CN112342237B - 一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法 - Google Patents

一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物领域，特别是涉及一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法。本发明提供一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，包括：将克隆载体导入小鼠肝脏以提供所述乙型肝炎病毒小鼠模型，所述克隆载体的多核苷酸序列包括HBV全基因组序列，所述HBV全基因组序列相对于野生型包括如下突变位点：A96T、A853C、A940C、T1008A、T1029C、G1032A、T1051C、C1218G、A1242G、G1249C、C1287A、G1347A、C1464G、G1506G、G2138T、C2183A、T2224C、G2504T、T2526G、C2549T、G2648A、A2721G、C2774T、G3115A、T3120G。本发明所提供的乙型肝炎病毒小鼠模型是一个更现实且相对合适的实验室适用动物模型，具有良好的产业化前景。

Description

一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法
技术领域
本发明涉及生物领域，特别是涉及一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法。
背景技术
目前，除了人类以外，有研究报道类人的灵长类动物如黑猩猩可感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)；但是考虑到伦理问题和经济效益方面的限制，类人的灵长类动物黑猩猩实际上无法常规用于建立HBV慢性感染模型。另外，树鼩也可自然地感染HBV病毒，但是感染效率很低，且表现为急性感染。HBV病毒感染的受体是NCTP，但是人源性NTCP转基因小鼠并不支持HBV自然感染。而当下学者们主要是使用实验室小鼠作为HBV慢性化的动物模型，其原理是运用小鼠尾静脉高压水动力注射的方法，将HBV基因组复制子快速地导入肝脏细胞核内，作为HBV基因转录模板，以此实现病毒基因下一步肝细胞内的转录、复制步骤，常被用于模拟HBV“感染”。
首先，尽管自然状态下，HBV无法感染小鼠肝脏细胞，但是一些研究通过特殊的技术方法成功构建出了一系列模拟HBV慢性感染的小鼠模型。有研究报道通过小鼠尾静脉高压水动力注射的方法，将含1.2拷贝HBV基因组的腺相关病毒载体质粒AAV快速转导至C57BL/6小鼠的肝脏部位，并成功地构建了慢性化的HBV-小鼠模型，病毒抗原在血液中至少可存在6个月。利用该模型，将HBcAg的132位氨基酸络氨酸突变成丙氨酸，突变后HBcAg不能组装成二十面体核心颗粒，而将该突变质粒注射C57BL/6后发现HBV慢性化显著提高，提示核心颗粒有助于诱导出针对HBV特异性抗体和CTL反应。另外，从HBV基因组分析入手，并分别对各个开放阅读框引入提前终止突变，发现HBx、聚合酶和HBeAg终止表达不会影响到HBV慢性化；但是在HBcAg基因中提前终止却能够显著提高HBV慢性化，结果提示该模型中HBcAg决定HBV慢性化。一株从临床标本中获得的HBV克隆株，将其1.3拷贝基因组克隆在非病毒骨架质粒后，只有注射入特殊的FVB/N小鼠品系后才能观察到HBV的慢性化。但是这些模型依靠的是腺病毒载体以及特定的小鼠宿主背景，而非HBV的病毒自身序列。另有文章报道将1.5倍体的HBV基因组构建在非病毒骨架载体质粒上，并注射于免疫缺陷型BALB/Ca的裸鼠品系，这一方法能够成功地构建出HBV慢性化小鼠模型，实验结果表明血清中，相关的病毒抗原至少可存在1年，但明显的是，该慢性化模型的建立依靠的小鼠的免疫缺陷，并不适用于免疫学方面的研究。总而言之，大多数建立的HBV慢性模型主要依赖特定载体(如慢病毒载体)，或者特殊的小鼠品系如免疫缺陷小鼠等，而非HBV病毒自身的基因序列，且载体上的外源元件对于HBV复制和表达的影响不清楚。
其次，基于携带HBV复制子的重组病毒感染的方法，是以低剂量的携带HBV复制子的重组腺病毒来感染C57BL/6小鼠从而构建HBV慢性化模型。该方法研究了HBV在人白细胞抗原HLA-A2/DR1转基因鼠中HBV慢性化的机制。其它重组病毒还包括重组腺相关病毒和重组慢病毒。上述模型中均借助了非HBV的重组病毒感染，目前还不清楚这些病毒同HBV之间是否存在相互作用，以及它们本身与宿主的相互作用在多大程度上可能影响HBV与宿主的相互作用。此外，使用携带HBV复制子的重组病毒还存在着生物安全性的问题。
部分HBV小鼠模型的缺陷如下表1所示：
表1
HBV小鼠模型 缺点 不适用于
HBV转基因小鼠 中枢免疫系统耐受 免疫学研究
慢病毒载体介导病毒感染(AAV/ADV) 慢性化取决于慢病毒载体 病毒动力学研究
人肝嵌合鼠 肝源有限，鼠免疫系统不完整 免疫学研究
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，包括：将克隆载体导入小鼠肝脏以提供所述乙型肝炎病毒小鼠模型，所述克隆载体的多核苷酸序列包括HBV全基因组序列，所述HBV全基因组序列相对于野生型包括如下突变位点：A96T、A853C、A940C、T1008A、T1029C、G1032A、T1051C、C1218G、A1242G、G1249C、C1287A、G1347A、C1464G、G1506G、G2138T、C2183A、T2224C、G2504T、T2526G、C2549T、G2648A、A2721G、C2774T、G3115A、T3120G。
在本发明一些实施方式中，所述HBV全基因组序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述HBV全基因组为1.3倍体HBV全基因组，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括HBV全基因组序列。
在本发明一些实施方式中，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括第一增强子I/X蛋白启动子序列，所述第一增强子I/X蛋白启动子序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括第二增强子II/Core蛋白启动子序列，所述第二增强子II/Core蛋白启动子序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括第一S蛋白启动子序列，所述第一S蛋白启动子序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括第二S蛋白启动子序列，所述第二S蛋白启动子序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括SEQ IDNO.7所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述克隆载体选自pUC18、pUC19等克隆载体。
