CN113832169A - 靶向HBV cccDNA的药物筛选模型及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒学领域，特别是乙肝病毒治疗领域。具体地，本发明涉及用于筛选HBV cccDNA抑制剂的模型及方法。本发明的筛选模型及方法以拆分荧光素酶的检测作为HBV cccDNA检测的替代指标，能够高通量地筛选靶向cccDNA的药物。

Description

靶向HBV cccDNA的药物筛选模型及方法

技术领域

本发明涉及病毒学领域，特别是乙肝病毒治疗领域。具体地，本发明涉及用于筛选HBV cccDNA抑制剂的模型及方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)导致的慢性乙型肝炎(简称慢乙肝，chronic hepatitis B,CHB)是全球范围最严重的公共卫生问题之一，全球每年有超过80万人死于包括慢性活动性肝炎(chronic active hepatitis)、乙肝相关肝硬化(livercirrhosis)及原发性肝癌(hepatocellular carcinoma)等在内的各类由乙肝病毒感染引起的肝脏疾病。目前临床上主要的两类治疗药物(核苷类似物和干扰素)都很难实现临床治愈。HBV cccDNA的稳定存在是慢乙肝难以治愈的关键原因之一，目前临床上的药物都不能有效清除cccDNA,胞内存在的cccDNA可以持续作为病毒复制和转录的模板。

由于HBV cccDNA形成和维持的机制复杂，直接设计针对cccDNA的药物高度困难，一种可以用于高通量筛选cccDNA抑制剂的筛选模型为开发清除cccDNA的药物提供了新的方法。cccDNA的检测方法复杂，Southern blot是cccDNA检测的金标准，但是细胞用量大，操作复杂，耗时长，不能用于高通量的药物筛选；荧光定量PCR检测相对Southern blot简单快速，通量较高，但也难以应用于大规模的药物筛选，而且检测可能受rcDNA干扰。利用其他更易检测的标志物作为cccDNA检测的替代指标可以降低检测成本，提高检测效率，提高检测的通量。

理想的cccDNA报告模型应该既满足cccDNA的来源稳定，又满足作为替代检测指标的标记易检测，信噪比高。因此，发展适合用于高通量筛选的HBV cccDNA报告模型是十分必要的。

发明内容

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，构建了以拆分荧光素酶作为HBVcccDNA检测替代指标的HBV cccDNA报告模型，其操作简单、耗时短，可实现高通量的药物筛选。因此可利用这种模型进行初筛，获得对HBV cccDNA有抑制潜力的候选药物，再通过更多的HBV体内外研究模型进行验证。

报告模型I

在一些情况下，可以将荧光素酶片段互补技术(LFCA)中的第一片段序列(例如HiBiT)整合入HBV基因组以形成HBV变体，以该HBV变体为模板转录的mRNA缺乏该第一片段(例如HiBiT)表达的起始密码子，不能翻译偶联该第一片段(例如HiBiT)标签的蛋白，只有以该HBV变体转录的pgRNA逆转录形成cccDNA后，以cccDNA为模板转录的mRNA才能翻译偶联该第一片段(例如HiBiT)标签的蛋白，因此可以通过荧光素酶片段互补技术(LFCA)测定该第一片段(例如HiBiT)的表达水平，从而指示HBV cccDNA的形成情况。

1、分离的核酸分子

因此，在第一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含HBV基因组序列(例如野生型HBV基因组)的变体，所述变体包括：包含C-ORF、S-ORF和P-ORF的HBV基因组片段，并且所述C-ORF在precore和core基因之间包含外源插入序列，所述外源插入序列包含编码荧光素酶第一片段的核苷酸序列。所述荧光素酶第一片段能够与荧光素酶片段互补技术(LFCA)中的相应的荧光素酶第二片段结合，并产生荧光素酶活性。

在本文中，术语“荧光素酶片段互补技术(LFCA)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其将荧光素酶分为各自无酶活性的第一片段和第二片段，当这两个片段在相互作用时可以相互补充，产生荧光素酶活性，从而在存在荧光素酶底物的情况下释放发光信号。在某些示例性实施方案中，所述荧光素酶片段互补技术基于来自Promega公司的LgBiT以及能够与其互补结合的小片段(例如HiBiT或SmBiT)，通过LgBiT与HiBiT或SmBiT的结构互补以产生功能性酶。

在某些实施方案中，所述荧光素酶第一片段是LgBiT，所述荧光素酶第二片段是能够与LgBiT互补结合的小片段(例如HiBiT或SmBiT)。

在某些实施方案中，所述荧光素酶第一片段是能够与LgBiT互补结合的小片段(例如HiBiT或SmBiT)，所述荧光素酶第二片段是LgBiT。在某些实施方案中，所述荧光素酶第一片段是HiBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT。在某些实施方案中，HiBiT具有如SEQ IDNO:2所示的序列。在某些实施方案中，所述编码HiBiT的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在某些实施方案中，所述HBV基因组片段还包含X-ORF。

在某些实施方案中，所述变体在HBV基因组序列(例如野生型HBV基因组)的precore和core基因之间包含所述外源插入序列。

在某些实施方案中，所述外源插入序列包含多个拷贝的以串联重复方式存在的编码荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述外源插入序列包含三个拷贝的以串联重复方式存在的编码荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述多个拷贝的以串联重复方式存在的编码荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列中的每个拷贝在其5’端均包含编码连接肽的序列。在某些实施方案中，所述连接肽是柔性肽接头。在某些实施方案中，所述连接肽由G(甘氨酸)和/或S(丝氨酸)组成。在某些实施方案中，所述连接肽是GSG。

在某些实施方案中，所述外源插入序列包含如SEQ ID NO:4所示的序列。

在某些实施方案中，所述HBV基因组是全长基因组，例如，HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的基因组。在某些实施方案中，所述HBV基因组是超长度基因组，例如1.1倍体基因组或1.3倍体基因组。在某些实施方案中，所述HBV基因组是1.1倍体基因组，例如如SEQ ID NO:1所示。

在某些实施方案中，所述外源插入序列与诱导型启动子可操作地连接。

在某些实施方案中，所述外源插入序列通过Tet-On基因调控表达系统而被调控表达。因此，在某些实施方案中，所述诱导型启动子是Tet-On基因调控表达系统中的操纵基因(Tet operator,TetO)或启动子，其必须要Doxycycline结合与之相应的反式激活蛋白才能启动转录。

在某些实施方案中，所述诱导型启动子是TRE3G启动子(例如，如SEQ ID NO:5所示)，与之相应的反式激活蛋白是Tet-On 3G反式激活蛋白(例如，如SEQ ID NO:9所示)。

在某些实施方案中，所述诱导型启动子是包含Tet操纵因子序列(TetO)的一个或多个重复，与之相应的反式激活蛋白可以是反式Tet阻遏蛋白(rTetR)或反义Tet转录活化因子(rtTA)。

在某些实施方案中，所述诱导型启动子具有双向启动活性。

在某些实施方案中，所述诱导型启动子是具有双向启动活性的TRE3G启动子。

在某些实施方案中，所述诱导型启动子可操作地连接有报告基因。在某些实施方案中，所述报告基因与所述外源插入序列的方向相反。在某些实施方案中，所述报告基因选自荧光蛋白基因和/或抗生素抗性基因。

在某些实施方案中，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色或红色荧光蛋白、近红外荧光蛋白、或长斯托克位移荧光蛋白。在某些实施方案中，所述荧光蛋白选自红色荧光蛋白、近红外荧光蛋白或长斯托克位移荧光蛋白，例如mRuby3、mApple、FusionRed、mCherry、mScarlet、RFP、iRFP670、mBeRFP或CyOFP1。

在某些实施方案中，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白，例如mGamillus、mNeonGreen、EGFP、mClover、UnaG、TurboGFP、TagGFP、Venus、EYFP、RFP、iRFP670、mBeRFP、CyOFP1。

在某些实施方案中，所述抗生素抗性基因选自能够赋予对hygromycin、neomycin、G418、blasticidin、puromycin或ouabain的抗性的基因。

在某些实施方案中，所述报告基因包含荧光蛋白基因和抗生素抗性基因。在某些实施方案中，所述报告基因包含编码iRFP(例如，如SEQ ID NO:11所示)的基因和Blasticidin抗性基因(例如，如SEQ ID NO:13所示)。

在某些实施方案中，所述荧光蛋白基因和抗生素抗性基因任选地通过编码自裂解肽(例如P2A，E2A，F2A或T2A)的核苷酸序列连接。在某些实施方案中，所述裂解肽是P2A，例如如SEQ ID NO:6所示。

在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含如SEQ ID NO:8所示的序列。

2、重组HBV cccDNA

本发明第一方面所述的分离的核酸分子中所包含的HBV变体可以作为模板转录形成pgRNA，并可逆转录形成cccDNA。

因此，在第二方面，本发明还提供了一种重组HBV cccDNA，其包含第一方面所述的分离的核酸分子。

在某些实施方案中，所述重组HBV cccDNA包含第一方面中所述的HBV基因组序列的变体。

在某些实施方案中，所述重组HBV cccDNA由第一方面所述的分离的核酸分子环化形成。

3、表达系统

在第三方面，本发明提供了一种表达系统，其包含第一方面所述的分离的核酸分子。

在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含与外源插入序列可操作地连接的诱导型启动子，所述表达系统包含该分离的核酸分子作为第一核酸序列，并且包含第二核酸序列，所述第二核酸序列包含编码与所述诱导型启动子相对应的反式激活蛋白的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述反式激活蛋白选自Tet-On 3G反式激活蛋白、rTetR、rtTA。

在某些实施方案中，所述第二核酸序列还包含与所述编码反式激活蛋白的核苷酸序列可操作地连接的表达调控元件，例如启动子(例如组成型启动子)和/或增强子。

在某些实施方案中，所述第一核酸序列包含TRE3G启动子作为诱导型启动子，所述第二核酸序列包含编码Tet-On 3G反式激活蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述TRE3G启动子包含如SEQ ID NO:5所示的序列。

在某些实施方案中，所述编码Tet-On 3G反式激活蛋白的核苷酸序列包含如SEQID NO:10所示的序列。

4、载体

在第四方面，本发明还提供了一种载体，其包含第一方面所述的分离的核酸分子，或者包含第三方面所述的表达系统。

在某些实施方案中，所述载体包含第三方面所述的表达系统，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列被提供在相同或不同的载体上。在某些实施方案中，所述第一核酸序列和第二核酸序列被提供在相同的载体上。

在某些实施方案中，所述载体是转座子载体，例如PiggyBac转座子载体。在某些实施方案中，可以将所述第一核酸序列和/或第二核酸序列插入任意的市购可得的PiggyBac转座子载体，例如PB-CMV-MCS-EF1α-RedPuro(Cat.#PB514B-1)。在某些实施方案中，所述第一核酸序列和第二核酸序列位于所述转座子载体的两个ITR序列之间。

5、共转染系统

在第五方面，本发明提供了一种共转染系统，其包含第四方面所述的载体，所述载体是转座子载体，以及转座酶表达载体。

在某些实施方案中，所述转座酶表达载体是PiggyBac转座酶表达载体。在本文中，所述PiggyBac转座酶表达载体是本领域熟知的，并且是广泛市购可得的。在某些实施方案中，所述PiggyBac转座酶表达载体是PB210PA-1(System Biosciences)。

6、宿主细胞

在第六方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含第一方面所述的分离的核酸分子，或第二方面所述的重组HBV cccDNA，或第三方面所述的表达系统，或第四方面所述的载体，或第五方面所述的共转染系统。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞支持功能性HBV cccDNA形成和转录。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是肝细胞来源的真核细胞，例如肝瘤细胞或肝细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞选自HepaRG、HepG2或Huh7。

在某些实施方案中，所述宿主细胞也可以是非肝细胞，前提是它们支持嗜肝DNA病毒cccDNA形成(或在更广意义下，嗜肝DNA病毒DNA复制)。例如，如果将病毒前基因组RNA引入细胞或通过外源启动子从DNA模板转录，则可以修饰这种非肝细胞/宿主以支持嗜肝DNA病毒cccDNA形成(或嗜肝DNA病毒DNA复制)。

在某些实施方案中，所述宿主细胞在其基因组中包含第三方面所述的表达系统。

在某些实施方案中，当存在与所述诱导型启动子及反式激活蛋白相对应的诱导物(例如Doxycycline)时，所述宿主细胞能够稳定表达由所述HBV基因组序列的变体所形成的HBV cccDNA。

