JP7455336B2 - Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する医薬組成物およびスクリーニング方法 - Google Patents
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する医薬組成物およびスクリーニング方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、抗Ｂ型肝炎ウイルス活性を有する医薬組成物およびＢ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。
Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルス属に属するウイルスで、直径約４２ｎｍの球状のＤＮＡウイルスである。ウイルスそのものは、外被（エンベロープ、ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、不完全二重鎖のＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素などを含む、直径２７ｎｍの芯（コア、ｃｏｒｅ）からなるＤＮＡウイルスであり、Ｄａｎｅ粒子と呼ばれている。二重構造を形成し、外側はＨＢｓ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｓＡｇ）、内側はＨＢｃ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｃｏｒｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｃＡｇ）と遺伝子ＤＮＡからなっている（非特許文献１）。
ＨＢｓ抗原は、Ｄａｎｅ粒子以外に、中空粒子、小型球形粒子または桿状粒子として存在する。
ＨＢＶのゲノムＤＮＡには、ｐｒｅ－Ｓ／Ｓ遺伝子領域、Ｐ遺伝子領域、Ｘ遺伝子領域、ｐｒｅ－Ｃ／Ｃ遺伝子領域の４種類の転写解読枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）、３つのプロモーター、および２つのエンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ、Ｅｎｈ）領域がある。Ｘ遺伝子領域のｃｏｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｃ遺伝子領域のｐｒｅｃｏｒｅ領域は、ＨＢｅ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｅＡｇ）構成タンパク質の産生に関与し、この領域のｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎによりＨＢｅ抗原構成タンパク質が産生されなくなり、ＨＢｅ抗原陰性となる。
また、２つのエンハンサー領域はエンハンサーＩ（Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｉ、ＥｎｈＩ）およびエンハンサーＩＩ（Ｅｎｈａｎｃｅｒ ＩＩ、ＥｎｈＩＩ）と呼ばれ、いずれも３つ全てのプロモーター活性を増大させることが可能である（特許文献１）。
ＨＢＶは肝細胞に侵入すると、不完全環状二本鎖ＤＮＡが肝細胞の核内に取り込まれ、完全閉鎖二本鎖ＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ）に転換される。ＨＢＶの慢性感染状態では、ｃｃｃＤＮＡは肝細胞１個あたり５～５０個、ミニ染色体として存在する。肝細胞核内のｃｃｃＤＮＡからは４種のＲＮＡが転写され、それらより構造タンパク質であるＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原およびＨＢｅ抗原、Ｘタンパク質ならびに逆転写酵素を含むポリメラーゼが翻訳される。ＲＮＡの１つはｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡとしてコア粒子に取り込まれ、逆転写酵素の働きによりマイナス鎖ＤＮＡが合成され、次にプラス鎖ＤＮＡが合成され不完全環状二本鎖ＤＮＡとなる。さらに、ＨＢｓ抗原より形成されるエンベロープに包まれてウイルス粒子（Ｄａｎｅ粒子）となり血中に放出される。ＲＮＡにより翻訳されたＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原およびｐ２２ｃｒ抗原を含む中空粒子（ＤＮＡの核が無い粒子）や肝細胞膜を通過するＨＢｅ抗原などは、Ｄａｎｅ粒子の血中放出ルートとは別に多量に血中に放出、分泌される。この作用は、ＨＢＶ感染における宿主免疫機構の攻撃から逃れている作用と考えられる。ＨＢｅ抗原、ＨＢｃ抗原およびｐ２２ｃｒ抗原は、ＨＢｃｒ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｃｏｒｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｃｒＡｇ）として測定可能であり、ウイルス複製のマーカーとして使用されている（非特許文献１）。
ＨＢｓ抗原は、Ｄａｎｅ粒子以外に、中空粒子、小型球形粒子または桿状粒子として存在する。
ＨＢＶのゲノムＤＮＡには、ｐｒｅ－Ｓ／Ｓ遺伝子領域、Ｐ遺伝子領域、Ｘ遺伝子領域、ｐｒｅ－Ｃ／Ｃ遺伝子領域の４種類の転写解読枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）、３つのプロモーター、および２つのエンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ、Ｅｎｈ）領域がある。Ｘ遺伝子領域のｃｏｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｃ遺伝子領域のｐｒｅｃｏｒｅ領域は、ＨＢｅ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｅＡｇ）構成タンパク質の産生に関与し、この領域のｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎによりＨＢｅ抗原構成タンパク質が産生されなくなり、ＨＢｅ抗原陰性となる。
また、２つのエンハンサー領域はエンハンサーＩ（Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｉ、ＥｎｈＩ）およびエンハンサーＩＩ（Ｅｎｈａｎｃｅｒ ＩＩ、ＥｎｈＩＩ）と呼ばれ、いずれも３つ全てのプロモーター活性を増大させることが可能である（特許文献１）。
ＨＢＶは肝細胞に侵入すると、不完全環状二本鎖ＤＮＡが肝細胞の核内に取り込まれ、完全閉鎖二本鎖ＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ）に転換される。ＨＢＶの慢性感染状態では、ｃｃｃＤＮＡは肝細胞１個あたり５～５０個、ミニ染色体として存在する。肝細胞核内のｃｃｃＤＮＡからは４種のＲＮＡが転写され、それらより構造タンパク質であるＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原およびＨＢｅ抗原、Ｘタンパク質ならびに逆転写酵素を含むポリメラーゼが翻訳される。ＲＮＡの１つはｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡとしてコア粒子に取り込まれ、逆転写酵素の働きによりマイナス鎖ＤＮＡが合成され、次にプラス鎖ＤＮＡが合成され不完全環状二本鎖ＤＮＡとなる。さらに、ＨＢｓ抗原より形成されるエンベロープに包まれてウイルス粒子（Ｄａｎｅ粒子）となり血中に放出される。ＲＮＡにより翻訳されたＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原およびｐ２２ｃｒ抗原を含む中空粒子（ＤＮＡの核が無い粒子）や肝細胞膜を通過するＨＢｅ抗原などは、Ｄａｎｅ粒子の血中放出ルートとは別に多量に血中に放出、分泌される。この作用は、ＨＢＶ感染における宿主免疫機構の攻撃から逃れている作用と考えられる。ＨＢｅ抗原、ＨＢｃ抗原およびｐ２２ｃｒ抗原は、ＨＢｃｒ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｃｏｒｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｃｒＡｇ）として測定可能であり、ウイルス複製のマーカーとして使用されている（非特許文献１）。
Ｂ型肝炎とは、ＨＢＶに感染することで発症するウイルス性肝炎の一つであり、感染者数は全世界で約２億４０００万人であるとされている。先述のように、ＨＢＶに感染すると、Ｄａｎｅ粒子が血中に放出されるとともに、Ｄａｎｅ粒子の放出ルートとは別にウイルスタンパク質が血中に大量に分泌される。ウイルスタンパク質のうち、とくにＨＢｓ抗原は宿主であるヒトの免疫機構による感染細胞の排除を妨害している可能性が指摘されている（非特許文献２、３）。したがって、Ｂ型肝炎の治療には、Ｄａｎｅ粒子を減らすこと、すなわちウイルスの増殖を抑制するとともに、ＨＢｓ抗原をはじめとするウイルスタンパク質を減らすことが重要であると考えられている。
Ｂ型肝炎の第一選択薬には、エンテカビルやテノホビなどの核酸アナログが使用されている。核酸アナログ製剤はＨＢＶポリメラーゼタンパクの活性を阻害、不完全環状二本鎖ＤＮＡの生成を阻害することにより、血中のＤａｎｅ粒子を減少、すなわちウイルスの増殖を抑制することが可能である。しかしながら、核酸アナログ製剤はＨＢｓ抗原を減少させることができないため、宿主免疫機構による感染細胞の排除を達成することは困難である。そのため、ＨＢｓ抗原の減少を達成可能な医薬品の開発が望まれている。
近年、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の原理によりＨＢＶ ＲＮＡに結合し、これを分解する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の研究開発が進められている。これら二本鎖ＲＮＡは、ＨＢＶ感染細胞などにおいてＨＢｓ抗原を減少させることが報告されている（非特許文献４）。二本鎖ＲＮＡはその性質上、ＨＢＶ ＲＮＡに結合し効果を発揮するためには、ＨＢＶ ＲＮＡと高い配列同一性を有する必要がある。しかしながら、ＨＢＶには８種類の遺伝子型が存在すること、遺伝子変異などによりＲＮＡの配列が変化することなどから、ＨＢＶ ＲＮＡに結合する二本鎖ＲＮＡの効果を期待できない例が懸念されている。実際、Ｂ型肝炎患者から採取したＨＢＶを分析した結果、同一患者において遺伝子配列の異なる複数のクローンが存在すること、ＨＢＶ ＲＮＡに対する二本鎖ＲＮＡの効果が減弱するクローンが存在することが報告されている（非特許文献５）。したがって、新たな作用メカニズムによりＨＢｓ抗原の減少を達成可能な医薬品の開発が必要である。
Ｂ型肝炎の第一選択薬には、エンテカビルやテノホビなどの核酸アナログが使用されている。核酸アナログ製剤はＨＢＶポリメラーゼタンパクの活性を阻害、不完全環状二本鎖ＤＮＡの生成を阻害することにより、血中のＤａｎｅ粒子を減少、すなわちウイルスの増殖を抑制することが可能である。しかしながら、核酸アナログ製剤はＨＢｓ抗原を減少させることができないため、宿主免疫機構による感染細胞の排除を達成することは困難である。そのため、ＨＢｓ抗原の減少を達成可能な医薬品の開発が望まれている。
近年、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の原理によりＨＢＶ ＲＮＡに結合し、これを分解する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の研究開発が進められている。これら二本鎖ＲＮＡは、ＨＢＶ感染細胞などにおいてＨＢｓ抗原を減少させることが報告されている（非特許文献４）。二本鎖ＲＮＡはその性質上、ＨＢＶ ＲＮＡに結合し効果を発揮するためには、ＨＢＶ ＲＮＡと高い配列同一性を有する必要がある。しかしながら、ＨＢＶには８種類の遺伝子型が存在すること、遺伝子変異などによりＲＮＡの配列が変化することなどから、ＨＢＶ ＲＮＡに結合する二本鎖ＲＮＡの効果を期待できない例が懸念されている。実際、Ｂ型肝炎患者から採取したＨＢＶを分析した結果、同一患者において遺伝子配列の異なる複数のクローンが存在すること、ＨＢＶ ＲＮＡに対する二本鎖ＲＮＡの効果が減弱するクローンが存在することが報告されている（非特許文献５）。したがって、新たな作用メカニズムによりＨＢｓ抗原の減少を達成可能な医薬品の開発が必要である。
ＨＢＶは自身の遺伝子からＲＮＡを転写するために必要な分子群、およびＲＮＡからウイルスタンパク質を産生するために必要な分子群を有していない。したがって、ＨＢＶの増殖やウイルスタンパク質の産生には、感染したヒト肝細胞がもつ分子群を利用しなければならない。そこで、ＨＢＶが利用するヒトタンパク質を標的とし、ＨＢＶの増殖やウイルスタンパク質の産生を阻害する新たなアプローチが注目され始めた。
例えば、ＨＢＶゲノムＤＮＡ中のエンハンサーＩに結合する核酸分子を用いて、ＨＢＶゲノムＤＮＡからＨＢＶ ＲＮＡへの転写を制御し、ＨＢＶの複製を調節する試みがなされている（特許文献２）。また、ＨＢＶゲノムＤＮＡ中のエンハンサー領域に作用する転写因子の発現を制御することにより、ＨＢＶ ＲＮＡへの転写を制御し、ＨＢＶの増殖を抑制する試みがなされている（特許文献３～５）。
しかしながら、宿主であるヒトのどの因子がＨＢＶの増殖やウイルスタンパク質の産生に必要なのか、それらを制御することによりどのような抗ＨＢＶ効果につながるのか、十分に明らかにはなっていない。
例えば、ＨＢＶゲノムＤＮＡ中のエンハンサーＩに結合する核酸分子を用いて、ＨＢＶゲノムＤＮＡからＨＢＶ ＲＮＡへの転写を制御し、ＨＢＶの複製を調節する試みがなされている（特許文献２）。また、ＨＢＶゲノムＤＮＡ中のエンハンサー領域に作用する転写因子の発現を制御することにより、ＨＢＶ ＲＮＡへの転写を制御し、ＨＢＶの増殖を抑制する試みがなされている（特許文献３～５）。
しかしながら、宿主であるヒトのどの因子がＨＢＶの増殖やウイルスタンパク質の産生に必要なのか、それらを制御することによりどのような抗ＨＢＶ効果につながるのか、十分に明らかにはなっていない。
田中ら、モダンメディア、５４巻、１２号、３４７～３５２頁、２００８年
Ｂｒｏｕｗら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２６巻、２８０～２８９頁、２００８年
Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８３巻、１２８１～１２８９頁、２００２年
Ｗｏｏｄｄｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２１巻、５号、９７３～９８５頁、２０１３年
Ｗｕら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１２８巻、７０８～７１６頁、２００５年
本発明の課題は、宿主因子であるヒトタンパク質を標的とし、抗Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）活性を有する新規の医薬組成物を提供することである。また、本発明の課題は、ヒトタンパク質を標的とし、ＨＢＶタンパク質の産生を抑制する医薬組成物を提供することである。さらに、本発明の課題は、宿主因子を標的とし、ＨＢＶタンパク質の産生を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題に対し鋭意研究を重ねた結果、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ（ＨＢＶゲノムＤＮＡ）上のエンハンサーＩ（Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｉ、ＥｎｈＩ）領域配列およびエンハンサーＩＩ（Ｅｎｈａｎｃｅｒ ＩＩ、ＥｎｈＩＩ）領域配列に相当する、Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡ（ＨＢＶ ＲＮＡ）配列の少なくとも１つの領域に結合するヒトタンパク質を阻害する医薬組成物が、ＨＢＶタンパク質の産生阻害能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を提供する。
＜１＞
