은 기능성 리가아제를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열 편집 방법을 교시하며, 상기 방법은 a) 다음을 반응에 도입하는 단계: i) 본 발명의 모듈식 CRISPR DNA 구조체; ii) 모듈식 CRISPR DNA 구조체에서 2개의 별개의 cTAG를 표적으로 하는 적어도 2개의 CRISPR 복합체로서, 각각의 CRISPR 복합체는 1) CRISPR 엔도뉴클레아제, 및 2) 상기 표적화된 별개의 cTAGs의 하나에 상기 CRISPR 엔도뉴클레아제를 모집할 수 있는 가이드 RNA를 포함하며; 제 1 및 제 2 CRISPR 복합체는 모듈식 CRISPR DNA 구조체에서 2개의 별개의 cTAG를 절단하고, 최종 별개의 cTAGs는 오버행 말단을 포함한다, 및 b) 다음을 제 2 반응에 도입하는 단계: i) (a)에서 생성된 분해된 cTAGs를 갖는 모듈식 CRISPR DNA 구조체; 및 ii) 대체 DNA 삽입체 부분, 상기 대체 DNA 삽입체 부분은 제 1 및 제 2 삽입체 cTAG가 측면에 위치되며; 1) 제 1 삽입체 cTAG는 (a)에서 절단된 분해되지 않은 별개의 cTAGs의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제 2 삽입체 cTAG는 (a)에서 절단된 다른 분해되지 않은 별개의 cTAG의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고; 및 2) 상기 제 1 및 제 2 삽입체 cTAGs는 양립 가능한 오버행 말단의 혼성화 및 혼성화된 말단의 공유 결합을 허용하는 조건(a)로부터 별개의 cTAGs의 오버행 말단과 양립 가능한 오버행 말단을 포함하며; 여기서 생성된 편집된 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 (a)에서 표적화된 최초의 분해되지 않은 별개의 cTAG의 완전한 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열 편집 방법을 교시하며, 단계(b)의 반응은 기능적 리가아제를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열 편집 방법을 교시하며, CRISPR 엔도뉴클레아제가 Cpf1이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열 편집 방법을 교시하며, 여기서 단계(a)는 2개의 절단된 별개의 cTAG를 단일 가닥의 엑소뉴클레아제로 분해시켜 오버행 말단을 갖는 별개의 cTAG를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 엑소뉴클레아제 단계 이후에 폴리머라제 및 리가아제로 접합부를 수리하기 위해 리가아제 및 폴리머라제를 첨가할 수 있다. 일부 양태에서, 이 반응은 또한 Cas9 분해되고, 평활 말단 절단으로 수행될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열 편집 방법을 교시하며, CRISPR 엔도 뉴클레아제는 Cas9이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하는 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 포함하는 숙주 세포 게놈을 제공하며, 상기 다중 복제 부위는 a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각 cTAG는 다음을 포함한다: i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위; 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위의 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 독특한 것이다; 및 b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들); i) 상기 별개의 cTAGs의 각각은 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)의 각각의 주위의 플랭킹 위치에 분포되어 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 핵산 분자를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 분해된 DNA 말단을 갖는 삽입체 부분을 생성하기 위해 적어도 2개의 복수의 DNA 삽입체 부분에서 하나 이상의 제한 효소에 의해 표적화된 cTAG의 분해를 허용하는 조건하에서 a) 다음을 포함하는 혼합물을 배양하는 단계: i) 2개의 복제 태그(cTAGs)가 측면에 위치되는 복수의 DNA 삽입체 부분, 각 cTAG는 1) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위; 및 2) 희귀(≥8개 염기) 제한 효소 인식 부위; 적어도 2개의 삽입체 부분의 cTAGs의 적어도 하나는 동일한 제한 효소 부위를 포함한다; ii) 복수의 DNA 삽입체 부분의 적어도 2개에서 희귀 제한 효소 부위를 표적으로 하는 하나 이상의 제한 효소; 및 b) 분해된 DNA 말단의 공유 결합을 허용하는 조건하에서 단계(a)에서 생성된 분해된 DNA 말단으로 DNA 삽입체 부분(들)을 배양하는 단계를 포함하며; 생성된 재조합 핵산 분자는 상기 방법에서 공유 결합된 최초의 삽입체 부분의 완전한 cTAG 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열 편집 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 다음을 제공하는 단계: i) 본 발명의 모듈식 CRISPR DNA 구조체, 적어도 2개의 별개의 cTAGs는 희귀(≥8개 염기) 제한 효소 인식 부위를 포함한다; ii) 대체 DNA 삽입체 부분, 상기 대체 DNA 삽입체 부분은 제 1 및 제 2 삽입체 cTAG가 측면에 위치된다; 1) 제 1 삽입체 cTAG는 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 별개의 cTAG의 하나의 희귀 제한 효소 인식 부위를 포함하고, 제 2 삽입체 cTAG는 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 다른 별개의 cTAG의 희귀 제한 효소 인식 부위를 포함한다; 및 iii) 제 1 및 제 2 삽입체 cTAG에서 희귀 제한 효소 부위를 표적으로 하는 하나 이상의 제한 효소; 부분 (ⅰ) 및 (ⅱ)는 각각 (ⅲ) 부분과 함께 단일 또는 별도의 반응으로 배양되며; 하나 이상의 제한 효소는 제 1 및 제 2 삽입체 cTAG의 희귀 제한 효소 인식 부위 및 이들의 상응하는 별개의 cTAG를 절단하여 분해된 DNA 말단을 생성시킨다, 및 b) 분해된 DNA 말단의 공유 결합을 허용하는 조건하에서 단계(a)에서 생성된 분해된 DNA 말단으로 대체 DNA 삽입체 부분 및 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 배양하는 단계를 포함하며; 생성된 편집된 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 상기 방법에서 공유 결합된 최초의 삽입체 부분의 완전한 cTAG 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 핵산 분자를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 2개의 DNA 삽입체 부분에서 공유된 cTAG의 분해를 허용하여, 적어도 2개의 DNA 삽입체 부분에서 양립 가능한 오버행 DNA 말단을 생성하는 조건하에서 a) 다음을 포함하는 혼합물을 배양하는 단계: i) 각각이 2개의 복제 태그(cTAGs)가 측면에 위치되는 복수의 DNA 삽입체 부분, 각 cTAG는 1) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위; DNA 삽입체 부분의 적어도 2개는 동일한 cTAG를 공유한다; ii) 단일 가닥 DNA(ssDNA) 엑소뉴클레아제, 및 b) 적어도 2개의 DNA 삽입체 부분의 양립 가능한 오버행 DNA 말단의 혼성화 및 공유 결합을 허용하는 조건하에서 (a)에서 생성된 분해된 cTAG로 DNA 삽입체 부분을 배양하는 단계를 포함하며; 생성된 재조합 핵산 분자는 분해 전 공유된 cTAG의 완전한 cTAG 서열을 포함한다. 이 반응은 또한 접합을 고정하는데 사용되는 폴리머라제 및 또는 리가아제로 수행될 수 있다. 또한, 이것은 미리 분해된 벡터로 수행될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하거나 숙주 세포의 게놈을 조작하기 위한 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하고, 상기 구조체는 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하고, 상기 다중 복제 부위는 다음을 포함한다: a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각각의 cTAG는 다음을 포함한다: i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및 b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들); i) 여기서 각각의 상기 별개의 cTAG는 각각의 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들) 주위의 플랭킹 위치에 분포되고; 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)은 CRISPR 기능의 조절자에 대한 DNA를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 선별 가능한 마커를 추가로 포함하는 CRISPR 기능의 조절자를 암호화하는 DNA를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 CRISPR 기능의 조절자가 복제 기점, 선택 가능 마커, 역 선택 가능 마커, 항-CRISPR 단백질, 프로모터, 터미네이터, dCas 단백질, dCpf1 단백질, 바코드, Cas9 단백질, Cpf1 단백질, DNA 도너 및 다중화를 용이하게 하는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 포함하는 숙주 세포를 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포를 교시하고, 여기서 숙주 세포는 촉매적으로 활성인 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산 분자 및 촉매적으로 활성화된 CRISPR 효소를 DNA 표적 부위로 모집할 수 있는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포를 교시하며, 여기서 숙주 세포는 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산 분자 및 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 DNA 표적 부위로 모집할 수 있는 가이드 RNA를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포를 교시하며, 여기서 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소가 전사 활성화 단백질에 융합된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포를 교시하며, 여기서 숙주 세포는, 발현될 때, 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자체로 부착할 수 있는 전사 활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포를 교시하며, 여기서 전사 활성화 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 불 활성화된 CRISPR 효소에 자체로 부착한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포를 교시하며, 여기서 가이드 RNA는 전사 활성화 단백질에 자체로 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포를 교시하며, 여기서 전사 활성화 단백질은 VP16, VP64 및 VP160으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하고, 여기서 상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 원형이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 여기서 상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 선형이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 여기서 상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 유기체의 게놈 내로 통합된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 여기서 상기 별개의 cTAG 중 적어도 하나는 적어도 2개의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 여기서 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 Cas9 엔도뉴클레아제에 대한 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 여기서 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 Cpf1 엔도뉴클레아제에 대한 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 여기서 상기 별개의 cTAG 중 적어도 하나는 희귀(≥8 염기 길이) 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 돌연변이된 Cas9 엔도뉴클레아제이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 돌연변이된 Cpf1 엔도뉴클레아제이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포를 교시하며, 여기서 숙주 세포는 하나 초과의 핵산 가이드 RNA를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포를 교시하며, 여기서 가이드 RNA 중 적어도 하나가 다른 가이드 RNA와 상이한 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포를 교시하며, 가이드 RNA 중 적어도 하나가 다른 가이드 RNA와 상이한 DNA 표적 부위 서열을 표적으로 한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포를 교시하며, 여기서 숙주 세포는 하나 이상의 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포를 교시하며, 여기서 촉매적으로 불 활성화된 CRISPR 효소 중 적어도 하나는 구조체에서 암호화된 다른 촉매적으로 불 활성화된 CRISPR 효소와 상이한 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 삽입체 부분을 교시하고, 여기서 cTAG의 하나 이상은 SEQ ID NO: 65-74, 78-81 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하는 고 처리량 방법을 교시하고, 상기 방법은 본 발명의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하며; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하는 고 처리량 방법을 교시하며, 여기서 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 적어도 하나의 삽입체 부분은 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하는 고 처리량 방법을 교시하며, 여기서 삽입체 부분은 CRISPR 단백질의 기능을 조절한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하는 고 처리량 방법을 교시하며, 여기서 삽입체 부분은 gRNA의 기능을 조절한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하는 고 처리량 방법을 교시하며, 여기서 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 여분의 염색체 DNA로서 숙주 세포에 남아 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 CRISPR 효소 변이체를 선별하기 위한 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 상기 구조체는 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하고, 상기 다중 복제 부위는 a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각각의 cTAG는 i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하며; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및 b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들); i) 여기서 상기 별개의 cTAG의 각각은 각각의 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)의 각각의 주위의 플랭킹 위치에 분포된다;를 포함하며, 여기서 구조체는 다음을 추가로 포함한다: c) CRISPR 효소, 또는 CRISPR 기능을 갖는 것으로 의심되는 효소("추정적인 CRISPR 효소")를 암호화하는 제 1 핵산; 및 d) DNA 표적 부위에 결합할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 제 2 핵산.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 CRISPR 활성을 선별하는 고 처리량 방법을 교시하며, 상기 방법은 a) 본 발명의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치한다; 및 b) DNA 표적 부위에서 발생하는 DNA 절단 정도를 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 CRISPRi 및/또는 CRISPRa 활성을 선별하는 고 처리량 방법을 교시하며, 상기 방법은 a) 본 발명의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치한다; 및 b) DNA 표적 부위에서 발생하는 전사 조절 정도를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1a-c는 본 발명의 CRISPR/Cas9 및 CRISPR/Cpf1 시스템의 비교를 도시한다. 도 1a - Cas9 엔도뉴클레아제는 tracrRNA 및 crRNA 복합체에 의해 표적 dsDNA에 모집된다. 도 1b - Cas9 엔도뉴클레아제는 인위적으로 융합된 tracrRNA 및 단일 가이드 RNA(sgRNA)로 알려진 crRNA 서열에 의해 표적 dsDNA에 모집될 수 있다. Cas9 엔도뉴클레아제는 평활 말단을 생성한다. 도 1c - Cpf1 엔도뉴클레아제는 crRNA 가이드 폴리리보뉴클레오티드만을 필요로 한다. Cpf1 엔도뉴클레아제 절단은 5'오버행을 갖는 이중 가닥 절단을 생산한다.
도 2a-2c는 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체를 이용하는 본 발명의 복제 방법의 한 실시태양을 도시한다. 도 2a는 본 발명에 따라 Cas9 또는 Cpf1 뉴클레아제로 쉽게 변형될 수 있는 모듈식 CRISPR 플라스미드를 나타낸다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체는 "MegaModular"구조체라 할 수 있다. 숫자로 표시되는 상호 교환 가능한 부분은 문자로 표시되는 불변 cTAG 서열이 측면에 위치된다. 부분은 사전 조립되거나 cTAG 서열 동일성을 기반으로 생체외에서 조립될 수 있다. 삽입체 부분의 예는 도 2a의 오른쪽에 도시된다. 도 2b - cTAG에서의 Cas9, Cpf1 또는 제한 엔도뉴클레아제 절단과 같은 여러 전략을 사용하여 전체 플라스미드를 재구성하지 않고도 개별 부분을 대체할 수 있다. cTAG 서열은 Cas9, Cpf1, 제한 및/또는 재조합 부위를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 복제 부위를 포함할 수 있다. 도 2c - 일단 유기체의 게놈에 통합되면, cTAG는 사전 확증된 Cas9 또는 Cpf1 랜딩 부위로 계속 사용될 수 있어, 사전 확증된 직교 gRNA 염기 서열을 가진 게놈적으로 통합된 DNA의 대체, 삽입 또는 제거를 가능하게 한다.
도 3a-d는 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체를 이용하는 본 발명의 복제 방법의 한 실시태양을 도시한다. 도 3a는 본 발명에 따라, Cas9 또는 Cpf1 뉴클레아제로 쉽게 변형될 수 있는 모듈식 CRISPR 플라스미드를 나타낸다. 숫자로 표시되는 상호 교환 가능한 부분은 문자로 표시되는 불변 cTAG 서열에 의해 인접된다. 부분은 사전 조립되거나 cTAG 서열 동일성을 기반으로 생체내 또는 생체외에서 조립될 수 있다. 예시적 삽입체 부분은 도 3a의 오른쪽에 도시된다. 도 3b - cTAG에서의 Cas9, Cpf1 또는 제한 엔도뉴클레아제 절단과 같은 여러 전략을 사용하여 전체 플라스미드를 재구성하지 않고도 개별 부분을 대체할 수 있다. cTAG 서열은 Cas9, Cpf1, 제한 및/또는 재조합 부위를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 복제 부위를 포함할 수 있다 도 3c는 삽입cp 부분을 제거하거나 기존의 모듈식 플라스미드로부터 스터퍼 서열을 추가하기 위한 본 발명의 방법을 예시한다. 도 3d - 본 발명의 모듈식 플라스미드의 삽입체 부분은 숙주 세포의 게놈 속으로 모듈식 CRISPR 벡터의 일부 또는 전부의 게놈 통합을 위한 서열로서 작용할 수 있다.
도 4는 실시예 1의 원-포트(one-pot) 생체외 모듈식 CRISPR 복제를 도시한다. 구체적으로, 원-포트 반응에서 하나의 플라스미드로부터 다른 플라스미드로 인서트를 옮김으로써 플라스미드 13001009086의 생성이 도시된다. 이 반응의 세부 사항은 실시예 1에 기재되어 있다.
도 5는 실시예 2의 생체외 모듈식 CRISPR 복제 방법의 실시태양을 예시한다. 각 패널은 실시예 2에 기술된 실험 디자인의 설명을 제공한다. 클로람페니콜 내성 유전자는 카나마이신 내성 백본 플라스미드에 복제시켜 이중 내성 플라스미드를 생성하였다. 그런 후에 이중 내성 플라스미드는 박테리아로 형질전환된 이후, 카나마이신 및 클로람페니콜 항생제로 강화된 배지에서 배양하였다. 내성 콜로니는 성공적인 Cpf1 복제 어셈블리를 나타내었다.
도 6은 실시예 2의 생체외 모듈식 CRISPR 복제 방법의 결과를 도시한다. y-축은 카나마이신 및 클로람페니콜로 강화된 배지에서 성장하는 회수된 콜로니 수를 나타낸다. 내성 콜로니는 성공적인 Cpf1 복제 어셈블리를 나타낸다. 결과는 이중 내성 플라스미드의 리가아제 의존성 어셈블리가 나타났다.
도 7은 pJDI427에 대한 벡터 지도를 묘사한다. Cpf1 어셈블리에 사용된 CRISPR 랜딩 부위는 cTAG M 및 cTAG N으로 레이블된다. 관련 서열 정보는 SEQ ID NO: 102에서 찾을 수 있다.
도 8은 pJDI429에 대한 벡터 지도를 묘사한다. Cpf1 어셈블리에 사용된 CRISPR 랜딩 부위는 cTAG N 및 cTAG O로 레이블된다. 관련 서열 정보는 SEQ ID NO: 103에서 찾을 수 있다.
도 9는 pJDI430에 대한 벡터 지도를 묘사한다. Cpf1 어셈블리에 사용된 CRISPR 랜딩 부위는 cTAG P 및 cTAG N으로 레이블된다. 관련 서열 정보는 SEQ ID NO: 104에서 찾을 수 있다.
도 10은 pJDI431에 대한 벡터 지도를 묘사한다. Cpf1 어셈블리에 사용된 CRISPR 랜딩 부위는 cTAG P 및 cTAG O로 레이블된다. 관련 서열 정보는 SEQ ID NO: 105에서 찾을 수 있다.
도 11은 pJDI432에 대한 벡터 지도를 묘사한다. Cpf1 어셈블리에 사용된 CRISPR 랜딩 부위는 cTAG M 및 cTAG N으로 레이블된다. 관련 서열 정보는 SEQ ID NO: 106에서 찾을 수 있다.
도 12는 pJDI434에 대한 벡터 지도를 묘사한다. Cpf1C 어셈블리에 사용된 CRISPR 랜딩 부위는 cTAG N 및 cTAG O로 레이블된다. 관련 서열 정보는 SEQ ID NO: 107에서 찾을 수 있다.
도 13은 pJDI435에 대한 벡터 지도를 묘사한다. Cpf1 어셈블리에 사용된 CRISPR 랜딩 부위는 cTAG P 및 cTAG N으로 레이블된다. 관련 서열 정보는 SEQ ID NO: 108에서 찾을 수 있다.
도 14는 pJDI436에 대한 벡터 지도를 묘사한다. Cpf1 어셈블리에 사용된 CRISPR 랜딩 부위는 cTAG P 및 cTAG O로 레이블된다. 관련 서열 정보는 SEQ ID NO: 109에서 찾을 수 있다.
도 15는 본 발명의 방법에 따라 모듈식 CRISPR 구조체의 예시적인 유전자 편집을 도시한다. 구체적으로, 도 15는 실시예 3의 메가모듈식 디자인을 사용하여 제한 효소 분해 및 결찰에 의한 플라스미드 어셈블리를 도시한다. 도 15는 모듈식 CRISPR 플라스미드 백본 p1300283391 및 양립 가능한 GFP-함유 삽입체 DNA 부분이 각각 ApaI 및 PvuI 제한 효소로 분해 되어 양립 가능한 복제 태그 말단을 생성하는 것을 나타낸다. 분해된 백본과 인서트는 생체외에서 결찰되어 새로운 모듈식 CRISPR 구조체를 생성한다.
도 16은 dCas9의 DNA에 대한 gRNA-지향 결합을 예시하는 다이어그램이다.
도 17a-b는 실시예 5에 기술된 바와 같은 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 CRISPRi 기술 검증을 나타낸다. 도 17a는 표적 유전자의 전사 불활성화를 유도하는 dCas9 발현 벡터의 다이어그램이다. 도 17b는 WT 또는 파프리카 생산 균주에서 발현된 다양한 가이드 RNA와 동시에 발현된 dCas9를 사용하는 유전자 전사의 억제를 도시한다. 7개의 생물학적 복제에 대한 살아있는 게이트된 세포의 중앙 형광이 표시된다.
도 18a-b는 CRISPRi/CRISPRa 라이브러리에 대한 잠재력을 예시한다. 도 18a는 단일 프로모터를 표적으로 하는 CRISPRi/CRISPRa 라이브러리를 도시한다. 도 18b는 게놈 전체에 걸쳐 다중 프로모터를 표적으로 하는 CRISPRi/CRISPRa 라이브러리를 도시한다.
정의
다음의 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 잘 이해되는 것으로 생각되지만, 다음 정의는 본 발명에 개시된 주제의 설명을 용이하게 하기 위해 제시된다.
용어 하나("a" 또는 "an")는 그 실체 중 하나 이상을 의미하며, 즉 복수의 지시대상을 의미할 수 있다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"라는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 또한, 부정관사에 의한 "한 요소"에 대한 언급은, 내용이 분명하게는 요소의 하나 및 단지 하나가 존재하는 것을 요구하지 않는 한, 하나 이상의 요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다.
용어 "원핵 생물"은 당업계에 공지되어 있으며 핵을 함유하지 않는 유기체를 의미한다. 원핵생물은 일반적으로 두 영역, 박테리아와 고세균의 하나로 분류된다. 고세균과 박테리아 영역의 유기체 사이의 명확한 차이는 16S 리보솜 RNA에서 뉴클레오타이드 염기 서열의 근본적인 차이에 기초한다.
"진핵 생물"은 세포가 막 내에 둘러싸인 핵 및 다른 소기관을 함유하는 임의의 유기체이다. 진핵 생물은 분류군(Eukarya 또는 Eukaryota)에 속한다. 진핵 생물 세포를 원핵 생물(앞에서 언급한 박테리아와 고세균)과 구분시키는 정의하는 특징은 막으로 둘러싸인 유전자 물질, 특히 유전자 물질을 함유하고 핵막에 의해 둘러싸인 핵을 가진다는 것이다.
용어 "고세균는 전형적으로 특이한 환경에서 발견되고 세포벽에서 리보솜 단백질의 수 및 뮤라민산의 부족을 포함하는 몇몇 기준에 의해 나머지 원핵 생물과 구별되는 멘도시쿠테스(Mendosicutes) 문의 유기체의 범주를 의미한다. ssrRNA 분석에 기초하여, 고세균은 두 계통발생학적으로 다른 그룹으로 구성된다: 크렌고세균(Crenarchaeota) 및 유리고세균(Euryarchaeota). 생리학을 기초로, 고세균은 세 가지 유형으로 구성될 수 있다: 메테인 생성균(methanogens)(메테인을 생성하는 원핵 생물); 고염성 세균(extreme halophiles)(매우 높은 농도의 염(NaCl)에서 사는 원핵 생물; 및 고온성(초고온성) 세균(extreme(hyper) thermophilus)(초고온에서 사는 원핵 생물). 박테리아와 구별되는 통일된 고세균의 특징(즉, 세포벽, 에스터-연결 막 지질 등에 뮤레인 없음)이외에, 이런 원핵 생물은 이들의 특정한 서식 환경에 적응시키는 특이한 구조 또는 생화학적 특성을 나타낸다. 크렌고세균은 주로 초고온성 황 의존성 원핵 생물로 이루어지며 유리고세균은 메테인 생성균과 고염성 세균을 함유한다.
"박테리아" 또는 "진정세균(eubacteria)"는 원핵 생물의 영역을 의미한다. 박테리아는 다음과 같이 적어도 11개의 구별된 그룹을 포함한다: (1) 그람 양성 (그람+) 박테리아, 2개의 주요 세부구분이 존재한다: (1) 높은 G+C 그룹(액티노마이세테스, 마이코박테리아, 마이크로코콕커스, 기타) (2) 낮은 G+C 그룹(바실러스, 클로스트리디아, 락토바실러스, 스타필로콕키, 스트렙토콕키, 마이코플라스마스); (2) 프로테오박테리아, 예를 들어, 보라색 광합성 + 비 광합성 그람 음성 박테리아 (대부분의 "일반적인" 그람 음성 박테리아 포함); (3) 사이아노박테리아, 예를 들면, 산소성 광영양생물; (4) 스피로체테스 및 관련 종; (5) 플랭크토마이세스; (6) 박테로이데스, 플라보박테리아; (7) 클라마이디아; (8) 녹색 황 박테리아; (9) 녹색 비 황 박테리아(또한 혐기성 광영양식물); (10) 방사성 저항성 마이크로콕키 및 동족; (11) 써모토가(Thermotoga) 및 써모시포 써모필레스(Thermosipho thermophiles).
용어 "유전자 변형된 숙주 세포", "재조합 숙주 세포" 및 "재조합 균주"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용되고 본 발명의 클로닝 및 형질전환 방법에 의해 유전자 변형된 숙주 세포를 의미한다. 따라서, 이 용어는 유전자 변경, 변형 또는 조작되어, 숙주 세포가 유도된 자연 발생 유기체와 비교하여 변경, 변형 또는 상이한 유전자형 및/또는 표현형을 나타내는(예를 들어, 유전자 변형이 미생물의 핵산 서열 암호화에 영향을 미칠 때) 숙주 세포(예를 들어, 박테리아, 효모 세포, 균류 세포, CHO, 인간 세포 등)를 포함한다. 이 용어는 문제의 특정 재조합 미생물뿐만 아니라 이런 미생물의 자손 또는 잠재적 자손을 의미하는 것으로 이해된다.
용어 "유전자 조작된"은 (예를 들어, 핵산의 삽입 또는 결실에 의한) 숙주 세포의 게놈의 임의적 조작을 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "선택 가능한 마커"는 흔히 특정 조건하에서 분자(예를 들어, 레플리콘) 또는 이를 함유하는 세포를 선택할 수 있게 하는 핵산 분절이다. 이들 마커는 RNA, 펩타이드 또는 단백질의 생산과 같으나 이에 제한되지 않는 활성을 암호화할 수 있거나 RNA, 펩타이드, 단백질, 무기 및 유기 화합물 또는 조성물 등을 위한 결합 부위를 제공할 수 있다. 선택 가능한 마커의 예는 (1) 독성 화합물에 대한 내성을 제공하는 생산물(예를 들어, 항생제)을 암호화하는 핵산 분절; (2) 수용체 세포에서 결핍된 생산물(예를 들어, tRNA 유전자, 영양요구성 마커)을 암호화하는 핵산 분절; (3) 유전자 생산물의 활성을 억제하는 생산물을 암호화하는 핵산 분절; (4) 쉽게 식별될 수 있는 생산물(예를 들어, β-갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 시안 형광 단백질(CFP) 및 세포 표면 단백질과 같은 표현형 마커)을 암호화하는 핵산 분절; (5) 세포 생존 및/또는 기능에 해를 끼치는 다른 생산물과 결합하는 생산물을 암호화하는 핵산 분절; (6) 가시적인 또는 선택 가능한 표현형을 생산하는 임의의 핵산 단편의 활성을 억제하는 핵산(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)을 암호화하는 핵산 분절; (7) 기질을 변형시키는 다른 생성물과 결합하는 생성물(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)을 암호화하는 핵산 분절; (8) 원하는 분자(예를 들어, 특정 단백질 결합 부위)를 분리 또는 동정하는 데 사용될 수 있는 핵산 분절; (9) 비 기능적일 수 있는 특정 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 분자의 아집단의 PCR 증폭용)을 암호화하는 핵산 분절; (10) 부재시에는 특정 화합물에 대해 직접 또는 간접적으로 내성 또는 민감성을 부여하는 핵산 분절을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 "역선택 가능한 마커" 또는 "역선택 마커"는 선택시 숙주 유기체의 성장을 제거 또는 억제하는 핵산 분절이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 역선택 가능한 마커는 세포를 하나 이상의 화학 물질/성장 조건/유전적 배경에 민감하게 만든다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 역선택 가능한 마커는 독성 유전자이다. 일부 실시태양에서, 역선택 가능한 마커는 유도성 프로모터에 의해 발현된다.
본 발명에 사용된 용어 "핵산"은 임의의 길이의 중합체 형태의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 이의 유사체를 의미한다. 이 용어는 분자의 1 차 구조를 의미하며, 따라서 이중 나선 및 단일 가닥의 DNA뿐 아니라 이중 및 단일 가닥의 RNA를 포함한다. 또한, 메틸화 및/또는 캡핑된 핵산과 같은 변형된 핵산, 변형된 염기를 함유하는 핵산, 골격 변형 등과 같은 변형 핵산을 포함한다. 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자"는 생물학적 기능과 관련된 DNA의 임의의 분절을 의미한다. 따라서, 유전자는 암호화 서열 및/또는 그의 발현에 요구되는 조절 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 유전자는 또한, 예를 들어, 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비 발현 DNA 분절을 포함할 수 있다. 유전자는 관심 공급원으로부터의 클로닝 또는 공지되거나 예측된 서열 정보로부터의 합성을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있고, 원하는 파라미터를 갖도록 디자인된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "상동성" 또는 "동족체" 또는 "오르쏘로그(ortholog)"는 당업계에 공지되어 있고 공통 조상 또는 가족 구성원을 공유하고 서열 동일성의 정도에 기초하여 결정되는 관련 서열을 의미한다. 용어 "상동 관계", "상동성", "실질적으로 유사" 및 "상응하게 실질적으로"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 이들은 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기의 변화가 유전자 발현을 중재하거나 특정 표현형을 생성시키는 핵산 단편의 능력에 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 의미한다. 이런 용어는 또한 초기의 변형되지 않은 단편에 비해 생성된 핵산 단편의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형을 의미한다. 따라서, 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 특정 예시적인 서열 이상을 포함하는 것으로 이해된다. 이런 용어는 한 종, 아종, 품종, 품종 또는 균주에서 발견된 유전자 및 다른 종, 아종, 품종, 품종 또는 균주에서 상응하는 또는 동등한 유전자 사이의 관계를 기술한다. 본 발명을 위해서, 상동성 서열이 비교된다. "상동 서열" 또는 "상동체" 또는 "오르쏘로그"는 기능적으로 관련이 있다고 생각되거나 믿거나 알려진다. 기능적 관계는 (a) 서열 동일성 및/또는 (b) 동일하거나 유사한 생물학적 기능을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 방식 중 임의의 하나로 표시될 수 있다. 바람직하게는, (a) 및 (b) 모두가 표시된다. 상동성은 Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, 섹션 7.718, 표 7.71에서 논의된 바와 같은 당해분야에서 용이하게 이용 가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 정렬 프로그램은 맥벡터(MacVector)(Oxford Molecular Ltd, Oxford, U.K.), ALIGN 플러스(Plus)(Scientific and Educational Software, Pennsylvania) 및 AlignX(Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, CA)이다. 다른 정렬 프로그램은 기본 매개변수를 사용하여 시퀀처(Sequencher)(Gene Codes, Ann Arbor, Michigan)이다.
