JPWO2015133613A1 - Ｂ型肝炎ウイルスレポーターベクター、ｂ型肝炎ウイルス様粒子及びそれを用いたｂ型肝炎治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、効率的なＢ型肝炎ウイルスの治療薬のスクリーニング法を提供することである。前記課題は、本発明のＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子、及びＸ遺伝子を含むＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶレポーターベクター；並びに（１）ＨＢＶのコアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質、並びに（２）ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子、及びＸ遺伝子を含むＨＢＶのプレゲノムＲＮＡ、及び前記プレゲノムＲＮＡから合成されたマイナス鎖ＤＮＡ及びプラス鎖ＤＮＡからなる不完全環状二本鎖ＤＮＡ、を含む、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子によって解決することができる。
Description
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスレポーターベクター、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子、及びそれを用いたＢ型肝炎治療薬のスクリーニング方法に関する。本発明によれば、Ｂ型肝炎治療薬を効率よくスクリーニングすることができる。
現在、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、世界でおよそ３億人が感染しているとの報告がある。Ｂ型肝炎ウイルスの感染は急性および慢性の肝炎（Ｂ型肝炎）を引き起こし、さらには肝硬変、肝癌を引き起こすことが知られている。また、毎年３０万人がＢ型肝炎関連疾患で死亡していると報告されている。
Ｂ型肝炎ウイルスの治療薬としては、現在インターフェロン（ＩＦＮ）又は核酸アナログ製剤が使用されている。核酸アナログ製剤としては、ラミブジン（Lamivudine）、アデフォビル（Adefovir）、エンテカビル（Entecavir）、テノフォビル（Tenofovir）、テルビブジン（Telbivudine）、又はクレブジン（Clevudine）などが国内又は海外で使用されている。これらの治療薬によって、ウイルスを減少させることは可能だが、ウイルスの完全排除はできない。また、インターフェロンには、熱、全身倦怠感、関節痛、又は筋肉痛などの副作用が見られる。更に、核酸アナログ製剤は、ＨＢＶの増殖を抑えて肝炎を沈静化させることが可能だが、薬剤耐性株（変異株）と呼ばれる核酸アナログ製剤が効かないＨＢＶが出現することがある。このような耐性株が一旦出現すると肝炎のコントロールが困難となり、肝炎の急性増悪により死に至ることもある。従って、副作用が少なく、耐性株の出現のないＢ型肝炎治療薬の開発が期待されている。
「ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」（米国）２０１３年、第８７巻、ｐ．６６１５−６６２４
「プロス・ワン（ＰＬＯＳ ＯＮＥ）」（米国）２０１３年、第８巻、ｐ．ｅ６０３０６
例えば、非特許文献１にはＨＢＶ遺伝子のプレＳ１／ポリメレーススペーサー領域の２０７ｂｐの欠失を有するＨＢＶ変異株が高い複製能を有していることが記載され、この領域に、蛍光タンパク質であるＤｓＲｅｄを組込んだＨＢＶベクターが記載されている。また、非特許文献２には、ＨＢＶのコア遺伝子の下流に、インターナル・リボソーム・エントリー・サイト（ＩＲＥＳ）を挿入し、その後ろにＥＧＦＰ又はＲＬｕｃの遺伝子を組み込み、ＥＧＦＰ又はＲＬｕｃを発現させることのできるＨＢＶベクターが記載されている。
本発明者らは、Ｂ型肝炎ウイルスの治療薬のスクリーニング法について、鋭意研究を行い、非特許文献２に記載のように、ＨＢＶのポリメレース遺伝子にレポータータンパク質の遺伝子を組み込み、そのＨＢＶベクターを用いて、レポータータンパク質を発現するＨＢＶ様粒子の作成を試みた（比較例２）。しかしながら、得られたＨＢＶ様粒子は、レポータータンパク質の発現が悪く、薬剤のスクリーニングに使用することが困難であった。
従って、本発明の目的は、効率的なＢ型肝炎ウイルスの治療薬のスクリーニング法を提供することである。
本発明者らは、Ｂ型肝炎ウイルスの治療薬のスクリーニング法について、鋭意研究を行い、非特許文献２に記載のように、ＨＢＶのポリメレース遺伝子にレポータータンパク質の遺伝子を組み込み、そのＨＢＶベクターを用いて、レポータータンパク質を発現するＨＢＶ様粒子の作成を試みた（比較例２）。しかしながら、得られたＨＢＶ様粒子は、レポータータンパク質の発現が悪く、薬剤のスクリーニングに使用することが困難であった。
従って、本発明の目的は、効率的なＢ型肝炎ウイルスの治療薬のスクリーニング法を提供することである。
本発明者は、Ｂ型肝炎ウイルスの治療薬のスクリーニング法について、鋭意研究した結果、ＨＢＶ遺伝子のプレコア／コア遺伝子の一部をレポーター遺伝子に置換したＨＢＶレポーターベクターを用いて、ＨＢＶ様粒子を作製することに成功した。そして、そのＨＢＶ様粒子を、細胞に感染させることにより、驚くべきことに、十分にレポータータンパク質が発現し、その感染系を用いてＢ型肝炎ウイルスの治療薬のスクリーニングが可能であることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子、及びＸ遺伝子を含むＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶレポーターベクター、
［２］前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＤｓＲｅｄ遺伝子、及びそれらの改変体遺伝子からなる群から選択される１つ以上である、［１］に記載のＨＢＶレポーターベクター、
［３］前記ＨＢＶ遺伝子が３．６Ｋｂ以下である、［１］又は［２］に記載のＨＢＶレポーターベクター、
［４］前記ＨＢＶ遺伝子が、配列番号１、又は配列番号２で表される塩基配列のＨＢＶプレゲノムを産生できるＨＢＶ遺伝子である、［１］〜［３］のいずれかに記載のＨＢＶレポーターベクター、
［５］（１）ＨＢＶのコアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質、並びに（２）ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子、及びＸ遺伝子を含むＨＢＶのプレゲノムＲＮＡ、及び前記プレゲノムＲＮＡから合成されたマイナス鎖ＤＮＡ及びプラス鎖ＤＮＡからなる不完全環状二本鎖ＤＮＡ、を含む、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子、
［６］（１）［１］〜［４］のいずれかに記載のＨＢＶレポーターベクター、及び野生型ＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶヘルパーベクターを細胞にトランスフェクションする工程、及び（２）前記トランスフェクションされた細胞からＢ型肝炎ウイルス様粒子を回収する工程、を含むＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換されたプレゲノムＲＮＡを含むＢ型肝炎ウイルス様粒子の製造方法、
［７］前記細胞が、ＨｅｐＧ２細胞である［６］に記載のＢ型肝炎ウイルス様粒子の製造方法、
［８］［５］に記載のＢ型肝炎ウイルス様粒子が、感染した細胞、及び
［９］（ａ）［５］に記載のＢ型肝炎ウイルス様粒子を細胞に接触させる工程、（ｂ）試験物質と細胞とを接触させる工程、及び（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を分析する工程、を含む、Ｂ型肝炎に関与する物質のスクリーニング方法、
に関する。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子、及びＸ遺伝子を含むＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶレポーターベクター、
［２］前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＤｓＲｅｄ遺伝子、及びそれらの改変体遺伝子からなる群から選択される１つ以上である、［１］に記載のＨＢＶレポーターベクター、
［３］前記ＨＢＶ遺伝子が３．６Ｋｂ以下である、［１］又は［２］に記載のＨＢＶレポーターベクター、
［４］前記ＨＢＶ遺伝子が、配列番号１、又は配列番号２で表される塩基配列のＨＢＶプレゲノムを産生できるＨＢＶ遺伝子である、［１］〜［３］のいずれかに記載のＨＢＶレポーターベクター、
［５］（１）ＨＢＶのコアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質、並びに（２）ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子、及びＸ遺伝子を含むＨＢＶのプレゲノムＲＮＡ、及び前記プレゲノムＲＮＡから合成されたマイナス鎖ＤＮＡ及びプラス鎖ＤＮＡからなる不完全環状二本鎖ＤＮＡ、を含む、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子、
［６］（１）［１］〜［４］のいずれかに記載のＨＢＶレポーターベクター、及び野生型ＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶヘルパーベクターを細胞にトランスフェクションする工程、及び（２）前記トランスフェクションされた細胞からＢ型肝炎ウイルス様粒子を回収する工程、を含むＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換されたプレゲノムＲＮＡを含むＢ型肝炎ウイルス様粒子の製造方法、
［７］前記細胞が、ＨｅｐＧ２細胞である［６］に記載のＢ型肝炎ウイルス様粒子の製造方法、
［８］［５］に記載のＢ型肝炎ウイルス様粒子が、感染した細胞、及び
［９］（ａ）［５］に記載のＢ型肝炎ウイルス様粒子を細胞に接触させる工程、（ｂ）試験物質と細胞とを接触させる工程、及び（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を分析する工程、を含む、Ｂ型肝炎に関与する物質のスクリーニング方法、
に関する。
本発明のＨＢＶレポーターベクターによれば、細胞に感染してレポータータンパク質を発現させることのできるＨＢＶ様粒子を作製することができる。また、本発明のＨＢＶ様粒子は、様々な細胞に感染し、レポータータンパク質を発現することによって、感染の有無を容易に確認することが可能である。更に、ＨＢＶ様粒子が感染した細胞に、Ｂ型肝炎ウイルスの治療薬の候補化合物を作用させ、レポータータンパク質の発現の増減を確認することによって、容易にＢ型肝炎ウイルスの治療薬のスクリーニングが可能である。
［１］Ｂ型肝炎ウイルスレポーターベクター（ＨＢＶレポーターベクター）
本発明のＢ型肝炎ウイルスレポーターベクターは、ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子及びＸ遺伝子を含むＨＢＶ遺伝子を含む。
野生型のＨＢＶ遺伝子は、プレコア／コア遺伝子、ポリメレース遺伝子、プレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子、及びＸ遺伝子の４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする遺伝子を有している。プレコア／コア遺伝子の最後の領域と重複して読み枠の異なるポリメレース遺伝子のＯＲＦが存在する。また、プレＳ／Ｓ遺伝子のＯＲＦは、ポリメレース遺伝子のＯＲＦの領域に、読み枠の異なるＯＲＦとして含まれる。そして、ポリメレース遺伝子の最後の領域と重複して読み枠の異なるＸ遺伝子のＯＲＦが存在する。
本発明のＢ型肝炎ウイルスレポーターベクターは、ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子及びＸ遺伝子を含むＨＢＶ遺伝子を含む。
野生型のＨＢＶ遺伝子は、プレコア／コア遺伝子、ポリメレース遺伝子、プレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子、及びＸ遺伝子の４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする遺伝子を有している。プレコア／コア遺伝子の最後の領域と重複して読み枠の異なるポリメレース遺伝子のＯＲＦが存在する。また、プレＳ／Ｓ遺伝子のＯＲＦは、ポリメレース遺伝子のＯＲＦの領域に、読み枠の異なるＯＲＦとして含まれる。そして、ポリメレース遺伝子の最後の領域と重複して読み枠の異なるＸ遺伝子のＯＲＦが存在する。
（プレコア／コア／レポーター遺伝子）
本発明のＨＢＶレポーターベクターは、プレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子（以下、プレコア／コア／レポーター遺伝子と称することがある）を含む。
