CN114774454B - 用于构建贝氏柯克斯体可诱导型CRISPRi系统的DNA分子及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于构建贝氏柯克斯体可诱导型CRISPRi系统的DNA分子及应用，属于遗传工程技术领域。本发明提供了一种DNA分子，所述DNA分子自上游至下游依次包括：启动子、sgRNA基因、Tet阻遏蛋白的反义基因、Tet操纵子、dCas9基因、所述启动子的反向启动子，所述反向启动子是核苷酸序列与所述启动子的核苷酸序列反向互补的启动子。本发明仅需要向贝氏柯克斯体中一次性转入含有上述DNA分子的质粒，即可完成贝氏柯克斯体的特定基因表达抑制，该方法可更为方便快捷地对贝氏柯克斯体进行遗传操作，为研究贝氏柯克斯体特定基因的生物学功能和毒力表型提供了技术基础。

Description

用于构建贝氏柯克斯体可诱导型CRISPRi系统的DNA分子及 应用

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及用于构建贝氏柯克斯体可诱导型CRISPRi系统的DNA分子及应用。

背景技术

贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)是重要人兽共患病Q热的病原体，主要通过感染动物的流产或分娩排泄物、粪便、阴道分泌物、乳汁等排出体外，形成含贝氏柯克斯体气溶胶，引起人类感染。

DotB为贝氏柯克斯体IV型分泌系统伴侣蛋白，敲除或敲低该蛋白表达，不影响贝氏柯克斯体在体外培养基中的生长繁殖水平，但会影响贝氏柯克斯体在宿主细胞内的生长繁殖水平；Com1为贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白，为细菌结构完整必需蛋白，通常用来作为细菌载量的内参。

长期以来，贝氏柯克斯体被认为是专性胞内寄生菌，且生长缓慢，对其进行遗传学操作是一项巨大挑战。2009年Ander等人建立了贝氏柯克斯体的体外培养方法，开启了贝氏柯克斯体的遗传操作新时代。目前，仅自杀质粒同源重组技术可用于贝氏柯克斯体染色体编码基因的定向突变研究。一方面该技术操作繁琐，需要利用抗生素和蔗糖作为筛选标记进行两次阳性克隆筛选；另一方面由于贝氏柯克斯体同源重组发生率低，需要设计不同长度的同源臂的重组质粒进行尝试，通常一次成功的基因定点敲除实验需要耗费几个月周期。因此亟需开发高效的基因定点敲除或者基因表达抑制方法，高效实现特定基因的表达抑制，以便于研究贝氏柯克斯体特定基因的生物学功能和毒力表型。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：如何高效实现贝氏柯克斯体特定目的基因的表达抑制。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种DNA分子，所述DNA分子自上游至下游依次包括Tet阻遏蛋白(Tet repressor protein, TetR)的反义基因、Tet操纵子(Tet operator, TetO)和dCas9基因。

所述反义基因的核苷酸序列与所述Tet阻遏蛋白的核苷酸序列反向互补。所述反义基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.2第7-630位。

所述贝氏柯克斯体可为贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)；

所述tet阻遏蛋白(TetR)的编码序列可为SEQ ID No.2第7-630位的反向序列；

所述Tet操纵子(TetO)的编码序列可为SEQ ID No.2第649-704位；

所述dCas9的编码序列可为SEQ ID No.1第25-4131位。

进一步地，上述的DNA分子中，所述DNA分子还包括表达sgRNA的sgRNA基因。

进一步地，上述的DNA分子中，所述DNA分子自上游至下游依次包括：启动子、所述sgRNA基因、所述Tet阻遏蛋白的反义基因、所述Tet操纵子、所述dCas9基因、所述启动子的反向启动子，所述反向启动子是核苷酸序列与所述启动子的核苷酸序列反向互补的启动子。

进一步地，上述的DNA分子中，所述启动子的核苷酸序列可为SEQ ID No.3第7-201位，所述反向启动子的核苷酸序列与所述启动子的核苷酸序列反向互补。

在本发明的一个实施例中，所述sgRNA的靶标基因是dotB基因，所述dotB基因的编码序列可为核苷酸序列是SEQ ID No.4的DNA分子。

所述sgRNA的PAM序列可为SEQ ID No.3第202-221位。

所述sgRNA基因可为核苷酸序列是SEQ ID No.3第202-303位的DNA分子。

在本发明的一个实施例中，上述的DNA分子中包含表达盒1和表达盒2，所述表达盒1自上游至下游依次包含P1169启动子、sgRNA基因、Tet操纵子和dCas9基因，所述表达盒2自上游至下游包含P1169启动子和Tet阻遏蛋白(TetR)，所述表达盒1和表达盒2的表达方向不同。

为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供生物材料，所述生物材料可为B1)、B2)或B3)，

B1)、含有上述DNA分子的重组载体；

B2)、含有上述DNA分子或B1)所述重组载体的重组微生物；

B3)、含有上述DNA分子或B1)所述重组载体或B2)所述重组微生物的重组细胞。

为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供应用，所述应用可为A1)、A2)或A3)

A1)、上述的DNA分子或上述的生物材料在研究贝氏柯克斯体特定基因的生物学功能中的应用；

A2)、上述的DNA分子或上述的生物材料在研究贝氏柯克斯体特定基因的毒力表型中的应用；

A3)、上述的DNA分子或上述的生物材料在贝氏柯克斯体遗传转化中的应用。

为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供抑制贝氏柯克斯体的靶基因表达的方法，所述方法包括将含有上述DNA分子的载体导入贝氏柯克斯体，抑制贝氏柯克斯体的靶基因表达，所述DNA分子中，所述sgRNA的靶标基因是所述靶基因。