본 발명에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 변화"는 당업계에서 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 뉴클레오타이드 치환, 결실 및/또는 삽입을 의미한다. 예를 들어 돌연변이는 침묵 치환, 추가 또는 결실을 생성하나 암호화된 단백질의 특성 또는 활성 또는 단백질이 어떻게 만들어지는지를 변형하지 않는 변경을 함유한다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 변형"은, 예를 들어, 당업계에서 잘 이해되는 바와 같이, 아미노산 치환, 아미노산 변형, 결실 및/또는 삽입을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 핵산 또는 폴리펩타이드의 "적어도 일부" 또는 "단편"은 전장 분자를 포함하는 전장 분자의 이런 서열 또는 임의의 더 큰 단편의 최소 크기 특성을 갖는 부분을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 단편은 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분을 암호화할 수 있다. 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분은 유전자 조절 요소를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 중 하나의 일부를 분리하고 본 발명에 기재된 바와 같은 활성을 평가함으로써 제조될 수 있다. 유사하게, 폴리펩타이드의 일부는 전장 폴리펩타이드까지 이르는 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산 등일 수 있다. 사용될 부분의 길이는 특정 용도에 따라 다를 것이다. 하이브리드화 프로브로서 유용한 핵산의 일부는 12개 뉴클레오타이드 정도로 짧을 수 있으며; 일부 실시태양에서, 이것은 20개 뉴클레오타이드이다. 에피토프로서 유용한 폴리펩티드의 일부는 4개의 아미노산 정도로 짧을 수 있다. 전장 폴리펩타이드의 기능을 수행하는 폴리펩타이드의 일부는 일반적으로 4개 이상의 아미노산보다 길 수 있다.
본 발명에 개시된 폴리뉴클레오타이드의 PCR 증폭을 위해, 임의의 관심 유기체로부터 추출된 cDNA 또는 게놈 DNA로부터의 상응하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 PCR 반응에 사용하기 위해 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 디자인될 수 있다. PCR 프라이머 및 PCR 클로닝을 디자인하기 위한 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, Sambrook et al.(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). See also Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); and Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)에 개시된다. PCR의 공지된 방법은 쌍을 이룬 프라이머, 네스티드 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 축퇴성 프라이머, 유전자 특이적 프라이머, 벡터 특이적 프라이머, 부분적 불일치 프라이머 등을 사용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "프라이머"는 DNA 중합효소를 부착시키는 증폭 표적에 대한 어닐링을 행할 수 있어, 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓일 때, 즉, 뉴클레오타이드 및 DNA 중합효소와 같은 중합화제의 존재하에서 및 적절한 온도 및 pH에서 DNA 합성의 개시점으로서 작용하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. (증폭) 프라이머는 증폭 효율을 최대화하기 위해 바람직하게는 단일 가닥이다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 중합화제의 존재 하에서 증량 생성물의 합성을 시작하기에 충분히 길어야한다. 프라이머의 정확한 길이는 프라이머의 온도 및 조성(A/T 대 G/C 함량)을 포함하는 많은 요소에 따라 달라질 것이다. 한 쌍의 양방향성 프라이머는 PCR 증폭과 같은 DNA 증폭 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 하나의 순방향 및 역방향 프라이머로 구성된다.
용어 "엄격성" 또는 "엄격한 혼성화 조건"은 하이브리드의 안정성에 영향을 주는 혼성화 조건, 예를 들어 온도, 염 농도, pH, 포름아마이드 농도 등을 의미할 수 있다. 이러한 조건은 특이적 결합을 최대화하고 표적 핵산 서열에 대한 프라이머 또는 프로브의 비특이적 결합을 최소화하기 위해 경험적으로 최적화된다. 사용된 용어는 프로브 또는 프라이머가 다른 서열보다 검출 가능하게 더 큰 정도로 (예를 들어, 배경보다 적어도 2배) 이의 표적 서열에 혼성화될 조건에 대한 언급을 포함한다. 엄격한 조건은 서열 의존성이며 다른 상황에서 상이할 것이다. 긴 서열은 고온에서 특이적으로 혼성화된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮은 것으로 선택된다. Tm은 상보적 표적 서열의 50%가 완벽하게 매치된 프로브 또는 프라이머에 하이브리드화되는 온도(정의된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M Na+ 이온 미만, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0 M Na+ 이온 농도(또는 다른 염)이고 온도는 짧은 프로브 또는 프라이머(예를 들어, 10 내지 50개 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 약 30℃이고 긴 프로브 또는 프라이머(예를 들어, 50개 초과 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 또한 포름아마이드와 같은 불안정화제의 첨가로 성취될 수 있다. 예시적인 낮은 엄격한 조건 또는 "감소된 엄격한 조건"은 37℃에서 30% 포름아마이드, 1M NaCl, 1% SDS의 완충액에 의한 하이브리드화 및 40℃에서 2 x SSC의 세척을 포함한다. 예시적인 높은 엄격 조건은 37℃에서 50% 포름아마이드, 1M NaCl, 1% SDS에서 하이브리드화 및 60℃에서 0.1 x SSC 세척을 포함한다. 하이브리드화 절차는 당업계에 주지되어 있으며 예를 들어, Ausubel et al., 1998 and Sambrook et al., 2001에 의해 기술된다. 일부 실시태양에서, 엄격한 조건은 1mM Na2EDTA, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%와 같은 45℃의 0.5-20% 황산 도데실 나트륨을 함유하는 0.25 M Na2HPO4 완충액(pH 7.2)에서의 하이브리드화, 및 뒤이은 55℃ 내지 65℃에서 0.1%(w/v) 황산 도데실 나트륨을 함유하는 5 x SSC 세척이다.
본 발명에 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 이하의 뉴클레오타이드가 변하는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. cTAGs의 문맥에서 사용되는 경우, 실질적으로 동일한 용어는 적어도 하나의 CRISPR 랜딩 부위에서 CRISPR 절단을 폐기하기 위해 디자인된 cTAGs의 하나의 PAM 또는 프로토스페이서 영역의 돌연변이를 제외하고는 동일할 2개의 cTAG를 나타낸다. 용어 "부분적" 서열 또는 cTAG와 함께 용어 실질적으로 동일한이 사용되는 경우, 상기 조합은 상기한 바와 같이 2개의 실질적으로 동일한 cTAG 사이의 비교를 의미하며, cTAG의 하나가 CRISPR 엔도뉴클레아제로 분해되었다. 따라서 이 용어는 기술된 cTAG가 PAM 또는 프로토스페이서 영역의 돌연변이를 제외하고 (분해되지 않은 형태의) 제 2 cTAG와 동일하다는 것을 나타내는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "프로모터"는 암호화 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수있는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터 서열은 근위 및 더 원위 상류 요소로 구성될 수 있고, 후자의 요소는 종종 인핸서로 의미된다. 따라서, "인핸서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열이며, 프로모터의 선천적인 요소 또는 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키기 위해 삽입된 이종성 요소일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "이종성"은 특정 유기체에서 자연적으로 발견되지 않는 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "내인성", "내인성 유전자"는 유전자의 자연 발생 복사물을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "자연적으로 발생하는"은 자연적으로 발생하는 원료로부터 유래된 유전자 또는 서열을 의미한다. 일부 실시태양에서, 자연적으로 발생하는 유전자는, 상이한 유기체에 도입될 때, 원료 유기체 내의 내인성 설정에 위치되거나 "이종성" 설정에 놓인 경우, 야생형(비-형질전환 유전자) 유전자의 유전자를 의미한다. 따라서, 본 발명의 목적 상, "자연적으로 발생하지 않은" 서열은 공지된 천연 서열과 상이한 서열을 갖도록 합성되고, 돌연변이되고 또는 변형된 서열이다. 일부 실시태양에서, 변형은 단백질 수준일 수 있다(예를 들어, 아미노산 치환). 다른 실시태양에서, 변형은 단백질 서열에 영향을 주지 않으면서 DNA 수준일 수 있다(예를 들어, 코돈 최적화). 일부 실시태양에서, 자연적으로 발생하지 않는 서열은 구조체일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "외인성"는 용어 "이종성(heterologous)"과 상호 교환적으로 사용되고, 자연 공급원 이외의 일부 공급원으로부터 유도하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 용어 "외인성 단백질" 또는 "외인성 유전자"는 비 자연 공급원 또는 위치의 단백질 또는 유전자 및 생물학적 시스템에 공급된 단배질 또는 유전자를 의미한다. 내인성 유전자의 인공적으로 돌연변이된 변이체는 본 발명의 목적 상 "외인성"으로 고려된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 구조체", "발현 구조체", "키메라 구조체", "구조체" 및 "재조합 DNA 구조체"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 재조합 구조체는 천연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 암호화 서열과 같은 핵산 단편의 인위적인 조합을 포함한다. 예를 들어, 키메라 구조체는 상이한 공급원으로부터 유도된 조절 서열 및 암호화 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유도되지만 자연계에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구조체는 그 자체로 사용되거나 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터가 사용되는 경우 벡터의 선택은 당업자에게 주지된 바와 같이 숙주 세포를 형질 전환하는 데 사용될 방법에 의존한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 분리된 핵산 단편을 포함하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환, 선별 및 증식시키기 위해 벡터 상에 존재해야 하는 유전자 요소를 잘 알고 있다. 당업자는 또한 상이한 독립적인 형질전환 사건이 발현의 상이한 수준 및 패턴을 유도한다는 것을 인식할 것이며(Jones et al., (1985) EMBO J. 4 : 2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen Genetics 218 : 78-86), 따라서 다수의 사건은 원하는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 라인을 수득하기 위해 선별돼야한다. 이러한 선별은 다른 것들 중에서, DNA의 서던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, 단백질 발현의 면역 블로팅 분석 또는 표현형 분석에 의해 실행될 수 있다. 벡터는 자율적으로 복제하거나 숙주 세포의 염색체에 통합될 수있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스, 파지미드, 트랜스포존, 인공 염색체 등일 수 있다. 벡터는 또한 자율적으로 복제하지 않는 네이키드 RNA 폴리뉴클레오타이드, 네이키드 DNA 폴리뉴클레오타이드, 동일한 가닥 내의 DNA 및 RNA 모두로 구성된 폴리뉴클레오타이드, 폴리-라이신-컨쥬게이드된 DNA 또는 RNA, 펩타이드-컨쥬게이드된 DNA 또는 RNA, 리포좀-컨쥬게이드된 DNA 등일 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "발현"은 기능적 최종 산물, 예를 들어 mRNA 또는 단백질(전구체 또는 성숙)의 생산을 의미한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 추가 폴리뉴클레오타이드의 전사를 초래하는 추가의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 의한 본 발명에 따른 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 순차적 배열을 의미한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 프로모터 서열은 유전자의 5'UTR 또는 오픈 리딩 프레임 직전에 삽입된다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열 및 유전자 서열은 하나 이상의 링커 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. CRISPR 프로토스페이서 및 프로토스페이서 인접 모티프(PAMs)의 문맥에서 용어 "작동 가능하게 연결된"은 CRISPR 엔도뉴클레아제 복합체에 의해 고효율로 절단될 수 있는 인접 배치된 프로토스페이서/PAM 조합 서열을 의미한다. 가이드 RNA/앱타머의 문맥에서 용어 "작동 가능하게 연결된"은 CRISPR 엔도뉴클레아제를 DNA 표적 부위에 모집할 수 있는 동시에 이의 앱타머 서열을 통해 제 2 이펙터 펩타이드를 모집할 수 있는(예를 들어, 앱타머에 의해 표적화된 전사 활성화 도메인을 모집할 수 있는) 가이드 RNA를 의미한다. 터미네이터 서열의 문맥에서 용어 "작동 가능하게 연결된"은 상류 서열의 전사를 종료하기 위한 터미네이터 서열의 배열을 의미한다. 일부 실시태양에서, 터미네이터 서열은 유전자 또는 오페론의 말단에 위치한다.
용어 "CRISPR RNA" 또는 "crRNA"는 표적 DNA 서열과의 혼성화 및 CRISPR 엔도뉴클레아제의 모집을 담당하는 RNA 가닥을 의미한다. crRNA는 자연 발생적이거나 RNA를 생산하는 임의의 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다.
용어 "가이드 서열" 또는 "스페이서"는 표적 DNA와의 혼성화를 담당하는 crRNA 또는 가이드 RNA(gRNA)의 일부분을 의미한다.
용어 "프로토스페이서"는 crRNA 또는 가이드 가닥에 의해 표적화된 DNA 서열을 의미한다. 일부 실시태양에서, 프로토스페이서 서열은 CRISPR 복합체의 crRNA 가이드 서열과 혼성화한다.
용어 "씨드 영역"은 DNA 서열 CRISPR 리보뉴클레오단백질 복합체 간의 초기 착물화를 담당하는 리보핵산 서열을 의미한다. 씨드 영역과 표적 DNA 서열 사이의 불일치는 crRNA/sgRNA 서열의 나머지 부분보다 표적 부위 인식 및 절단에 더 강한 영향을 미친다. 일부 실시태양에서, crRNA/gRNA의 씨드 영역에서의 단일 불일치는 CRISPR 복합체를 그 결합 부위에서 불활성으로 만들 수 있다. 일부 실시태양에서, Cas9 엔도뉴클레아제의 씨드 영역은 PAM에 인접한 프로토스페이서 표적 서열의 부분에 상응(혼성화)하는 가이드 서열의 3' 부분의 마지막 ~ 12nt를 따라 위치된다. 일부 실시태양에있어서, Cpf1 엔도뉴클레아제의 씨드 영역은 PAM에 인접한 프로토스페이서 표적 서열의 부분에 상응(혼성화)하는 가이드 서열의 5' 부분의 첫 번째 ~ 5nt를 따라 위치된다.
용어 "표적 부위"는, CRISPR의 문맥에서, 가이드 RNA(예를 들어, 단일 가이드 RNA 또는 tracrRNA)가 해당 씨드 영역과 복합체를 형성하여 가이드 RNA가 DNA의 해당 부분에 CRISPR 엔도뉴클레아제(활성 또는 기타)를 모집할 수 있게 되는 부위를 의미한다.
용어 "tracrRNA"는 작은 트랜스-암호화 RNA를 의미한다. TracrRNA는 crRNA와 상보적이고 염기 쌍을 이뤄 CRISPR 엔도뉴클레아제를 표적 서열에 모집할 수있는 crRNA/tracrRNA 하이브리드를 형성한다.
본 발명에 사용된 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 CRISPR 엔도뉴클레아제를 표적 서열에 모집할 수 있는 RNA 서열 또는 서열 조합을 의미한다. 따라서, 본 발명에 사용된 바와 같이, 가이드 RNA는 천연 또는 합성 crRNA(예를 들어, Cpf1의 경우), 천연 또는 합성 crRNA/tracrRNA 하이브리드(예를 들어, Cas9의 경우) 또는 단일 가이드 RNA(sgRNA)일 수 있다. 따라서 가이드 RNA를 암호화하는 발현 또는 뉴클레오티드를 언급하는 청구항은 별개의 분자로서 단일 가이드 RNA 서열, crRNA 및/또는 crRNA와 tracrRNA 모두의 발현/암호화를 지칭할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "CRISPR 랜딩 부위"는 CRISPR 복합체에 의해 표적화될 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 따라서, 일부 실시태양에서, CRISPR 랜딩 부위는 CRISPR 엔도뉴클레아제 복합체가 절단될 수 있는 인접 배치된 프로토스페이서/프로토스페이서 인접 모티프 조합 서열을 포함한다. 용어 "확증된 CRISPR 랜딩 부위"는 상기 서열의 고효율 절단을 유도할 수 있는 가이드 RNA가 존재하는 CRISPR 랜딩 부위를 의미한다. 따라서, 용어 확증된은 서열이 이전에 CRISPR 복합체에 의해 절단 가능한 것으로 입증되었다는 의미로 해석되어야 한다. 각각의 "확증된 CRISPR 랜딩 부위"는 정의에 의해 확증과 관련된 테스트된 가이드 RNA의 존재를 확인할 것이다. 용어 "확증된 CRISPR 랜딩 부위"는 랜딩 부위가 고효율 및 신뢰할 수 있는 DNA 절단 표적 역할을 하는 명시적인 목적으로 DNA 서열에 인위적으로 디자인되고 추가되었음을 의미하는 것으로 추가로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 "확증된 CRISPR 랜딩 부위"는 원래 CRISPR 표적화 부위로 디자인되지 않았지만 나중에 플라스미드의 영역을 표적화하는 맞춤형 CRISPR 복합체의 생성을 통해 절단되는 이전에 존재하는 플라스미드의 서열을 제외한다.
용어 "점착성 말단(들)"은 서열 오버행을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자 말단을 의미한다. 일부 실시태양에서, 점착성 말단은 5' 또는 3' 서열 오버행을 갖는 dsDNA 분자 말단일 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 점착성 말단은 동일 또는 다른 분자의 양립 가능한 점착성 말단과 혼성화할 수 있다. 따라서, 한 실시태양에서, 제 1 DNA 단편의 3' 상의 점착성 말단은 제 2 DNA 단편 상의 양립 가능한 점착성 말단과 혼성화될 수 있다. 일부 실시태양에서, 이들 혼성화 점착성 말단은 리가아제에 의해 함께 봉합될 수 있다. 다른 실시태양에서, 점착성 말단은 결찰 전에 dsDNA 분자를 완성하기 위해 오버행의 연장을 필요로 할 수 있다. 용어 "유전적 흔적(들)"은 DNA 조작 방법에 의해 핵산 서열에 도입된 임의의 바람직하지 않은 서열을 의미한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 제한 효소 결합 부위, 복제를 수용하기 위한 서열 어탭터 또는 스페이서, TA 부위, NHEJ로부터 남겨진 흔적 등과 같은 유전적 흔적을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 흔적없는 복제 및 유전자 편집을 교시한다.
본 발명에 사용된 용어 "표적화된"은 하나의 품목 또는 분자가 비 표적 품목 또는 분자를 배제하기 위해 특이성의 정도로 다른 품목 또는 분자와 상호 작용할 것이라는 기대를 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 따른, 제 2 폴리뉴클레오타이드에 대해 표적화된 제 1 폴리뉴클레오타이드는 서열 특이적 방식으로 (예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍을 통해) 제 2 폴리뉴클레오티드와 혼성화하도록 디자인되었다. 일부 실시태양에서, 혼성화의 선택된 영역은 혼성화를 하나 이상의 표적화된 영역에 특유하게 하도록 디자인된다. 제 2 폴리뉴클레오타이드는 그의 표적화 서열(혼성화 영역)이 돌연변이되거나 그렇지 않으면 제 2 폴리뉴클레오타이드로부터 제거/분리된다면, 제 1 표적화 폴리뉴클레오티드의 표적이 되는 것을 중지시킬 수 있다.
본 발명은 "메가모듈식" 구조체 또는 디자인으로서 교시되고 기술된 범용 모듈식 CRISPR DNA 구조체 또는 디자인을 의미한다.
DNA 뉴클레아제
일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 뉴클레아제를 이용한 유전자 편집/복제를 위한 방법 및 조성물을 교시한다. CRISPR 복합체, 전사 활성제 유사 작용제 뉴클레아제(TALENs), 아연 핑거 뉴클레아제(ZFNs) 및 FokI 제한 효소는 유전자 편집 도구로 사용된 서열 특이성 뉴클레아제의 일부이다. 이들 효소는 관심 서열을 인식하도록 조작된 가이드 영역과의 상호 작용을 통해 원하는 표적 유전자좌에 그들의 뉴클레아제 활성을 표적화할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 CRISPR-기반 유전자 편집 방법을 교시한다.
생체내 CRISPR-기반 편집의 원리는 주로 천연 세포 DNA 복구 시스템에 의존한다. 뉴클레아제에 의해 도입된 이중 가닥 dsDNA 절단은 비 상동성 말단 결합(NHEJ) 또는 상동성 직접 수선(HDR) 또는 단일 가닥 어닐링(SSA) 또는 미세상동 말단 결합(MMEJ)에 의해 복구된다.
HDR은 DNA 절단의 표적화된 부위를 둘러싸는 영역에 상동성인 서열을 함유하는 주형 DNA에 의존한다. 세포 수리 단백질은 외인성으로 공급된 또는 내인성 DNA 서열과 dsDNA 절단을 복구하기 위한 DNA 절단 주위 부위 사이의 상동성을 사용하여 절단을 주형 DNA 상의 서열로 대체한다. 그러나 주형 DNA를 통합하는데 실패는 NHEJ, MMEJ 또는 SSA를 발생시킬 수 있다. NHEJ, MMEJ 및 SSA는 종종 표적 부위에서 뉴클레오타이드(indels)의 삽입 또는 결실을 수반하는 오류가 발생하기 쉬운 과정으로, 조기 정지 코돈의 프레임시프트 돌연변이 또는 삽입에 의한 게놈의 표적화된 영역의 유전자 녹아웃(silencing)을 초래한다. Cpf1 매개 편집은 또한 엔도뉴클레아제에 의해 생성된 오버행의 전통적인 혼성화와 이어지는 결찰을 통해 기능할 수 있다.
CRISPR 엔도뉴클레아제는 또한 본 발명의 이후 섹션에서 논의되는 바와 같이 생체외 DNA 조작에 유용하다.
CRISPR 시스템
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 및 CRISPR-관련(CRISPR-associated(cas)) 엔도뉴클레아제는 원래 바이러스 및 플라스미드 침입으로부터 보호하기 위해 박테리아 및 고세균에 의해 진화된 적응 면역 시스템으로서 발견되었다. 박테리아에서 자연적으로 발생하는 CRISPR/Cas 시스템은 하나 이상의 Cas 유전자와 이전에 만났던 바이러스 및 플라스미드에서 얻은 게놈 표적화 서열에 의해 분리된 염기 서열의 짧은 회문 반복체(스페이서라고 함)로 이루어진 하나 이상의 CRISPR 어레이로 구성된다. (Wiedenheft, B., et. al. Nature. 2012; 482:331; Bhaya, D., et. al., Annu. Rev. Genet. 2011; 45:231; and Terms, M.P. et. al., Curr. Opin. Microbiol. 2011; 14:321). 하나 이상의 CRISPR 유전자좌를 가진 박테리아와 고세균은 CRISPR 어레이의 근위 말단에서 외래 서열(프로토스페이서)의 짧은 단편을 숙주 염색체에 통합시킴으로써 바이러스 또는 플라스미드 공격에 대응한다. CRISPR 유전자좌의 전사는 이전에 만났던 침입하는 핵산과 상보적인 서열을 함유하는 CRISPR 유래 RNA(crRNA)의 라이브러리를 생성한다(Haurwitz, R.E., et. al., Science. 2012:329;1355; Gesner, E.M., et. al., Nat. Struct. Mol. Biol. 2001:18;688; Jinek, M., et. al., Science. 2012:337; 816-21). crRNA에 의한 표적 인지는 Cas 단백질에 의한 외래 서열의 절단을 지시하는 표적 DNA와의 상보적 염기쌍을 통해 일어난다. (Jinek et. al. 2012 "A Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Science. 2012:337; 816-821).
적어도 5개의 주요 CRISPR 시스템 유형(유형 I, II, III, IV 및 V) 및 적어도 16개의 별개의 아형이 존재한다(Makarova, K.S., et al., Nat Rev Microbiol. 2015. Nat. Rev. Microbiol. 13, 722-736). CRISPR 시스템은 또한 이펙터 단백질에 따라 분류된다. 클래스 1 시스템은 다중 서브 유닛 crRNA-이펙터 복합체를 보유하는 반면, 클래스 2 시스템에서 이펙터 복합체의 모든 기능이 단일 단백질(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)에 의해 수행된다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 유형 II 및/또는 유형 V 단일-서브유닛 이펙터 시스템을 사용하는 것을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 클래스 2 CRISPR 시스템들을 사용하여 교시한다.
CRISPR/Cas9
일부 실시태양에서, 본 발명은 유형 II CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 편집 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 유형 II CRISPR 시스템은 Cas9 효소를 사용한다. 유형 II 시스템은 i) 단일 엔도뉴클레아제 단백질, ii) 트랜스활성화 crRNA(tracrRNA), 및 iii) crRNA의 5' 말단의 ~ 20 뉴클레오타이드(nt) 부분이 표적 핵산에 상보적인 crRNA에 의존한다. 표적 DNA 프로토스페이서에 상보적인 CRISPR crRNA 가닥의 영역은 본 발명에서 "가이드 서열"이라고 불린다.
일부 실시태양에서, 유형 II 시스템의 tracrRNA 및 crRNA 성분은 단일 가이드 RNA(sgRNA)로 대체될 수 있다. sgRNA는, 예를 들어, 표적 DNA 서열(가이드 서열)에 상보적인 적어도 12-20개 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고 이의 3' 말단에 공통 스캐폴드 RNA 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용된 "공통 스캐폴드 RNA"는 tracrRNA 서열을 모방하는 임의의 RNA 서열 또는 tracrRNA로서 기능하는 임의의 RNA 서열을 의미한다.
Cas9 엔도뉴클레아제는 평활 말단 DNA 절단을 생산하고 crRNA 및 tracrRNA 올리고머의 조합에 의해 표적 DNA에 모집되며, 이것이 RNA CRISPR 복합체의 상보적 혼성화를 통해 엔도뉴클레아제를 연결한다. (도 1a의 검은 색 삼각형 화살표 참조).
일부 실시태양에서, crRNA/엔도뉴클레아제 복합체에 의한 DNA 인식은 표적 프로토스페이서로부터의 하류인 표적 DNA의 3' 부분에 위치된 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif(PAM))(예를 들어, 5'-NGG-3')와의 추가적인 상보적인 염기쌍을 필요로 한다. (Jinek, M., et. al., Science. 2012:337;816-821). 일부 실시태양에서, Cas9에 의해 인식되는 PAM 모티프는 상이한 Cas9 단백질에 대해 다양하다.
일부 실시태양에서, 당업자는 본 발명에 개시된 Cas9가 임의의 공급원으로부터 유도되거나 분리된 임의의 변이체일 수 있음을 인식할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 Cas9 펩타이드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 6로부터 선택된 하나 이상의 SEQ ID NOs를 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 Cas9 펩타이드는 Fonfara et al. Nucleic Acids Res.　2014 Feb;42(4):2577-90; Nishimasu H. et al. Cell.　2014 Feb 27;156(5):935-49; Jinek M. et al. Science.　2012 337:816-21; 및 Jinek M. et al. Science.　2014 Mar 14;343(6176)에 기술된 기능성 돌연변이를 포함하나 이에 제한되지 않는 문헌에 기술된 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고; 또한 본 발명에 참조로 포함되는 2013년 3월 15일에 출원된 미국 특허 출원 제 13/842,859호 참조; 또한, 본 발명에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,697,359호; 제8,771,945호; 제8,795,965호; 제8,865,406호; 제8,871,445호; 제8,889,356호; 제8,895,308호; 제8,906,616호; 제8,932,814호; 제8,945,839호; 제8,993,233호; 및 제8,999,641호에 참조. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 시스템 및 방법은 이중 가닥 뉴클레아제 활성을 갖는 야생형 Cas9 단백질, 단일 가닥 뉴클레아제로서 작용하는 Cas9 돌연변이체 또는 변형된 뉴클레아제 활성을 갖는 다른 돌연변이체와 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 본 문서의 이후 섹션에서 더 상세히 설명되는 바와 같이 촉매적으로 불활성화된 Cas9 돌연변이체의 사용을 추가로 구상한다. 일부 실시태양에서, 용어 "촉매적으로 불활성화된" 또는 "촉매적으로 불활성" CRISPR은 DNAase 촉매 도메인이 비 기능적(즉, 효소가 더 이상 DNA를 절단하지 않는다)인 CRISPR 단백질을 지칭한다. 따라서 일부 실시태양에서, 본 발명은 dCas9 돌연변이체를 교시한다. Cas9에서 뉴클레아제를 감소 또는 제거하는 돌연변이의 비 제한적인 목록은 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 또는 A987, 또는 Cas9 동족체 또는 오르쏘로그의 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 돌연변이(들)는 임의의 천연(예를 들어, 알라닌) 또는 비 천연 아미노산에 의한 치환 또는 결실을 포함할 수 있다. 예시적인 뉴클레아제 결함 dCas9 단백질은 Cas9D10A & H840A이다(Jinek, et al., Science. 2012 Aug. 17; 337(6096):816-21; Qi, et al., Cell. 2013 Feb. 28; 152(5):1173-83). dCas9 변이체의 비 제한적인 목록은 표 1에 제공된다.
dCas9 벡터의 무제한 목록
플라스미드 유전자/삽입체 프로모터 선택 가능한 마커 공보
식물 　 　 　
pYPQ153 pco-dCas9-3X(SRDX) (Plant codon-optimized) (Other) 　 　 A CRISPR/Cas9 toolbox for multiplexed plant genome editing and transcriptional regulation.　Plant Physiol. 2015 Aug 21. pii: pp.00636.2015.
pYPQ233 (dLbCpf1-SRDX) LbCpf1-SRDX (Other) 　 　 A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants.　Nat Plants. 2017 Feb 17;3:17018. doi: 10.1038/nplants.2017.18.
pYPQ223 (dAsCpf1-SRDX) dAsCpf1-SRDX (Other) 　 　 A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants.　Nat Plants. 2017 Feb 17;3:17018. doi: 10.1038/nplants.2017.18.
pHSN6I01 dCas9-KRAB (Synthetic), gRNA scaffold (Synthetic) 2Х35Sp, AtU6-26p Hygromycin A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.　BMC Plant Biol. 2014 Nov 29;14(1):327.
pMOD_A0801 Csy4-P2A-AtCas9_dead (D10A + H840A) (Synthetic) 35S 　 A multi-purpose toolkit to enable advanced genome engineering in plants.　Plant Cell. 2017 May 18. pii: tpc.00922.2016. doi: 10.1105/tpc.16.00922.
pBUN6I11 dCas9-KRAB (Synthetic), gRNA scaffold (Synthetic) Ubi1p, OsU3p Bar A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.　BMC Plant Biol. 2014 Nov 29;14(1):327.
pHdzCas9-KRAB 　 CaMV35S Hygromycin CRISPRi mediated phosphoenolpyruvate carboxylase regulation to enhance the production of lipid in Chlamydomonas reinhardtii.　Bioresour Technol. 2017 May 4. pii: S0960-8524(17)30619-3. doi: 10.1016/j.biortech.2017.04.111.
pMOD_A0402 AtCas9_dead (D10A + H840A) (Synthetic) AtUbi10 　 A multi-purpose toolkit to enable advanced genome engineering in plants.　Plant Cell. 2017 May 18. pii: tpc.00922.2016. doi: 10.1105/tpc.16.00922.
pEGB 35S:dCas9:Tnos (GB1191) dCas9 (Other) 35S 　 GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology.　Plant Physiol. 2013 Jul;162(3):1618-31.
pMOD_A1810 Csy4-P2A-TaCas9_dead (D10A + H840A) (Synthetic) ZmUbi 　 A multi-purpose toolkit to enable advanced genome engineering in plants.　Plant Cell. 2017 May 18. pii: tpc.00922.2016. doi: 10.1105/tpc.16.00922.
포유류 　 　 　
pHR-SFFV-KRAB-dCas9-P2A-mCherry KRAB-dCas9-P2A-mCherry fusion (Homo sapiens) SFFV mCherry Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.　Cell. 2014 Oct 23;159(3):647-61. doi: 10.1016/j.cell.2014.09.029. Epub 2014 Oct 9.
pHR-SFFV-dCas9-BFP-KRAB dCas9-BFP-KRAB fusion (Homo sapiens) SFFV 　 CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes.　Cell. 2013 Jul 9. pii: S0092-8674(13)00826-X. doi: 10.1016/j.cell.2013.06.044.
pLV hU6-sgRNA hUbC-dCas9-KRAB-T2a-GFP humanized dCas9-KRAB T2A GFP (Other), sgRNA 　 　 Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.Nat Methods. 2015 Dec;12(12):1143-9. doi: 10.1038/nmeth.3630. Epub 2015 Oct 26.
pLV hU6-sgRNA hUbC-dCas9-KRAB-T2a-Puro humanized dCas9-KRAB T2A Puro (Other), sgRNA 　 Puromycin Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.Nat Methods. 2015 Dec;12(12):1143-9. doi: 10.1038/nmeth.3630. Epub 2015 Oct 26.
pHAGE EF1α dCas9-KRAB dCas9 (Other) EF1alpha Puromycin Cas9 effector-mediated regulation of transcription and differentiation in human pluripotent stem cells.Development. 2014 Jan;141(1):219-23. doi: 10.1242/dev.103341.