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）の産生を阻害する医薬組成物であって、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害することを特徴とする、医薬組成物。
＜２＞
ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する配列であり、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列である、＜１＞に記載の医薬組成物。
＜３＞
ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する配列であり、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する配列である、＜１＞または＜２＞に記載の医薬組成物。
＜４＞
ＨＢＶタンパク質が、ＨＢｓ抗原タンパク質である、＜１＞～＜３＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜５＞
さらに、ＨＢＶゲノムＤＮＡの発現量を低下することを特徴とする、＜１＞～＜４＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜６＞
さらに、完全二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の発現量を低下することを特徴とする、＜１＞～＜５＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜７＞
ＲＮＡ結合タンパク質が、ＲＢＦＯＸ１、ＥＬＡＶＬ２、ＭＢＮＬ１、ＲＢＭＸ、ＳＲＳＦ９、ＳＲＳＦ１０、ＳＮＲＰＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＰＵＭ２、ＹＴＨＤＣ１、ＳＲＳＦ１、ＫＨＤＲＢＳ３およびＥＩＦ４Ｂより選択される少なくとも１つのタンパク質である、＜１＞～＜６＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜８＞
ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質を同定することを特徴とする、スクリーニング方法。
＜９＞
ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する配列であり、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列である、＜８＞に記載のスクリーニング方法。
＜１０＞
ＨＢＶタンパク質が、ＨＢｓ抗原タンパク質である、＜８＞または＜９＞に記載のスクリーニング方法。
＜１１＞
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質を同定する工程、
（ｂ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞に対し、同定したＲＮＡ結合タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質、または同タンパク質の発現量を低下させる被験物質を接触させる工程、
（ｃ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞におけるＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程、および
（ｄ）（ｃ）のＨＢＶタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程
を含む、方法。
＜１２＞
（ａ）が、ＲＮＡ結合タンパク質配列データベースを用いる工程を含む、＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞
（ｂ）の被験物質が、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系である、＜１１＞に記載の方法。
＜１４＞
（ｃ）が、ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞の培養上清中のＨＢＶタンパク質を測定する工程を含む、＜１１＞に記載の方法。
＜１５＞
（ｄ）の物質が、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系である、＜１１＞に記載の方法。
＜１＞
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）の産生を阻害する医薬組成物であって、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害することを特徴とする、医薬組成物。
＜２＞
ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する配列であり、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列である、＜１＞に記載の医薬組成物。
＜３＞
ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する配列であり、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する配列である、＜１＞または＜２＞に記載の医薬組成物。
＜４＞
ＨＢＶタンパク質が、ＨＢｓ抗原タンパク質である、＜１＞～＜３＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜５＞
さらに、ＨＢＶゲノムＤＮＡの発現量を低下することを特徴とする、＜１＞～＜４＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜６＞
さらに、完全二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の発現量を低下することを特徴とする、＜１＞～＜５＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜７＞
ＲＮＡ結合タンパク質が、ＲＢＦＯＸ１、ＥＬＡＶＬ２、ＭＢＮＬ１、ＲＢＭＸ、ＳＲＳＦ９、ＳＲＳＦ１０、ＳＮＲＰＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＰＵＭ２、ＹＴＨＤＣ１、ＳＲＳＦ１、ＫＨＤＲＢＳ３およびＥＩＦ４Ｂより選択される少なくとも１つのタンパク質である、＜１＞～＜６＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜８＞
ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質を同定することを特徴とする、スクリーニング方法。
＜９＞
ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する配列であり、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列である、＜８＞に記載のスクリーニング方法。
＜１０＞
ＨＢＶタンパク質が、ＨＢｓ抗原タンパク質である、＜８＞または＜９＞に記載のスクリーニング方法。
＜１１＞
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質を同定する工程、
（ｂ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞に対し、同定したＲＮＡ結合タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質、または同タンパク質の発現量を低下させる被験物質を接触させる工程、
（ｃ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞におけるＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程、および
（ｄ）（ｃ）のＨＢＶタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程
を含む、方法。
＜１２＞
（ａ）が、ＲＮＡ結合タンパク質配列データベースを用いる工程を含む、＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞
（ｂ）の被験物質が、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系である、＜１１＞に記載の方法。
＜１４＞
（ｃ）が、ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞の培養上清中のＨＢＶタンパク質を測定する工程を含む、＜１１＞に記載の方法。
＜１５＞
（ｄ）の物質が、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系である、＜１１＞に記載の方法。
また、本発明は、以下を提供する。
＜ａ＞
＜１＞～＜７＞のいずれか一つに記載の医薬組成物を、ＨＢＶに感染しているか、または、ＨＢＶ感染が関連する疾病にかかっている対象に投与することを含む、処置方法。
＜ｂ＞
ＨＢＶ感染が関連する疾病が、Ｂ型肝炎、それらによる肝硬変、またはそれらによる肝がんである、＜ａ＞に記載の処置方法。
＜ｃ＞
＜１＞～＜７＞のいずれか一つに記載の医薬組成物；および
ＨＢＶ感染が関連する疾病の処置方法が記載されている指示書
を含む、ＨＢＶ感染が関連する疾病の処置用キット。
＜ｄ＞
前記ＨＢＶ感染が関連する疾病の処置方法が、前記医薬組成物を、ＨＢＶに感染しているか、または、ＨＢＶ感染が関連する疾病にかかっている対象に投与することを含む、＜ｃ＞に記載のＨＢＶ感染が関連する疾病の処置用キット。
＜ｅ＞
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）の産生を阻害する処置において使用するための、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質。
＜ｆ＞
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）の産生を阻害する医薬組成物の製造のための、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質の使用。
＜ａ＞
＜１＞～＜７＞のいずれか一つに記載の医薬組成物を、ＨＢＶに感染しているか、または、ＨＢＶ感染が関連する疾病にかかっている対象に投与することを含む、処置方法。
＜ｂ＞
ＨＢＶ感染が関連する疾病が、Ｂ型肝炎、それらによる肝硬変、またはそれらによる肝がんである、＜ａ＞に記載の処置方法。
＜ｃ＞
＜１＞～＜７＞のいずれか一つに記載の医薬組成物；および
ＨＢＶ感染が関連する疾病の処置方法が記載されている指示書
を含む、ＨＢＶ感染が関連する疾病の処置用キット。
＜ｄ＞
前記ＨＢＶ感染が関連する疾病の処置方法が、前記医薬組成物を、ＨＢＶに感染しているか、または、ＨＢＶ感染が関連する疾病にかかっている対象に投与することを含む、＜ｃ＞に記載のＨＢＶ感染が関連する疾病の処置用キット。
＜ｅ＞
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）の産生を阻害する処置において使用するための、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質。
＜ｆ＞
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）の産生を阻害する医薬組成物の製造のための、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質の使用。
本発明の医薬組成物は、優れた抗ＨＢＶ活性を有し、抗ＨＢＶ剤として有用である。また、本発明のスクリーニング方法は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質のスクリーニングに有用である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、特に断らない限り、各用語は、次の意味を有する。
本明細書において、特に断らない限り、各用語は、次の意味を有する。
予防とは、発症の阻害、発症リスクの低減または発症の遅延などを意味する。
治療とは、対象となる疾患または状態の改善または進行の抑制などを意味する。
処置とは、各種疾患に対する予防または治療などを意味する。
有効量とは、治療有効量または予防有効量などを意味する。
治療有効量とは、感染した対象におけるＨＢＶ感染の安定化、ＨＢＶ感染の低減またはＨＢＶ感染の根絶に十分な量である。また、予防有効量とは、感染するリスクのある対象におけるＨＢＶ感染の予防に十分な量である。
対象とは、ヒトを含む哺乳動物を意味する。
治療とは、対象となる疾患または状態の改善または進行の抑制などを意味する。
処置とは、各種疾患に対する予防または治療などを意味する。
有効量とは、治療有効量または予防有効量などを意味する。
治療有効量とは、感染した対象におけるＨＢＶ感染の安定化、ＨＢＶ感染の低減またはＨＢＶ感染の根絶に十分な量である。また、予防有効量とは、感染するリスクのある対象におけるＨＢＶ感染の予防に十分な量である。
対象とは、ヒトを含む哺乳動物を意味する。
＜Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）＞
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、Ｂ型肝炎を発症させる能力を有するウイルスを意味する。ＨＢＶは遺伝子変異に由来する塩基配列の違いにより、現在Ａ型～Ｈ型までの８つの遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）に分類されている。本発明の医薬組成物における予防または治療の対象となるＨＢＶとしては、全ての遺伝子型を含む。
本発明において、ＨＢＶ感染が関連する疾病としては、Ｂ型肝炎が挙げられ、急性肝炎、慢性肝炎および劇症肝炎が挙げられる。また、ヒトを含む生体へのＨＢＶの感染により引き起こされる疾患であれば、肝硬変、肝線維化、肝細胞がんなどの肝がんも含まれる。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、Ｂ型肝炎を発症させる能力を有するウイルスを意味する。ＨＢＶは遺伝子変異に由来する塩基配列の違いにより、現在Ａ型～Ｈ型までの８つの遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）に分類されている。本発明の医薬組成物における予防または治療の対象となるＨＢＶとしては、全ての遺伝子型を含む。
本発明において、ＨＢＶ感染が関連する疾病としては、Ｂ型肝炎が挙げられ、急性肝炎、慢性肝炎および劇症肝炎が挙げられる。また、ヒトを含む生体へのＨＢＶの感染により引き起こされる疾患であれば、肝硬変、肝線維化、肝細胞がんなどの肝がんも含まれる。
＜Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）＞
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）は、ＨＢＶを構成するタンパク質であり、ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢｅ抗原などが挙げられる。
本発明において、ＨＢＶタンパク質は、特に限定されないが、ＨＢｓ抗原であることが好ましい。
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）は、ＨＢＶを構成するタンパク質であり、ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢｅ抗原などが挙げられる。
本発明において、ＨＢＶタンパク質は、特に限定されないが、ＨＢｓ抗原であることが好ましい。
＜ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列およびＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列＞
ＨＢＶゲノムＤＮＡ上には２つのエンハンサー領域（ＥｎｈＩおよびＥｎｈＩＩ）を有し、ＥｎｈＩおよびＥｎｈＩＩはＨＢＶゲノムＤＮＡからＨＢＶ ＲＮＡへの転写を促進することが知られている。