本发明中，所述sgRNA的PAM序列可以位于所述靶基因上，也可以位于所述靶基因起始密码子的上游。

所述sgRNA的PAM序列可以位于正义链(编码链)上，也可以位于反义链(非编码链)上。

为解决上述技术问题，第五个方面，本发明提供制备重组贝氏柯克斯体的方法，所述方法包括将含有上述DNA分子的载体导入贝氏柯克斯体，得到重组贝氏柯克斯体，所述重组贝氏柯克斯体在脱水四环素存在的条件下在宿主细胞内繁殖能力低于所述贝氏柯克斯体；所述DNA分子中，所述sgRNA的靶标基因是dotB基因。

所述dotB基因的编码序列是核苷酸序列为SEQ ID No.4的DNA分子。

在本发明的一个实施例中，所述sgRNA的PAM序列位于dotB基因的起始密码子ATG的反义链上游。

具体的，所述sgRNA的PAM序列的核苷酸序列是SEQ ID No.3第202-221位。

所述sgRNA基因的核苷酸序列是SEQ ID No.3第202-303位。

进一步地，上述的方法中，所述宿主细胞可为动物细胞。

在本发明的一个实施例中，所述动物细胞为THP-1细胞，所述THP-1细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0233。

在本发明的一个实施例中，所述脱水四环素 (简称aTc，购自MCE，货号为HY-118660)，所述脱水四环素的工作浓度为0.2 μg/mL。

本发明中，所述重组载体可为原核表达载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体的骨架载体为pJB-Kan-P1169-3xFLAG，获得的重组载体命名为pdCas9-sgdotB。

所述pdCas9-sgdotB的制备方法为：

用EcoRI和SalI双酶切pJB-Kan-P1169-3xFLAG质粒，用EcoRI和BglII双酶切tetO-TetR(SEQ ID No.2所示的DNA分子)，用BglII和SalI双酶切dCas9(SEQ ID No.1所示的DNA分子)，通过连接酶连结的方式将酶切后的tetO-TetR和酶切后的dCas9序列整合到双酶切后的pJB-Kan-P1169-3xFLAG质粒上，获得的重组质粒命名为pdCas9，在重组载体pdCas9中，启动dCas9表达的启动子为p1169启动子。

利用AfIII单酶切重组载体pdCas9获得线性化的重组载体pdCas9。利用引物F/R扩增SEQ ID No.3所示的StuI-p1169-PAM(dotB)-gRNA scaffold，获得带有同源臂的扩增产物。将线性化的重组载体pdCas9和带有同源臂的扩增产物通过同源重组连接，形成新的重组表达载体命名为pdCas9-sgdotB。引物F是核苷酸序列为SEQ ID No.6所示的DNA分子，引物R是核苷酸序列为SEQ ID No.7所示的DNA分子。

本发明中，所述微生物可为细菌。

在本发明的一个实施例中，所述微生物可为贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)，

具体地，所述贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)为贝氏柯克斯体九里株II相菌(NMII)。

为解决上述技术问题，第六个方面，本发明提供述上述方法制备的重组贝氏柯克斯体。

上述方法制备获得的贝氏柯克斯体可用于研究目的，例如研究贝氏柯克斯体特定基因(例如dotB基因)的生物学功能和毒力表型，也可以用于构建贝氏柯克斯体减毒活疫苗候选株。

本发明取得的有益技术效果如下：

本发明公开了一种贝氏柯克斯体可诱导型CRISPRi系统的构建方法，该方法包括选择一个可诱导的穿梭质粒pJB-Kan-P1169-3xFLAG，将化脓链球菌dCas9基因插入到pJB-Kan-P1169-3xFLAG穿梭质粒中，并将其与四环素调控系统配合使用；再依据贝氏柯克斯体的特定基因，设计相应的sgRNA表达序列，最后将sgRNA表达序列插入至上述重组质粒中即得可诱导型CRISPRi系统；该系统可更方便快捷的进行贝氏柯克斯体目的基因定向表达抑制，以研究目的基因的毒力表型或构建Q热减毒活疫苗。

附图说明

图1为本发明构建的可诱导型CRISPRi质粒图谱。

图2为ACCM-2培养基配方。

图3为实施例2中2.2.1的实验分组信息。

图4为RT-PCR的引物序列。

图5为RT-PCR的反应体系。

图6为RT-PCR检测dcas9、dotB基因表达情况，其中，图6中A为6个小组中dCas9mRNA的相对表达水平，图6中B为6个小组中dotB mRNA的相对表达水平。

图7为Westernblot检测dCas9和DotB蛋白表达水平。

图8为实施例2中2.2.3的实验分组信息。

图9为绝对定量Q-PCR引物及探针。

图10为绝对定量 Q-PCR反应体系(20 μL)。

图11为脱水四环素干扰条件下或脱水四环素未干扰条件下NMII(A)、NMIIpdCas9(B)、NMIIpdCas9-sgdotB(C)菌株的生长曲线，其中图11中A为aTc处理(NMII+aTc)或不加入aTc处理(NMII)的NMII野生菌株的相对增殖倍数，图11中B为aTc处理(NMIIpdCas9+aTc)或不加入aTc处理(NMIIpdCas9)的NMIIpdCas9菌株的相对增殖倍数，图11中C为aTc处理(NMIIpdCas9-sgdotB+aTc)或不加入aTc处理(NMIIpdCas9-sgdotB)的NMIIpdCas9-sgdotB菌株的相对增殖倍数。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pJB-Kan-P1169-3xFLAG质粒，由吉林大学第一医院馈赠，在论文“Coxiellaburnetii inhibits host immunity by a protein phosphatase adapted fromglycolysis. Zhang Y, Fu J, Liu S, Wang L, Qiu J, van Schaik EJ, Samuel JE,Song L, Luo ZQ. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jan 4;119(1):e2110877119.”里公开(补充材料里有记载)，公众可从申请人获得该生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的贝氏柯克斯体九里株II相菌(NMII)为本实验室保存，在论文“Coxiella burnetii Plasmid Effector B Promotes LC3-II Accumulation andContributes To Bacterial Virulence in a SCID Mouse Model. Fu M, Zhang J, ZhaoM, Zhang S, Dai L, Ouyang X, Yu Y, Wen B, Zhou D, Sun Y, Jiao J, Xiong X.Infect Immun. 2022 May 19:e0001622.”里公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