Cas9m4 Cas9m4 (Other) 　 　 CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering.　Nat Biotechnol. 2013 Aug 1. doi: 10.1038/nbt.2675.
pHAGE TRE dCas9-KRAB dCas9 (Other) TRE Neomycin (select with G418) Cas9 effector-mediated regulation of transcription and differentiation in human pluripotent stem cells.Development. 2014 Jan;141(1):219-23. doi: 10.1242/dev.103341.
pSLQ1658-dCas9-EGFP dCas9 fuse to EGFP (Homo sapiens) MSCV LTR promoter Puromycin Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System.　Cell. 2013 Dec 19;155(7):1479-91. doi: 10.1016/j.cell.2013.12.001.
pHR-SFFV-dCas9-BFP dCas9-BFP fusion (Homo sapiens) SFFV 　 CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes.　Cell. 2013 Jul 9. pii: S0092-8674(13)00826-X. doi: 10.1016/j.cell.2013.06.044.
pLV hUbC-dCas9-T2A-GFP humanized dead Cas9 T2A GFP (Other) hUbC Zeocin Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.　Nucleic Acids Res. 2014 Aug 13. pii: gku749.
박테리아 　 　 　
pdCas9-bacteria dCas9 (bacteria) (Other) pLtetO-1 　 Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression.　Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83. doi: 10.1016/j.cell.2013.02.022.
pdCas9 tracrRNA (Other), dcas9 (Other), CRISPR array 　 　 Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system.　Nucleic Acids Res. 2013 Jun 12.
pMJ841 Cas9 (Other) T7 　 A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.　Science. 2012 Jun 28.
pET302-6His-dCas9-Halo His6-dCas9-Halo (Synthetic) 　 　 CASFISH: CRISPR/Cas9-mediated in situ labeling of genomic loci in fixed cells.　Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Sep 22;112(38):11870-5. doi: 10.1073/pnas.1515692112. Epub 2015 Aug 31.
10xHis-MBP-TEV-S. pyogenes dCas9 M1C D10A C80S H840A C574S dCas9 M1C D10A C80S H840A C574S (Other) 　 　 Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.　Nature. 2014 Sep 28. doi: 10.1038/nature13769.
pJMP1 dCas9 (Other) xylA 　 A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria.　Cell. 2016 Jun 2;165(6):1493-506. doi: 10.1016/j.cell.2016.05.003. Epub 2016 May 26.
pCRISPathBrick 　 Constitutive native promoters 　 CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli.　ACS Synth Biol. 2015 Mar 30.
pZ8-T_dCas9 dcas9 ptac 　 Corynebacterium glutamicum Metabolic Engineering with CRISPR Interference (CRISPRi).　ACS Synth Biol. 2016 Feb 16.
DS-SPcasN- Cas9, nuclease-null (Other), tracrRNA precursor (Other) proC, tracdrRNA promoter 　 Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing.　Nat Methods. 2013 Sep 29. doi: 10.1038/nmeth.2681.
pSET-dCas9-actII-4-NT-S1 dCas9 (Synthetic), sgRNA ermE*p, J23119 　 CRISPR/dCas9-Mediated Multiplex Gene Repression in Streptomyces.　Biotechnol J. 2018 Jun 3. doi: 10.1002/biot.201800121.
효모 　 　 　
pTDH3-dCas9-Mxi1 dCas9-Mxi1 TDH3 LEU2 CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes.　Cell. 2013 Jul 9. pii: S0092-8674(13)00826-X. doi: 10.1016/j.cell.2013.06.044.
pTDH3-dCas9 dCas9 TDH3 LEU2 CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes.　Cell. 2013 Jul 9. pii: S0092-8674(13)00826-X. doi: 10.1016/j.cell.2013.06.044.
pRS416-dCas9-Mxi1 + TetR + pRPR1(TetO)-NotI-gRNA dCas9-Mxi1 (Synthetic), Tet Repressor (Other), Structural gRNA for S pyogenes (Synthetic) pTef1, pGPM1, pRPR1(TetO) URA3 Quantitative CRISPR interference screens in yeast identify chemical-genetic interactions and new rules for guide RNA design.　Genome Biol. 2016 Mar 8;17(1):45. doi: 10.1186/s13059-016-0900-9.
pCRISPRi_Mxi1_yl_NHEJ Codon optimized dCas9-Mxi1 (Synthetic), KU70 sgRNA expression cassette (Synthetic), KU80a sgRNA expression cassette (Synthetic), KU80b sgRNA expression cassette (Synthetic) UAS1B8-TEF(136), SCR1'-tRNA, SCR1'-tRNA, SCR1'-tRNA LEU2 CRISPRi repression of nonhomologous end-joining for enhanced genome engineering via homologous recombination in Yarrowia lipolytica.Biotechnol Bioeng. 2017 Aug 19. doi: 10.1002/bit.26404.
pCRISPRi_Mxi1_yl Codon optimized dCas9-Mxi1 (Synthetic), sgRNA expression cassette (Synthetic) UAS1B8-TEF(136), SCR1'-tRNA LEU2 CRISPRi repression of nonhomologous end-joining for enhanced genome engineering via homologous recombination in Yarrowia lipolytica.Biotechnol Bioeng. 2017 Aug 19. doi: 10.1002/bit.26404.
pTPGI_dCas9 Yeast-optimized dCas9 (Saccharomyces cerevisiae) pTPGI TRP1 Tunable and Multifunctional Eukaryotic Transcription Factors Based on CRISPR/Cas.ACS Synth Biol. 2013 Sep 11.
pJZC518 dCas9 (Other) pTdh3 LEU2 Engineering Complex Synthetic Transcriptional Programs with CRISPR RNA Scaffolds.　Cell. 2014 Dec 18. pii: S0092-8674(14)01570-0. doi: 10.1016/j.cell.2014.11.052.
CRISPR/Cpf1
다른 실시태양에서, 본 발명은 유형 V CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 편집 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 프레보텔라 및 프란시셀라( P revotella and F rancisella) 1(Cpf1)의 CRISPR을 사용하는 방법을 교시한다.
본 발명의 Cpf1 CRISPR 시스템은 i) 단일 엔도뉴클레아제 단백질, 및 ii) crRNA의 3' 말단의 일부가 표적 핵산에 상보적인 가이드 서열을 함유하는 crRNA를 포함한다. 이 시스템에서, Cpf1 뉴클레아제는 crRNA에 의해 표적 DNA에 직접 모집된다(도 1b의 검은 색 삼각형 화살표 참조). 일부 실시태양에서, Cpf1에 대한 가이드 서열은 검출 가능한 DNA 절단을 달성하기 위해 적어도 12nt, 13nt, 14nt, 15nt 또는 16nt이어야 하고, 효율적인 DNA 절단을 달성하기 위해 최소 14nt, 15nt, 16nt, 17nt 또는 18nt이어야 한다.
본 발명의 Cpf1 시스템은 다양한 방식으로 Cas9와 상이하다. 첫 번째, Cas9와는 달리, Cpf1은 분열을 위한 별도의 tracrRNA를 필요로 하지 않는다. 일부 실시태양에서, Cpf1 crRNA는 길이가 약 42-44 염기 정도로 짧을 수 있으며, 그 중 23-25nt는 가이드 서열이고 19nt는 구조적 직접 반복체 서열이다. 대조적으로, Cas9 tracrRNA 및 crRNA 합성 서열의 결합은 약 100 염기 길이일 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 "가이드 RNA"로서 Cpf1에 대한 crRNA를 언급할 것이다.
두 번째, Cpf1은 이의 표적의 5' 상류에 위치한 "TTN" PAM 모티프를 선호한다. 이것은 Cas9 시스템의 표적 DNA의 3' 상에 위치한 "NGG" PAM 모티프와는 대조적이다. 일부 실시태양에서, 가이드 서열 직전의 우라실 염기는 치환될 수 없다(모든 목적을 위해 그 전체가 참조 문헌으로 본 발명에 포함되는 Zetsche, B. et al. 2015. "Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System" Cell 163, 759-771).
세 번째로, Cpf1 절단 부위는 약 3-5개 염기에 의해 엇갈리게 배치되어 "끈끈한 말단"을 만든다(2016년 6월 온라인 발행된 Kim et al., 2016. "Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells"). ~3-5nt 오버행을 갖는 이 점착성 말단은 NHEJ 매개 결찰을 촉진하고, 말단이 일치하는 DNA 단편의 유전자 편집을 향상시키는 것으로 생각된다. 절단 부위는 PAM이 있는 5' 말단에 대해 멀리 있는 표적 DNA의 3' 말단에 있다. 절단 위치는 대개 비 혼성화 가닥 상의 18번째 염기와 crRNA에 혼성화된 상보적 가닥 상의 상응하는 23번째 염기를 따른다(도 1b).
넷째, Cpf1 복합체에서, "씨드" 영역은 가이드 서열의 처음 5nt 내에 위치한다. Cpf1 crRNA 씨드 영역은 돌연변이에 매우 민감하며 이 영역에서의 단일 염기 치환조차도 절단 활성을 크게 감소시킬 수 있다(Zetsche B. et al. 2015 "Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System" Cell 163, 759-771 참조). 비판적으로, Cas9 CRISPR 표적과 달리, Cpf1 시스템의 절단 부위 및 씨드 영역은 중첩되지 않는다. 올리고스를 표적으로 하는 Cpf1 crRNA를 디자인하는 것에 대한 추가 지침은 (Zetsche B. et al. 2015. "Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System" Cell 163, 759-771)에서 이용 가능하다.
당업자는 본 발명에 개시된 Cpf1이 임의의 공급원으로부터 유도되거나 분리 된 임의의 변이체일 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 Cpf1 펩타이드는 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 하나 이상의 SEQ ID Nos를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 문서의 이후 섹션에서 더 상세히 설명되는 바와 같이 촉매적으로 불활성화된 Cpf1 돌연변이체의 사용을 추가로 구상한다. 따라서 일부 실시태양에서, 본 발명은 dCpf1 돌연변이체를 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 dCpf1은 ddCpf1(Zhang et al. "Multiplex gene regulation by CRISPR ddCpf1" Cell Discovery 3, Article number 17018 (2017); 프란시엘라 노비시다(Francisella novicida)(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN)), 라치노스피라세애(Lachnospiraceae) 박테리아(UniProtKB-A0A182DWE3(A0A182DWE3_9FIRM)) 및 아시다미노콕커스 종(Acidaminococcus sp.)(UniProtKB-U2UMQ6(CPF1 ACISB))을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 dCpf1은 촉매 도메인 AsCpf1을 돌연변이시킴으로써 생성된다(D908A Yamano, T., Nishimasu, H., Zetsche, B., Hirano, H., Slaymaker, I. M., Li, Y., Fedorova, I., Nakane, T., Makarova, K. S., Koonin, E. V. et al. (2016) Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA.　Cell,　165, 949-962).
리가아제
일부 실시태양에서, 본 발명은 표적화된 Cpf1 복합체를 통해 표적 DNA를 절단한 다음, 생성된 점착성 말단을 DNA 삽입체와 결찰시키는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 표적 DNA를 절단하는 Cpf1 복합체 및 DNA를 다시 "봉합"하는 리가아제를 제공하는 방법을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 연결된 리가아제 효소를 포함하는 변형된 Cpf1 복합체를 교시한다.
본 발명에 사용된 용어 "리가아제"는 임의의 수의 효소 또는 비 효소 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리가아제는 적절한 조건하에서 DNA 분자, RNA 분자 또는 하이드리드의 인접한 뉴클레오타이드의 3'-OH와 5'-포스페이트 사이에 포스포다이에스터 결합을 형성하는 효소적 결찰 시약 또는 촉매이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 효소적 리가아제의 사용을 교시한다. 양립 가능한 온도 민감성 효소적 리가아제는 박테리오파지 T4 리가아제 및 대장균 리가아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 열 안정성 리가아제는 Afu 리가아제, Taq 리가아제, Tfl 리가아제, Tth 리가아제, Tth HB8 리가아제, 써머스(Thermus) 종 AK16D 리가아제 및 Pfu 리가아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다(예를 들어 공개된 PCT 출원 WO/2000/026381, Wu et al., Gene, 76(2):245-254, (1989), 및 Luo et al., Nucleic Acids Research, 24(15): 3071-3078 (1996)). 당업자는 임의의 수의 열 안정성 리가아제는 호열성 또는 과호열성 유기체, 예를 들어 진균 및 고세균의 특정 종으로부터 얻을 수 있음과 이런 리가아제가 개시된 방법 및 키트에 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시태양에서, 가역적으로 불활성화된 효소(예를 들어, 미국 특허 제5,773,258호 참조)가 본 발명의 일부 실시태양에서 사용될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 화학적 결찰제의 사용을 교시한다. 화학적 결합제는 카보다이이미드, 시아노겐 브로마이드(BrCN), N-사이아노이미다졸, 이미다졸, 1-메틸이미다졸/카보다이이미드/시스타민, 다이티오트레이톨(DTT) 및 자외선과 같은 활성제, 축합제 및 환원제를 제한없이 포함한다. 자동 결찰, 즉 결찰제 부재 하에서의 자발적 결찰도 또한 본 발명의 교시의 범위 내에 있다. 화학적 결찰 방법에 대한 상세한 프로토콜 및 적절한 반응성 그룹에 대한 설명은, 다른 곳 중에서, Xu et al., Nucleic Acid Res., 27:875-81 (1999); Gryaznov and Letsinger, Nucleic Acid Res. 21:1403-08 (1993); Gryaznov et al., Nucleic Acid Res. 22:2366-69 (1994); Kanaya and Yanagawa, Biochemistry 25:7423-30 (1986); Luebke and Dervan, Nucleic Acids Res. 20:3005-09 (1992); Sievers and von Kiedrowski, Nature 369:221-24 (1994); Liu and Taylor, Nucleic Acids Res. 26:3300-04 (1999); Wang and Kool, Nucleic Acids Res. 22:2326-33 (1994); Purmal et al., Nucleic Acids Res. 20:3713-19 (1992); Ashley and Kushlan, Biochemistry 30:2927-33 (1991); Chu and Orgel, Nucleic Acids Res. 16:3671-91 (1988); Sokolova et al., FEBS Letters 232:153-55 (1988); Naylor and Gilham, Biochemistry 5:2722-28 (1966); 및 U.S. Pat. No. 5,476,930에서 발견할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 또한 광결찰 반응과 양립 가능하다. 적절한 파장의 광을 결찰제로 사용하는 광결찰도 이 교시의 범위 내에 있다. 일부 실시태양에서, 광결찰은 4-티오티미딘, 5-바이닐우라실 및 이의 유도체 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 프로브를 포함한다. 일부 실시태양에서, 결합제는 (a) UV-A 범위(약 320nm 내지 약 400nm), UV-B 범위(약 290nm 내지 약 320nm), 또는 이들의 조합 (b) 약 300nm 내지 약 375nm의 파장을 갖는 광, (c) 약 360nm 내지 약 370nm의 파장을 갖는 광; (d) 약 364nm 내지 약 368nm의 파장을 갖는 광, 또는 (e) 약 366nm의 파장을 갖는 광을 포함한다. 일부 실시태양에서, 광결찰은 가역적이다. 광결찰의 설명은, 다른 곳 중에서, Fujimoto et al., Nucl. Acid Symp. Ser. 42:39-40 (1999); Fujimoto et al., Nucl. Acid Res. Suppl. 1:185-86 (2001); Fujimoto et al., Nucl. Acid Suppl., 2:155-56 (2002); Liu and Taylor, Nucl. Acid Res. 26:3300-04 (1998) and on the world wide web at: sbchem.kyoto-u.ac.jp/saito-lab에서 발견할 수 있다.
범용 모듈식 CRISPR DNA 구조체 및 이의 용도
일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 구조체의 모듈식 조립을 위한 전략을 기술한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 DNA 조립 방법은 플라스미드, 작은 선형 DNA 및 형질전환된 염색체 유전자좌를 포함하는 임의의 구조체에 적용 가능하다.
양태들에서, 발명자들은 "범용 모듈식 CRISPR DNA 구조체"를 "메가모듈식 (MegaModular)" 디자인으로 언급한다.
전통적인 DNA 편집 및 조립 기술의 단점
전통적인 다성분 DNA 복제 전략은 복잡한 서열을 갖는 다중 성분 DNA 구조체를 효과적으로 조립 및 변형시키는 능력이 제한적이다. 예를 들어, 제한 효소 복제는 각 DNA 삽입체의 복제 접합부 및 최종 벡터 내에서의 목적 부위에 적절하게 위치한 특유의 제한 효소 인식 부위의 이용 가능성에 의해 제한된다. 게이트웨이 복제 기술은 다성분 조립에 이용될 수 있는 비교적 적은 수의 특유의 재조합 부위에 의해 유사하게 제한된다.
전통적인 DNA 조립 기술에 대한 또 다른 단점은 서열을 편집할 수 있는 능력이 종종 제작 시간에 제한된다는 것이다. 예를 들어, 리가아제 순환 반응과 같은 효율적인 조립 전략의 생산물(LCR은 초기 조립이 완료되면 쉽게 변형되지 않는다(Kok, S, et al., 2014 "Rapid and Reliable DNA assembly via Ligase Cycling Reaction" ACS Synth. Biol., 3 (2): 97-106). 일반적인 제한 인식 부위가 제한 부위를 함유하는 폴리뉴클레오타이드가 조립되는 구조체 속에 삽입되거나 구조체가 상기 부위의 염색체 속에 통합될 때 독특한 복제 지점으로서 기능하는 것을 중지하는 전통적인 제한 효소 복제에 의해 유사한 우려가 나타난다. 따라서 연속적인 제한 복제를 통해 생산된 벡터는 복제 과정이 잘 진행되면 서열을 고정하거나 업데이트하는데 매우 적은 옵션을 제공한다.
종래의 CRISPR DNA 조립 기술과 같은 더 새로운 기술조차도 유사한 복잡성, 이전에 조립된 구조체/벡터 디자인에 대한 반복의 용이성 및 속도 제한으로 어려움을 겪고 있다(Wang, JW. et al., 2015 "CRISPR/Cas9 nuclease combined with Gibson assembly for seamless cloning" BioTechniques, Vol 58, No. 4:161-170). CRISPR 복제는 양립 가능한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 옆에 표적화된 기능성 가이드 RNA의 디자인이 필요하다. 표적 부위 내 적합한 PAM 서열의 이용 가능성은 게놈 또는 구조체 내의 가능한 DNA 삽입 위치의 수에 대한 중요한 디자인 제한을 초래한다.
더욱이, 가이드 RNA 서열의 디자인 및 테스트는 다성분 조립에 대한 중요한 기술적 도전을 부과한다. 당업자는 예를 들어, 모든 gRNA 서열이 기능적이지는 않으며, CRISPR DNA 조립의 효과적인 구현은 종종 다중 gRNA 서열 변이체의 디자인 및 검증을 필요로 한다는 것을 인식할 것이다. 이러한 제한은 원하는 변형을 성공적으로 일으키는 단일 gRNA 서열의 고장이 원래 복제 계획에 더 이상 포함되지 않는 후속 조립 성분을 재디자인할 필요성을 야기할 수 있는 다성분 조립에서 특히 부담이 된다. 따라서 다성분 조립의 모든 접합부에 대해 다수의 주문형 가이드 RNA를 필요로 하는 기술을 적용하는 것은 또한 매우 고가이고, 부담이 되고, 비실용적일 수 있다.
모듈식 CRISPR 태그 조립 벡터 및 이의 사용 방법
일부 실시태양에서, 본 발명은 상기 전술한 전통적인 기술과 관련된 많은 제한을 극복하는 DNA 조립 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 본 발명의 방법과 함께 사용하기 위한 모듈식 CRISPR 조립 구조체, 조성물 및 키트를 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 CRISPR 다중 복제 부위(cMCS)를 포함하는 DNA 구조체를 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 cMCS는 기술된 DNA 구조체의 단지 일부를 나타낸다(즉, 구조체의 일부만이 본 발명의 방법에 따라 쉽게 편집 가능하다). 다른 실시태양에서, 본 발명의 cMCS는 전체 구조체 내의 주요 위치 상에 위치되어, 전체 DNA 구조체가 쉽게 편집 가능하다. 따라서, 일부 실시태양에서, 모듈식 cTAG 벡터의 모든 기능적 부분(예를 들어, 모든 기원, 마커, 화물, 조립에 필요한 요소)은 삽입체 DNA 부분 내에 포함되며 본 발명의 유전자 편집 방법을 통해 쉽게 교환될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 cMCS는 적어도 하나의 확증된 CRISPR 표적화 부위를 각각 포함하는 하나 이상의 복제 태그(cTAG)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 cMCS는 각각 한 쌍의 cTAG가 측면에 위치되는 DNA 삽입체 부분을 추가로 포함하여, 하나 이상의 cTAG를 표적으로 하는 하나 이상의 CRISPR 엔도뉴클레아제를 갖는 cMCS의 분해가 상기 측면에 위치된 삽입체 부분을 방출하여, 양립 가능한 도너 DNA 부분의 삽입을 허용할 것이다.
본 명세서의 도 2 및 3은 본 발명의 방법에 따른 모듈식 CRISPR 조립 플라스미드 구조체의 한 실시태양을 도시한다. 개시된 예시적 플라스미드는 각각 도 2a의 한 쌍의 cTAG(태그 A-H)에 의해 측면에 위치되는 일련의 DNA 삽입(도 2a의 파트 1-8)을 함유한다. 적절한 CRISPR/가이드 서열 복합체를 갖는 본 실시예의 cTAG A 및 B의 분해는 플라스미드의 파트 2를 방출하여 원하는 특성을 갖는 대체 파트 2 삽입체의 삽입을 가능하게 한다.
당업자는 생체내 및 생체외에서 벡터의 서열 특이적 모듈식 복제/편집을 가능하게 하는 현재 기술된 벡터 시스템의 이점을 즉각 인식할 것이다. 아래의 섹션은 개시된 모듈식 복제 벡터의 다양한 양태뿐만 아니라 분자 생물학, 유전자 치료 및 유전자 편집에 대한 이들의 다양한 응용을 약술할 것이다.
모듈식 CRISPR 벡터 삽입체 부분
일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 CRISPR 분해 후 상동성 재조합 삽입을 위한 도너 DNA 서열이다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분 서열은 서열의 상동성 재조합, 혼성화 및 삽입을 유발하기 위해, 분해된 모듈식 CRISPR 구조체의 말단에 충분한 상동성을 갖는 서열이 측면에 위치하는 관심 삽입체 서열을 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 점착성 말단(예를 들어, Cpf1 분해, 제한 효소 분해, 깁슨 조립, 또는 LCR을 포함하는 기타 혼성화 기반 조립 이후)을 통한 혼성화 및 결찰이 가능한 도너 DNA 서열이다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분 서열은 점착성 말단의 혼성화를 허용하기 위해 분해된 모듈식 CRISPR 구조체의 말단과 충분한 상동성을 갖는 서열이 측면에 위치하는 관심 삽입체 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 평활 말단 결찰을 위한 도너 DNA 서열이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 임의의 삽입체 부분 서열과 양립 가능하다. 따라서, 본 벡터의 부분은 선택 가능한 마커, 복제 기원, 프로모터, 터미네이터 서열; 다른 조절 서열, 바코드, 재조합 부위 또는 사용자에게 관심있는 다른 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 하나 이상의 유전자좌로의 상동성 재조합 및 삽입을 유발하기 위한 상동성 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 상동성 재조합 삽입체 부분은 재조합 사건을 통해 게놈으로 삽입될 다른 삽입체 부분에 선행하고 후행할 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 각 삽입체 부분이 단일 서열(예를 들어, 단지 프로모터 또는 단지 관심 유전자, 도 2a, 파트 8 참조)을 포함한다는 것을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 삽입체 부분이 관심 프로모터-유전자(GOI) 조합, 다중-아단위 키메라 단백질 융합체, 또는 심지어 전체 구조체와 같은 다중 요소(도 2a, 파트 5 참조, 프로모터-GOI-터미네이터 조합을 포함)를 함유할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 결합되지 않은 개별 삽입체 부분을 교시한다. 즉, 일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 또는 복수의 연결되지 않은 삽입체 부분을 교시한다(도 2a 참조, 우측은 결합되지 않은 삽입체 부분의 목록을 나타낸다). 일부 실시태양에서, 본 발명은 상기 복수의 부분을 하나 이상의 모듈식 CRISPR 구조체로 조립하는 방법을 교시한다. 일부 양태에서, 본 발명은 메가모듈식 구조체를 조립하기 위한 키트를 교시한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 부분적으로 또는 완전히 조립된 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 이상의 조립된 삽입체 부분 및 이들 사이의 임의의 범위를 포함하는 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시한다. 본 발명은 또한 상기 삽입체 부분을 포함하는 키트를 교시한다.
일부 실시태양에서, 상기 조립되거나 부분 조립된 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 선형이다. 일부 실시태양에서, 상기 조립되거나 부분 조립된 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 원형(예를 들어, 플라스미드)이다. 일부 실시태양에서, 상기 조립되거나 부분 조립된 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 게놈 DNA에 통합된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 구조체는 초기에 추가 복제를 위한 플레이스 홀더로서 단지 짧은 스페이서 서열만을 함유할 것이다(도 3c의 "스터퍼(stuffer)"서열 참조). 일부 실시태양에서, 삽입체 부분 플레이스홀더는 작고 무작위화된 서열이다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 초기에 하나 이상의 미리 선택된 삽입체 DNA 부분을 포함할 것이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 모듈식 CRISPR 구조체는 초기에 적어도 하나의 선택 가능한 마커 및/또는 적어도 하나의 복제 기점을 포함할 것이다.
적합한 선택 가능한 마커는 항생제 내성을 부여하는 유전자, 형광 단백질을 암호화하는 유전자, tRNA 유전자, 영양요구성 마커, 독성 유전자, 표현형 마커, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 제한 엔도뉴클레아제, 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위, 효소 절단 부위, 단백질 결합 부위 및 PCR 프라이머 서열에 상보적인 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
적절한 항생제 내성 유전자는 클로람페니콜 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 제오신 저항성 유전자, 스펙티노마이신 내성 유전자 및 카나마이신 내성 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 역선택 가능한 마커는 독성 유전자이다. 적절한 독성 유전자는 ccdB 유전자, 하나 이상의 ter 부위에 결합하는 tus 단백질을 암호화하는 유전자, kicB 유전자, sacB 유전자, ASK1 유전자, ΦX174 E 유전자 및 DpnI 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 독성 선택 가능한 마커의 존재는 삽입이 수행되지 않았거나 성공적이지 못한 지표로서 작용한다. 독성 선택 가능한 마커는 또한 여전히 독성 유전자가 있는 변형되지 않은 벡터를 보유하고 있는 세포에 사멸을 유발함으로써, 양성 세포의 비 변형 부모 벡터의 배경을 감소시키는 역할을 한다.
본 발명의 방법의 추가 실시태양에서, 모듈식 CRISPR 구조체는 하나 이상의 독성 유전자 및 하나 이상의 항생제 내성 유전자 모두를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 모듈식 CRISPR 구조체는 초기에 적어도 하나의 조절 서열을 포함할 것이다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 제한 없이, 매트릭스 부착 영역, 발현 인슐레이터 서열, 발현 인핸서 서열, 프로모터, 5'UTR, 3'UTR, 터미네이터 서열, 종지 코돈, 개시 코돈 등을 포함하는 벡터를 교시한다. 일부 실시태양에서, 모듈식 CRISPR 구조체는 초기에 상기 구조체의 염색체 삽입을 용이하게 하기 위한 서열(예를 들어, t-DNA 경계, Cre/Lox 또는 염색체 서열에 대한 상동성 말단)을 포함할 것이다. 일부 실시태양에서, 염색체 삽입을 위한 서열은 유기체의 게놈에 전체 모듈식 CRISPR 구조체를 삽입하도록 위치된다. 다른 실시태양에서, 염색체 삽입을 위한 서열은 모듈식 CRISPR 구조체의 일부만 삽입하도록 위치된다(도 3d 참조).
일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 추가의 cTAG를 포함할 수 있다. 삽입체 부분을 통한 cTAG의 추가는 이용 가능한 복제 체계의 복잡성을 증가시킬 수 있으며 또한 대체될 수 있는 이용 가능한 삽입체 부분의 수를 확장하여 구조체의 크기를 확장할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 전통적인 복제 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 게이트웨이 재조합 부위, 제한 부위, Cre/Lox 부위, 또는 다른 전통적인 복제 부위를 포함하는 삽입체 부분을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 골든 게이트 복제을 위한 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 전통적인 제한 효소 복제를 위한 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 게이트웨이 복제를 위한 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 전통적인 DNA 구조체로부터 삽입체 부분을 생산하는 방법을 교시한다. 즉, 일부 실시태양에서, 본 발명은 전통적인 DNA 구조체(예를 들어, 올리고, PCR 단편, 플라스미드 또는 다른 이용 가능한 DNA 단편)에 cTAG를 첨가하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 관심 유전자(GOI), 프로모터와 같은 단일 성분에 cTAG를 첨가하는 방법을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 다중 요소 구조체에 cTAG를 첨가하는 방법을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 바코드의 사용을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 바코드는 DNA 벡터에 존재할 때 데이터베이스에서 벡터에 대한 정보를 검색하는 데 사용될 수 있는 고유한 일련의 DNA 뉴클레오타이드이다. 일부 실시태양에서, 벡터의 존재는 다양한 성분에 대한 소스와 벡터가 언제, 누구에 의해 생성되었는지를 포함하는 벡터의 히스토리와 데이터베이스에서 연관될 수 있다. 바코드는 분자 계수 또는 기타 유사한 응용 프로그램에 필요한 경우와 같이 동일한 DNA 조각을 구별하는데도 사용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 바코드는 전체 벡터와 연관될 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 바코드를 삽입체 부분으로 통합하는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 바코드는 하나 이상의 cTAG에 있다. 특정 실시태양에서, 삽입체 부분의 바코드는 상이한 CRISPR 효소를 표지하거나 삽입체 부분에 의해 암호화된 가이드 RNA를 표지하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 바코드를 서열분석하는 것은 그렇지 않으면 전체 삽입체 부분 또는 전체 벡터/구조체의 서열분석을 필요로 하는 정보를 제공할 수 있다.
당업자는 삽입체 부분을 제조하는 방법을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, cTAG는 상기 cTAG를 포함하는 프라이머로 PCR 증폭을 통해 DNA 분자 내로 혼입될 수 있다. 다른 실시태양에서, cTAG는 전통적인 복제 기술(예를 들어, 제한 효소, 깁슨 또는 다른 조립 방법)을 통해 혼입될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, cTAG는 평활 말단 연결을 통해 혼입될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 넓은 종의 상용성 스펙트럼을 가질 수 있다(예를 들어, 마커가 원핵 생물 및 진핵 생물 발현 서열 둘 다를 함유하여 다수의 생물체에서 효과적이게 할 수 있다). 다른 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 단일 종/속/과/목/강/문/계 또는 영역 내의 유기체에 대한 제한된 응용 가능성을 갖도록 디자인된다. 일부 실시태양에서, 예를 들어, 복제 기원 부분은 단지 단일 종 또는 종 그룹에서 플라스미드를 유지할 수 있다. 다른 실시태양에서, 형광 마커는 원핵 생물 및 진핵 생물 영역 모두에서 기능하도록 코돈 최적화될 수 있다.