本発明において、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列およびＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列とは、ＨＢＶ ＲＮＡ配列のうち、ＨＢＶタンパク質をコードするＲＮＡの３’非翻訳領域（以下３’ＵＴＲともいう）内にある、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩに相当する領域の塩基配列、あるいはＨＢＶタンパク質をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内にある、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩに相当する領域の塩基配列を意味する。
本発明において、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列およびＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列とは、ＨＢＶ ＲＮＡ配列のうち、ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内にある、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩに相当する領域の塩基配列、あるいはＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内にある、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩに相当する領域の塩基配列が好ましい。
ＨＢＶゲノムＤＮＡ上には２つのエンハンサー領域（ＥｎｈＩおよびＥｎｈＩＩ）を有し、ＥｎｈＩおよびＥｎｈＩＩはＨＢＶゲノムＤＮＡからＨＢＶ ＲＮＡへの転写を促進することが知られている。
本発明において、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列およびＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列とは、ＨＢＶ ＲＮＡ配列のうち、ＨＢＶタンパク質をコードするＲＮＡの３’非翻訳領域（以下３’ＵＴＲともいう）内にある、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩに相当する領域の塩基配列、あるいはＨＢＶタンパク質をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内にある、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩに相当する領域の塩基配列を意味する。
本発明において、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列およびＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列とは、ＨＢＶ ＲＮＡ配列のうち、ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内にある、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩに相当する領域の塩基配列、あるいはＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内にある、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩに相当する領域の塩基配列が好ましい。
本発明において、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列は、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する配列が挙げられ、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列は、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列が挙げられる。
上記ＨＢＶ ＲＮＡは、ＨＢＶタンパク質をコードするＲＮＡであり、ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡであることが好ましい。
上記ＨＢＶ ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号１または配列番号２の配列が挙げられる。上記配列は、配列番号１または配列番号２の配列と８０％以上の配列同一性を有していることが好ましく、８５％がより好ましく、９０％がさらに好ましく、９５％がよりさらに好ましく、９８％がよりさらに好ましく、１００％の配列同一性を有していることが特に好ましい。
上記ＨＢＶ ＲＮＡは、ＨＢＶタンパク質をコードするＲＮＡであり、ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡであることが好ましい。
上記ＨＢＶ ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号１または配列番号２の配列が挙げられる。上記配列は、配列番号１または配列番号２の配列と８０％以上の配列同一性を有していることが好ましく、８５％がより好ましく、９０％がさらに好ましく、９５％がよりさらに好ましく、９８％がよりさらに好ましく、１００％の配列同一性を有していることが特に好ましい。
配列番号１：
uuauaugcauguauacaaucuaagcaggcuuucacuuucucgccaacuuacaaggccuuucuguguaaacaauaucugaaccuuuaccccguugcccggcaacggucaggucucugccaaguguuugcugacgcaacccccacuggauggggcuuggcuaucggccaucgccgcaugcguggaaccuuuguggcuccgcug
配列番号２：
uugcccaaggucuuauauaagaggacucuuggacucucagcgaugucaacgaccgaccuugaggcauacuucaaagacuguuuguuuaaggacugggaggaguugggggaggagauuagguuaaagauuuuugu
uuauaugcauguauacaaucuaagcaggcuuucacuuucucgccaacuuacaaggccuuucuguguaaacaauaucugaaccuuuaccccguugcccggcaacggucaggucucugccaaguguuugcugacgcaacccccacuggauggggcuuggcuaucggccaucgccgcaugcguggaaccuuuguggcuccgcug
配列番号２：
uugcccaaggucuuauauaagaggacucuuggacucucagcgaugucaacgaccgaccuugaggcauacuucaaagacuguuuguuuaaggacugggaggaguugggggaggagauuagguuaaagauuuuugu
＜ＲＮＡ結合タンパク質＞
ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、特定の標的ＲＮＡと配列特異的に結合し、ＲＮＡスプライシング、ポリアデニル化、キャッピング、修飾、輸送、局在化、翻訳、代謝回転など、転写後および転写後のタンパク質発現において様々な細胞機能を制御することが知られている（Ｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ、４９９巻、１１号、２０１３年）。
本発明において、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＨＢＶ ＲＮＡ上の特定の配列に結合することで、ＨＢＶタンパク質の発現（産生）を制御すると推測される。
上記ＨＢＶ ＲＮＡは、ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡであることが好ましい。
上記ＨＢＶ ＲＮＡ上の特定の配列は、例えば、配列番号１または配列番号２の配列が挙げられる。上記配列は、配列番号１または配列番号２の配列に対して、８０％以上の配列同一性を有していることが好ましく、８５％がより好ましく、９０％がさらに好ましく、９５％がよりさらに好ましく、９８％がよりさらに好ましく、１００％の配列同一性を有していることが特に好ましい。
ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、特定の標的ＲＮＡと配列特異的に結合し、ＲＮＡスプライシング、ポリアデニル化、キャッピング、修飾、輸送、局在化、翻訳、代謝回転など、転写後および転写後のタンパク質発現において様々な細胞機能を制御することが知られている（Ｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ、４９９巻、１１号、２０１３年）。
本発明において、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＨＢＶ ＲＮＡ上の特定の配列に結合することで、ＨＢＶタンパク質の発現（産生）を制御すると推測される。
上記ＨＢＶ ＲＮＡは、ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡであることが好ましい。
上記ＨＢＶ ＲＮＡ上の特定の配列は、例えば、配列番号１または配列番号２の配列が挙げられる。上記配列は、配列番号１または配列番号２の配列に対して、８０％以上の配列同一性を有していることが好ましく、８５％がより好ましく、９０％がさらに好ましく、９５％がよりさらに好ましく、９８％がよりさらに好ましく、１００％の配列同一性を有していることが特に好ましい。
本発明において、ＲＮＡ結合タンパク質は、上記配列上の４～９塩基を認識して結合するものが好ましく、例えば、ＲＢＦＯＸ１（RNA binding protein, fox-1 homolog）、ＥＬＡＶＬ２（ELAV like RNA binding protein 2）、ＭＢＮＬ１（muscleblind-like Protein 1）、ＲＢＭＸ（RNA-binding motif protein, X chromosome）、ＳＲＳＦ９（serine and arginine rich splicing factor 9）、ＳＲＳＦ１０（serine and arginine rich splicing factor 10）、ＳＮＲＰＡ（small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A）、ＥＬＡＶＬ１（ELAV like RNA binding protein 1）、ＰＵＭ２（pumilio homolog 2）、ＹＴＨＤＣ１（YTH domain containing 1）、ＳＲＳＦ１（serine and arginine rich splicing factor 1）、ＫＨＤＲＢＳ３（KH RNA binding domain containing, signal transduction associated 3）またはＥＩＦ４Ｂ（eukaryotic translation initiation factor 4B）などが挙げられる。
本発明のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＢＦＯＸ１、ＥＬＡＶＬ２、ＭＢＮＬ１、ＲＢＭＸ、ＳＲＳＦ９、ＳＲＳＦ１０、ＳＮＲＰＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＰＵＭ２、ＹＴＨＤＣ１、ＳＲＳＦ１、ＫＨＤＲＢＳ３、およびＥＩＦ４Ｂより選択される少なくとも１つのタンパク質であることが好ましい。
本発明のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＢＦＯＸ１、ＥＬＡＶＬ２、ＭＢＮＬ１、ＲＢＭＸ、ＳＲＳＦ９、ＳＲＳＦ１０、ＳＮＲＰＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＰＵＭ２、ＹＴＨＤＣ１、ＳＲＳＦ１、ＫＨＤＲＢＳ３、およびＥＩＦ４Ｂより選択される少なくとも１つのタンパク質であることが好ましい。
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、「物質」、具体的には「ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質」と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質として、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質を含む。
本発明の医薬組成物は、「物質」、具体的には「ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質」と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質として、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質を含む。
本発明の医薬組成物は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質が好ましく、ＨＢｓ抗原の産生を阻害する物質がより好ましい。
「物質」としては、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクター、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系などが挙げられる。
「アンチセンス核酸」は、あるタンパク質をコードする「センス」核酸、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖、ｍＲＮＡ配列または遺伝子のコード鎖の塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的とする塩基配列と特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。
「ＲＮＡｉ核酸」は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子の発現を干渉または阻害する核酸を含むが、それらに限定されない。
「二本鎖ＲＮＡ」は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子の発現を干渉または阻害する核酸を含むが、それらに限定されない。
「ＲＮＡ干渉剤」は、ＲＮＡ干渉を介して標的遺伝子の発現を干渉または阻害する核酸である。
ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いてｄｓＲＮＡと同じ配列を含むｍＲＮＡを分解する、転写後標的遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７巻，２４３１～２４３２頁、２０００年；Ｚａｍｏｒｅら、Ｃｅｌｌ、１０１巻、２５～３３頁、２０００年；Ｔｕｓｃｈｌら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３巻、３１９１～３１９７、１９９９年）。内因性リボヌクレアーゼが長いｄｓＲＮＡを切断し、より短い２１または２２ヌクレオチド長の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡを生成する場合に生じる。このｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの分解を仲介する。ＲＮＡｉの合成のためのキットは、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＡｍｂｉｏｎから商業的に入手可能である。一つの態様において、アンチセンスＲＮＡに使用するための上記化学の一つ以上が使用できる。
本発明の医薬組成物に含まれる物質としては、アンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡが好ましく、二本鎖ＲＮＡがより好ましい。
また、二本鎖ＲＮＡの場合、ＲＮＡ干渉剤であることが特に好ましい。