本明細書において「プレコア／コア／レポーター遺伝子を含む」とは、プレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子が、レポーター遺伝子が発現可能な状態でベクターに含まれることを意味する。すなわち、野生型プレコア／コア遺伝子の開始コドンを含み、インフレーム又はアウトフレームでレポーター遺伝子が結合されている。好ましくは、野生型プレコア／コア遺伝子の開始コドンから約５５アミノ酸に相当する遺伝子、より好ましくは約７０アミノ酸に相当する遺伝子がレポーター遺伝子の開始コドンの上流に位置するように配置すればよい。また、レポーター遺伝子に続いて、プレコア／コア遺伝子がインフレーム又はアウトフレームで結合されていてもよい。すなわち、レポーター遺伝子の終始コドンでプレコア／コア／レポーター遺伝子の翻訳が終了してもよく、アウトフレームで結合したプレコア／コア遺伝子の出現した終始コドンでプレコア／コア／レポーター遺伝子の翻訳が終了してもよく、インフレームで結合したプレコア／コア遺伝子の終始コドンでプレコア／コア／レポーター遺伝子の翻訳が終了してもよい。
本発明のＨＢＶレポーターベクターは、プレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子（以下、プレコア／コア／レポーター遺伝子と称することがある）を含む。
本明細書において「プレコア／コア／レポーター遺伝子を含む」とは、プレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子が、レポーター遺伝子が発現可能な状態でベクターに含まれることを意味する。すなわち、野生型プレコア／コア遺伝子の開始コドンを含み、インフレーム又はアウトフレームでレポーター遺伝子が結合されている。好ましくは、野生型プレコア／コア遺伝子の開始コドンから約５５アミノ酸に相当する遺伝子、より好ましくは約７０アミノ酸に相当する遺伝子がレポーター遺伝子の開始コドンの上流に位置するように配置すればよい。また、レポーター遺伝子に続いて、プレコア／コア遺伝子がインフレーム又はアウトフレームで結合されていてもよい。すなわち、レポーター遺伝子の終始コドンでプレコア／コア／レポーター遺伝子の翻訳が終了してもよく、アウトフレームで結合したプレコア／コア遺伝子の出現した終始コドンでプレコア／コア／レポーター遺伝子の翻訳が終了してもよく、インフレームで結合したプレコア／コア遺伝子の終始コドンでプレコア／コア／レポーター遺伝子の翻訳が終了してもよい。
（レポーター遺伝子）
プレコア／コア／レポーター遺伝子に含まれるレポーター遺伝子は、細胞内においてレポーターとして機能するタンパク質を発現できる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば薬剤耐性タンパク質、発光タンパク質、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子を挙げることができ、特には発光タンパク質、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子が好ましい。
発光タンパク質としては、ホタルルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、又はそれらを改変した改変体ルシフェラーゼを挙げることができる。改変体ルシフェラーゼとしては、例えば分子量が１９ｋＤａと小さいＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼを挙げることができる。
また、蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、又はそれらを改変した改変体ＧＦＰ、若しくは改変体ＤｓＲｅｄを挙げることができる。改変体ＧＦＰ又は改変体ＤｓＲｅｄとしては、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＳＢＰ２、ＥＢＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＴａｇＢＦＰ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＰ１、ＭｉＣｙ（Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ Ｃｙａｎ）、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＣＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＡＧ（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）、ｍＡＧ１、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ）、ＥＧＦＰ、ＧＰ２、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＥＹＦＰ、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ｔｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＫＯ１、ＫＯ（Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫＯ２、Ｋｅｉｍａ５７０、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＡｐｐｌｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ＴａｇＦＰ６３５、ｍＰｌｕｍ、ｅｇＦＰ６５０、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、又はｅｇＦＰ６７０を挙げることができる。
プレコア／コア／レポーター遺伝子に含まれるレポーター遺伝子は、細胞内においてレポーターとして機能するタンパク質を発現できる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば薬剤耐性タンパク質、発光タンパク質、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子を挙げることができ、特には発光タンパク質、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子が好ましい。
発光タンパク質としては、ホタルルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、又はそれらを改変した改変体ルシフェラーゼを挙げることができる。改変体ルシフェラーゼとしては、例えば分子量が１９ｋＤａと小さいＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼを挙げることができる。
また、蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、又はそれらを改変した改変体ＧＦＰ、若しくは改変体ＤｓＲｅｄを挙げることができる。改変体ＧＦＰ又は改変体ＤｓＲｅｄとしては、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＳＢＰ２、ＥＢＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＴａｇＢＦＰ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＰ１、ＭｉＣｙ（Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ Ｃｙａｎ）、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＣＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＡＧ（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）、ｍＡＧ１、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ）、ＥＧＦＰ、ＧＰ２、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＥＹＦＰ、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ｔｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＫＯ１、ＫＯ（Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫＯ２、Ｋｅｉｍａ５７０、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＡｐｐｌｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ＴａｇＦＰ６３５、ｍＰｌｕｍ、ｅｇＦＰ６５０、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、又はｅｇＦＰ６７０を挙げることができる。
（ポリメレース遺伝子）
本発明のＨＢＶレポーターベクターは、ポリメレース遺伝子を含んでもよい。本明細書において「ポリメレース遺伝子を含む」とは、ポリメレース遺伝子の全長を発現可能な状態で含むこと、ポリメレース遺伝子の一部を発現可能な状態で含むこと、及びポリメレース遺伝子を発現しない状態で含むこと、を意味する。
本発明のＨＢＶレポーターベクターに含まれるポリメレース遺伝子は、プレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換されることによって、ポリメレースタンパク質の開始コドンを欠失し、ポリメレースタンパク質の全長を発現しないポリメレース遺伝子であってもよい。すなわち、ポリメレース遺伝子に含まれる開始コドン以外のインフレームのＡＴＧから翻訳される短いポリメレースをコードするポリメレース遺伝子でもよく、ポリメレースタンパク質を全く発現しないように改変されたポリメレース遺伝子でもよい。
更に、前記レポーター遺伝子を、ポリメレースタンパク質の開始コドンを欠失しないように組み込む場合は、全長のポリメレースタンパク質を発現するポリメレース遺伝子でもよい。
本発明のＨＢＶレポーターベクターは、ポリメレース遺伝子を含んでもよい。本明細書において「ポリメレース遺伝子を含む」とは、ポリメレース遺伝子の全長を発現可能な状態で含むこと、ポリメレース遺伝子の一部を発現可能な状態で含むこと、及びポリメレース遺伝子を発現しない状態で含むこと、を意味する。
本発明のＨＢＶレポーターベクターに含まれるポリメレース遺伝子は、プレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換されることによって、ポリメレースタンパク質の開始コドンを欠失し、ポリメレースタンパク質の全長を発現しないポリメレース遺伝子であってもよい。すなわち、ポリメレース遺伝子に含まれる開始コドン以外のインフレームのＡＴＧから翻訳される短いポリメレースをコードするポリメレース遺伝子でもよく、ポリメレースタンパク質を全く発現しないように改変されたポリメレース遺伝子でもよい。
更に、前記レポーター遺伝子を、ポリメレースタンパク質の開始コドンを欠失しないように組み込む場合は、全長のポリメレースタンパク質を発現するポリメレース遺伝子でもよい。
（プレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子）
本発明のＨＢＶレポーターベクターは、プレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子を含むことができる。本明細書において「プレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子を含む」とは、レＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子の全長を発現可能な状態で含むこと、レＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子の一部を発現可能な状態で含むこと、及びレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子を発現しない状態で含むこと、を意味する。本発明のＨＢＶレポーターベクターに含まれるプレＳ／Ｓ遺伝子は、プレＳ１タンパク質、プレＳ２タンパク質、及びＳタンパク質の１つ以上を発現することのできるプレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子でもよく、プレＳ１タンパク質、プレＳ２タンパク質、及びＳタンパク質を発現しないように改変されたプレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子でもよい。
本発明のＨＢＶレポーターベクターは、プレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子を含むことができる。本明細書において「プレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子を含む」とは、レＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子の全長を発現可能な状態で含むこと、レＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子の一部を発現可能な状態で含むこと、及びレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子を発現しない状態で含むこと、を意味する。本発明のＨＢＶレポーターベクターに含まれるプレＳ／Ｓ遺伝子は、プレＳ１タンパク質、プレＳ２タンパク質、及びＳタンパク質の１つ以上を発現することのできるプレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子でもよく、プレＳ１タンパク質、プレＳ２タンパク質、及びＳタンパク質を発現しないように改変されたプレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子でもよい。