pET32a(+)购自Novagen公司。

THP-1细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0233。

实施例1、可诱导型CRISPRi系统构建

1.1、pdCas9质粒构建

(1)dCas9基因合成

委托金斯瑞生物科技股份有限公司人工合成化脓链球菌dCas9基因，dCas9基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1，其中SEQ ID No.1的第1-6位为BglII酶切位点，第7-18位为RBS，第25-4131位为dCas9基因，第4132-4137位为SalI酶切位点。

(2)teto-TetR序列合成

委托金斯瑞生物科技股份有限公司人工合成tetO-TetR序列，合成后的序列的核苷酸序列为SEQ ID No.2，其中，SEQ ID No.2第1-6位为EcoRI酶切位点，第7-630位为Tet阻遏蛋白(Tet repressor protein, TetR)的反向互补序列，第649-704位为Tet操纵子(Tetoperator, TetO)，第716-721位为BglII酶切位点。

(3)pdCas9质粒构建

用EcoRI和SalI双酶切pJB-Kan-P1169-3xFLAG质粒，用EcoRI和BglII双酶切tetO-TetR，用BglII和SalI双酶切dCas9，通过连接酶连结的方式将酶切后的tetO-TetR和酶切后的dCas9序列整合到双酶切后的pJB-Kan-P1169-3xFLAG质粒上，获得的重组质粒命名为pdCas9，在重组载体pdCas9中，启动dCas9表达的启动子为p1169启动子。

1.2、dotB基因抑制质粒(pdCas9-sgdotB)的构建

寻找dotB基因的起始密码子ATG的反义链上游NGG(N代表任意碱基，本实例以反义链上游43bp处tgg为例，向NGG上游拉20bp即5’-aacgttccccctttatatta-3’(SEQ ID No.3第202-221位)为PAM序列。

通过融合PCR，将195bp的p1169启动子与20bp的PAM序列、82bp的gRNA scaffold融合，形成StuI-p1169-PAM(dotB)-gRNA scaffold，命名为sgRNA(dotB)，sgRNA(dotB)的核苷酸序列为SEQ ID No.3，其中，SEQ ID No.3第1-6位为StuI酶切位点，第7-201位为P1169启动子，第202-221位为dotB PAM，第222-303位为gRNA scaffold。

利用AfIII单酶切重组载体pdCas9获得线性化的重组载体pdCas9。利用引物F/R扩增SEQ ID No.3所示的StuI-p1169-PAM(dotB)-gRNA scaffold，获得带有同源臂的扩增产物。将线性化的重组载体pdCas9和带有同源臂的扩增产物通过同源重组连接，形成新的重组表达载体命名为pdCas9-sgdotB。重组表达载体pdCas9-sgdotB的图谱如图1所示。重组表达载体pdCas9-sgdotB即为可诱导型CRISPRi质粒。

所用引物F/R序列如下：

引物F：5’-ttcacacaggaaacagaattcAGGCCTATGGCTTCGTTTCG-3’(SEQ ID No.6，小写字母表示同源臂序列)；

引物R：5’-gaaagtgggtcttaagaattcAAAAAAGCACCGACTCGGTG-3’(SEQ ID No.7，小写字母表示同源臂序列)。

1.3、可诱导型CRISPRi系统导入贝氏柯克斯体

(1)ACCM-2培养基配方

配制培养贝氏柯克斯体专用的无细胞培养基，其配方如图2所示。

(2)制备电感受态贝氏柯克斯体

将贝氏柯克斯体九里株II相菌(NMII)接种至20 mL 1×ACCM-2培养基，在37 ℃、2.5% O₂、5% CO₂条件下培养7 d。7 d后取出菌液， 4℃ 12000 r/min离心30 min，去除上清，沉淀用10 mL冰水中预冷的10％甘油重悬，冰水中放置10 min。4 ℃ 12000 r/min离心15min，去除上清，沉淀用0.5 mL预冷的10%甘油重悬，冰水中静置10 min；4℃ 12000 r/min离心15 min，去除上清，菌体沉淀用100 μL预冷的10%甘油重悬，冰水中静置待用。

(3)重组载体pdCas9、pdCas9-sgdotB的电转化和筛选

pdCas9-sgdotB的电转化和筛选的具体步骤为：取100 μL贝氏柯克斯体感受态，加入5 μg的质粒DNA(重组载体pdCas9-sgdotB)，轻柔混匀，冰水中静置5 min后转移至0.1 cm电击杯中，1.8 kV、25 μF、500 Ω电击，立即向杯中加入900 μL室温RPMI 1640培养基，吹打混匀，分别取150 μL菌液接种至6 mL含1%胎牛血清ACCM-2中，37 ℃、2.5% O₂、5% CO₂培养24h后加入终浓度为400 μg/mL的卡那霉素，继续培养6 d，筛选获得的菌株命名为NMIIpdCas9-sgdotB。

重组载体pdCas9的电转化和筛选的步骤与pdCas9-sgdotB相同，其区别仅在于，转化的质粒DNA是用重组载体pdCas9替换重组载体pdCas9-sgdotB，筛选获得的菌株命名为NMIIpdCas9。