「ＲＮＡｉ核酸」は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子の発現を干渉または阻害する核酸を含むが、それらに限定されない。
「二本鎖ＲＮＡ」は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子の発現を干渉または阻害する核酸を含むが、それらに限定されない。
「ＲＮＡ干渉剤」は、ＲＮＡ干渉を介して標的遺伝子の発現を干渉または阻害する核酸である。
ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いてｄｓＲＮＡと同じ配列を含むｍＲＮＡを分解する、転写後標的遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７巻，２４３１～２４３２頁、２０００年；Ｚａｍｏｒｅら、Ｃｅｌｌ、１０１巻、２５～３３頁、２０００年；Ｔｕｓｃｈｌら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３巻、３１９１～３１９７、１９９９年）。内因性リボヌクレアーゼが長いｄｓＲＮＡを切断し、より短い２１または２２ヌクレオチド長の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡを生成する場合に生じる。このｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの分解を仲介する。ＲＮＡｉの合成のためのキットは、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＡｍｂｉｏｎから商業的に入手可能である。一つの態様において、アンチセンスＲＮＡに使用するための上記化学の一つ以上が使用できる。
本発明の医薬組成物に含まれる物質としては、アンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡが好ましく、二本鎖ＲＮＡがより好ましい。
また、二本鎖ＲＮＡの場合、ＲＮＡ干渉剤であることが特に好ましい。
「アデノ随伴ウイルス」は、パルボウイルス科に属する約４７００塩基からなる一本鎖ＤＮＡウイルスであり、エンベロープをもたず直径２０～３０ｎｍの正二十面体構造のキャプシドを有しており、細胞膜も普遍的成分であるヘパラン硫酸プロテオグリカンを認識して感染するため、宿主域は広い。
アデノ随伴ウイルスのゲノム内には、任意の遺伝子、核酸を挿入することができる。したがって、遺伝子改変を行ったアデノ随伴ウイルスを標的となる細胞に感染させることで目的の遺伝子、核酸を導入することができることから、アデノ随伴ウイルスは遺伝子導入のためのベクターとして用いることができる。さらに、「アデノ随伴ウイルスベクター」は、病原性がなく、終末分化した非分裂細胞にも遺伝子導入できるため、遺伝子治療への応用が期待されている。
アデノ随伴ウイルスは血清型の違いにより、組織および細胞への感染指向性が異なることが知られている（小澤ら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ、２２巻、６号、６４３～６５０頁、２００７年）。
本発明の医薬組成物に含まれる物質としては、アデノ随伴ウイルス５型、アデノ随伴ウイルス７型、アデノ随伴ウイルス８型またはアデノ随伴ウイルス９型が好ましく、アデノ随伴ウイルス８型がより好ましい。
アデノ随伴ウイルスのゲノム内には、任意の遺伝子、核酸を挿入することができる。したがって、遺伝子改変を行ったアデノ随伴ウイルスを標的となる細胞に感染させることで目的の遺伝子、核酸を導入することができることから、アデノ随伴ウイルスは遺伝子導入のためのベクターとして用いることができる。さらに、「アデノ随伴ウイルスベクター」は、病原性がなく、終末分化した非分裂細胞にも遺伝子導入できるため、遺伝子治療への応用が期待されている。
アデノ随伴ウイルスは血清型の違いにより、組織および細胞への感染指向性が異なることが知られている（小澤ら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ、２２巻、６号、６４３～６５０頁、２００７年）。
本発明の医薬組成物に含まれる物質としては、アデノ随伴ウイルス５型、アデノ随伴ウイルス７型、アデノ随伴ウイルス８型またはアデノ随伴ウイルス９型が好ましく、アデノ随伴ウイルス８型がより好ましい。
「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系」は、真性細菌や古細菌が有する獲得免疫として発見されたＣｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムをゲノム編集に転用したシステムである（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７巻、８１６～８２１頁、２０１２年）。具体的には、上記細菌のＣＲＩＳＰＲ領域と呼ばれるゲノム領域には、断片化された外来ＤＮＡ（２０ｂｐ）が取り込まれたカセットが複数リピートしており、各カセットには、異なる外来ＤＮＡが取り込まれている。
各カセットは、外来生物（例えば、ファージなど）のＤＮＡが細胞内に取り込まれた場合にこれを断片化してＣＲＩＳＰＲ領域に組み込むことで生じると考えられる。
各カセットは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードしている。ｃｒＲＮＡは、プロトスペーサー配列と後述するｔｒａｎｓ－ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と相補的な配列とを有する。プロトスペーサー配列は、２０ヌクレオチド長であり、標的となるＤＮＡ配列と相補的な配列を有する。プロトスペーサー配列は、標的配列と１００％の相補性を有している必要はなく、５’末端から６ヌクレオチドの領域ではミスマッチが許容される。ｃｒＲＮＡは、相補的部分を介して別に転写されるｔｒａｎｓ－ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合体を形成する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとさらなる複合体を形成する。ｃｒＲＮＡ中のプロトスペーサー部分は、外来ＤＮＡと相補的にハイブリッド形成を行い、これによりＣａｓ９エンドヌクレアーゼを外来ＤＮＡの標的配列に先導する。外来ＤＮＡは標的配列の部位においてＣａｓ９エンドヌクレアーゼにより切断され、ＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムは、外来ＤＮＡから宿主を防御する。
このようにＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムは、真性細菌や古細菌が新しい外来ＤＮＡに対する獲得免疫として機能することで発見されたものであるが、外来ＤＮＡからなるプロトスペーサーを設計することで、哺乳動物のゲノムを配列依存的に切断できること、およびそれにより、哺乳動物のゲノムを編集することができる。
「ＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓベクター系」とは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの機能を併せ持つガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびＣａｓ遺伝子配列を含んでなるベクター系である。現在主に使用されているシステムは、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する第２種のＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムであるが、これに限定されない。
各カセットは、外来生物（例えば、ファージなど）のＤＮＡが細胞内に取り込まれた場合にこれを断片化してＣＲＩＳＰＲ領域に組み込むことで生じると考えられる。
各カセットは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードしている。ｃｒＲＮＡは、プロトスペーサー配列と後述するｔｒａｎｓ－ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と相補的な配列とを有する。プロトスペーサー配列は、２０ヌクレオチド長であり、標的となるＤＮＡ配列と相補的な配列を有する。プロトスペーサー配列は、標的配列と１００％の相補性を有している必要はなく、５’末端から６ヌクレオチドの領域ではミスマッチが許容される。ｃｒＲＮＡは、相補的部分を介して別に転写されるｔｒａｎｓ－ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合体を形成する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとさらなる複合体を形成する。ｃｒＲＮＡ中のプロトスペーサー部分は、外来ＤＮＡと相補的にハイブリッド形成を行い、これによりＣａｓ９エンドヌクレアーゼを外来ＤＮＡの標的配列に先導する。外来ＤＮＡは標的配列の部位においてＣａｓ９エンドヌクレアーゼにより切断され、ＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムは、外来ＤＮＡから宿主を防御する。
このようにＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムは、真性細菌や古細菌が新しい外来ＤＮＡに対する獲得免疫として機能することで発見されたものであるが、外来ＤＮＡからなるプロトスペーサーを設計することで、哺乳動物のゲノムを配列依存的に切断できること、およびそれにより、哺乳動物のゲノムを編集することができる。
「ＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓベクター系」とは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの機能を併せ持つガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびＣａｓ遺伝子配列を含んでなるベクター系である。現在主に使用されているシステムは、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する第２種のＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムであるが、これに限定されない。
また、薬学的に許容され得る担体とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤などが挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、粉体製剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、貼付剤、軟膏剤、注射剤、液剤、トローチ剤あるいはエリキシル剤などの形態の医薬組成物を調製することができる。
これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、定法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤などが含まれる。
また、本発明の医薬組成物の投与量および投与回数は、患者の性別、体重、年齢、重症度および症状などに応じて適宜選択することができる。通常、成人に対しては、経口または非経口（例えば、注射、点滴および直腸部位への投与など）投与により、１日当たり０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇを１回から数回に分割して投与すればよい。
これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、定法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤などが含まれる。
また、本発明の医薬組成物の投与量および投与回数は、患者の性別、体重、年齢、重症度および症状などに応じて適宜選択することができる。通常、成人に対しては、経口または非経口（例えば、注射、点滴および直腸部位への投与など）投与により、１日当たり０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇを１回から数回に分割して投与すればよい。
本発明の医薬組成物は、さらにＨＢＶ ＤＮＡの発現量を低下することが好ましい。
本発明の医薬組成物は、さらに完全二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の発現量を低下することが好ましい。
本発明の医薬組成物は、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列の少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害するための医薬品として、または、上記ＲＮＡ結合タンパク質が関与する疾患の発症または進行を抑制、阻害し、上記疾患を治療または予防するための医薬品として有用である。
＜スクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法として有用である。
本発明のスクリーニング方法は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法として有用である。
本発明のスクリーニング方法は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質を同定することを特徴とする、スクリーニング方法として有用である。
本発明のスクリーニング方法は、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号1と８０％以上の配列同一性を有する配列であり、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列であることが好ましい。
本発明のスクリーニング方法はまた、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質として、ＨＢｓ抗原の産生を阻害する物質を同定することが好ましい。
本発明のスクリーニング方法は、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号1と８０％以上の配列同一性を有する配列であり、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列が、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列であることが好ましい。
本発明のスクリーニング方法はまた、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質として、ＨＢｓ抗原の産生を阻害する物質を同定することが好ましい。
本発明のスクリーニング方法としては、
（ａ）ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質を同定する工程、
（ｂ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞に対し、同定したＲＮＡ結合タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質、または同タンパク質の発現量を低下させる被験物質を接触させる工程、
（ｃ）ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞におけるＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程、および
（ｄ）（ｃ）のＨＢＶタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程、
を含む方法が挙げられる。
（ａ）ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質を同定する工程、
（ｂ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞に対し、同定したＲＮＡ結合タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質、または同タンパク質の発現量を低下させる被験物質を接触させる工程、