（Ｘ遺伝子）
本発明のＨＢＶレポーターベクターは、Ｘ遺伝子を含む。本明細書において「Ｘ遺伝子を含む」とは、Ｘ遺伝子が、発現可能な状態でベクターに含まれることを意味する。ＨＢＶ遺伝子に、Ｘ遺伝子が発現可能な状態でベクターに含まれない場合、比較例１に示すように、レポーター遺伝子からのレポータータンパク質の発現が抑制される。
Ｘ遺伝子から翻訳されるＸタンパク質は、転写因子や転写領域の活性、シグナル伝達活性の調節、そしてプロテオソーム活性など様々な作用を持つと考えられている。更に、コア遺伝子発現調節を介して、ウイルス増殖及び発癌にも大きく関わっていると考えられる。
本発明のＨＢＶレポーターベクターは、Ｘ遺伝子を含む。本明細書において「Ｘ遺伝子を含む」とは、Ｘ遺伝子が、発現可能な状態でベクターに含まれることを意味する。ＨＢＶ遺伝子に、Ｘ遺伝子が発現可能な状態でベクターに含まれない場合、比較例１に示すように、レポーター遺伝子からのレポータータンパク質の発現が抑制される。
Ｘ遺伝子から翻訳されるＸタンパク質は、転写因子や転写領域の活性、シグナル伝達活性の調節、そしてプロテオソーム活性など様々な作用を持つと考えられている。更に、コア遺伝子発現調節を介して、ウイルス増殖及び発癌にも大きく関わっていると考えられる。
（ＨＢＶ遺伝子）
本発明のＨＢＶレポーターベクターに含まれるＨＢＶ遺伝子は、限定されるものではないが、プレコア／コア／レポーター遺伝子及びＸ遺伝子に加えて、好ましくはポリメレース遺伝子及び／又はプレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子を含む。このＨＢＶレポーターベクターに含まれるポリメレース遺伝子及び／又はプレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子は、前記のようにポリメレース遺伝子及び／又はプレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子を発現する状態で含んでもよく、一部又は全部を発現しない状態で含んでもよい。ＨＢＶ遺伝子の実施態様として、配列番号１又は２で表されるＨＢＶ遺伝子を挙げることができる。配列番号１で表されるＨＢＶ遺伝子は、レポーター遺伝子としてＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子を含み、配列番号２で表されるＨＢＶ遺伝子は、レポーター遺伝子としてＤｓＲｅｄ遺伝子を含む。なお、配列番号１又は２で表される塩基配列は、プレゲノムＲＮＡへの転写を促進するため、ＨＢＶ遺伝子のプレコア／コア遺伝子の上流からプレコア／コアをコードする遺伝子にかけての約６００塩基の塩基配列を頭部と尾部とに重複して含み、更に尾部の配列は、プレコア／コアをコードする遺伝子を含んでいる。これらの頭部と尾部の塩基配列のすべてが、プレゲノムＲＮＡの転写のために必須ではないが、重複した配列を含むことによって、プレゲノムＲＮＡへの転写が促進される。
本明細書において「ＨＢＶ遺伝子を含む」とは、ＨＢＶのプレゲノムＲＮＡを産生できるＨＢＶ遺伝子構造を含むことを意味する。従って本明細書において「配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列のＨＢＶプレゲノムを産生できるＨＢＶ遺伝子である」とは、配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列における少なくともＨＢＶのプレゲノムＲＮＡを産生できるＨＢＶ遺伝子構造を含むことを意味する。
本発明のＨＢＶレポーターベクターに含まれるＨＢＶ遺伝子は、限定されるものではないが、プレコア／コア／レポーター遺伝子及びＸ遺伝子に加えて、好ましくはポリメレース遺伝子及び／又はプレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子を含む。このＨＢＶレポーターベクターに含まれるポリメレース遺伝子及び／又はプレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子は、前記のようにポリメレース遺伝子及び／又はプレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子を発現する状態で含んでもよく、一部又は全部を発現しない状態で含んでもよい。ＨＢＶ遺伝子の実施態様として、配列番号１又は２で表されるＨＢＶ遺伝子を挙げることができる。配列番号１で表されるＨＢＶ遺伝子は、レポーター遺伝子としてＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子を含み、配列番号２で表されるＨＢＶ遺伝子は、レポーター遺伝子としてＤｓＲｅｄ遺伝子を含む。なお、配列番号１又は２で表される塩基配列は、プレゲノムＲＮＡへの転写を促進するため、ＨＢＶ遺伝子のプレコア／コア遺伝子の上流からプレコア／コアをコードする遺伝子にかけての約６００塩基の塩基配列を頭部と尾部とに重複して含み、更に尾部の配列は、プレコア／コアをコードする遺伝子を含んでいる。これらの頭部と尾部の塩基配列のすべてが、プレゲノムＲＮＡの転写のために必須ではないが、重複した配列を含むことによって、プレゲノムＲＮＡへの転写が促進される。
本明細書において「ＨＢＶ遺伝子を含む」とは、ＨＢＶのプレゲノムＲＮＡを産生できるＨＢＶ遺伝子構造を含むことを意味する。従って本明細書において「配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列のＨＢＶプレゲノムを産生できるＨＢＶ遺伝子である」とは、配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列における少なくともＨＢＶのプレゲノムＲＮＡを産生できるＨＢＶ遺伝子構造を含むことを意味する。
本発明のＨＢＶレポーターベクターに含まれるＨＢＶ遺伝子の長さは、限定されるものではないが、好ましくは３．６Ｋｂ以下であり、より好ましくは３．５ｋｂ以下であり、更に好ましくは３．４ｋｂ以下である。ＨＢＶ遺伝子の長さが、３．６ｋｂを超える場合、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子に含まれるプレゲノムＲＮＡ、及び不完全環状二本鎖ＤＮＡが大きくなり、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の形成が阻害される可能性がある。
また、ＨＢＶ遺伝子の配列は、後述のＢ型肝炎ウイルス様粒子に含まれるプレゲノムＲＮＡ、及びそれから合成される不完全環状二本鎖ＤＮＡとして機能する限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば配列番号１で表される塩基配列からＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼをコードする塩基配列を除いた塩基配列に対して、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性を示し、且つプレゲノムＲＮＡの機能を有するものである。また、配列番号２で表される塩基配列からＤｓＲｅｄをコードする塩基配列を除いた塩基配列に対して、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性を示し、且つプレゲノムＲＮＡの機能を有するものである。本明細書において「プレゲノムＲＮＡの機能を有する」とは、感染細胞内において、プレゲノムＲＮＡ由来の完全環状二本鎖ＤＮＡから、ｍＲＮＡが合成され、レポータータンパク質が感染細胞内において発現することを意味する。
また、ＨＢＶ遺伝子の配列は、後述のＢ型肝炎ウイルス様粒子に含まれるプレゲノムＲＮＡ、及びそれから合成される不完全環状二本鎖ＤＮＡとして機能する限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば配列番号１で表される塩基配列からＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼをコードする塩基配列を除いた塩基配列に対して、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性を示し、且つプレゲノムＲＮＡの機能を有するものである。また、配列番号２で表される塩基配列からＤｓＲｅｄをコードする塩基配列を除いた塩基配列に対して、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性を示し、且つプレゲノムＲＮＡの機能を有するものである。本明細書において「プレゲノムＲＮＡの機能を有する」とは、感染細胞内において、プレゲノムＲＮＡ由来の完全環状二本鎖ＤＮＡから、ｍＲＮＡが合成され、レポータータンパク質が感染細胞内において発現することを意味する。
本発明のＨＢＶレポーターベクターの骨格となるベクターは、本技術分野において、通常、発現ベクターとして使用されているものであれば、特に制限なく使用することができる。例えば、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、又はウイルスベクターを挙げることができる。プラスミドベクターとしては、例えばｐＵＣ系ベクターを挙げることができる。
これらの骨格となるベクターに、前記プレコア／コア／レポーター遺伝子及びＸ遺伝子を発現可能な状態で含むＨＢＶ遺伝子を挿入することによって、本発明のＨＢＶレポーターベクターを得ることができる。
これらの骨格となるベクターに、前記プレコア／コア／レポーター遺伝子及びＸ遺伝子を発現可能な状態で含むＨＢＶ遺伝子を挿入することによって、本発明のＨＢＶレポーターベクターを得ることができる。
［２］Ｂ型肝炎ウイルス様粒子（ＨＢＶ様粒子）
本発明のＢ型肝炎ウイルス様粒子（以下、ＨＢＶ様粒子と称することがある）は（１）ＨＢＶのコアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質、並びに（２）ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子、及びＸ遺伝子を含むＨＢＶのプレゲノムＲＮＡ、及び前記プレゲノムＲＮＡから合成されたマイナス鎖ＤＮＡ及びプラス鎖ＤＮＡからなる不完全環状二本鎖ＤＮＡ、を含む。
本発明のＢ型肝炎ウイルス様粒子（以下、ＨＢＶ様粒子と称することがある）は（１）ＨＢＶのコアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質、並びに（２）ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子、及びＸ遺伝子を含むＨＢＶのプレゲノムＲＮＡ、及び前記プレゲノムＲＮＡから合成されたマイナス鎖ＤＮＡ及びプラス鎖ＤＮＡからなる不完全環状二本鎖ＤＮＡ、を含む。
（コアタンパク質）
コアタンパク質は、ＨＢＶ様粒子の中で球形のコア粒子を形成し、プレゲノムＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼ（ポリメラーゼタンパク質）を、そのコア粒子内に取り込む。本発明のＢ型肝炎ウイルス様粒子においては、コアタンパク質は、野生型のＨＢＶヘルパーベクターから供給される。
コアタンパク質は、ＨＢＶ様粒子の中で球形のコア粒子を形成し、プレゲノムＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼ（ポリメラーゼタンパク質）を、そのコア粒子内に取り込む。本発明のＢ型肝炎ウイルス様粒子においては、コアタンパク質は、野生型のＨＢＶヘルパーベクターから供給される。
（ポリメレースタンパク質）
ポリメレースタンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、ＨＢＶ様粒子の中のコア粒子に、プレゲノムＲＮＡとともに含まれる。逆転写活性も有しており、プレゲノムＲＮＡからウイルスＤＮＡのマイナス（−）鎖を合成し、更にこのマイナス（−）鎖を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ活性によりウイルスＤＮＡのプラス（＋）鎖を合成し、不完全環状二本鎖ＤＮＡを作製することができる。本発明のＢ型肝炎ウイルス様粒子においては、ポリメレースタンパク質は、本発明のＨＢＶレポーターベクターから供給されてもよく、野生型のＨＢＶヘルパーベクターから供給されてもよい。
ポリメレースタンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、ＨＢＶ様粒子の中のコア粒子に、プレゲノムＲＮＡとともに含まれる。逆転写活性も有しており、プレゲノムＲＮＡからウイルスＤＮＡのマイナス（−）鎖を合成し、更にこのマイナス（−）鎖を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ活性によりウイルスＤＮＡのプラス（＋）鎖を合成し、不完全環状二本鎖ＤＮＡを作製することができる。本発明のＢ型肝炎ウイルス様粒子においては、ポリメレースタンパク質は、本発明のＨＢＶレポーターベクターから供給されてもよく、野生型のＨＢＶヘルパーベクターから供給されてもよい。
