TWI393779B

TWI393779B - 用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統及其應用

Info

Publication number: TWI393779B
Application number: TW098135114A
Authority: TW
Inventors: Yu Wei Leu; Shu Huei Hsiao; Chia Chen Hsu; Tim Hui-Ming Huang
Original assignee: Nat Univ Chung Cheng
Priority date: 2009-10-16
Filing date: 2009-10-16
Publication date: 2013-04-21
Also published as: US20110091875A1; TW201114897A

Description

用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統及其應用

本發明是有關於一種用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統(three-component gene expression reporting system)，其包含有一第一表現匣(expression cassette)、一第二表現匣以及一經甲基化的聚核苷酸(methylated polynucleotide)。該三元件基因表現報導系統可被用來建立重組型哺乳動物細胞(recombinant mammalian cells)以供篩選一去甲基化試劑(demethylating agent)。

表觀基因調節(epigenetic regulation)(被發現對於所有的細胞功能是必須的)包括許多修飾DNA以及組織蛋白結構(histone structures)的方式，諸如DNA甲基化(DNA methylation)、組織蛋白修飾與再成型(remodeling)，以及藉由小RNAs(small RNAs)的基因默化(gene silencing)(H.S. Choet al. (2007),Journal of Biochemistry and Molecular Biology ,40:151-155)。累積的證據顯示：表觀基因修飾(epigenetic modifications)在病理性疾病(pathological disorders)[包括，例如，癌症、遺傳性疾病(inherited diseases)以及慢性發炎性疾病(chronic inflammatory diseases)]中具有一決定性的角色。

DNA甲基化是藉由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化作用而將一來自於S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)的甲基基團附接至CpG二核苷酸(CpG dinucleotides)中的胞嘧啶(cytosine)的第5個碳上。CpG二核苷酸通常是分布在位於60%的人類基因的啟動子(promoter)和/或第一外顯子(first exon)中的1-至2-kb富含GC的DNA片段[被命名為CpG島(CpG islands)]內(A. Bird(2002),Genes Dev .,16:6-21;M. Ehrlich(1982),Nucleic Acids Research ,10:2709-2721)。

啟動子甲基化(promoter methylation)被知曉會參與重新組織染色質結構(chromatin structure)並且亦在轉錄的不活化(transcriptional inactivation)上扮演一角色(A. Bird(2002)，同上述；M. Ehrlich(2003),J. Cell Biochem .,88:899-910)。位在一活化的啟動子中的CpG島通常是未甲基化的(non-methylated)，而與周圍的染色質表現出一“開放的(open)”構形，容許轉錄因子(transcription factors)以及其他共-活化子(co-activators)的接近以起始基因表現(E. Ballestar and M. Esteller(2002),Carcinogenesis ,23:1103-1109;P.A. Jones and S.B. Baylin(2002),Nat. Rev. Genet .,3:415-428;K.P. Nephew and Tim H-M Huang(2003),Cancer Lett .,190:125-133)。再者，轉錄因子的佔據(occupancy)可以使啟動子對於抑制子(repressors)或其他染色質再成型蛋白質(chromatin remodeling proteins)是不能接近的。相對的，在一不活化的啟動子中的CpG島可以變成被甲基化的，而與有關聯的染色質展現出一“封閉的(closed)”構形。因此，被甲基化的區域對於轉錄因子不再是可接近的，致使該啟動子的功能活性喪失(P.A. Jones and S.B. Baylin(2002)，同上述；S.B. Baylinet al .(2001),Hum. Mol. Genet .,10:687-692;M.R. Rountreeet al. (2001),Oncogene ,20:3156-3165)。

DNA甲基化是非常穩定的表觀基因修飾。此修飾對於哺乳動物的發育(mammalian development)、細胞內印痕基因(imprinted gene)的建立與維持以及細胞內基因組的穩定(stability of genome)都相當的重要。不正常的DNA甲基化修飾，不論是引入(introduction)或移除(removal)，不僅會造成疾病的發生，亦涉及細胞的癌化過程。不正常的DNA甲基化被推想是以兩種主要的方式來造成癌症，一種是特定基因[特別是腫瘤抑制基因(tumor suppressor genes)]當中的高度甲基化(hypermethylation)，而另一種是全體性DNA去甲基化(global DNA demethylation)。

先前的研究顯示DNA甲基化參與了基因的轉錄抑制(J. Boyes and A. Bird(1991),Cell ,64(6):1123-1134;J. Boyes and A. Bird(1992),EMBO J .,11(1):327-333;S.U. Kasset al .(1997),Curr Biol ,7(3):p. 157-165;X. Nanet al. (1997),Cell ,88(4):471-481;R. Singal and G.D. Ginder(1999),Blood ,93(12):4059-4070)。

雖然DNA甲基化被認為是一個相當穩定的表觀基因修飾，更多的證據顯示，在特定的參與分化、發育的基因，或是特定的訊息傳導路徑的下游基因(例如，雌性素受體訊息傳導路徑)，以及在影響細胞癌化的過程中的基因，皆可以觀察到動態的DNA甲基化(dynamic DNA methylation)。

關於疾病(像是癌症)的治療，化學性去甲基化試劑(chemical demethylation reagents)或DNA甲基轉移酶(DNMT)抑制劑被推想能夠恢復腫瘤抑制基因的表現。一個經美國食品與藥物管理局(US Food and Drug Administration,FDA)核准並且被廣泛使用在臨床上的去甲基化試劑的實例是地西他濱(decitabine)[5-氮-2’-去氧胞核苷(5-aza-2’-deoxycytidine)，商品名稱為Dacogen]，它是藉由抑制DNMT來治療骨髓發育不良症候群(myelodysplastic syndrome)。在DNA去甲基化上的成功以及個別的基因表現的恢復指出：表觀基因的調節(譬如DNA甲基化)要比基因的修飾/治療是更加可逆的並且可行的(more reversible and feasible)。

過去20年來，為了瞭解一感興趣之基因的DNA甲基化態樣(DNA methylation pattern)，已有數種分析方法被發展出，例如：亞硫酸氫鹽基因組定序法(bisulfite genomic sequencing method)(MARIANNE FROMMERet al. (1992),Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,89:1827-1831)；甲基化-特異性聚合酶鏈反應(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)(JAMES G. HERMANet al. (1996),Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,93:9821-9826)；組合的亞硫酸氫鹽限制分析(COmbined Bisulfite Restriction Analysis,COBRA)(Zhenggang Xiong and Peter W. Laird(1997),Nucleic Acids Research ,25:2532-2534)；限制標記基因組掃瞄(Restriction Landmark Genomic Scanning,RLGS)(Joseph F. Costelloet al. (2000),Nature Genetics ,25:132-138)；CpG島微陣列(CpG island microarrays)(Pearlly S. Yanet al .(2001),CANCER RESEARCH ,61:8375-8380)；以及甲基-DNA免疫沉澱法(Methyl-DNA ImmunoPrecipitation,MeDIP)(Filipe V. Jacintoet al .(2008),BioTechniques ,44:35-43)。然而，這些分析方法均需取得基因組DNA(genomic DNA)作為分析甲基化態樣的樣品來源，然而，取得基因組DNA的過程必定涉及細胞的破壞。因此，當這些分析方法被用來篩選去甲基化試劑時，不但無法長期且持續地對試驗細胞進行觀察，更無法在去甲基化試劑的投藥之前、期間以及之後連續地即時反映DNA甲基化態樣的動態變化。

報導基因系統(reporter gene system)是一種用於研究調節啟動子與增強子序列(enhancer sequence)以及用於研究轉錄因子的廣泛工具箱。感興趣的調節序列被組合以一選定的報導建構物(reporter construct)且隨後連同相關聯的轉錄因子而被分析。若報導系統被妥適地選定，那麼報導基因的表現位準將與感興趣之啟動子、增強子以及轉錄因子的轉錄活性相關聯。為了確保此一關聯性，報導基因既不能夠擾亂經轉形之細胞的代謝，也不能夠在會產生背景訊號(background signals)的標的細胞內被內生性地表現(endogenously expressed)。在本技藝中，報導基因系統的一些實例包括：氯黴素乙醯基轉移酶(Chloramphenicol AcetylTransferase,CAT)報導基因系統、lac Z報導基因系統、β-葡萄醣醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)報導基因系統以及綠色螢光蛋白質(Green Fluorescent Protein,GFP)報導基因系統等等。然而，針對被應用於啟動子分析(promoter assay)的報導基因系統而言，現今所使用的報導基因系統僅能藉由報導基因的表現量來分析感興趣的啟動子對於啟動下游基因表現的轉錄活性，而無法得知該感興趣之啟動子上的表觀基因調節(特別是DNA甲基化)態樣以及表觀基因調節對於啟動子的轉錄活性的影響。

基於報導基因系統具有透過報導基因的表現位準來反映感興趣之啟動子的轉錄活性的特性，如果能夠以報導基因系統為基礎來發展出一種動態地反映一感興趣之啟動子的甲基化態樣的分析方法，將會是吾人所企望的。

因此，如何能夠即時在某一個特殊時期的細胞內觀察到特定基因啟動子的DNA甲基化修飾的增加或減少，成為一個基因表現報導系統(gene expression reporting system)值得發展的目標。又，由於DNA甲基化參與基因默化的調控，此報導系統必須兼顧下面兩個要點：可以在活細胞中即時觀察，又能成功重演細胞內表觀基因修飾調控基因轉錄生理現象。於是，申請人嘗試利用這兩個要點來設計一可利用活細胞來即時觀察特定基因啟動子的動態甲基化的現象的基因表現報導系統。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統(three-component gene expression reporting system)，包含有：一第一表現匣，沿一轉錄方向(along a transcription direction)依序地包含有：一可於一哺乳動物細胞內運作的第一啟動子序列，一可於該哺乳動物細胞內運作的第一操縱子區域，以及一報導基因，其中該第一啟動子序列以及該第一操縱子區域控制該報導基因的表現；一第二表現匣，包含有：一可於該哺乳動物細胞內運作的第二啟動子序列，以及一坐落在該第二啟動子序列的下游並且編碼一能夠結合至該第一操縱子區域以抑制該報導基因的表現的第一基因產物的第一核酸序列，其中該第二啟動子序列在它的序列中具有一或多個CpG島並且控制該第一核酸序列表現該第一基因產物；以及一選自於由下列所構成的群組中的經甲基化的聚核苷酸：

(i)一單股分子，它具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；

(ii)一雙股分子，它的一股具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；以及

(iii)(i)以及(ii)的組合，

其中該經甲基化的聚核苷酸至一已被該第一與第二表現匣共轉染的哺乳動物細胞的導入可引起該經共轉染的哺乳動物細胞暨其後代細胞(progeny cell)內的該第二啟動子序列的該一或多個CpG島的甲基化，因而抑制該第一核酸序列表現該第一基因產物。

在第二個方面，本發明提供一種用於篩選一去甲基化試劑的套組，包含有：

(a)　一包含有下列的重組型哺乳動物細胞：

(i)一第一表現匣，沿一轉錄方向依序地包含有：一可於一哺乳動物細胞內運作的第一啟動子序列，一可於該哺乳動物細胞內運作的第一操縱子區域，以及一報導基因，其中該第一啟動子序列以及該第一操縱子區域控制該報導基因的表現；以及

(ii)一第二表現匣，包含有：一可於該哺乳動物細胞內運作的第二啟動子序列，以及一坐落在該第二啟動子序列的下游並且編碼一能夠結合至該第一操縱子區域以抑制該報導基因的表現的第一基因產物的第一核酸序列，其中該第二啟動子序列在它的序列中具有一或多個CpG島並且控制該第一核酸序列表現該第一基因產物；以及

(b)　一選自於由下列所構成之群組中的經甲基化的聚核苷酸：

(iii)(i)以及(ii)的組合，

其中該經甲基化的聚核苷酸至該重組型哺乳動物細胞的導入可引起該重組型哺乳動物細胞暨其後代細胞內的該第二啟動子序列的該一或多個CpG島的甲基化，因而抑制該第一核酸序列表現該第一基因產物。

在第三個方面，本發明提供一種用於篩選一作為一去甲基化試劑的候選化合物的方法，其包括：提供一第一群的重組型哺乳動物細胞，各個細胞包含有：

(a)一第一表現匣，沿一轉錄方向依序地包含有：一可於一哺乳動物細胞內運作的第一啟動子序列，一可於該哺乳動物細胞內運作的第一操縱子區域，以及一報導基因，其中該第一啟動子序列以及該第一操縱子區域控制該報導基因的表現；以及

(b)一第二表現匣，包含有：一可於該哺乳動物細胞內運作的第二啟動子序列，以及一坐落在該第二啟動子序列的下游並且編碼一能夠結合至該第一操縱子區域以抑制該報導基因的表現的第一基因產物的第一核酸序列，其中該第二啟動子序列在它的序列中具有一或多個CpG島並且控制該第一核酸序列表現該第一基因產物；