（ｃ）ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞におけるＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程、および
（ｄ）（ｃ）のＨＢＶタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程、
を含む方法が挙げられる。
（ａ）ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質を同定する工程
例えば、ＲＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａＢａｓｅ、ＲＢＰＤＢのような公共のＲＮＡ結合タンパク質配列データベースを活用することが挙げられる。活用する公共のＲＮＡ結合タンパク質配列データベースとしては、とくに限定されない。ＲＢＰＤＢまたはこれに準じるデータベースに対し、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列またはＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列を入力することにより、これら領域配列に結合するＲＮＡ結合タンパクを抽出することができる。
また、例えば、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞由来の細胞抽出液と、試験管内で転写されたＨＢＶ ゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列またはＥｎｈＩＩ領域配列に相当する配列を有するＲＮＡを用いたプルダウンアッセイを行い、得られた結合タンパク質を質量分析装置にて特定する方法またはこれらに準じる方法が挙げられる。
例えば、ＲＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａＢａｓｅ、ＲＢＰＤＢのような公共のＲＮＡ結合タンパク質配列データベースを活用することが挙げられる。活用する公共のＲＮＡ結合タンパク質配列データベースとしては、とくに限定されない。ＲＢＰＤＢまたはこれに準じるデータベースに対し、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列またはＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ ＲＮＡ配列を入力することにより、これら領域配列に結合するＲＮＡ結合タンパクを抽出することができる。
また、例えば、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞由来の細胞抽出液と、試験管内で転写されたＨＢＶ ゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列またはＥｎｈＩＩ領域配列に相当する配列を有するＲＮＡを用いたプルダウンアッセイを行い、得られた結合タンパク質を質量分析装置にて特定する方法またはこれらに準じる方法が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法は、（ａ）が、ＲＮＡ結合タンパク質配列データベースを用いる工程を含む方法であることが好ましい。
また、別の態様として、（ａ）が、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列またはＥｎｈＩＩ領域配列に相当する配列を有するＲＮＡを用いたプルダウンアッセイを行う工程を含む方法であることが好ましい。
また、別の態様として、（ａ）が、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列またはＥｎｈＩＩ領域配列に相当する配列を有するＲＮＡを用いたプルダウンアッセイを行う工程を含む方法であることが好ましい。
（ｂ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞に対し、同定したＲＮＡ結合タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質、または同タンパク質の発現量を低下させる被験物質を接触させる工程
ＨＢＶに感染した細胞としては、例えば、ＨＢＶクローンＣ＿ＪＰＮＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１）に感染したヒト初代培養肝細胞、あるいはｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＮＴＣＰ）を強制発現させたＨｅｐＧ２細胞であって、ＨＢＶクローンＣ＿ＪＰＮＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１）に感染した細胞が挙げられる。上記のＨＢＶクローンと細胞の組み合わせについては、とくに限定されない。
ＨＢＶを発現する細胞としては、例えば、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞、あるいはＨＢＶクローンＣ＿ＪＰＮＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１）のゲノム配列を１．２４倍長化した配列を含んでなるプラスミドを強制発現させたＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ－７細胞、ＨｅｐａＲＧ細胞、あるいはヒト初代培養肝細胞が挙げられる。上記のＨＢＶクローンについては、とくに限定されない。また、上記のＨＢＶクローンのゲノム配列を含んでなるプラスミドに挿入されるＨＢＶゲノム由来の配列の長さについては、ＨＢＶクローンのゲノム配列の１．２４倍長以上であれば、とくに限定されない。
ＨＢＶに感染した細胞としては、例えば、ＨＢＶクローンＣ＿ＪＰＮＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１）に感染したヒト初代培養肝細胞、あるいはｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＮＴＣＰ）を強制発現させたＨｅｐＧ２細胞であって、ＨＢＶクローンＣ＿ＪＰＮＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１）に感染した細胞が挙げられる。上記のＨＢＶクローンと細胞の組み合わせについては、とくに限定されない。
ＨＢＶを発現する細胞としては、例えば、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞、あるいはＨＢＶクローンＣ＿ＪＰＮＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１）のゲノム配列を１．２４倍長化した配列を含んでなるプラスミドを強制発現させたＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ－７細胞、ＨｅｐａＲＧ細胞、あるいはヒト初代培養肝細胞が挙げられる。上記のＨＢＶクローンについては、とくに限定されない。また、上記のＨＢＶクローンのゲノム配列を含んでなるプラスミドに挿入されるＨＢＶゲノム由来の配列の長さについては、ＨＢＶクローンのゲノム配列の１．２４倍長以上であれば、とくに限定されない。
被験物質としては、例えば、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクター、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系などから選ばれた物質が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法に用いる被験物質としては、アンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡが好ましく、二本鎖ＲＮＡがより好ましい。
また、二本鎖ＲＮＡの場合、ＲＮＡ干渉剤であることが特に好ましい。
本発明のスクリーニング方法に用いる被験物質としては、アンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡが好ましく、二本鎖ＲＮＡがより好ましい。
また、二本鎖ＲＮＡの場合、ＲＮＡ干渉剤であることが特に好ましい。
ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞と被験物質との接触は、例えば、培養培地に被検物質を添加し、一定期間培養することで実施できる。添加される被験物質の濃度は物質の種類（溶解度、毒性など）により異なるが、例えば、約０．１ｎｍｏｌ／Ｌ～約１００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲で適宜選択される。培養時間としては、例えば、約２４時間～約１２０時間が挙げられる。
（ｃ）ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞におけるＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程
ＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程としては、ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞の培養上清中のＨＢＶタンパク質を測定する方法が挙げられる。
例えば、回収した培養上清を用いて化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、あるいは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）などの方法またはこれらに準じる方法で、ＨＢＶタンパク質を測定することできる。
ＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程としては、ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞の培養上清中のＨＢＶタンパク質を測定する方法が挙げられる。
例えば、回収した培養上清を用いて化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、あるいは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）などの方法またはこれらに準じる方法で、ＨＢＶタンパク質を測定することできる。
（ｄ）（ｃ）のＨＢＶタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程
例えば、（ｃ）において被験物質を作用させることにより、陰性対照に比べて、ＨＢＶタンパク質の産生を、３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、よりさらに好ましくは９０％以上抑制する物質を選択することができる。
例えば、（ｃ）において被験物質を作用させることにより、陰性対照に比べて、ＨＢＶタンパク質の産生を、３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、よりさらに好ましくは９０％以上抑制する物質を選択することができる。
＜医薬組成物の用途＞
本発明の医薬組成物は、ＨＢＶ感染の治療または予防において有用である。
本発明の医薬組成物は、ＨＢＶ感染の治療または予防において有用である。
本発明の医薬組成物は、ＨＢＶタンパク質の産生、特にＨＢｓ抗原の産生を阻害することができる。また、ＨＢＶ遺伝子発現（ＨＢＶのＤＮＡ産生）を阻害することができる。したがって、本発明の医薬組成物は、ＨＢＶ感染の治療または予防のために有用である。
本発明は、ＨＢｓ抗原の産生の阻害のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
本発明は、ＨＢＶのＤＮＡ産生の阻害のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
本発明は、ＨＢＶの遺伝子発現の阻害のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
本発明は、ＨＢＶのＤＮＡ産生の阻害のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
本発明は、ＨＢＶの遺伝子発現の阻害のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
本発明は、ＨＢＶ感染の治療または予防のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
ＨＢＶ感染に関連する疾病には、進行性肝線維症、炎症および壊死が含まれ、これらは肝硬変、末期肝疾患および肝細胞癌に進行する。
ＨＢＶ感染に関連する疾病には、進行性肝線維症、炎症および壊死が含まれ、これらは肝硬変、末期肝疾患および肝細胞癌に進行する。
次に、本発明について試験例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[試験例１]
（ＥｎｈＩ／ＥｎｈＩＩ領域欠損コンストラクトを用いたレポーターアッセイ）
ＰＣＲ反応は１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）、０．２μｍｏｌ／Ｌプライマーを含む反応液中で行った。ＨＢＶゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１；以下「遺伝子型Ｃ」ともいう）を鋳型にして、ＰｒｅＳ２／Ｓプロモーターを含む領域４１０ｂｐを、配列番号３の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１５秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。同様にして、ＨＢｓ抗原をコードする遺伝子の３’非翻訳領域（以下「３’ＵＴＲ」ともいう）の配列を含む領域１０８６ｂｐを、配列番号５の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１５秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＸｂａＩとＳａｌＩの制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。それぞれの断片をＫｐｎＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせ、またはＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせで処理し、ｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＫｐｎI、ＨｉｎｄＩＩＩの部位にまたはＸｂａＩ、ＳａｌＩの部位に挿入して連結したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ」ともいう。なお、後述する試験例４では、遺伝子型の違いを明確にするために、「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミドを鋳型にして、配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号９の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミド中のＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ ｄＥｎｈＩ」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミドを鋳型にして、配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１１の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号１０の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１２の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミド中のＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ ｄＥｎｈＩＩ」ともいう。