（ラージＳタンパク質）
本発明のＢ型肝炎ウイルス様粒子に含まれるラージＳタンパク質は、プレＳ１タンパク質、プレＳ２タンパク質、及びＳタンパク質からなるタンパク質である。ラージＳタンパク質は、ＨＢＶ様粒子のエンベロープを形成するタンパク質であり、ＨＢＶ様粒子と細胞のレセプターとの結合に関与する。本発明のＢ型肝炎ウイルス様粒子においては、ラージＳタンパク質は、本発明のＨＢＶレポーターベクターから供給されてもよく、野生型のＨＢＶヘルパーベクターから供給されてもよい。
本発明のＢ型肝炎ウイルス様粒子に含まれるラージＳタンパク質は、プレＳ１タンパク質、プレＳ２タンパク質、及びＳタンパク質からなるタンパク質である。ラージＳタンパク質は、ＨＢＶ様粒子のエンベロープを形成するタンパク質であり、ＨＢＶ様粒子と細胞のレセプターとの結合に関与する。本発明のＢ型肝炎ウイルス様粒子においては、ラージＳタンパク質は、本発明のＨＢＶレポーターベクターから供給されてもよく、野生型のＨＢＶヘルパーベクターから供給されてもよい。
前記コアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質のアミノ酸配列は、それらのタンパク質の基本的な機能を有している限りにおいて、限定されるものではない。すなわち、ＨＢＶ粒子を形成することが可能であり、細胞への感染能を有するウイルス様粒子を形成することのできる、コアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質を限定することなく用いることができる。具体的には、配列番号６〜８で表されたコアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質のそれぞれのアミノ酸配列に対して、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性を有するコアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質を用いることができる。なお、配列番号９にＨＢＶのＸタンパク質のアミノ酸配列を示す。
（プレゲノムＲＮＡ）
本発明のＨＢＶ様粒子は、プレゲノムＲＮＡを含む。本発明のＨＢＶ様粒子に含まれるプレゲノムＲＮＡは、本発明のＨＢＶレポーターベクターに含まれるＨＢＶ遺伝子由来のｍＲＮＡである。すなわち、プレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子及びＸ遺伝子を含むＨＢＶ遺伝子のｍＲＮＡである。プレゲノムＲＮＡは、ポリメレース遺伝子のＲＮＡ、及びプレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子を発現する状態で含んでもよく、発現しない状態で含んでもよい。プレゲノムＲＮＡは、前記ＨＢＶレポーターベクターから合成され、前記コア粒子の中に取り込まれる。
本発明のＨＢＶ様粒子は、プレゲノムＲＮＡを含む。本発明のＨＢＶ様粒子に含まれるプレゲノムＲＮＡは、本発明のＨＢＶレポーターベクターに含まれるＨＢＶ遺伝子由来のｍＲＮＡである。すなわち、プレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子及びＸ遺伝子を含むＨＢＶ遺伝子のｍＲＮＡである。プレゲノムＲＮＡは、ポリメレース遺伝子のＲＮＡ、及びプレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子を発現する状態で含んでもよく、発現しない状態で含んでもよい。プレゲノムＲＮＡは、前記ＨＢＶレポーターベクターから合成され、前記コア粒子の中に取り込まれる。
（不完全環状二本鎖ＤＮＡ）
本発明のＨＢＶ様粒子は、不完全環状二本鎖ＤＮＡを含む。本発明のＨＢＶ様粒子に含まれる不完全環状二本鎖ＤＮＡは、前記プレゲノムＲＮＡから、ＤＮＡポリメレースの逆転写活性により合成されたマイナス（−）鎖ＤＮＡ、及びＤＮＡポリメラーゼ活性によりマイナス（−）鎖を鋳型として合成されたプラス（＋）鎖ＤＮＡからなる。このウイルスＤＮＡの合成は、途中で停止するために、不完全環状二本鎖ＤＮＡとなる。この不完全環状二本鎖ＤＮＡは、コア粒子の中に含まれる。
なお、本発明のＨＢＶ様粒子が、細胞に感染すると、核内で完全閉鎖二本鎖ＤＮＡ（covalenty closed circular DNA：cccDNA）に変換される。
本発明のＨＢＶ様粒子は、不完全環状二本鎖ＤＮＡを含む。本発明のＨＢＶ様粒子に含まれる不完全環状二本鎖ＤＮＡは、前記プレゲノムＲＮＡから、ＤＮＡポリメレースの逆転写活性により合成されたマイナス（−）鎖ＤＮＡ、及びＤＮＡポリメラーゼ活性によりマイナス（−）鎖を鋳型として合成されたプラス（＋）鎖ＤＮＡからなる。このウイルスＤＮＡの合成は、途中で停止するために、不完全環状二本鎖ＤＮＡとなる。この不完全環状二本鎖ＤＮＡは、コア粒子の中に含まれる。
なお、本発明のＨＢＶ様粒子が、細胞に感染すると、核内で完全閉鎖二本鎖ＤＮＡ（covalenty closed circular DNA：cccDNA）に変換される。
本発明のＨＢＶ様粒子は、後述の「Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の製造方法」に記載のように、本発明のＨＢＶレポーターベクター及び野生型のＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶヘルパーベクターを細胞にコトランスフェクションすることによって製造することができる。プレゲノムＲＮＡ及び不完全環状二本鎖ＤＮＡは、本発明のＨＢＶレポーターベクターから供給され、コアタンパク質は、ＨＢＶヘルパーベクターから供給される。また、ポリメレースタンパク質、又はラージＳタンパク質は、ＨＢＶレポーターベクター由来のものでもよく、ＨＢＶヘルパーベクター由来のものでもよい。
［３］Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の製造方法
本発明のＢ型肝炎ウイルス様粒子の製造方法は、（１）ＨＢＶレポーターベクター、及び野生型ＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶヘルパーベクターを細胞にトランスフェクションする工程、及び（２）前記トランスフェクションされた細胞からＢ型肝炎ウイルス様粒子を回収する工程、を含む。得られるＢ型肝炎ウイルス様粒子は、ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換されたプレゲノムＲＮＡを含む。
本発明のＢ型肝炎ウイルス様粒子の製造方法は、（１）ＨＢＶレポーターベクター、及び野生型ＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶヘルパーベクターを細胞にトランスフェクションする工程、及び（２）前記トランスフェクションされた細胞からＢ型肝炎ウイルス様粒子を回収する工程、を含む。得られるＢ型肝炎ウイルス様粒子は、ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換されたプレゲノムＲＮＡを含む。
《トランスフェクション工程》
本発明のトランスフェクション工程において用いられるＨＢＶレポーターベクターとしては、本発明のＨＢＶレポーターベクターを用いることができる。
本発明のトランスフェクション工程において用いられるＨＢＶレポーターベクターとしては、本発明のＨＢＶレポーターベクターを用いることができる。
（ＨＢＶヘルパーベクター）
本発明のトランスフェクション工程において用いられるＨＢＶヘルパーベクターは、少なくとも野生型のコアタンパク質を発現するベクターである。ＨＢＶレポーターベクターは、コアタンパク質を発現することができないからである。また、ＨＢＶレポーターベクターが、ポリメレースタンパク質を発現できないベクターの場合は、ＨＢＶヘルパーベクターは野生型のポリメレースタンパク質を発現できるベクターを用いる。更に、ＨＢＶレポーターベクターが、ラージＳタンパク質を発現できないベクターの場合は、ＨＢＶヘルパーベクターは野生型のラージＳタンパク質を発現できるベクターを用いる。従って、ＨＢＶヘルパーベクターは、コアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質（プレＳ１／プレＳ２／Ｓタンパク質）を発現できるベクターが好ましく、更にＸタンパク質を発現できるベクターが好ましい。従って、野生型のＨＢＶ遺伝子をそのまま含むベクターが最も好ましい。
本発明のトランスフェクション工程において用いられるＨＢＶヘルパーベクターは、少なくとも野生型のコアタンパク質を発現するベクターである。ＨＢＶレポーターベクターは、コアタンパク質を発現することができないからである。また、ＨＢＶレポーターベクターが、ポリメレースタンパク質を発現できないベクターの場合は、ＨＢＶヘルパーベクターは野生型のポリメレースタンパク質を発現できるベクターを用いる。更に、ＨＢＶレポーターベクターが、ラージＳタンパク質を発現できないベクターの場合は、ＨＢＶヘルパーベクターは野生型のラージＳタンパク質を発現できるベクターを用いる。従って、ＨＢＶヘルパーベクターは、コアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質（プレＳ１／プレＳ２／Ｓタンパク質）を発現できるベクターが好ましく、更にＸタンパク質を発現できるベクターが好ましい。従って、野生型のＨＢＶ遺伝子をそのまま含むベクターが最も好ましい。
トランスフェクション工程においては、ＨＢＶレポーターベクターと、ＨＢＶヘルパーベクターとを細胞にコトランスフェクションさせる。コトランスフェクションによって、例えば、ＨＢＶレポーターベクター由来のプレゲノムＲＮＡ及び不完全環状二本鎖ＤＮＡと、ＨＢＶヘルパーベクター由来のコアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質とが、組み換えを起こすことによって、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子を得ることができる。
トランスフェクションは、公知の方法を用いることができる。例えば、トランスフェクション試薬を用いてもよい。あるいは、エレクトロポレーションによって、ＨＢＶレポーターベクターと、ＨＢＶヘルパーベクターとを細胞にトランスフェクションしてもよい。
トランスフェクションは、公知の方法を用いることができる。例えば、トランスフェクション試薬を用いてもよい。あるいは、エレクトロポレーションによって、ＨＢＶレポーターベクターと、ＨＢＶヘルパーベクターとを細胞にトランスフェクションしてもよい。
トランスフェクションに用いる細胞は、ＨＢＶウイルスの複製、タンパク質の発現が起きる限りにおいて限定されるものではないが、肝臓由来の細胞が好ましい、例えば、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、Ｈｕｈ６細胞、Ａｌｅｘ細胞、ＰＨ５ＣＨ細胞、ＫＹＮ−１細胞、ＨＡＫ６細胞、ＨＡＫ５細胞、ＨＡＫ１Ｂ細胞、ＨＡＫ１Ａ細胞、又はＫｉｍ−１細胞を用いることができる。
（ウイルス様粒子回収工程）
トランスフェクション後、細胞を例えば１〜７日程度培養し、培養上清からウイルス様粒子を回収する。ウイルス様粒子の回収は、公知の方法を用いることができる。例えば、ポリエチレングリコールによりウイルスを沈殿させ、遠心分離により沈殿を回収する、得られた沈殿を、Ｈｅｐｅｓバッファーに溶解させ、２０％スクロースに重層して、超遠心機により遠心分離することにより、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子を得ることができる。
トランスフェクション後、細胞を例えば１〜７日程度培養し、培養上清からウイルス様粒子を回収する。ウイルス様粒子の回収は、公知の方法を用いることができる。例えば、ポリエチレングリコールによりウイルスを沈殿させ、遠心分離により沈殿を回収する、得られた沈殿を、Ｈｅｐｅｓバッファーに溶解させ、２０％スクロースに重層して、超遠心機により遠心分離することにより、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子を得ることができる。
［４］スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、（ａ）前記Ｂ型肝炎ウイルス様粒子を細胞に接触させる工程、（ｂ）試験物質と細胞とを接触させる工程、及び（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を分析する工程、を含む。
本発明のスクリーニング方法は、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子が感染した細胞をスクリーニングのツールとして用い、Ｂ型肝炎の感染を修飾（例えば、抑制又は促進）する物質を選択するものである。従って、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子を細胞に感染させる工程（ａ）、及び試験物質を細胞と接触させる工程（ｂ）を行う。ここで、前記感染工程（ａ）及び接触工程（ｂ）は、いずれかの工程を先に行ってもよく、２つの工程を同時に行ってもよい。従って、各工程の順番の態様としては、感染工程（ａ）及び接触工程（ｂ）の順に行う態様、接触工程（ｂ）及び感染工程（ａ）の順に行う態様、又は感染工程（ａ）及び接触工程（ｂ）を同時に行う態様がある。