(4)NMIIpdCas9、NMIIpdCas9-sgdotB的克隆分纯

配置0.4％琼脂糖100 mL，高压蒸汽灭菌，室温下进行降温，42 ℃水浴30 min，取100 mL 2×ACCM-2、37 ℃金属浴30 min。取无菌平皿10个，将2×ACCM-2和0.4％琼脂糖等体积混匀，加入终浓度为400 μg/mL的卡那霉素，向每个平皿中加入20 mL混合后的含0.2％琼脂糖的ACCM-2，生物安全柜中通风放置30 min。将菌液梯度稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6拷贝数/mL(可调整)，取0.5mL稀释后的菌液轻轻滴加在平皿中，用无菌涂布棒小心涂抹均匀，在生物安全柜中通风晾干约30 min。37 ℃、2.5% O₂、5% CO₂培养7 d后，取出平皿，观察菌落，尽可能在接种浓度小的平皿中挑取单一且形态较好的菌落，取96孔板，每孔加入100 μL含有卡那霉素的ACCM-2，将挑出的菌落打入含ACCM-2的96孔板中，37 ℃、2.5% O₂、5% CO₂培养7 d。取出96孔板，吸取显微镜下观察有细菌团块的孔中的菌液扩大培养。为确保得到单克隆，可重复筛选1-2次后扩大培养。

实施例2、可诱导型CRISPRi系统抑制贝氏柯克体dotB表达效率检测

2.1、DotB、Com1蛋白抗血清的制备

(1)制备贝氏柯克斯体dotB基因和com1基因的原核表达载体，dotB基因的编码序列的核苷酸序列是SEQ ID No.4，com1基因的核苷酸序列是SEQ ID No.5。

(2)将上述序列分别插入到原核表达载体pET32a(+)的多克隆位点上，转化入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司，货号CD601-02)，然后采用LB液体培养基37 ℃、200 r/min培养14 h以上。然后以1:100的体积比转接入含氨苄抗性的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养至OD₆₀₀=0.6，然后加入IPTG并使其在体系中的终浓度为500 μM，然后18 ℃、200 r/min培养16 h。离心收集菌体经超声破碎后收集蛋白上清，并分别利用DotB、Com1蛋白所带的His6标签通过Ni柱 (HisTrap HP column，GEHealthcareLife Science)对DotB、Com1蛋白进行初步纯化。

(3)选取5只8周龄、体重相近的雌性BALB/c小鼠(采购自北京维通利华实验动物技术有限公司)。首次免疫以纯化后的DotB、Com1抗原20 µg分别与等体积的弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich，货号F5881) 乳化混合后皮下注射；每间隔两周进行第二次皮下免疫和第三次皮下免疫，第二、三次免疫时佐剂改用弗氏不完全佐剂 (Sigma-Aldrich，货号F5506)。第三次免疫后第14 天眼眶取血处死小鼠，获得DotB和Com1的抗血清。

2.2、pdCas9-sgdotB抑制dotB基因表达效率检测

2.2.1、RT-PCR检测dcas9、dotB基因相对表达量

实验分为两组进行，共计六个小组，每个小组设2个平行。分组情况如图3所示。具体步骤如下所述

(1)以NMIIpdCas9-sgdotB诱导为例，将NMIIpdCas9-sgdotB转接入1瓶T75（T75培养瓶）的含有卡那抗性的ACCM-2培养基中，培养3 天后，将培养液平均分为2瓶，一瓶加入脱水四环素 (aTc，MCE，货号HY-118660)至工作浓度为0.2 μg/mL作为aTc处理组，另一瓶加入相同体积的DMSO (对照，Sigma，货号D2650)作为 DMSO处理组，分别继续培养1天 。

NMII、NMIIpdCas9的诱导操作步骤与NMIIpdCas9-sgdotB相同，其区别仅在于将菌株NMIIpdCas9-sgdotB替换为菌株NMII或NMIIpdCas9。

(2)以NMIIpdCas9-sgdotB感染THP-1细胞为例(NMIIpdCas9-sgdotB小组)，将aTc处理组和DMSO处理组的NMIIpdCas9-sgdotB分别以MOI=100感染THP-1细胞，aTc处理组的细胞培养液中继续加入脱水四环素 (aTc，MCE，货号HY-118660)至工作浓度为0.2 μg/mL，DMSO处理组的细胞培养液继续加入相同体积的DMSO，感染后4 h进行换液处理，清洗掉吸附在细胞表面未进入细胞的菌体，培养3 天后用RNA 提取试剂盒 (Invitrogen，货号12183018A) 提取细胞RNA。

(ⅰ)用PBS缓冲液清洗细胞2次，加入胰酶消化细胞，3 min后用PBS缓冲液轻轻吹打细胞使细胞悬浮。

(ⅱ)将细胞悬液移至无RNA酶的1.5 mL EP管内，3000 r/min 4 ℃离心5 min收集细胞，弃去上清。

(ⅲ)将细胞沉淀用0.3 ml含1 % β-巯基乙醇的试剂盒配套的Lysis Buffer重悬。

(ⅳ)加入0.3 ml 70 %的乙醇，充分振荡混匀液体至无肉眼可见的沉淀，将液体移至试剂盒配套的离心柱内，4 ℃ 13000 r/min离心30 s，弃掉流出液，将离心柱再次装回离心管内。

(ⅴ)离心柱内加入0.7 ml 试剂盒配套的Wash Buffer Ⅰ，4 ℃ 13000 r/min离心30 s，弃掉流出液，将离心柱再次装回离心管内。

(ⅵ)离心柱内加入0.5 ml 试剂盒配套的Wash Buffer Ⅱ (含乙醇)，4 ℃ 13000r/min离心30 s，弃掉流出液，将离心柱再次装回离心管内，而后重复这一步骤，弃掉流出液后将离心柱装在新的离心管内。