일부 실시태양에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 표적 서열의 PAM으로부터 3-4개 뉴클레오타이드 상류를 절단한다. 따라서 Cas9 복합체에 의한 cTAG 분해는 PAM 서열 또는 표적의 프로토스이서 서열의 손실을 통한 cTAG 기능의 상실을 초래할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 도너 삽입체 서열을 디자인함으로써 상기 cTAG 서열의 기능성을 유지시켜 이들이 삽입시(예를 들어, 이전에 분실된 PAM 또는 프로토스페이서 서열의 삽입을 통해) cTAG 서열을 재구성하는 방법을 교시한다. 유사한 대비가 Cpf1 엔도뉴클레아제를 통해 절단된 서열에 대해 계획된다.
도 2b는 cTAG 수리의 현재 개시된 개념을 도시한다. Cas9 엔도뉴클레아제에 의한 삽입체 부분 2의 절단은 또한 cTAG A 및 B의 일부의 손실을 초래한다. 상동성 재조합을 통한 삽입체 부분 2a-2d 중 임의의 하나의 후속 삽입은 전체 cTAG 서열의 복원을 초래한다.
당업자는 삽입체 부분에 대한 거의 무한한 옵션을 인식할 것이다. 상기 삽입체 목록은 예시적인 것으로 의도되었으며, 현재 개시된 방법, 키트 및 구조체의 응용 가능성을 제한하는 것으로 결코 해석되어서는 안 된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 CRISPR 효소, 촉매적으로 불 활성화된 CRISPR 효소 또는 추정 CRISPR 효소를 자체적으로 암호화할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "추정 CRISPR 효소"는 시험관 내 또는 숙주 세포에서 CRISPR-유사 기능을 나타낼 수 있는 것으로 여겨지는 단백질을 지칭한다. 당업자는 펩타이드가 추정 CRISPR 효소로 분류될 수 있는 다양한 방식을 인식할 것이다. 일부 실시태양에서, 추정 CRISPR 효소는 하나 이상의 공지된 CRISPR 효소와의 서열 또는 구조적 상동성에 기초하여 분류될 것이다. 다른 실시태양에서, 추정 CRISPR 효소는 하나 이상의 가이드 RNA와 상호 작용하는 능력에 기초하여 분류될 것이다. 다른 실시태양에서, 추정 CRISPR 효소는 효소를 암호화하는 DNA가 숙주 세포의 CRISPR 면역에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 기능 라이브러리의 획득 또는 손실의 유전자 스크린 결과를 기반으로 분류될 것이다. 따라서, 일부 실시태양에서, 현재 개시된 모듈식 벡터는 하나 이상의 숙주 세포에서 CRISPR 활성을 갖는 귀중한 효소를 확인하기 위해서 추정 CRISPR 효소 라이브러리를 선별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 가이드 RNA 서열과 조합하여 테스트하고 표적 절단 정도를 측정함으로써 추정 CRISPR 효소를 검증하기 위한 고 처리량 방법을 교시한다. 표적 절단은 표적 유전자의 발현 손실을 측정하거나, 예를 들어, 분해된 생성물을 겔 상에서 실행하거나, 분해된 생성물을 서열분석하거나, 분해되지 않은 표적 DNA를 증폭하도록 디자인된 PCR 반응을 실행함으로써 분해를 측정하는 것을 포함하여 당업자에게 알려진 임의의 방법을 통해 측정될 수 있다.
모듈식 CRISPR 복제 태그
일부 실시태양에서, 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체는 하나 이상의 복제 태그(cTAGs)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 이상의 cTAG를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 각각의 cTAG가 적어도 하나의 확증된 CRISPR 프로토스페이서/PAM 조합 서열("CRISPR 랜딩 부위")을 포함함을 교시한다. 즉, 일부 실시태양에서, cTAG는 적어도 하나의 실험적으로 확증된 고효율 CRISPR 랜딩 부위를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 cTAG는 습식 벤치 실험(wet bench experimentation)(예를 들어, 상기 CRISPR 랜딩 부위를 표적으로 하는 CRISPR 복합체에 의한 cTAG 서열의 생체외 절단)에 의해 확증될 수 있다. 다른 실시태양에서, cTAG 확증은 피어-리뷰 저널에서의 절단 리포트로부터 가정될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 cTAG는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 CRISPR 랜딩 부위를 포함한다. 일부 실시태양에서, CRISPR 랜딩 부위는 서로 중첩된다. 다른 실시태양에서, CRISPR 랜딩 부위는 cTAG 내의 뚜렷한 중첩되지 않는 영역을 차지한다. 일부 실시태양에서, CRISPR 랜딩 부위는 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제 절단에 특이적일 수 있다. 일부 실시태양에서, CRISPR 랜딩 부위는 임의의 다른 현재 또는 앞으로 발견될 CRISPR 엔도뉴클레아제에 특이적일 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 단일 cTAG 내의 다중 복제 부위가 상이한 유기체를 통해 기능하도록 디자인될 수 있음을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, cTAG Cpf1 랜딩 부위는 HR 기계장치가 결여되거나 하향조절되는 유기체에서 바람직할 수 있다. 다른 실시태양에서, cTAG의 제한 부위는 초기의 생체외 복제에 바람직할 수 있는 반면, Cas9 또는 Cpf1 랜딩 부위는 선택된 진핵 생물에서 생체내에서 발생하는 보다 복잡한 편집에 바람직할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 cTAG가 하나 이상의 비-CRISPR 복제 서열을 포함할 수 있음을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 cTAG는 제한 효소 부위, 재조합 부위, 토포아이소머라제 부위, 스플라이싱 부위 및 Cre-Lox 부위로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 요소를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 적합한 제한 효소 부위는 제한 없이 AaII, AarI, AasI, AatII, Acc65I, AccB7I, AccI, AccIII, AciI, AclI, AcuI, AdeI, AfeI, AflII, AflIII,　AgeI, AhdI, AleI, AloI, AluI, Alw21I, Alw26I, Alw44I, AlwI, AlwNI, ApaI, ApaLI, ApeKI, ApoI, AscI, AseI, AsiSI, AvaI, AvaII, AvrII, BaeI, BalI, BamHI, BanI, BanII, BbsI, BbuI, BbvCI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BclI, BcnI, BcuI, BfaI, BfiI, BfmI BfrBI, BfuAI, BfuCI, BfuI, BglI, BglII, BlpI, Bme1390I, Bme1580I, BmgBI, BmrI, BmtI, BoxI, BpiI, BplI, BpmI, Bpu10I, Bpu1102I, BpuEI, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaI, BsaJI, BsaMI, BsaWI, BsaXI, BseDI, BseGI, BseJI, BseLI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseSI, BseXI, BseYI, BsgI, Bsh1236I, Bsh1285I, BshNI, BshTI, BsiEI, BsiHKAI, BsiWI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BsmI, BsoBI, Bsp19I, Bsp120I, Bsp1286I, Bsp1407I, Bsp143I, Bsp143II, Bsp68I, BspCNI, BspDI, BspEI, BspHI, BspLI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTI, BsrBI, BsrDI, BsrFI, BsrGI, BsrI, BsrSI, BssHII, BssKI, BssSI, Bst1107I, Bst98I, BstAPI, BstBI, BstEII, BstF5I, BstNI, BstOI, BstUI, BstXI, BstYI, BstZI, BstZ17I, Bsu15I, Bsu36I, BsuRI, BtgI, BtgZI, BtsCI, BtsI, BveI, Cac8I, CaiI, CfoI, Cfr10I, Cfr13I, Cfr42I, Cfr9I, CfrI, ClaI, CpoI, Csp45I, Csp6I, CspI, CspCI, CviaII, CviKI-1, CviQI, DdeI, DpnI, DpnII, DraI,　DraIII, DrdI, EaeI, EagI, Eam1104I, Eam1105I, EarI, EciI, Ecl136II, EclHKI, Eco105I, Eco130I, Eco147I, Eco24I, Eco31I, Eco32I, Eco47I, Eco47III, Eco52I, Eco57I, Eco57MI, Eco72I, Eco81I, Eco88I, Eco91I, EcolCRI, EcoNI, EcoO109I, EcoP15I, EcoRI, EcoRV, EheI, Esp3I, FatI, FauI, Fnu4HI, FokI, FseI, FspI, FspAI, GsuI, HaeII, HaeIII, HgaI, HhaI, Hin1I, Hin4I, Hin6I, HincII, HindIII, HinfI, HinP1I, HpaI, HpaII, HphI, Hpy166II, Hpy188I, Hpy188III, Hpy8I, Hpy99I, HpyAV, HpyCH4III, HpyCH4IV, HpyCH4V, HpyF10VI, Hsp92I, Hsp92II, I-PpoI, I-CreI, KasI, Kpn2I, KpnI, KspAI, LweI, MbiI, MboI, MboII,　MfeI, MisI, MluI, MlyI, MmeI, MnlI, Mph1103I, MscI, MseI, MslI, MspA1I, MspI, MssI, MunI, Mva1269I, MvaI, MwoI, NaeI, NarI, NciI, NcoI, NdeI, NdeII, NgoMIV, NheI, NheI-HF, NlaIII, NlaIV, NmeAIII, NmuCI, NotI, NruI, NsbI, NsiI, NspI, OliI, PacI, PaeI, PaeR7I, PagI, PauI, PciI, PdiI, PdmI, Pfl23II, PflFI, PflMI, PfoI, PhoI, PleI, PmeI, PmlI, PpiI, PpuMI, PshAI, PsiI, Psp1406I, Psp5II, PspGI, PspOMI, PspXI, PstI, PsuI, PsyI, PvuI, PvuII, PvuII-HF, RsaI, RsrII, SacI, SacII, SalI, SalI-HF, SapI, SatI, Sau3AI, Sau96I, SbfI, ScaI, ScaI-HF, SchI, ScrFI, SdaI, SduI, SexAI, SfaNI, SfcI, SfiI, SfoI, SgfI, SgrAI, SinI, SmaI, SmiI, SmlI, SmuI, SnaBI, SpeI, SphI, SphI-HF, SspI, StuI, StyD4I, StyI, SwaI, TaaI, TaiI, TaqαI, TaqI, TasI, TatI, TauI, TfiI, TliI, Tru1I, Tru91, TseI, Tsp45I, Tsp509I, TspMI, TspRI, Tth111I, TurboNaeI, TurboNarI, Van91I, VspI, XagI, XapI, XbaI, XceI, XcmI, XhoI, XhoII, XmaI, XmaJI, XmiI, XmnI, 및 ZraI로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제한 효소에 의해 인식되는 부위를 포함한다. 양태는 또한 I-SceI, I-CeuI 및 PI-PspI와 같은 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease)를 포함한다. 이런 효소에 대한 상응하는 절단 부위는 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 길이가 8개 이상의 뉴클레오타이드(≥8 제한 효소)를 인식하는 희귀 제한 효소의 사용을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 각각의 cTAG에서 단일 희귀 제한 부위의 사용을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 cTAG는 둘 이상의 제한 부위를 포함할 수 있다. 하기 표 2는 본 발명에 따른 cTAG의 목록을 제공하며, 각각 희귀 제한 효소 부위가 굵게 표시되어 있다.
실시예 cTAG 서열, CRISPR 랜딩 부위 및 희귀한 제한 효소 부위(굵은 서열 부분은 제한 효소 부위이다)
TagA ACTGGGTGGAATCCCTTCTGCAGCACCTGGATTACCCTGTTATCCCTAGT
ACTGGGTGGAATCCCTTCTGCAGCACCTGGATTACCCTGTTATCCCTAGT		 I-SceI SEQ ID NO: 65
TagB TAATGAGTAGTCCTCATCTCCCTCAAGCAGGCGCCGGCGGTACTGCCATC
TAATGAGTAGTCCTCATCTCCCTCAAGCAGGCGCCGGCGGTACTGCCATC		 MreI SEQ ID NO: 66
TagC CATATAATCTCCCTCAAGCAGGCCCCGCTGGCGCGCGCGAATGTTAGGAA MauBI SEQ ID NO: 67
TagD GCCTATAATGTGAAGAGCTTCACTGAGTAGGGCCCGGGCTGTAAACGGTT SrfI SEQ ID NO: 68
TagE ATTCGCTAGCAGATGTAGTGTTTCCACAGGGGCGATCGCTGATATGGGTC AsiSI SEQ ID NO: 69
TagF ACTACCTAGCTGCATTTTCAGGAGGAAGCGATGGGCGGCCGCACACCTTC NotI SEQ ID NO: 70
TagG TGATAATGGGTGAGTGAGTGTGTGCGTGTGGGGCGCGCCAGATGGGAACA AscI SEQ ID NO: 71
TagH ACTCCAGTCTTTCTAGAAGATGGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGT PI-PspI SEQ ID NO: 72
TagI TAGTGGACGGGGCCACTAGGGACAGGATTGGCCTGCAGGATTCCCGTCAA SbfI SEQ ID NO: 73
TagJ TGAACTAAGGCGGCTGCACAACCAGTGGAGGCCTAAATGATC 없음 SEQ ID NO: 74
일부 실시태양에서, 본 발명에서 사용하기 위한 적합한 재조합 부위는 attB 부위, attP 부위, attL 부위, attR 부위, lox 부위, psi 부위, tnpI 부위, dif 부위, cer 부위, frt 부위 및 이들의 돌연변이체, 변이체 및 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 토포아이소머라제 인식 부위는, 존재한다면, 유형 IB 토포아이소머라아제 일 수 있는 유형 I 토포아이소머라제에 의해 인식되고 결합된다. 유형 IB 토포아이소머라제의 적합한 유형은 진핵 생물 핵 유형 I 토포아이소머라제 및 폭스 바이러스 토포아이소머라제를 포함하나 이에 제한정되지 않는다. 일부 실시태양에서, 적절한 유형의 폭스 바이러스 토포아이소머라제는 우두 바이러스, 쇼프 섬유종 바이러스, ORF 바이러스, 계두 바이러스, 물사마귀 바이러스 및 암삭타 모레리엔토모폭스바이러스(Amsacta morreientomopoxvirus)와 같은 바이러스에 의해 생성되거나 이로부터 분리된 폭스바이러스 토포아이소머라제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, CRISPR 및 비-CRISPR 복제 부위의 cTAG 배열은 사용자 선호에 따라 주문할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 CRISPR 결합 부위가 삽입체 부분으로부터 가장 멀리 떨어져 있도록 주문되어야 한다고 교시한다. 하나의 예시적인 실시태양에서, cTAG는 5'-3':(부분 I)-[R1-A1-C-A2-R2]-(부분 Ⅱ)로부터 다음과 같이 배열될 수 있으며, 여기서 R = 제한 부위, A = 재조합효소 부위 및 C = CRISPR 랜딩 부위. 일부 실시태양에서, C는 다수의 중첩, 또는 순차적인 CRISPR 및/또는 제한 랜딩 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 cTAG 상의 복제 부위의 배열은 대칭(즉, 복제 부위의 유형의 대칭적인 순서를 제공한다)일 것이다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 cTAG 상의 복제 부위의 배열은 비대칭일 수 있다. 예를 들어, 다른 예시적인 실시태양에서, cTAG는 5'-3':(부분 I)-[R1-A1-C1-C2]-(부분 Ⅱ)로부터 다음과 같이 배열될 수 있으며, 여기서 R = 제한 부위, A = 재조합효소 부위 및 C1-2 = CRISPR 랜딩 부위(들). 또 다른 실시태양에서, cTAG는 5'-3': i) (부분 I)-[R1-C1-C2]-(부분 II), ii) (부분 I)-[R1-C1]-(부분 II), iii) (부분 I)-[C1-C2]-(부분 II)로부터 다음과 같이 배열될 수 있으거나 이들의 역순서로 배열될 수 있으며, 여기서 R = 제한 부위, A = 재조합효소 부위 및 C1-2 = CRISPR 랜딩 부위(들).
당업자는 다양한 cTAG 배열의 이점 및 응용을 인식할 것이다. 예를 들어, 단일 태그 실시태양에서, 모듈식 구조체는 단일 CRISPR 엔도뉴클레아제를 소화시키면서 삽입할 수 있지만(추가 cTAG의 추가 분해 없이는) 삽입의 제거 또는 교체를 허용하지 않을 것인데, 이는 제 2 플랭킹 cTAG 부위의 부족 때문이다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 삽입된 부분들이 cMCS 내의 가능한 삽입체 부분 위치의 수를 확장하기 위해 추가 cTAG를 자체적으로 포함할 수 있음을 교시한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 모듈식 CRISPR 구조체로부터 하나 이상의 삽입체 부분을 제거하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 모듈식 CRISPR 구조체의 둘 이상의 cTAG는 양립 가능한 말단을 생성할 수 있는 제한 효소 결합 부위를 포함한다. 일부 실시태양에서, 제한 효소 부위는 동일하다. 다른 실시태양에서, 제한 효소 부위는 별개이지만, 상기 부위의 최종 분해는 혼성화 및 결찰을 위한 양립 가능한 말단을 생성한다. 일부 실시태양에서, 모듈식 CRISPR 구조체의 일부의 결실을 위한 제한 부위는 둘 이상의 cTAGS의 다른 말단에 위치하여, 최종 결찰 구조체는 cTAGS에 대한 삽입체 부분의 동일한 비율을 여전히 유지할 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체 내의 결실에 사용되는 제한 효소 부위가 양립 가능한 말단을 생성하는 임의의 제한 효소일 수 있음을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체 내의 결실에 사용되는 제한 효소 부위가 양립 가능한 말단을 생성하는 임의의 희귀 8≥ 염기 제한 효소일 수 있음을 교시한다. 선택된 실시태양에서, 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체 내의 결실에 사용되는 제한 효소 부위가 I-SceI 및 PI-PspI일 수 있음을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 cTAG 쌍을 생성하기 위해 각각의 삽입체 부분에 인접한 2개의 cTAG를 갖는 모듈식 CRISPR 구조체를 교시한다. 일부 실시태양에서, 상기 cTAG 쌍은 삽입체 부분의 선택적 절단/교체를 허용한다. 예를 들어, 도 2b에 예시된 바와 같이, cTAG A 및 B를 표적으로 하는 엔도뉴클레아제에 의한 모듈식 CRISPR 플라스미드의 분해가 삽입체 부분 2의 특이적 제거를 초래할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 선택된 실시태양은 엔도뉴클레아제 절단 후 cTAG 기능을 회복시키는 대체 삽입체 부분을 제공한다. 따라서, 도 2b에 도시된 바와 같이, 대체 삽입체 부분 2a-2d는 모듈식 CRISPR 플라스미드 내로 삽입시 cTAG A 및 B 기능을 회복시킬 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 cTAG가 또한 삽입체 부분 방향성을 제어할 수 있음을 교시한다. 삽입체 부분에서 cTAG 말단 및 모듈식 CRISPR 구조체에서 절단된 cTAG 사이의 서열 상동성은, 상동성 재조합 또는 혼성화(예를 들어, 깁슨 접근법에서)를 통한 Cas9 절단된 서열에 대한 삽입 방향성을 결정할 것이다. Cpf1 서열의 삽입 방향성은 cTAG 상의 Cpf1 점착성 말단의 왓슨 크릭 혼성화를 통해 또한 조절될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 대안적인 cTAG 배열을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체는 중첩된 cTAG의 사용을 위한 기능성을 제공하도록 디자인될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 생체외 및 생체내 다성분 조립을 가능하게 하는 공유된 중첩 "태그" 영역에 기초한 성분-기초 CRISPR 조립을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 태그는 DNA 구조체로부터 미래의 복제 또는 생체외 DNA 조립을 용이하게 하기 위한 CRISPR 랜딩 부위를 포함한다. DNA 구조체가 숙주 유기체의 게놈에 통합되면, 미리 선택된 Cas9 또는 Cpf1 랜딩 부위는 쉽게 유전자 변형을 용이하게 할 수 있다. 한 세트의 실험에서, 조립 전략은 많은 수와 유형의 DNA 성분을 함유하는 여러 유기체에서 사용될 수 있는 DNA 플라스미드의 제작을 가능하게 한다.
일부 실시태양에서, 이 조립 전략은 대사 경로를 비롯한 임의의 원하는 세트의 DNA 성분을 암호화하는 플라스미드를 조립하고 빠르게 재조립하는 데 사용될 수 있다. 다른 실시태양에서, 통합 플라스미드로 cTAG를 디자인하는 것은 또한 숙주 유기체의 게놈 내외로 DNA 성분을 직접 교체하여 미래 플라스미드를 복제할 필요성을 회피하는 데 사용될 수 있다.
cTAG 서열 디자인 알고리즘
일부 실시태양에서, 본 발명은 cTAG 내의 CRISPR 랜딩 부위를 용이하게 하도록 디자인된 알고리즘을 교시한다. 일부 실시태양에서, CRISPR 랜딩 부위는 기존 서열로부터 동정된 서열이다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 소프트웨어 프로그램의 사용이 원하는 가이드 서열 길이 및 특정 CRISPR 효소에 대한 CRISPR 모티프 서열(PAM, 프로토스페이서 인접 모티프)에 기초하여 입력 DNA 서열의 양 가닥 상의 후보 CRISPR 표적 서열을 동정하도록 디자인된다. 예를 들어, PAM 서열 TTN을 갖는 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) U112로부터의 Cpf1에 대한 표적 부위는 입력 서열 및 입력 서열의 역보체 모두에서 5'-TTN-3'을 검색함으로써 동정될 수 있다. PAM 서열을 갖는 라치노스피라세(Lachnospiraceae) 박테리아와 아시다미노콕쿠스 에스피(Acidaminococcus sp.)로부터의 Cpf1에 대한 표적 부위는 입력 서열 및 입력 서열의 역보체 모두에서 5'-TTTN-3'을 탐색함으로써 동정될 수 있다. 마찬가지로, PAM 서열 NNAGAAW를 갖는 에스 써모필루스(S.thermophilus) CRISPR1의 Cas9에 대한 표적 부위는 입력 서열 및 입력 서열의 역보체 모두에서 5'-Nx-NNAGAAW-3'을 검색함으로써 동정될 수 있다. 에스 피로젠스(S. pyogenes)의 Cas9에 대한 PAM 서열은 5'-NGG-3'이다.
마찬가지로, PAM 서열 NGGNG를 갖는 에스 써모필루스(S. thermophilus) CRISPR의 Cas9에 대한 표적 부위는 입력 서열 및 입력 서열의 역보체 모두에서 5'-N, -NGGNG-3'을 검색함으로써 동정될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 처음부터 CRISPR 랜딩 부위를 디자인하는 방법을 교시한다. 당업자는 본 발명의 가이드 RNA와 함께 CRISPR 랜딩 부위를 쉽게 디자인할 수 있으며, 여기서 최종 프로토스페이서 서열은, 전술한 바와 같이, 원하는 CRISPR 엔도뉴클레아제에 적합한 PAM 모티프와 결합된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID NO. 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 81 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 cTAG를 교시한다.
DNA 표적 부위의 게놈에서의 다수의 발생은, 모든 잠재적 부위를 동정한 후에, 비특이적 게놈 편집을 유도할 수 있기 때문에, 본 발명은, 일부 실시태양에서, 관련 참조 게놈 또는 모듈식 CRISPR 구조체에서 나타나는 횟수에 기초하여 서열을 필터링하는 것을 교시한다. 서열 특이성이 '씨드'서열(Cpf1 매개 분할에 대한 가이드 서열의 처음 5nt와 같은)에 의해 결정되는 CRISPR 효소의 경우, 필터링 단계는 또한 동일한 씨드를 갖는 상이한 서열을 필터 아웃할 수 있다.
일부 실시태양에서, 알고리즘 툴은 또한 특정 가이드 서열에 대한 표적 부위로부터의 잠재적 가능성을 확인할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, Cas-Offinder는 Cpf1에 대한 표적 부위로부터의 잠재적 가능성을 확인하는데 사용될 수 있다(Kim et al., 2016. "Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells" published online June 06, 2016 참조). Zhang 연구실의 crispr.mit.edu 툴을 포함하여 임의의 다른 공개적으로 이용 가능한 CRISPR 디자인/동정 툴이 사용될 수 있다(Hsu, et al. 2013 "DNA targeting specificity of RNA_guided Cas9 nucleases" Nature Biotech 31, 827-832 참조).
일부 실시태양에서, 사용자는 씨드 서열의 길이를 선택할 수 있다. 또한 사용자는 필터를 통과하기 위해 게놈에 있는 씨드:PAM 서열의 발생 횟수를 지정할 수 있다. 기본값은 독특한 서열을 선별하는 것이다. 여과 수준은 씨드 서열의 길이와 게놈에서 서열의 발생 횟수를 변화시킴으로써 변경된다. 프로그램은, 부가적으로 또는 선택적으로, 동정된 표적 서열(들)의 역보체를 제공함으로써 보고된 표적 서열(들)에 상보적인 가이드 서열의 서열을 제공할 수 있다.
모듈식 CRISPR DNA 구조체 복제
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 사용하여 신규 재조합 핵산 분자를 제조하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 부분 조립 방법을 교시한다. 각 방법에 대한 설명은 아래에 제공된다.
DNA 조립 방법
일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 부분의 모듈 조립 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 DNA 조립 방법은 생체외에서 수행된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 i) 적어도 하나의 CRISPR 복합체와 함께 적어도 2개의 삽입체 부분 DNA를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계 및 ii) 상기 혼합물을 삽입체 DNA의 CRISPR 분해를 위한 조건에서 배양하는 단계 iii) 2개의 삽입체 부분 DNA의 각각의 분해로부터 양립 가능한 점착성 말단을 혼성화하는 단계, 및 iv) 상기 혼성화된 말단을 서로 결찰시켜 새로운 재조합 핵산을 생성시키는 단계를 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분 DNA는 함께 분해된다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 동일하거나 상이한 CRISPR 복합체로 각 삽입체 부분 DNA를 개별적으로 분해하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 삽입체 부분은 CRISPR 복합체에 의해 분해되지 않는다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 (후술되는 절에서 기술된 바와 같이 이중 CRISPR 분해를 위한) 엑소뉴클레아제 처리가 단계 ⅲ)의 혼성화 전에 수행됨을 교시한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 삽입체 부분 말단을 ssDNA 엑소뉴클레아 제에 노출시키고 최종 점착성 말단을 혼성화하고 폴리머라제에 의한 선택적 충전과 결찰에 의해 삽입체 부분의 깁슨형 결합을 교시한다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 삽입체 부분은 ssDNA 엑소뉴클레아제 처리 전에 dsDNA 엑소뉴클레아제에 노출된다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 CRISPR 엔도뉴클레아제(예를 들어, 후술되는 절에서 기술된 바와 같은 이중 CRISPR 분해)에 의해 분해된 삽입체 부분 또는 모듈식 CRISPR 벡터의 깁슨형 결합을 교시한다.
아래의 절은 본 발명의 삽입체 부분 및 모듈식 CRISPR 구조체가 조립되고 편집될 수 있는 다양한 방식을 설명하는 일련의 예시적인 실시예를 제공한다. 아래 기술된 기술의 목록은 본 발명의 서열의 유용성을 강조하는 예시적인 일련의 실시예를 제공하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당업자는 본 발명에 따른 삽입체 부분의 조립 및 편집을 허용하는 다른 기술을 인식할 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 Cpf1 및/또는 Cas9 CRISPR 엔도뉴클레아제를 포함하는 방법을 기술한다. 이러한 특정 CRISPR 엔도뉴클레아제를 언급하는 것은 예시적인 것이고 청구항에 명시된 경우를 제외하고는 제한적이지 않다. 당업자는 다른 기존의 또는 지금까지 발견되지 않은 CRISPR 엔도뉴클레아제의 본 발명의 구조체 및 방법에의 응용가능성을 즉시 인식할 것이다. Cpf1에 대한 언급은 점착성 DNA 말단을 생성하기 위해 지그재그형 DNA 절단을 촉매할 수 있는 임의의 현재 공지된 또는 알려지지 않은 CRISPR 엔도뉴클레아제의 사용을 포괄하는 것으로 해석될 수 있다. Cas9에 대한 언급은 유사하게 dsDNA의 평활 말단 절단을 촉매할 수 있는 임의의 현재 공지된 또는 알려지지 않은 CRISPR 엔도뉴클레아제의 사용을 포괄하는 것으로 해석될 수 있다.
생체외 Cpf1
일부 실시태양에서, 본 발명의 생체외 DNA 조립은 아래 기술된 바와 같이 Cpf1 CRISPR 복합체로 수행된다. 첫 번째, 2개 이상의 삽입체 부분은 적어도 2개의 삽입체 부분 사이에서 공통적인 cTAG를 표적으로 하는 Cpf1 CRISPR 복합체와 함께 배양된다. 일부 실시태양에서, 삽입체 부분은 단일 혼합물로 함께 배양된다. 다른 실시태양에서, 삽입체 부분은 상이한 혼합물에서 배양된다.
두 번째, 일부 실시태양에서, 분해된 생성물은 정제되어 활성 CRISPR 뉴클레아 제를 제거한다. 일부 실시태양에서, 정제는 분해된 삽입체 부분으로부터 활성 Cpf1 복합체를 분리하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 정제는 겔 또는 컬럼 정제와 같은 DNA 정제를 통해 달성될 수 있다. 다른 실시태양에서, 정제는 열 또는 화학적 불활성화와 같은 Cpf1 불활성화에 의해 달성될 수 있다.
세 번째, 분해된 삽입체 부분은 Cpf1 복합체에 의해 생성된 양립 가능한 점착성 말단의 혼성화에 적합한 조건에서 배양된다. 그런 후에 혼성화된 말단은 본 발명의 초기 부분에서 기술된 것을 포함하는 임의의 공지된 결찰 방법에 따라 결찰된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 C RISPR and Li gase C loning 방법("CLIC"로 지칭됨)을 사용하는 DNA 조립을 교시한다(US16/310,895; WO/2018/013990 참조, 이들 모두는 본 발명에 전문이 포함된다).
CLIC 기술에서, crRNA 표적화 폴리뉴클레오타이드는 결실을 위해 예정된 DNA 삽입체 영역(예를 들어, 다중 복제 부위 "MCS")의 내부 부분에 역 배향으로 결합하여 제거된 DNA 단편의 외부를 향해 절단되도록 디자인되었다. 별도의 crRNA 표적화 폴리뉴클레오타이드는 또한 DNA 삽입체의 외부 말단(예를 들어, 관심 유전자 "GOI")을 표적화하여 반응 중에 DNA 결합 부위를 제거하도록 디자인되었다. 일부 실시태양에서, crRNA 가이드 서열은 동일할 수 있다.
역 배향으로 crRNA 결합 부위를 디자인하면 절단 과정에서 결합 부위가 제거되어 호환 가능한 서열 오버행에 의해 플랭킹된 두 개의 DNA 단편이 동일한 반응에서 매끄럽게 결찰되게 한다.
생체외 Cas9
다른 실시태양에서, 본 발명의 생체외 DNA 조립은 아래 기술된 바와 같은 Cas9 CRISPR 복합체로 수행된다. 첫 번째, 2개 이상의 삽입체 부분은 적어도 2개의 삽입체 부분 사이에 공통적인 cTAG를 표적으로 하는 Cas9 CRISPR 복합체와 함께 배양된다. 일부 실시태양에서, 삽입체 부분은 단일 혼합물로 함께 배양된다. 다른 실시태양에서, 삽입체 부분은 상이한 혼합물로 배양된다.