また、本発明のスクリーニング方法は、Ｂ型肝炎の感染を修飾（抑制又は促進）する物質を選択するものであり、従って試験物質によって、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の感染、又は増殖が、抑制又は促進されることを分析する工程（ｃ）を行う。具体的には、レポーター遺伝子の発現を分析して、コントロールと比較して、レポーター遺伝子の発現の増加又は減少を分析することができる。
本発明のスクリーニング方法は、（ａ）前記Ｂ型肝炎ウイルス様粒子を細胞に接触させる工程、（ｂ）試験物質と細胞とを接触させる工程、及び（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を分析する工程、を含む。
本発明のスクリーニング方法は、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子が感染した細胞をスクリーニングのツールとして用い、Ｂ型肝炎の感染を修飾（例えば、抑制又は促進）する物質を選択するものである。従って、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子を細胞に感染させる工程（ａ）、及び試験物質を細胞と接触させる工程（ｂ）を行う。ここで、前記感染工程（ａ）及び接触工程（ｂ）は、いずれかの工程を先に行ってもよく、２つの工程を同時に行ってもよい。従って、各工程の順番の態様としては、感染工程（ａ）及び接触工程（ｂ）の順に行う態様、接触工程（ｂ）及び感染工程（ａ）の順に行う態様、又は感染工程（ａ）及び接触工程（ｂ）を同時に行う態様がある。
また、本発明のスクリーニング方法は、Ｂ型肝炎の感染を修飾（抑制又は促進）する物質を選択するものであり、従って試験物質によって、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の感染、又は増殖が、抑制又は促進されることを分析する工程（ｃ）を行う。具体的には、レポーター遺伝子の発現を分析して、コントロールと比較して、レポーター遺伝子の発現の増加又は減少を分析することができる。
《感染工程（ａ）》
本発明のスクリーニング方法における感染工程（ａ）は、ＨＢＶ様粒子の感染が起きる限りにおいて限定されるものではないが、細胞にＨＢＶ様粒子を接触させることによって行うことができる。感染細胞数、ウイルス様粒子量、及び培地は、細胞の種類などに応じて、適宜決定することが可能である。
本発明のスクリーニング方法における感染工程（ａ）は、ＨＢＶ様粒子の感染が起きる限りにおいて限定されるものではないが、細胞にＨＢＶ様粒子を接触させることによって行うことができる。感染細胞数、ウイルス様粒子量、及び培地は、細胞の種類などに応じて、適宜決定することが可能である。
（感染細胞）
感染に用いる細胞は、ＨＢＶ様粒子が侵入し、レポーター遺伝子が発現する限りにおいて限定されるものではないが、肝臓由来細胞が好ましく、例えばＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、Ｈｕｈ６細胞、Ａｌｅｘ細胞、ＰＨ５ＣＨ細胞、ＫＹＮ−１細胞、ＨＡＫ６細胞、ＨＡＫ５細胞、ＨＡＫ１Ｂ細胞、ＨＡＫ１Ａ細胞、Ｋｉｍ−１細胞、ヒト初代肝臓細胞、又はヒト初代肝臓細胞を実験動物で継代した細胞などを用いることができる。ヒト初代肝臓細胞を実験動物で継代した細胞として、例えばフェニックスバイオ社から販売されているＰＸＢ細胞を用いることができる。
感染細胞においては、本発明のＨＢＶ様ウイルスに含まれている不完全環状二本鎖ＤＮＡから完全環状二本鎖ＤＮＡが合成される。そして完全環状二本鎖ＤＮＡから、ｍＲＮＡ及びプレゲノムＲＮＡが合成され、レポーター遺伝子からレポータータンパク質が翻訳されると考えられる。
感染に用いる細胞は、ＨＢＶ様粒子が侵入し、レポーター遺伝子が発現する限りにおいて限定されるものではないが、肝臓由来細胞が好ましく、例えばＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、Ｈｕｈ６細胞、Ａｌｅｘ細胞、ＰＨ５ＣＨ細胞、ＫＹＮ−１細胞、ＨＡＫ６細胞、ＨＡＫ５細胞、ＨＡＫ１Ｂ細胞、ＨＡＫ１Ａ細胞、Ｋｉｍ−１細胞、ヒト初代肝臓細胞、又はヒト初代肝臓細胞を実験動物で継代した細胞などを用いることができる。ヒト初代肝臓細胞を実験動物で継代した細胞として、例えばフェニックスバイオ社から販売されているＰＸＢ細胞を用いることができる。
感染細胞においては、本発明のＨＢＶ様ウイルスに含まれている不完全環状二本鎖ＤＮＡから完全環状二本鎖ＤＮＡが合成される。そして完全環状二本鎖ＤＮＡから、ｍＲＮＡ及びプレゲノムＲＮＡが合成され、レポーター遺伝子からレポータータンパク質が翻訳されると考えられる。
《接触工程（ｂ）》
接触工程（ｂ）は、試験物質と細胞とを接触させる工程であり、感染工程（ａ）の前に接触工程（ｂ）を行ってもよく、感染工程（ａ）の後に接触工程（ｂ）を行ってもよく、感染工程（ａ）と接触工程（ｂ）とを同時に行ってもよい。
試験物質は、ＨＢＶの感染を修飾する可能性のある物質、又はそのような物質を含むものである限りにおいて限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群、又は低分子化合物を用いることができる。また、微生物の培養上清、細胞の培養上清、生体内の体液、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。
接触工程（ｂ）は、試験物質と細胞とを接触させる工程であり、感染工程（ａ）の前に接触工程（ｂ）を行ってもよく、感染工程（ａ）の後に接触工程（ｂ）を行ってもよく、感染工程（ａ）と接触工程（ｂ）とを同時に行ってもよい。
試験物質は、ＨＢＶの感染を修飾する可能性のある物質、又はそのような物質を含むものである限りにおいて限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群、又は低分子化合物を用いることができる。また、微生物の培養上清、細胞の培養上清、生体内の体液、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。
接触工程における細胞と試験物質との接触のタイミング、すなわち、試験物質の添加の時期は、特に限定されるものではない。例えば、感染工程（ａ）の前に接触工程（ｂ）を行う場合、感染前の任意の時期（例えば１時間〜５日前）に接触させてもよく、接触の回数及試験物質の量も適宜決定することができる。同様に、感染工程（ａ）の後に接触工程（ｂ）を行う場合も、感染後に任意の時期（例えば１時間後〜５日後）に接触させてもよく、接触の回数、及び試験物質の量も適宜決定することができる。
《分析工程（ｃ）》
本発明における分析工程（ｃ）は、前記レポーター遺伝子の発現を分析する工程である。
遺伝子の発現の分析は、特に限定されるものではないが、例えばｍＲＮＡの合成量を分析してもよく、ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質量を分析してもよいが、本スクリーニング系では、発光タンパク質又は蛍光タンパク質の発現量を発光量又は蛍光量で分析できるため、タンパク質量の分析が、容易で正確に分析可能である。すなわち、試験物質を添加してないコントロールと比較して、特定の発光又は蛍光タンパク質の量が減少していれば、ＨＢＶウイルスの感染が抑制されたと判断され、発光又は蛍光タンパク質の量が増加していれば、ＨＢＶウイルスの感染が促進されたと判断される。発光又は蛍光タンパク質の量は、例えば測定キットを用いて測定することができる。更に蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、又は多光子レーザー顕微鏡で測定することも可能である。
本発明における分析工程（ｃ）は、前記レポーター遺伝子の発現を分析する工程である。
遺伝子の発現の分析は、特に限定されるものではないが、例えばｍＲＮＡの合成量を分析してもよく、ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質量を分析してもよいが、本スクリーニング系では、発光タンパク質又は蛍光タンパク質の発現量を発光量又は蛍光量で分析できるため、タンパク質量の分析が、容易で正確に分析可能である。すなわち、試験物質を添加してないコントロールと比較して、特定の発光又は蛍光タンパク質の量が減少していれば、ＨＢＶウイルスの感染が抑制されたと判断され、発光又は蛍光タンパク質の量が増加していれば、ＨＢＶウイルスの感染が促進されたと判断される。発光又は蛍光タンパク質の量は、例えば測定キットを用いて測定することができる。更に蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、又は多光子レーザー顕微鏡で測定することも可能である。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：ＮＬ−ｐｒｅＣベクター》
本実施例では、ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子にＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子を組み込み、ポリメラーゼタンパク質のＮ末の一部を欠失したＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶレポーターベクター（ＮＬ−ｐｒｅＣ）を構築した。更に、得られたベクター及び野生型ＨＢＶベクターを用いて、ＨＢＶ様粒子を産生した。
（１）ベクターの構築
ＰＵＣ１．２ｘＨＢＶベクター（配列番号５）を鋳型として、以下の２つのプライマー及びKOD enzymeを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲフラグメント１を得た。
Primer H f：ATTACGCCAAGCTTgacgtcctttgtctacgtc（配列番号１０）
Primer NL r：CTTCGAGTGTGAAGACcattttggtttttctttgaggcggtgtcgaggagatctcg（配列番号１１）
次に、ｐＮＬ２．１ Ｎ１０６１（Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型として、以下の２つのプライマー及びＫＯＤ ｅｎｚｙｍｅを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲフラグメント２を得た。
Primer NL f：attcgagatctcctcgacaccgcctcaaagaaaaaccaaaatgGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGAC（配列番号１２）
Primers A r：taactgtaagagggcccCTACGCCAGAATGCGTTCGCACAGCCGC（配列番号１３）
得られたＰＣＲフラグメント１及びＰＣＲフラグメント２を混合したものを鋳型とし、前記Primer H f、Primers A r及びKOD enzymeを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行った。得られたフラグメントをＰＣＲフラグメント３と称する。
ＰＣＲフラグメント３をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩで切断し、ＰＵＣ１．２ｘＨＢＶベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ部位に組み込み、ＮＬ−ｐｒｅＣベクターを得た（図１Ｂ）。
（２）ＨＢＶ様粒子の産生
ＨｅｐＧ２細胞を用いて、ウイルス様粒子の産生を行った。
４ｘ１０６のＨｅｐＧ２細胞を１０ｃｍプレートに撒種した。一日後、トランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１ ｒｅａｇｅｎｔ：Ｍｉｒｕｓ社）を用い、ＨｅｐＧ２細胞にＨＢＶプラスミドを導入した。１０００μＬのＯＰＴ−ＭＥＭに３０μＬのＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１を混合し、室温で１０分放置し、トランスフェクション用液を調製した。７．５μＬのＰＵＣ１．２ｘＨＢＶ（７．５μｇ）及び７．５μＬのＮＬ−ｐｒｅＣベクター（７．５μｇ）を混合し、更に前記のトランスフェクション用液１０００μＬを加えて、混合した。混合液を室温に３０分放置し、培養液を除いたＨｅｐＧ２細胞に滴下した。培養液を加え、４８時間後培養後に、培養液を回収した。
培養液を８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、上清を回収し、４５ｕｍフィルターでろ過した。回収した上清に、２６％ポリエチレングリコール（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を等量加えて、４℃で１２時間静置し、ウイルスを沈殿させた。沈殿物を含む液を、８，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、ウイルス様粒子を含む沈殿物を得た。沈殿物を、１ｍｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．６：０．１％アルブミン含有）に溶解した。溶解液を２０％スクロース溶液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ：ｐＨ７．６）に重層して、超遠心機を用いて、３，５０００ｒｐｍで、３時間遠心分離した。得られた沈殿物をＯＰＴ−ＭＥＭに懸濁して、ウイルス様粒子として用いた。