將一選自於由下列所構成之群組中的經甲基化的聚核苷酸導入至該第一群的重組型哺乳動物細胞內：

(iii)(i)以及(ii)的組合，

而使得該第一群的重組型哺乳動物細胞暨其後代細胞內的該第二啟動子序列的該一或多個CpG島變成被甲基化，因而抑制該第一核酸序列表現該第一基因產物；培育該第一群的重組型哺乳動物細胞一段時間以得到一第二群的重組型哺乳動物細胞；偵測該第二群的重組型哺乳動物細胞以得到該報導基因之一第一表現位準；以一候選化合物來處理該第二群的重組型哺乳動物細胞，繼而培育一段時間，俾以得到一第三群的重組型哺乳動物細胞；以及偵測該第三群的重組型哺乳動物細胞以得到該報導基因之一第二表現位準，其中若所得到的該報導基因之第二表現位準是低於所得到的該報導基因之第一表現位準，該候選化合物被認為是一去甲基化試劑。

在第四個方面，本發明提供一種重組型哺乳動物細胞，包含有：一第一表現匣，沿一轉錄方向依序地包含有：一可於一哺乳動物細胞內運作的第一啟動子序列，一可於該哺乳動物細胞內運作的第一操縱子區域，以及一報導基因，其中該第一啟動子序列以及該第一操縱子區域控制該報導基因的表現；以及一第二表現匣，包含有：一可於該哺乳動物細胞內運作的第二啟動子序列，以及一坐落在該第二啟動子序列的下游並且編碼一能夠結合至該第一操縱子區域以抑制該報導基因的表現的第一基因產物的第一核酸序列，其中該第二啟動子序列在它的序列中具有一或多個CpG島並且控制該第一核酸序列表現該第一基因產物，其中在該重組型哺乳動物細胞中，該第二啟動子序列中的該一或多個CpG島已被甲基化而造成該第一核酸序列的抑制，因而容許該報導基因在該重組型哺乳動物細胞中被表現。

在第五個方面，本發明提供一種使用如上所述的重組型哺乳動物細胞來篩選一作為一去甲基化試劑之候選化合物的方法，其包括：培育一第一群的如上所述的重組型哺乳動物細胞；偵測該第一群的重組型哺乳動物細胞以得到該報導基因之一第一表現位準；以一候選化合物來處理該第一群的重組型哺乳動物細胞，繼而培育一段時間，俾以得到一第二群的重組型哺乳動物細胞；以及偵測該第二群的重組型哺乳動物細胞以得到該報導基因之一第二表現位準，其中若所得到的該報導基因之第二表現位準是低於所得到的該報導基因之第一表現位準，該候選化合物被認為是一去甲基化試劑。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。

如本文中所用的，術語“基因(gene)”意指一DNA序列，包括但不限於：一可被轉錄成mRNA[它可被轉譯成多肽鏈(polypeptide chains)]、被轉錄成rRNA或tRNA，或者供酵素以及其他涉及DNA複製(DNA replication)、轉錄(transcription)以及調節(regulation)的蛋白質作為辨識位址(recognition sites)的DNA序列。這個定義包括各種不同的序列多型性(sequence polymorphisms)、突變和/或序列變異體(sequence variants)，其中該等改變(alternation)不會影響基因產物(gene product)的功能。該術語“基因(gene)”被意欲包括不只編碼基因產物的區域還有調節區域包括，例如：啟動子、終止區域(termination regions)、轉譯調節序列(translational regulatory sequences)[諸如，核糖體結合位址以及內部核糖體進入位址(internal ribosome entry sites)]、增強子(enhancers)、默化子(silencers)、絕緣子(insulators)、邊界要素(boundary elements)、複製源點(replication origins)、基質附著位址(matrix attachment sites)，以及基因座控制區域(locus control regions)。該術語“基因”進一步包括所有插入子(intron)以及其他被剪接自mRNA轉錄本(mRNA transcripts)的DNA序列，還有由選擇性剪接位址(alternative splice site)所導致的變異體。該術語“基因(gene)”包括，但不限於：結構基因(structural genes)、免疫基因(immunity genes)以及分泌(輸送)基因[secretory(transport)genes]。

如本文中所用的，術語“報導基因(reporter gene)”意指一聚核苷酸，它編碼一可直接地或者透過對於宿主細胞的特徵的作用而被容易地偵測的分子。代表性的報導基因編碼酵素(enzyme)[例如β-半乳糖酶(lacZ)、氯黴素乙醯基轉移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)、β-葡萄醣醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)]、冷光或螢光蛋白質(luminescent or fluorescent proteins)[諸如綠色螢光蛋白質(Green Fluorescent Protein,GFP)及其變異體]、抗原決定位(antigenic epitopes)[例如組胺酸-tag(Histidine-tag)或流行性感冒血球凝集素tag(influenza hemagluttinin tag)]、不同序列的mRNA，以及類似之物。

如本文中所用的，術語“基因表現報導系統”意指任一種帶有一報導基因以供偵測基因表現的系統、裝置或工具。

如本文中所用的，術語“表現匣”意指在一接受者細胞(recipient cell)內的含有編碼序列(coding sequences)以及足夠的會指引該等編碼序列的適當的轉錄(transcription)與轉譯(translation)的調節資訊(regulatory information)的遺傳物質(genetic material)的建構物(construct)。該表現匣可以被插入至一用來標靶至一所欲的宿主細胞內和/或至一個體中的載體(vector)。

如本文中所用的，術語“載體(vector)”意指任何外源性DNA的載體(carrier)，它對於轉移DNA至一宿主細胞內用以藉由該宿主細胞來複製和/或適當的表現該外源性DNA而言是有用的。術語“載體”包括選殖的以及表現的載體(vehicles)，諸如質體、噬菌體、移動子(transposons)、黏接質體(cosmids)、脂質體、病毒-脂質體複合物、DNA-病毒綴合物(DNA-viral conjugates)、RNA/DNA寡核苷酸、病毒、細菌等。

如本文中所用的，術語“啟動子(promoter)”可與術語“啟動子序列(promoter sequence)”交替地使用，並且意指一能夠在一細胞中結合RNA聚合酶(RNA polymerase)並且起始一個下游(3’方向)編碼序列之轉錄的DNA調節區域。該啟動子是以它的3’端被結合在一編碼序列的轉譯起始密碼子(translation start codon)的旁邊，並且往上游(5’方向)延伸至包括起始轉錄所需的一最小數目的鹼基(bases)或要素(elements)。在多數情形下會引起一基因在多數細胞類型內被表現的啟動子通常被意指為“組成性啟動子(constitutive promoters)”。在一改變的環境條件或發育條件的影響之下會造成一結構核苷酸序列的有條件的表現的啟動子通常被意指為“可誘導的啟動子(inducible promoter)”。

如本文中所用的，術語“操縱子”意指來自一基因(等)的上游(upstream)(5’)的DNA區域，並且一或多個調節蛋白質(抑制子或活化子)結合至該區域俾以控制該基因(等)的表現。

如本文中所用的，術語“上游(upstream)”以及“下游(downstream)”意指核苷酸序列的一要素的位置。“上游”表示一個要比參考要素(reference element)更加5’的要素。“下游”表示一個要比參考要素更加3’的要素。

如本文中所用的，術語“聚核苷酸(polynucleotide)”意指一藉由磷酸二酯鍵聯(phosphodiester linkages)而被連結之核苷酸的序列。本發明的一聚核苷酸可以是一個呈單-或者雙股形式的去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)分子或核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)分子。核苷酸鹼基在此是藉由一個單一字母代碼(letter code)而被表示：腺嘌呤(adenine,A)、鳥嘌吟(guanine,G)、胸腺嘧啶(thymine,T)、胞嘧啶(cytosine,C)、肉苷(inosine,I)以及尿嘧啶(uracil,U)。本發明的一聚核苷酸可使用對於在本技藝中具有通常技術者所熟知的標準技術而被製備。這個術語不是要被解讀為限制關於一聚合物的長度，並且涵括天然核苷酸的已知類似物(analogues)，以及在糖和/或磷酸部分上被修飾的核苷酸。這個術語亦涵括含有經修飾的主鏈殘基或鍵聯(backbone residues or linkages)的核酸，該等核酸是合成的、天然存在的(naturally occurring)以及非天然存在的，該等核酸具有如同參考核酸之相似的結合性質，並且該等核酸以一相似於參考核苷酸的方式被代謝。

如本文中所用的，術語“相同於(identical to)”意指二或多個核苷酸序列當就最大對應(maximum correspondence)而被比對以及被排列[如使用序列比對演算法(sequence comparison algorithms)或藉由檢驗(inspection)所測得的]時是相同的。

如本文中所用的，術語“互補於(complementary to)”意指2個核苷酸序列藉由依據一般用以形成雙螺旋核酸複合物(duplex nucleic acid complexes)之華特生-克里克規則(Watson-Crick rules)而經由它們的嘌呤(purine)和/或嘧啶(pyrimidine)鹼基之氫鍵結(hydrogen bonding)來彼此序列專一性地結合的能力。

如本文中所用的，術語“基因產物(gene product)”主要意指由一核酸所編碼的蛋白質以及多肽，但進一步涵括由其他核酸所編碼的核酸[例如，非-編碼以及調節的RNAs(諸如tRNA、sNRPs)]。

現今用於分析DNA甲基化態樣(DNA methylation pattern)的分析方法均需取得基因組DNA(genomic DNA)作為樣品來源，然而，取得基因組DNA的過程會破壞細胞。因此，在去甲基化試劑的活體外初步篩選中，習知的分析方法不但無法持續地在篩選過程中對試驗細胞進行觀察，更無法在去甲基化試劑的投藥之前、期間以及之後連續反映DNA甲基化態樣的動態變化。

另一方面，已知的報導基因系統僅能藉由報導基因的表現量來分析感興趣的啟動子對於啟動下游基因表現的轉錄活性，而無法得知該感興趣之啟動子上的DNA甲基化態樣以及DNA甲基化對於啟動子的轉錄活性的影響。若能以報導基因系統為基礎發展出一種報導系統來動態地反映一啟動子的甲基化態樣，在新藥開發領域上應會有極高的應用潛力。

再者，由於DNA甲基化參與基因默化的調控，此報導系統最好還能夠兼具下面兩個要點：可以在活細胞中即時觀察，又能成功重演細胞內表觀基因修飾調控基因轉錄生理現象。因此，申請人嘗試利用這兩個要點來設計一可利用活細胞來即時觀察特定基因啟動子的動態甲基化的現象的基因表現報導系統。

於是，本發明提供一種用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，包含有：一第一表現匣，沿一轉錄方向依序地包含有：一可於一哺乳動物細胞內運作的第一啟動子序列，一可於該哺乳動物細胞內運作的第一操縱子區域，以及一報導基因，其中該第一啟動子序列以及該第一操縱子區域控制該報導基因的表現；一第二表現匣，包含有：一可於該哺乳動物細胞內運作的第二啟動子序列，以及一坐落在該第二啟動子序列的下游並且編碼一能夠結合至該第一操縱子區域以抑制該報導基因的表現的第一基因產物的第一核酸序列，其中該第二啟動子序列在它的序列中具有一或多個CpG島並且控制該第一核酸序列表現該第一基因產物；以及一選自於由下列所構成的群組中的經甲基化的聚核苷酸：

(iii)(i)以及(ii)的組合，

其中該經甲基化的聚核苷酸至一已被該第一與第二表現匣共轉染的哺乳動物細胞的導入可引起該經共轉染的哺乳動物細胞暨其後代細胞內的該第二啟動子序列的該一或多個CpG島的甲基化，因而抑制該第一核酸序列表現該第一基因產物。

如本文中所用的，術語“轉錄方向(transcription direction)”意指核苷酸至未成熟之RNA轉錄本(nascent RNAtranscripts)的5’到3’加入的方向。

如本文中所用的，術語“哺乳動物細胞(mammalian cells)”包含衍生自一哺乳動物的正常組織或腫瘤的細胞。依據本發明，該哺乳動物可以選自於由下列所構成的群組：人、牛、綿羊、山羊、馬、犬、貓、兔、大鼠以及小鼠。

較佳地，該哺乳動物細胞是一人類細胞。在本發明的一個較佳具體例中，該哺乳動物細胞是一正常的人類細胞株(normal human cell line)。在本發明的另一個較佳具體例中，該哺乳動物細胞是一人類腫瘤/癌細胞株(human tumor/cancer cell line)。在本發明的一個更佳具體例中，該哺乳動物細胞是一選自於下列所構成的群組中的人類乳癌細胞株：MCF7、ZR-75-1、T-47-D、BT-474、MDA-MB-134以及MDA-MB-361。

依據本發明，一能於一選定的哺乳動物細胞內啟動該報導基因的表現的啟動子即能被使用作為該第一啟動子序列。依據本發明，該第一啟動子序列可以是一來自於病毒(viruses)、噬菌體(bacteriophages)、原核生物細胞或真核生物細胞之一基因的天然啟動子，亦可為一改造自前述天然啟動子序列的人工合成啟動子。依據本發明，該第一啟動子序列較佳地是一組成性啟動子。