(ⅶ)4 ℃ 13000 r/min离心2 min去除离心柱上附着的多余液体，弃掉流出液并将离心柱移至新的1.5 ml EP管内。

(ⅷ)向离心柱中央的吸附膜上滴加50 μl 无RNA 酶的水，室温孵育1 min后4 ℃13000 r/min离心，收集流出液即为提取的RNA，-80 ℃冷冻保存样品。

以贝氏柯克斯体rpoB基因为内参，以提取的mRNA为模板，利用一步法反转录荧光定量试剂盒 (TaKaRa，货号RR096A) 实施定量逆转录PCR(quantitative reversetranscription PCR, RT-qPCR)检测感染细胞内dcas9、dotB基因表达情况，RT-PCR引物如图4所示，按照图5所示添加RT-PCR反应组分至96孔PCR反应板中。加样完毕后按照首先42℃ 5 min，95 ℃ 10 s；第二阶段 95 ℃ 5 s，梯度递减1.6 ℃/s至60 ℃ 34 s，共进行40个循环；最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s的反应条件设置反应程序并进行反应。

NMII、NMIIpdCas9感染THP-1细胞和收样检测的操作步骤与NMIIpdCas9-sgdotB相同，其区别仅在于，将侵染菌株NMIIpdCas9-sgdotB替换为NMII或NMIIpdCas9，所在实验组分别命名为NMII小组、NMIIpdCas9小组。

实验结果如图6所示，图6中A为6个小组中dCas9 mRNA的相对表达水平，图6中B为6个小组中dotB mRNA的相对表达水平。由图6中A可知， DMSO处理组的NMII、NMIIpdCas9和NMIIpdCas9-sgdotB3个小组均不表达dcas9 mRNA； aTC处理组的NMIIpdCas9、NMIIpdCas9-sgdotB小组的dcas9 mRNA相对表达水平分别为21415.41±347.69、18063.75±1128.32，而NMII小组不表达dcas9 mRNA，证明构建的CRISPRi系统中，dcas9 mRNA能在aTC诱导下在贝氏柯克斯体中高水平表达。

由图6中B可知，DMSO处理组中，NMII、NMIIpdCas9、NMIIpdCas9-sgdotB3个小组的dotB mRNA相对表达水平分别为1±0.00、1.03±0.09、0.85±0.01，3组表达水平无显著差异。aTC处理组中，NMII、NMIIpdCas9、NMIIpdCas9-sgdotB这3个小组的dotB mRNA相对表达水平分别为1.01±0.03、1.10±0.05、0.2±0.01，NMIIpdCas9-sgdotB小组的dotB mRNA相对表达水平显著低于NMII和NMIIpdCas9，证明针对dotB基因的CRISPRi系统能在aTC诱导下在贝氏柯克斯体中抑制dotB的mRNA表达，抑制效率在80%以上。

2.2.2、Westernblot检测dCas9和DotB蛋白表达水平

参照2.2.1中所述的方法及分组对THP-1细胞进行感染操作，感染3 天后后裂解不同感染组细胞提取全蛋白，取等量提取的蛋白样品上样，而后依次进行电泳和转膜，转膜完毕后将膜置于封闭液(PBST配置的5%脱脂牛奶)中，摇床上缓慢摇动，室温封闭2 h，而后分别用dCas9(华安生物，货号EM50804)、DotB(2.1制备)小鼠抗血清、Com1(2.1制备)小鼠抗血清作为一抗室温孵育1 h，PBST洗脱3次，每次约5 min，后室温孵育相应二抗1 h，再次洗脱3次，每次约5 min，最后进行曝光，分别检测不同组别中dCas9、DotB蛋白表达情况，以Com1多克隆抗体检测Com1蛋白表达情况作为贝氏柯克斯体感染载量内参。

结果如图7所示。由图7可知，DMSO处理组中，NMII、NMIIpdCas9、NMIIpdCas9-sgdotB小组均检测不到dCas9表达，均检测到DotB和Com1的正常表达；aTC处理组中，NMII、NMIIpdCas9、NMIIpdCas9-sgdotB小组均检测到Com1正常表达； NMII检测不到dCas9表达，而NMIIpdCas9、NMIIpdCas9-sgdotB组能检测到dCas9表达；NMII、 NMIIpdCas9组均检测到DotB正常表达，而NMIIpdCas9-sgdotB组中DotB表达水平显著降低，证明针对dotB基因的CRISPRi系统能在aTC诱导下在贝氏柯克斯体中抑制DotB蛋白表达。

2.2.3、NMII、NMIIpdCas9、NMIIpdCas9-sgdotB菌株的生长曲线

再次参照2.2.1中所述的方法及分组(分组详情见图8，每组设置两个平行)对THP-1细胞进行感染操作，在感染后约4 h换液时，用DNA提取试剂盒 (QIAGEN，货号69506) 提取不同感染组细胞的DNA作为第0 天的样品，之后分别提取感染后第1 天、3天、5天、7天的细胞DNA。利用绝对定量Q-PCR检测贝氏柯克斯体的拷贝数，Com1基因探针引物如图9所示，按照图10所示添加绝对定量Q-PCR反应组分至96孔PCR反应板中，加样完毕后按照50 ℃ 2min，95 ℃ 10 min，而后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min循环 40个循环的反应条件设置反应程序并进行反应。检测Com1基因以指示不同感染小组中贝氏柯克斯体的拷贝数。