本実施例では、ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子にＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子を組み込み、ポリメラーゼタンパク質のＮ末の一部を欠失したＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶレポーターベクター（ＮＬ−ｐｒｅＣ）を構築した。更に、得られたベクター及び野生型ＨＢＶベクターを用いて、ＨＢＶ様粒子を産生した。
（１）ベクターの構築
ＰＵＣ１．２ｘＨＢＶベクター（配列番号５）を鋳型として、以下の２つのプライマー及びKOD enzymeを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲフラグメント１を得た。
Primer H f：ATTACGCCAAGCTTgacgtcctttgtctacgtc（配列番号１０）
Primer NL r：CTTCGAGTGTGAAGACcattttggtttttctttgaggcggtgtcgaggagatctcg（配列番号１１）
次に、ｐＮＬ２．１ Ｎ１０６１（Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型として、以下の２つのプライマー及びＫＯＤ ｅｎｚｙｍｅを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲフラグメント２を得た。
Primer NL f：attcgagatctcctcgacaccgcctcaaagaaaaaccaaaatgGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGAC（配列番号１２）
Primers A r：taactgtaagagggcccCTACGCCAGAATGCGTTCGCACAGCCGC（配列番号１３）
得られたＰＣＲフラグメント１及びＰＣＲフラグメント２を混合したものを鋳型とし、前記Primer H f、Primers A r及びKOD enzymeを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行った。得られたフラグメントをＰＣＲフラグメント３と称する。
ＰＣＲフラグメント３をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩで切断し、ＰＵＣ１．２ｘＨＢＶベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ部位に組み込み、ＮＬ−ｐｒｅＣベクターを得た（図１Ｂ）。
（２）ＨＢＶ様粒子の産生
ＨｅｐＧ２細胞を用いて、ウイルス様粒子の産生を行った。
４ｘ１０６のＨｅｐＧ２細胞を１０ｃｍプレートに撒種した。一日後、トランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１ ｒｅａｇｅｎｔ：Ｍｉｒｕｓ社）を用い、ＨｅｐＧ２細胞にＨＢＶプラスミドを導入した。１０００μＬのＯＰＴ−ＭＥＭに３０μＬのＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１を混合し、室温で１０分放置し、トランスフェクション用液を調製した。７．５μＬのＰＵＣ１．２ｘＨＢＶ（７．５μｇ）及び７．５μＬのＮＬ−ｐｒｅＣベクター（７．５μｇ）を混合し、更に前記のトランスフェクション用液１０００μＬを加えて、混合した。混合液を室温に３０分放置し、培養液を除いたＨｅｐＧ２細胞に滴下した。培養液を加え、４８時間後培養後に、培養液を回収した。
培養液を８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、上清を回収し、４５ｕｍフィルターでろ過した。回収した上清に、２６％ポリエチレングリコール（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を等量加えて、４℃で１２時間静置し、ウイルスを沈殿させた。沈殿物を含む液を、８，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、ウイルス様粒子を含む沈殿物を得た。沈殿物を、１ｍｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．６：０．１％アルブミン含有）に溶解した。溶解液を２０％スクロース溶液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ：ｐＨ７．６）に重層して、超遠心機を用いて、３，５０００ｒｐｍで、３時間遠心分離した。得られた沈殿物をＯＰＴ−ＭＥＭに懸濁して、ウイルス様粒子として用いた。
《実施例２：ＤｓＲｅｄ−ｐｒｅＣ》
本実施例では、ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子にＤｓＲｅｄ遺伝子を組み込み、ポリメラーゼタンパク質のＮ末の一部を欠失したＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶレポーターベクター（ＤｓＲｅｄ−ｐｒｅＣ）を構築した。
（１）ベクターの構築
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターを鋳型として、以下の２つのプライマー及びKOD enzymeを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲフラグメント１を得た。
Primer HindIII f：TATGACCATGATTACGCCAAGCTTgac（配列番号１４）
Primer DsRed r：CTCCTTGATGACGTCCTCGGtGttGtcggccagattcatcaactcaccccaac（配列番号１５）
次に、ｐＤｓＲｅｄ−ｍｏｎｏｍｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型として、以下の２つのプライマー及びＫＯＤ ｅｎｚｙｍｅを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲフラグメント２を得た。
PCR-2
Primer DsRed f：gttggggtgagttgatgaatctggccgaCaaCaCCGAGGACGTCATCAAGGAG（配列番号１６）
Primer DsRed A r：cttttttcattaactgtaagagggcccCTACAGGAACAGGTGGTGGCGGgCCTCGGCGtGCTCGTAC（配列番号１７）
得られたＰＣＲフラグメント１及びＰＣＲフラグメント２を混合したものを鋳型とし、前記Primer HindIII f、Primer DsRED A r：cttttttcattaactgtaagagggcccCTA（配列番号１８）、及びKOD enzymeを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行った。得られたフラグメントをＰＣＲフラグメント３と称する。
ＰＣＲフラグメント３をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩで切断し、ＮＬ−ｐｒｅＣベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ部位に組み込み、ＤｓＲｅｄ−ｐｒｅＣベクターを得た（図７）。
（２）ＨＢＶ様粒子の産生
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターに代えて、ＤｓＲｅｄ−ｐｒｅＣベクターを用いたことを除いては、実施例１の「（２）ＨＢＶ様粒子の産生」の操作を繰り返して、ウイルス様粒子を得た。なお、ウイルス様粒子の回収は４日後に行った。
本実施例では、ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子にＤｓＲｅｄ遺伝子を組み込み、ポリメラーゼタンパク質のＮ末の一部を欠失したＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶレポーターベクター（ＤｓＲｅｄ−ｐｒｅＣ）を構築した。
（１）ベクターの構築
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターを鋳型として、以下の２つのプライマー及びKOD enzymeを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲフラグメント１を得た。
Primer HindIII f：TATGACCATGATTACGCCAAGCTTgac（配列番号１４）
Primer DsRed r：CTCCTTGATGACGTCCTCGGtGttGtcggccagattcatcaactcaccccaac（配列番号１５）
次に、ｐＤｓＲｅｄ−ｍｏｎｏｍｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型として、以下の２つのプライマー及びＫＯＤ ｅｎｚｙｍｅを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲフラグメント２を得た。
PCR-2
Primer DsRed f：gttggggtgagttgatgaatctggccgaCaaCaCCGAGGACGTCATCAAGGAG（配列番号１６）
Primer DsRed A r：cttttttcattaactgtaagagggcccCTACAGGAACAGGTGGTGGCGGgCCTCGGCGtGCTCGTAC（配列番号１７）
得られたＰＣＲフラグメント１及びＰＣＲフラグメント２を混合したものを鋳型とし、前記Primer HindIII f、Primer DsRED A r：cttttttcattaactgtaagagggcccCTA（配列番号１８）、及びKOD enzymeを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行った。得られたフラグメントをＰＣＲフラグメント３と称する。
ＰＣＲフラグメント３をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩで切断し、ＮＬ−ｐｒｅＣベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ部位に組み込み、ＤｓＲｅｄ−ｐｒｅＣベクターを得た（図７）。
（２）ＨＢＶ様粒子の産生
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターに代えて、ＤｓＲｅｄ−ｐｒｅＣベクターを用いたことを除いては、実施例１の「（２）ＨＢＶ様粒子の産生」の操作を繰り返して、ウイルス様粒子を得た。なお、ウイルス様粒子の回収は４日後に行った。
《参考例１》
本参考例では、実施例１で得られたＮＬ−ｐｒｅＣベクターのポリメレース遺伝子の欠失した頭部分を挿入して、全長のポリメレースタンパク質が発現するＨＢＶ遺伝子を含むベクター（ＮＬ−ｐｒｅＣ＋ｐｏｌ）を構築した。
（１）ベクターの構築
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターを鋳型として、以下の２つのプライマー及びKOD enzymeを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲフラグメント１を得た。
Primer H f：ATTACGCCAAGCTTgacgtcctttgtctacgtc（配列番号１９）
Primer NL-pol r：gctgaggcggtgtCTACGCCAGAATGCGTTCGCACAGCCGCC（配列番号２０）
次に、ＰＵＣ１．２ｘＨＢＶベクターを鋳型として、以下の２つのプライマー及びＫＯＤ ｅｎｚｙｍｅを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲフラグメント２を得た。
Primer NL-pol f：GGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTAGacaccgcctcagc（配列番号２１）
Primers Apa r：ctccttttttcattaactgtaagagggcccacatattgttgacatctatta（配列番号２２）
得られたＰＣＲフラグメント１及びＰＣＲフラグメント２を混合したものを鋳型とし、前記Primer H f、Primers Apa r、及びKOD enzymeを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行った。得られたフラグメントをＰＣＲフラグメント３と称する。
ＰＣＲフラグメント３をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩで切断し、ＮＬ−ｐｒｅＣベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ部位に組み込み、ＮＬ−ｐｒｅＣ＋ｐｏｌベクターを得た（図１（Ｃ））。
（２）ＨＢＶ様粒子の産生
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターに代えて、ＮＬ−ｐｒｅＣ＋ｐｏｌベクターを用いたことを除いては、実施例１の「（２）ＨＢＶ様粒子の産生」の操作を繰り返して、ウイルス様粒子を得た。