依據本發明，該第一啟動子序列包含有一選自於由下列所構成之群組中的啟動子：CMV啟動子、SV40初期啟動子、RSV啟動子、HSV-TK啟動子、U6啟動子、CMV-HSV胸腺核苷激酶啟動子、SRα啟動子以及HIV‧LTR啟動子。在本發明的一個較佳具體例中，該第一啟動子序列包含有一CMV啟動子。

依據本發明，為避免來自於內生性轉錄因子的干擾，該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者較佳地是異源於(heterologous to)該哺乳動物細胞。如本文中所用的，術語“異源於宿主細胞的基因組(heterologous to the genome of the host cell)”意指聚核苷酸不會天然地存在於宿主細胞的基因組中。

依據本發明，該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者較佳地是衍生自一微生物來源。例如，該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者可以衍生自下列任一者之一基因：病毒、細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞以及藻類細胞。更佳地，該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者是衍生自一細菌細胞[例如大腸桿菌(Escherichia coli )細胞]之一基因。

在本發明的一個較佳具體例中，該第一操縱子區域包含有一四環素操縱子(tetracycline operator)以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一四環素抑制子(tetracycline repressor)。

在本發明的另一個較佳具體例中，該第一操縱子區域包含有一Lac操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一Lac抑制子。

在本發明的再一個較佳具體例中，該第一操縱子區域包含有一GUS操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一GUS抑制子。

依據本發明，該報導基因編碼一選自於由下列所構成的群組中的報導基因產物：綠色螢光蛋白質(green fluorescent protein,GFP)、增強的綠色螢光蛋白質(enhanced green fluorescent protein,EGFP)、紅色螢光蛋白質(red fluorescent protein)、黃色螢光蛋白質(yellow fluorescent protein)、藍色螢光蛋白質(blue fluorescent protein)、td-Tomato、mCherry、螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase)、水母螢光素酶(Renilla luciferase)、β-半乳糖酶(β-galactosidase)、β-葡萄醣醛酸酶(β-glucuronidase)，以及一包含有此等蛋白質的一或多者的融合蛋白。在本發明的一個較佳具體例中，該報導基因產物是EGFP。

依據本發明，該第二啟動子序列在一選定的哺乳動物細胞內是處於活躍地轉錄的狀態(actively transcribed state)，亦即處於未甲基化狀態。

依據本發明，該第二啟動子序列可以進一步包含有它所來自的基因之第一外顯子(first exon)。如此處所用的，術語“第一外顯子”意指一基因的第一區域，該第一區域編碼一多肽或一多肽區域並且位於該基因的啟動子區域的下游。

較佳地，該第二啟動子序列包含有一選自於由下列所構成的群組中的啟動子：Trip10 啟動子、Casp8AP2 啟動子、ENSA 啟動子以及H1C1 啟動子。在本發明的一個較佳具體例中，該第二啟動子序列包含有Trip10 啟動子以及Trip10 基因的第一外顯子的第1-339個核苷酸殘基。

依據本發明，該經甲基化的聚核苷酸具有一範圍落在22至2,000個核苷酸或甚至更長的長度。較佳地，該經甲基化的聚核苷酸具有一範圍落在60至1,500個核苷酸的長度。更佳地，該經甲基化的聚核苷酸具有一範圍落在150至1,000個核苷酸的長度。在本發明的一個較佳具體例中，該經甲基化的聚核苷酸具有一為500個核苷酸的長度。

如本文中所用的，術語“轉染(transfection)”可與術語“轉形(transformation)”交替地使用，並且意指將一外源性核酸分子(exogenous nucleic acid molecule)導入至一被選定的宿主細胞內。依據本技藝中已知的技術，一外源性核酸分子[例如，一重組型DNA建構物(recombinant DNA construct)或一重組型載體(recombinant vector)]可藉由各種不同的技術[諸如基因槍(gene gun)、電穿孔(electroporation)、顯微注射(microinjection)、熱休克(heat shock)、磷酸鈣沉澱(calcium phosphate precipitation)、磁性轉染(magnetofection)、核轉染(nucleofection)、脂質體轉染(lipofection)、轉染試劑的使用(use of transfection reagents)、陽離子聚合物的使用(use of cationic polymers)等等]而被導入至一勝任宿主細胞(competent host cell)內。

如本文中所用的，術語“被共轉染(co-transfected)”或“共轉染(co-transfection)”意指將數個核酸一起導入至一選定的接受者細胞內。

依據本發明，該第一表現匣進一步包含有一第一標記基因(first marker gene)以及該第二表現匣進一步包含有一第二標記基因(second marker gene)，其中該第一標記基因、該第二標記基因以及該報導基因彼此互不相同，藉此一被該第一與第二表現匣共轉染的哺乳動物細胞可從一篩選試驗(screening test)中被挑選出

如本文中所用的，術語“標記基因”意指一可轉錄的聚核苷酸分子，它的表現可以某種方式被篩選或評比(scored)。

較佳地，適用於本發明的該第一標記基因以及該第二標記基因各自獨立地選自於由下列所構成的群組：潮黴素抗性基因(hygromycin resistance gene)、新黴素抗性基因(neomycin resistance gene)、健他黴素抗性基因(gentamycin resistance gene)、殺稻瘟菌素抗性基因(blasticidin resistance gene)、吉歐黴素抗性基因(Zeocin resistance gene)以及嘌呤黴素抗性基因(puromycin resistance gene)。在本發明的一個較佳具體例中，該第一標記基因是潮黴素抗性基因，而該第二標記基因是新黴素抗性基因。

依據本發明，該第一表現匣以及該第二表現匣可存在於互不相同的載體(vector)內。另擇地，該第一表現匣以及該第二表現匣可存在於一相同的載體內且彼此間隔分開。該載體可以是一線性或環形表現系統，並且涵括保持游離基因形式或是被整合至宿主細胞的基因組內的表現系統。該表現系統可具有或不具有自我複製的能力，它可能只會驅使宿主細胞的短暫表現。

圖1示意地顯示本發明的三元件基因表現報導系統的一個較佳具體例的實施，其中有一個第一表現匣以及一個第二表現匣被設計成分別位在不同的載體上。該第一表現匣沿一轉錄方向依序地帶有一個CMV啟動子(P_CMV )、2個四環素操縱子(2x TetO₂ )以及一個EGFP基因，並且有一個潮黴素抗性基因(Hygro)位在該CMV啟動子的上游處以作為該第一表現匣的標記基因。該第二表現匣帶有一個Trip10 啟動子以及一個坐落在該Trip10 啟動子的下游並且編碼四環素抑制子(TetR，以空心圓圈物表示)的核酸序列，並有一個新黴素抗性基因(Neo)位在該Trip10 啟動子的上游處以作為該第二表現匣的標記基因。

該第一與第二表現匣可被共轉染至一哺乳動物細胞內。參見圖1，在該Trip10 啟動子的序列中的CpG島是未經甲基化的情況下(以空心直立火柴棒表示)，該Trip10 啟動子可以啟動該編碼四環素抑制子的核酸序列的表現，而由此所生成的TetR會以雙體(dimer)的形式結合至該第一表現匣的TetO₂ ，而使得該EGFP基因在經共轉染的哺乳動物細胞內的表現被抑制。

參見圖1，若將經甲基化的單股聚核苷酸(以於頂部標示有實心直立火柴棒的齒梳狀物表示)導入至該經共轉染的哺乳動物細胞內，該經共轉染的哺乳動物細胞暨其後代細胞內的Trip10 啟動子的序列中的CpG島會變成被甲基化(以實心直立火柴棒表示)，這使得該Trip10 啟動子無法啟動該編碼四環素抑制子的核酸序列的表現，因而TetO₂ 不會受到該TetR雙體的抑制，使得該EGFP基因可以被表現(圖1當中的星形物代表該EGFP基因的基因產物)。

申請人發現：以該經甲基化的單股聚核苷酸來處理該經共轉染的哺乳動物細胞，可以於活細胞內即時且持續地觀察該Trip10 啟動子的動態甲基化。

申請人又發現：在被該經甲基化的單股聚核苷酸處理過之後，若以一去甲基化試劑來進一步處理該經共轉染的哺乳動物細胞，該經共轉染的哺乳動物細胞暨其後代細胞內的Trip10 啟動子的序列中的CpG島會變成去甲基化，這使得該Trip10 啟動子可啟動該編碼四環素抑制子的核酸序列的表現，因而該EGFP基因在經共轉染的哺乳動物細胞暨其後代細胞內的表現再度被抑制。

申請人又發現：在以該去甲基化試劑來處理被該經甲基化的單股聚核苷酸處理過的該經共轉染的哺乳動物細胞時，可以將一可幫助反轉該Trip10 啟動子的該一或多個CpG島的甲基化的試劑同時施用至該經共轉染的哺乳動物細胞，俾以促進該Trip10 啟動子的去甲基化。該試劑可為一雌激素或一雌激素類似物，例如17β-雌二醇。

因此，依據本發明的三元件基因表現報導系統可被用來建立重組型哺乳動物細胞以供在活細胞內即時觀察特定基因啟動子的動態甲基化的現象。同時，依據本發明的三元件基因表現報導系統與重組型哺乳動物細胞被預期在篩選去甲基化試劑上具有極佳的應用潛力。

於是，本發明提供一種用於篩選一去甲基化試劑的套組，包含有：

(a)一包含有下列的重組型哺乳動物細胞：

(b)一選自於由下列所構成之群組中的經甲基化的聚核苷酸：

(iii)(i)以及(ii)的組合，

其中該經甲基化的聚核苷酸至該哺乳動物細胞的導入可引起該哺乳動物細胞暨其後代細胞內的該第二啟動子序列的該一或多個CpG島的甲基化，因而抑制該第一核酸序列表現該第一基因產物。

依據本發明，該重組型哺乳動物細胞是藉由以該第一與第二表現匣來共轉染一選自於由下列所構成的群組中的細胞而被獲得：人類細胞、牛細胞、綿羊細胞、山羊細胞、馬細胞、犬細胞、貓細胞、兔細胞、大鼠細胞以及小鼠細胞。較佳地，該重組型哺乳動物細胞是藉由以該第一與第二表現匣來共轉染一人類細胞而被獲得。在本發明的一個較佳具體例中，該哺乳動物細胞是一正常的人類細胞株。在本發明的另一個較佳具體例中，該哺乳動物細胞是一人類腫瘤/癌細胞株。在本發明的一個更佳具體例中，該哺乳動物細胞是一選自於下列所構成的群組中的人類乳癌細胞株：MCF7、ZR-75-1、T-47-D、BT-474、MDA-MB-134以及MDA-MB-361。

本發明亦提供用於篩選一作為一去甲基化試劑的候選化合物的方法，其包括：提供一第一群的重組型哺乳動物細胞，各個細胞包含有：

(i) 一單股分子，它具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；

(iii)(i)以及(ii)的組合，

而使得該第一群的重組型哺乳動物細胞暨其後代細胞內的該第二啟動子序列的該一或多個CpG島變成被甲基化，因而抑制該第一核酸序列表現該第一基因產物；

培育該第一群的重組型哺乳動物細胞一段時間以得到一第二群的重組型哺乳動物細胞；偵測該第二群的重組型哺乳動物細胞以得到該報導基因之一第一表現位準；以一候選化合物來處理該第二群的重組型哺乳動物細胞，繼而培育一段時間，俾以得到一第三群的重組型哺乳動物細胞；以及偵測該第三群的重組型哺乳動物細胞以得到該報導基因之一第二表現位準，其中若所得到的該報導基因之第二表現位準是低於所得到的該報導基因之第一表現位準，該候選化合物被認為是一去甲基化試劑。

有關偵測該重組型哺乳動物細胞以獲得該報導基因的表現位準，這可採用熟習此項技藝者所熟知且慣用的技術來執行。例如，可藉由比色法(colormetry)、螢光測定法(fluorimetry)、冷光分析(luminescent analysis)、酵素結合免疫吸附分析(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)或流動式細胞測量術(flow cytometry)來偵測該重組型哺乳動物細胞。在本發明的一個較佳具體例中，偵測該重組型哺乳動物細胞是藉由螢光測定法來執行。

依據本發明，在以該候選化合物來處理該第二群的重組型哺乳動物細胞時，一可幫助反轉該第二啟動子序列的該一或多個CpG島的甲基化的試劑被同時施用至該第二群的重組型哺乳動物細胞。在本發明的一個較佳具體例中，該第二啟動子序列包含有一Trip10 啟動子，以及該試劑是一雌激素。在本發明的另一個較佳具體例中，該第二啟動子序列包含有一Trip10 啟動子，以及該試劑是一雌激素類似物[例如，17β-雌二醇(17β-estradiol)]。