두 번째, 일부 실시태양에서, 분해된 생성물을 정제하여 활성 CRISPR 뉴클레아제를 제거한다. 일부 실시태양에서, 정제는 분해된 삽입체 부분으로부터 활성 Cas9 복합체를 분리하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이는 겔 또는 컬럼 정제와 같은 DNA 정제를 통해 달성될 수 있다. 다른 실시태양에서, 정제는 열 또는 화학적 불활성화와 같은 Cas9 불활성화에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시태양에서, Cas9 분해 생성물에 대한 세 번째 단계는 평활 말단 결합에 적합한 조건으로 삽입체 부분을 배양하는 것이다.
이중 CRISPR 조립
다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 적어도 하나의 공유된 cTAG 서열을 갖는 CRISPR-분해된 삽입체의 조각을 조립하기 위한 깁슨-조립 유형 방법(예를 들어, 상이한 CRISPR 랜딩 부위에서 분해된 양립 가능한 cTAG의 조립)을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 아래 기술된 바와 같은 이중 CRISPR 분해 조립을 교시한다.
먼저, 2개 이상의 삽입체 부분은 적어도 2개의 삽입체 부분 사이에서 공통적인 상기 cTAG 내의 각 부분에 인접한 2개의 상이한 CRISPR 랜딩 부위를 표적으로 하는 2개의 CRISPR 복합체와 함께 배양된다.
일부 실시태양에서, 2개의 상이한 CRISPR 랜딩 부위는 함께 분해된다. 다른 실시태양에서, 하나의 삽입체 부분 DNA는 하나의 CRISPR 랜딩 부위를 표적으로 하는 하나의 CRISPR 복합체로 분해되고 다른 삽입체 부분 DNA는 별도의 용기에서 제 2 CRISPR 랜딩 표적 부위를 표적으로 하는 상이한 CRISPR 복합체로 분해된다. 각각의 경우에, 이러한 분해의 결과는 2개의 삽입체 DNA cTAG의 각각에 공유된 cTAG가 서로 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20bp의 서열 중복을 포함하는 것이 될 것이다.
예를 들어, 예시적인 실시태양에서, 2개의 삽입체 DNA 부분 사이의 공유 cTAG는 5'-3': (부분 I)-[R1-C1-C2]-(부분 II)로부터 다음과 같이 배열될 것이며, R = 제한 부위, C1 = 제 1 CRISPR 랜딩 부위 및 C2 = 제 2 CRISPR 랜딩 부위. 이 예시적인 실시태양에서, 3' 공유된 cTAG를 갖는 제 1 삽입체 DNA 부분은 C2를 표적으로 하는 CRISPR 복합체로 분해되고 5' 공유된 cTAG를 갖는 제 2 삽입체 DNA 부분은 C1을 표적으로 하는 CRISPR 복합체로 분해될 것이다. 이것은 C1-C2에 걸친 중복 서열을 갖는 2개의 DNA체 삽입 부분을 생성할 것이다.
두 번째, 일부 실시태양에서, 분해된 생성물은 정제되어 활성 CRISPR 뉴클레아제를 제거한다. 일부 실시태양에서, 정제는 분해된 삽입체 부분으로부터 활성 CRISPR 복합체의 분리를 수반한다. 일부 실시태양에서, 이는 겔 또는 컬럼 정제와 같은 DNA 정제를 통해 달성될 수 있다. 다른 실시태양에서, 정제는 열 또는 화학적 불활성화와 같은 CRISPR 불활성화에 의해 달성될 수 있다.
세 번째로, 일부 실시태양에서, CRISPR-분해된 삽입체 부분은 ssDNA 엑소뉴클레아제와 함께 배양하여 2개의 삽입체 DNA 부분 사이에 중첩하는 점착성 말단을 생성한다.
넷째, 분해된 삽입체 부분은 CRISPR 복합체/엑소뉴클레아제 분해에 의해 생성된 양립 가능한 점착성 말단의 혼성화에 적합한 조건하에 배양한다. 그런 후에 혼성화된 말단은 본 발명의 초기 부분에서 기술된 것을 포함하는 임의의 공지된 결찰 방법에 따라 결찰된다. 일부 실시태양에 있어서, 혼성화된 부분은 중합 효소와 함께 배양되어 결찰 전에 임의의 누락된 서열 간격을 채운다.
가교 조립
다른 실시태양에서, 본 발명은 삽입체 부분의 분해된 cTAG 서열과 중첩하는 가교 서열을 포함하는 제 3 DNA 서열의 첨가를 통해 Cas9 분해된 부분의 깁슨-조립을 교시한다.
이 예시적인 예에서, 두 삽입체 부분은 동일한 CRISPR 랜딩 부위를 표적으로 하는 동일한 Cas9 CRISPR 복합체로 분해된다. 이 실시태양에서, 최종 분해된 cTAG는 서열 중첩을 갖지 않을 것이다. 따라서, 일부 실시태양에서, 제 3 단계는 Cas9 분해된 삽입체 부분이 ssDNA 엑소뉴클레아제로 추가로 분해되어 3' 또는 5' 오버행을 생성하는 것이다. 그런 후에 엑소뉴클레아제 분해된 삽입체 부분은 CRISPR 복합체 및 엑소뉴클레아제 분해와 가교 서열의 조합에 의해 생성된 양립 가능한 점착성 말단의 혼성화에 적합한 조건에서 배양된다. 그런 후에 혼성화된 말단은 본 발명의 초기 부분에서 기술된 것을 포함하는 임의의 공지된 결찰 방법에 따라 결찰된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 엑소뉴클레아제 분해는 제 2 단계 전에 수행된다.
생체외 HDR
다른 실시태양에서, 본 발명은 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제로 분해된 삽입체 부분 DNA의 말단을 HDR 복합체와 조립하여, 상기 분해된 삽입체 부분의 재조합을 개시하는 생체외 방법을 교시한다.
생체내 상동성 재조합
일부 실시태양에서, 본 발명의 생체내 DNA 조립은 아래 기술된 바와 같이 Cpf1 또는 Cas9 CRISPR 복합체로 수행된다. 한 실시태양에서, 적어도 하나의 공유된 cTAG를 갖는 둘 이상의 삽입체 부분이 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 실시태양에서, 상동성 공유된 cTAG 서열을 갖는 DNA 삽입체 부분의 존재는 상동성 재조합 조립(예를 들어, 효모 상동성 재조합)를 유발하기에 충분할 것이다.
예를 들어, 일부 실시태양에서, 2개의 삽입체 DNA 부분 사이의 적어도 하나의 공유된 cTAG 서열은 선형 구조체를 생성하도록 조립될 수 있다. 이러한 예시적인 실시태양에서, 2개의 나머지 외측 cTAG는 또한 세포 내 다른 벡터의 cTAG와 재조합되도록 디자인될 수 있다(예를 들어, 기존 플라스미드 또는 염색체 내로의 삽입). 다른 실시태양에서, 2개의 부분은 2개의 삽입체 DNA 부분 사이에 제 2 공유된 cTAG의 재조합을 통해 원형 구조체로 추가로 조립될 수 있다. 조립된 구조체는 조립에 사용된 유기체에서 사용될 수 있거나, 일부 실시태양에서, 제 2 유기체(예를 들어, 효모의 조립 및 박테리아로의 후속 변형)로 정제되고 변형될 수 있다.
다른 실시태양에서, 공유된 cTAG를 갖는 하나 이상의 삽입체 부분은 숙주 세포 내로 도입되기 전에 분해될 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 방출된 부분의 생체내 조립 전에 큰 벡터로부터 삽입체 부분을 방출시키는 CRISPR 분해를 교시한다. 일부 실시태양에서, 분해는 Cas9로 수행된다. 다른 실시태양에서, 분해는 Cpf1로 수행된다. 다른 실시태양에서, 분해는 제한 엔도뉴클레아제로 수행된다. 일부 실시태양에서, 삽입체 부분의 CRISPR 분해는 생체외에서 수행된다. 일부 실시태양에서, 분해된 생성물은 정제되어 조립 숙주 세포로의 삽입체 부분의 형질전환 전에 활성 CRISPR 엔도뉴클레아제를 제거한다.
일부 실시태양에서, 정제 단계는 겔 또는 컬럼 정제와 같은 DNA 정제를 통해 달성될 수 있다. 다른 실시태양에서, 정제는 열 또는 화학적 불활성화와 같은 CRISPR 불활성화에 의해 달성될 수 있다.
생체내 결찰
일부 실시태양에서, 본 발명은 CRISPR 엔도뉴클레아제에 의한 재절단으로부터 삽입체 부분을 보호하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 DNA 서열의 화학적 변형을 통해 엔도뉴클레아제 절단으로부터 보호될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드를 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 다중 부분 DNA 조립에 특히 유용하다.
본 명세서의 도 2a는 본 발명의 방법에 따른 다중 부분 DNA 조립의 예시적인 예를 제공한다. 이 예에서, 2개의 cTAG(태그 A-H)가 있는 일련의 8개의 DNA 부분(부분 1-8)은 생체외에서 결합된 다음 자체 조립될 수 있다(상기한 바와 같이 생체내 상동성 재조합 또는 결찰).
DNA 편집 방법
일부 실시태양에서, 본 발명은 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 편집 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 DNA 편집 방법은 전술한 DNA 조립 방법의 동일한 원리를 적용하지만, 하나 이상의 미리 존재하는 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 편집하는 목적으로 수행한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 DNA 편집 방법은 생체외에서 수행된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 i) 모듈식 CRISPR DNA 구조체 및 적어도 하나의 삽입체 DNA 부분을 적어도 하나의 CRISPR 복합체와 함께 포함하는 혼합물을 형성하는 단계, ii) 상기 혼합물을 삽입체 DNA의 cTAG 및 이의 상응하는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 cTAG의 CRISPR 분해를 위한 조건에서 배양하는 단계, iii) 상기 cTAG 각각의 분해에 의해 생성된 양립 가능한 점착성 말단(Cpf1인 경우)을 혼성화하는 단계 및 iv) 상기 혼성화 말단(또는 Cas9가 사용되는 경우, 평활 말단)을 서로 결찰하여 새로운 재조합 핵산을 생성하는 단계를 교시한다. 일부 실시태양에서, 엑소 뉴클레아제 처리는 단계 iii)의 혼성화(아래의 절에서 기술된 바와 같은 이중 CRISPR 분해를 위한) 전에 수행된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 분해는 삽입체 부분 DNA 및 모듈식 CRISPR DNA 구조체에 대해 개별적으로 수행된다. 일부 실시태양에서, 모듈식 CRISPR DNA 구조체만이 CRISPR 복합체로 분해된다.
생체외 Cpf1
일부 실시태양에서, 본 발명의 생체외 DNA 편집 방법은 아래 기술된 바와 같은 Cpf1 CRISPR 복합체를 사용하여 수행한다. 첫 번째, 모듈식 CRISPR DNA 구조체와 적어도 하나의 삽입체 DNA 부분은 삽입체 부분의 cTAG 및 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내의 상응하는 태그를 표적으로 하는 Cpf1 CRISPR 복합체로 배양된다. 일부 실시태양에서, 모듈식 CRISPR DNA 및 삽입체 부분 DNA의 분해는 개별 반응으로 수행된다.
두 번째, 일부 실시태양에서, 분해된 생성물은 정제되어 활성 CRISPR 뉴클레아제를 제거한다. 일부 실시태양에서, 정제는 분해된 뉴클레오타이드로부터 활성 Cpf1 복합체를 분리하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 정제는 겔 또는 컬럼 정제와 같은 DNA 정제를 통해 달성될 수 있다. 다른 실시태양에서, 정제는 열 또는 화학적 불활성화와 같은 Cpf1 불활성화에 의해 달성될 수 있다.
세 번째, 분해된 모듈식 CRISPR DNA 구조체 및 삽입체 부분은 Cpf1 복합체에 의해 생성된 양립 가능한 점착성 말단의 혼성화에 적합한 조건에서 배양된다. 그런 후에 혼성화된 말단은 본 발명의 초기 부분에서 기술된 것을 포함하는 임의의 공지 된 결찰 방법에 따라 결찰된다.
생체외 Cas9
다른 실시태양에서, 본 발명의 생체외 DNA 편집 방법은 아래 기술된 바와 같은 Cas9 CRISPR 복합체를 사용하여 수행된다. 첫 번째, 모듈식 CRISPR DNA 구조체와 적어도 하나의 삽입체 DNA 부분은 삽입체 부분의 cTAG 및 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내의 상응하는 태그를 표적으로 하는 Cas9 CRISPR 복합체로 배양된다. 일부 실시태양에서, 모듈식 CRISPR DNA 및 삽입체 부분 DNA의 분해는 개별 반응으로 수행된다.
두 번째, 일부 실시태양에서, 분해된 생성물은 정제되어 활성 CRISPR 뉴클레아제를 제거한다. 일부 실시태양에서, 정제는 분해된 뉴클레오타이드로부터 활성 Cas9 복합체를 분리하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 정제는 겔 또는 컬럼 정제와 같은 DNA 정제를 통해 달성될 수 있다. 다른 실시태양에서, 정제는 열 또는 화학적 불활성화와 같은 Cas9 불활성화에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시태양에서, Cas9 분해 생성물에 대한 세 번째 단계는 평활 말단 결합에 적합한 조건에서 삽입체 부분을 배양하는 것이다.
깁슨 편집
다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 손상되지 않은 중첩 cTAG 서열을 함유하는 CRISPR-분해된 구조체 및/또는 분해되지 않은 삽입체 부분의 서열을 편집하기 위한 깁슨-조립 유형 방법을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 제 3 단계는 Cas9 분해된 모듈식 CRISPR DNA 구조체 및 삽입체 부분(들)이 ssDNA 엑소뉴클레아제로 추가로 분해되어 3' 또는 5' 오버행을 생성하는 것이다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 ssDNA 분해 전에 비-CRISPR 분해된 삽입체 부분을 단축시키는 dsDNA 엑소뉴클레아제 분해를 교시한다.
그런 후에 엑소뉴클레아제 분해된 DNA 절편은 CRISPR 복합체와 엑소뉴클레아제 분해의 조합에 의해 생성된 양립 가능한 점착성 말단의 혼성화에 적합한 조건하에서 배양된다. 그런 후에 혼성화된 말단은 본 발명의 초기 부분에서 기술된 것을 포함하는 임의의 공지된 결찰 방법에 따라 결찰된다. 일부 실시태양에서, 혼성화된 DNA는 중합 효소와 함께 배양되어 결찰 전에 누락된 DNA 절편을 채운다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 엑소뉴클레아제 분해는 CRISPR 불활성화 단계 전에 수행된다.
일부 실시태양에서, 분해된 서열의 결찰은 생체외에서 발생할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제로 분해된 모듈식 CRISPR DNA 구조체 및 적어도 하나의 분해되지 않은 삽입체를 HDR 복합체로 조립하여 상기 분해된 모듈식 CRISPR DNA 구조체 및 적어도 하나의 삽입체 DNA 부분의 재조합을 개시하는 생체외 방법을 교시한다 .
본 발명의 DNA 편집 방법의 일부 실시태양에서, DNA 삽입체 부분은 제 2 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에 포함된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 DNA 편집 방법은 하나의 모듈식 CRISPR DNA 구조체로부터 다른 구조체로 DNA 삽입체 부분의 전달을 포함한다.
숙주 세포에서 CRISPR 활성을 조절하기 위한 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 사용
일부 실시태양에서, 본 발명은 세포에서 CRISPR 활성을 조절하기 위한 조성물 및 방법을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 교시하며, 여기서 상기 구조체는 CRISPR 기능의 하나 이상의 조절자에 대한 핵산을 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "CRISPR 기능의 조절자"는 여분의 염색체 벡터에 존재할 때 또는 숙주 세포의 게놈에 통합될 때 숙주 세포에서 CRISPR 활성의 변형(예를 들어, 증가 또는 감소)을 초래하는 임의의 서열을 지칭하는 것으로 광범위하게 해석되어야 한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 CRISPR 기능의 조절자가 복제 기점, 선택 가능 마커, 역 선택 가능 마커, 항-CRISPR 단백질, 프로모터, 터미네이터, dCas 단백질, dCpf1 단백질, 바코드, Cas9 단백질, Cpf1 단백질, DNA 도너 및 다중화를 용이하게 하는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 교시한다.
특정 실시태양에서, CRISPR 기능의 조절자는 항-CRISPR 단백질이다(Pawluk et al., "Anti-CRISPR: discovery, mechanisms and function" Nature Reviews: Microbiology Vol 16, Jan 2018, pp 12-16). CRISPR-Cas 적응 면역 체계는 박테리아와 고세균 사이에 널리 퍼져 있다. 그러나, 최근 연구는 CRISPR 시스템은 박테리아 면역에 대한 최소 장기간의 진화적 영향을 가져서, CRISPR-Cas 면역을 회피하는 데 파지 및 기타 이동 유전 요소를 지원하는 항-CRISPR 인자의 존재를 시사한다.
현재까지, 유형 I 및 유형 II CRISPR-Cas 시스템에 대해 기술된 21개의 고유 한 항-CRISPR 단백질 패밀리가 있다. 지난 몇 년 동안, 작용 메커니즘은 유전, 생화학 및 구조 연구의 조합을 사용하여 여러 항-CRISPR 단백질에 대한 결정되었다. 일부 항-CRISPR 단백질 음성은 DNA 결합을 방해하여 CRISPR 효소 기능을 조절한다. 다른 항-CRISPR 단백질은 CRISPR 효소의 이량체화를 유발하여, 유전자 편집의 가용성을 감소시킨다. 그러나 다른 항-CRISPR 단백질은 CRISPR 효소의 엔도뉴클레아제 활성을 차단하여, 이중 가닥 DNA 절단 능력을 감소시킨다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 천연 CRISPR 시스템에 영향을 미치거나 외인적으로 첨가된 CRISPR 복합체의 효과를 추가로 변형시킴으로써 숙주 CRISPR 활성의 활성을 조절하기 위한 항-CRISPR 단백질의 사용을 교시한다.
일부 실시태양에서, CRISPR 기능의 조절자는 숙주 세포에서 CRISPR 활성을 "미세 조정" 하기 위해 사용된다. 다른 실시태양에서, CRISPR 기능의 조절자는 숙주 세포에서 CRISPR 활성을 감소시키는 데 사용된다. 다른 실시태양에서, CRISPR 기능의 조절자는 숙주 세포에서 CRISPR 활성을 증가시키는 데 사용된다.
하나의 예시적인 예에서, 본 발명은 숙주 세포의 형질 전환 속도를 개선하기위한 항-CRISPR 효소의 사용을 교시한다. 일부 종에서, CRISPR은 변형에 대한 장벽을 나타낸다. 본 발명은 항-CRISPR 단백질의 사용을 통해 CRISPR 기반 선천적 면역성을 제거하면 일부 미생물 종이 유전자 조작에 순응하게 만들 수 있음을 교시한다. 최근 보고서는 파지에서 파생된 다양한 항-CRISPR 단백질을 기술하였다(Bondy-Denomy et al, 2013 Nature 493:429-432). 항-CRISPR 단백질을 사용하여 형질 전환 장벽을 극복하는 것은 여러 가지 이점이 있다. 첫째, 숙주 유기체에서 CRISPR 시스템의 존재는 게놈 DNA 서열 분석을 통해 쉽게 확인할 수 있다. 둘째, 항-CRISPR의 공동 발현은 숙주 게놈의 사전 조작이 필요하지 않다. 셋째, 항-CRISPR 단백질의 유도성 발현은 플라스미드의 음성 선택을 허용한다(즉, 플라스미드는 항-CRISPR 단백질 발현이 차단될 때 CRISPR 의존적 방식으로 파괴된다).
한 실시태양에서, 항생제 내성 유전자 및 관심 유전자(들)와 함께 하나 이상의 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 플라스미드는 새로운 숙주로 형질 전환되고 형질 전환체는 항생제 내성에 기초하여 선택된다. 항-CRISPR 유전자 발현이 꺼졌을 때 항생제 내성 클론의 존재와 항생제 내성 상실은 형질 전환에 대한 장벽이 효과적으로 제거되었음을 나타내는 표현형이다. 두 번째 실시태양에서, 항-CRISPR 단백질은 플라스미드가 유전자 발현이 확립되기 전에 활성 CRISPR 시스템에 의해 제한되지 않도록 보장하기 위해 상기 플라스미드와 공동-형질 전환된다. 본 발명의 조성물 및 방법과 호환되는 항-CRISPR 단백질의 비 제한적인 목록은 표 3에 제공된다.
본 발명의 항-CRISPR 단백질의 비 제한적 목록
항-CRISPR 단백질 패밀리 특징화된 멤버 억제된 CRISPR 시스템 아미노산의 수 이를 개시하는 참조 문헌
AcrE1 JBD5-34 (Pseudomonos oeruginoso) I-E 100 Maxwell,　K.　L. & Davidson,　A.　R. A new group of phage anti-CRISPR genes inhibits the type　I-E CRISPR-Cas system of Pseudomonas aeruginosa. mBio 5, e00896 (2014).
AcrE2 J BD88a-3 2 (P. aeruginosa) I-E 84 Maxwell,　K.　L. & Davidson,　A.　R. A new group of phage anti-CRISPR genes inhibits the type　I-E CRISPR-Cas system of Pseudomonas aeruginosa. mBio 5, e00896 (2014).
AcrE3 DMS3-30 (P. aeruginosa) I-E 68 Maxwell,　K.　L. & Davidson,　A.　R. A new group of phage anti-CRISPR genes inhibits the type　I-E CRISPR-Cas system of Pseudomonas aeruginosa. mBio 5, e00896 (2014).
AcrE4 D3112-31 (P. aeruginosa) I-E 52 Maxwell,　K.　L. & Davidson,　A.　R. A new group of phage anti-CRISPR genes inhibits the type　I-E CRISPR-Cas system of Pseudomonas aeruginosa. mBio 5, e00896 (2014).
AcrF1 JBD30-35 (P. aeruginosa) I-F 78 Bondy-Denomy,　J., Pawluk,　A., Maxwell,　K.　L. & Davidson,　A.　R. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system. Nature 493, 429-432 (2013).
AcrF2 D3112-30 (P. aeruginosa) I-F 90 Bondy-Denomy,　J., Pawluk,　A., Maxwell,　K.　L. & Davidson,　A.　R. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system. Nature 493, 429-432 (2013).
AcrF3 JBD5-35 (P. aeruginosa) I-F 139 Bondy-Denomy,　J., Pawluk,　A., Maxwell,　K.　L. & Davidson,　A.　R. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system. Nature 493, 429-432 (2013).
AcrF4 JBD26-3 7 (P. aeruginosa) I-F 100 Bondy-Denomy,　J., Pawluk,　A., Maxwell,　K.　L. & Davidson,　A.　R. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system. Nature 493, 429-432 (2013).
AcrF5 JBD5-36 (P. aeruginosa) I-F 79 Bondy-Denomy,　J., Pawluk,　A., Maxwell,　K.　L. & Davidson,　A.　R. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system. Nature 493, 429-432 (2013).
AcrF6 AcrF6Poe (P. aeruginosa) I-E and I-F 100 Pawluk,　A. et　al. Inactivation of CRISPR-Cas systems by anti-CRISPR proteins in diverse bacterial species. Nat. Microbiol. 1, 16085 (2016).
AcrF7 AcrF7Poe(P. aeruginosa) I-F 67 Pawluk,　A. et　al. Inactivation of CRISPR-Cas systems by anti-CRISPR proteins in diverse bacterial species. Nat. Microbiol. 1, 16085 (2016).
AcrF8 Acrf8ZF40 (Pectobacterium phage Zf40) I-F 92 Pawluk,　A. et　al. Inactivation of CRISPR-Cas systems by anti-CRISPR proteins in diverse bacterial species. Nat. Microbiol. 1, 16085 (2016).
AcrF9 AcrF9Vpo (Vibrio parahaemolyticus) I-F 68 Pawluk,　A. et　al. Inactivation of CRISPR-Cas systems by anti-CRISPR proteins in diverse bacterial species. Nat. Microbiol. 1, 16085 (2016).
AcrF10 AcrF10Sxf (Shewanella xiamenensis) I-F 97 Pawluk,　A. et　al. Inactivation of CRISPR-Cas systems by anti-CRISPR proteins in diverse bacterial species. Nat. Microbiol. 1, 16085 (2016).
AcrIIA1 AcrllA1Lmo (Listeria monocytogenes) II-A 149 Rauch,　B.　J. et　al. Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell 168, 150-158.e10 (2017).
AcrIIA2 AcrllA2 Lmo (L monocytogenes) II-A 123 Rauch,　B.　J. et　al. Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell 168, 150-158.e10 (2017).
AcrII3 AcrllA3 Lmo (L monocytogenes) II-A 125 Rauch,　B.　J. et　al. Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell 168, 150-158.e10 (2017).
AcrIIA4 AcrllA4 Lmo (L monocytogenes) II-A 87 Rauch,　B.　J. et　al. Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell 168, 150-158.e10 (2017).
AcrIIC1 AcrllC1Nme (Neisserio meningitidis) II-C 85 Pawluk,　A. et　al. Naturally occurring off-switches for CRISPR-Cas9. Cell 167, 1829-1838.e9 (2016).
AcrIIC2 AcrllC2 Nme (N. meningitidis) II-C 123 Pawluk,　A. et　al. Naturally occurring off-switches for CRISPR-Cas9. Cell 167, 1829-1838.e9 (2016).
AcrIIC3 AcrllC3 Nme (N. meningiridis) II-C 116 Pawluk,　A. et　al. Naturally occurring off-switches for CRISPR-Cas9. Cell 167, 1829-1838.e9 (2016).
CRISPRi 및 CRISPRa 응용분야에서 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 사용
소개/배경
대사 공학은 분자의 대사, 조절 및 이화 작용에 직간접적으로 관련된 주요 유전자의 변경에 크게 의존한다. 예를 들어, 경쟁하는 대사 경로에 사용되는 보조 인자 또는 대사 전구체를 흡수하는 데 관여하는 유전자의 발현을 줄이는 것이 종종 유용하다. 그러나, 대사체의 복잡성은 하향 조절에 필요한 정확한 유전자와 하향 조절의 최적량 모두가 세포 독성을 제한하면서 수율을 증가시키는 것이 필요하다는 것을 선험적으로 예측하는 것을 어렵게 한다. 대사 산물 생산에 대한 유행성 또는 비가산성, 자연적 또는 다중 유전자 변화는 유익할 수 있는 변화 세트의 예측을 더욱 복잡하게 한다.
따라서, 조절 네트워크의 고속 고 처리량 샘플링을 가능하게 하는 기술 및 방법론에 대한 강력한 요구가 있다. 발현의 변경을 가능하게 하는 많은 전략이 있다. 유전자의 복제 수 변경, 유전자의 선호 코돈 사용 변경, 유전자 구동 프로모터의 강도 변경, mRNA의 리보솜 결합 부위 변경 및 mRNA 전사체 조절은 모두 유전자 발현 변화에 영향을 미치기 위해 사용되었다. 그러나, 이러한 각 변화는 유전자 변화에 의존한다. 사용되는 유기체에 따라, 게놈 편집은 시간이 많이 걸리고, 힘들며 종종 비효율적인 과정이다. 이 두 가지 모두는 테스트할 수 있는 변경 범위를 제한하고 많은 유기체에서 여러 게놈 변경을 동시에 다중화하는 것을 방지한다.
유전자 변경에 대한 대안으로, 많은 연구자들은 원핵 생물에서 전사를 억제하기 위해 촉매적으로 비활성화된 Cas9(dCas9)를 사용하였다. 코리네박테리움 글루 타미쿰과 같은 원핵 생물에서, 프로모터 또는 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)에 대한 dCas9는 전사 개시 또는 연장을 차단할 수 있다. 최근 간행물은 또한 전사 활성화 서브 유닛을 촉매적으로 비활성화된 dCas9 유전자에 융합함으로써 유전자를 상향 조절하는 능력을 제안하였다. 하향 조절을 위해 서로 다른 유전자를 표적으로하는 가이드 RNA 라이브러리는 유익한 변화를 선별하거나 선택하는 데 사용되었다. 마지막으로, 원핵 생물 유전자의 활성화는 대장균에서 낮은 처리량으로 입증되었다.
그러나, 이들 기술을 성공적이고 고 처리량의 대사 공학 캠페인에 통합할 필요가 있다. 또한, 이러한 이질적인 전략을 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 비정규 유기체에 결합하고 적용할 필요가 있다. 대사 공학 캠페인을 위해 대규모 dCas9 지향 가이드 RNA 라이브러리 세트를 적용하기 위한 충족되지 않은 요구가 있다.
본 발명은 테스트될 수 있는 전사 섭동의 수를 크게 증가시키면서 이루어져야 할 힘든 유전자 변경의 수를 감소시키는 스크리닝 도구로서 Cas9 또는 dCas9를 사용하는 것을 설명한다. 본 발명은 CRISPRi/CRISPRa 응용을 위해 현재 개시된 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 힘 및 유연성을 활용함으로써 이러한 우려를 해결한다. 이들 접근법은 단독으로 사용될 수 있거나, 특정 실시태양에서, 숙주 게놈 서열로부터 발현을 조절하고 게놈 서열도 변형하기 위해 게놈 변형을 위한 CRISPR 접근법과 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 구조체는 DNA를 암호화하는 활성 및 불활성 CRISPR 단백질 둘 다를 포함할 수 있거나, 상이한 구조체가 상이한 CRISPR(예를 들어, 불활성 및 활성) CRISPR 형태를 함유하는 다중 구조체가 생성될 수 있다.
기술 개요
일부 실시태양에서, 본 발명은 CRISPRi(CRISPR 간섭) 및 CRISPRa(CRISPR 활성화) 기술을 통해 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 현재 개시된 기술은 더 이상 이중 DNA 가닥 파손을 생성하지 않도록 돌연변이된 촉매적으로 비활성화된(즉, 뉴클레아제-비활성화된) CRISPR 엔도뉴클레아제를 사용하지만, 여전히 이들의 상응하는 가이드 RNA를 통해 DNA 표적 부위에 결합할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 "죽은(dedd) CRISPR" 또는 "dCRISPR" 효소로서 이러한 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 지칭한다. "죽은" 변형자는 또한 죽은 Cas9(dCas9) 또는 죽은 Cpf1(dCpf1)과 같은 특정 CRISPR 효소와 관련하여 사용될 수 있다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 이 기술의 dCRISPR 효소가 촉매적으로 불활성화된 dCRISPR 효소를 가이드 RNA를 통해 표적 DNA 서열로 모집함으로써 기능하여, dCRISPR 효소가 특정 유전자에 대한 숙주 세포의 전사 기계와 상호 작용하게 한다고 믿는다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 CRISPRi 방법은 dCRISPR 효소를 사용하여 전사에 필요한 표적 DNA 서열을 점유하여 표적화된 유전자의 전사를 차단한다(L. S. Qi et al.,　"Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression." Cell. 152, 1173-1183 (2013); 또한 L. A. Gilbert et al., "CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes." Cell. 154, 442-451 (2013) 참조). 다른 실시태양에서, 본 발명의 CRISPRi 방법은 번역적으로 융합되거나 그렇지 않으면 하나 이상의 전사 억제 도메인에 테더링된 dCRISPR 효소를 이용하거나, 대안적으로 표적 부위에 전사 억제 도메인을 모집할 수 있는 변형된 가이드 RNA를 이용한다(예를 들어, 아래에 논의된 바와 같이, 앱타머를 통해 테더링됨).