（ＥｎｈＩ／ＥｎｈＩＩ領域欠損コンストラクトを用いたレポーターアッセイ）
ＰＣＲ反応は１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）、０．２μｍｏｌ／Ｌプライマーを含む反応液中で行った。ＨＢＶゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１；以下「遺伝子型Ｃ」ともいう）を鋳型にして、ＰｒｅＳ２／Ｓプロモーターを含む領域４１０ｂｐを、配列番号３の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１５秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。同様にして、ＨＢｓ抗原をコードする遺伝子の３’非翻訳領域（以下「３’ＵＴＲ」ともいう）の配列を含む領域１０８６ｂｐを、配列番号５の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１５秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＸｂａＩとＳａｌＩの制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。それぞれの断片をＫｐｎＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせ、またはＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせで処理し、ｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＫｐｎI、ＨｉｎｄＩＩＩの部位にまたはＸｂａＩ、ＳａｌＩの部位に挿入して連結したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ」ともいう。なお、後述する試験例４では、遺伝子型の違いを明確にするために、「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミドを鋳型にして、配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号９の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミド中のＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ ｄＥｎｈＩ」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミドを鋳型にして、配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１１の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号１０の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１２の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミド中のＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ ｄＥｎｈＩＩ」ともいう。
肝芽細胞腫（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞株ＨｅｐＧ２にＨＢＶゲノムが導入された、持続的にウイルスを産生する細胞であるＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４巻 １００５頁～１００９頁 １９８７年）を用いて、以下の手順でレポーターアッセイを実施した。
細胞培養用培地として、以下を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）＋５μｇ／ｍＬインスリン（Ｗａｋｏ社製）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ社製）＋５０μｍｏｌ／Ｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）
細胞培養用培地として、以下を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）＋５μｇ／ｍＬインスリン（Ｗａｋｏ社製）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ社製）＋５０μｍｏｌ／Ｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、１ウェルあたり１×１０４ｃｅｌｌ／１００μＬとなるよう９６穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間インキュベートした。０．０６２μｇのＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミド、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ ｄＥｎｈＩプラスミド、またはＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ ｄＥｎｈＩＩプラスミドのいずれか、および０．２５ｎｇのｐＲＬ－ＳＶ４０プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、０．２３μＬのＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を、７．８μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で２０分インキュベートした。このプラスミド－ＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ混合液８μＬを前述のＨｅｐＧ２．２．１５を播種したウェルに添加し、２４時間インキュベートした。次に前述の細胞培養用培地１００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに４８時間インキュベートした。インキュベート後Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にてホタルルシフェラーゼによる発光およびウミシイタケルシフェラーゼによる発光を検出した。各ウェルについてウミシイタケルシフェラーゼの発光量で補正したホタルルシフェラーゼの発光量を算出した結果を、図１に示した。また、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミド添加ウェル中のホタルルシフェラーゼの発光量に対する各欠損プラスミド添加ウェル中のルシフェラーゼの発光量の相対値（％）を算出した結果を、図１に示した。
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、１ウェルあたり２×１０５ｃｅｌｌ／１０００μＬとなるよう１２穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間インキュベートした。１μｇのＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミド、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ ｄＥｎｈＩプラスミド、またはＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ ｄＥｎｈＩＩプラスミドのいずれか、および３μＬのＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を、９７μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で２０分インキュベートした。このプラスミド－ＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ混合液１００μＬを前述のＨｅｐＧ２．２．１５を播種したウェルに添加し、２４時間インキュベートした。次に前述の細胞培養用培地１０００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに２４時間インキュベートした。そして培養上清を廃棄し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（１０００μＬ／ウェル、富士フイルム和光純薬社製）で洗浄、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎi Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ１μｇを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡをもとにホタルルシフェラーゼＲＮＡの発現量を定量し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミドをトランスフェクションしたウェル中のホタルルシフェラーゼＲＮＡの発現量に対する各プラスミド添加ウェル中のホタルルシフェラーゼＲＮＡの発現量の相対値（％）を算出した結果を、図２に示した。
ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が７０％～８０％程度減少した（図１）。したがって、上記現象は、ＤＮＡ配列からＥｎｈＩ領域もしくはＥｎｈＩＩ領域が欠損されたことによる転写活性の減少（ホタルルシフェラーゼＲＮＡ発現量の減少）に起因する可能性、またはＲＮＡ配列からＥｎｈＩに相当する領域もしくはＥｎｈＩＩに相当する領域が欠損されたことによるＲＮＡの機能変化に起因する可能性、が考えられた。そこで、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量を解析した結果、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量はほとんど変化しなかった（図２）。このことから、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損による相対発光量の減少は、ＲＮＡ配列からＥｎｈＩに相当する領域またはＥｎｈＩＩに相当する領域が欠損されたことによるＲＮＡの機能変化に起因することが明らかとなった。すなわち、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩに相当する領域またはＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩに相当する領域はＲＮＡ上で機能し、タンパク質の発現量を制御することが明らかとなった。
[試験例２]
（ＲＮＡ結合タンパク質のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ同定）
ＥｎｈＩに相当する領域、ＥｎｈＩＩに相当する領域がＲＮＡ上で機能することから、これらの領域に結合するＲＮＡ結合タンパク質の同定を試みた。推定上のＲＮＡ結合タンパク質は、公共のＲＮＡ結合タンパク質配列データベース（ＲＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａＢａｓｅ、ＲＢＰＤＢ）に対しＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内ＥｎｈＩ相当領域（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５、塩基番号１０６０番～１２６０番からなるＥｎｈＩ領域に相当するＲＮＡ配列、配列番号１）、あるいはＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内ＥｎｈＩＩ相当領域（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５、塩基番号１６３８番～１７７１番からなるＥｎｈＩＩ領域に相当するＲＮＡ配列、配列番号２）を入力、結合タンパク質予測プログラムを実行することによって同定した。ＲＢＰＤＢは、ヒト、マウス、ハエなどを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験から得られたＲＮＡ結合タンパク質とその結合配列に関する情報を蓄積したデータベースであり、ＲＮＡの塩基配列を入力することにより当該配列をもつＲＮＡに結合すると推定されるＲＮＡ結合タンパク質を抽出することが可能である（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３９巻、Ｄ３０1頁～Ｄ３０８頁、２０１１）。
（ＲＮＡ結合タンパク質のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ同定）
ＥｎｈＩに相当する領域、ＥｎｈＩＩに相当する領域がＲＮＡ上で機能することから、これらの領域に結合するＲＮＡ結合タンパク質の同定を試みた。推定上のＲＮＡ結合タンパク質は、公共のＲＮＡ結合タンパク質配列データベース（ＲＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａＢａｓｅ、ＲＢＰＤＢ）に対しＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内ＥｎｈＩ相当領域（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５、塩基番号１０６０番～１２６０番からなるＥｎｈＩ領域に相当するＲＮＡ配列、配列番号１）、あるいはＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内ＥｎｈＩＩ相当領域（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５、塩基番号１６３８番～１７７１番からなるＥｎｈＩＩ領域に相当するＲＮＡ配列、配列番号２）を入力、結合タンパク質予測プログラムを実行することによって同定した。ＲＢＰＤＢは、ヒト、マウス、ハエなどを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験から得られたＲＮＡ結合タンパク質とその結合配列に関する情報を蓄積したデータベースであり、ＲＮＡの塩基配列を入力することにより当該配列をもつＲＮＡに結合すると推定されるＲＮＡ結合タンパク質を抽出することが可能である（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３９巻、Ｄ３０1頁～Ｄ３０８頁、２０１１）。
ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡ上のＥｎｈＩ相当領域およびＥｎｈＩＩ相当領域の少なくとも１つの領域に対し、複数のＲＮＡ結合タンパク質が結合することが予想された。
［試験例３］
（抗ＨＢＶアッセイ）
肝芽細胞腫（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞株ＨｅｐＧ２にＨＢＶゲノムが導入された、持続的にウイルスを産生する細胞であるＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４巻 １００５頁～１００９頁 １９８７年）を用いて、各分子の阻害による抗ＨＢＶ効果を以下の手順で評価した。
細胞培養用培地として、以下を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）＋５μｇ／ｍＬインスリン（Ｗａｋｏ社製）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ社製）＋５０μｍｏｌ／Ｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）
（抗ＨＢＶアッセイ）