7、试剂盒

在第七方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含第一方面所述的分离的核酸分子，或第三方面所述的表达系统，或第四方面所述的载体，或第五方面所述的共转染系统，或第六方面所述的宿主细胞。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含：第四方面所述的载体，或第五方面所述的共转染系统。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含：第六方面所述的宿主细胞。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含LgBiT蛋白。任选地，所述试剂盒还可以包括荧光素酶底物。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含与所述诱导型启动子及反式激活蛋白相对应的诱导物(例如Doxycycline)。

8、筛选方法

在第八方面，本发明用于筛选HBV cccDNA抑制剂的方法，其包括：

(1)提供第六方面所述的宿主细胞；所述宿主细胞在其基因组中包含第三方面所述的表达系统；

(2)将诱导试剂与所述宿主细胞接触，所述诱导试剂是与所述宿主细胞中所包含的诱导型启动子及反式激活蛋白相对应的诱导物(例如Doxycycline)；

(3)将受试试剂与所述宿主细胞接触；其中，步骤(2)和(3)可以同时进行或者以任意顺序进行；

(4)检测所述宿主细胞的细胞上清中的荧光素酶第一片段(例如HiBiT)水平。

在某些实施方案中，步骤(1)包括以下步骤：

(1a)将第三方面所述的表达系统中的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列引入宿主细胞中，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的表达载体上，并且，所述第一核酸序列是第一方面中所述的包含与所述外源插入序列可操作地连接的诱导型启动子的分离的核酸分子；

(1b)培养所述宿主细胞。

在某些实施方案中，所述宿主细胞选自肝细胞来源的真核细胞，例如肝瘤细胞或肝细胞；优选地，所述宿主细胞选自HepaRG、HepG2或Huh7。

在某些实施方案中，在步骤(1a)中，所述表达载体是转座子载体(例如PiggyBac转座子载体)，该步骤进一步包括：将转座酶表达载体(例如PiggyBac转座酶表达载体)引入所述宿主细胞。

在某些实施方案中，所述步骤(1)还包括：(1c)鉴定并选择在其基因组中已整合第三方面所述的表达系统的宿主细胞。在某些实施方案中，通过检测所述第一核酸序列所包含的报告基因来鉴定所述宿主细胞的基因组中是否已整合所述表达系统。

在某些实施方案中，在步骤(2)中，所述诱导试剂激活诱导型启动子，从而启动其下游的HBV基因组变体的转录复制，产生重组HBV cccDNA，所述重组HBV cccDNA包含荧光素酶第一片段作为标记。

在某些实施方案中，所述步骤(2)包括在以下条件培养宿主细胞，所述条件允许：(i)合成HBV前基因组(pg)RNA；(ii)逆转录所述合成的pgRNA成为负链DNA；(iii)合成第二正链DNA，从而所述负链DNA和所述正链DNA形成双链松弛型环状DNA；(iv)从所述松弛型环状双链DNA形成cccDNA。

在某些实施方案中，在步骤(4)中，通过荧光素酶片段互补技术(即，提供与所述第一片段结构互补的荧光素酶第二片段和荧光素酶底物)来检测荧光素酶第一片段水平。

在某些实施方案中，通过与所述荧光素酶第一片段互补的荧光素酶第二片段来检测。

在某些实施方案中，所述荧光素酶第一片段是能够与LgBiT互补结合的小片段，例如HiBiT或SmBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT蛋白。在某些实施方案中，所述荧光素酶第一片段是HiBiT或SmBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT蛋白。

在某些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：

(5)将步骤(4)的测定结果与不存在所述受试试剂时测定的荧光素酶第一片段水平进行比较；其中，如果步骤(4)的测定结果与不存在所述受试试剂时的测定结果相比降低，表明所述受试试剂是HBV cccDNA抑制剂。

本发明还涉及前文中所述的分离的核酸分子、表达系统、载体、共转染系统、宿主细胞、试剂盒用于筛选HBV cccDNA抑制剂的用途。

报告模型II

在另一些情况下，可以利用重组酶技术将线性HBV复制子环化形成cccDNA。线性HBV复制子包含整合的荧光素酶片段互补技术(LFCA)中的第一片段序列(例如HiBiT序列)，在重组酶不表达的情况下该第一片段(例如HiBiT)标签缺乏启动子，无法表达；而在重组酶表达的情况下可以介导双链DNA的重组，使线性HBV基因组DNA形成闭合环状DNA，形成环状DNA后，该第一片段(例如HiBiT)标签可以利用HBV的内源启动子启动偶联该第一片段(例如HiBiT)标签的蛋白表达。因此可以通过荧光素酶片段互补技术(LFCA)测定该第一片段(例如HiBiT)标签的信号指示重组HBV cccDNA即HBV rcccDNA的形成。

9、分离的核酸分子

因此，在第九方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含HBV基因组序列(例如野生型HBV基因组)的变体，所述变体从5’至3’方向包含：

(i)编码荧光素酶第一片段的核苷酸序列；所述荧光素酶第一片段能够与荧光素酶片段互补技术(LFCA)中的相应的荧光素酶第二片段结合，并产生荧光素酶活性；

(ii)HBV基因组的C-ORF的3’端区域的序列；

(iii)包含S-ORF、P-ORF的HBV基因组片段；

(iv)HBV基因组的C-ORF的5’端区域的序列，其与(ii)所述的序列能够组成完整的C-ORF序列；

并且，所述变体位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间。

在某些实施方案中，所述荧光素酶第一片段是能够与LgBiT互补结合的小片段，例如HiBiT或SmBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT。在某些实施方案中，所述荧光素酶第一片段是HiBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT。在某些实施方案中，HiBiT具有如SEQ IDNO:2所示的序列。在某些实施方案中，所述编码HiBiT的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在某些实施方案中，所述HBV基因组是全长基因组，例如，HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的基因组。在某些实施方案中，所述HBV基因组是超长度基因组，例如1.1倍体基因组或1.3倍体基因组。在某些实施方案中，所述HBV基因组是1.1倍体基因组，例如如SEQ ID NO:1所示。

在某些实施方案中，(iii)所述的序列还包含X-ORF。

在某些实施方案中，(iii)所述的序列包含去除了C-ORF的HBV基因组片段。

在某些实施方案中，(iii)所述的序列包含如SEQ ID NO:16所示的序列。

在某些实施方案中，(ii)所述的序列包含core基因，(iv)所述的序列包含pre-core基因。在某些实施方案中，(ii)所述的序列包含如SEQ ID NO:14所示的序列。在某些实施方案中，(iv)所述的序列包含如SEQ ID NO:15所示的序列。

在某些实施方案中，所述位点特异性重组酶识别序列选自loxP序列或FRT序列。

在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:17所示的序列。

10、重组HBV cccDNA

本发明第九方面所述的分离的核酸分子可在重组酶的作用下环化，形成cccDNA。

因此，在第十方面，本发明还提供了一种重组HBV cccDNA，其由第九方面所述的分离的核酸分子中的所述HBV基因组序列的变体环化形成。

在某些实施方案中，所述重组HBV cccDNA由第九方面所述的分离的核酸分子在存在与所述位点特异性重组酶识别序列相对应的位点特异性重组酶(例如Cre重组酶或FLP重组酶)的条件下环化形成。

在某些实施方案中，所述重组HBV cccDNA包含C-ORF、S-ORF、P-ORF，所述C-ORF包含编码所述荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述重组HBV cccDNA进一步包含X-ORF。

在某些实施方案中，所述重组HBV cccDNA包括：包含编码所述荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列的C-ORF、以及去除了C-ORF的HBV基因组片段(例如SEQ ID NO:16所示的序列)。

在某些实施方案中，所述重组cccDNA包含如SEQ ID NO:18所示的序列。

11、载体

在第十一方面，本发明还提供了一种载体，其包含第九方面所述的分离的核酸分子。

在某些实施方案中，所述载体是转座子载体，例如PiggyBac转座子载体。在某些实施方案中，可以将第九方面所述的分离的核酸分子插入任意的市购可得的PiggyBac转座子载体，例如PB-CMV-MCS-EF1α-RedPuro(Cat.#PB514B-1)。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子位于所述转座子载体的两个ITR序列之间。

12、共转染系统

在第十二方面，本发明还提供了一种共转染系统，其包含第十一方面所述的载体，以及转座酶表达载体。

在某些实施方案中，所述转座酶表达载体是PiggyBac转座酶表达载体。在本文中，所述PiggyBac转座酶表达载体是本领域熟知的，并且是广泛市购可得的。在某些实施方案中，所述PiggyBac转座酶表达载体是PB210PA-1(System Biosciences)。

13、宿主细胞

在第十三方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含第九方面所述的分离的核酸分子，或第十方面所述的重组cccDNA，或第十一方面所述的载体，或第十二方面所述的共转染系统。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞支持功能性HBV cccDNA形成和转录。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是肝细胞来源的真核细胞，例如肝瘤细胞或肝细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞选自HepaRG、HepG2或Huh7。

在某些实施方案中，所述宿主细胞也可以是非肝细胞，前提是它们支持嗜肝DNA病毒cccDNA形成(或在更广意义下，嗜肝DNA病毒DNA复制)。例如，如果将病毒前基因组RNA引入细胞或通过外源启动子从DNA模板转录，则可以修饰这种非肝细胞/宿主以支持嗜肝DNA病毒cccDNA形成(或嗜肝DNA病毒DNA复制)。

在某些实施方案中，所述宿主细胞在其基因组中包含第九方面所述的分离的核酸分子。

在某些实施方案中，当存在与所述位点特异性重组酶识别序列相对应的位点特异性重组酶(例如Cre重组酶或FLP重组酶)时，所述宿主细胞能够稳定表达由所述HBV基因组序列的变体环化形成的重组HBV cccDNA。

14、试剂盒

在第十四方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含第九方面所述的分离的核酸分子，或第十方面所述的重组cccDNA，或第十一方面所述的载体，或第十二方面所述的共转染系统，或第十三方面所述的宿主细胞。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含：第十一方面所述的载体，或第十二方面所述的共转染系统。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含：第十三方面所述的宿主细胞。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含LgBiT蛋白。任选地，所述试剂盒还包含荧光素酶底物。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含重组酶(例如Cre重组酶或FLP重组酶)或重组酶(例如Cre重组酶或FLP重组酶)表达载体。

15、筛选方法

在第十五方面，本发明提供了用于筛选HBV cccDNA抑制剂的方法，其包括：

(1)提供第十三方面所述的宿主细胞；所述宿主细胞在其基因组中包含第九方面所述的分离的核酸分子；

(2)将重组酶或重组酶表达载体导入所述宿主细胞，所述重组酶与所述宿主细胞中所包含的位点特异性重组酶识别序列对应；

(3)将受试试剂与所述宿主细胞接触；

(4)检测所述宿主细胞的细胞上清中的荧光素酶第一片段(例如HiBiT)水平。

在某些实施方案中，步骤(1)包括以下步骤：

(1a)将第九方面所述的分离的核酸分子或第十一方面所述的载体引入宿主细胞中；

(1b)培养所述宿主细胞。

在某些实施方案中，所述宿主细胞选自肝细胞来源的真核细胞，例如肝瘤细胞或肝细胞；优选地，所述宿主细胞选自HepaRG、HepG2或Huh7。

在某些实施方案中，在步骤(1a)中，所述表达载体是转座子载体(例如PiggyBac转座子载体)，该步骤进一步包括：将转座酶表达载体(例如PiggyBac转座酶表达载体)引入所述宿主细胞。

在某些实施方案中，在步骤(2)中，在重组酶的作用下，所述宿主细胞中所包含的HBV基因组序列的变体将环化形成cccDNA。

在某些实施方案中，在步骤(4)中，通过荧光素酶片段互补技术(即，提供与所述第一片段结构互补的荧光素酶第二片段和荧光素酶底物)来检测荧光素酶第一片段水平。

在某些实施方案中，通过与所述荧光素酶第一片段互补的荧光素酶第二片段来检测。

在某些实施方案中，所述荧光素酶第一片段是能够与LgBiT互补结合的小片段，例如HiBiT或SmBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT蛋白。在某些实施方案中，所述荧光素酶第一片段是HiBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT蛋白。

在某些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：

(5)将步骤(4)的测定结果与不存在所述受试试剂时测定的荧光素酶第一片段水平进行比较；其中，如果步骤(4)的测定结果与不存在所述受试试剂时的测定结果相比降低，表明所述受试试剂是HBV cccDNA抑制剂。