结果如图11所示，图11中A为aTc处理(+aTc)或不加入aTc处理的NMII菌株的相对增殖增殖倍数，图11中B为aTc处理(+aTc)或不加入aTc处理的NMIIpdCas9菌株的相对增殖增殖倍数，图11中C为aTc处理(+aTc)或不加入aTc处理的NMIIpdCas9-sgdotB菌株的相对增殖倍数。由图11中A可知，在THP-1细胞培养液中加入aTc处理(+aTc)或不加入aTc处理，贝氏柯克斯体NMII菌株在THP-1细胞繁殖7天后的生长倍数无明显差别(分别为初始感染剂量的74.9±0.98倍和76.57±5.34倍)。由图11中B可知，加入aTc处理或不加入aTc处理，NMIIpdCas9菌株在THP-1细胞繁殖7天后的生长倍数无明显差别(分别为初始感染剂量的99.78±7.61倍和100.25±2.32倍)，提示aTc诱导dCas9表达并不影响贝氏柯克斯体的毒力。由图11中C可知，加入aTc处理诱导后的NMIIpdCas9-sgdotB胞内繁殖水平显著低于未加aTc处理诱导的NMIIpdCas9-sgdotB组的胞内繁殖水平(分别为初始感染剂量的64.66±1.87倍和33.99±1.77倍)，表明加入aTc处理诱导NMIIpdCas9-sgdotB组的dCas9表达并在sgdotB的引导下抑制dotB基因的表达，进而显著抑制贝氏柯克斯体NMIIpdCas9-sgdotB株的胞内繁殖，提示dotB基因是贝氏柯克斯体细胞内繁殖的一个重要毒力因子。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 用于构建贝氏柯克斯体可诱导型CRISPRi系统的DNA分子及应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatctaaag aggagaaagg atctatggat aagaaatact caataggctt agctatcggc 60