本参考例では、実施例１で得られたＮＬ−ｐｒｅＣベクターのポリメレース遺伝子の欠失した頭部分を挿入して、全長のポリメレースタンパク質が発現するＨＢＶ遺伝子を含むベクター（ＮＬ−ｐｒｅＣ＋ｐｏｌ）を構築した。
（１）ベクターの構築
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターを鋳型として、以下の２つのプライマー及びKOD enzymeを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲフラグメント１を得た。
Primer H f：ATTACGCCAAGCTTgacgtcctttgtctacgtc（配列番号１９）
Primer NL-pol r：gctgaggcggtgtCTACGCCAGAATGCGTTCGCACAGCCGCC（配列番号２０）
次に、ＰＵＣ１．２ｘＨＢＶベクターを鋳型として、以下の２つのプライマー及びＫＯＤ ｅｎｚｙｍｅを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲフラグメント２を得た。
Primer NL-pol f：GGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTAGacaccgcctcagc（配列番号２１）
Primers Apa r：ctccttttttcattaactgtaagagggcccacatattgttgacatctatta（配列番号２２）
得られたＰＣＲフラグメント１及びＰＣＲフラグメント２を混合したものを鋳型とし、前記Primer H f、Primers Apa r、及びKOD enzymeを用いて、熱変性９４℃、アニーリング５６℃、伸長７２℃の条件で、３２サイクルのＰＣＲを行った。得られたフラグメントをＰＣＲフラグメント３と称する。
ＰＣＲフラグメント３をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩで切断し、ＮＬ−ｐｒｅＣベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ部位に組み込み、ＮＬ−ｐｒｅＣ＋ｐｏｌベクターを得た（図１（Ｃ））。
（２）ＨＢＶ様粒子の産生
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターに代えて、ＮＬ−ｐｒｅＣ＋ｐｏｌベクターを用いたことを除いては、実施例１の「（２）ＨＢＶ様粒子の産生」の操作を繰り返して、ウイルス様粒子を得た。
《比較例１》
本比較例１では、前記ＮＬ−ｐｒｅＣベクターのＸ遺伝子が発現しないように改変した。Ｘ遺伝子の開始コドン（メチオニン）から８番目のグルタミン（Ｑ）のコドンＣＡＡをＴＡＡに変換し、終止コドンに改変した。なお、この改変により重複するポリメレースののコドンは変更されない。
（１）ベクターの構築
ＰＵＣ ＮＬ−ｐｒｅＣをＮｃｏ１及びＢａｍＨＩで切断し、ａｔｇｇｃｔｇｃｔａｇｇｇｔｇｔｇｃｔｇｃｃａａｃｔｇｇａｔｃ（配列番号２３）のフラグメントを除く。Ｎｃｏ１／ＢａｍＨＩ部位に、合成オリゴマーｃａｔｇｇｃｔｇｃｔａｇｇｇｔｇｔｇｃｔｇｃＴａａｃｔｇｇａｔｃ（配列番号２４）を挿入し、ＮＬ−ｐｒｅＣ，−Ｘベクターを得た（図１（Ｄ））。
（２）ＨＢＶ様粒子の産生
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターに代えて、ＮＬ−ｐｒｅＣ，−Ｘベクターを用いたことを除いては、実施例１の「（２）ＨＢＶ様粒子の産生」の操作を繰り返して、ウイルス様粒子を得た。
本比較例１では、前記ＮＬ−ｐｒｅＣベクターのＸ遺伝子が発現しないように改変した。Ｘ遺伝子の開始コドン（メチオニン）から８番目のグルタミン（Ｑ）のコドンＣＡＡをＴＡＡに変換し、終止コドンに改変した。なお、この改変により重複するポリメレースののコドンは変更されない。
（１）ベクターの構築
ＰＵＣ ＮＬ−ｐｒｅＣをＮｃｏ１及びＢａｍＨＩで切断し、ａｔｇｇｃｔｇｃｔａｇｇｇｔｇｔｇｃｔｇｃｃａａｃｔｇｇａｔｃ（配列番号２３）のフラグメントを除く。Ｎｃｏ１／ＢａｍＨＩ部位に、合成オリゴマーｃａｔｇｇｃｔｇｃｔａｇｇｇｔｇｔｇｃｔｇｃＴａａｃｔｇｇａｔｃ（配列番号２４）を挿入し、ＮＬ−ｐｒｅＣ，−Ｘベクターを得た（図１（Ｄ））。
（２）ＨＢＶ様粒子の産生
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターに代えて、ＮＬ−ｐｒｅＣ，−Ｘベクターを用いたことを除いては、実施例１の「（２）ＨＢＶ様粒子の産生」の操作を繰り返して、ウイルス様粒子を得た。
《比較例２》
本比較例２では、ＨＢＶのポリメレース遺伝子にＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだＨＢＶレポーターベクター（ＮＬ ｉｎ ｐｏｌベクター）を構築した。
（１）ベクターの構築
ＰＵＣ１．２ｘＨＢＶベクターを用いて、ポリメレース遺伝子の読み枠にインフレームとなるように、ＰＣＲで増幅したＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子を挿入し、ＮＬ ｉｎ ｐｏｌベクターを得た（図１（Ｅ））。
（２）ＨＢＶ様粒子の産生
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターに代えて、ＮＬ ｉｎ ｐｏｌベクターを用いたことを除いては、実施例１の「（２）ＨＢＶ様粒子の産生」の操作を繰り返して、ウイルス様粒子を得た。
本比較例２では、ＨＢＶのポリメレース遺伝子にＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだＨＢＶレポーターベクター（ＮＬ ｉｎ ｐｏｌベクター）を構築した。
（１）ベクターの構築
ＰＵＣ１．２ｘＨＢＶベクターを用いて、ポリメレース遺伝子の読み枠にインフレームとなるように、ＰＣＲで増幅したＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子を挿入し、ＮＬ ｉｎ ｐｏｌベクターを得た（図１（Ｅ））。
（２）ＨＢＶ様粒子の産生
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターに代えて、ＮＬ ｉｎ ｐｏｌベクターを用いたことを除いては、実施例１の「（２）ＨＢＶ様粒子の産生」の操作を繰り返して、ウイルス様粒子を得た。
《実施例３》
本実施例では、ＰＸＢ細胞（キメラマウス由来ヒト肝臓初代培養細胞：フェニックスバイオ社）に、実施例１、参考例１及び比較例２で得られたウイルス様粒子を感染させ、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の活性を測定した。
（１）ウイルス様粒子の感染
４８ウェルプレートで培養したＰＸＢ細胞に、培地１５０μＬ、ＰＢＳに溶解した４０％ポリエチレングリコール（８０００）２０μＬ、及びウイルス様粒子液３０μＬの混合液を添加した。更に、各ウェルに、ＤＭＳＯを最終濃度２％になるように加えた。２４時間後に、ウイルス液を除去し、２％ＤＭＳＯ入りの培地に交換した。
（２）ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の活性測定
７日後に細胞を回収し、１００μＬのpassive lysis buffer(Promega)を加え、細胞を破砕した。抽出液を遠心分離によって回収した。１０μＬの抽出液のＮａｎｏＬｕｃ活性を、ＮａｎｏＬｕｃ活性測定キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって測定した。測定方法はメーカーのプロトコールに従った。結果を図２に示す。なお、活性は実施例１のＨＢＶ様粒子を１００とした場合の相対値で表した。
本実施例では、ＰＸＢ細胞（キメラマウス由来ヒト肝臓初代培養細胞：フェニックスバイオ社）に、実施例１、参考例１及び比較例２で得られたウイルス様粒子を感染させ、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の活性を測定した。
（１）ウイルス様粒子の感染
４８ウェルプレートで培養したＰＸＢ細胞に、培地１５０μＬ、ＰＢＳに溶解した４０％ポリエチレングリコール（８０００）２０μＬ、及びウイルス様粒子液３０μＬの混合液を添加した。更に、各ウェルに、ＤＭＳＯを最終濃度２％になるように加えた。２４時間後に、ウイルス液を除去し、２％ＤＭＳＯ入りの培地に交換した。
（２）ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の活性測定
７日後に細胞を回収し、１００μＬのpassive lysis buffer(Promega)を加え、細胞を破砕した。抽出液を遠心分離によって回収した。１０μＬの抽出液のＮａｎｏＬｕｃ活性を、ＮａｎｏＬｕｃ活性測定キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって測定した。測定方法はメーカーのプロトコールに従った。結果を図２に示す。なお、活性は実施例１のＨＢＶ様粒子を１００とした場合の相対値で表した。
ＮＬ−ｐｒｅＣベクターを用いて得られたＨＢＶ様粒子（実施例１）は、高いＮａｎｏＬｕｃ活性を示した。すなわち、ＰＸＢ細胞に対して、効率に感染が成立していると考えられる。一方、ＮＬ−ｐｒｅＣ＋ｐｏｌベクターを用いて得られたＨＢＶ様粒子（参考例１）は、実施例１のＨＢＶ様粒子と比較すると１／１０程度のＮａｎｏＬｕｃ活性であった。また、比較例２のＮＬ ｉｎ ｐｏｌベクター用いて得られたＨＢＶ様粒子（比較例２）は、非常に低いＮａｎｏＬｕｃ活性しか示さなかった。すなわち、ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子にレポーター遺伝子を組み込まれたウイルス様粒子の方が、ポリメレース遺伝子にレポーター遺伝子を組み込まれたウイルス様粒子よりも、ＮａｎｏＬｕｃ活性が高く、効率的に感染の成立を判定することができた。
《実施例４》
本実施例では、ＰＸＢ細胞（キメラマウス由来ヒト肝臓初代培養細胞：フェニックスバイオ社）に、実施例１、及び比較例１で得られたウイルス様粒子を感染させ、ＮａｎｏＬｕｃの活性を測定した。
実施例１及び比較例１で得られたウイルス様粒子を用いたこと、及び細胞を２日、７日、１２日、及び１７日に回収したことを除いては、実施例３の（１）及び（２）の操作を繰り返して、ＮａｎｏＬｕｃ活性を測定した。結果を図３に示す。
比較例１のＮＬ−ｐｒｅＣ、−Ｘベクターを用いて得られたＨＢＶ様粒子（比較例１）は、ＮａｎｏＬｕｃ活性が低かった。
本実施例では、ＰＸＢ細胞（キメラマウス由来ヒト肝臓初代培養細胞：フェニックスバイオ社）に、実施例１、及び比較例１で得られたウイルス様粒子を感染させ、ＮａｎｏＬｕｃの活性を測定した。
実施例１及び比較例１で得られたウイルス様粒子を用いたこと、及び細胞を２日、７日、１２日、及び１７日に回収したことを除いては、実施例３の（１）及び（２）の操作を繰り返して、ＮａｎｏＬｕｃ活性を測定した。結果を図３に示す。
比較例１のＮＬ−ｐｒｅＣ、−Ｘベクターを用いて得られたＨＢＶ様粒子（比較例１）は、ＮａｎｏＬｕｃ活性が低かった。
《実施例５》
本実施例では、ＰＸＢ細胞以外のＨｕＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞について、実施例１で得られたウイルス様粒子の感染を検討した。また、ＨＢＶの受容体であるＮＴＣＰを発現させた場合の感染に与える影響を検討した。
ＰＸＢ細胞に代えて、ＨｕＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞を用いたことを除いては、実施例３の（１）及び（２）の操作を繰り返した。ＮＴＣＰの発現は、感染前にＮＴＣＰの発現ベクターをＨｕＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションし、ｔｒａｎｓｉｅｎｔにＮＴＣＰを発現させることによって行った。
ＨｕＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞でも、ウイルス様粒子の感染が確認できた。また、ＮＴＣＰを発現した細胞の方が、感染の効率が上昇するようであった（図４）。
本実施例では、ＰＸＢ細胞以外のＨｕＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞について、実施例１で得られたウイルス様粒子の感染を検討した。また、ＨＢＶの受容体であるＮＴＣＰを発現させた場合の感染に与える影響を検討した。
ＰＸＢ細胞に代えて、ＨｕＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞を用いたことを除いては、実施例３の（１）及び（２）の操作を繰り返した。ＮＴＣＰの発現は、感染前にＮＴＣＰの発現ベクターをＨｕＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションし、ｔｒａｎｓｉｅｎｔにＮＴＣＰを発現させることによって行った。
ＨｕＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞でも、ウイルス様粒子の感染が確認できた。また、ＮＴＣＰを発現した細胞の方が、感染の効率が上昇するようであった（図４）。
《実施例６》
本実施例では、ＨｕＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞以外の細胞株について、実施例１で得られたウイルス様粒子の感染を検討した。