本發明亦提供一種重組型哺乳動物細胞，包含有：一第一表現匣，沿一轉錄方向依序地包含有：一可於一哺乳動物細胞內運作的第一啟動子序列，一可於該哺乳動物細胞內運作的第一操縱子區域，以及一報導基因，其中該第一啟動子序列以及該第一操縱子區域控制該報導基因的表現；以及一第二表現匣，包含有：一可於該哺乳動物細胞內運作的第二啟動子序列，以及一坐落在該第二啟動子序列的下游並且編碼一能夠結合至該第一操縱子區域以抑制該報導基因的表現的第一基因產物的第一核酸序列，其中該第二啟動子序列在它的序列中具有一或多個CpG島並且控制該第一核酸序列表現該第一基因產物，其中在該重組型哺乳動物細胞中，該第二啟動子序列中的該一或多個CpG島已被甲基化而造成該第一核酸序列的抑制，因而容許該報導基因在該重組型哺乳動物細胞中被表現。

依據本發明，該重組型哺乳動物細胞的獲得是藉由以該第一與第二表現匣來共轉染一選自於由人類細胞、牛細胞、綿羊細胞、山羊細胞、馬細胞、犬細胞、貓細胞、兔細胞、大鼠細胞以及小鼠細胞所構成的群組中的細胞，繼而將一選自於由下列所構成之群組中的經甲基化的聚核苷酸導入至由此所得到的經共轉染的細胞：

(ii)　一雙股分子，它的一股具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；以及

(iii)　(i)以及(ii)的組合。

較佳地，該重組型哺乳動物細胞是藉由以該第一與第二表現匣來共轉染一人類細胞，繼而將該經甲基化的聚核苷酸導入至由此所得到的經共轉染的人類細胞而被獲得。

本發明亦提供一種使用如上所述的重組型哺乳動物細胞來篩選一作為一去甲基化試劑之候選化合物的方法，其包括：培育一第一群的如上所述的重組型哺乳動物細胞；偵測該第一群的重組型哺乳動物細胞以得到該報導基因之一第一表現位準；以一候選化合物來處理該第一群的重組型哺乳動物細胞，繼而培育一段時間，俾以得到一第二群的重組型哺乳動物細胞；以及偵測該第二群的重組型哺乳動物細胞以得到該報導基因之一第二表現位準，其中若所得到的該報導基因之第二表現位準是低於所得到的該報導基因之第一表現位準，該候選化合物被認為是一去甲基化試劑。

依據本發明，在以該候選化合物來處理該第一群的重組型哺乳動物細胞時，一可幫助反轉該第二啟動子序列的該一或多個CpG島的甲基化的試劑被同時施用至該第一群的重組型哺乳動物細胞。在本發明的一個較佳具體例中，該第二啟動子序列包含有一Trip10 啟動子，以及該試劑是一雌激素。在本發明的另一個較佳具體例中，該第二啟動子序列包含有一Trip10 啟動子，以及該試劑是一雌激素類似物[例如，17β-雌二醇]。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 實驗材料： 1.生長培養基(Growth medium)：

若無特別說明，在下面實施例中用來培養哺乳動物細胞的生長培養基是以最低必需培養基(minimum essential medium,MEM)(Gibco BRL)作為基礎培養基(basal medium)，並補充有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Biological Industries)、2mM麩醯胺酸(glutamine)(Gibco BRL)以及100mg/mL盤尼西林(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)。

2.篩選培養基(Screening medium)：

在下面實施例中所使用的篩選培養基大體上是以上節「1.生長培養基」當中所述的材料來配製，並進一步補充有0.5mg/mL G418以及0.4mg/mL潮黴素(hygromycin)。

3.表現雌激素受體α(estrogen receptor α ⁺ ,ERα ⁺ )的人類乳癌細胞株MCF7：

MCF7細胞[美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)，寄存編號(accession number)HTB-22]被置入於含有培養基的培養瓶(flask)中，並且被培養在一被設定為37℃與95% O₂ /5% CO₂ 的培養箱(incubator)中，每週予以更換新鮮的生長培養基2次。當細胞密度達到90%匯聚(confluence)時，即進行細胞繼代培養(cell passages)。

一般實驗方法： 1.轉形(Transformation)：

將選定的質體與勝任大腸桿菌DH5α細胞(competentE. coli DH5α cells)(Yeastern Biotech,Cat. No. YE607-J)混合均勻，繼而置於冰上作用歷時5分鐘。接著，將所形成的混合物塗佈於含有50μg/mL胺芐青黴素(ampicillin)的固態瓊脂培養盤(solid agar plates)上，並於37℃下培養歷時16小時。之後，由固態瓊脂培養盤上挑出抗-胺芐青黴素菌落(ampicillin-resistant colonies)並予以接種至含有50μg/mL胺芐青黴素的LB肉湯培養基(LB broth)內，於37℃下培養歷時16小時。

2.轉染(Transfection)：

於6井-培養盤的各井中植入要被進行轉染的細胞(1x10⁵ 細胞/2mL生長培養基/井)。在細胞貼附之後，移除各井中的液體，繼而對培養盤的各井予以加入轉染混合物[包含有300μL的MEM、6μL的DMRIE-C試劑(Invitrogen)以及一被選定要用來轉染細胞的DNA]，並予以培育歷時4小時。之後，以生長培養基將各井中的液體體積補足至1mL並繼續培育歷時48小時。

實施例1.帶有人類 Trip10 啟動子的重組型質體pTrip10-TR的構築(Construction of recombinant plasmid pTrip10-TR containing human Trip10 promoter)

重組型質體pTrip10-TR包含有人類Trip10 啟動子以及四環素抑制子(Tetracycline Repressor,TetR)基因，其構築流程如圖2所示並且被詳細說明如下。

1.構築重組型質體pTrip10-yT＆A： 根據以參考序列(Reference Sequence)NM_004240[智慧人甲狀腺激素受體相互作用蛋白質10(Homo sapiens thyroid hormone receptor interactor 10,Homo sapiens Trip10)，mRNA]被登錄於NCBI網站的核苷酸序列，以及以UCSC ID uc002mfs.1被登錄於UCSC網站之人類Trip10 基因的核苷酸序列而分別設計出下面2個引子： h_Trip10_promoter_clo_F2引子：5’-ggcctcaggttaaagtttgaccctagga-3’(序列辨識編號：1) h_Trip10_promoter_clo_R1引子：5’-ccttctgcccgcctcattcgcaa-3’(序列辨識編號：2) 以使用基因組DNA純化套組(Genomic DNA Purification Kit)(GeneMark,Cat. No. DP02-150)而被純化出之人類上皮卵巢癌細胞株CP70(human epithelial ovarian cancer cell line CP70)(由University of Glasgow的Dr. Robert Brown所贈與)的基因組DNA作為模版(template)，並且以上面2個引子來進行使用下面表1中所示之反應條件的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)，藉此而擴增出一含有人類Trip10 啟動子的PCR產物(1916bps)，其中該PCR產物的核苷酸序列大體上對應於一始於人類Trip10 基因上游的第1,577個核苷酸殘基直至人類Trip10 基因的第一外顯子(first exon)的第339個核苷酸殘基的核苷酸序列。

於完成PCR之後所得到的PCR產物是藉由1%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)而被確認。接著，以清除與凝膠萃取套組(Clean and Gel Extraction Kit)(BioKit,Cat. No. Bio-C300)來進行PCR產物的純化與回收。最後，將回收的PCR產物溶於20μL的ddH₂ O中以形成一PCR產物溶液(PCR product solution)。

吸取6μL的PCR產物溶液，繼而加入1μL T₄ DNA接合酶(T₄ DNA ligase)、1μL接合緩衝液A(ligation buffer A)、1μL接合緩衝液B以及1μL yT&A選殖載體(yT&Acloning vector)[2728bps，含有胺芐青黴素抗性基因(ampicillin resistance gene)][這4者皆來自於yT&A選殖載體套組(yT&A Cloning Vector Kit)(Yeastern Biotech,Cat. No. YC001)]並予以混合均勻。將所形成的混合物置於4℃下歷時16小時以完成接合反應，藉此而得到重組型質體pTrip10-yT&A，其質體架構如圖2所示。

接著，依據上面“一般實驗方法”的「1.轉形」當中所述方法，大腸桿菌DH5α細胞以該重組型質體pTrip10-yT&A來轉形並予以培養。之後，收取培養物並使用高速質體迷你套組(High-Speed Plasmid Mini Kit)(Geneaid)來抽取該重組型質體pTrip10-yT&A，繼而藉由使用限制酶Hind III的限制酶切割(restriction enzyme cleavage)以及瓊脂糖凝膠電泳來確認所得到的重組型質體pTrip10-yT&A的分子量大小的正確性。經確認的重組型質體pTrip10-yT&A是委託源資生技公司(Tri-I Biotech)來進行定序分析。

2.構築重組型質體pcDNA3-Trip10：

使用限制酶Bgl II以及Eco RI來切割質體pcDNA3[5446bps，具有CMV啟動子(CMV promoter,P_CMV )、新黴素抗性基因(neomycin resistance gene)、限制酶Bgl II切割位址(Bgl II restriction site)以及限制酶Eco RI切割位址](Invitrogen)，而得到一個含有P_CMV 的切割產物(cleavage product)(926bps)以及一個不含有P_CMV 的切割產物(4520bps)。之後，藉由瓊脂糖凝膠電泳，繼而為清除與凝膠萃取套組，來純化與回收該不含有P_CMV 的切割產物。

另外，使用限制酶Bgl II以及Eco RI來切割上面所得到的該重組型質體pTrip10-yT&A，而得到一個含有人類Trip10 啟動子的DNA片段(1928bps)。之後，藉由瓊脂糖電泳，繼而為清除與凝膠萃取套組，來純化與回收該含有人類Trip10 啟動子的DNA片段。

將10μL之含有人類Trip10 啟動子的DNA片段(0.07μg/μL，配於ddH₂ O中)混合以4μL之該不含有P_CMV 的切割產物(0.02μg/μL，配於ddH₂ O中)、2μL的T₄ DNA接合酶、2μL的10X接合緩衝液(Ligation Buffer)以及2μL的50%聚乙二醇4000溶液(50% polyethylene glycol 4000 solution,50% PEG4000 solution)(後3者均得自於Fermentas，Cat. No. EL0334)並予以混合均勻，繼而置於4℃下歷時16小時以完成接合反應，藉此而得到重組型質體pcDNA3-Trip10(圖2中未顯示)。

接著，依據上面“一般實驗方法”的「1.轉形」當中所述方法，大腸桿菌DH5α細胞被轉形以該重組型質體pcDNA3-Trip10並予以培養。之後，收取培養物並使用高速質體迷你套組來抽取該重組型質體pcDNA3-Trip10，繼而使用限制酶切割來確認分子量大小的正確性。最後，經確認的重組型質體pcDNA3-Trip10是委託源資生技公司來進行定序分析。

3.構築重組型質體pTrip10-TR：

使用限制酶Xba I來切割上面所得到的該重組型質體pcDNA3-Trip10，隨後加入5μL的牛腸鹼性磷酸酶(CalfIntestinal Alkaline Phosphatase(CIAP),Promega)(0.01U/μL)以及5μL的10X CIAP反應緩衝液(10X CIAP Reaction Buffer)(Promega)並混合均勻，繼而以ddH₂ O將體積補足至50μL，然後置於37℃下歷時30分鐘，俾以防止該經限制酶Xba I切開之呈線形的重組型質體pcDNA3-Trip10發生自我接合(self-ligation)。

另外，使用限制酶Xba I而從質體pcDNA6/TR(6662bps，含有四環素抑制子基因)(Invitrogen,Cat. No. V1025-20)切出一個含有TetR基因的DNA片段(821bps)，接而使用瓊脂糖凝膠電泳，繼而為清除與凝膠萃取套組，來純化與回收該含有TetR基因的DNA片段。

將4μL的含有該經CIAP處理之以Xba I切開的重組型質體pcDNA3-Trip10(0.1μg/μL，配於ddH₂ O中)混合以20μL的該含有TetR基因的DNA片段(0.15μg/μL，配於ddH₂ O中)，繼而加入4μL的T₄ DNA接合酶、4μL的10X接合緩衝液以及4μL的50% PEG4000溶液並混合均勻，然後置於4℃下歷時16小時以完成接合反應，藉此而得到重組型質體pTrip10-TR(7270bps)，其質體架構如圖2所示。

接著，依據上面“一般實驗方法”的「1.轉形」當中所述方法，大腸桿菌DH5α細胞被轉形以該重組型質體pTrip10-TR並予以培養。之後，收取培養物並使用高速質體迷你套組來抽取該重組型質體pTrip10-TR，繼而使用限制酶切割來確認分子量大小的正確性。最後，經確認的重組型質體pTrip10-TR是委託源資生技公司使用來進行定序分析。

實施例2.帶有增強的綠色螢光蛋白質之重組型質體pTetO-EGFP的構築(Construction of recombinant plasmid pTetO-EGFP containing enhanced green fluorescent protein)