本发明还涉及前文中所述的分离的核酸分子、载体、共转染系统、宿主细胞、试剂盒用于筛选HBV cccDNA抑制剂的用途。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)”是指，具有大约3200个碱基对的小双链DNA基因组和肝细胞向性的Hepadnaviridae家族的成员。“HBV”包括感染多种哺乳动物(例如人类、非人类灵长类动物等)和禽类(鸭等)宿主中的任何一种的乙型肝炎病毒。“HBV”包括任何已知的HBV基因型，例如血清型A、B、C、D、E、F和G；任何HBV血清型或HBV亚型；任何HBV分离株；HBV突变体，例如HBeAg阴性变体，耐药性HBV变体(例如拉米夫定(lamivudine)抗性变体；阿德福韦(adefovir)抗性突变体；替诺福韦(tenofovir)抗性突变体；恩替卡韦(entecavir)抗性突变体等)；等等。

如本文中所使用的，“HBV基因组”不仅包括全长基因组(1个单位基因组)，也包括超长度HBV基因组(>1个单位基因组，换句话说，长度超过1个单位基因组)。HBV基因组包含构建和维持HBV复制所需的所有信息。这些基因组序列可获自文章和GeneBank中的每种基因型。“超长度HBV基因组”或“超过全长的HBV基因组”是指包含全长基因组和部分基因组的序列，其序列可根据所需的基因组单位和特定的HBV株变化。此外，在现有技术文献中描述了获得大于全长HBV基因组并确定所述基因组序列的方法，例如在欧洲专利EP1543168中。

在某些示例性实施方案中，所述HBV是指人类HBV，其基因组中含有四个主要的相互重叠的开放读码框(Open reading frame,ORF)，分别为S-ORF、C-ORF、P-ORF、X-ORF。S-ORF分为S基因、pre-S2区和pre-S1区，各有其起始密码ATG，C-ORF分为C基因和pre-C区,各有起始密码ATG，P-OFR是最长的读架，其开始区段与C-ORF重叠,中间与S-ORF重叠，最后区段与X-ORF重叠。

如本文中所使用的，“HBV基因组片段”是指HBV基因组的一部分。该片段可以是HBV基因组的至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100或3200个连续核苷酸。该片段还可以是含有HBV基因组中所含的一个或多个基因的部分基因组，例如，该片段可以是编码包膜蛋白、核心/前核蛋白、x蛋白和/或HBV聚合酶蛋白的核酸。此外，该片段可以是编码HBV的包膜蛋白、核心/前核蛋白、x蛋白和/或聚合酶蛋白的一个或多个部分的核酸。

如本文中所使用的，术语“共价闭合环状DNA”和“cccDNA”是本领域熟知的，在本文中互换地使用。通常，“共价闭合环状DNA”或“cccDNA”是指嗜肝DNA病毒基因组的复制中间体，是嗜肝DNA病毒mRNA和前基因组RNA的合成模板。

如本文中所使用的，术语“cccDNA抑制剂”是指能够抑制cccDNA的稳定性(即指降低的cccDNA稳定性)、抑制cccDNA的转录活性(即指使用cccDNA作为转录模板的嗜肝DNA病毒mRNA转录减少)、和/或抑制cccDNA的形成(即无或更少cccDNA形成)。

如本文中所使用的，术语“变体”用于指代与亲本多肽序列或多核苷酸具有一定程度的氨基酸/核苷酸序列同一性的多肽或多核苷酸。变体类似于亲本序列，但在其氨基酸序列或核苷酸序列中具有至少一个或几个或多个取代、缺失或插入，使得它们与亲本多肽或亲本多核苷酸的序列不同。在一些情况下，变体已经被操作和/或工程化以在其氨基酸序列或核苷酸序列中包含至少一个取代、缺失或插入，这使得它们与亲本序列不同。另外，变体可以保留亲本多肽或亲本多核苷酸的功能特征或活性，例如，保持亲本多肽或亲本多核苷酸的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的生物活性。

如本文中所使用的，术语“重组”DNA分子是指通过遗传重组(例如分子克隆)的实验室方法形成的DNA分子，以将来自多个来源的遗传物质汇集在一起，产生在生物有机体中不会发现的序列。术语“位点特异性重组”是指两个核苷酸序列之间的重组，其各自包含至少一个识别位点。“位点特异性”是指特定的核苷酸序列，其可以位于宿主细胞基因组中的特定位置。核苷酸序列可以是宿主细胞的内源性，其在宿主基因组中的天然位置或基因组中的某个其他位置，或者其可以是通过各种已知方法中的任何一种先前插入宿主细胞基因组中的异源核苷酸序列。

如本文中所使用的，术语“重组酶”是遗传重组酶，其通常衍生自细菌和真菌，并且催化每种重组酶特异性的短(30-40个核苷酸)靶位点序列之间的定向敏感的DNA交换反应。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。将载体和/或其所携带的核酸分子导入细胞的方法是本领域已知的，例如病毒感染/转导、缀合、纳米颗粒递送、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接注射等。方法的选择通常取决于正在转染的细胞的类型和转染发生的环境(即在体外、离体或体内)。这些方法的总体讨论可以在Ausu bel等人，ShortProtocols in Molecular Biology，第3版，Wiley&Sons，1995中找到。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

发明的有益效果

本发明的HBV cccDNA抑制剂筛选模型以拆分荧光素酶作为HBV cccDNA检测替代指标，其检测简单耗时短，可实现高通量的药物筛选，可用于研究、治疗、诊断等诸多领域，具有广阔的应用前景及临床价值。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了实施例1中用于构建稳定整合细胞株的PiggyBac转座子载体示意图。

图2显示了实施例1中以HiBiT指示HBV复制过程中产生的cccDNA的报告模型的HBV改造方式示意图。

图3显示了实施例1中评估整合不同序列的HiBiT标签的HBV变体的病毒复制表达情况。

图4显示了实施例1中评估RG-Hibit16细胞用于筛选抑制HBV cccDNA形成的抑制剂的可行性。

图5显示了实施例2中以HiBiT作为rcccDNA报告模型的示意图及功能验证。

图6显示了实施例3中利用RG-Hibit16和G2-Rccc1筛选靶向HBV cccDNA的化合物。

图7显示了实施例3中在HepG2-hNTCP-2B1感染模型中验证对HBV cccDNA有抑制效果的化合物。

图8显示了实施例3中在HepG2-hNTCP-2B1感染模型中验证对HBV cccDNA有促进效果的化合物。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供如下。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

以下实施例中所涉及的主要检测方法描述如下：

HiBiT的检测：HiBiT检测使用Promega公司的Nano Glo HiBiT ExtracellularDetection System(目录号N2421)，检测步骤按试剂盒说明书进行。

HBsAg/HBeAg检测：乙肝表面抗原(化学发光法CLEIA，产品标准编号：YZB/国0346-2014)和e抗原(酶联免疫法ELISA，产品标准编号：YZB/国0216-2013)的检测操作均按北京万泰公司的检测试剂盒的检验方法进行。

HBV DNA检测：HBV DNA的提取，收集的细胞用PBS清洗一遍后，利用病毒DNA&RNA提取试剂盒(北京金麦格)，在核酸提取工作站进行自动化提取。HBV DNA定量，采用探针法，所用的试剂是Premix Ex TaqTM(Takara)，所使用的仪器是罗氏的

96，所用引物序列见表1。

表1：PCR引物序列

HBV cccDNA检测：HBV cccDNA提取采用改良Hirt法，所使用的试剂盒是天根质粒小提试剂盒，涉及到的裂解液有Buffer I(50mM Tris,10mM EDTA,pH 7.5)，Buffer II(1.2％SDS)，Buffer III(3M CsCl,1M Potassium acetate,0.67M Acetic acid)，分别替换天根质粒小提试剂盒中的P1,P2和P3。提取的步骤方法参照试剂盒质粒提取方法。荧光定量所用引物见表1，所使用的仪器是罗氏的

96，分别对HBV cccDNA和线粒体DNA(mtDNA)进行定量，计算HBV cccDNA与mtDNA的相对值。

DNA免疫印迹法检测HBV DNA的步骤如下。DNA的提取：细胞经处理后，用PBS洗涤细胞1次；加入NET Buffer(50mM Tris-pH8.0,1mM EDTA,100mM NaCl,0.5％NP-40)4℃裂解细胞1h；收集细胞裂解上清，加入终浓度33μg/mL的Micrococcal nuclease和6mM CaCl₂，37℃水浴30min；加入终浓度25mM EDTA,65℃水浴15min；加入终浓度200μg/mL proteinase K和0.5％SDS，50℃水浴12h；酚氯仿抽提DNA。检测：用1.2％的琼脂糖电泳2h分离DNA，依次用0.2N HCl,0.5M NaOH/1.5M NaCl和1M Tris-HCl处理凝胶，使DNA变性，再用真空转印仪将核酸转移至尼龙膜上，紫外交联固定核酸后再进行预杂交和杂交，洗去多余的探针，用封闭液封闭后加入Anti-Dig-Ap抗体，最后加入CDP-star显色，连续曝光检测目的条带。

实施例1：以HiBiT指示HBV复制过程中产生的cccDNA的报告模型构建

本实施例PiggyBac转座子系统的PB-CMV-MCS-EF1α-RedPuro(Cat.#PB514B-1)作为载体，该载体与PiggyBac转座酶(System Biosciences，PB210PA-1)共转染时可以将载体质粒上两个“ITR序列”之间的序列整合至细胞的基因组中，实现目的基因的整合。为实现HBV的可调控表达，我们将该载体上的“CMV Promoter”替换为“TRE3G Promoter”(Takara,Tet-On3G Inducible Expression System)，该启动子须要Doxycycline结合Tet-On 3GTransactivator Protein才能启动转录，因此可以用Doxycycline调控目的蛋白的表达。为避免目的序列在整合时丢失部分序列，我们选用的是具有双向启动活性的TRE3G启动子，在N端引入了iRFP荧光标记和Blasticidin抗性筛选标记，利用双抗性和双荧光作为整合细胞的筛选条件。由于Tet-On 3G蛋白是TRE3G启动子转录所必须的，我们在载体上引入表达框表达Tet-On3G蛋白，最终的载体如图1所示，红色虚线框内的序列为整合至细胞基因组上的序列。“GOI”表示连接的目的基因(Gene of interest)，本实施例中所连接的为插入了报告基因的HBV 1.1倍体基因组序列。

HBV基因组的各开放阅读框高度重叠，因此HBV的改造对外源基因的插入位置有严格的限制。本实施例在pre core与core之间插入不同拷贝数以及通过不同连接肽连接的的HiBiT序列，制备包含HiBiT的HBV变体，插入方式的示意图如图2所示。并验证了这些插入突变的HiBiT信号、病毒蛋白表达情况及病毒复制情况，在肝癌细胞系HepG2和Huh7细胞中分别转染不同的HBV变体，检测细胞上清中的HiBiT信号、HBV抗原HBsAg和HBeAg的表达情况(A)以及通过Southern Blot检测病毒的复制情况(B)，如图3所示。可见Hibit16即插入了3个拷贝的HiBiT标签的插入突变(SEQ ID NO:4)为较优的选择，HiBiT的拷贝数减少则HiBiT的信号弱，HiBiT拷贝数增加则病毒蛋白的表达或复制受影响。不同连接肽的比较而言，HiBiT序列前后均插入肽段“GSG”的效果优于只在一端插入肽段“G”或不引入连接肽。因此，本实施例构建了稳定整合HBV突变Hibit16的HepaRG细胞用于筛选可以抑制cccDNA形成的抑制剂。

HepaRG-Hibit16细胞是在HepaRG细胞中转染Hibit16质粒及PiggyBac转座酶，将HBV变体序列(Hibit16)及筛选标记整合至细胞的基因组中，通过Puromycin抗性和红色荧光标记筛选获得，Doxycycline可以激活TRE3G启动子，启动iRFP670的表达，以及HBV的转录复制，进而产生HiBiT，如图4A所示。在该细胞中评价HBV抑制剂的功能，先将细胞铺板，在加入Doxycycline诱导病毒转录复制的同时加入不同的HBV抑制剂进行干预，每2天收集细胞上清，更换培养基，检测细胞上清中的HiBiT信号、HBsAg、HBeAg以及细胞裂解液中的HBVDNA和HBV cccDNA该细胞对HBV抑制剂的应答情况见图4B-F。替诺福韦(tenofovirdisoproxil fumarate,TDF)是核苷酸类逆转录酶抑制剂，Morphothiadin(简称：Mor)是core颗粒的组装调节剂，已经处于临床Phase II/III评估阶段，二者均可以抑制cccDNA的形成。在本研究构建的细胞模型中，TDF和Mor可以抑制cccDNA的形成，相应的Mor处理组的细胞HiBiT表达水平也明显低于对照组，说明该模型可以用于筛选Mor这类抑制cccDNA形成的抑制剂。