acaaatagcg tcggatgggc ggtgatcact gatgaatata aggttccgtc taaaaagttc 120

aaggttctgg gaaatacaga ccgccacagt atcaaaaaaa atcttatagg ggctctttta 180

tttgacagtg gagagacagc ggaagcgact cgtctcaaac ggacagctcg tagaaggtat 240

acacgtcgga agaatcgtat ttgttatcta caggagattt tttcaaatga gatggcgaaa 300

gtagatgata gtttctttca tcgacttgaa gagtcttttt tggtggaaga agacaagaag 360

catgaacgtc atcctatttt tggaaatata gtagatgaag ttgcttatca tgagaaatat 420

ccaactatct atcatctgcg aaaaaaattg gtagattcta ctgataaagc ggatttgcgc 480

ttaatctatt tggccttagc gcatatgatt aagtttcgtg gtcatttttt gattgaggga 540

gatttaaatc ctgataatag tgatgtggac aaactattta tccagttggt acaaacctac 600

aatcaattat ttgaagaaaa ccctattaac gcaagtggag tagatgctaa agcgattctt 660

tctgcacgat tgagtaaatc aagacgatta gaaaatctca ttgctcagct ccccggtgag 720

aagaaaaatg gcttatttgg gaatctcatt gctttgtcat tgggtttgac ccctaatttt 780

aaatcaaatt ttgatttggc agaagatgct aaattacagc tttcaaaaga tacttacgat 840

gatgatttag ataatttatt ggcgcaaatt ggagatcaat atgctgattt gtttttggca 900

gctaagaatt tatcagatgc tattttactt tcagatatcc taagagtaaa tactgaaata 960

actaaggctc ccctatcagc ttcaatgatt aaacgctacg atgaacatca tcaagacttg 1020

actcttttaa aagctttagt tcgacaacaa cttccagaaa agtataaaga aatctttttt 1080

gatcaatcaa aaaacggata tgcaggttat attgatgggg gagctagcca agaagaattt 1140

tataaattta tcaaaccaat tttagaaaaa atggatggta ctgaggaatt attggtgaaa 1200

ctaaatcgtg aagatttgct gcgcaagcaa cggacctttg acaacggctc tattccccat 1260

caaattcact tgggtgagct gcatgctatt ttgagaagac aagaagactt ttatccattt 1320

ttaaaagaca atcgtgagaa gattgaaaaa atcttgactt ttcgaattcc ttattatgtt 1380

ggtccattgg cgcgtggcaa tagtcgtttt gcatggatga ctcggaagtc tgaagaaaca 1440

attaccccat ggaattttga agaagttgtc gataaaggtg cttcagctca atcatttatt 1500

gaacgcatga caaactttga taaaaatctt ccaaatgaaa aagtactacc aaaacatagt 1560

ttgctttatg agtattttac ggtttataac gaattgacaa aggtcaaata tgttactgaa 1620

ggaatgcgaa aaccagcatt tctttcaggt gaacagaaga aagccattgt tgatttactc 1680

ttcaaaacaa atcgaaaagt aaccgttaag caattaaaag aagattattt caaaaaaata 1740

gaatgttttg atagtgttga aatttcagga gttgaagata gatttaatgc ttcattaggt 1800

acctaccatg atttgctaaa aattattaaa gataaagatt ttttggataa tgaagaaaat 1860

gaagatatct tagaggatat tgttttaaca ttgaccttat ttgaagatag ggagatgatt 1920

gaggaaagac ttaaaacata tgctcacctc tttgatgata aggtgatgaa acagcttaaa 1980

cgtcgccgtt atactggttg gggacgtttg tctcgaaaat tgattaatgg tattagggat 2040

aagcaatctg gcaaaacaat attagatttt ttgaaatcag atggttttgc caatcgcaat 2100

tttatgcagc tgatccatga tgatagtttg acatttaaag aagacattca aaaagcacaa 2160

gtgtctggac aaggcgatag tttacatgaa catattgcaa atttagctgg tagccctgct 2220

attaaaaaag gtattttaca gactgtaaaa gttgttgatg aattggtcaa agtaatgggg 2280

cggcataagc cagaaaatat cgttattgaa atggcacgtg aaaatcagac aactcaaaag 2340

ggccagaaaa attcgcgaga gcgtatgaaa cgaatcgaag aaggtatcaa agaattagga 2400

agtcagattc ttaaagagca tcctgttgaa aatactcaat tgcaaaatga aaagctctat 2460

ctctattatc tccaaaatgg aagagacatg tatgtggacc aagaattaga tattaatcgt 2520

ttaagtgatt atgatgtcga tgccattgtt ccacaaagtt tccttaaaga cgattcaata 2580

gacaataagg tcttaacgcg ttctgataaa aatcgtggta aatcggataa cgttccaagt 2640

gaagaagtag tcaaaaagat gaaaaactat tggagacaac ttctaaacgc caagttaatc 2700

actcaacgta agtttgataa tttaacgaaa gctgaacgtg gaggtttgag tgaacttgat 2760

aaagctggtt ttatcaaacg ccaattggtt gaaactcgcc aaatcactaa gcatgtggca 2820

caaattttgg atagtcgcat gaatactaaa tacgatgaaa atgataaact tattcgagag 2880

gttaaagtga ttaccttaaa atctaaatta gtttctgact tccgaaaaga tttccaattc 2940

tataaagtac gtgagattaa caattaccat catgcccatg atgcgtatct aaatgccgtc 3000

gttggaactg ctttgattaa gaaatatcca aaacttgaat cggagtttgt ctatggtgat 3060

tataaagttt atgatgttcg taaaatgatt gctaagtctg agcaagaaat aggcaaagca 3120

accgcaaaat atttctttta ctctaatatc atgaacttct tcaaaacaga aattacactt 3180

gcaaatggag agattcgcaa acgccctcta atcgaaacta atggggaaac tggagaaatt 3240

gtctgggata aagggcgaga ttttgccaca gtgcgcaaag tattgtccat gccccaagtc 3300

aatattgtca agaaaacaga agtacagaca ggcggattct ccaaggagtc aattttacca 3360

aaaagaaatt cggacaagct tattgctcgt aaaaaagact gggatccaaa aaaatatggt 3420

ggttttgata gtccaacggt agcttattca gtcctagtgg ttgctaaggt ggaaaaaggg 3480

aaatcgaaga agttaaaatc cgttaaagag ttactaggga tcacaattat ggaaagaagt 3540

tcctttgaaa aaaatccgat tgacttttta gaagctaaag gatataagga agttaaaaaa 3600

gacttaatca ttaaactacc taaatatagt ctttttgagt tagaaaacgg tcgtaaacgg 3660

atgctggcta gtgccggaga attacaaaaa ggaaatgagc tggctctgcc aagcaaatat 3720

gtgaattttt tatatttagc tagtcattat gaaaagttga agggtagtcc agaagataac 3780

gaacaaaaac aattgtttgt ggagcagcat aagcattatt tagatgagat tattgagcaa 3840

atcagtgaat tttctaagcg tgttatttta gcagatgcca atttagataa agttcttagt 3900

gcatataaca aacatagaga caaaccaata cgtgaacaag cagaaaatat tattcattta 3960

tttacgttga cgaatcttgg agctcccgct gcttttaaat attttgatac aacaattgat 4020

cgtaaacgat atacgtctac aaaagaagtt ttagatgcca ctcttatcca tcaatccatc 4080

actggtcttt atgaaacacg cattgatttg agtcagctag gaggtgacta agtcgac 4137

<210> 2

<211> 721

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaattcttaa gacccacttt cacatttaag ttgtttttct aatccgcata tgatcaattc 60

aaggccgaat aagaaggctg gctctgcacc ttggtgatca aataattcga tagcttgtcg 120

taataatggc ggcatactat cagtagtagg tgtttccctt tcttctttag cgacttgatg 180

ctcttgatct tccaatacgc aacctaaagt aaaatgcccc acagcgctga gtgcatataa 240

tgcattctct agtgaaaaac cttgttggca taaaaaggct aattgatttt cgagagtttc 300

atactgtttt tctgtaggcc gtgtacctaa atgtactttt gctccatcgc gatgacttag 360

taaagcacat ctaaaacttt tagcgttatt acgtaaaaaa tcttgccagc tttccccttc 420

taaagggcaa aagtgagtat ggtgcctatc taacatctca atggctaagg cgtcgagcaa 480

agcccgctta ttttttacat gccaatacaa tgtaggctgc tctacaccta gcttctgggc 540

gagtttacgg gttgttaaac cttcgattcc gacctcatta agcagctcta atgcgctgtt 600

aatcacttta cttttatcta atctagacat cattaattcc taatttttgt tgacactcta 660

tcgttgatag agttatttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagaat tcaaaagatc 720

t 721

<210> 3

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggcctatgg cttcgtttcg cagcgaactt ggaaaaaaaa tttttggcga ttcgccgctt 60