重組型質體pTetO-EGFP包含有2個四環素操縱子(2x Tetracycline Operator,2x TetO₂ )以及可被該2x TetO₂ 調控的增強的綠色螢光蛋白質基因(enhanced green fluorescent protein gene,EGFP gene)，其構築過程被詳細說明如下。

首先，使用限制酶Nhe I來切割質體pEGFP-C1(4731bps，含有G418抗性基因)(Clontech,Cat. No. 6084-1)，繼而使用T₄ DNA聚合酶(T₄ DNA polymerase)(New England BioLabs)將黏端(sticky end)補齊為鈍端(blunt end)，並回收經補齊的切割產物。接著，使用限制酶Xho I來切割經補齊的切割產物，而得到一含有EGFP基因的DNA片段(752bps)以及一不含有EGFP基因的DNA片段(3983bps)。之後，藉由瓊脂糖凝膠電泳，繼而為清除與凝膠萃取套組，來純化與回收該含有EGFP基因的DNA片段。

另外，使用Hin dIII來切割pcDNA5/TO[5667bps，具有2個四環素操縱子(2x TetO₂ )以及潮黴素抗性基因(hygromycin resistance gene)](Invitrogen,Cat. No. V1033-20)，繼而使用T₄ DNA聚合酶將黏端補齊為鈍端，並回收經補齊的切割產物。接著，使用限制酶Xho I來切割經補齊的切割產物，而得到一個DNA小片段(74bps)以及一個DNA大片段(5597bps)。之後，藉由瓊脂糖凝膠電泳，繼而為清除與凝膠萃取套組，來純化與回收該DNA大片段。

將12μL之該含有EGFP基因的DNA片段(0.08μg/μL，配於ddH₂ O中)混合以2μL的該DNA大片段(0.02μg/μL，配於ddH₂ O中)，接而加入2μL的T₄ DNA接合酶、2μL的10X接合緩衝液以及2μL的50% PEG4000溶液並混合均勻，然後置於4℃下歷時16小時以完成接合反應，藉此而得到重組型質體pTetO-EGFP(6345bps)，其質體架構如圖3所示。

接著，依據上面“一般實驗方法”的「1.轉形」當中所述方法，大腸桿菌DH5α細胞被轉形以該重組型質體pTetO-EGFP並予以培養。之後，收取培養物並使用高速質體迷你套組來抽取重組型質體pTetO-EGFP，繼而使用限制酶切割來確認分子量大小的正確性。經確認的重組型質體pTetO-EGFP是委託源資生技公司來進行定序分析，而被證實具有如圖3所示的質體架構。

實施例3.使用重組型質體pTrip10-TR以及pTetO-EGFP來轉染人類乳癌細胞株MCF7(Transfection of human breast cancer cell line MCF7 with recombinant plasmids pTrip10-TR and pTetO-EGFP) 實驗方法：

於6井-培養盤的各井中植入MCF7細胞(1 x 10⁵ 細胞/2mL生長培養基/井)內，接著依據上面“一般實驗方法”的「2.轉染」當中所述方法，以9μL的含有得自於實施例1的該重組型質體pTrip10-TR(1.12μg/μL，配於ddH₂ O中)的溶液以及1μL的含有得自於實施例2的該重組型質體pTetO-EGFP(1μg/μL，配於ddH₂ O中)的溶液來共轉染MCF7細胞。

之後，移除各井中的液體，並將經轉染的MCF7細胞以一為20個細胞/mL的細胞密度分配至含有篩選培養基的10cm培養皿(petri dish)中進行培養。大約1~2週後，挑選出能夠在G418以及潮黴素的存在下生長之經轉染的MCF7細胞，並以篩選培養基來進行培養以及繼代培養，俾以獲得大量經轉染的MCF7細胞。

為了確認該等重組型質體pTrip10-TR以及pTetO-EGFP已分別被併入至經轉染的MCF7細胞的基因組DNA內而形成穩定的轉殖株(stable clone,SC)，下面的實驗被進行。

首先，選取2株編號分別為SC6以及SC9之經轉染的MCF7細胞，並使用基因組DNA純化套組來分別抽取它們的基因組DNA。以所得到的基因組DNA作為模版，並使用如下面表2中所示針對該等重組型質體pTrip10-TR以及pTetO-EGFP的核苷酸序列而被設計出的4組專一性引子對(specific primer pairs)(這4組引子對所分別擴增出的核苷酸區域被顯示於圖4中)來進行使用下面表3中所示反應條件的PCR。另外，分別以水、一含有該等重組型質體pTrip10-TR以及pTetO-EGFP的混合物以及MCF7細胞的基因組DNA來進行相同的實驗以作為空白組(blank)、正對照組(positive control)以及對照組(control)。

於完成PCR之後所得到的PCR產物是藉由瓊脂糖凝膠電泳來進行分析與確認。

另外，穩定轉殖株的確認亦可藉由多西環素(doxycycline，一種能夠結合至TetR而致使TetR對於2x TetO₂ 的抑制作用被解除的四環素類似物)來達成。簡言之，將經篩選培養基所選出之經轉染的MCF7細胞培養於含有1μg/mL多西環素的篩選培養基中，並於37℃下進行培養歷時16至24小時。之後，使用一倒立螢光顯微鏡(inverted fluorescence microscope)(Nikon)，於一為507nm的波長以及一為400X的放大倍率下觀察EGFP的表現情形，並使用一台附接於該倒立螢光顯微鏡的數位照相機來拍照紀錄。另外，被培養於不含多西環素的篩選培養基中之經轉染的MCF7細胞被使用作為對照組。

結果：

圖5顯示以SC6以及SC9細胞的基因組DNA作為模版並使用分別針對重組型質體pTrip10-TR以及pTetO-EGFP之核苷酸序列而被設計出的4組引子對(TR1、TR2、EGFP1以及EGFP2)來進行PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果。從圖5可見，當使用SC6以及SC9細胞的基因組DNA作為模版來進行PCR時，使用上述4組引子對所分別擴增出的PCR產物可在瓊脂糖凝膠上被清楚地觀察到。這個實驗結果顯示：在所選出的SC6以及SC9細胞中，重組型質體pTrip10-TR以及pTetO-EGFP確實已分別被併入至SC6以及SC9細胞各自的基因組DNA內而形成穩定轉殖株。

圖6顯示分別被培養在含有以及不含有1μg/mL多西環素的篩選培養基中的SC6細胞以400X的放大倍率所觀察到的EGFP表現情形。從圖6可見，與對照組相較之下，以含有多西環素的篩選培養基來進行培養的SC6細胞能夠表現EGFP。類似的實驗結果亦在SC9細胞中被觀察到(數據未顯示)。申請人據此而認為：依據本發明所得到的SC6以及SC9細胞皆為穩定轉殖株。在下面的實施例當中，申請人使用SC6細胞來進行實驗。

實施例4. SC6細胞供用於報導 Trip10 啟動子的不活化(inactivation)的評估 1.製備經甲基化之帶有人類 Trip10 啟動子的DNA：

以上面實施例1的「1.構築重組型質體pTrip10-yT＆A」一節中所得到的重組型質體pTrip10-yT＆A作為模版，並使用同節中所示的2個引子來進行使用表1中所示之反應條件的PCR。於完成PCR之後所得到之帶有人類Trip10 啟動子的DNA是藉由瓊脂糖凝膠電泳，繼而為清除與凝膠萃取套組來進行純化與回收。接著，使用NanoDrop(Thermo Scientific)來定量所回收的DNA。

4μg之帶有人類Trip10 啟動子的DNA是藉由在4μL的160μM S-腺苷甲硫胺酸(S-adenosylmethionine,SAM)(New England BioLabs,Cat. No. M0226L)的存在下與20U CpG甲基轉移酶(CpG methyltransferase)(M.SssI )(New England BioLabs,Cat. No. M0226L)於37℃下培育歷時4小時，繼而於65℃下加熱歷時5分鐘而被甲基化。之後，將經甲基化之帶有人類Trip10 啟動子的DNA(以下簡稱為me_Trip10 DNA)置於95℃下加熱歷時5分鐘，繼而立即移至冰上靜置超過5分鐘，藉此而得到呈單股的me_Trip10 DNA。

2.使用me_ Trip10 DNA來轉染SC6細胞(Transfection of SC6 cells with me- Trip10 DNA)：

在一個預備實驗中，申請人發現到：以一數量為0.4μg的單股me_Trip10 DNA來轉染SC6細胞並且持續培養經轉染的SC6細胞歷時72小時，即足以誘導Trip10 啟動子的甲基化(數據未顯示)。因此，在本實驗中，申請人選用0.4μg的單股me_Trip10 DNA來進行下面的實驗。

依據上面“一般實驗方法”的「2.轉染」當中所述的方法，以0.4μg的單股me_Trip10 DNA來轉染上面實施例3中所得到的SC6細胞，並以一為2天的時間間隔重複地進行轉染共計3次。將第1次補足各井內的液體體積至1mL之時間點定義為第0小時，在第0、24、72以及120小時之時，使用倒立螢光顯微鏡來觀察有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞的EGFP表現情形，並使用數位照相機來拍照紀錄。

所拍下的照片是藉由影像分析軟體Scion Image來進行分析。簡言之，Scion Image將數位照相機所拍下的照片分割成若干區域，在視觀上為黑色的區域的EGFP訊號被定義為0，而在視觀上具有最強螢光的區域的EGFP訊號被定義為255。接著，將全部區域的EGFP訊號加總，再除以全部區域的總面積而得到EGFP強度(EFGP intensity)。最後，將第0天的EGFP強度當作100%，並計算出其他各個時間點相對於第0天的EGFP強度百分比(EFGP intensity percentage)。

為了確認SC6細胞的基因組DNA在Trip10 啟動子處發生經標靶的DNA甲基化(targeted DNA methylation)，在第3次轉染之後的2天，收取一部分細胞來進行下面的半-定量甲基化特異性PCR(semi-quantitative methylation-specific PCR,qMSP)以及的亞硫酸氫鹽定序(bisulfite sequencing)。

3.半-定量甲基化特異性PCR(Semi-quantitative methylation-specific PCR,qMSP)：

有關於qMSP實驗的操作步驟是參考P.S. Yanet al .(2006),Clin.Cancer Res .,64:6626-6636當中所述的操作程序來進行。

首先，使用基因組DNA純化套組來純化出SC6細胞的基因組DNA。依據製造商的操作指南，使用EZ DNA甲基化套組(EZ DNA Methylation kit)(Zymo Research,#D5001)而將0.5μg之經純化的基因組DNA予以亞硫酸氫鹽轉化(bisulfite converted)。另外，CpGenome Universal Methylated DNA(Chemicon,Cat. No. S7821)、MCF7細胞的基因組DNA以及被轉染以未甲基化之該帶有人類Trip10 啟動子的DNA的SC6細胞的基因組DNA亦被亞硫酸氫鹽轉化並且分別被使用作為一正對照組、負對照組(negative control)以及模擬轉染對照組(mock-transfection control)。

qMSP實驗在一為25μL的反應混合物[含有4μL的模版(經亞硫酸氫鹽轉化的基因組DNA)(0.02μg/μL)、2μL的引子對(2.5μM)、12.5μL的2X反應緩衝液(SYBR Green Realtime PCR Master Mix)(Toyobo,Cat. No. QPK201)以及6.5μL的ddH₂ O]中被執行。被使用於qMSP實驗中的引子被列示於下面表4中，其中BR_137引子以及BR_138引子是針對人類第II型α1膠原蛋白基因(collagen type II alpha 1 gene,COL2A1 gene)而被設計出，並且被使用來擴增經系列稀釋(serious dilution)(1/10、1/100以及1/1000)的經亞硫酸氫鹽-轉化的CpGenome Universal Methylated DNA，俾以產生用以定量(quantification)的標準曲線(standard curves)以及標準化位在測試樣品中之經甲基化的DNA的數量。

qMSP實驗在一Bio-Rad iQ5即時PCR機器(Bio-Rad iQ5 real time PCR machine)上被執行：在95℃下進行變性反應歷時5分鐘，接而進行40個循環如下：維持在95℃下歷時30秒以及維持在60℃下歷時1分鐘。關於熔化曲線確認(melting curve validation)，PCR以下列條件被執行：維持在55℃下歷時1分鐘又30秒，並且接著斜升(ramping)至95℃(0.5℃/30秒)。單一PCR產物可以藉由一個單一熔化峰(melting peak)的出現而被確認。

甲基化百分比(methylation percentage)是藉由下列公式被計算出：

A=(B/C)×100

A：甲基化百分比(%)