ＰＸＢ細胞に加えて、ＨＡＫ１Ａ細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｈｕｈ７細胞、Ｋｉｍ−１細胞、ＨＡＫ１Ｂ細胞、ＨＡＫ５細胞、ＨＡＫ６細胞、ＫＹＮ−１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａｌｅｘ細胞、Ｈｕｈ６細胞、及びＰＨ５ＣＨ細胞を用いたことを除いては、実施例３の（１）及び（２）の操作を繰り返した。なお、Ｈｅｌａ細胞、Ｈｕｈ７細胞、Ｋｉｍ−１細胞、ＨＡＫ１Ｂ細胞、ＨＡＫ５細胞、ＨＡＫ６細胞、ＫＹＮ−１細胞については、ＨＢＶの受容体であるＮＴＣＰをｓｔａｂｌｅに発現させた細胞を用い、ＨｅｐＧ２細胞、、Ａｌｅｘ細胞、Ｈｕｈ６細胞、及びＰＨ５ＣＨ細胞については、ＮＴＣＰをｔｒａｎｓｉｅｎｔに発現させた細胞を用いた。結果を図５に示す。
Ｈｕｈ７細胞、Ｋｉｍ−１細胞、ＨＡＫ１Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａｌｅｘ細胞、及びＨｕｈ６細胞では、比較的高いＮａｎｏＬｕｃ活性が検出できた（図５）。
本実施例では、ＨｕＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞以外の細胞株について、実施例１で得られたウイルス様粒子の感染を検討した。
ＰＸＢ細胞に加えて、ＨＡＫ１Ａ細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｈｕｈ７細胞、Ｋｉｍ−１細胞、ＨＡＫ１Ｂ細胞、ＨＡＫ５細胞、ＨＡＫ６細胞、ＫＹＮ−１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａｌｅｘ細胞、Ｈｕｈ６細胞、及びＰＨ５ＣＨ細胞を用いたことを除いては、実施例３の（１）及び（２）の操作を繰り返した。なお、Ｈｅｌａ細胞、Ｈｕｈ７細胞、Ｋｉｍ−１細胞、ＨＡＫ１Ｂ細胞、ＨＡＫ５細胞、ＨＡＫ６細胞、ＫＹＮ−１細胞については、ＨＢＶの受容体であるＮＴＣＰをｓｔａｂｌｅに発現させた細胞を用い、ＨｅｐＧ２細胞、、Ａｌｅｘ細胞、Ｈｕｈ６細胞、及びＰＨ５ＣＨ細胞については、ＮＴＣＰをｔｒａｎｓｉｅｎｔに発現させた細胞を用いた。結果を図５に示す。
Ｈｕｈ７細胞、Ｋｉｍ−１細胞、ＨＡＫ１Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａｌｅｘ細胞、及びＨｕｈ６細胞では、比較的高いＮａｎｏＬｕｃ活性が検出できた（図５）。
《実施例７》
本実施例では、ＨＢＶの阻害剤を用い、実施例１で得られたウイルス様粒子の感染が、阻害されるか否かを検討した。
ＨＢＶ様粒子の感染時の混合液に阻害剤を下記の濃度で添加したことを除いては、実施例３の（１）及び（２）の操作を繰り返した。
Anti-HBV抗体（ヘブスブリン、ベネシス社）：０、３０、７５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ
ヘパリン（シグマ社）：０、５０、１５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ
エンテカビル（Toronto Res. Chemical Inc）：０、３０、３００ｎＭ
インターフェロン（インターフェロンベータ：持田製薬）：０、１００ＩＵ／ｍＬ
なお、インターフェロン及びエンテカビルは、培養液に常時添加し、ヘパリン及びAnti-HBV抗体（ヘブスブリン）は、感染時のみに添加した。結果を図６（１）に示す。
また、インターフェロンについては、感染６日後、１１日後、及び１６日後に細胞内のウイルス量をＰＣＲにより定量した。結果を図６（２）に示す。
ＨＢＶ阻害剤の濃度が上昇するにしたがって、ＮａｎｏＬｕｃ活性が低下した。従って、ＨＢＶ感染の抑制を、実施例１で得られたＨＢＶ様ウイルスを用いた感染系で検出することが可能であり、この感染系がＨＢＶ阻害剤のスクリーニングに用いることが可能であることが確認できた。
本実施例では、ＨＢＶの阻害剤を用い、実施例１で得られたウイルス様粒子の感染が、阻害されるか否かを検討した。
ＨＢＶ様粒子の感染時の混合液に阻害剤を下記の濃度で添加したことを除いては、実施例３の（１）及び（２）の操作を繰り返した。
Anti-HBV抗体（ヘブスブリン、ベネシス社）：０、３０、７５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ
ヘパリン（シグマ社）：０、５０、１５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ
エンテカビル（Toronto Res. Chemical Inc）：０、３０、３００ｎＭ
インターフェロン（インターフェロンベータ：持田製薬）：０、１００ＩＵ／ｍＬ
なお、インターフェロン及びエンテカビルは、培養液に常時添加し、ヘパリン及びAnti-HBV抗体（ヘブスブリン）は、感染時のみに添加した。結果を図６（１）に示す。
また、インターフェロンについては、感染６日後、１１日後、及び１６日後に細胞内のウイルス量をＰＣＲにより定量した。結果を図６（２）に示す。
ＨＢＶ阻害剤の濃度が上昇するにしたがって、ＮａｎｏＬｕｃ活性が低下した。従って、ＨＢＶ感染の抑制を、実施例１で得られたＨＢＶ様ウイルスを用いた感染系で検出することが可能であり、この感染系がＨＢＶ阻害剤のスクリーニングに用いることが可能であることが確認できた。
《実施例８》
本実施例では、ＰＸＢ細胞（キメラマウス由来ヒト肝臓初代培養細胞：フェニックスバイオ社）に、実施例２で得られたウイルス様粒子を感染させ、蛍光顕微鏡でＤｓＲｅｄの発現を観察した。
（１）ウイルス様粒子の感染
実施例２で得られたウイルス様粒子を用いたこと、ＤＭＳＯとＰＥＧを用いたこと、及び感染時にヘパリンを添加したこと又は添加しなかったことを除いては、実施例３の（１）の操作を繰り返して、ＰＸＢ細胞にウイルス様粒子を感染させた。なお、ヘパリンはＨＢＶ感染の阻害剤である。
（２）ＤｓＲｅｄの発現
感染５日後に、蛍光顕微鏡でＤｓＲｅｄの発現を観察した。ヘパリンを添加しないものでは、強いＤｓＲｅｄの蛍光が観察されたが、ヘパリンを添加することによって、ＤｓＲｅｄの発現が抑制された（図７）。従って、実施例２で得られたウイルス様粒子によっても、ＨＢＶ感染を修飾する物質をスクリーニングすることが可能であることが分かった。
本実施例では、ＰＸＢ細胞（キメラマウス由来ヒト肝臓初代培養細胞：フェニックスバイオ社）に、実施例２で得られたウイルス様粒子を感染させ、蛍光顕微鏡でＤｓＲｅｄの発現を観察した。
（１）ウイルス様粒子の感染
実施例２で得られたウイルス様粒子を用いたこと、ＤＭＳＯとＰＥＧを用いたこと、及び感染時にヘパリンを添加したこと又は添加しなかったことを除いては、実施例３の（１）の操作を繰り返して、ＰＸＢ細胞にウイルス様粒子を感染させた。なお、ヘパリンはＨＢＶ感染の阻害剤である。
（２）ＤｓＲｅｄの発現
感染５日後に、蛍光顕微鏡でＤｓＲｅｄの発現を観察した。ヘパリンを添加しないものでは、強いＤｓＲｅｄの蛍光が観察されたが、ヘパリンを添加することによって、ＤｓＲｅｄの発現が抑制された（図７）。従って、実施例２で得られたウイルス様粒子によっても、ＨＢＶ感染を修飾する物質をスクリーニングすることが可能であることが分かった。
《実施例９》
本実施例では、ヘパリン、エンテカビル、インターフェロンβ、及びＨＢＶ免疫グロブリン（ＨＢＩＧ）を用い、ＰＸＢ細胞及びＨｅｐＧ２／ＮＴＣＰ細胞において、実施例１で得られたウイルス様粒子の感染の阻害を検討した。
ＨＢＶ様粒子の感染時の混合液に阻害剤を下記の濃度で添加したことを除いては、実施例３の（１）及び（２）の操作を繰り返した。
ヘパリン（シグマ社）：５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ（低用量）、１５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ（高用量）
エンテカビル（Toronto Res. Chemical Inc）：０．１μＭ（低用量）、０．５μＭ（低用量）
インターフェロン（インターフェロンベータ：持田製薬）：２５０ＩＵ／ｍＬ（低用量）７５０ＩＵ／ｍＬ（低用量）
感染後７日目に細胞を回収して、ＮＬ活性及びＰＣＲによるＨＢＶ−ＲＮＡ量を測定した。なお、ヘパリンはＰＣＲ反応を阻害するため、ＲＮＡ測定は行わなかった。ＰＸＢ細胞の結果を図８に示す。なお、ＨｅｐＧ２／ＮＴＣＰ細胞でも同様の結果であった。
ＮＬ活性及びＰＣＲによるＨＢＶ−ＲＮＡ量は相関しており、ＨＢＶの阻害物質によって、ＮＬ活性及びＨＢＶ−ＲＮＡ量は低下した。従って、本発明のウイルス様粒子を用いて、ＨＢＶ阻害剤のスクリーニングを行うことが可能であった。
本実施例では、ヘパリン、エンテカビル、インターフェロンβ、及びＨＢＶ免疫グロブリン（ＨＢＩＧ）を用い、ＰＸＢ細胞及びＨｅｐＧ２／ＮＴＣＰ細胞において、実施例１で得られたウイルス様粒子の感染の阻害を検討した。
ＨＢＶ様粒子の感染時の混合液に阻害剤を下記の濃度で添加したことを除いては、実施例３の（１）及び（２）の操作を繰り返した。
ヘパリン（シグマ社）：５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ（低用量）、１５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ（高用量）
エンテカビル（Toronto Res. Chemical Inc）：０．１μＭ（低用量）、０．５μＭ（低用量）
インターフェロン（インターフェロンベータ：持田製薬）：２５０ＩＵ／ｍＬ（低用量）７５０ＩＵ／ｍＬ（低用量）
感染後７日目に細胞を回収して、ＮＬ活性及びＰＣＲによるＨＢＶ−ＲＮＡ量を測定した。なお、ヘパリンはＰＣＲ反応を阻害するため、ＲＮＡ測定は行わなかった。ＰＸＢ細胞の結果を図８に示す。なお、ＨｅｐＧ２／ＮＴＣＰ細胞でも同様の結果であった。
ＮＬ活性及びＰＣＲによるＨＢＶ−ＲＮＡ量は相関しており、ＨＢＶの阻害物質によって、ＮＬ活性及びＨＢＶ−ＲＮＡ量は低下した。従って、本発明のウイルス様粒子を用いて、ＨＢＶ阻害剤のスクリーニングを行うことが可能であった。
本発明のＢ型肝炎ウイルスレポーターベクター、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子及びそれを用いたＨＢＶ感染系は、ＨＢＶの感染を修飾する物質のスクリーニングに用いることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (9)
- ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子、及びＸ遺伝子を含むＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶレポーターベクター。
- 前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＤｓＲｅｄ遺伝子、及びそれらの改変体遺伝子からなる群から選択される１つ以上である、請求項１に記載のＨＢＶレポーターベクター。
- 前記ＨＢＶ遺伝子が３．６Ｋｂ以下である、請求項１又は２に記載のＨＢＶレポーターベクター。
- 前記ＨＢＶ遺伝子が、配列番号１、又は配列番号２で表される塩基配列のＨＢＶプレゲノムを産生できるＨＢＶ遺伝子である、１〜３のいずれか一項に記載のＨＢＶレポーターベクター。
- （１）ＨＢＶのコアタンパク質、ポリメレースタンパク質、及びラージＳタンパク質、並びに
（２）ＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換された遺伝子、及びＸ遺伝子を含むＨＢＶのプレゲノムＲＮＡ、及び前記プレゲノムＲＮＡから合成されたマイナス鎖ＤＮＡ及びプラス鎖ＤＮＡからなる不完全環状二本鎖ＤＮＡ、
を含む、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子。 - （１）前記請求項１〜４のいずれか一項に記載のＨＢＶレポーターベクター、及び野生型ＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶヘルパーベクターを細胞にトランスフェクションする工程、及び
（２）前記トランスフェクションされた細胞からＢ型肝炎ウイルス様粒子を回収する工程、
を含むＨＢＶのプレコア／コア遺伝子の一部がレポーター遺伝子に置換されたプレゲノムＲＮＡを含むＢ型肝炎ウイルス様粒子の製造方法。 - 前記細胞が、ＨｅｐＧ２細胞である請求項６に記載のＢ型肝炎ウイルス様粒子の製造方法
- 請求項５に記載のＢ型肝炎ウイルス様粒子が、感染した細胞。
- （ａ）請求項５に記載のＢ型肝炎ウイルス様粒子を細胞に接触させる工程、
（ｂ）試験物質と細胞とを接触させる工程、及び
（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を分析する工程、
を含む、Ｂ型肝炎に関与する物質のスクリーニング方法。
Applications Claiming Priority (3)
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| JP2014045712 | 2014-03-07 | ||
| JP2014045712 | 2014-03-07 | ||
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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-
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