일부 실시태양에서, 본 발명의 CRISPRa 방법은 가이드 RNA에 의해 프로모터 영역으로 지시될 수 있는 상이한 전사 활성화 도메인에 번역적으로 융합되거나 그렇지 않으면 테더링된 dCRISPR 효소를 이용한다. (A. W. Cheng et al.,　"Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system." Cell Res. 23, 1163-1171 (2013) 참조; 또한 L. A. Gilbert et al.,　"Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation." Cell. 159, 647-661 (2014) 참조). 다른 실시태양에서, 본 발명의 CRISPRa 방법은 표적 유전자의 발현을 상향 조절하기 위해 추가 전사 활성화 도메인을 모집하는 변형된 가이드 RNA를 이용한다(예를 들어, 아래 논의 된 바와 같이 앱타머를 통해 테더링됨).
또 다른 실시태양에서, 현재 개시된 발명은 또한 dCRISPR 효소 및 가이드 RNA를 이용하여 DNA 부위를 표적화하기 위한 다른 조절 인자를 모집하는 것을 구상한다. 위에서 논의된 바와 같이, 전사 억제자 또는 활성화 도메인을 모집하는 것 외에도, 본 발명의 dCRISPR 효소 및 가이드 RNA는 DNA 메틸화, 염색질 리모델러, 유비퀴틴화, 수모일화 범위의 활성을 갖는 단백질을 모집하도록 변형될 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 dCRISPR 효소 및 가이드 RNA는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 탈아미노화 활성, 디스뮤타제 활성, 알킬화 활성, 탈정제 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 재조합 효소 활성, 중합 효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 광분해 효소 활성, 글리코실라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데 닐화 활성, 데아데닐화 활성, 스모일화 활성, 데수모일화 활성, 리보실화 활성, 데리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 리모델링 활성, 프로테아제 활성, 산화 환원 효소 활성, 트랜스페라제 활성, 가수 분해 효소 활성, 라이아제 활성, 이성화 효소 활성, 신타제 활성, 신티타제 활성, 데미리스토일화 활성, 시티딘 데아미나제 활성 및 이의 임의의 조합을 갖는 인자를 모집하도록 변형될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 dCRISPR 효소 및 가이드 RNA는 형광 단백질, 금 입자, 방사성 동위 원소, GUS 효소, 또는 검출될 수 있는 다른 공지된 생물학적 또는 합성적 조성물과 같은 하나 이상의 마커 유전자/조성물을 모집하도록 변형될 수 있다. 이 마지막 실시태양은 연구자들이 숙주 세포의 게놈 영역에 태그를 지정하고 추적할 수 있게 한다. 본 발명에 사용된 용어 "cis 조절 인자"는 본 발명의 dCRISPR 또는 가이드 RNA에 의해 모집될 수 있는 임의의 생물학적 또는 합성적 조성물을 지칭한다.
고 처리량 CRISPRi 및 CRISPRa 벡터
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포의 고 처리량 CRISPRi/CRISPRa 유전 공학을 위한 벡터, 키트 및 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 효율적인, 게놈-전체 유전자 발현 변형(증가 또는 감소)을 수행하기 위해 본 출원에서 논의된 모듈식 CRISPR 구조체의 힘을 활용한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체는 한 번에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상의 유전자의 발현을 조절(증가 또는 감소)할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 CRISPRi 또는 CRISPRa 시스템을 암호화하는 핵산을 포함하는 모듈식 CRISPR 구조체를 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체는 i) dCRISPR 효소를 암호화하는 제 1 핵산 서열, 및 ii) dCRISPR 효소를 DNA 표적 부위에 모집할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 제 2 핵산을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 CRISPRa/CRISPRi 시스템의 하나 이상의 부분이 이미 숙주에 존재하거나 별도의 벡터에 의해 제공되는 경우 벡터로부터 제외될 수 있음을 교시한다. 따라서 일부 실시태양에서, 모듈식 CRISPR 구조체는 dCRISPR 효소를 암호화하지 않을 것이다. 다른 실시태양에서, 모듈식 CRISPR 구조체는 가이드 RNA를 암호화하지 않을 것이다.
당업자는 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체가 하나 초과의 dCRISPR 효소 및/또는 하나 초과의 가이드 RNA를 암호화할 수 있음을 인식할 것이다(예를 들어, 도 18a-b 참조).
일부 실시태양에서, dCRISPR 효소 및/또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체의 하나 이상의 삽입체 부분에 함유된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 모듈식 CRISPR 구조체는 사용자가 상이한 가이드 RNA(예를 들어, 위에서 논의한 바와 같이, 상이한 유전자를 표적화하는 가이드 RNA 또는 상이한 cis 조절 인자를 모집할 수 있는 앱타머를 암호화하는 가이드 RNA) 또는 상이한 dCRISPR 효소(예를 들어, 위에서 논의한 바와 같이, 다양한 cis 조절 인자와의 dCas9, 또는 dCpf1, 또는 dCRISPR 단백질 융합)를 암호화하는 삽입체 부분을 추가 또는 제거하기 위해 구조체를 빠르고 효과적으로 변형하게 한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 모듈식 CRISPR 구조체의 삽입체 부분이 단일 암호화 서열만을 포함함을 교시한다. 즉, 일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 단일 dCRISPR에 대해서만 암호화하거나 단일 가이드 RNA에 대해서만 암호화할 것이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 바람직한 유전자 조합을 갖는 삽입체 부분을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 삽입체 부분은 생합성 경로에서 2개 이상의 유전자를 표적화하는 가이드 RNA와 같은 다중 가이드 RNA를 암호화하도록 디자인될 수 있다. 다른 실시태양에서, 단일 삽입체 부분은 하나 초과의 dCRISPR 효소를 암호화하도록 디자인될 수 있다. 일부 실시태양에서, 다른 유전자는 또한 가이드 RNA 또는 dCRISPR 효소와 조합하여 암호화될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은, 예를 들어, 삽입체 부분을 함유하는 세포를 확인하기 위해서, 구조체 의해 암호화된 하나 이상의 구성 요소와 연관될 수 있는(즉, 존재를 입증하기 위해 사용되는) 선별 가능한 마커를 암호화하도록 디자인된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 삽입체 부분은 특정 dCRISPR 효소를 암호화하는 핵산 서열과 함께 선택 가능한 마커를 포함하도록 디자인될 수 있다. 본 발명은 추가로 삽입체 부분의 블록, 예를 들어, 특정 생합성 경로를 표적으로 하는 가이드 RNA의 블록, 또는 하나 이상의 cis 조절 인자를 암호화하는 삽입체 부분의 블록의 선택을 위한 선택 가능한 마커의 사용을 추가로 구상한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 자체 포함되도록 디자인되어, 삽입체 부분의 발현에 필요한 모든 요소를 포함한다. 즉, 일부 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분은 삽입체 부분이 숙주 세포 기구에 의해 발현되는 데 필요한 모든 필요한 프로모터 및/또는 터미네이터를 포함할 것이다(반드시 복제 기원 또는 플라스미드를 유지하는 데 필요한 선택 가능한 마커를 계산할 필요는 없음). 다른 실시태양에서, 본 발명의 삽입체 부분의 발현은 다른 삽입체 부분에 위치한 프로모터 또는 터미네이터 서열, 예를 들어, 유전자 암호화 삽입체 부분의 바로 상류에 위치하는 것, 또는 단일 삽입체 부분에 있거나 하나 이상의 삽입체 부분에 걸쳐 있는 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산의 시작부에 위치되는 것에 의존할 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 모듈식 CRISPR 구조체의 삽입체 부분 중 하나 이상의 발현을 유도하기 위한 유도성 프로모터의 사용을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 dCRISPR 효소를 암호화하는 핵산의 발현을 유도하기 위한 유도성 프로모터의 사용을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 가이드 RNA를 암호화하는 핵산의 발현을 유도하기 위한 유도성 프로모터의 사용을 교시한다.
일부 실시태양에서, 모듈식 cTAG 벡터의 모든 기능적 부분(예를 들어, 모든 기원, 마커,화물, 프로모터, 터미네이터 및 조립에 필요한 모든 요소)은 삽입체 DNA 부분 내에 포함되며 본 발명의 DNA 조립 또는 유전자 편집 방법을 통해 쉽게 교환될 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, 현재 개시된 모듈식 구조체는 dCRISPR 효소를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 상이한 프로모터 또는 터미네이터의 신속한 스위칭 및 테스팅을 허용한다. 다른 특정 실시태양에서, 현재 개시된 모듈식 구조체는 sgRNA 또는 crRNA/tracrRNA 또는 가이드 RNA 또는 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 상이한 프로모터 또는 터미네이터의 신속한 스위칭 및 테스팅을 허용한다.
복제 기원
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 종에서 플라스미드를 유지(즉, 계속 복제)하기 위한 복제 기점의 사용을 교시한다. 당업자는 다양한 이용 가능한 복제 서열 기원에 익숙할 것이다. 박테리아, 고세균, 진핵 생물 및 다세포 생물에 대한 복제 기원의 공통적인 특징은 Leonard and Mechali, "DNA replication Origins" Cold Spring Harb Perspect Biol 2013 Oct; 5(10)에서 논의된다. 일반적인 복제 기원의 비 제한적인 목록은 아래 표 4에 제공된다.
일반적인 벡터 및 복제 기원 목록
일반 벡터 복제 수+ ORI 제어
pUC ~500-700 pMB1 (유도체) 완화
pBR322 ~15-20 pMB1 완화
pET ~15-20 pBR322 완화
pGEX ~15-20 pBR322 완화
pColE1 ~15-20 ColE1 완화
pR6K ~15-20 R6K* 엄격
pACYC ~10 p15A 완화
pSC101 ~5 pSC101 엄격
pBluescript ~300-500 ColE1 (유도체) 및 F1** 완화
pGEM ~300-500 pUC 및 F1** 완화
Cis 조절 요소(전사 조절자) 테더링
일부 실시태양에서, 본 발명은 전사 조절자의 사용을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, cis 조절 인자는 전사 조절자이다. 일부 실시태양에서, 전사 조절자는 본 발명의 CRISPRi/CRISPRa 방법에 의해 표적화된 유전자의 발현을 추가로 억제하는 능력 또는 대안적으로 활성화하는 능력에 기초하여 선택된다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 (즉, 융합 구조체의 사용을 통해) dCRISPR 효소와 전사 조절자를 테더링 또는 번역적으로 융합시키는 것을 교시한다.
융합 구조체는 일반적으로 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열은 개별적으로 조립될 수 있고 삽입체 부분과 같은 적절한 구조체로 결찰될 수 있다. 결찰된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 하나의 펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 5' 또는 3' 말단은 제 2 펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 각각 3' 또는 5' 말단에 펩타이드 링커에 의해 또는 펩타이드 링커 없이 결찰되어 서열의 판독 프레임은 위상이 동일하다. 이것이 두 성분 펩타이드의 생물학적 활성을 유지하는 단일 융합 단백질로의 번역을 허용한다.
일부 실시태양에서, dCRISPR 효소 및 전사 조절자 도메인은 펩타이드 링커를 통해 연결된다. 펩타이드 링커 서열은 각각의 펩타이드가 2차 및 3차 구조로 접히는 것을 보장하기에 충분한 거리만큼 제 1 및 제 2 펩타이드 성분을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 펩타이드 링커 서열은 당업계에 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 융합 단백질에 통합된다. 적합한 펩타이드 링커 서열은 다음 인자에 기초하여 선택될 수 있다: (1) 유연한 확장 형태를 채택하는 능력; (2) 제 1 및 제 2 펩타이드의 기능 영역과 상호 작용할 수 있는 이차 구조를 채택하지 못하는 능력; 및 (3) 펩타이드 기능성 영역과 반응할 수 있는 소수성 또는 하전된 잔기의 부족. 특정 실시태양에서, 펩타이드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala와 같은 다른 거의 중성 아미노산도 링커 서열에 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 전사 조절자 도메인을 dCRISPR에 테더링하기위한 단백질-단백질 상호 작용 도메인의 사용을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, dCRISPR 효소의 서열은 전사 조절자(또는 기타 cis 조절 요인)에 번역적으로 융합된 제 2 단백질-단백질 상호 작용 도메인(PP2)과 이량체화할 수 있는 제 1 단백질-단백질 상호 작용 도메인(PP1)에 번역적으로 융합된다. 발현될 때, 각각의 dCRISPR-PP1 및 PP2-전사 조절자의 각각은 이량체화되어, 전사 조절자를 DNA 표적 부위에 모집한다. 당업자는 자연 발생 또는 합성 단백질-단백질 상호 작용 도메인을 사용하여 생체 내 이량체를 생성하는 방법을 알고 있을 것이다. (Giescke et al., 2006 "Synthetic protein-protein interaction domains created by shuffling Cys2His2 zinc-fingers." Mol Syst Biol 2: 2006.0011 참조).
다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 cis 조절 인자를 모집할 수 있는 RNA 앱타머를 갖는 변형된 가이드 RNA를 교시한다. 본 발명의 RNA 앱타머는 가이드 RNA의 5' 또는 3' 말단에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, DNA 표적 부위에 대한 dCRISPR 결합에 영향을 미치지 않도록 디자인된다. 대신, RNA 앱타머는 전사 조절자와 같은 하나 이상의 cis 조절 인자를 모집하기 위한 추가 테더를 제공한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 cis 조절 인자와 직접 상호 작용하도록 디자인된 맞춤형 RNA 앱타머를 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 특정 서열을 표적화하는 공지된 앱타머의 사용을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 확증된 RNA 앱타머를 갖는 가이드 RNA를 구상하고, 이는 이어서 하나 이상의 cis 조절 인자(즉, guide_RNA-Aptamer-Aptamer_Target-Cis_Regulatory_Factor)에 번역적으로 융합되는 천연 표적에 결합한다. 일부 실시태양에서, cis 조절 인자를 테더링하기 위해 RNA 앱타머를 통합하는 가이드 RNA는 스캐폴드 RNA(scRNA)로 지칭된다. (Zalatan JG, et al. "Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds." Cell. 2015;160:339-350). scRNA는 직교 작용하는 단백질 결합 RNA 앱타머로 가이드 RNA 서열을 확장함으로써 디자인되었다. 각 scRNA는 DNA 표적 인식 및 특정 억제 인자 또는 활성 인자 단백질 모집을 위한 정보를 암호화할 수 있다. 모듈 방식으로 DNA 표적화 서열 또는 RNA 앱타머를 변경함으로써, 여러 dCas9-scRNA가 동일한 세포에서 여러 유전자를 동시에 활성화하거나 억제할 수 있다.
예를 들어, 시너지 활성화 매개체(SAM) 시스템이라고 하는 개선은 MS2 앱타머를 가이드 RNA에 추가함으로써 달성되었다. MS2 앱타머는 p65AD 및 열 충격 계수 1(HSF1)에 융합된 동족 MS2 코트 단백질(MCP)을 모집하도록 디자인되었다(Dominguez et al., 2016 "Beyond editing; repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation" Nat Rev Mol Cel Biol Jan 17(1) 5-15). SAM 기술은 dCas9-VP64와 함께 dCas9?VP64 단독에 비해 내인성 유전자 활성화를 더욱 증가시켰으며 동시에 10개의 유전자를 활성화하는 것으로 나타났다. (Konermann S, et al. "Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex."　Nature.　2014; 517:583-588). 유사한 결과는 PP7 또는 com과 같은 다른 확증된 앱타머-스캐폴드 단백질 조합을 사용하여 얻을 수 있다. (Zalatan JG, et al. "Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds." Cell. 2015;160:339-350).
일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 dCRISPR 효소를 하나 이상의 cis 조절 인자에 테더링할 수 있는 양면 앱타머의 사용을 구상한다. 본 발명의 양면 앱타머는 상기 논의된 앱타머와 유사하게 기능하지만, dCRISPR 단백질 및 cis 조절 인자 모두에 결합할 수 있다. 하나의 예시적인 예에서, dCRISPR 효소는 MS2 코트 단백질 도메인에 번역적으로 융합될 것이고, cis 조절 요소(VP16 도메인)는 PP7 도메인에 번역적으로 융합될 것이다. 양면 RNA 앱타머는 한 말단에 MS2 결합 도메인을 포함하고 다른 말단에 PP7 결합 도메인을 포함할 것이다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 양면 앱타머는 다음의 일반적인 구조를 형성할 것으로 예상될 수 있다: dCRISPR-Aptamer_Target-Aptamer_Side1-Aptamer_Side2-Aptamer_Target-Cis_Regulatory_Factor.
현재 개시된 발명과 양립 가능한 전사 활성화 도메인의 비 제한적인 목록은 VP16, VP64, VP160, EBNA2, E1A, Gal4, Oaf1, Leu3, Rtg3, Pho4, Gln3, Gcn4, Gli3, Pip2, Pdr1, Pdr3, Lac9, Tea1, p53, NFAT, Sp1(예를 들어, Sp1a), AP-2(예를 들어, Ap-2a), Sox2, NF-κB, MLL/ALL, E2A, CREB, ATF, FOS/JUN, HSF1, KLF2, NF-1L6, ESX, Oct1, Oct2, SMAD, CTF, HOX, Sox2, Sox4, VPR, RpoZ 또는 Nanog의 전사 조절 기능을 갖는 전사 조절 도메인의 단편 및 도메인의 단편을 포함한다. 일부 실시태양에서, 전사 활성자는 VPR이다(Kiani S. et al., "Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression" Nature Methods 12, 1051-1054 (2015) 참조).
현재 개시된 발명과 양립 가능한 전사 억제자의 비 제한적인 목록은 다른 것들 중에서 다음을 포함한다: Mxi1, Tbx3, KRAB(Kruppel-associated box, Margolin, J. F, et al. "Kruppel-associated boxes are potent transcriptional repression domains."　Proc. Natl. Acad. Sci. USA　91, 4509-4513 (1994)), EnR 또는 SID, SID4X(짧은 펩타이드 링커에 의해 연결된 4개의 SID 도메인의 직렬 반복체), PIE-1, IAA28-RD.
일부 실시태양에서, 본 발명의 전사 활성화 도메인은 표 5의 활성화 도메인을 포함한다. 9개-아미노산 트랜스활성화 도메인(9 aaTAD)은 효모에서 Gal4, Oaf1, Leu3, Rtg3, Pho4, GIn3, Gcn4 및 포유류에서 p53, NFAT, NF-κB 및 VP16으로 표시되는 진핵 전사 인자의 큰 수퍼패밀리에 공통되는 신규 도메인을 정의한다. 9개의 aa TAD(산성 및 친수성 트랜스 활성화 도메인 모두)에 대한 예측은 ExPASy™ 및 EMBnet™ 데이터베이스에서 온라인으로 제공된다.
전사 활성화 도메인의 비 제한적인 예
전사 인자 소스 9 aa TAD
P53　TAD1 ETFSDLWKL (SEQ ID NO: 114)
P53　TAD2 DDIEQWFTE (SEQ ID NO: 115)
MLL DIMDFVLK (SEQ ID NO: 116)
EA2 DLLDFSMMF (SEQ ID NO: 117)
Rtg3 ETLDFSLVT (SEQ ID NO: 118)
CREB RKILNDLSS (SEQ ID NO: 119)
CREBaB6 EAILAELKK (SEQ ID NO: 120)
Gli3 DDVVQYLNS (SEQ ID NO: 121)
Gal4 DDVYNYLFD (SEQ ID NO: 122)
Oaf1 DLFDYDFLV (SEQ ID NO: 123)
Pip2 DFFDYDLLF (SEQ ID NO: 124)
Pdr1 EDLYSILWS (SEQ ID NO: 125)
Pdr3 TDLYHTLWN (SEQ ID NO: 126)
가이드 RNA 다중 시스템
일부 실시태양에서, 본 발명은 가이드 RNA 다중 시스템의 사용을 교시한다. 즉, 일부 실시태양에서, 본 발명은, 예를 들어 다중 프로모터 또는 폴리시스 트론 전사체를 사용하여 하나 이상의 가이드 RNA를 발현하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 Csy4 다중 시스템의 사용을 교시한다. 과발현되면, Csy4는 28개의 염기 Csy4 인식 부위 사이에 끼어있는 gRNA를 효율적으로 절단한다. CpfI는 또한 여러 gRNA를 처리할 수 있다. (Murata et al. 2018., "Highly multiplexed genome engineering using CRISPR/CAS9 gRNA arrays" PLOS ONE 13(9): e0198714 참조, 모든 목적을 위해 전문이 본 발명에 포함된다). Csy4 또는 기타 다중 시스템이 발현되지 않으면, gRNA가 방출되지 않아 시스템에 시간적 및/또는 공간적 제어가 추가된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 가이드 RNA는 리보뉴클레아제 인식 부위에 의해 플랭킹된다. 리보뉴클레아제(RNase로 약칭)는 RNA의 가수 분해를 촉매하는 뉴 클레아제이다. 리보뉴클레아제는 엔도리보뉴클레아제 또는 엑소리보뉴클레아제일 수 있다. 엔도리보뉴클레아제는 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA를 절단한다. 엑소 리보뉴클레아제는 RNA의 5' 말단 또는 3' 말단에서 말단 뉴클레오티드를 제거하여 RNA를 분해한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 가이드 RNA는 Csy 리보뉴클레아제 인식 부위(예를 들어, Csy4 리보뉴클레아제 인식 부위)에 의해 플랭킹된다. Csy4는 특정 RNA 서열을 인식하고 RNA를 절단하며 상류 단편에 결합된 상태로 유지되는 엔도리보뉴클레아제이다. 일부 실시태양에서, Csy 리보뉴클레아제(예를 들어, Csy4 리보뉴클레아제)는 조작된 핵산 전사체로부터 가이드 RNA를 방출하기 위해 사용된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 세포는 Csy4 또는 다른 Cas6 리보뉴클레아제 인식 부위에 의해 플랭된 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 Csy4 또는 다른 Cas6 리보뉴클레아제를 암호화하는 조작된 핵산을 포함하는 조작된 구조체로 공동 형질감염된다. 대안적으로 또는 추가로, 세포는 Csy4 또는 다른 Cas6 리보뉴클레아제를 안정적으로 발현하거나 안정적으로 발현하도록 변형될 수 있다. 일부 실시태양에서, Csy 리보뉴클레아제(예를 들어, Csy4 리보뉴클레아제)는 수도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로콕쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 피로콕쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 또는 설폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)로부터의 것이다. 다른 리보 뉴클레아제 및 리보뉴클레아제 인식 부위가 본 발명에서 고려된다(예를 들어, Mojica, F. J. M. et al.,　CRISPR-Cas Systems, RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea, Barrangou, Rodolphe, van der Oost, John (Eds.), 2013, ISBN 978-3-642-34657-6 참조, 이의 리보뉴클레아제/인식 부위와 관련된 주제는 본 발명에 참고로 포함된다).
일부 실시태양에서, 리보뉴클레아제 인식 부위(예를 들어, Csy4 리보뉴클레아제 인식 부위)는 길이가 10개 내지 50개 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, Csy 리보뉴클레아제 인식 부위는 10 내지 40개, 10 내지 30개, 10 내지 20개, 20 내지 50개, 20 내지 40개 또는 20 내지 30개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시태양에서, Csy 리보뉴클레아제 인식 부위는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시태양에서, Csy 리보뉴클레아제 인식 부위(예를 들어, Csy4 리보뉴클레아제 인식 부위)는 28개 뉴클레오타이드 길이이다. Csy 동족체도 본 발명에서 고려된다(예를 들어, Mojica, F. J. M. et al.,　CRISPR-Cas Systems, RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea, Barrangou, Rodolphe, van der Oost, John (Eds.), 2013, ISBN 978-3-642-34657-6 참조, 이의 리보뉴클레아제/인식 부위와 관련된 주제는 본 발명에 참고로 포함된다). 또한 미국 특허 일련 번호 US 9,745,610 및 미국 공개 출원 US 2017/022499를 참조하며, 이들 각각은 모든 목적을 위해 전문이 본 발명에 포함된다.
발현, 정제 및 배달
일부 실시태양에서, 본 발명은 CRISPR 복합체를 암호화하는 벡터, 구조체 및 핵산 서열의 방법 및 조성물을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 Cas9 또는 Cpf1 단백질의 형질전환 또는 일시적인 발현을 위한 플라스미드를 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 리가아제, 링커 및 NLS를 포함하나 이에 제한되지 않는, 본 발명에 기술된 하나 이상의 다른 폴리펩타이드의 단백질 융합을 위한 인 프레임 서열을 포함하는 키메라 Cas9 또는 Cpf1 단백질을 암호호하는 플라스미드를 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 플라스미드 및 벡터는 Cas9/Cpf1 단백질을 암호화하고 또한 본 발명의 crRNA/tracrRNA/sgRNA 및/또는 도너 삽입체 서열을 암호화할 것이다. 다른 실시태양에서, 조작된 복합체의 상이한 성분은 하나 이상의 별개의 플라스미드에서 암호화될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 플라스미드는 여러 종에 걸쳐 사용될 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, 단일 플라스미드는 삽입체 부분을 다중 종, 예를 들어 다중 박테리아 종, 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰 및 대장균에 도입할 수 있도록 디자인될 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 플라스미드는 형질전환되는 유기체에 맞추어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 서열은 이의 유전자가 편집되고 있는 유기체에서 발현하도록 코돈-최적화될 것이다. 당업자는 유전자 편집을 위한 적절한 발현을 제공하는 프로모터의 사용의 중요성을 인식할 것이다. 일부 실시태양에서, 상이한 종에 대한 플라스미드는 상이한 프로모터를 필요로 할 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 플라스미드 및 벡터는 관심 세포에서 선택적으로 발현된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 이소성 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 발달 조절된 프로모터, 또는 유도성 프로모터의 사용을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 터미네이터 서열의 사용을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 Cpf1 및/또는 Cas9 엔도뉴클레아제 단백질을 발현 및 정제하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 단백질이 상업적으로 입수 가능한 단백질 생산 및 정제 키트 또는 서비스 중 임의의 것에 의해 생산될 수 있음을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 Cas9 및/또는 Cpf1을 폴리히스티딘(His), 글루타티온 s-트랜스퍼라제(GST) 또는 다른 정제 태그 키메라 융합으로 벡터 속에 복제하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 다양한 원핵 생물 및 진핵 생물, 및 무세포 단백질 생산 시스템을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 대장균 BL21에서 단백질 발현 플라스미드의 발현을 교시한다. 일부 실시태양에서, 단백질 생산 시스템은 단백질 독성의 영향을 감소시키도록 유도성일 것이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 IPTG 또는 아라비노스 유도 시스템을 사용하는 방법을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 친화성 태그(His-Nickel, GST-Glutathione 등)를 포함하는 다양한 단백질 정제 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 단백질 정제를 위한 천연 조건 및 변성 조건 모두를 교시한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 GenScript®, ThermoFisher® 및 NovoProtein®을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 단백질 생산 서비스를 통한 Cas9 및/또는 Cpf1의 생산을 교시한다.
형질전환
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 플라스미드 및 벡터의 형질전환의 사용을 교시한다. 당업자는 본 발명의 플라스미드가 본 명세서의 다른 부분에서 기술된 바와 같이 임의의 공지된 시스템을 통해 세포로 형질전환될 수 있음을 인식 할 것이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 입자 폭격, 화학적 형질전환, 아그로박테리움 형질전환, 나노-스파이크 형질전환, 전기천공 및 바이러스 형질전환에 의한 형질전환을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 형질전환, 형질감염, 형질도입, 바이러스 감염, 유전자 총 또는 Ti 매개 유전자 전달을 포함하는 다양한 기술 중 임의의 것을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 특정 방법은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공을 포함한다(Davis, L., Dibner, M., Battey, I. 1986 "Basic Methods in Molecular Biology"). 다른 형질전환 방법은, 예를 들어, 아세트산 리튬 형질전환 및 전기천공을 포함한다. 예를 들어, Gietz et al.,　Nucleic Acids Res.　27:69-74 (1992); Ito et al.,　J. Bacterol.　153:163-168 (1983); 및 Becker and Guarente,　Methods in Enzymology　194:182-187 (1991)를 참조한다. 일부 실시태양에서, 형질전환된 숙주 세포는 재조합 숙주 균주로 불린다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 96-웰 플레이트 로보틱스 플랫폼 및 액체 취급 기계를 사용하여 세포의 고효율 형질전환을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 외인성 단백질(Cpf1/Cas9 및 DNA 리가아제), RNA(crRNA/tracRNA/가이드 RNA) 및 DNA(삽입체 DNA 부분 또는 모듈식 CRISPR 구조체)를 세포 내로 얻는 방법을 교시한다. 단백질/RNA/DNA의 직접 형질감염 또는 DNA 형질전환과 RNA 및 단백질의 세포내 발현을 포함하는 이를 달성하기 위한 다양한 방법은 이전에 기술되어있다(Dicarlo, J. E. et al. "Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems." Nucleic Acids Res (2013). doi:10.1093/nar/gkt135; Ren, Z. J., Baumann, R. G. & Black, L. W. "Cloning of linear DNAs in vivo by overexpressed T4 DNA ligase: construction of a T4 phage hoc gene display vector." Gene 195, 303-311 (1997); Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K. & Doudna, J. A. "Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery." Elife 3, e04766 (2014)).
일부 실시태양에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 하나 이상의 선택 마커로 형질전환된 세포를 선별하는 것을 교시한다. 이런 일 실시태양에서, 카나마이신 내성 마커(KanR)를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포는 유효량의 카나마이신 항생제를 함유하는 배지 상에 플레이트된다. 카나마이신-레이스(kanamycin-laced) 배지에서 볼 수 있는 콜로니 형성 단위는 벡터 카세트를 게놈에 통합시킨 것으로 추정된다. 원하는 서열의 삽입은 PCR, 제한 효소 분석 및/또는 관련 삽입 부위의 서열 분석을 통해 확인될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 일부 또는 전체 복합체는 세포에 직접 전달될 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드 및 핵산의 발현 및 정제를 교시한다. 당업자는 단백질 및 핵산을 정제하는 많은 방법을 인식할 것이다. 일부 실시태양에서, 폴리펩타이드는 박테리아 시스템, 효모 시스템, 식물 세포 시스템 또는 동물 세포 시스템과 같은 유도성 또는 구조성 단백질 생산 시스템을 통해 발현될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 친화성 태그 또는 맞춤형 항체 정제를 통한 단백질 및/또는 폴리펩타이드의 정제를 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드에 대한 화학적 합성 방법을 교시한다.
일부 실시태양에서, 당업자는 유전자 발현을 위한 바이러스 벡터 또는 플라스미드가 본 발명에 개시된 복합체를 전달하는 데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 바이러스-유사 입자(VLP)는 리보뉴클레오단백질 복합체를 캡슐화하는데 사용될 수 있고, 본 발명에 개시된 정제된 리보뉴클레오타이드 복합체는 정제되고 전기 천공 또는 주사를 통해 세포로 전달될 수 있다.
키트
일부 실시태양에서, 본 발명은 상기 방법 및 조성물에 개시된 임의의 하나 이상의 요소를 함유하는 키트를 제공한다. 일부 실시태양에서, 키트는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 및 키트 및 임의의 필요한 시약 또는 반응물의 사용 지침을 포함한다. 일부 실시태양에서, 벡터 시스템은, 본 출원에서 상기한 바와 같이, (a) 모듈식 CRISPR DNA 구조체, (b) CRISPR 엔도뉴클레아제 단백질 및 필요한 표적 가이드 RNA(들)(또는 상기 항목을 암호화하는 서열)을 포함하는 CRISPR 복합체 및 선택적으로 (c) 삽입체 DNA 부분을 포함한다.