实施例2：以HiBiT指示重组rcccDNA的报告模型构建

本实施例构建了利用HiBiT指示重组cccDNA的报告模型，重组cccDNA即rcccDNA，是通过Cre/loxP重组酶系统使线性的HBV DNA环化形成闭合环状DNA。我们构建了如图5A所示的HBV变体，将HBV core ORF的C端部分序列(SEQ ID NO:14)放在整个复制子的N端，而core ORF的N端部分序列以及core的启动子(SEQ ID NO:15)放在复制子的C端，报告基因HiBiT的序列放在复制子的N端，在复制子的前后分别加上loxP序列(SEQ ID NO:19)。在不表达Cre重组酶的情况下，HiBiT缺乏启动子，不能表达，而rcccDNA形成以后，HiBiT可以利用core的启动子表达融合了HiBiT标签的HBeAg及HBcAg。因此HiBiT可以作为rcccDNA检测的替代指标。该HBV变体选用PiggyBac转座子系统作为载体，方便目的基因即整合了报告基因的HBV变体整合到细胞基因组中构建整合细胞株，该克隆命名为Rccc1a。在HepG2细胞中转染该质粒，6h后换液时感染腺病毒Adv-Cre表达Cre重组酶(SEQ ID NO:20)，48h后检测细胞上清中的HiBiT；并裂解细胞，以裂解液为模板，扩增loxP序列前后的rcccDNA的部分序列，确认是否形成预期的rcccDNA，扩增引物和测序引物均为表1中的cccDNA-F和cccDNA-R。图5B显示了转染Rccc1a的HepG2细胞中Cre重组酶表达与否细胞上清中的HiBiT检测结果，图5C显示的是转染Rccc1a的HepG2细胞表达Cre重组酶之后形成的rcccDNA的测序结果。以上结果说明，Cre重组酶能使预期的rcccDNA产生，并且启动HiBiT标签偶联蛋白的表达。

实施例3：报告模型用于筛选cccDNA抑制剂

实施例1制备的报告模型包含整合3次重复的HiBiT序列的HBV变体，直接以该HBV变体为模板转录的mRNA缺乏HiBiT表达的起始密码子，不能翻译偶联HiBiT标签的蛋白，只有以该HBV变体转录的pgRNA逆转录形成cccDNA后，以cccDNA为模板转录的mRNA才能翻译偶联HiBiT标签的蛋白，因此可以用HiBiT的表达水平指示HBV cccDNA的形成情况。实施例2制备的报告模型是在HBV core的序列中间插入HiBiT序列，并且将core N端的序列和C端的序列分别至于HBV复制子的C端和N端，并且在HBV复制子两端连接loxP序列，在Cre重组酶不表达的情况下HiBiT标签缺乏启动子，无法表达；而Cre重组酶表达的情况下可以介导双链DNA的重组，使线性HBV基因组DNA形成闭合环状DNA，形成环状DNA后，HiBiT标签可以利用HBV的内源启动子启动偶联HiBiT标签的蛋白表达，因此可以用HiBiT标签的信号指示重组HBVcccDNA即HBV rcccDNA的形成。

本实施例分别考察实施例1的报告模型(基于HepaRG细胞构建的整合Hibit16的HepaRG-Hibit16)和实施例2的报告模型(基于HepG2构建了整合Rccc1a的HepG2-Rccc1a)筛选cccDNA抑制剂的能力，利用这两种细胞评估了189种针对不同疾病的临床用药或者处于临床研究阶段的药物抑制cccDNA的潜力。筛选工作在96孔细胞培养板中进行，RG-Hibit16细胞以15,000/well的细胞密度铺板，G2-Rccc1a以35,000/well的细胞密度铺板；RG-Hibit16细胞铺板1周后开始加药处理，RG-Hibit16在加入Dox诱导病毒表达的同时加入不同的化合物处理，G2-Rccc1a铺板次日先感染腺病毒Adv-Cre表达Cre重组酶蛋白，2天后开始加入不同的化合物处理,所有化合物稀释至1μM的终浓度，每孔200μL；每2天更换一次新的培养基，化合物处理4天后检测细胞上清中的HiBiT表达情况，并以10:1的比例加入CCK8检测试剂，检测化合物的细胞毒性。RG-Hibit16细胞和G2-Rccc1a细胞用于化合物筛选的结果如图6所示。这189种化合物中，对RG-Hibit16细胞的HiBiT表达水平抑制最显著的3种化合物为Cetylpyridinium,Guanfacine和Palovarotene；对G2-Rccc1a细胞的HiBiT表达水平抑制最显著的4种化合物为Crizotinib,Doxifluridine,Palovarotene和Dithranol，根据CCK8的检测结果，这6种药物对2种细胞均无明显的细胞毒性，其中Palovarotene在两种模型中都显示出对HBV cccDNA的抑制效果。

我们进一步在HepG2-hNTCP-2B1感染模型中验证这6种化合物的功能。HepG2-hNTCP-2B1是在HepG2细胞中过表达hNTCP，并挑选的对HBV易感性最高的单克隆2B1。该模型中的评价是先用HBV病毒感染该细胞，次日用PBS洗去残余病毒，2天后加入不同的化合物处理，之后每2天收集细胞上清并更换新鲜培养基，检测细胞上清中的病毒抗原，感染8天后裂解细胞，检测胞内的HBV cccDNA,评价结果如图7所示。Palovarotene对HBsAg的抑制效果相对较差，但是对HBsAg和HBV cccDNA的抑制率都在60％以上，优于另外5种化合物。此外，Doxifluridine在该感染模型中对cccDNA也有显著的抑制效果。根据RG-Hibit16细胞和G2-Rccc1a细胞的评价结果，我们也挑选出在2种模型中对HBV cccDNA均有上调效果的5种化合物，分别是：Vincristine,Naftopidil,Cinchophen,Mebhydrolin和Cladribine，并在HepG2-hNTCP-2B1感染模型中验证这5种化合物的功能，评估策略与前述抑制剂相同，结果如图8所示。5种化合物对HBeAg的促进效果均较弱；其中Vincristine和Cladribine可以显著上调HBsAg的表达水平；Vincristine,Cinchophen,Mebhydrolin和Cladribine均可以上调胞内的cccDNA水平。感染模型的验证结果说明本研究构建的2种cccDNA报告模型可以用于筛选对cccDNA有促进或抑制作用的化合物，尽管筛选到的部分化合物在感染模型中未体现出相应的效果，但是大大缩小了候选化合物的范围，可用于靶向HBV cccDNA化合物的初步筛选。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门大学

养生堂有限公司

<120> 靶向HBV cccDNA的药物筛选模型及方法

<130> IDC210224

<150> CN202010588643.8

<151> 2020-06-24

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV 1.1倍体基因组序列

<400> 1

ttcacctctg cctaatcatc tcttgttcat gtcctactgt tcaagcctcc aagctgtgcc 60

ttgggtggct ttggggcatg gacatcgacc cttataaaga atttggagct actgtggagt 120

tactctcgtt tttgccttct gacttctttc cttcagtacg agatcttcta gataccgcct 180

cagctctgta tcgggaagcc ttagagtctc ctgagcattg ttcacctcac catactgcac 240

tcaggcaagc aattctttgc tggggggaac taatgactct agctacctgg gtgggtgtta 300

atttggaaga tccagcgtct agagacctag tagtcagtta tgtcaacact aatatgggcc 360

taaagttcag gcaactcttg tggtttcaca tttcttgtct cacttttgga agagaaacag 420

ttatagagta tttggtgtct ttcggagtgt ggattcgcac tcctccagct tatagaccac 480

caaatgcccc tatcctatca acacttccgg agactactgt tgttagacga cgaggcaggt 540

cccctagaag aagaactccc tcgcctcgca gacgaaggtc tcaatcgccg cgtcgcagaa 600

gatctcaatc tcgggaatct caatgttagt attccttgga ctcataaggt ggggaacttt 660

actgggcttt attcttctac tgtacctgtc tttaatcctc attggaaaac accatctttt 720

cctaatatac atttacacca agacattatc aaaaaatgtg aacagtttgt aggcccactc 780

acagttaatg agaaaagaag attgcaattg attatgcctg ccaggtttta tccaaaggtt 840

accaaatatt taccattgga taagggtatt aaaccttatt atccagaaca tctagttaat 900

cattacttcc aaactagaca ctatttacac actctatgga aggcgggtat attatataag 960

agagaaacaa cacatagcgc ctcattttgt gggtcaccat attcttggga acaagatcta 1020

cagcatgggg cagaatcttt ccaccagcaa tcctctggga ttctttcccg accaccagtt 1080

ggatccagcc ttcagagcaa acaccgcaaa tccagattgg gacttcaatc ccaacaagga 1140

cacctggcca gacgccaaca aggtaggagc tggagcattc gggctgggtt tcaccccacc 1200

gcacggaggc cttttggggt ggagccctca ggctcagggc atactacaaa ctttgccagc 1260

aaatccgcct cctgcctcca ccaatcgcca gtcaggaagg cagcctaccc cgctgtctcc 1320

acctttgaga aacactcatc ctcaggccat gcagtggaat tccacaacct tccaccaaac 1380

tctgcaagat cccagagtga gaggcctgta tttccctgct ggtggctcca gttcaggaac 1440

agtaaaccct gttctgacta ctgcctctcc cttatcgtca atcttctcga ggattgggga 1500

ccctgcgctg aacatggaga acatcacatc aggattccta ggaccccttc tcgtgttaca 1560

ggcggggttt ttcttgttga caagaatcct cacaataccg cagagtctag actcgtggtg 1620

gacttctctc aattttctag ggggaactac cgtgtgtctt ggccaaaatt cgcagtcccc 1680

aacctccaat cactcaccaa cctcttgtcc tccaacttgt cctggttatc gctggatgtg 1740

tctgcggcgt tttatcatct tcctcttcat cctgctgcta tgcctcatct tcttgttggt 1800

tcttctggac tatcaaggta tgttgcccgt ttgtcctcta attccaggat cctcaacaac 1860

cagcacggga ccatgccgga cctgcatgac tactgctcaa ggaacctcta tgtatccctc 1920

ctgttgctgt accaaacctt cggacggaaa ttgcacctgt attcccatcc catcatcctg 1980

ggctttcgga aaattcctat gggagtgggc ctcagcccgt ttctcctggc tcagtttact 2040

agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct ttcccccact gtttggcttt cagttatatg 2100

gatgatgtgg tattgggggc caagtctgta cagcatcttg agtccctttt taccgctgtt 2160

accaattttc ttttgtcttt gggtatacat ttaaacccta acaaaacaaa gagatggggt 2220

tactctctaa attttatggg ttatgtcatt ggatgttatg ggtccttgcc acaagaacac 2280

atcatacaaa aaatcaaaga atgttttaga aaacttccta ttaacaggcc tattgattgg 2340

aaagtatgtc aacgaattgt gggtcttttg ggttttgctg ccccttttac acaatgtggt 2400

tatcctgcgt tgatgccttt gtatgcatgt attcaatcta agcaggcttt cactttctcg 2460

ccaacttaca aggcctttct gtgtaaacaa tacctgaacc tttaccccgt tgcccggcaa 2520

cggccaggtc tgtgccaagt gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg cttggtcatg 2580

ggccatcagc gcatgcgtgg aaccttttcg gctcctctgc cgatccatac tgcggaactc 2640

ctagccgctt gttttgctcg cagcaggtct ggagcaaaca ttatcgggac tgataactct 2700

gttgtcctat cccgcaaata tacatcgttt ccatggctgc taggctgtgc tgccaactgg 2760

atcctgcgcg ggacgtcctt tgtttacgtc ccgtcggcgc tgaatcctgc ggacgaccct 2820

tctcggggtc gcttgggact ctctcgtccc cttctccgtc tgccgttccg accgaccacg 2880

gggcgcacct ctctttacgc ggactccccg tctgtgcctt ctcatctgcc ggaccgtgtg 2940

cacttcgctt cacctctgca cgtcgcatgg agaccaccgt gaacgcccac caaatattgc 3000

ccaaggtctt acataagagg actcttggac tctcagcaat gtcaacgacc gaccttgagg 3060

catacttcaa agactgtttg tttaaagact gggaggagtt gggggaggag attaggttaa 3120

aggtctttgt actaggaggc tgtaggcata aattggtctg cgcaccagca ccatgcaact 3180

ttttcacctc tgcctaatca tctcttgttc atgtcctact gttcaagcct ccaagctgtg 3240

ccttgggtgg ctttggggca tggacatcga cccttataaa gaatttggag ctactgtgga 3300

gttactctcg tttttgcctt ctgacttctt tccttcagta cgag 3344

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HiBiT的氨基酸序列

<400> 2

Val Ser Gly Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HiBiT的核苷酸序列

<400> 3

gtaagcggct ggcggctatt caagaaaatc tcc 33

<210> 4

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hibit16插入序列

<400> 4

gtaagcggct ggcggctatt caagaagatt agcggcagcg gcgtctccgg ttggagatta 60

ttcaagaaga tttcgggatc cggggttagt gggtggcgct tgttcaagaa gatcagc 117

<210> 5

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TRE3G启动子

<400> 5

ggtggcggcc gcaattctcc aggcgatctg acggttcact aaacgagctc tgcttatata 60

ggcctcccac cgtacacgcc acctcgacat actcgagttt actccctatc agtgatagag 120

aacgtatgaa gagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatgcagact ttactcccta 180