B：經由Trip10 的引子對而擴增的強度

C：經由Col2A1 的引子對而擴增的強度

4.亞硫酸氫鹽定序(Bisulfite sequencing)：

0.02μg之上面所得到的經亞硫酸氫鹽轉化的SC6細胞的基因組DNA被使用作為模版。PCR於一為25μL的反應混合物[含有4μL的經亞硫酸氫鹽轉化的基因組DNA、4μL的引子對(2.5μM)、1μL的dNTPs(10mM)、5μL的MgCl₂ (50mM)、2.5μL的10XTaq 緩衝液、0.2μL的1.25UTaq DNA聚合酶(Fermentus,Cat. No. EP0402)以及8.3μL的ddH₂ O]中被執行。被使用於PCR的引子對如下面所示：

h_bis_Trip10_TR_F2引子：5’-gggaaaggggaaaaggagatggg-3’(序列辨識編號：17)

h_bis_Trip10_TR_R2引子：5’-atcttaccaactttccccttctaaaaaac-3’(序列辨識編號：18)

PCR在一Mastercycler PCR機器(Eppendorf)上被進行，在95℃下進行變性反應歷時5分鐘，接而進行37個循環如下：在95℃下進行變性反應歷時30秒；在60℃下進行引子黏合歷時30秒；以及在72℃下進行延長反應歷時1分鐘又15秒，最後，在72℃下歷時4分鐘以供額外的延長反應。另外，被轉染以一含有未甲基化之該帶有人類Trip10 啟動子的DNA的SC6細胞的基因組DNA被使用作為模擬轉染對照組並進行相同的實驗。

於完成PCR之後所得到的PCR產物是藉由瓊脂糖凝膠電泳而被確認，接著，使用清除與凝膠萃取套組來進行純化與回收。經回收的PCR產物是依據上面實施例1的「1.構築重組型質體pTrip10-yT＆A」當中所述方法，使用yT＆A選殖載體套組而被次選殖(subcloned)。10~15個插入物-陽性轉殖株(insert-positive clones)的質體DNAs是藉由高速質體迷你套組來進行抽取，並且藉由使用限制酶Eco RI以及Bam HI的限制酶切割(restriction enzyme cleavage)以及瓊脂糖凝膠電泳來確認分子量大小的正確性。最後，經確認的質體DNAs是委託源資生技公司進行定序分析。

結果：

圖7顯示有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞在不同時間點以400X的放大倍率所觀察到的EGFP表現情形，其中在上方4個區塊(panels)分別表示在可見光下所觀察到的結果，而在下方4個區塊分別表示在507nm的波長下所觀察到的結果。

圖8顯示藉由影像分析軟體來分別定量分析圖7當中的下方4個區塊所顯示的EGFP表現而得到的EGFP強度分析結果。

從圖7以及圖8可見，當以單股me_Trip10 DNA來轉染SC6細胞時，SC6細胞內的EGFP表現會隨著轉染次數的增加而逐漸上升，而這個現象在細胞分裂數代之後(亦即，第72至120小時)更為明顯。這個實驗結果顯示：SC6細胞能夠持續地藉由EGFP的表現情形來即時反映Trip10 啟動子上的甲基化態樣。

圖9是一長條圖，其顯示藉由qMSP來測定有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞在其Trip10 啟動子以及第一外顯子區域處的甲基化百分比。從圖9可見，有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞在Trip10 啟動子以及第一外顯子區域處的甲基化百分比要比負對照組以及模擬轉染對照組所具者高出約15%。

在亞硫酸氫鹽定序實驗中，為了避免內生性Trip10 啟動子的偽陽性擴增，申請人特別設計出如被顯示於圖4中的專一性的Bis引子對並以之來進行PCR。圖10顯示有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞在Trip10 啟動子與第一外顯子區域處的亞硫酸氫鹽定序結果。從圖10可見，在Trip10 啟動子與第一外顯子區域處的絕大多數CpG二核苷酸在模擬轉染對照組細胞中是未經甲基化的(空心圓圈)，而在導入單股me_Trip10 DNA之後，內生性的DNA甲基化(實心圓圈)在有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞中被觀察到。

歸納上述，依據本發明所建立的SC6細胞能夠透過EGFP的表現量以視觀的方式來報導一經標靶的DNA甲基化態樣。

在一個先前研究中，申請人藉由ChIP-on-chip分析發現到：ERα作用有如一配位子-可誘導的轉錄因子(ligand-inducible transcription factor)，它會藉由結合至下游的標的基因(例如，Trip10 )啟動子區域或繫鏈(tethering)至其他的轉錄因子以調節標的基因的轉錄。在該研究中進一步指出：若要使被默化的基因座(silenced locus)再活化(亦即，恢復轉錄活性)，ERα以及DNA去甲基化這兩者是需要的(Y.W. Leuet al. (2004),Cancer Research ,64:8184-8192)。因此，為了重演Trip10 啟動子再活化的過程，在下面的實驗中，申請人首先在SC6細胞中提供一個不活化的Trip10 啟動子，藉此模擬一個異常的DNA甲基化。接著，申請人在培養基中分別添加(a)17β-雌二醇(17β-estradiol，一種雌激素類似物)以及(b)17β-雌二醇與5-氮-2’-去氧胞核苷(5-aza-2’-deoxycytidine，一種去甲基化試劑)並觀察EGFP的表現情形，俾以瞭解17β-雌二醇與5-氮-2’-去氧胞核苷對於Trip10 啟動子轉錄活性的影響。

實施例5. SC6細胞供用於報導 Trip10 啟動子的轉錄活性變化以及細胞毒性(cytotoxicity)的評估 I.　17β-雌二醇在 Trip10 啟動子對抗DNA甲基化的效用： 實驗方法：

首先，取適量的17β-雌二醇並予以溶於酒精中以形成一濃度為10mg/mL的儲備溶液(stock solution)備用。之後，將上面實施例3所得到的SC6細胞植入至6井-培養盤的各井(1x10⁵ 細胞/2mL篩選培養基/井)內，繼而將培養盤置於培養箱(37℃，95% O₂ /5% CO₂ )中培養過夜以使細胞貼附。接著，對各井予以加入適量之上面所準備的儲備溶液，而使得各井中的17β-雌二醇的最終濃度為10ng/mL。在37℃下培育歷時24小時之後，依照實施例4的「2.使用me_Trip10 DNA來轉染SC6細胞」當中所述的轉染方式，以單股me_Trip10 DNA(0.4μg)來轉染SC6細胞，但不同之處在於：使用補充有10ng/mL 17β-雌二醇的生長培養基來補足各井中的液體體積至1mL。

將第1次補足各井內的液體體積至1mL之時間點定義為第0小時，分別在第0、24、72以及120小時使用倒立螢光顯微鏡來觀察EGFP的表現情形，並使用數位照相機來拍照紀錄，所拍下的照片是藉由影像分析軟體Scion Image來進行定量分析。

結果：

圖11顯示有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞於不同時間點以400X的放大倍率分別在可見光(上方4個區塊)以及507nm的波長(下方4個區塊)下所觀察到的EGFP表現情形。圖12顯示藉由影像分析軟體來定量分析圖11當中的下方4個區塊所顯示的EGFP表現而得到的EGFP強度分析結果。從圖11與12可見，與第0小時相較之下，除了在第72小時的EGFP強度上升至大約150%之外，在其他各時間點的螢光強度皆維持在100%左右。這個實驗結果顯示：若在進行轉染之前將SC6細胞預先培養於添加有17β-雌二醇的篩選培養基中，並且在轉染後持續以添加有17β-雌二醇的篩選培養基來進行培養，可防止Trip10 啟動子受到me_Trip10 DNA的誘導並且維持著未被甲基化的態樣。

II. 5-氮-2’-去氧胞核苷以及17β-雌二醇的共添加(coaddition)對於不活化的 Trip10 啟動子的再活化(reactivation of inactivated Trip10 promoter)的影響： 實驗方法：

將依據上面實施例4的「2.使用me_Trip10 DNA來轉染SC6細胞」一節當中所述，於第3次轉染後的2天所收取之經轉染的SC6細胞植入至6井-培養盤的各井(1x10⁴ 細胞/2mL篩選培養基/井)內，並將培養盤置放在培養箱(37℃，95% O₂ /5% CO₂ )中培養過夜以使細胞貼附。接著，對各井予以加入10mM的5-氮-2’-去氧胞核苷(配於DMSO中)至一最終濃度為25μM(第0天)。之後，以一為2天的時間間隔來更換新鮮的篩選培養基(補充有25μM的5-氮-2’-去氧胞核苷)。自第2次更換篩選培養基(第4天)起，使用補充有25μM的5-氮-2’-去氧胞核苷以及10ng/mL的17β-雌二醇的篩選培養基。在每次更換培養基之前使用倒立螢光顯微鏡來觀察EGFP的表現情形，並使用數位照相機來拍照紀錄，所拍下的照片是藉由影像分析軟體Scion Image來進行定量分析。

結果：

圖13顯示有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞於不同時間點以400X的放大倍率分別在可見光(上方4個區塊)以及507nm的波長(下方的4個區塊)下所觀察到的EGFP表現情形。圖14顯示藉由影像分析軟體來定量分析圖13當中的下方4個區塊所顯示的EGFP表現而得到的EGFP強度分析結果。從圖13與14可見，與第2天的EGFP強度(100%)相較之下，在第4天時的EGFP強度可維持在100%以上，然而，在第6天(使用添加有5-氮-2’-去氧胞核苷以及17β-雌二醇的篩選培養基進行培養累計達2天)時的EGFP強度下降至大約50%，而在第8天(使用含有5-氮-2’-去氧胞核苷以及17β-雌二醇的篩選培養基來進行培養累計達4天)時的EGFP強度下降至大約25%。這個實驗結果顯示：對於Trip10 啟動子而言，在5-氮-2’-去氧胞核苷單獨存在的情況下並不足以再活化Trip10 啟動子，唯有在5-氮-2’-去氧胞核苷以及17β-雌二醇這兩者同時存在的情況下才能夠反轉Trip10 啟動子的甲基化，進而使得Trip10 啟動子再活化而回復至轉錄活化狀態，這與申請人的先前研究結果是一致的(Y.W. Leuet al .(2004)，同上述)。

另一方面，SC6細胞被觀察到能夠隨著時間而在添加有5-氮-2’-去氧胞核苷的篩選培養基中持續生長，這表示5-氮-2’-去氧胞核苷不會對SC6細胞造成傷害，因而不具有細胞毒性。

歸納上述，申請人已發展出一種用於篩選一作為一去甲基化試劑的候選試劑的方法，該方法可以透過報導基因的表現情形在活的試驗細胞中直接且即時地反映該候選試劑對於一感興趣之啟動子的DNA甲基化態樣的影響，藉此決定該候選試劑是否可作為一去甲基化試劑。同時，依據本發明的方法具有不需要破壞細胞的優點，而方便於實驗操作人員在篩選過程中對該試驗細胞進行持續性觀察以分析該候選試劑是否具有細胞毒性。因此，依據本發明的篩選方法被預期是一可用於大量且有效率地篩選去甲基化試劑的有力工具。

於本案說明書中被引述之所有文獻資料以及專利文件以它們的整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案的詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，顯著地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

圖1示意地顯示本發明的三元件基因表現報導系統的一個較佳具體例的實施，其中有一個第一表現匣以及一個第二表現匣被設計成分別位在不同的載體上。該第一表現匣沿一轉錄方向依序地帶有一個CMV啟動子(P_CMV )、2個四環素操縱子(TetO₂ )以及一個EGFP基因，並且有一個潮黴素抗性基因(Hygro)位在該CMV啟動子的上游處以作為該第一表現匣的標記基因。該第二表現匣帶有一個Trip10 啟動子以及一個坐落在Trip10 啟動子的下游並且編碼四環素抑制子(TetR，以空心圓圈物表示)的核酸序列，並有一個新黴素抗性基因(Neo)位在該Trip10 啟動子的上游處以作為該第二表現匣的標記基因，在該Trip10 啟動子上的空心以及實心直立火柴棒分別表示未甲基化的CpG島位置以及經甲基化的CpG島位置，彎曲的箭頭表示轉錄起始位址，×表示轉錄被中止，於頂部標示有實心直立火柴棒的齒梳狀物表示經甲基化的單股聚核苷酸，TATA表示TATA盒(TATA box)，以及星形物表示EGFP；

圖2顯示重組型質體pTrip10-TR的構築流程，其中各代碼所表示的意思如下：TetR，四環素抑制子基因；Amp，胺芐青黴素抗性基因(ampicillin resistance gene)；Neo，新黴素抗性基因；SV40-A，SV40聚腺苷酸化訊號；SV40-P，SV40啟動子；以及Eco RI、Xba I與Bgl II分別意指各個限制酶的切割位址；

圖3顯示重組型質體pTetO-EGFP的質體架構，其中各代碼所表示的意思如下：P_CMV ，CMV啟動子；2x TetO₂ ，2個四環素操縱子；EGFP，增強的綠色螢光蛋白質基因；Hygro，潮黴素抗性基因；以及Xho I意指限制酶的切割位址；