요소는 개별적으로 또는 조합으로 제공될 수 있으며, 바이알, 병 또는 튜브, 또는 숙주 세포 또는 플라스미드와 같은 임의의 적합한 용기에 제공될 수 있다. 일부 실시태양에서, 키트는 하나 이상의 언어, 예를 들어 하나 초과 언어의 지침을 포함한다.
일부 실시태양에서, 키트는 본 발명에 기술된 하나 이상의 요소(예를 들어, 정제된 Cpf1 엔도뉴클레아제)를 이용하는 공정에서 사용하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 시약은 임의의 적절한 용기에 제공될 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 반응 또는 저장 버퍼를 제공할 수 있다. 시약은 특정 분석에서 가능하거나 사용 전에 하나 이상의 다른 성분의 첨가를 필요로 하는 형태(예를 들어, 농축액 또는 동결건조 형태)로 제공될 수 있다. 완충액은 탄산나트륨 완충액, 중탄산나트륨 완충액, 붕산염 완충액, 트리스 완충액, MOPS 완충액, HEPES 완충액 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 완충액일 수 있다. 일부 실시태양에서, 완충액은 알칼리성이다. 일부 실시태양에서, 완충액은 약 7 내지 약 10의 pH를 갖는다. 일부 실시태양에서, 키트는 crRNA 서열 및 조절 요소를 작동 가능하게 연결시키기 위해 벡터에 삽입하기 위한 crRNA 서열에 상응하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 다양한 실시태양을 설명하기 위해 제공되며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 청구항의 범위에 의해 정의된 바와 같이, 본 발명의 취지 내에 포함되는 본 발명의 변화 및 다른 용도는 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 1: 원-포트 생체외 모듈식 CRISPR 복제
이 실시예는 원 포트 반응에서 하나의 플라스미드로부터 다른 플라스미드로 삽입체를 전달함으로써 플라스미드 13001009086(SEQ ID NO: 82)의 생성을 기술한다. 도 4를 참조.
두 플라스미드는 관심 부위에 인접하는 복제 태그를 운반한다(cTAG K [SEQ ID NO: 78] /cTAG L [SEQ ID NO: 79] 및 cTAG K' [SEQ ID NO: 80] /cTAG L' [SEQ ID NO: 81]). 편집된 플라스미드 대한 복제 반응을 유도하기 위해, Cpf1 스페이서는 수용자 및 도너 플라스미드(각각 K/K' 및 L/L') 상에서 반대 방향에 있다. 이 인사이드-아웃(inside-out)/아웃사이드-인(outside-in) 분해는 최종 생성물의 Cpf1 스페이서를 제거하여, 원하는 생성물의 재절단을 제거한다('485 플라스미드의 인사이드-아웃 및 '784 플라스미드의 아웃사이드-인 분해를 묘사하는 도 4의 곡선 화살표 참조). Cas9 스페이서는 유지되어, 이 부위에서 반복 편집을 가능하게 한다. 따라서, 메가모듈식 구조체는 반복 편집을 가능하게 하는 신속한 단일-포트 반응 방식을 허용한다.
Cpf1 단백질은 젠스트립(Genscript)에 의해 합성하였고, crRNA는 씬티코(Synthego)에 의해 합성하였다. crRNA(crRNA 1 및 crRNA 3)로 복합체화된 Cpf1 단백질을 ATP를 함유하는 완충액 속 플라스미드(13000789485 - SEQ ID NO: 83 and 13000823784 - SEQ ID NO: 84) 및 DNA 리가아제에 첨가하였다. 이런 성분을 절단과 결찰에 최적화된 온도에서 회수하였다.
반응물을 대장균으로 형질전환시키고 양성 클론을 서열 분석하여 새로운 삽입체의 삽입 및 Cpf1 스페이서의 손실을 확인하였다.
결실을 위해, 사용된 복제 태그 내의 Cpf1 부위는 플라스미드 밀봉을 허용하기 위해 양립 가능한 오버행을 생성해야 한다. cTAG L'은 2개의 Cpf1 스페이서를 포함하도록 디자인되었는데, 하나는 오버행이 cTAG K'와 양립 가능하지 않은 경우에 삽입을 위한 것이고 두 번째는 오버행이 cTAG K'와 양립 가능한 경우에 결실을 위한 것이다.
실시예 2: 생체외 모듈식 CRISPR 복제
이 실시예는 CRISPR 클로닝의 유연성을 입증하기 위해 디자인되었다. 초기 단계로서, 키나마이신 또는 클로람페니콜 내성 유전자를 암호화하는 몇 가지 내성 플라스미드를 각각 소스 벡터 pzHR039(SEQ ID No: 100) 및 13000223370(SEQ ID No: 101)으로부터 생성하였다. 카나마이신 내성 플라스미드는 각각 GFP 유전자의 측면에 위치하는 다양한 Cpf1 랜딩 부위를 포함하도록 디자인하였다(분해시, 이들 플라스미드는 "카나마이신 내성 플라스미드 백본"을 생성한다). 클로람페니콜 내성 플라스미드는 각각 클로람페니콜 내성 유전자의 측면에 위치하는 다양한 Cpf1 랜딩 부위를 포함하도록 디자인하였다(분해시, 이들 플라스미드는 "클로람페니콜 내성 삽입체"를 생성한다). 이 실시예에서 사용된 각각의 플라스미드에 대한 서열 및 벡터 지도가 표 6에 개시되어 있다.
각각의 카나마이신 및 클로람페니콜 내성 플라스미드는 초기에 타입 II 제한 효소 KpnI-HF 및 PvuI-HF(모두 NEB로부터 상업적으로 입수 가능함)로 선형화시켰다. 각 플라스미드 상의 KpnI 및 PvuI 제한 부위의 위치는 도 7 내지 도 14에 제공된 벡터 지도에 기재되어 있다. 선형화 후 저항성 플라스미드는 더 이상 박테리아 숙주 시스템에서 자체 복제가 불가능하였다.
그런 후에 선형화된 내성 플라스미드를 60μL의 반응물에서 15μg(최종 농도 1.58 μM)의 Cpf1 효소와 2μL의 5μM의 각각의 가이드 RNA(최종 농도 0.167μM)와 혼합하여 활성 CRISPR 복합체를 형성하였다.
본 실시예에서 사용된 Cpf1 효소는 IDT로부터 구입하였다. Cpf1은 아시다미노콕쿠스 에스피(Acidaminococcus sp.) Cpf1(AsCpf1)로부터 얻었다. 효소는 1개의 N-말단 핵 편재 서열(NLS) 및 1개의 C-말단 NLS뿐만 아니라 3개의 N-말단 FLAG 태그 및 C-말단 6-His 태그를 포함하도록 추가로 변형시켰다.
이 실시예에서 사용된 가이드 RNA는 IDT로부터 맞춤 주문하였다. 각 가이드 RNA는 선형화된 내성 플라스미드 내에 위치한 상이한 CRISPR 랜딩 부위를 표적으로 하도록 디자인하였다. 이 실시예에서, 백본 플라스미드의 Cpf1 랜딩 부위는 절제되었지만 삽입체의 결찰시 복원되었다. 표 6은 사용된 각 가이드 RNA의 가이드 서열 부분을 제공한다. 혼합물 내의 CRISPR 복합체는 카나마이신 내성 플라스미드 백본을 생성하기 위해 각각의 카나마이신 내성 플라스미드로부터 GFP 유전자를 절단하도록 디자인하였다(도 5, 제 2 패널 참조). 혼합물 내의 CRISPR 복합체는 또한 클로람페니콜 내성 플라스미드로부터 클로람페니콜 내성 유전자를 절단하여 클로람페니콜 내성 삽입체를 생성하도록 디자인하였다(도 5, 제 2 패널 참조). 각 반응의 카나마이신 내성 플라스미드 백본 및 클로람페니콜 내성 삽입체는 말단의 혼성화를 초래하여 "이중 내성" 카나마이신 및 클로람페니콜 플라스미드를 생성하는 양립 가능한 오버행을 생성하도록 유사하게 디자인하였다.
Cpf1 및 가이드 RNA를 포함하는 선형화된 내성 플라스미드 혼합물을 제조자의 권장된 Cpf1 완충액에서 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양시켰다. 선택된 반응을 아가로오스 겔 상에서 수행하고 생성된 단편을 표준 DNA 추출 키트(제조사의 지침에 따라 사용된 Zymo Research 키트)를 사용하여 정제 하였다. 정제(대조군) 및 비 정제(테스트).
카나마이신 내성 플라스미드 백본 및 클로람페니콜 내성 삽입체를 포함하는 DNA 단편은 T4 DNA 리가아제(NEB로부터 구입 가능)를 갖는 또는 갖지 않는 새로운 반응에서 결합되어 NEB10-B 세포(NEB로부터 구입 가능)로 형질전환되었다. 형질전환된 세포를 기능적 내성 플라스미드를 함유하지 않은 임의의 세포의 성장을 방지하도록 디자인된 카나마이신 및 클로람페니콜로 증강된 배지 상에 플레이팅하였다.
개별 콜로니를 생거 서열 분석하도록 보내서 Cpf1 복제 접합부를 확인하였다. 회수된 콜로니는 또한 표 6에 기술된 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 확증하였다. 도 5는 상기한 바와 같이 Cpf1 분해 전에 플라스미드를 선형화시킨 것을 제외하고는 상기한 일반적인 실험 디자인을 예시한다.
이 실시예 2에 사용된 서열 목록
성분 설명 SEQ ID NO
GFP Cpf1 cTAG M fwd 5' CAGCACCTGGATTACCCTGTTATCCCTAGTTTTGGGTTAAAGATGGTTAAATGATTCGAAAATAATAAAGGGAAAATCA 3' SEQ ID No: 86
GFP Cpf1 cTAG N fwd 5' CAGCACCTGGATTACCCTGTTATCCCTAGTTTTGGGATGTTAAGAGTCCCTATCTTCGAAAATAATAAAGGGAAAATCA 3' SEQ ID No: 87
GFP Cpf1 cTAG P fwd 5' CAGCACCTGGATTACCCTGTTATCCCTAGTTTTGAGGAGTGTTCAGTCTCCGTGAACTCGAAAATAATAAAGGGAAAATCA 3' SEQ ID No: 88
GFP Cpf1 cTAG O rvs 5' CGCTTCCTCCTGAAAATGCAGCTAGGTAGTTTTGACCGCCCCCCCCATACCCCAATCGACATGCCGAACTCAGAAGTGA 3' SEQ ID No: 89
GFP Cpf1 cTAG N rvs 5' CGCTTCCTCCTGAAAATGCAGCTAGGTAGTTTTGGGATGTTAAGAGTCCCTATCTTCGACATGCCGAACTCAGAAGTGA 3' SEQ ID No: 90
CAT01 Cpf1 cTAG M fwd 5' TTTGGGTTAAAGATGGTTAAATGATTCGACATACACATAAAGTAGCTTGCG 3' SEQ ID No: 91
CAT01 Cpf1 cTAG N fwd 5' TTTGGGATGTTAAGAGTCCCTATCTTCGACATACACATAAAGTAGCTTGCG 3' SEQ ID No: 92
CAT01 Cpf1 cTAG P fwd 5' TTTGAGGAGTGTTCAGTCTCCGTGAACTCGACATACACATAAAGTAGCTTGCG 3' SEQ ID No: 93
CAT01 Cpf1 cTAG N rvs 5' TTTGGGATGTTAAGAGTCCCTATCTTCGACTGGAAGGACAAGGGGGACC 3' SEQ ID No: 94
CAT01 Cpf1 cTAG O rvs 5' TTTGACCGCCCCCCCCATACCCCAATCGACTGGAAGGACAAGGGGGACC 3' SEQ ID No: 95
Cpf1 cTAG M 5' TTTGGGTTAAAGATGGTTAAATGAT 3' SEQ ID No: 96
RNA targeting cTAG M 5' UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGGUUAAAGAUGGUUAAAUGAU 3' SEQ ID NO: 110
Cpf1 cTAG N 5' TTTGGGATGTTAAGAGTCCCTATCT 3' SEQ ID No: 97
RNA targeting cTAG N 5' UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGGAUGUUAAGAGUCCCUAUCU 3' SEQ ID NO: 111
Cpf1 cTAG O 5' TTTGACCGCCCCCCCCATACCCCAA 3' SEQ ID No: 98
RNA targeting cTAG O 5' UAAUUUCUACUCUUGUAGAUACCGCCCCCCCCAUACCCCAA 3' SEQ ID NO: 112
Cpf1 cTAG P 5' TTTGACCGCCCCCCCCATACCCCAA 3' SEQ ID No: 99
RNA targeting cTAG P 5' UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAGGAGUGUUCAGUCUCCGUGAAC 3' SEQ ID NO: 113
pzHR039 카나마이신 내성 및 GFP에 대한 원료. 전체 서열 목록 참조. SEQ ID NO: 100
13000223370 클로람페니콜 내성 및 GFP에 대한 원료. 전체 서열 목록 참조. SEQ ID NO: 101
pJDI427 GFP Cpf1 cTAGs M 및 N KanR CENARS TRP1 전체 서열 목록 참조. SEQ ID NO: 102
도 7
pJDI429 GFP Cpf1 cTAGs N 및 O KanR CENARS TRP1 전체 서열 목록 참조. SEQ ID NO: 103
도 8
pJDI430 GFP Cpf1 cTAGs N 및 P KanR CENARS TRP1 전체 서열 목록 참조. SEQ ID NO: 104
도 9
pJDI431 GFP Cpf1 cTAGs O 및 P KanR CENARS TRP1 전체 서열 목록 참조. SEQ ID NO: 105
도 10
pJDI432 pJET AmpR CmR Cpf1 cTAGs M 및 N 전체 서열 목록 참조. SEQ ID NO: 106
도 11
pJDI434 pJET AmpR CmR blunt Cpf1 cTAGs N 및 O 전체 서열 목록 참조. SEQ ID NO: 107
도 12
pJDI435 pJET AmpR CmR blunt Cpf1 cTAGs N 및 P 전체 서열 목록 참조. SEQ ID NO: 108
도 13
pJDI436 pJET AmpR CmR blunt Cpf1 cTAGs O 및 P 전체 서열 목록 참조. SEQ ID NO: 109
도 14
*** SEQ ID NOs: 110-113에 대한 가이드 RNA의 밑줄이 없는 부분은 IDT의 화학적으로 변형된 Alt-R RNA이다. 각각의 cTAG(즉, M-P)에 대한 서열의 상동성 영역은 밑줄이 그어져있다.
이 실험의 결과를 표 7 및 도 6에 도시한다. 각각의 형질전환에 대한 반응 수를 상단 행을 따라 도시하고, 사용된 가이드 RNA를 표 7의 좌측 열을 따라 나타내었다. 리가아제가 있는 및 없는 동일한 Cpf1 반응의 비교를 리가이제 효소의 존재하에서 9.9배 형질전환체 증가를 나타내었고, 이는 콜로니 성장은 Cpf1 분해 후 이중 카나마이신 및 클로람페니콜 내성 플라스미드의 형성 때문이었다는 것을 나타내었다. 비 리가아제 반응은 반응이 특이적이라는 것을 입증하기 위해 디자인된 일치된 대조군이며 단순히 분해되지 않은 내성 플라스미드의 오염 수준의 존재에 의한 것이 아니었다.
16개의 개별 콜로니를 상류 및 하류 클로닝 접합부 모두를 확인하기 위해 생거(Sanger) 서열 분석하였다. 7개의 상류 서열 분석된 접합부 중 7개 및 9개의 하류 접합부 중 8개에서, T4 DNA 리가아제에 의한 반응으로부터의 Cpf1 매개 클론이 충실한 분해와 결찰을 나타내었다.
반응 71 및 72를 DNA 겔 정제 단계를 거치지 않은 Cpf1 분해 플라스미드로 형질전환시켰다. 그러나 Cpf1 효소는 T4 DNA 리가아제의 첨가 전에 공급자의 지침에 따라 열 비활성화시켰다(반응 72). 반응 71 및 72는 동일한 리가아제 의존성을 나타냈다.
Cpf1 편집 벡터를 포함하는 내성 형질전환체 콜로니
55 56 59 60 67 68 71* 72*
가이드 M + N 네 네
가이드 N + O 네 네
가이드 P + O 네 네 네 네
T4 리가아제 아니오 네 아니오 네 아니오 네 아니오 네
형질전환체의 #
(Kan 내성 콜로니)		 1 20 0 141 0 12 2 95
* 플레이트 71 및 72를 Cpf1 분해 후 DNA 겔 정제를 거치지 않은 분해 \된 DNA로 형질전환하였다.
PCT/US2017/042245(WO 2018/013990 A1, 미국 가출원 제62/362,909호 우선권 주장)의 발명은 그 전체가 본 발명에 포함된다.
실시예 3: 메가모듈식 디자인을 사용하는 제한 효소 분해 및 결찰에 의한 플라스미드 조립
이 실시예는 본 발명의 방법에 따른 모듈식 CRISPR 벡터의 유전자 편집을 기술한다. 도 15는 이 실시예에서 기술된 모듈식 CRISPR 플라스미드 13000444591의 유전자 편집을 예시한다. 플라스미드 백본은 먼저 제작된 플라스미드로부터 "스터 퍼" 삽입체 DNA 부분을 제거함으로써 제조하였다. 스터퍼 삽입체 DNA 부분은 스터퍼 부분의 인접 복제 태그(cTAGs) D (SEQ ID NO: 68) 및 E (SEQ ID NO: 69)를 제한 효소 ApaI 및 PvuI로 분해시킴으로써 제거하였다. 생성된 단편을 겔 전기 영동을 통해 분리하고, 플라스미드 백본에 상응하는 원하는 8.3kb 단편을 겔로부터 절제하고 표준 실리카 막 컬럼을 사용하여 추출하였다.
모듈식 CRISPR 벡터에 대한 새로운 삽입체를 생성하기 위하여, cTAG D 및 cTAG E가 측면에 위치하는 원하는 삽입체 DNA 부분을 범용 cTAG oligos tagD_FWD (SEQ ID NO: 75) 및 tagE_REV (SEQ ID NO: 76)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 생성된 삽입체는 cTAG D 및 cTAG E가 측면에 위치한 GFP 마커 유전자를 함유하였다. 생성 된 PCR 단편을 cTAG D 내에서 절단하는 ApaI 효소 및 cTAG E 서열 내에서 절단하는 PvuI 효소로 분해하였다. 분해된 삽입체 DNA 부분을 표준 실리카 막 컬럼을 사용하여 정제하였다.
정제된 모듈식 CRISPR 벡터 백본 및 삽입체 DNA 부분을 리가아제와의 단일 반응으로 조합하여 원형 플라스미드를 생성하였다. 생성된 편집 GFP-함유 플라스미드 13000444591에 대한 서열은 (SEQ ID NO: 77)에 제공된다.
실시예 4: 메가모듈식 디자인을 사용하는 효모 상동성 재조합에 의한 플라스미드 조립
플라스미드 13000283399(SEQ ID NO: 85)는 메가모듈식 태그가 측면에 위치하는 PCR 단편의 효모 상동성 재조합에 의해 조립하였다. 조립을 위한 원하는 구조체는 특정 메가모듈식 태그가 측면에 위치하는 방식으로 PCR에 의해 증폭하였다. 이러한 태그는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서 단편의 방향성 조립을 허용하였는데, 이는 태그 자체가 상동성 재조합을 위한 중첩하는 상동성 영역으로 사용되었기 때문이다. 구체적으로, 5개의 단편은 다음과 같이 메가모듈식 태그가 측면에 위치하게 PCR을 통해 증폭되었다: 태그 A - 단편 1 - 태그 B; 태그 B - 단편 2 - 태그 C; 태그 C - 단편 3 - 태그 D; 태그 D - 단편 4 - 태그 E; 태그 E - 단편 5 - 태그 F. 효모의 복제 기점과 TRP 영양요구성 선별 마커뿐만 아니라 한 쪽 말단에는 태그 A와 다른 쪽에는 태그 F를 포함하는 선형화된 조립 벡터와 함께 이런 단편들을 에스 세레비시애로 형질전환하였다. 원형화되고 조립된 플라스미드는 트립토판이 결여된 배지에서 에스 세레비시애의 성장에 의해 선택하였다. 이들 플라스미드를 회수하여 대장균에서 증폭시켰으며, 서열 분석을 통해 정확한 구조를 확인하였다.
실시예 5: 코리네박테리움에서 CRISPRi 검증
본 발명의 CRISPRi 방법은 코리네박테리움 글루타미쿰의 비정규 종에서 테스트하였다. CRISPRi 시스템의 구성 요소는 dCas9 및 가이드 RNA를 암호화하는 단일 테스트 벡터로 복제하였다. 테스트 벡터의 가이드 RNA는 표적 프로모터를 "파프리카" 적색 형광 단백질(RFP)을 암호화하는 유전자에 작동 가능하게 연결하는 제 2 구조체의 프로모터 영역을 표적화하도록 디자인되었다. 가이드 RNA가 파프리카 RFP를 표적으로하지 않는 별도의 서열인 제 2 대조 벡터를 생성하였다.
상기 테스트 및 대조군 벡터를 야생형(WT) C. 글루타미쿰 균주, 및 상기 프로모터-RFP 구조체뿐만 아니라 RFP 구조체가 결여된 WT 균주를 포함하는 pcg2613- 파프리카 균주 둘 다로 형질 전환시켰다(도 17a의 실험 디자인 참조). pBAD 프로모터를 통해 dCas9를 유도하기 위해 2% 아라비노스가 보충된 배지에서 30℃에서 48시간 동안 배양물을 성장시켰다. 7개 생물학적 복제에 대한 살아있는 게이트 세포의 중앙 형광을 기록하였다. 이 실험의 결과는 도 17b에 도시된다. 어떤 WT 균주도 RFP 형광을 나타내지 않았다. 대조군 CRISPRi 플라스미드를 함유하는 Pcg2613 균주는 정상적인 수준의 RFP 형광을 나타내었다. 그러나, 테스트 CRISPRi 플라스미드는 RFP 유전자의 발현을 낮추는 데 성공하였다.
본 발명의 추가 실시태양
본 발명에 의해 고려되는 다른 주제는 다음의 번호가 매겨진 실시태양에서 설명된다:
1. 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하기 위한 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체로서, 상기 구조체는 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하고, 상기 다중 복제 부위는 다음을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체:
a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각 cTAG는
i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하며; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및
b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들);
i) 상기 별개의 cTAG의 각각은 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)의 각각의 주위의 플랭킹 위치에 분포된다;
여기서 구조체는
c) 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 제 1 핵산;
d) (c)의 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 DNA 표적 부위에 모집할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 제 2 핵산.
1.1. 제 1 실시태양에 있어서,
모듈식 CRISPR DNA 구조체는 제 1 복제 기점을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
1.2. 제 1 또는 제 1.1 실시태양에 있어서,
모듈식 CRISPR DNA 구조체는 하나 초과의 복제 기점을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
1.3. 제 1 내지 제 1.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
모듈식 CRISPR DNA 구조체는 제 1 복제 기점 및 제 2 복제 기점을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
1.4. 제 1.1 또는 제 1.3 실시태양에 있어서,
제 1 복제 기점은 대장균에 플라스미드를 유지할 수 있는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
1.5. 제 1.1, 1.3 및 1.4 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 2 복제 기점은 코리네박테리움 글루타미쿰에 플라스미드를 유지할 수 있는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
1.6. 제 1 내지 제 1.4 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 1 복제 기점은 대장균에 플라스미드를 유지할 수 있고, 제 2 복제 기점은 사카로마이세스 세레비시애에 플라스미드를 유지할 수 있고 제 3 복제 기점은 코리네박테리움 글루타미쿰에 플라스미드를 유지할 수 있는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
1.7. 제 1 내지 제 1.6 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
모듈식 CRISPR DNA 구조체는 선택 가능한 마커를 암호화하는 삽입체 부분을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
1.8. 제 1 내지 제 1.7 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
적어도 하나의 복제 기점은 CRISPR 다중 복제 부위 내의 삽입체 부분 내에 포함되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
2. 제 1 내지 제 1.8 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 1 핵산은 CRISPR 다중 복제 부위 내의 삽입체 부분 내에 포함되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
3. 제 2 실시태양에 있어서,
제 1 핵산을 포함하는 삽입체 부분은 선택 가능한 마커를 추가로 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
4. 제 1 내지 제 3 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 2 핵산은 CRISPR 다중 복제 부위 내의 삽입체 부분 내에 포함되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
5. 제 4 실시태양에 있어서,
제 2 핵산을 포함하는 삽입체 부분은 선택 가능한 마커를 추가로 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
6. 제 1 내지 제 1.8 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 1 핵산과 제 2 핵산은 각각 CRISPR 다중 복제 부위 내의 자신의 삽입체 부분 내에 포함되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
7. 제 6 실시태양에 있어서,
제 1 핵산 및 제 2 핵산을 포함하는 삽입체 부분은 선택 가능한 마커를 각각 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
8. 제 5 내지 제 7 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 1 핵산을 포함하는 삽입체 부분에 포함된 선택 가능한 마커 및 제 2 핵산을 포함하는 삽입체 부분에 포함된 선택 가능한 마커가 상이한 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
9. 제 1 내지 제 5 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 1 핵산과 제 2 핵산은 CRISPR 다중 복제 부위 내의 동일한 삽입체 부분 내에 포함되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
10. 제 1 내지 제 9 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 1 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
10.1. 제 1 내지 제 10 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 1 핵산은 터미네이터에 작동 가능하게 연결되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
11. 제 1 내지 제 10.1 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 2 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
11.1. 제 1 내지 제 11 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 2 핵산은 터미네이터에 작동 가능하게 연결되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
12. 제 10 내지 제 11.1 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 이종성 프로모터인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
12.1 제 10 내지 제 12 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 구조성 프로모터인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
12.2. 제 10 내지 제 12 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 유도성 프로모터인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
13. 제 1 내지 제 12.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 1 핵산은 전사 활성화 단백질에 번역적으로 융합된 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
13.1. 제 1 내지 제 12.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 1 핵산은 전사 불활성화 단백질에 번역적으로 융합된 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
13.2. 제 1 내지 제 12.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 1 핵산은 전사 억제자 인자에 번역적으로 융합된 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
14. 제 1 내지 제 12.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
구조체는, 발현될 때, (e) 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착할 수 있는 전사 활성화 단백질을 암호화하는 제 3 핵산을 추가로 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
14.1. 제 1 내지 제 12.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
구조체는, 발현될 때, (e) 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착할 수 있는 전사 불활성화 단백질을 암호화하는 제 3 핵산을 추가로 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
14.2. 제 1 내지 제 12.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
구조체는, 발현될 때, (e) 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착할 수 있는 전사 억제자 단백질을 암호화하는 제 3 핵산을 추가로 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
15. 제 14 실시태양에 있어서,
전사 활성화 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 비활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
15.1. 제 14.1 실시태양에 있어서,
전사 불활성화 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 비활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
15.2. 제 14.2 실시태양에 있어서,
전사 억제자 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 비활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
16. 제 1 내지 제 12.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 2 핵산은 자신을 전사 활성화 단백질에 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결된 가이드 RNA를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
16.1. 제 1 내지 제 12.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 2 핵산은 자신을 전사 불활성화 단백질에 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결된 가이드 RNA를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
16.2. 제 1 내지 제 12.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
제 2 핵산은 자신을 전사 억제자 단백질에 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결된 가이드 RNA를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
17. 제 13 내지 16 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
전사 활성화 단백질은 VP16, VP64, 및 VP160, VPR로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
17.1. 제 13.1 내지 16.1 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
전사 불활성화 단백질은 Mxi1, Tbx3, KRAB, EnR, 및 SID로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
17.2. 제 13.2 내지 16.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
전사 억제자 단백질은 Mxi1, Tbx3, KRAB, EnR, 및 SID로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
18. 제 1 내지 17.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 원형인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
19. 제 1 내지 17.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 선형인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
20. 제 1 내지 17.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 유기체의 게놈에 통합되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
21. 제 1 내지 제 20 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
상기 별개의 cTAG의 적어도 하나는 적어도 2개의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
22. 제 1 내지 제 21 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
CRISPR 랜딩 부위의 적어도 하나는 Cas9 엔도뉴클레아제를 위한 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
23. 제 1 내지 제 22 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
CRISPR 랜딩 부위의 적어도 하나는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 위한 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
24. 제 1 내지 제 23 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
상기 별개의 cTAG의 적어도 하나는 희귀(≥8 염기 길이) 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
24.1. 제 1 내지 제 23 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
각각의 cTAG는 희귀(≥8 염기 길이) 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
25. 제 1 내지 제 24.1 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 돌연변이된 Cas9 엔도뉴클레아제인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
26. 제 1 내지 제 24.1 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 돌연변이된 Cpf1 엔도뉴클레아제인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
27. 제 1 내지 제 24.1 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 표 1의 벡터에 포함된 dCas9 유전자 중에서 선택되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
28. 제 1 내지 제 24.1 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 프란시엘라 노비시다(Francisella novicida)(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN)), 라치노스피라세애(Lachnospiraceae) 박테리아(UniProtKB-A0A182DWE3(A0A182DWE3_9FIRM)) 및 아시다미노콕커스 종(Acidaminococcus sp.)(UniProtKB-U2UMQ6(CPF1 ACISB))로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
29. 제 1 내지 제 24.1 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 AsCpf1(D908A)인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
30. 제 1 내지 제 26 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 (c)의 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 DNA 표적 부위로 모집할 수 있는 하나 이상의 가이드 RNA를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
31. 제 30 실시태양에 있어서,
가이드 RNA의 적어도 하나는 구조체에서 암호화된 다른 가이드 RNA와 상이한 서열을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
32. 제 30 또는 제 31 실시태양에 있어서,
가이드 RNA의 적어도 하나는 구조체에서 암호화된 다른 가이드 RNA와 상이한 DNA 표적 부위 서열을 표적으로 하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
33. 제 1 내지 제 32 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 하나 초과의 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
34. 제 33 실시태양에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소의 적어도 하나는 구조체에서 암호화된 다른 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소와 상이한 서열을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
35. 제 1 내지 제 34 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
하나 이상의 cTAG는 SEQ ID NO: 65-74, 78-81 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 삽입체 부분.
35.5. 제 1 내지 제 35 실시태양 중 어느 하나의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 포함하는 숙주 세포.
36. 하나 이상의 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하는 고 처리량 방법으로서, 상기 방법은 제 1 내지 제 35 실시태양 중 어느 하나의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하며; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치하는 것인 고 처리량 방법.
37. 제 36 실시태양에 있어서,
재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 적어도 하나의 삽입체 부분은 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 고 처리량 방법.
38. 제 36 실시태양에 있어서,
재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 여분의 염색체 DNA로서 숙주 세포에 남아 있는 것인 고 처리량 방법.
39. 제 36 실시태양에 있어서,
제 10 내지 제 12.2 실시태양 중 어느 하나의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 숙주 세포 내에 도입되는 것인 고 처리량 방법.
40. 제 39 실시태양에 있어서,
숙주 세포를 유도성 프로모터의 발현을 증가시킬 수 있는 화합물로 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 고 처리량 방법.