肝芽細胞腫（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞株ＨｅｐＧ２にＨＢＶゲノムが導入された、持続的にウイルスを産生する細胞であるＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４巻 １００５頁～１００９頁 １９８７年）を用いて、各分子の阻害による抗ＨＢＶ効果を以下の手順で評価した。
細胞培養用培地として、以下を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）＋５μｇ／ｍＬインスリン（Ｗａｋｏ社製）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ社製）＋５０μｍｏｌ／Ｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）
（１） トランスフェクションに用いたｄｓＲＮＡは、以下のものを使用した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）。ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＲＢＦＯＸ１ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１３３７７－０１）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＥＬＡＶＬ１ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－００３７７３－００）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＥＬＡＶＬ２ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１９８０１－００）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＭＢＮＬ１ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１４１３６－００）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＲＢＭＸ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１１６９１－０１）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＰＵＭ２ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１４０３１－０２）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＹＴＨＤＣ１ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１５３３２－０２）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＲＳＦ１ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１８６７２－０１）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＲＳＦ９ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１９５２９－０１）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＲＳＦ１０ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－００７２７８－００）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＫＨＤＲＢＳ３ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１２７４８－０１）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＥＩＦ４Ｂ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０２０１７９－００）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＮＲＰＡ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１９４３５－０２）。また、ｏｎ－ｔａＲｇｅＴｐｌｕｓ Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｏｏｌ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を陰性対照ｄｓＲＮＡとして用いた。
（２）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬのＨｅｐＧ２．２．１５細胞懸濁液を調製した。ｄｓＲＮＡをＮｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（ｎｏｔ ＤＥＰＣ－Ｔｒｅａｔｅｄ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて希釈し、２．７４３～２０００ｎｍｏｌ／Ｌ、３倍希釈系列のｄｓＲＮＡ溶液を調製した。１．５μＬの調製済みｄｓＲＮＡ溶液および０．３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、８．２μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で５分インキュベートした。このｄｓＲＮＡ－Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ混合液１０μＬを細胞培養用培地４０μＬで希釈し、５０μＬとした。これを前述のＨｅｐＧ２．２．１５細胞懸濁液５０μＬと混合し、９６穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で３日間インキュベートした（ｄｓＲＮＡの最終濃度：０．９１～３０ｎｍｏｌ／Ｌ、３倍希釈系列）。次に前述の細胞培養用培地１００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに３日間インキュベートした。そして培養上清を回収するとともに、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞生存率を測定した。回収した培養上清中のＨＢｓ抗原量を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＢｓＡｇ）Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて測定した。また、回収した培養上清をＢｕｆｆｅｒ ＡＬ（Ｑｉａｇｅｎ社製）およびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の混合物で処理し、得られた溶液中のＨＢＶのＤＮＡ（ＨＢＶ ＤＮＡ）を、リアルタイムＰＣＲ法にて定量した。各マーカーについて、各濃度の陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェルに対する各ｄｓＲＮＡ添加ウェルの相対値（％）を算出した（図３および図４）。
ＲＢＦＯＸ１、ＳＲＳＦ１０、ＥＬＡＶＬ１、ＰＵＭ２のノックダウンにより、ＨＢｓ抗原が最大３０％程度減少し、ＳＲＳＦ９、ＳＮＲＰＡ、ＹＴＨＤＣ１、ＳＲＳＦ１のノックダウンにより、ＨＢｓ抗原が最大７０～９０％程度減少した（図３）。また、ＰＵＭ２、ＳＲＳＦ１のノックダウンにより、ＨＢＶ ＤＮＡが最大４０～５０％程度減少し、ＹＴＨＤＣ１のノックダウンにより、ＨＢＶ ＤＮＡが最大８０％程度減少した。一方、これら遺伝子のノックダウンは細胞生存率に影響を与えなかった（図４）。以上より、ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡ上のＥｎｈＩ相当領域およびＥｎｈＩＩ相当領域に結合するタンパク質を阻害することによりＨＢＶタンパク質の産生阻害やＨＢＶ ＤＮＡ発現量の低下などの抗ＨＢＶ効果が得られることが明らかとなった。
[試験例４]
（ＥｎｈＩ／ＥｎｈＩＩ領域欠損コンストラクトを用いたアッセイ、遺伝子型の検討）
ＰＣＲ反応は１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）、０．２μｍｏｌ／Ｌプライマーを含む反応液中で行った。ＨＢＶゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ４６２０４１．１；以下「遺伝子型Ａ」ともいう）を鋳型にして、ＨＢｓ抗原をコードする遺伝子の３’ＵＴＲの配列（以下「３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）」ともいう）を含む領域１０８６ｂｐを、配列番号１３の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１４の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＸｂａＩとＳａｌＩの制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。この断片をＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせで処理し、試験例１で作製したＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）のＸｂａＩ、ＳａｌＩの部位に挿入して連結したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）プラスミドを鋳型にして、配列番号１５の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１６の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）プラスミド中のＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩ」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）プラスミドを鋳型にして、配列番号１７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１８の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）プラスミド中のＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩＩ」ともいう。
（ＥｎｈＩ／ＥｎｈＩＩ領域欠損コンストラクトを用いたアッセイ、遺伝子型の検討）
ＰＣＲ反応は１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）、０．２μｍｏｌ／Ｌプライマーを含む反応液中で行った。ＨＢＶゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ４６２０４１．１；以下「遺伝子型Ａ」ともいう）を鋳型にして、ＨＢｓ抗原をコードする遺伝子の３’ＵＴＲの配列（以下「３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）」ともいう）を含む領域１０８６ｂｐを、配列番号１３の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１４の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＸｂａＩとＳａｌＩの制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。この断片をＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせで処理し、試験例１で作製したＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）のＸｂａＩ、ＳａｌＩの部位に挿入して連結したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）プラスミドを鋳型にして、配列番号１５の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１６の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）プラスミド中のＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩ」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）プラスミドを鋳型にして、配列番号１７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１８の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）プラスミド中のＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩＩ」ともいう。
ＨＢＶゲノムＤＮＡ（配列番号１９、以下「遺伝子型Ｂ」ともいう）を鋳型にして、ＨＢｓ抗原をコードする遺伝子の３’ＵＴＲの配列（以下「３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）」ともいう）を含む領域１０９５ｂｐを、配列番号２０の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２１の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＸｂａＩとＳａｌＩの制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。この断片をＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせで処理し、試験例１で作製したＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）のＸｂａＩ、ＳａｌＩの部位に挿入して連結したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）プラスミドを鋳型にして、配列番号２２の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２３の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）プラスミド中のＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）ｄＥｎｈＩ」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）プラスミドを鋳型にして、配列番号２４の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２５の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）プラスミド中のＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）ｄＥｎｈＩＩ」ともいう。
ＨＢＶゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ９５５５１．１；以下「遺伝子型Ｄ」ともいう）を鋳型にして、ＨＢｓ抗原をコードする遺伝子の３’ＵＴＲの配列（以下「３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）」ともいう）を含む領域１０８６ｂｐを、配列番号２６の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２７の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１５秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＸｂａＩとＳａｌＩの制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。この断片をＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせで処理し、試験例１で作製したＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）のＸｂａＩ、ＳａｌＩの部位に挿入して連結したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）プラスミドを鋳型にして、配列番号２８の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２９の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）プラスミド中のＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）ｄＥｎｈＩ」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）プラスミドを鋳型にして、配列番号３０の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号３１の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）プラスミド中のＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）ｄＥｎｈＩＩ」ともいう。
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を用いて、以下の手順でレポーターアッセイを実施した。
細胞培養用培地として、以下を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）＋５μｇ／ｍＬインスリン（富士フイルム和光純薬社製）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（富士フイルム和光純薬社製）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（富士フイルム和光純薬社製）＋５０μｍｏｌ／Ｌヒドロコルチゾン（富士フイルム和光純薬社製）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）
細胞培養用培地として、以下を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）＋５μｇ／ｍＬインスリン（富士フイルム和光純薬社製）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（富士フイルム和光純薬社製）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（富士フイルム和光純薬社製）＋５０μｍｏｌ／Ｌヒドロコルチゾン（富士フイルム和光純薬社製）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、１ウェルあたり１×１０４ｃｅｌｌ／１００μＬとなるよう９６穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩インキュベートした。６４ｎｇの各種プラスミド（ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）ｄＥｎｈＩＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）ｄＥｎｈＩＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）ｄＥｎｈＩＩ）のいずれか、および０．２５ｎｇのｐＲＬ－ＳＶ４０プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、０．２４μＬのＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を、７．８μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で２０分インキュベートした。このプラスミド－ＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ混合液８μＬを前述のＨｅｐＧ２．２．１５を播種したウェルに添加し、さらに１日インキュベートした。次に前述の細胞培養用培地１００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに２４時間インキュベートした。インキュベート後Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にてホタルルシフェラーゼによる発光およびウミシイタケルシフェラーゼによる発光を検出した。各ウェルについてウミシイタケルシフェラーゼの発光量で補正したホタルルシフェラーゼの発光量を算出した。そして、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）の各プラスミド添加ウェル中のホタルルシフェラーゼの発光量に対する各遺伝子型の欠損プラスミド添加ウェル中のルシフェラーゼの発光量の相対値（％）を算出した結果を、図５に示した。
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、１ウェルあたり１×１０５ｃｅｌｌ／５００μＬとなるよう２４穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩インキュベートした。５００ｎｇの各種プラスミド（ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）ｄＥｎｈＩＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）ｄＥｎｈＩＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）ｄＥｎｈＩＩ）のいずれか、および１．５μＬのＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を、５０μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で２０分インキュベートした。このプラスミド－ＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ混合液５２μＬを前述のＨｅｐＧ２．２．１５を播種したウェルに添加し、一晩インキュベートした。次に前述の細胞培養用培地５００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに１日インキュベートした。そして培養上清を廃棄し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（１０００μＬ／ウェル、富士フイルム和光純薬社製）で洗浄、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎi Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡをもとにホタルルシフェラーゼＲＮＡの発現量を定量し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）の各プラスミド添加ウェル中のホタルルシフェラーゼＲＮＡの発現量に対する各遺伝子型の欠損プラスミド添加ウェル中のルシフェラーゼＲＮＡ発現量の相対値（％）を算出した結果を、図５に示した。
遺伝子型Ａにおいて、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が８７％～９０％減少した（図５）。一方、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量は３１～４９％減少した。
遺伝子型Ｂにおいて、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が６５％～８０％減少した。一方、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量は３９～４３％減少した。
遺伝子型Ｃにおいて、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が７４％～８４％減少した。一方、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量は３４～６１％減少した。
遺伝子型Ｄにおいて、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が８６％～９１％減少した。一方、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量は５１～５２％減少した。
以上の結果はいずれもＲＮＡからタンパク質に翻訳される過程に対するＥｎｈＩ領域およびＥｎｈＩＩ領域の寄与を示すものである。すなわち、ＨＢＶの複数の遺伝子型に共通して、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩに相当する領域またはＥｎｈＩＩに相当する領域はＲＮＡ上で機能し、タンパク質の発現量を制御することが明らかとなった。
遺伝子型Ｂにおいて、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が６５％～８０％減少した。一方、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量は３９～４３％減少した。
遺伝子型Ｃにおいて、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が７４％～８４％減少した。一方、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量は３４～６１％減少した。
遺伝子型Ｄにおいて、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が８６％～９１％減少した。一方、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量は５１～５２％減少した。
以上の結果はいずれもＲＮＡからタンパク質に翻訳される過程に対するＥｎｈＩ領域およびＥｎｈＩＩ領域の寄与を示すものである。すなわち、ＨＢＶの複数の遺伝子型に共通して、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩに相当する領域またはＥｎｈＩＩに相当する領域はＲＮＡ上で機能し、タンパク質の発現量を制御することが明らかとなった。
本発明の医薬組成物は、優れた抗ＨＢＶ活性を示し、抗B型肝炎ウイルス剤として有用である。
Claims (10)
- Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害するための医薬組成物であって、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列、およびＢ型肝炎ウイルゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害することを特徴とし、
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する物質と、薬学的に許容され得る担体とを含み、
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する物質が、ＲＢＦＯＸ１、ＳＲＳＦ９、ＳＲＳＦ１０、ＳＮＲＰＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＰＵＭ２、ＹＴＨＤＣ１およびＳＲＳＦ１より選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡであり、
Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列が、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する配列であり、Ｂ型肝炎ウイルゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列が、配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する配列であり、
ＲＮＡ結合タンパク質が、ＲＢＦＯＸ１、ＳＲＳＦ９、ＳＲＳＦ１０、ＳＮＲＰＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＰＵＭ２、ＹＴＨＤＣ１およびＳＲＳＦ１より選択される少なくとも１つのタンパク質である、
医薬組成物。 - Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質が、ＨＢｓ抗原タンパク質である、請求項１に記載の医薬組成物。
- さらに、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡの発現量を低下することを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
- さらに、完全閉鎖二本鎖ＤＮＡの発現量を低下することを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- ＲＮＡ結合タンパク質が、ＳＲＳＦ９、ＳＮＲＰＡ、ＹＴＨＤＣ１およびＳＲＳＦ１より選択される少なくとも１つのタンパク質である、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列、およびＢ型肝炎ウイルゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質を同定する工程、
（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルスに感染した細胞またはＢ型肝炎ウイルスを発現する細胞に対し、同定したＲＮＡ結合タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質、または同タンパク質の発現量を低下させる被験物質を接触させる工程、
（ｃ）Ｂ型肝炎ウイルスに感染した細胞またはＢ型肝炎ウイルスを発現する細胞におけるＢ型肝炎ウイルスタンパク質の産生能を測定する工程、および
（ｄ）（ｃ）のＢ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程
を含み、
（ａ）のＢ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列が、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する配列であり、Ｂ型肝炎ウイルゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列が、配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する配列であり、
ＲＮＡ結合タンパク質が、ＲＢＦＯＸ１、ＳＲＳＦ９、ＳＲＳＦ１０、ＳＮＲＰＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＰＵＭ２、ＹＴＨＤＣ１およびＳＲＳＦ１より選択される少なくとも１つのタンパク質である、
方法。 - （ａ）が、ＲＮＡ結合タンパク質配列データベースを用いる工程を含む、請求項６に記載の方法。
- （ｂ）の被験物質が、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系である、請求項６に記載の方法。
- （ｃ）が、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した細胞またはＢ型肝炎ウイルスを発現する細胞の培養上清中のＢ型肝炎ウイルスタンパク質を測定する工程を含む、請求項６に記載の方法。
- （ｄ）の物質が、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｓベクター系である、請求項６に記載の方法。
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