tcagtgatag agaacgtata aggagtttac tccctatcag tgatagagaa cgtatgaaga 240

gtttactccc tatcagtgat agagaacgta tgcagacttt actccctatc agtgatagag 300

aacgtataag gagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatgaagagt ttactcccta 360

tcagtgatag agaacgtatg cagactttac tccctatcag tgatagagaa cgtataagga 420

gtttactccc tatcagtgat agagaacgta tgaccagttt actccctatc agtgatagag 480

aacgtatcta cagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatatccagt ttactcccta 540

tcagtgatag agaacgtata agctttaggc gtgtacggtg ggcgcctata aaagcagagc 600

tcgtttagtg aaccggtcaa cttt 624

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2A的氨基酸序列

<400> 6

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2A的核苷酸序列

<400> 7

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 8

<211> 3488

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含Hibit16的HBV基因组变体序列

<400> 8

ttcacctctg cctaatcatc tcttgttctt gtcctactgt tcaagcctcc aagctgtgcc 60

ttgggtggct ttggggcaag gacatcggca gcggcgtaag cggctggcgg ctattcaaga 120

agattagcgg cagcggcgtc tccggttgga gattattcaa gaagatttcg ggatccgggg 180

ttagtgggtg gcgcttgttc aagaagatca gcggaggtac catggacatc gacccttata 240

aagaatttgg agctactgtg gagttactct cgtttttgcc ttctgacttc tttccttcag 300

tacgagatct tctagatacc gcctcagctc tgtatcggga agccttagag tctcctgagc 360

attgttcacc tcaccatact gcactcaggc aagcaattct ttgctggggg gaactaatga 420

ctctagctac ctgggtgggt gttaatttgg aagatccagc gtctagagac ctagtagtca 480

gttatgtcaa cactaatatg ggcctaaagt tcaggcaact cttgtggttt cacatttctt 540

gtctcacttt tggaagagaa acagttatag agtatttggt gtctttcgga gtgtggattc 600

gcactcctcc agcttataga ccaccaaatg cccctatcct atcaacactt ccggagacta 660

ctgttgttag acgacgaggc aggtccccta gaagaagaac tccctcgcct cgcagacgaa 720

ggtctcaatc gccgcgtcgc agaagatctc aatctcggga atctcaatgt tagtattcct 780

tggactcata aggtggggaa ctttactggg ctttattctt ctactgtacc tgtctttaat 840

cctcattgga aaacaccatc ttttcctaat atacatttac accaagacat tatcaaaaaa 900

tgtgaacagt ttgtaggccc actcacagtt aatgagaaaa gaagattgca attgattatg 960

cctgccaggt tttatccaaa ggttaccaaa tatttaccat tggataaggg tattaaacct 1020

tattatccag aacatctagt taatcattac ttccaaacta gacactattt acacactcta 1080

tggaaggcgg gtatattata taagagagaa acaacacata gcgcctcatt ttgtgggtca 1140

ccatattctt gggaacaaga tctacagcat ggggcagaat ctttccacca gcaatcctct 1200

gggattcttt cccgaccacc agttggatcc agccttcaga gcaaacaccg caaatccaga 1260

ttgggacttc aatcccaaca aggacacctg gccagacgcc aacaaggtag gagctggagc 1320

attcgggctg ggtttcaccc caccgcacgg aggccttttg gggtggagcc ctcaggctca 1380

gggcatacta caaactttgc cagcaaatcc gcctcctgcc tccaccaatc gccagtcagg 1440

aaggcagcct accccgctgt ctccaccttt gagaaacact catcctcagg ccatgcagtg 1500

gaattccaca accttccacc aaactctgca agatcccaga gtgagaggcc tgtatttccc 1560

tgctggtggc tccagttcag gaacagtaaa ccctgttctg actactgcct ctcccttatc 1620

gtcaatcttc tcgaggattg gggaccctgc gctgaacatg gagaacatca catcaggatt 1680

cctaggaccc cttctcgtgt tacaggcggg gtttttcttg ttgacaagaa tcctcacaat 1740

accgcagagt ctagactcgt ggtggacttc tctcaatttt ctagggggaa ctaccgtgtg 1800

tcttggccaa aattcgcagt ccccaacctc caatcactca ccaacctctt gtcctccaac 1860

ttgtcctggt tatcgctgga tgtgtctgcg gcgttttatc atcttcctct tcatcctgct 1920

gctatgcctc atcttcttgt tggttcttct ggactatcaa ggtatgttgc ccgtttgtcc 1980

tctaattcca ggatcctcaa caaccagcac gggaccatgc cggacctgca tgactactgc 2040

tcaaggaacc tctatgtatc cctcctgttg ctgtaccaaa ccttcggacg gaaattgcac 2100

ctgtattccc atcccatcat cctgggcttt cggaaaattc ctatgggagt gggcctcagc 2160

ccgtttctcc tggctcagtt tactagtgcc atttgttcag tggttcgtag ggctttcccc 2220

cactgtttgg ctttcagtta tatggatgat gtggtattgg gggccaagtc tgtacagcat 2280

cttgagtccc tttttaccgc tgttaccaat tttcttttgt ctttgggtat acatttaaac 2340

cctaacaaaa caaagagatg gggttactct ctaaatttta tgggttatgt cattggatgt 2400

tatgggtcct tgccacaaga acacatcata caaaaaatca aagaatgttt tagaaaactt 2460

cctattaaca ggcctattga ttggaaagta tgtcaacgaa ttgtgggtct tttgggtttt 2520

gctgcccctt ttacacaatg tggttatcct gcgttgatgc ctttgtatgc atgtattcaa 2580

tctaagcagg ctttcacttt ctcgccaact tacaaggcct ttctgtgtaa acaatacctg 2640

aacctttacc ccgttgcccg gcaacggcca ggtctgtgcc aagtgtttgc tgacgcaacc 2700

cccactggct ggggcttggt catgggccat cagcgcatgc gtggaacctt ttcggctcct 2760

ctgccgatcc atactgcgga actcctagcc gcttgttttg ctcgcagcag gtctggagca 2820

aacattatcg ggactgataa ctctgttgtc ctatcccgca aatatacatc gtttccatgg 2880

ctgctaggct gtgctgccaa ctggatcctg cgcgggacgt cctttgttta cgtcccgtcg 2940

gcgctgaatc ctgcggacga cccttctcgg ggtcgcttgg gactctctcg tccccttctc 3000

cgtctgccgt tccgaccgac cacggggcgc acctctcttt acgcggactc cccgtctgtg 3060

ccttctcatc tgccggaccg tgtgcacttc gcttcacctc tgcacgtcgc atggagacca 3120

ccgtgaacgc ccaccaaata ttgcccaagg tcttacataa gaggactctt ggactctcag 3180

caatgtcaac gaccgacctt gaggcatact tcaaagactg tttgtttaaa gactgggagg 3240

agttggggga ggagattagg ttaaaggtct ttgtactagg aggctgtagg cataaattgg 3300

tctgcgcacc agcaccatgc aactttttca cctctgccta atcatctctt gttcatgtcc 3360

tactgttcaa gcctccaagc tgtgccttgg gtggctttgg ggcatggaca tcgaccctta 3420

taaagaattt ggagctactg tggagttact ctcgtttttg ccttctgact tctttccttc 3480

agtacgag 3488

<210> 9

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Tet-On 3G的氨基酸序列

<400> 9

Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu

1 5 10 15

Leu Asn Gly Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln

20 25 30

Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys

35 40 45

Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Pro Ile Glu Met Leu Asp Arg His His