41. CRISPR 효소 변이체를 선별하기 위한 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체로서, 상기 구조체는 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하고, 상기 다중 복제 부위는 다음을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체:
a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각각의 cTAG는
i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하며; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및
b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들);
i) 여기서 상기 별개의 cTAG의 각각은 각각의 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)의 각각의 주위의 플랭킹 위치에 분포된다;
여기서 구조체는 다음을 추가로 포함한다:
c) 단백질을 암호화하는 제 1 핵산; 및
d) DNA 표적 부위에 결합할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 제 2 핵산.
41.1. CRISPR 효소 변이체를 선별하기 위한 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체로서, 상기 구조체는 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하고, 상기 다중 복제 부위는 다음을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체:
a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각각의 cTAG는
i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하며; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및
b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들);
i) 여기서 상기 별개의 cTAG의 각각은 각각의 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)의 각각의 주위의 플랭킹 위치에 분포된다;
여기서 구조체는 다음을 추가로 포함한다:
c) CRISPR 효소, 또는 CRISPR 기능을 갖는 것으로 의심되는 효소("추정적인 CRISPR 효소")를 암호화하는 제 1 핵산; 및
d) DNA 표적 부위에 결합할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 제 2 핵산.
41.2. 제 41 또는 제 41.1 실시태양의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 포함하는 숙주 세포.
42. CRISPR 효소 변이체를 선별하는 고 처리량 방법으로서, 이 방법은 다음 단계:
a) 제 41 또는 제 41.1 실시태양의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치한다; 및
b) DNA 표적 부위에서 발생하는 DNA 절단 정도를 측정하는 단계를 포함하는 것인 고 처리량 방법.
43. 숙주 세포 유전자의 발현을 조절 또는 숙주 세포 게놈을 조작하기 위한 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체로서, 상기 구조체는 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하고, 상기 다중 복제 부위는 다음을 포함하며:
a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각각의 cTAG는
i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하며; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및
b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들);
i) 여기서 상기 별개의 cTAG의 각각은 각각의 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)의 각각의 주위의 플랭킹 위치에 분포된다;
여기서 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)은 CRISPR 기능의 조절자를 암호화하는 DNA를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
44. 제 43 실시태양에 있어서,
CRISPR 기능의 조절자를 암호화하는 DNA를 포함하는 삽입체 부분은 선별 가능한 마커를 추가로 포함하는 CRISPR 기능의 조절자를 암호화하는 DNA를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
45. 제 43 또는 제 44 실시태양에 있어서,
CRISPR 기능의 조절자는 복제 기점, 선택 가능 마커, 역 선택 가능 마커, 항-CRISPR 단백질, 프로모터, 터미네이터, dCas9 단백질, dCpf1 단백질, 바코드, Cas9 단백질, Cpf1 단백질, DNA 도너 및 다중화된 게놈 편집을 용이하게 하는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
46. 제 43 내지 제 45 실시태양 중 어느 하나의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 포함하는 숙주 세포.
47. 제 46 실시태양에 있어서,
숙주 세포는 촉매적으로 활성인 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산 분자 및 촉매적으로 활성인 CRISPR 효소를 DNA 표적 부위로 모집할 수 있는 가이드 RNA를 포함하는 것인 숙주 세포.
48. 제 46 실시태양에 있어서,
숙주 세포는 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산 분자 및 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 DNA 표적 부위로 모집할 수 있는 가이드 RNA를 포함하는 것인 숙주 세포.
49. 제 48 실시태양에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 전사 활성화 단백질에 번역적으로 융합되는 것인 숙주 세포.
49.1. 제 48 실시태양에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 전사 불활성화 단백질에 번역적으로 융합되는 것인 숙주 세포.
49.2. 제 48 실시태양에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 전사 억제자 단백질에 번역적으로 융합되는 것인 숙주 세포.
50. 제 48 실시태양에 있어서,
숙주 세포는, 발현될 때, 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자체로 부착할 수 있는 전사 활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 것인 숙주 세포.
50.1. 제 48 실시태양에 있어서,
숙주 세포는, 발현될 때, 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자체로 부착할 수 있는 전사 불활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 것인 숙주 세포.
50.2. 제 48 실시태양에 있어서,
숙주 세포는, 발현될 때, 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자체로 부착할 수 있는 전사 억제자 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 것인 숙주 세포.
51. 제 50 실시태양에 있어서,
전사 활성화 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자체로 부착하는 것인 숙주 세포.
51.1. 제 50.1 실시태양에 있어서,
전사 불활성화 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자체로 부착하는 것인 숙주 세포.
51.2. 제 50.2 실시태양에 있어서,
전사 억제자 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자체로 부착하는 것인 숙주 세포.
52. 제 51 실시태양에 있어서,
가이드 RNA는 자체로 전사 활성화 단백질에 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결되는 것인 숙주 세포.
52.1. 제 51.1 실시태양에 있어서,
가이드 RNA는 자체로 전사 불활성화 단백질에 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결되는 것인 숙주 세포.
52.2. 제 51.3 실시태양에 있어서,
가이드 RNA는 자체로 전사 억제자 단백질에 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결되는 것인 숙주 세포.
53. 제 49, 51 및 52 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
전사 활성화 단백질은 VP16, VP64, 및 VP160, VPR로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
53.1. 제 49.1, 51.1 및 52.1 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
전사 불활성화 단백질은 Mxi1, Tbx3, KRAB, EnR, 및 SID로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
53.2. 제 49.2, 51.2 및 52.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
전사 활성화 단백질은 Mxi1, Tbx3, KRAB, EnR, 및 SID로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
54. 제 43 내지 45 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 원형인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
55. 제 43 내지 45 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 선형인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
56. 제 43 내지 45 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 유기체의 게놈에 통합되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
57. 제 43 내지 제 45 및 제 54 내지 제 56 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
상기 별개의 cTAG의 적어도 하나는 적어도 2개의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
58. 제 43 내지 제 45 및 제 54 내지 제 57 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
CRISPR 랜딩 부위의 적어도 하나는 Cas9 엔도뉴클레아제를 위한 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
59. 제 43 내지 제 45 및 제 54 내지 제 58 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
CRISPR 랜딩 부위의 적어도 하나는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 위한 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
60. 제 43 내지 제 45 및 제 54 내지 제 59 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
상기 별개의 cTAG의 적어도 하나는 희귀(≥8 염기 길이) 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
61. 제 47 내지 제 53.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 돌연변이된 Cas9 엔도뉴클레아제인 숙주 세포.
62. 제 48 내지 제 53.2 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 돌연변이된 Cpf1 엔도뉴클레아제인 숙주 세포.
63. 제 47 내지 제 53.2 및 제 61 내지 61 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
숙주 세포는 하나 초과의 핵산 가이드 RNA를 포함하는 것인 숙주 세포.
64. 제 63 실시태양에 있어서,
가이드 RNA 중 적어도 하나는 다른 가이드 RNA와 상이한 서열을 포함하는 것인 숙주 세포.
65. 제 64 실시태양에 있어서,
가이드 RNA 중 적어도 하나는 다른 가이드 RNA와 상이한 DNA 표적 부위 서열을 표적으로 하는 것인 숙주 세포.
66. 제 48 내지 53.2 및 제 61 내지 제 65 실시태양 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 하나 초과의 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 포함하는 것인 숙주 세포.
67. 제 66 실시태양에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소 중 적어도 하나는 구조체에서 암호화된 다른 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소와 상이한 서열을 포함하는 것인 숙주 세포.
68. 제 43 내지 제 67 실시태양 중 어느 하나에 있어서,
cTAG 중 하나 이상은 SEQ ID NO: 65-74, 78-81 및 이들의 조합으로 이루어진그룹으로부터 선택되는 것인 삽입체 부분.
69. 하나 이상의 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하는 고 처리량 방법으로서, 상기 방법은 제 43 내지 제 45 및 제 54 내지 제 60 중 어느 하나의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하며; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치하는 것인 고 처리량 방법.
70. 제 69 실시태양에 있어서,
재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 적어도 하나의 삽입체 부분은 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 고 처리량 방법.
71. 제 69 또는 제 70 실시태양에 있어서,
삽입체 부분은 CRISPR 단백질의 기능을 조절하는 것인 고 처리량 방법.
72. 제 69 또는 제 70 실시태양에 있어서,
삽입체 부분은 gRNA의 기능을 조절하는 것인 고 처리량 방법.
73. 제 69 또는 제 70 실시태양에 있어서,
재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 여분의 염색체 DNA로서 숙주 세포에 남아 있는 것인 고 처리량 방법.
74. CRISPR 효소 변이체를 선별하기 위한 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체로서, 상기 구조체는 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하고, 상기 다중 복제 부위는 다음을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체:
a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각각의 cTAG는
i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하며; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및
b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들);
i) 여기서 상기 별개의 cTAG의 각각은 각각의 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)의 각각의 주위의 플랭킹 위치에 분포된다;
여기서 구조체는 다음을 추가로 포함한다:
c) CRISPR 효소, 또는 CRISPR 기능을 갖는 것으로 의심되는 효소("추정적인 CRISPR 효소")를 암호화하는 제 1 핵산; 및
d) DNA 표적 부위에 결합할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 제 2 핵산.
75. 숙주 세포에서 CRISPR 활성을 선별하는 고 처리량 방법으로서, 이 방법은 다음 단계:
a) 제 43 내지 제 45, 제 54 내지 제 60 및 제 74 실시태양 중 어느 하나의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치한다; 및
b) DNA 표적 부위에서 발생하는 DNA 절단 정도를 측정하는 단계를 포함하는 것인 고 처리량 방법.
76. 숙주 세포에서 CRISPRi 활성을 선별하는 고 처리량 방법으로서, 상기 방법은 다음 단계:
a) 제 43 내지 제 45, 제 54 내지 제 60 및 제 74 실시태양 중 어느 하나의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치한다; 및
b) DNA 표적 부위에서 발생하는 전사 조절 정도를 측정하는 단계를 포함하는 것인 고 처리량 방법.
본 발명에 인용된 모든 참고문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다. 그러나 본 발명에 언급된 모든 참고문헌, 기사, 출판물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 세계 어느 나라에서든 유효한 선행 기술을 구성하거나 보통의 일반 지식의 일부를 구성한다는 인정 또는 어떠한 형태의 제안으로 간주되어서는 안 된다. 본 출원은 모든 목적을 위해 이의 전문으로 PCT/US2018/017573을 참조로 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> Zymergen Inc. <120> APPLICATIONS OF CRISPRi IN HIGH-THROUGHPUT METABOLIC ENGINEERING <130> ZYMR-030/01WO 327574-2149 <150> US 62/764,672 <151> 2018-08-15 <160> 126 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 984 <212> PRT <213> Campylobacter jejuni <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(984) <223> Cas9 <400> 1 Met Ala Arg Ile Leu Ala Phe Asp Ile Gly Ile Ser Ser Ile Gly Trp 1 5 10 15 Ala Phe Ser Glu Asn Asp Glu Leu Lys Asp Cys Gly Val Arg Ile Phe 20 25 30 Thr Lys Val Glu Asn Pro Lys Thr Gly Glu Ser Leu Ala Leu Pro Arg 35 40 45 Arg Leu Ala Arg Ser Ala Arg Lys Arg Leu Ala Arg Arg Lys Ala Arg 50 55 60 Leu Asn His Leu Lys His Leu Ile Ala Asn Glu Phe Lys Leu Asn Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Ser Leu Ala Lys Ala Tyr Lys Gly 85 90 95 Ser Leu Ile Ser Pro Tyr Glu Leu Arg Phe Arg Ala Leu Asn Glu Leu 100 105 110 Leu Ser Lys Gln Asp Phe Ala Arg Val Ile Leu His Ile Ala Lys Arg 115 120 125 Arg Gly Tyr Asp Asp Ile Lys Asn Ser Asp Asp Lys Glu Lys Gly Ala 130 135 140 Ile Leu Lys Ala Ile Lys Gln Asn Glu Glu Lys Leu Ala Asn Tyr Gln 145 150 155 160 Ser Val Gly Glu Tyr Leu Tyr Lys Glu Tyr Phe Gln Lys Phe Lys Glu 165 170 175 Asn Ser Lys Glu Phe Thr Asn Val Arg Asn Lys Lys Glu Ser Tyr Glu 180 185 190 Arg Cys Ile Ala Gln Ser Phe Leu Lys Asp Glu Leu Lys Leu Ile Phe 195 200 205 Lys Lys Gln Arg Glu Phe Gly Phe Ser Phe Ser Lys Lys Phe Glu Glu 210 215 220 Glu Val Leu Ser Val Ala Phe Tyr Lys Arg Ala Leu Lys Asp Phe Ser 225 230 235 240 His Leu Val Gly Asn Cys Ser Phe Phe Thr Asp Glu Lys Arg Ala Pro 245 250 255 Lys Asn Ser Pro Leu Ala Phe Met Phe Val Ala Leu Thr Arg Ile Ile 260 265 270 Asn Leu Leu Asn Asn Leu Lys Asn Thr Glu Gly Ile Leu Tyr Thr Lys 275 280 285 Asp Asp Leu Asn Ala Leu Leu Asn Glu Val Leu Lys Asn Gly Thr Leu 290 295 300 Thr Tyr Lys Gln Thr Lys Lys Leu Leu Gly Leu Ser Asp Asp Tyr Glu 305 310 315 320 Phe Lys Gly Glu Lys Gly Thr Tyr Phe Ile Glu Phe Lys Lys Tyr Lys 325 330 335 Glu Phe Ile Lys Ala Leu Gly Glu His Asn Leu Ser Gln Asp Asp Leu 340 345 350 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<211> 399 <212> PRT <213> Francisella philomiragia subsp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(399) <223> Genbank ABZ87876 Cpf1 <400> 23 Met Phe Tyr Leu Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser Phe 1 5 10 15 Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Ile Gln 20 25 30 Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Leu Glu Glu Lys Ser 35 40 45 Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln Lys 50 55 60 Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr Asp 65 70 75 80 Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Leu Ile Gly Thr Ser Val 85 90 95 Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Val Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn Pro 100 105 110 Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala Lys 115 120 125 Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Arg Asp Ala Leu Asn Glu Phe Asn Lys 130 135 140 His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Phe Ala Ser 145 150 155 160 Phe Ala Asp Ile Pro Val Leu Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys Asn 165 170 175 Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr 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tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 4020 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 4080 cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 4140 ataggcgtat cacgaggcc 4159 <210> 110 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically constructed RNA targeting cTAG M <400> 110 uaauuucuac ucuuguagau gguuaaagau gguuaaauga u 41 <210> 111 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically constructed RNA targeting cTAG N <400> 111 uaauuucuac ucuuguagau ggauguuaag agucccuauc u 41 <210> 112 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically constructed RNA targeting cTAG O <400> 112 uaauuucuac ucuuguagau accgcccccc ccauacccca a 41 <210> 113 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically constructed RNA targeting cTAG P <400> 113 uaauuucuac ucuuguagau aggaguguuc agucuccgug aac 43 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> P53 TAD1 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Claims (112)

1. 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하기 위한 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체로서, 상기 구조체는 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하고, 상기 다중 복제 부위는 다음을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체:
a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각 cTAG는
i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하며; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및
b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들);
i) 상기 별개의 cTAG의 각각은 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)의 각각의 주위의 플랭킹 위치에 분포된다;
여기서 구조체는
c) 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 제 1 핵산;
d) (c)의 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 DNA 표적 부위에 모집할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 제 2 핵산.
제 1 항에 있어서,
모듈식 CRISPR DNA 구조체는 제 1 복제 기점을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
모듈식 CRISPR DNA 구조체는 하나 초과의 복제 기점을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 2 항에 있어서,
모듈식 CRISPR DNA 구조체는 제 1 복제 기점 및 제 2 복제 기점을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 2 항에 있어서,
제 1 복제 기점은 대장균에 플라스미드를 유지할 수 있는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
제 2 복제 기점은 코리네박테리움 글루타미쿰에 플라스미드를 유지할 수 있는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 2 항에 있어서,
제 1 복제 기점은 대장균에 플라스미드를 유지할 수 있고, 제 2 복제 기점은 사카로마이세스 세레비시애에 플라스미드를 유지할 수 있고 제 3 복제 기점은 코리네박테리움 글루타미쿰에 플라스미드를 유지할 수 있는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
모듈식 CRISPR DNA 구조체는 선택 가능한 마커를 암호화하는 삽입체 부분을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
적어도 하나의 복제 기점은 CRISPR 다중 복제 부위 내의 삽입체 부분 내에 포함되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 1 핵산은 CRISPR 다중 복제 부위 내의 삽입체 부분 내에 포함되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 10 항에 있어서,
제 1 핵산을 포함하는 삽입체 부분은 선택 가능한 마커를 추가로 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 2 핵산은 CRISPR 다중 복제 부위 내의 삽입체 부분 내에 포함되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 12 항에 있어서,
제 2 핵산을 포함하는 삽입체 부분은 선택 가능한 마커를 추가로 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 1 핵산과 제 2 핵산은 CRISPR 다중 복제 부위 내의 자신의 삽입체 부분 내에 포함되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 14 항에 있어서,
제 1 핵산 및 제 2 핵산을 포함하는 삽입체 부분은 선택 가능한 마커를 각각 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 15 항에 있어서,
제 1 핵산을 포함하는 삽입체 부분에 포함된 선택 가능한 마커 및 제 2 핵산을 포함하는 삽입체 부분에 포함된 선택 가능한 마커가 상이한 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 1 핵산과 제 2 핵산은 CRISPR 다중 복제 부위 내의 동일한 삽입체 부분 내에 포함되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 1 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 1 핵산은 터미네이터에 작동 가능하게 연결되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 2 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 2 핵산은 터미네이터에 작동 가능하게 연결되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 18 항 또는 제 20 항에 있어서,
프로모터는 이종성 프로모터인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 18 항 또는 제 20 항에 있어서,
프로모터는 구조성 프로모터인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 18 항 또는 제 20 항에 있어서,
프로모터는 유도성 프로모터인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 1 핵산은 전사 활성화 단백질에 번역적으로 융합된 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 1 핵산은 전사 불활성화 단백질에 번역적으로 융합된 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 1 핵산은 전사 억제자 인자에 번역적으로 융합된 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
구조체는, 발현될 때, (e) 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착할 수 있는 전사 활성화 단백질을 암호화하는 제 3 핵산을 추가로 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
구조체는, 발현될 때, (e) 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착할 수 있는 전사 불활성화 단백질을 암호화하는 제 3 핵산을 추가로 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
구조체는, 발현될 때, (e) 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착할 수 있는 전사 억제자 단백질을 암호화하는 제 3 핵산을 추가로 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 28 항에 있어서,
전사 활성화 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 비활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 29 항에 있어서,
전사 불활성화 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 비활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 30 항에 있어서,
전사 억제자 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 비활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 2 핵산은 자신을 전사 활성화 단백질에 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결된 가이드 RNA를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 2 핵산은 자신을 전사 불활성화 단백질에 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결된 가이드 RNA를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
제 2 핵산은 자신을 전사 억제자 단백질에 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결된 가이드 RNA를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 25 항, 제 28 항, 제 31 항 및 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
전사 활성화 단백질은 VP16, VP64, 및 VP160, VPR로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 26 항, 제 29 항, 제 32 항 및 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
전사 불활성화 단백질은 Mxi1, Tbx3, KRAB, EnR, 및 SID로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 27 항, 제 30 항, 제 33 항 및 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
전사 억제자 단백질은 Mxi1, Tbx3, KRAB, EnR, 및 SID로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 원형인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 선형인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 유기체의 게놈에 통합되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
상기 별개의 cTAG의 적어도 하나는 적어도 2개의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
CRISPR 랜딩 부위의 적어도 하나는 Cas9 엔도뉴클레아제를 위한 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
CRISPR 랜딩 부위의 적어도 하나는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 위한 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
상기 별개의 cTAG의 적어도 하나는 희귀(≥8 염기 길이) 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
각각의 cTAG는 희귀(≥8 염기 길이) 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 돌연변이된 Cas9 엔도뉴클레아제인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 돌연변이된 Cpf1 엔도뉴클레아제인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 표 1의 벡터에 포함된 dCas9 유전자 중에서 선택되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 프란시엘라 노비시다(Francisella novicida)(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN)), 라치노스피라세애(Lachnospiraceae) 박테리아(UniProtKB-A0A182DWE3(A0A182DWE3_9FIRM)) 및 아시다미노콕커스 종(Acidaminococcus sp.)(UniProtKB-U2UMQ6(CPF1 ACISB))로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 AsCpf1(D908A)인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 (c)의 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 DNA 표적 부위로 모집할 수 있는 하나 이상의 가이드 RNA를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 53 항에 있어서,
가이드 RNA의 적어도 하나는 구조체에서 암호화된 다른 가이드 RNA와 상이한 서열을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 53 항에 있어서,
가이드 RNA의 적어도 하나는 구조체에서 암호화된 다른 가이드 RNA와 상이한 DNA 표적 부위 서열을 표적으로 하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 하나 초과의 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 56 항에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소의 적어도 하나는 구조체에서 암호화된 다른 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소와 상이한 서열을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 1 항에 있어서,
하나 이상의 cTAG는 SEQ ID NO: 65-74, 78-81 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 삽입체 부분.
제 1 항 내지 제 57 항 중 어느 항의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 포함하는 숙주 세포.
하나 이상의 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하는 고 처리량 방법으로서, 상기 방법은 제 1 항의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하며; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치하는 것인 고 처리량 방법.
제 60 항에 있어서,
재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 적어도 하나의 삽입체 부분은 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 고 처리량 방법.
제 60 항에 있어서,
재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 여분의 염색체 DNA로서 숙주 세포에 남아 있는 것인 고 처리량 방법.
제 60 항에 있어서,
제 18 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 숙주 세포 내에 도입되는 것인 고 처리량 방법.
제 63 항에 있어서,
숙주 세포를 유도성 프로모터의 발현을 증가시킬 수 있는 화합물로 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 고 처리량 방법.
CRISPR 효소 변이체를 선별하기 위한 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체로서, 상기 구조체는 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하고, 상기 다중 복제 부위는 다음을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체:
a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각각의 cTAG는
i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하며; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및
b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들);
i) 여기서 상기 별개의 cTAG의 각각은 각각의 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)의 각각의 주위의 플랭킹 위치에 분포된다;
여기서 구조체는 다음을 추가로 포함한다:
c) 단백질을 암호화하는 제 1 핵산; 및
d) DNA 표적 부위에 결합할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 제 2 핵산.
CRISPR 효소 변이체를 선별하기 위한 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체로서, 상기 구조체는 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하고, 상기 다중 복제 부위는 다음을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체:
a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각각의 cTAG는
i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하며; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및
b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들);
i) 여기서 상기 별개의 cTAG의 각각은 각각의 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)의 각각의 주위의 플랭킹 위치에 분포된다;
여기서 구조체는 다음을 추가로 포함한다:
c) CRISPR 효소, 또는 CRISPR 기능을 갖는 것으로 의심되는 효소("추정적인 CRISPR 효소")를 암호화하는 제 1 핵산; 및
d) DNA 표적 부위에 결합할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 제 2 핵산.
제 66 항의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 포함하는 숙주 세포.
CRISPR 효소 변이체를 선별하는 고 처리량 방법으로서, 상기 방법은 다음 단계:
a) 제 66 항의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치한다; 및
b) DNA 표적 부위에서 발생하는 DNA 절단 정도를 측정하는 단계를 포함하는 것인 고 처리량 방법.
숙주 세포 유전자의 발현을 조절 또는 숙주 세포 게놈을 조작하기 위한 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체로서, 상기 구조체는 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하고, 상기 다중 복제 부위는 다음을 포함하며:
a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각각의 cTAG는
i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하며; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및
b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들);
i) 여기서 상기 별개의 cTAG의 각각은 각각의 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)의 각각의 주위의 플랭킹 위치에 분포된다;
여기서 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)은 CRISPR 기능의 조절자를 암호화하는 DNA를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 69 항에 있어서,
CRISPR 기능의 조절자를 암호화하는 DNA를 포함하는 삽입체 부분은 선별 가능한 마커를 추가로 포함하는 CRISPR 기능의 조절자를 암호화하는 DNA를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 70 항에 있어서,
CRISPR 기능의 조절자는 복제 기점, 선택 가능 마커, 역 선택 가능 마커, 항-CRISPR 단백질, 프로모터, 터미네이터, dCas9 단백질, dCpf1 단백질, 바코드, Cas9 단백질, Cpf1 단백질, DNA 도너 및 다중화된 게놈 편집을 용이하게 하는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 69 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 포함하는 숙주 세포.
제 72 항에 있어서,
숙주 세포는 촉매적으로 활성인 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산 분자 및 촉매적으로 활성인 CRISPR 효소를 DNA 표적 부위로 모집할 수 있는 가이드 RNA를 포함하는 것인 숙주 세포.
제 72 항에 있어서,
숙주 세포는 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산 분자 및 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 DNA 표적 부위로 모집할 수 있는 가이드 RNA를 포함하는 것인 숙주 세포.
제 74 항에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 전사 활성화 단백질에 번역적으로 융합되는 것인 숙주 세포.
제 74 항에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 전사 불활성화 단백질에 번역적으로 융합되는 것인 숙주 세포.
제 74 항에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 전사 억제자 단백질에 번역적으로 융합되는 것인 숙주 세포.
제 74 항에 있어서,
숙주 세포는, 발현될 때, 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자체로 부착할 수 있는 전사 활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 것인 숙주 세포.
제 74 항에 있어서,
숙주 세포는, 발현될 때, 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자체로 부착할 수 있는 전사 불활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 것인 숙주 세포.
제 74 항에 있어서,
숙주 세포는, 발현될 때, 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소에 자체로 부착할 수 있는 전사 억제자 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 것인 숙주 세포.
제 78 항에 있어서,
전사 활성화 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 비활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착하는 것인 숙주 세포.
제 79 항에 있어서,
전사 불활성화 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 비활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착하는 것인 숙주 세포.
제 80 항에 있어서,
전사 억제자 단백질은 연결 앱타머를 통해 또는 단백질-단백질 상호 작용을 통해 촉매적으로 비활성화된 CRISPR 효소에 자신을 부착하는 것인 숙주 세포.
제 81 항에 있어서,
가이드 RNA는 자신을 전사 활성화 단백질에 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결되는 것인 숙주 세포.
제 82 항에 있어서,
가이드 RNA는 자신을 전사 불활성화 단백질에 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결되는 것인 숙주 세포.
제 83 항에 있어서,
가이드 RNA는 자신을 전사 억제자 단백질에 부착할 수 있는 앱타머에 작동 가능하게 연결되는 것인 숙주 세포.
제 75 항, 제 81 항 및 제 84 항 중 어느 한 항에 있어서,
전사 활성화 단백질은 VP16, VP64, 및 VP160, VPR로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
제 76 항, 제 82 항 및 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서,
전사 불활성화 단백질은 Mxi1, Tbx3, KRAB, EnR, 및 SID로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
제 77 항, 제 83 항 및 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서,
전사 활성화 단백질은 Mxi1, Tbx3, KRAB, EnR, 및 SID로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
제 69 항에 있어서,
상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 원형인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 69 항에 있어서,
상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 선형인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 69 항에 있어서,
상기 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 유기체의 게놈에 통합되는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 69 항에 있어서,
상기 별개의 cTAG의 적어도 하나는 적어도 2개의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 69 항에 있어서,
CRISPR 랜딩 부위의 적어도 하나는 Cas9 엔도뉴클레아제를 위한 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 69 항에 있어서,
CRISPR 랜딩 부위의 적어도 하나는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 위한 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 69 항에 있어서,
상기 별개의 cTAG의 적어도 하나는 희귀(≥8 염기 길이) 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체.
제 73 항에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 돌연변이된 Cas9 엔도뉴클레아제인 숙주 세포.
제 73 항에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소는 돌연변이된 Cpf1 엔도뉴클레아제인 숙주 세포.
제 73 항에 있어서,
숙주 세포는 하나 초과의 핵산 가이드 RNA를 포함하는 것인 숙주 세포.
제 99 항에 있어서,
가이드 RNA 중 적어도 하나는 다른 가이드 RNA와 상이한 서열을 포함하는 것인 숙주 세포.
제 99 항에 있어서,
가이드 RNA 중 적어도 하나는 다른 가이드 RNA와 상이한 DNA 표적 부위 서열을 표적으로 하는 것인 숙주 세포.
제 74 항에 있어서,
숙주 세포는 하나 초과의 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소를 포함하는 것인 숙주 세포.
제 102 항에 있어서,
촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소 중 적어도 하나는 구조체에서 암호화된 다른 촉매적으로 불활성화된 CRISPR 효소와 상이한 서열을 포함하는 것인 숙주 세포.
제 66 항에 있어서,
cTAG 중 하나 이상은 SEQ ID NO: 65-74, 78-81 및 이들의 조합으로 이루어진그룹으로부터 선택되는 것인 삽입체 부분.
하나 이상의 숙주 세포 유전자의 발현을 조절하는 고 처리량 방법으로서, 상기 방법은 제 66 항의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하며; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치하는 것인 고 처리량 방법.
제 105 항에 있어서,
재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체의 적어도 하나의 삽입체 부분은 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 고 처리량 방법.
제 105 항 또는 제 106 항에 있어서,
삽입체 부분은 CRISPR 단백질의 기능을 조절하는 것인 고 처리량 방법.
제 105 항 또는 제 106 항에 있어서,
삽입체 부분은 가이드 RNA의 발현을 조절하는 것인 고 처리량 방법.
제 105 항 또는 제 106 항에 있어서,
재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체는 여분의 염색체 DNA로서 숙주 세포에 남아 있는 것인 고 처리량 방법.
CRISPR 효소 변이체를 선별하기 위한 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체로서, 상기 구조체는 CRISPR 다중 복제 부위를 포함하고, 상기 다중 복제 부위는 다음을 포함하는 것인 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체:
a) 적어도 2개의 별개의 복제 태그(cTAG), 여기서 각각의 cTAG는
i) 각각이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 작동 가능하게 연결된 프로토스페이서 서열을 포함하는 하나 이상의 확증된 CRISPR 랜딩 부위를 포함하며; 여기서 상기 확증된 CRISPR 랜딩 부위 중 적어도 하나는 모듈식 CRISPR DNA 구조체 내에서 고유하다; 및
b) 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들);
i) 여기서 상기 별개의 cTAG의 각각은 각각의 하나 이상의 DNA 삽입체 부분(들)의 각각의 주위의 플랭킹 위치에 분포된다;
여기서 구조체는 다음을 추가로 포함한다:
c) CRISPR 효소, 또는 CRISPR 기능을 갖는 것으로 의심되는 효소("추정적인 CRISPR 효소")를 암호화하는 제 1 핵산; 및
d) DNA 표적 부위에 결합할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 제 2 핵산.
숙주 세포에서 CRISPR 활성을 선별하는 고 처리량 방법으로서, 상기 방법은 다음 단계:
a) 제 65 항 또는 제 66 항의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치한다; 및
b) DNA 표적 부위에서 발생하는 DNA 절단 정도를 측정하는 단계를 포함하는 것인 고 처리량 방법.
숙주 세포에서 CRISPRi 활성을 선별하는 고 처리량 방법으로서, 이 방법은 다음 단계:
a) 제 65 항 또는 제 66 항의의 재조합 모듈식 CRISPR DNA 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계; 여기서 가이드 RNA의 DNA 표적 부위는 숙주 세포 게놈 내에 위치한다; 및
b) DNA 표적 부위에서 발생하는 전사 조절 정도를 측정하는 단계를 포함하는 것인 고 처리량 방법.
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