tcgtataacg aagtaaaaac ctatctcagc gaacacccag gcggaaccgc agaacgagcc 120

tggaatcata tttgtgcgcc ttgaaatatc cctctccata ccccataaat aaataatgac 180

attaatcctt catgaaggag gaacgttccc cctttatatt agttttagag ctagaaatag 240

caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt 300

ttt 303

<210> 4

<211> 1119

<212> DNA

<213> Coxiella burnetii

<400> 4

atgatagaaa aatcgcaacg ctaccctaac gaaccttccc gcttcgaacc caaacacatt 60

gacgacttgc taatttattg tcatcggctc ggcgcgtcag atattactat tcaaaccggt 120

cgggccgtcc tcgctgaagt gtatggccgc ttgcaaaccc ttacccggcg tgaattatca 180

aacgcagaaa ccagcgattt attaaacgct atttacggac ccaatggcac aacgcagatc 240

atgcgcggcg aagacatcga tacgcattat gaaataagac ccaatcgaaa cgaacgtttt 300

cgttaccgaa ttaacggcac cggctgtcac gtagatggtc atgaaggtat tcaaattacc 360

attcgagcga ttcctgccga gccccccttg ttatcaaaac tcgacttgcc cgcggctatt 420

gtagacgcta ttgcacctca agaaggtgtg gtttatgtca cgggggccac gggttcgggt 480

aaaagcacgc ttttagcggc cattatccga gaattggccg aagcgccgga tagtcatcgg 540

aaaattttga cttacgaagc tcccattgaa tacgtttacg attcgttaac cacgccaacc 600

gcgagcgtgt gccaatcgga aatccctcgt catttaaatt ctttcgccgc cggtgttaga 660

aacgcacttc gccgcaaacc gcatgcgatc ttagtgggag aagcgcggga caatgaaacc 720

atcagcgcgg tgttagaggc cgctttaacg ggccacccgg tttatacgac ccttcatagc 780

agcggcgttg cagaaaccat tcgtcgactg gtcggcagct ttccggcgga agaacgcatc 840

ggtcgtacta tcgacattat tgaaacattg cgcttaatca tttggcagcg tttagtgcca 900

tcggtagacg gaaagcgggt tgcactgcgt gaatttttgg ttttcaaaga agaaattcgc 960

gatttgttac tcgacagtga tcccgaacaa atcactgcgg cggtgaggcg tttagtggct 1020

gaacatggtc agcccatgca agtcgatgtg gaagcaaaat tcaaaggggg attaatttca 1080

gagcggcttt ataaaatact ttctgcttcg caggaatga 1119

<210> 5

<211> 759

<212> DNA

<213> Coxiella burnetii

<400> 5

gtgaagaacc gtttgactgc actattttta gccggaacct tgaccgcagg cgtggcgata 60

gccgccccct ctcaattcag tttttctcct caacaagtca aagacataca aagcatcgtc 120

caccattatt tagtcaacca cccagaagtt ttagtagaag catcccaagc attgcaaaaa 180

aagacagaag cgcaacaaga agaacacgct caacaagcaa ttaaagaaaa tgcaaagaaa 240

ttatttaacg accctgcatc accagtggca ggcaatcctc atggcaatgt tacattggtt 300

gaatttttcg attatcaatg tggccattgc aaagccatga attctgttat tcaagctatc 360

gtgaaacaaa ataaaaacct ccgcgttgtc ttcaaagaac tgcccatttt tggcggccaa 420

tcgcaatacg ctgccaaagt atcattagca gccgctaaac aaggaaaata ttatgctttc 480

cacgacgcgc tgctcagtgt cgacggccaa ttatcagaac aaatcaccct tcaaaccgca 540

gaaaaagtag gattaaatgt tgctcagctc aaaaaagaca tggataatcc tgctatccaa 600

aaacaactgc gtgataactt ccaattagct caatcgttac agctagcagg caccccgacg 660

ttcgtcattg gtaataaagc gttaaccaaa ttcggtttta tacccggcgc cacctcacaa 720

caaaaccttc aaaaagaaat cgaccgggta gaaaagtaa 759

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcacacagg aaacagaatt caggcctatg gcttcgtttc g 41

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaagtgggt cttaagaatt caaaaaagca ccgactcggt g 41

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgcgtatcta aatgccgtcg ttgg 24

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttgcggttgc tttgcctatt tcttg 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgcaacgcta ccctaacgaa cc 22

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccgagccga tgacaataaa ttagc 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgtcatttcc accatcgtcc ctatc 25

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcccaaccca gatgagtttc cag 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaaacctccg cgttgtcttc a 21

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gctaatgata ctttggcagc gtattg 26

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agaactgccc atttttggcg gcca 24

Claims (6)

1.一种重组载体，所述重组载体含有一种DNA分子，所述DNA分子自上游至下游依次包括：启动子、sgRNA基因、Tet阻遏蛋白的反义基因、Tet操纵子、dCas9基因、所述启动子的反向启动子，所述反向启动子是核苷酸序列与所述启动子的核苷酸序列反向互补的启动子；

所述启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.3第7-201位；

所述dCas9的编码序列为SEQ ID No.1第25-4131位；

所述重组载体的骨架载体为pJB-Kan-P1169-3xFLAG。

2.权利要求1所述重组载体的应用，其特征在于：所述应用为A1)、A2)或A3)

A1)、权利要求1所述的重组载体在研究贝氏柯克斯体特定基因的生物学功能中的应用；

A2)、权利要求1所述的重组载体在研究贝氏柯克斯体特定基因的毒力表型中的应用；

A3)、权利要求1所述的重组载体在贝氏柯克斯体遗传转化中的应用。

3.抑制贝氏柯克斯体的靶基因表达的方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求1所述的重组载体导入贝氏柯克斯体，抑制贝氏柯克斯体的靶基因表达，所述重组载体中，所述sgRNA的靶标基因是所述靶基因。

4.制备重组贝氏柯克斯体的方法，其特征在于：所述方法包括将含有权利要求1所述的重组载体导入贝氏柯克斯体，得到重组贝氏柯克斯体，所述重组贝氏柯克斯体在脱水四环素存在的条件下在宿主细胞内繁殖能力低于所述贝氏柯克斯体；所述重组载体中，所述sgRNA的靶标基因是dotB基因。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为动物细胞。

6.由权利要求4或5所述方法制备的重组贝氏柯克斯体。

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