50 55 60

Thr His Ser Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg

65 70 75 80

Asn Asn Ala Lys Ser Tyr Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly

85 90 95

Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr

100 105 110

Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu

115 120 125

Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys

130 135 140

Val Leu Glu Glu Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr

145 150 155 160

Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Lys Gln Ala Ile Glu Leu

165 170 175

Phe Asp Arg Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu

180 185 190

Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Gly Pro

195 200 205

Thr Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala

210 215 220

Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp

225 230 235 240

Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly

245

<210> 10

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tet-On 3G的核苷酸序列

<400> 10

atgagcagac tggacaagag caaagtcata aactctgctc tggaattact caatggagtc 60

ggtatcgaag gcctgacgac aaggaaactc gctcaaaagc tgggagttga gcagcctacc 120

ctgtactggc acgtgaagaa caagcgggcc ctgctcgatg ccctgccaat cgagatgctg 180

gacaggcatc atacccactc ctgccccctg gaaggcgagt catggcaaga ctttctgcgg 240

aacaacgcca agtcataccg ctgtgctctc ctctcacatc gcgacggggc taaagtgcat 300

ctcggcaccc gcccaacaga gaaacagtac gaaaccctgg aaaatcagct cgcgttcctg 360

tgtcagcaag gcttctccct ggagaacgca ctgtacgctc tgtccgccgt gggccacttt 420

acactgggct gcgtattgga ggaacaggag catcaagtag caaaagagga aagagagaca 480

cctaccaccg attctatgcc cccacttctg aaacaagcaa ttgagctgtt cgaccggcag 540

ggagccgaac ctgccttcct tttcggcctg gaactaatca tatgtggcct ggagaaacag 600

ctaaagtgcg aaagcggcgg gccgaccgac gcccttgacg attttgactt agacatgctc 660

ccagccgatg cccttgacga ctttgacctt gatatgctgc ctgctgacgc tcttgacgat 720

tttgaccttg acatgctccc cgggtag 747

<210> 11

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> iRFP的氨基酸序列

<400> 11

Met Ala Arg Lys Val Asp Leu Thr Ser Cys Asp Arg Glu Pro Ile His

1 5 10 15

Ile Pro Gly Ser Ile Gln Pro Cys Gly Cys Leu Leu Ala Cys Asp Ala

20 25 30

Gln Ala Val Arg Ile Thr Arg Ile Thr Glu Asn Ala Gly Ala Phe Phe

35 40 45

Gly Arg Glu Thr Pro Arg Val Gly Glu Leu Leu Ala Asp Tyr Phe Gly

50 55 60

Glu Thr Glu Ala His Ala Leu Arg Asn Ala Leu Ala Gln Ser Ser Asp

65 70 75 80

Pro Lys Arg Pro Ala Leu Ile Phe Gly Trp Arg Asp Gly Leu Thr Gly

85 90 95

Arg Thr Phe Asp Ile Ser Leu His Arg His Asp Gly Thr Ser Ile Ile

100 105 110

Glu Phe Glu Pro Ala Ala Ala Glu Gln Ala Asp Asn Pro Leu Arg Leu

115 120 125

Thr Arg Gln Ile Ile Ala Arg Thr Lys Glu Leu Lys Ser Leu Glu Glu

130 135 140

Met Ala Ala Arg Val Pro Arg Tyr Leu Gln Ala Met Leu Gly Tyr His

145 150 155 160

Arg Val Met Leu Tyr Arg Phe Ala Asp Asp Gly Ser Gly Met Val Ile

165 170 175

Gly Glu Ala Lys Arg Ser Asp Leu Glu Ser Phe Leu Gly Gln His Phe

180 185 190

Pro Ala Ser Leu Val Pro Gln Gln Ala Arg Leu Leu Tyr Leu Lys Asn

195 200 205

Ala Ile Arg Val Val Ser Asp Ser Arg Gly Ile Ser Ser Arg Ile Val

210 215 220

Pro Glu His Asp Ala Ser Gly Ala Ala Leu Asp Leu Ser Phe Ala His

225 230 235 240

Leu Arg Ser Ile Ser Pro Cys His Leu Glu Phe Leu Arg Asn Met Gly

245 250 255

Val Ser Ala Ser Met Ser Leu Ser Ile Ile Ile Asp Gly Thr Leu Trp

260 265 270

Gly Leu Ile Ile Cys His His Tyr Glu Pro Arg Ala Val Pro Met Ala

275 280 285

Gln Arg Val Ala Ala Glu Met Phe Ala Asp Phe Leu Ser Leu His Phe

290 295 300

Thr Ala Ala His His Gln Arg

305 310

<210> 12

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> iRFP的核苷酸序列

<400> 12

atggcgcgta aggtcgatct cacctcctgc gatcgcgagc cgatccacat ccccggcagc 60

attcagccgt gcggctgcct gctggcctgc gacgcgcagg cggtgcggat cacgcgcatt 120

acggaaaatg ccggcgcgtt ctttggacgc gaaactccgc gggtcggtga gctactcgcc 180

gattacttcg gcgagaccga agcccatgcg ctgcgcaacg cactggcgca gtcctccgat 240

ccaaagcgac cggcgctgat cttcggttgg cgcgacggcc tgaccggccg caccttcgac 300

atctcactgc atcgccatga cggcaccagc atcatcgagt tcgagcctgc ggcggccgaa 360

caggccgaca atccgctgcg gctgacgcgg cagatcatcg cgcgcaccaa agaactgaag 420

tcgctcgaag agatggccgc acgggtgccg cgctatctgc aggcgatgct cggctatcac 480

cgcgtgatgt tgtaccgctt cgcggacgac ggctccggga tggtgatcgg cgaggcgaag 540

cgcagcgacc tggagagctt tctcggtcag cactttccgg cgtcgctggt cccgcagcag 600

gcgcggctac tgtacttgaa gaacgcgatc cgcgtggtct cggattcgcg cggcatcagc 660

agccggatcg tgcccgagca cgacgcctcc ggcgccgcgc tcgatctgtc gttcgcgcac 720

ctgcgcagca tctcgccctg ccatctcgaa tttctgcgga acatgggcgt cagcgcctcg 780

atgtcgctgt cgatcatcat tgacggcacg ctatggggat tgatcatctg tcatcattac 840

gagccgcgtg ccgtgccgat ggcgcagcgc gtcgcggccg aaatgttcgc cgacttctta 900

tcgctgcact tcaccgccgc ccaccaccaa cgctga 936

<210> 13

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Blasticidin抗性基因

<400> 13

atggccaagc ctttgtctca agaagaatcc accctcattg aaagagcaac ggctacaatc 60

aacagcatcc ccatctctga agactacagc gtcgccagcg cagctctctc tagcgacggc 120

cgcatcttca ctggtgtcaa tgtatatcat tttactgggg gaccttgtgc agaactcgtg 180

gtgctgggca ctgctgctgc tgcggcagct ggcaacctga cttgtatcgt cgcgatcgga 240

aatgagaaca ggggcatctt gagcccctgc ggacggtgcc gacaggtgct tctcgatctg 300

catcctggga tcaaagccat agtgaaggac agtgatggac agccgacggc agttgggatt 360

cgtgaattgc tgccctctgg ttatgtgtgg gagggctgag cttga 405

<210> 14

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rccc1a HBV基因组的C-ORF的3'端区域的序列

<400> 14

gacctagtag tcagttatgt caacactaat atgggcctaa agttcaggca actcttgtgg 60

tttcacattt cttgtctcac ttttggaaga gaaacagtta tagagtattt ggtgtctttc 120

ggagtgtgga ttcgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctatcaaca 180

cttccggaga ctactgttgt tagacgacga ggcaggtccc ctagaagaag aactccctcg 240

cctcgcagac gaaggtctca atcgccgcgt cgcagaagat ctcaatctcg ggaatctcaa 300

tgttag 306

<210> 15

<211> 147

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rccc1a HBV基因组的C-ORF的5'端区域的序列

<400> 15

cttctagata ccgcctcagc tctgtatcgg gaagccttag agtctcctga gcattgttca 60

cctcaccata ctgcactcag gcaagcaatt ctttgctggg gggaactaat gactctagct 120

acctgggtgg gtgttaattt ggaagat 147

<210> 16

<211> 2717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rccc1a 去除了C-ORF的HBV基因组片段序列

<400> 16

tattccttgg actcataagg tggggaactt tactgggctt tattcttcta ctgtacctgt 60

ctttaatcct cattggaaaa caccatcttt tcctaatata catttacacc aagacattat 120

caaaaaatgt gaacagtttg taggcccact cacagttaat gagaaaagaa gattgcaatt 180

gattatgcct gccaggtttt atccaaaggt taccaaatat ttaccattgg ataagggtat 240

taaaccttat tatccagaac atctagttaa tcattacttc caaactagac actatttaca 300

cactctatgg aaggcgggta tattatataa gagagaaaca acacatagcg cctcattttg 360

tgggtcacca tattcttggg aacaagatct acagcatggg gcagaatctt tccaccagca 420

atcctctggg attctttccc gaccaccagt tggatccagc cttcagagca aacaccgcaa 480

atccagattg ggacttcaat cccaacaagg acacctggcc agacgccaac aaggtaggag 540

ctggagcatt cgggctgggt ttcaccccac cgcacggagg ccttttgggg tggagccctc 600

aggctcaggg catactacaa actttgccag caaatccgcc tcctgcctcc accaatcgcc 660

agtcaggaag gcagcctacc ccgctgtctc cacctttgag aaacactcat cctcaggcca 720

tgcagtggaa ttccacaacc ttccaccaaa ctctgcaaga tcccagagtg agaggcctgt 780

atttccctgc tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc tgttctgact actgcctctc 840

ccttatcgtc aatcttctcg aggattgggg accctgcgct gaacatggag aacatcacat 900

caggattcct aggacccctt ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc 960

tcacaatacc gcagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggaacta 1020

ccgtgtgtct tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc 1080

ctccaacttg tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctcttca 1140

tcctgctgct atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg 1200

tttgtcctct aattccagga tcctcaacaa ccagcacggg accatgccgg acctgcatga 1260

ctactgctca aggaacctct atgtatccct cctgttgctg taccaaacct tcggacggaa 1320

attgcacctg tattcccatc ccatcatcct gggctttcgg aaaattccta tgggagtggg 1380

cctcagcccg tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc 1440

tttcccccac tgtttggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt 1500

acagcatctt gagtcccttt ttaccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca 1560

tttaaaccct aacaaaacaa agagatgggg ttactctcta aattttatgg gttatgtcat 1620

tggatgttat gggtccttgc cacaagaaca catcatacaa aaaatcaaag aatgttttag 1680

aaaacttcct attaacaggc ctattgattg gaaagtatgt caacgaattg tgggtctttt 1740

gggttttgct gcccctttta cacaatgtgg ttatcctgcg ttgatgcctt tgtatgcatg 1800

tattcaatct aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgtgtaaaca 1860

atacctgaac ctttaccccg ttgcccggca acggccaggt ctgtgccaag tgtttgctga 1920

cgcaaccccc actggctggg gcttggtcat gggccatcag cgcatgcgtg gaaccttttc 1980

ggctcctctg ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagcaggtc 2040

tggagcaaac attatcggga ctgataactc tgttgtccta tcccgcaaat atacatcgtt 2100

tccatggctg ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtttacgt 2160

cccgtcggcg ctgaatcctg cggacgaccc ttctcggggt cgcttgggac tctctcgtcc 2220

ccttctccgt ctgccgttcc gaccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggactcccc 2280

gtctgtgcct tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg 2340

gagaccaccg tgaacgccca ccaaatattg cccaaggtct tacataagag gactcttgga 2400

ctctcagcaa tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgttt gtttaaagac 2460

tgggaggagt tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat 2520

aaattggtct gcgcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcttgtt 2580

catgtcctac tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacatcg 2640

acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct tctgacttct 2700

ttccttcagt acgagat 2717

<210> 17

<211> 3324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rccc1a线性复制子序列

<400> 17

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatctggcg gtagcggtgt gagcggctgg 60

cgcctgttca agaagatcag cggcggcggc ggcagcaccg gtgacctagt agtcagttat 120

gtcaacacta atatgggcct aaagttcagg caactcttgt ggtttcacat ttcttgtctc 180

acttttggaa gagaaacagt tatagagtat ttggtgtctt tcggagtgtg gattcgcact 240

cctccagctt atagaccacc aaatgcccct atcctatcaa cacttccgga gactactgtt 300

gttagacgac gaggcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag acgaaggtct 360

caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct cgggaatctc aatgttagta ttccttggac 420

tcataaggtg gggaacttta ctgggcttta ttcttctact gtacctgtct ttaatcctca 480

ttggaaaaca ccatcttttc ctaatataca tttacaccaa gacattatca aaaaatgtga 540

acagtttgta ggcccactca cagttaatga gaaaagaaga ttgcaattga ttatgcctgc 600

caggttttat ccaaaggtta ccaaatattt accattggat aagggtatta aaccttatta 660

tccagaacat ctagttaatc attacttcca aactagacac tatttacaca ctctatggaa 720

ggcgggtata ttatataaga gagaaacaac acatagcgcc tcattttgtg ggtcaccata 780

ttcttgggaa caagatctac agcatggggc agaatctttc caccagcaat cctctgggat 840

tctttcccga ccaccagttg gatccagcct tcagagcaaa caccgcaaat ccagattggg 900

acttcaatcc caacaaggac acctggccag acgccaacaa ggtaggagct ggagcattcg 960

ggctgggttt caccccaccg cacggaggcc ttttggggtg gagccctcag gctcagggca 1020

tactacaaac tttgccagca aatccgcctc ctgcctccac caatcgccag tcaggaaggc 1080

agcctacccc gctgtctcca cctttgagaa acactcatcc tcaggccatg cagtggaatt 1140

ccacaacctt ccaccaaact ctgcaagatc ccagagtgag aggcctgtat ttccctgctg 1200

gtggctccag ttcaggaaca gtaaaccctg ttctgactac tgcctctccc ttatcgtcaa 1260

tcttctcgag gattggggac cctgcgctga acatggagaa catcacatca ggattcctag 1320

gaccccttct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc acaataccgc 1380

agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggaactacc gtgtgtcttg 1440

gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct ccaacttgtc 1500

ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctcttcatc ctgctgctat 1560

gcctcatctt cttgttggtt cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt tgtcctctaa 1620

ttccaggatc ctcaacaacc agcacgggac catgccggac ctgcatgact actgctcaag 1680

gaacctctat gtatccctcc tgttgctgta ccaaaccttc ggacggaaat tgcacctgta 1740

ttcccatccc atcatcctgg gctttcggaa aattcctatg ggagtgggcc tcagcccgtt 1800

tctcctggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt tcccccactg 1860

tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac agcatcttga 1920

gtcccttttt accgctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt taaaccctaa 1980

caaaacaaag agatggggtt actctctaaa ttttatgggt tatgtcattg gatgttatgg 2040

gtccttgcca caagaacaca tcatacaaaa aatcaaagaa tgttttagaa aacttcctat 2100

taacaggcct attgattgga aagtatgtca acgaattgtg ggtcttttgg gttttgctgc 2160

cccttttaca caatgtggtt atcctgcgtt gatgcctttg tatgcatgta ttcaatctaa 2220

gcaggctttc actttctcgc caacttacaa ggcctttctg tgtaaacaat acctgaacct 2280

ttaccccgtt gcccggcaac ggccaggtct gtgccaagtg tttgctgacg caacccccac 2340

tggctggggc ttggtcatgg gccatcagcg catgcgtgga accttttcgg ctcctctgcc 2400

gatccatact gcggaactcc tagccgcttg ttttgctcgc agcaggtctg gagcaaacat 2460

tatcgggact gataactctg ttgtcctatc ccgcaaatat acatcgtttc catggctgct 2520

aggctgtgct gccaactgga tcctgcgcgg gacgtccttt gtttacgtcc cgtcggcgct 2580

gaatcctgcg gacgaccctt ctcggggtcg cttgggactc tctcgtcccc ttctccgtct 2640

gccgttccga ccgaccacgg ggcgcacctc tctttacgcg gactccccgt ctgtgccttc 2700

tcatctgccg gaccgtgtgc acttcgcttc acctctgcac gtcgcatgga gaccaccgtg 2760

aacgcccacc aaatattgcc caaggtctta cataagagga ctcttggact ctcagcaatg 2820

tcaacgaccg accttgaggc atacttcaaa gactgtttgt ttaaagactg ggaggagttg 2880

ggggaggaga ttaggttaaa ggtctttgta ctaggaggct gtaggcataa attggtctgc 2940

gcaccagcac catgcaactt tttcacctct gcctaatcat ctcttgttca tgtcctactg 3000

ttcaagcctc caagctgtgc cttgggtggc tttggggcat ggacatcgac ccttataaag 3060

aatttggagc tactgtggag ttactctcgt ttttgccttc tgacttcttt ccttcagtac 3120

gagatcttct agataccgcc tcagctctgt atcgggaagc cttagagtct cctgagcatt 3180

gttcacctca ccatactgca ctcaggcaag caattctttg ctggggggaa ctaatgactc 3240

tagctacctg ggtgggtgtt aatttggaag atggaggtac cggcggtagc ataacttcgt 3300

ataatgtatg ctatacgaag ttat 3324

<210> 18

<211> 3290

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rccc1a重组cccDNA序列

<400> 18

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatctggcg gtagcggtgt gagcggctgg 60