圖4顯示針對重組型質體pTrip10-TR以及pTetO-EGFP的核苷酸序列而被設計出的4組引子對以及被使用於亞硫酸氫鹽定序實驗中的1組引子對所分別對應擴增出的核苷酸區域，其中各代碼所表示的意思如下：P_Trip10 ，Trip10 啟動子；TetR，四環素抑制子基因；Neo，新黴素抗性基因；Bis，Bis引子對；TR1，TR1引子對；TR2，TR2引子對；P_CMV ，CMV啟動子；2x TetO₂ ，2個四環素操縱子；EGFP，增強的綠色螢光蛋白質基因；polyA，聚腺苷酸化訊號；Hygro，潮黴素抗性基因；EGFP1，EGFP1引子對；EGFP2，EGFP2引子對；以及Eco RI、Xba I、Bgl II與Xho I分別意指各個限制酶的切割位址；

圖5顯示以SC6以及SC9細胞的基因組DNA作為模版並使用分別針對重組型質體pTrip10-TR以及pTetO-EGFP之核苷酸序列而被設計出的4組引子對(TR1、TR2、EGFP1以及EGFP2)來進行PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中空白組表示以水來進行PCR，正對照組表示以一含有重組型質體pTrip10-TR以及pTetO-EGFP的混合物來進行PCR，以及對照組表示以MCF7細胞的基因組DNA來進行PCR；

圖6顯示分別被培養在含有以及不含有1μg/mL多西環素的篩選培養基中的SC6細胞以一為400X的放大倍率所觀察到的EGFP表現情形；

圖7顯示有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞在不同時間點以一為400X的放大倍率所觀察到的EGFP表現情形，其中在圖7的上方4個區塊(panels)分別表示在可見光下所觀察到的結果，而在圖7的下方4個區塊分別表示在507nm的波長下所觀察到的結果；

圖8顯示藉由影像分析軟體來分別定量分析圖7當中的下方4個區塊所顯示的EGFP表現而得到的EGFP強度分析結果；

圖9是一長條圖，其顯示藉由qMSP來測定有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞在其Trip10 啟動子以及第一外顯子區域處的甲基化百分比，其中負對照組表示單獨以MCF7細胞之基因組DNA(經亞硫酸氫鹽轉化)來進行實驗，以及模擬轉染對照組表示以有接受一含有未經甲基化之帶有人類Trip10 啟動子的DNA之轉染混合物轉染的SC6細胞的基因組DNA(經亞硫酸氫鹽轉化)來進行實驗；

圖10顯示有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞在Trip10 啟動子與第一外顯子區域處的亞硫酸氫鹽定序結果，模擬轉染對照組表示以有接受一含有未甲基化之該帶有人類Trip10 啟動子的DNA轉染的SC6細胞的基因組DNA來進行亞硫酸氫鹽定序，其中各代碼所表示的意思如下：TetR，四環素抑制子基因；實心以及空心圓圈分別表示經甲基化的CpG二核苷酸以及未經甲基化的CpG二核苷酸；以及彎曲的箭頭表示轉錄起始位；

圖11顯示有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞於不同時間點以一為400X的放大倍率分別在可見光(上方4個區塊)以及507nm的波長(下方4個區塊)下所觀察到的EGFP表現情形；

圖12顯示藉由影像分析軟體來定量分析圖11當中的下方4個區塊所顯示的EGFP表現而得到的EGFP強度分析結果；

圖13顯示有接受單股me_Trip10 DNA轉染的SC6細胞於不同時間點以一為400X的放大倍率分別在可見光(上方4個區塊)以及507nm的波長(下方的4個區塊)下所觀察到的EGFP表現情形；以及