cgcctgttca agaagatcag cggcggcggc ggcagcaccg gtgacctagt agtcagttat 120

gtcaacacta atatgggcct aaagttcagg caactcttgt ggtttcacat ttcttgtctc 180

acttttggaa gagaaacagt tatagagtat ttggtgtctt tcggagtgtg gattcgcact 240

cctccagctt atagaccacc aaatgcccct atcctatcaa cacttccgga gactactgtt 300

gttagacgac gaggcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag acgaaggtct 360

caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct cgggaatctc aatgttagta ttccttggac 420

tcataaggtg gggaacttta ctgggcttta ttcttctact gtacctgtct ttaatcctca 480

ttggaaaaca ccatcttttc ctaatataca tttacaccaa gacattatca aaaaatgtga 540

acagtttgta ggcccactca cagttaatga gaaaagaaga ttgcaattga ttatgcctgc 600

caggttttat ccaaaggtta ccaaatattt accattggat aagggtatta aaccttatta 660

tccagaacat ctagttaatc attacttcca aactagacac tatttacaca ctctatggaa 720

ggcgggtata ttatataaga gagaaacaac acatagcgcc tcattttgtg ggtcaccata 780

ttcttgggaa caagatctac agcatggggc agaatctttc caccagcaat cctctgggat 840

tctttcccga ccaccagttg gatccagcct tcagagcaaa caccgcaaat ccagattggg 900

acttcaatcc caacaaggac acctggccag acgccaacaa ggtaggagct ggagcattcg 960

ggctgggttt caccccaccg cacggaggcc ttttggggtg gagccctcag gctcagggca 1020

tactacaaac tttgccagca aatccgcctc ctgcctccac caatcgccag tcaggaaggc 1080

agcctacccc gctgtctcca cctttgagaa acactcatcc tcaggccatg cagtggaatt 1140

ccacaacctt ccaccaaact ctgcaagatc ccagagtgag aggcctgtat ttccctgctg 1200

gtggctccag ttcaggaaca gtaaaccctg ttctgactac tgcctctccc ttatcgtcaa 1260

tcttctcgag gattggggac cctgcgctga acatggagaa catcacatca ggattcctag 1320

gaccccttct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc acaataccgc 1380

agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggaactacc gtgtgtcttg 1440

gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct ccaacttgtc 1500

ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctcttcatc ctgctgctat 1560

gcctcatctt cttgttggtt cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt tgtcctctaa 1620

ttccaggatc ctcaacaacc agcacgggac catgccggac ctgcatgact actgctcaag 1680

gaacctctat gtatccctcc tgttgctgta ccaaaccttc ggacggaaat tgcacctgta 1740

ttcccatccc atcatcctgg gctttcggaa aattcctatg ggagtgggcc tcagcccgtt 1800

tctcctggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt tcccccactg 1860

tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac agcatcttga 1920

gtcccttttt accgctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt taaaccctaa 1980

caaaacaaag agatggggtt actctctaaa ttttatgggt tatgtcattg gatgttatgg 2040

gtccttgcca caagaacaca tcatacaaaa aatcaaagaa tgttttagaa aacttcctat 2100

taacaggcct attgattgga aagtatgtca acgaattgtg ggtcttttgg gttttgctgc 2160

cccttttaca caatgtggtt atcctgcgtt gatgcctttg tatgcatgta ttcaatctaa 2220

gcaggctttc actttctcgc caacttacaa ggcctttctg tgtaaacaat acctgaacct 2280

ttaccccgtt gcccggcaac ggccaggtct gtgccaagtg tttgctgacg caacccccac 2340

tggctggggc ttggtcatgg gccatcagcg catgcgtgga accttttcgg ctcctctgcc 2400

gatccatact gcggaactcc tagccgcttg ttttgctcgc agcaggtctg gagcaaacat 2460

tatcgggact gataactctg ttgtcctatc ccgcaaatat acatcgtttc catggctgct 2520

aggctgtgct gccaactgga tcctgcgcgg gacgtccttt gtttacgtcc cgtcggcgct 2580

gaatcctgcg gacgaccctt ctcggggtcg cttgggactc tctcgtcccc ttctccgtct 2640

gccgttccga ccgaccacgg ggcgcacctc tctttacgcg gactccccgt ctgtgccttc 2700

tcatctgccg gaccgtgtgc acttcgcttc acctctgcac gtcgcatgga gaccaccgtg 2760

aacgcccacc aaatattgcc caaggtctta cataagagga ctcttggact ctcagcaatg 2820

tcaacgaccg accttgaggc atacttcaaa gactgtttgt ttaaagactg ggaggagttg 2880

ggggaggaga ttaggttaaa ggtctttgta ctaggaggct gtaggcataa attggtctgc 2940

gcaccagcac catgcaactt tttcacctct gcctaatcat ctcttgttca tgtcctactg 3000

ttcaagcctc caagctgtgc cttgggtggc tttggggcat ggacatcgac ccttataaag 3060

aatttggagc tactgtggag ttactctcgt ttttgccttc tgacttcttt ccttcagtac 3120

gagatcttct agataccgcc tcagctctgt atcgggaagc cttagagtct cctgagcatt 3180

gttcacctca ccatactgca ctcaggcaag caattctttg ctggggggaa ctaatgactc 3240

tagctacctg ggtgggtgtt aatttggaag atggaggtac cggcggtagc 3290

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> loxP序列

<400> 19

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34

<210> 20

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cre重组酶的氨基酸序列

<400> 20

Met Gly His His His His His His Gly Met Gly Ala Ala Gly Arg Lys

1 5 10 15

Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Ala Gly Thr Ser Val Ser Leu

20 25 30

Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu

35 40 45

Pro Ala Leu Pro Val Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu

50 55 60

Met Asp Met Phe Arg Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys

65 70 75 80

Met Leu Leu Ser Val Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn

85 90 95

Asn Arg Lys Trp Phe Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu

100 105 110

Leu Tyr Leu Gln Ala Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His

115 120 125

Leu Gly Gln Leu Asn Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro

130 135 140

Ser Asp Ser Asn Ala Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu

145 150 155 160

Asn Val Asp Ala Gly Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg

165 170 175

Thr Asp Phe Asp Gln Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys

180 185 190

Gln Asp Ile Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu

195 200 205

Leu Arg Ile Ala Glu Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg

210 215 220

Thr Asp Gly Gly Arg Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu

225 230 235 240

Val Ser Thr Ala Gly Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys

245 250 255

Leu Val Glu Arg Trp Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn

260 265 270

Asn Tyr Leu Phe Cys Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser

275 280 285

Ala Thr Ser Gln Leu Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala

290 295 300

Thr His Arg Leu Ile Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr

305 310 315 320

Leu Ala Trp Ser Gly His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met

325 330 335

Ala Arg Ala Gly Val Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp

340 345 350

Thr Asn Val Asn Ile Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu

355 360 365

Thr Gly Ala Met Val Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp

370 375 380

<210> 21

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cre重组酶的核苷酸序列

<400> 21

atgggccatc accatcacca tcacggcatg ggcgctgcag gtcgcaagaa acgtcgccaa 60

cgtcgccgtc cgcctgcagg cactagtgta agcttgaaga agaagaggaa ggtgtccaat 120

ttactgaccg tacaccaaaa tttgcctgca ttaccggtcg atgcaacgag tgatgaggtt 180

cgcaagaacc tgatggacat gttcagggat cgccaggcgt tttctgagca tacctggaaa 240

atgcttctgt ccgtttgccg gtcgtgggcg gcatggtgca agttgaataa ccggaaatgg 300

tttcccgcag aacctgaaga tgttcgcgat tatcttctat atcttcaggc gcgcggtctg 360

gcagtaaaaa ctatccagca acatttgggc cagctaaaca tgcttcatcg tcggtccggg 420

ctgccacgac caagtgacag caatgctgtt tcactggtta tgcggcggat ccgaaaagaa 480

aacgttgatg ccggtgaacg tgcaaaacag gctctagcgt tcgaacgcac tgatttcgac 540

caggttcgtt cactcatgga aaatagcgat cgctgccagg atatacgtaa tctggcattt 600

ctggggattg cttataacac cctgttacgt atagccgaaa ttgccaggat cagggttaaa 660

gatatctcac gtactgacgg tgggagaatg ttaatccata ttggcagaac gaaaacgctg 720

gttagcaccg caggtgtaga gaaggcactt agcctggggg taactaaact ggtcgagcga 780

tggatttccg tctctggtgt agctgatgat ccgaataact acctgttttg ccgggtcaga 840

aaaaatggtg ttgccgcgcc atctgccacc agccagctat caactcgcgc cctggaaggg 900

atttttgaag caactcatcg attgatttac ggcgctaagg atgactctgg tcagagatac 960

ctggcctggt ctggacacag tgcccgtgtc ggagccgcgc gagatatggc ccgcgctgga 1020

gtttcaatac cggagatcat gcaagctggt ggctggacca atgtaaatat tgtcatgaac 1080

tatatccgta acctggatag tgaaacaggg gcaatggtgc gcctgctgga agatggcgat 1140

tag 1143

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV-F

<400> 22

tttcacctct gcctaatcat 20

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV-R

<400> 23

tcagaaggca aaaaagagag taactc 26

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV-Probe

<400> 24

ccttgggtgg ctttggggca tgga 24

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cccDNA-Probe

<400> 25

accgtgaacg cccaccgaat gttgc 25

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cccDNA-F

<400> 26

tgcacttcgc ttcacct 17

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cccDNA-R

<400> 27

aggggcattt ggtggtc 17

<210> 28

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mt4987F

<400> 28

cccagctacg caaaat 16

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mt5106R

<400> 29

aatgcggtag tagttaggat a 21

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mt5010-Probe

<400> 30

catactcctc aattacccac atag 24

Claims (44)

1.分离的核酸分子，其包含HBV基因组序列的变体，所述变体包括：包含C-ORF、S-ORF和P-ORF的HBV基因组片段，并且所述C-ORF在precore和core基因之间包含外源插入序列，所述外源插入序列包含编码荧光素酶第一片段的核苷酸序列；所述荧光素酶第一片段能够与荧光素酶片段互补技术(LFCA)中相应的荧光素酶第二片段结合，并产生荧光素酶活性。

2.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中，所述HBV基因组片段还包含X-ORF。

3.权利要求1或2所述的分离的核酸分子，其中，所述变体在HBV基因组序列的precore和core基因之间包含所述外源插入序列。

4.权利要求1-3任一项所述的分离的核酸分子，其中，所述荧光素酶第一片段是能够与LgBiT互补结合的小片段，例如HiBiT或SmBiT；所述荧光素酶第二片段是LgBiT；

优选地，所述荧光素酶第一片段是HiBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT。

5.权利要求4所述的分离的核酸分子，其中，所述外源插入序列包含多个拷贝的以串联重复方式存在的编码所述荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列；

优选地，所述外源插入序列包含三个拷贝的以串联重复方式存在的编码所述荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列。

6.权利要求5所述的分离的核酸分子，其中，所述多个拷贝的以串联重复方式存在的编码所述荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列中的每个拷贝在其5’端均包含编码连接肽(例如柔性肽接头)的序列。

7.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中，所述外源插入序列包含如SEQ ID NO:4所示的序列。

8.权利要求1-7任一项所述的分离的核酸分子，其中，所述HBV基因组是全长基因组，或者是超长度基因组，例如1.1倍体基因组或1.3倍体基因组；

优选地，所述HBV基因组包含如SEQ ID NO:1所示的序列。

9.权利要求1-8任一项所述的分离的核酸分子，其进一步包含与所述外源插入序列可操作地连接的诱导型启动子；

优选地，所述诱导型启动子是TRE3G启动子，或者包含Tet操纵因子序列(TetO)的一个或多个重复；

优选地，所述诱导型启动子具有双向启动活性，例如具有双向启动活性的TRE3G启动子。

10.权利要求9所述的分离的核酸分子，其中，所述分离的核酸分子进一步包含与所述诱导型启动子可操作地连接的报告基因；

优选地，所述报告基因与所述外源插入序列的方向相反；

优选地，所述报告基因选自荧光蛋白基因(例如iRFP)和/或抗生素抗性基因(例如Blasticidin)；

优选地，所述报告基因包含荧光蛋白基因和抗生素抗性基因；

优选地，所述荧光蛋白基因和抗生素抗性基因任选地通过编码自裂解肽(例如P2A，E2A，F2A或T2A)的核苷酸序列连接。

11.权利要求9或10所述的分离的核酸分子，其中，所述分离的核酸分子包含如SEQ IDNO:8所示的序列。

12.重组HBV cccDNA，其包含权利要求1-11任一项所述的分离的核酸分子；

优选地，所述重组HBV cccDNA包含权利要求1-11任一项中所述的HBV基因组序列的变体；

优选地，所述重组HBV cccDNA由权利要求1-11任一项所述的分离的核酸分子环化形成。

13.表达系统，其包含权利要求9-11任一项所述的分离的核酸分子作为第一核酸序列，并且包含第二核酸序列，所述第二核酸序列包含编码与所述第一核酸序列中所包含的诱导型启动子相对应的反式激活蛋白的核苷酸序列；