圖14顯示藉由影像分析軟體來定量分析圖13當中的下方4個區塊所顯示的EGFP表現而得到的EGFP強度分析結果。

Claims

一種用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，包含有：一第一表現匣，沿一轉錄方向依序地包含有：一可於一哺乳動物細胞內運作的第一啟動子序列，一可於該哺乳動物細胞內運作的第一操縱子區域，以及一報導基因，其中該第一啟動子序列以及該第一操縱子區域控制該報導基因的表現；一第二表現匣，包含有：一可於該哺乳動物細胞內運作的第二啟動子序列，以及一坐落在該第二啟動子序列的下游並且編碼一能夠結合至該第一操縱子區域以抑制該報導基因的表現的第一基因產物的第一核酸序列，其中該第二啟動子序列在它的序列中具有一或多個CpG島並且控制該第一核酸序列表現該第一基因產物；以及一選自於由下列所構成的群組中的經甲基化的聚核苷酸：(i)一單股分子，它具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；(ii)一雙股分子，它的一股具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；以及(iii)(i)以及(ii)的組合，其中該經甲基化的聚核苷酸至一已被該第一與第二表現匣共轉染的哺乳動物細胞的導入可引起該經共轉染的哺乳動物細胞暨其後代細胞(progeny cell)內的該第二啟動子序列的該一或多個CpG島的甲基化，因而抑制該第一核酸序列表現該第一基因產物。
如申請專利範圍第1項的用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，其中該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者是異源於該哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第1項的用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，其中該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者是衍生自一微生物細胞之一基因。
如申請專利範圍第1項的用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，其中該第一操縱子區域包含有一四環素操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一四環素抑制子。
如申請專利範圍第1項的用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，其中該第一操縱子區域包含有一Lac操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一Lac抑制子。
如申請專利範圍第1項的用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，其中該第一操縱子區域包含有一GUS操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一GUS抑制子。
如申請專利範圍第1項的用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，其中該第一啟動子序列包含有一選自於由下列所構成之群組中的啟動子：CMV啟動子、SV40初期啟動子、RSV-啟動子、HSV-TK啟動子、U6啟動子、CMV-HSV胸腺核苷激酶啟動子、SRα啟動子以及HIV‧LTR啟動子。
如申請專利範圍第1項的用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，其中該報導基因編碼一選自於由下列所構成的群組中的報導基因產物：綠色螢光蛋白質、增強的綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質、黃色螢光蛋白質、藍色螢光蛋白質、td-Tomato、mCherry、螢火蟲螢光素酶、水母螢光素酶、β-半乳糖酶、β-葡萄醣醛酸酶，以及一包含有此等蛋白質的一或多者的融合蛋白。
如申請專利範圍第1項的用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，其中該第二啟動子序列包含有一選自於由下列所構成的群組中的啟動子：Trip10 啟動子、Casp8AP2 啟動子、ENSA 啟動子以及H1C1 啟動子。
如申請專利範圍第1項的用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，其中該經甲基化的聚核苷酸具有一範圍落在20至2,000個核苷酸的長度。
如申請專利範圍第1項的用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，其中該第一表現匣進一步包含有一第一標記基因以及該第二表現匣進一步包含有一第二標記基因，其中該第一標記基因、該第二標記基因以及該報導基因彼此互不相同，藉此一被該第一與第二表現匣共轉染的哺乳動物細胞可從一篩選試驗中被挑選出。
如申請專利範圍第11項的用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統，其中該第一標記基因以及該第二標記基因各自獨立地為一選自於由下列所構成的群組中的基因：潮黴素抗性基因、新黴素抗性基因、健他黴素抗性基因、殺稻瘟菌素抗性基因、吉歐黴素抗性基因以及嘌呤黴素抗性基因。
一種用於篩選一去甲基化試劑的套組，包含有：(a)一包含有下列的重組型哺乳動物細胞：(i)一第一表現匣，沿一轉錄方向依序地包含有：一可於一哺乳動物細胞內運作的第一啟動子序列，一可於該哺乳動物細胞內運作的第一操縱子區域，以及一報導基因，其中該第一啟動子序列以及該第一操縱子區域控制該報導基因的表現；以及(ii)一第二表現匣，包含有：一可於該哺乳動物細胞內運作的第二啟動子序列，以及一坐落在該第二啟動子序列的下游並且編碼一能夠結合至該第一操縱子區域以抑制該報導基因的表現的第一基因產物的第一核酸序列，其中該第二啟動子序列在它的序列中具有一或多個CpG島並且控制該第一核酸序列表現該第一基因產物；以及(b)一選自於由下列所構成之群組中的經甲基化的聚核苷酸：(i)　一單股分子，它具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；(ii)一雙股分子，它的一股具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；以及(iii)(i)以及(ii)的組合，其中該經甲基化的聚核苷酸至該重組型哺乳動物細胞的導入可引起該重組型哺乳動物細胞暨其後代細胞內的該第二啟動子序列的該一或多個CpG島的甲基化，因而抑制該第一核酸序列表現該第一基因產物。
如申請專利範圍第13項的套組，其中該重組型哺乳動物細胞是藉由以該第一與第二表現匣來共轉染一選自於由下列所構成的群組中的細胞而被獲得：人類細胞、牛細胞、綿羊細胞、山羊細胞、馬細胞、犬細胞、貓細胞、兔細胞、大鼠細胞以及小鼠細胞。
如申請專利範圍第14項的套組，其中該重組型哺乳動物細胞是藉由以該第一與第二表現匣來共轉染一人類細胞而被獲得。
如申請專利範圍第15項的套組，其中該人類細胞是一正常的人類細胞株或一人類腫瘤/癌細胞株。
如申請專利範圍第13項的套組，其中該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者是異源於該重組型哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第13項的套組，其中該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者是衍生自一微生物細胞之一基因。
如申請專利範圍第13項的套組，其中該第一操縱子區域包含有一四環素操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一四環素抑制子。
如申請專利範圍第13項的套組，其中該第一操縱子區域包含有一Lac操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一Lac抑制子。
如申請專利範圍第13項的套組，其中該第一操縱子區域包含有一GUS操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一GUS抑制子。
如申請專利範圍第13項的套組，其中該第一啟動子序列包含有一選自於由下列所構成之群組中的啟動子：CMV啟動子、SV40初期啟動子、RSV-啟動子、HSV-TK啟動子、U6啟動子、CMV-HSV胸腺核苷激酶啟動子、SRα啟動子以及HIV‧LTR啟動子。
如申請專利範圍第13項的套組，其中該報導基因編碼一選自於由下列所構成的群組中的報導基因產物：綠色螢光蛋白質、增強的綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質、黃色螢光蛋白質、藍色螢光蛋白質、td-Tomato、mCherry、螢火蟲螢光素酶、水母螢光素酶、β-半乳糖酶、β-葡萄醣醛酸酶，以及一包含有此等蛋白質的一或多者的融合蛋白。
如申請專利範圍第13項的套組，其中該第二啟動子序列包含有一選自於由下列所構成的群組中的啟動子：Trip10 啟動子、Casp8AP2 啟動子、ENSA 啟動子以及H1C1 啟動子。
如申請專利範圍第13項的套組，其中該經甲基化的聚核苷酸具有一範圍落在20至2,000個核苷酸的長度。
如申請專利範圍第13項的套組，其中該第一表現匣進一步包含有一第一標記基因以及該第二表現匣進一步包含有一第二標記基因，其中該第一標記基因、該第二標記基因以及該報導基因彼此互不相同，藉此該重組型哺乳動物細胞可以從一篩選試驗中被挑選出。
如申請專利範圍第26項的套組，其中該第一標記基因以及該第二標記基因各自獨立地為一選自於由下列所構成的群組中的基因：潮黴素抗性基因、新黴素抗性基因、健他黴素抗性基因、殺稻瘟菌素抗性基因、吉歐黴素抗性基因以及嘌呤黴素抗性基因。
一種用於篩選一作為一去甲基化試劑的候選化合物的方法，其包括：提供一第一群的重組型哺乳動物細胞，各個細胞包含有：(a)　一第一表現匣，沿一轉錄方向依序地包含有：一可於一哺乳動物細胞內運作的第一啟動子序列，一可於該哺乳動物細胞內運作的第一操縱子區域，以及一報導基因，其中該第一啟動子序列以及該第一操縱子區域控制該報導基因的表現；以及(b)　一第二表現匣，包含有：一可於該哺乳動物細胞內運作的第二啟動子序列，以及一坐落在該第二啟動子序列的下游並且編碼一能夠結合至該第一操縱子區域以抑制該報導基因的表現的第一基因產物的第一核酸序列，其中該第二啟動子序列在它的序列中具有一或多個CpG島並且控制該第一核酸序列表現該第一基因產物；將一選自於由下列所構成之群組中的經甲基化的聚核苷酸導入至該第一群的重組型哺乳動物細胞內：(i)一單股分子，它具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；(ii)一雙股分子，它的一股具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；以及(iii)(i)以及(ii)的組合，而使得該第一群的重組型哺乳動物細胞暨其後代細胞內的該第二啟動子序列的該一或多個CpG島變成被甲基化，因而抑制該第一核酸序列表現該第一基因產物；培育該第一群的重組型哺乳動物細胞一段時間以得到一第二群的重組型哺乳動物細胞；偵測該第二群的重組型哺乳動物細胞以得到該報導基因之一第一表現位準；以一候選化合物來處理該第二群的重組型哺乳動物細胞，繼而培育一段時間，俾以得到一第三群的重組型哺乳動物細胞；以及偵測該第三群的重組型哺乳動物細胞以得到該報導基因之一第二表現位準，其中若所得到的該報導基因之第二表現位準是低於所得到的該報導基因之第一表現位準，該候選化合物被認為是一去甲基化試劑。
如申請專利範圍第28項的方法，其中該第一群的重組型哺乳動物細胞是藉由以該第一與第二表現匣來共轉染一選自於由下列所構成的群組中的細胞而被獲得：人類細胞、牛細胞、綿羊細胞、山羊細胞、馬細胞、犬細胞、貓細胞、兔細胞、大鼠細胞以及小鼠細胞。
如申請專利範圍第29項的方法，其中該第一群的重組型哺乳動物細胞是藉由以該第一與第二表現匣來共轉染一人類細胞而被獲得。
如申請專利範圍第30項的方法，其中該人類細胞是一正常的人類細胞株或一人類腫瘤/癌細胞株。
如申請專利範圍第28項的方法，其中該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者是異源於該重組型哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第28項的方法，其中該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者是衍生自一微生物細胞之一基因。
如申請專利範圍第28項的方法，其中該第一操縱子區域包含有一四環素操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一四環素抑制子。
如申請專利範圍第28項的方法，其中該第一操縱子區域包含有一Lac操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一Lac抑制子。
如申請專利範圍第28項的方法，其中該第一操縱子區域包含有一GUS操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一GUS抑制子。
如申請專利範圍第28項的方法，其中該第一啟動子序列包含有一選自於由下列所構成之群組中的啟動子：CMV啟動子、SV40初期啟動子、RSV-啟動子、HSV-TK啟動子、U6啟動子、CMV-HSV胸腺核苷激酶啟動子、SRα啟動子以及HIV‧LTR啟動子。
如申請專利範圍第28項的方法，其中該報導基因編碼一選自於由下列所構成的群組中的報導基因產物：綠色螢光蛋白質、增強的綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質、黃色螢光蛋白質、藍色螢光蛋白質、td-Tomato、mCherry、螢火蟲螢光素酶、水母螢光素酶、β-半乳糖酶、β-葡萄醣醛酸酶，以及一包含有此等蛋白質的一或多者的融合蛋白。
如申請專利範圍第28項的方法，其中該第二啟動子序列包含有一選自於由下列所構成的群組中的啟動子：Trip10 啟動子、Casp8AP2 啟動子、ENSA 啟動子以及H1C1 啟動子。
如申請專利範圍第28項的方法，其中該經甲基化的聚核苷酸具有一範圍落在20至2,000個核苷酸的長度。
如申請專利範圍第28項的方法，其中該第一表現匣進一步包含有一第一標記基因以及該第二表現匣進一步包含有一第二標記基因，其中該第一標記基因、該第二標記基因以及該報導基因彼此互不相同，藉此該重組型哺乳動物細胞可以從一篩選試驗中被挑選出。
如申請專利範圍第41項的方法，其中該第一標記基因以及該第二標記基因各自獨立地為一選自於由下列所構成的群組中的基因：潮黴素抗性基因、新黴素抗性基因、健他黴素抗性基因、殺稻瘟菌素抗性基因、吉歐黴素抗性基因以及嘌呤黴素抗性基因。
如申請專利範圍第28項的方法，其中偵測該重組型哺乳動物細胞是藉由比色法、螢光測定法、冷光分析、酵素結合免疫吸附分析或流動式細胞測量術被執行。
如申請專利範圍第28項的方法，其中在以該候選化合物來處理該第二群的重組型哺乳動物細胞時，一可幫助反轉該第二啟動子序列的該一或多個CpG島的甲基化的試劑被同時施用至該第二群的重組型哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第44項的方法，其中該第二啟動子序列包含有一Trip10 啟動子，以及該試劑是一雌激素。
一種重組型哺乳動物細胞，包含有：一第一表現匣，沿一轉錄方向依序地包含有：一可於一哺乳動物細胞內運作的第一啟動子序列，一可於該哺乳動物細胞內運作的第一操縱子區域，以及一報導基因，其中該第一啟動子序列以及該第一操縱子區域控制該報導基因的表現；以及一第二表現匣，包含有：一可於該哺乳動物細胞內運作的第二啟動子序列，以及一坐落在該第二啟動子序列的下游並且編碼一能夠結合至該第一操縱子區域以抑制該報導基因的表現的第一基因產物的第一核酸序列，其中該第二啟動子序列在它的序列中具有一或多個CpG島並且控制該第一核酸序列表現該第一基因產物，其中在該重組型哺乳動物細胞中，該第二啟動子序列中的該一或多個CpG島已被甲基化而造成該第一核酸序列的抑制，因而容許該報導基因在該重組型哺乳動物細胞中被表現。
如申請專利範圍第46項的重組型哺乳動物細胞，其中該重組型哺乳動物細胞的獲得是藉由以該第一與第二表現匣來共轉染一選自於由人類細胞、牛細胞、綿羊細胞、山羊細胞、馬細胞、犬細胞、貓細胞、兔細胞、大鼠細胞以及小鼠細胞所構成的群組中的細胞，繼而將一選自於由下列所構成之群組中的經甲基化的聚核苷酸導入至由此所得到的經共轉染的細胞：(i)一單股分子，它具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；(ii)　一雙股分子，它的一股具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；以及(iii)(i)以及(ii)的組合。
如申請專利範圍第47項的重組型哺乳動物細胞，其中該重組型哺乳動物細胞是藉由以該第一與第二表現匣來共轉染一人類細胞，繼而將該經甲基化的聚核苷酸導入至由此所得到的經共轉染的人類細胞而被獲得。
如申請專利範圍第48項的重組型哺乳動物細胞，其中該人類細胞是一正常的人類細胞株或一人類腫瘤/癌細胞株。
如申請專利範圍第46項的重組型哺乳動物細胞，其中該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者是異源於該重組型哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第46項的重組型哺乳動物細胞，其中該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者是衍生自一微生物細胞之一基因。
如申請專利範圍第46項的重組型哺乳動物細胞，其中該第一操縱子區域包含有一四環素操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一四環素抑制子。
如申請專利範圍第46項的重組型哺乳動物細胞，其中該第一操縱子區域包含有一Lac操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一Lac抑制子。
如申請專利範圍第46項的重組型哺乳動物細胞，其中該第一操縱子區域包含有一GUS操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一GUS抑制子。
如申請專利範圍第46項的重組型哺乳動物細胞，其中該第一啟動子序列包含有一選自於由下列所構成之群組中的啟動子：CMV啟動子、SV40初期啟動子、RSV-啟動子、HSV-TK啟動子、U6啟動子、CMV-HSV胸腺核苷激酶啟動子、SRα啟動子以及HIV‧LTR啟動子。
如申請專利範圍第46項的重組型哺乳動物細胞，其中該報導基因編碼一選自於由下列所構成的群組中的報導基因產物：綠色螢光蛋白質、增強的綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質、黃色螢光蛋白質、藍色螢光蛋白質、td-Tomato、mCherry、螢火蟲螢光素酶、水母螢光素酶、β-半乳糖酶、β-葡萄醣醛酸酶，以及一包含有此等蛋白質的一或多者的融合蛋白。
如申請專利範圍第46項的重組型哺乳動物細胞，其中該第二啟動子序列包含有一選自於由下列所構成的群組中的啟動子：Trip10 啟動子、Casp8AP2 啟動子、ENSA 啟動子以及H1C1 啟動子。
如申請專利範圍第46項的重組型哺乳動物細胞，其中該經甲基化的聚核苷酸具有一範圍落在20至2,000個核苷酸的長度。
如申請專利範圍第46項的重組型哺乳動物細胞，其中該第一表現匣進一步包含有一第一標記基因以及該第二表現匣進一步包含有一第二標記基因，其中該第一標記基因、該第二標記基因以及該報導基因彼此互不相同，藉此該重組型哺乳動物細胞可以從一篩選試驗中被挑選出。
如申請專利範圍第59項的重組型哺乳動物細胞，其中該第一標記基因以及該第二標記基因各自獨立地為一選自於由下列所構成的群組中的基因：潮黴素抗性基因、新黴素抗性基因、健他黴素抗性基因、殺稻瘟菌素抗性基因、吉歐黴素抗性基因以及嘌呤黴素抗性基因。
一種用於篩選一作為一去甲基化試劑之候選化合物的方法，其包括：培育一第一群的如申請專利範圍第46項的重組型哺乳動物細胞；偵測該第一群的重組型哺乳動物細胞以得到該報導基因之一第一表現位準；以一候選化合物來處理該第一群的重組型哺乳動物細胞，繼而培育一段時間，俾以得到一第二群的重組型哺乳動物細胞；以及偵測該第二群的重組型哺乳動物細胞以得到該報導基因之一第二表現位準，其中若所得到的該報導基因之第二表現位準是低於所得到的該報導基因之第一表現位準，該候選化合物被認為是一去甲基化試劑。
如申請專利範圍第61項的方法，其中該第一群的重組型哺乳動物細胞的獲得是藉由以該第一與第二表現匣來共轉染一選自於由下列所構成的群組中的細胞：人類細胞、牛細胞、綿羊細胞、山羊細胞、馬細胞、犬細胞、貓細胞、兔細胞、大鼠細胞以及小鼠細胞，繼而將一選自於由下列所構成之群組中的經甲基化的聚核苷酸導入至由此所得到的經共轉染的細胞：(i)一單股分子，它具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；(ii)一雙股分子，它的一股具有一核苷酸序列是相同於或完全地互補於該第二啟動子序列之一部分所具者；以及(iii)(i)以及(ii)的組合。
如申請專利範圍第62項的方法，其中該第一群的重組型哺乳動物細胞是藉由以該第一與第二表現匣來共轉染一人類細胞，繼而將該經甲基化的聚核苷酸導入至由此所得到的經共轉染的人類細胞而被獲得。
如申請專利範圍第63項的方法，其中該人類細胞是一正常的人類細胞株或一人類腫瘤/癌細胞株。
如申請專利範圍第61項的方法，其中該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者是異源於該重組型哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第61項的方法，其中該第一操縱子區域以及該第一核酸序列這兩者是衍生自一微生物細胞之一基因。
如申請專利範圍第61項的方法，其中該第一操縱子區域包含有一四環素操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一四環素抑制子。
如申請專利範圍第61項的方法，其中該第一操縱子區域包含有一Lac操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一Lac抑制子。
如申請專利範圍第61項的方法，其中該第一操縱子區域包含有一GUS操縱子以及該第一核酸序列所編碼的該第一基因產物是一GUS抑制子。
如申請專利範圍第61項的方法，其中該第一啟動子序列包含有一選自於由下列所構成之群組中的啟動子：CMV啟動子、SV40初期啟動子、RSV-啟動子、HSV-TK啟動子、U6啟動子、CMV-HSV胸腺核苷激酶啟動子、SRα啟動子以及HIV‧LTR啟動子。
如申請專利範圍第61項的方法，其中該報導基因編碼一選自於由下列所構成的群組中的報導基因產物：綠色螢光蛋白質、增強的綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質、黃色螢光蛋白質、藍色螢光蛋白質、td-Tomato、mCherry、螢火蟲螢光素酶、水母螢光素酶、β-半乳糖酶、β-葡萄醣醛酸酶，以及一包含有此等蛋白質的一或多者的融合蛋白。
如申請專利範圍第61項的方法，其中該第二啟動子序列包含有一選自於由下列所構成的群組中的啟動子：Trip10 啟動子、Casp8AP2 啟動子、ENSA 啟動子以及H1C1 啟動子。
如申請專利範圍第61項的方法，其中該經甲基化的聚核苷酸具有一範圍落在20至2,000個核苷酸的長度。
如申請專利範圍第61項的方法，其中該第一表現匣進一步包含有一第一標記基因以及該第二表現匣進一步包含有一第二標記基因，其中該第一標記基因、該第二標記基因以及該報導基因彼此互不相同，藉此該重組型哺乳動物細胞可以從一篩選試驗中被挑選出。
如申請專利範圍第74項的方法，其中該第一標記基因以及該第二標記基因各自獨立地為一選自於由下列所構成的群組中的基因：潮黴素抗性基因、新黴素抗性基因、健他黴素抗性基因、殺稻瘟菌素抗性基因、吉歐黴素抗性基因以及嘌呤黴素抗性基因。
如申請專利範圍第61項的方法，其中偵測該重組型哺乳動物細胞是藉由比色法、螢光測定法、冷光分析、酵素結合免疫吸附分析或流動式細胞測量術來執行。
如申請專利範圍第61的方法，其中在以該候選化合物來處理該第一群的重組型哺乳動物細胞時，一可幫助反轉該第二啟動子序列的該一或多個CpG島的甲基化的試劑被同時施用至該第一群的重組型哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第77的方法，其中該第二啟動子序列包含有一Trip10 啟動子，以及該試劑是一雌激素。