优选地，所述反式激活蛋白选自Tet-On 3G反式激活蛋白、rTetR、rtTA；

优选地，所述第二核酸序列还包含与所述编码反式激活蛋白的核苷酸序列可操作地连接的表达调控元件，例如启动子(例如组成型启动子)和/或增强子。

14.权利要求13所述的表达系统，其中，所述第一核酸序列包含TRE3G启动子作为诱导型启动子，所述第二核酸序列包含编码Tet-On 3G反式激活蛋白的核苷酸序列；

优选地，所述TRE3G启动子包含如SEQ ID NO:5所示的序列；

优选地，所述编码Tet-On 3G反式激活蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:10所示的序列。

15.载体，其包含权利要求1-11任一项所述的分离的核酸分子，或者包含权利要求13或14所述的表达系统。

16.权利要求15所述的载体，其中，所述载体包含权利要求13或14所述的表达系统，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列被提供在相同或不同的载体上；

优选地，所述第一核酸序列和第二核酸序列被提供在相同的载体上。

17.权利要求15或16所述的载体，其中，所述载体是转座子载体，例如PiggyBac转座子载体；

优选地，所述第一核酸序列和第二核酸序列位于所述转座子载体的两个ITR序列之间。

18.共转染系统，其包含权利要求15-17任一项所述的载体，以及转座酶表达载体；

优选地，所述转座酶表达载体是PiggyBac转座酶表达载体。

19.宿主细胞，其包含权利要求1-11任一项所述的分离的核酸分子，或权利要求12所述的重组cccDNA，或权利要求13或14所述的表达系统，或权利要求15-17任一项所述的载体，或权利要求18所述的共转染系统；

优选地，所述宿主细胞选自肝细胞来源的真核细胞，例如肝瘤细胞或肝细胞；优选地，所述宿主细胞选自HepaRG、HepG2或Huh7。

20.权利要求19所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞在其基因组中包含权利要求13或14所述的表达系统；

优选地，当存在与所述诱导型启动子及反式激活蛋白相对应的诱导物(例如Doxycycline)时，所述宿主细胞能够稳定表达由所述HBV基因组序列的变体所形成的HBVcccDNA。

21.试剂盒，其包含权利要求1-11任一项所述的分离的核酸分子，或权利要求13或14所述的表达系统，或权利要求15-17任一项所述的载体，或权利要求18所述的共转染系统，或权利要求19或20所述的宿主细胞；

优选地，所述试剂盒包含：权利要求15-17任一项所述的载体，或权利要求18所述的共转染系统；

优选地，所述试剂盒包含：权利要求19或20所述的宿主细胞；

优选地，所述试剂盒还包含LgBiT蛋白以及任选的荧光素酶底物；

优选地，所述试剂盒还包含与所述诱导型启动子及反式激活蛋白相对应的诱导物(例如Doxycycline)。

22.用于筛选HBV cccDNA抑制剂的方法，其包括：

(1)提供权利要求20所述的宿主细胞；

(2)将诱导试剂与所述宿主细胞接触，所述诱导试剂是与所述宿主细胞中所包含的诱导型启动子及反式激活蛋白相对应的诱导物(例如Doxycycline)；

(3)将受试试剂与所述宿主细胞接触；其中，步骤(2)和(3)可以同时进行或者以任意顺序进行；

(4)检测所述宿主细胞的细胞上清中的所述荧光素酶第一片段水平。

23.权利要求22所述的方法，其中，步骤(1)包括以下步骤：

(1a)将权利要求13或14所述的表达系统中的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列引入宿主细胞中，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的表达载体上，并且，所述第一核酸序列是权利要求9-11任一项所述的分离的核酸分子；

(1b)培养所述宿主细胞；

优选地，所述宿主细胞选自肝细胞来源的真核细胞，例如肝瘤细胞或肝细胞；优选地，所述宿主细胞选自HepaRG、HepG2或Huh7；

优选地，在步骤(1a)中，所述表达载体是转座子载体(例如PiggyBac转座子载体)，该步骤进一步包括：将转座酶表达载体(例如PiggyBac转座酶表达载体)引入所述宿主细胞；

优选地，所述步骤(1)还包括：(1c)鉴定并选择在其基因组中已整合权利要求13或14所述的表达系统的宿主细胞；优选地，通过检测所述第一核酸序列所包含的报告基因来鉴定所述宿主细胞的基因组中是否已整合所述表达系统。

24.权利要求22或23所述的方法，其中，在步骤(4)中，通过荧光素酶片段互补技术来检测荧光素酶第一片段水平；

优选地，通过与所述荧光素酶第一片段互补的荧光素酶第二片段来检测；

优选地，所述荧光素酶第一片段是能够与LgBiT互补结合的小片段，例如HiBiT或SmBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT蛋白；优选地，所述荧光素酶第一片段是HiBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT蛋白。

25.权利要求22-24任一项所述的方法，其还包括以下步骤：

(5)将步骤(4)的测定结果与不存在所述受试试剂时测定的荧光素酶第一片段水平进行比较；

其中，如果步骤(4)的测定结果与不存在所述受试试剂时的测定结果相比降低，表明所述受试试剂是HBV cccDNA抑制剂。

26.分离的核酸分子，其包含HBV基因组序列的变体，所述变体从5’至3’方向包含：

(i)编码荧光素酶第一片段的核苷酸序列；所述荧光素酶第一片段能够与荧光素酶片段互补技术(LFCA)中相应的荧光素酶第二片段结合，并产生荧光素酶活性；

(ii)HBV基因组的C-ORF的3’端区域的序列；

(iii)包含S-ORF、P-ORF的HBV基因组片段；

(iv)HBV基因组的C-ORF的5’端区域的序列，其与(ii)所述的序列能够组成完整的C-ORF序列；

并且，所述变体位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间。

27.权利要求26所述的分离的核酸分子，其中，所述HBV基因组是全长基因组，或者是超长度基因组，例如1.1倍体基因组或1.3倍体基因组；

优选地，所述HBV基因组包含如SEQ ID NO:1所示的序列。

28.权利要求26或27所述的分离的核酸分子，其中，(iii)所述的序列还包含X-ORF；

优选地，(iii)所述的序列包含去除了C-ORF的HBV基因组片段；

优选地，(iii)所述的序列包含如SEQ ID NO:16所示的序列。

29.权利要求26-28任一项所述的分离的核酸分子，其中，(ii)所述的序列包含core基因，(iv)所述的序列包含pre-core基因；

优选地，(ii)所述的序列包含如SEQ ID NO:14所示的序列；

优选地，(iv)所述的序列包含如SEQ ID NO:15所示的序列。

30.权利要求26-29任一项所述的分离的核酸分子，其中，所述位点特异性重组酶识别序列选自loxP序列或FRT序列。

31.权利要求26-30所述的分离的核酸分子，其中，所述荧光素酶第一片段是能够与LgBiT互补结合的小片段，例如HiBiT或SmBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT；

优选地，所述荧光素酶第一片段是HiBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT。

32.权利要求26-31任一项所述的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:17所示的序列。

33.重组HBV cccDNA，其由权利要求26-32任一项所述的分离的核酸分子中的所述HBV基因组序列的变体环化形成；

优选地，所述重组HBV cccDNA由权利要求26-32任一项所述的分离的核酸分子在存在与所述位点特异性重组酶识别序列相对应的位点特异性重组酶(例如Cre重组酶或FLP重组酶)的条件下环化形成；

优选地，所述重组HBV cccDNA包含C-ORF、S-ORF、P-ORF，所述C-ORF包含编码所述荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列；

优选地，所述重组HBV cccDNA进一步包含X-ORF；

优选地，所述重组HBV cccDNA包括：包含编码所述荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列的C-ORF、以及去除了C-ORF的HBV基因组片段；

优选地，所述重组cccDNA包含如SEQ ID NO:18所示的序列。

34.载体，其包含权利要求26-32任一项所述的分离的核酸分子。

35.权利要求34所述的载体，其是转座子载体，例如PiggyBac转座子载体；

优选地，所述分离的核酸分子位于所述转座子载体的两个ITR序列之间。

36.共转染系统，其包含权利要求35所述的载体，以及转座酶表达载体；

优选地，所述转座酶表达载体是PiggyBac转座酶表达载体。

37.宿主细胞，其包含权利要求26-32任一项所述的分离的核酸分子，或权利要求33所述的重组cccDNA，或权利要求34或35所述的载体，或权利要求36所述的共转染系统；

优选地，所述宿主细胞选自肝细胞来源的真核细胞，例如肝瘤细胞或肝细胞；优选地，所述宿主细胞选自HepaRG、HepG2或Huh7。

38.权利要求37所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞在其基因组中包含权利要求26-32任一项所述的分离的核酸分子；

优选地，当存在与所述位点特异性重组酶识别序列相对应的位点特异性重组酶(例如Cre重组酶或FLP重组酶)时，所述宿主细胞能够稳定表达由所述HBV基因组序列的变体环化形成的重组HBV cccDNA。

39.试剂盒，其包含权利要求26-32任一项所述的分离的核酸分子，或权利要求33所述的重组cccDNA，或权利要求34或35所述的载体，或权利要求36所述的共转染系统，或权利要求37或38所述的宿主细胞；

优选地，所述试剂盒包含：权利要求34或35所述的载体，或权利要求36所述的共转染系统；

优选地，所述试剂盒包含：权利要求37或38所述的宿主细胞；

优选地，所述试剂盒还包含LgBiT蛋白以及任选的荧光素酶底物；

优选地，所述试剂盒还包含重组酶(例如Cre重组酶或FLP重组酶)或重组酶(例如Cre重组酶或FLP重组酶)表达载体。

40.用于筛选HBV cccDNA抑制剂的方法，其包括：

(1)提供权利要求38所述的宿主细胞；

(2)将重组酶或重组酶表达载体导入所述宿主细胞，所述重组酶与所述宿主细胞中所包含的位点特异性重组酶识别序列对应；

(3)将受试试剂与所述宿主细胞接触；

(4)检测所述宿主细胞的细胞上清中的荧光素酶第一片段水平。

41.权利要求40所述的方法，其中，步骤(1)包括以下步骤：

(1a)将权利要求26-32任一项所述的分离的核酸分子或权利要求34或35所述的载体引入宿主细胞中；

(1b)培养所述宿主细胞；

优选地，所述宿主细胞选自肝细胞来源的真核细胞，例如肝瘤细胞或肝细胞；优选地，所述宿主细胞选自HepaRG、HepG2或Huh7；

优选地，在步骤(1a)中，所述表达载体是转座子载体(例如PiggyBac转座子载体)，该步骤进一步包括：将转座酶表达载体(例如PiggyBac转座酶表达载体)引入所述宿主细胞。

42.权利要求40或41所述的方法，其中，在步骤(4)中，通过荧光素酶片段互补技术来检测荧光素酶第一片段水平；

优选地，通过与所述荧光素酶第一片段互补的荧光素酶第二片段来检测；

优选地，所述荧光素酶第一片段是能够与LgBiT互补结合的小片段，例如HiBiT或SmBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT蛋白；优选地，所述荧光素酶第一片段是HiBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT蛋白。

43.权利要求40-42任一项所述的方法，其还包括以下步骤：

(5)将步骤(4)的测定结果与不存在所述受试试剂时测定的荧光素酶第一片段水平进行比较；

其中，如果步骤(4)的测定结果与不存在所述受试试剂时的测定结果相比降低，表明所述受试试剂是HBV cccDNA抑制剂。

44.权利要求1-11任一项所述的分离的核酸分子，或权利要求13或14所述的表达系统，或权利要求15-17任一项所述的载体，或权利要求18所述的共转染系统，或权利要求19或20所述的宿主细胞，或权利要求21所述的试剂盒，权利要求26-32任一项所述的分离的核酸分子，或权利要求33所述的重组cccDNA，或权利要求34或35所述的载体，或权利要求36所述的共转染系统，或权利要求37或38所述的宿主细胞，或权利要求39所述的试剂盒，用于筛选HBV cccDNA抑制剂的用途。

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