在本发明一些实施方式中，所述小鼠选自BALB/c小鼠、或C57BL/6小鼠。
在本发明一些实施方式中，所述小鼠的年龄为6-8周。
在本发明一些实施方式中，通过尾静脉高压注射将克隆载体导入小鼠肝脏。
在本发明一些实施方式中，所述克隆载体的导入量为0.5～1ug/kg。
在本发明一些实施方式中，所述乙型肝炎病毒小鼠模型为慢性乙型肝炎病毒小鼠模型。
在本发明一些实施方式中，所述乙型肝炎病毒小鼠模型的S抗原和e抗原表达阳性≥112天。
在本发明一些实施方式中，所述乙型肝炎病毒小鼠模型无HBsAb抗体产生。
附图说明
图1显示为本发明实施例1中包括1.3倍体HBV全基因组的克隆载体的构建示意图。
图2显示为本发明实施例1中pUC18载体结构示意图。
图3显示为本发明实施例2中尾静脉高压注射示意图。
图4(a)显示为本发明实施例3中B6-PLUS构建获得的小鼠模型的HBsAg检测结果示意图。
图4(b)显示为本发明实施例3中B6构建获得的小鼠模型的HBsAg检测结果示意图。
图5(a)显示为本发明实施例3中B6-PLUS构建获得的小鼠模型的HBsAb检测结果示意图。
图5(b)显示为本发明实施例3中B6构建获得的小鼠模型的HBsAb检测结果示意图。
图6(a)显示为本发明实施例3中B6-PLUS构建获得的小鼠模型的HBeAg检测结果示意图。
图6(b)显示为本发明实施例3中B6构建获得的小鼠模型的HBeAg检测结果示意图。
图7(a)显示为本发明实施例3中B6-PLUS构建获得的小鼠模型的HBV DNA检测结果示意图。
图7(b)显示为本发明实施例3中B6构建获得的小鼠模型的HBV DNA检测结果示意图。
图8显示为本发明实施例3中小鼠模型的HBsAg阳性率曲线比较示意图。
图9显示为本发明实施例3中小鼠模型的HBeAg阳性率曲线比较示意图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。
本发明发明人经过大量研究，提供了一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，所述构建方法将突变的1.3倍体HBV全基因组通过克隆载体导入小鼠肝脏，非依赖于质粒载体、仅靠HBV全基因组自带的元件启动HBV的基因表达，从而建立一种简单、方便及稳定的乙型肝炎病毒小鼠模型，在此基础上完成了本发明。
本发明提供一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，包括：将包括克隆载体导入小鼠肝脏以提供所述乙型肝炎病毒小鼠模型，所述克隆载体的多核苷酸序列包括HBV全基因组序列，所述HBV全基因组序列相对于野生型包括如下突变位点：A96T、A853C、A940C、T1008A、T1029C、T1051C、G1056C、C1218G、A1242G、G1249C、C1287A、G1347A、C1464G、G2138T、C2183A、T2224C、G2504T、T2526G、C2549T、G2648A、A2721G、C2774T、G3115A、T3120G。本申请中，野生型的HBV全基因组可以是GenBank注册号为KR152339.1所对应的序列，其是一株BALB/c小鼠呈急性快速清除表现的HBV B型病毒株。通过在野生型的HBV基因中引入上述突变，并将全基因组序列通过克隆载体导入小鼠肝脏以后，即可获得稳定、持续的S抗原(HBsAg)表达和e抗原(HBeAg)表达，且无HBsAb抗体产生，从而可以提供所述乙型肝炎病毒小鼠模型。在本发明一具体实施例中，所述野生型的HBV全基因组的多核苷酸序列包括SEQID NO.2所示的序列。在本发明另一具体实施例中，所述HBV全基因组的多核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
ctccaccactttccaccaaactctgcaagatcccagagtcagggccctgtattttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctctgaatactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacatggagaacatcgcatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctaggggaaacacccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcctccaatttgtcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatcttcctctgcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcatcaactaccagcaccggaccatgcaaaacctgcacaactcctgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtaccaaacctacggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtctggctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctttatgccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaaaccctcacaaaacaaaacgatggggatattccctgaacttcatgggatatgtaattgggagttggggcacattgccacaggaacatattgtacaaaaaatcaaactgtgttttaggaaacttcctgtaaacaggcctattgattggaaagtatgtcaacgaattgtggggctattggggtttgccgccccttttacgcaatgtggatatcctgctctaatgcctttatatgcatgtatacaagcaaaacaggcttttactttctcgccaacttacaaggcctttctaagtaaacagtatctgaacctttacccagttgctcggcaacggcctggtctgtgccaagtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcttggcgatcggccatcagcgcatgcgtgggacctttctgtctcctctgccgatccatactgcggaactcctagcagcttgttttgctcgcagcaggtctggggcaaaactcatcgggactgacaattctgtcgtactttcccgcaagtatacatcatttccatggctgctagggtgtgctgccaactggatcctgcgcgggacgtcctttgtttacgtcccgtcggcgctgaatcccgcggacgacccctcgcggggtcgcttggggctctaccgcccgcttctccgcctgttctaccgaccgaccacggggcgcacctctctttacgcggactccccgtctgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcccaccggaacttgcccaaggtcttgcataagaggactcttggactttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaatgagtgggaggagttgggggaggagattaggttaaaggtctttgtactaggaggctgtaggcataaattggtgtgttcaccagcaccatgcaactttttcacctctgcctaatcatctcatgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtggctttggggcatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctctgctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacggcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaacctagccacctgggtgggaagtaatttggaagatccatcatccagggaattagtagtcagctatgtcaacgttaatatgggcataaaaatcagacaactattgtggtttcacatttcctgtctcacttttgggagagaaactgttcttgaatatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcgtatagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttagacgaagaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttagtattccttggacacataaggtgggaaactttacggggctttattcttctactgtaccttgctttaatcctaaagggcaaactccttcttttcctgatattcatttgcaagaggacattgttgatagatgtaagcaatttgtggggccccttacagtaaatgaaaacaggagactcaaattaattatgcctgctagattttatcccaatgttactaaatatttgcccttagataaagggatcaaaccgtattatccagagcatgtagttgatcattacttccagacaagacattatttacacactctttggaaggcgggtattttatataaaagagagtccacacgtagcgcctcattttgcgggtcaccatattcttgggaacaagatctacagcatgggaggttggtcttccaaacctcgaaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcacccctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggcctactcacaactgtgccaacagcgcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccgtgcagtggaa(SEQ ID NO.1)
ctccaccactttccaccaaactctgcaagatcccagagtcagggccctgtattttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacatggagaacatcgcatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctaggggaaacacccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcctccaatttgtcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatcttcctctgcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcatcaactaccagcaccggaccatgcaaaacctgcacaactcctgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtaccaaacctacggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtctggctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctttatgccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaaaccctcacaaaacaaaaagatggggatattccctgaacttcatgggatatgtaattgggagttggggcacattgccacaggaacatattgtacaaaaaatcaaaatgtgttttaggaaacttcctgtaaacaggcctattgattggaaagtatgtcaacgaattgtggggcttttggggtttgccgcccctttcacgcaatgtggatatcctgctttaatgcctttatatgcatgtatacaagcaaaacaggcttttactttctcgccaacttacaaggcctttctaagtaaacagtatctgaacctttacccagttgctcggcaacggcctggtctgtgccaagtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcttggccatcggccatcagcgcatgcgtggaacctttgtgtctcctctgccgatccatactgcggaactcctagccgcttgttttgctcgcagcaggtctggggcaaaactcatcgggactgacaattctgtcgtgctttcccgcaagtatacatcatttccatggctgctagggtgtgctgccaactggatcctgcgcgggacgtcctttgtttacgtcccgtcggcgctgaatcccgcggacgacccctcccggggtcgcttggggctctaccgcccgcttctccgcctgttgtaccgaccgaccacggggcgcacctctctttacgcggactccccgtctgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcccaccggaacttgcccaaggtcttgcataagaggactcttggactttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaatgagtgggaggagttgggggaggagattaggttaaaggtctttgtactaggaggctgtaggcataaattggtgtgttcaccagcaccatgcaactttttcacctctgcctaatcatctcatgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtggctttggggcatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctctgctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacggcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaacctagccacctgggtgggaagtaatttggaagatccagcatccagggaattagtagtcagctatgtcaacgttaatatgggcctaaaaatcagacaactattgtggtttcacatttcctgtcttacttttgggagagaaactgttcttgaatatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcgtatagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttagacgaagaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttagtattccttggacacataaggtgggaaactttacggggctttattcttctacggtaccttgctttaatcctaaatggcaaactccttcttttcctgacattcatttgcaagaggacattgttgatagatgtaagcaatttgtggggccccttacagtaaatgaaaacaggagactcaaattaattatgcctgctaggttttatcccaatgttactaaatatttgcccttagataaagggatcaaaccgtattatccagagcatgtagttaatcattacttccagacaagacattatttacacactctttggaaggcgggtatcttatataaaagagagtccacacgtagcgcctcattttgcgggtcaccatattcttgggaacaagatctacagcatgggaggttggtcttccaaacctcgaaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcacccctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggcatactcacaactgtgccagcagctcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatgcagtggaa(SEQ ID NO.2)
本发明所提供的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法中，所述HBV全基因组通常为1.3倍体HBV全基因组，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列通常包括上述HBV全基因组序列。野生型的HBV全基因组通常由4个重叠的开放阅读框组成，其可以是完全环化的，它们分别是Polymerase(P)、Core(C)、Surface(S)和X，编码7种HBV蛋白。基因组上4个启动起始转录的启动子区和两个增强子：Core promoter，S promoter1，S promoter2和Xpromoter驱动HBV全基因组中不同位置的转录起始分别产生3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.9kb多腺苷酸化的RNA；2个增强子(EnhancerI/II)在被转录激活子结合时促进基因转录。对应的，本申请中的1.3倍体HBV全基因组中，1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列还可以包括启动子序列和/或增强子序列，这些启动子和/或增强子通常来源于HBV。本发明一具体实施例中，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列中包括第一增强子I/X蛋白启动子序列，所述第一增强子I/X蛋白启动子序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。本发明另一具体实施例中，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括第二增强子II/Core蛋白启动子序列，所述第二增强子II/Core蛋白启动子序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。本发明另一具体实施例中，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括第一S蛋白启动子序列，所述第一S蛋白启动子序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。本发明另一具体实施例中，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括第二S蛋白启动子序列，所述第二S蛋白启动子序列包括SEQ IDNO.6所示的序列。本发明另一具体实施例中，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列。
cctattgattggaaagtatgtcaacgaattgtggggctattggggtttgccgccccttttacgcaatgtggatatcctgctctaatgcctttatatgcatgtatacaagcaaaacaggcttttactttctcgccaacttacaaggcctttctaagtaaacagtatctgaacctttacccagttgctcggcaacggcctggtctgtgccaagtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcttggcgatcggccatcagcgcatgcgtgggacctttctgtctcctctgccgatccatactgcggaactcctagcagcttgttttgctcgcagcaggtctggggcaaaactcatcgggactgacaattctgtcgtactttcccgcaagtatacatcatttcc(SEQ ID NO.3)
acgcccaccggaacttgcccaaggtcttgcataagaggactcttggactttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaatgagtgggaggagttgggggaggagattaggttaaaggtctttgtactaggaggctgtaggcataaattggtgtgttcaccagcaccatgcaactttttcacctctgcctaatcatctcatgttcatgtcctactgttcaagcctccaag(SEQ ID NO.4)
ttatccagagcatgtagttgatcattacttccagacaagacattatttacacactctttggaaggcgggtattttatataaaagagagtccacacgtagcgcctcattttgcgggtcacc(SEQ ID NO.5)
ggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcacccctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggcctactcacaactgtgccaacagcgcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggcc(SEQ ID NO.6)
cctattgattggaaagtatgtcaacgaattgtggggctattggggtttgccgccccttttacgcaatgtggatatcctgctctaatgcctttatatgcatgtatacaagcaaaacaggcttttactttctcgccaacttacaaggcctttctaagtaaacagtatctgaacctttacccagttgctcggcaacggcctggtctgtgccaagtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcttggcgatcggccatcagcgcatgcgtgggacctttctgtctcctctgccgatccatactgcggaactcctagcagcttgttttgctcgcagcaggtctggggcaaaactcatcgggactgacaattctgtcgtactttcccgcaagtatacatcatttccatggctgctagggtgtgctgccaactggatcctgcgcgggacgtcctttgtttacgtcccgtcggcgctgaatcccgcggacgacccctcgcggggtcgcttggggctctaccgcccgcttctccgcctgttctaccgaccgaccacggggcgcacctctctttacgcggactccccgtctgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcccaccggaacttgcccaaggtcttgcataagaggactcttggactttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaatgagtgggaggagttgggggaggagtttaggttaaaggtctttgtactaggaggctgtaggcataaattggtgtgttcaccagcaccatgcaactttttcacctctgcctaatcatctcatgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtggctttggggcatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctctgctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacggcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaacctagccacctgggtgggaagtaatttggaagatccatcatccagggaattagtagtcagctatgtcaacgttaatatgggcataaaaatcagacaactattgtggtttcacatttcctgtctcacttttgggagagaaactgttcttgaatatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcgtatagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttagacgaagaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttagtattccttggacacataaggtgggaaactttacggggctttattcttctactgtaccttgctttaatcctaaagggcaaactccttcttttcctgatattcatttgcaagaggacattgttgatagatgtaagcaatttgtggggccccttacagtaaatgaaaacaggagactcaaattaattatgcctgctagattttatcccaatgttactaaatatttgcccttagataaagggatcaaaccgtattatccagagcatgtagttgatcattacttccagacaagacattatttacacactctttggaaggcgggtattttatataaaagagagtccacacgtagcgcctcattttgcgggtcaccatattcttgggaacaagatctacagcatgggaggttggtcttccaaacctcgaaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcacccctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggcctactcacaactgtgccaacagcgcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccgtgcagtggaactccaccactttccaccaaactctgcaagatcccagagtcagggccctgtattttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctctgaatactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacatggagaacatcgcatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctaggggaaacacccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcctccaatttgtcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatcttcctctgcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcatcaactaccagcaccggaccatgcaaaacctgcacaactcctgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtaccaaacctacggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtctggctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctttatgccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaaaccctcacaaaacaaaacgatggggatattccctgaacttcatgggatatgtaattgggagttggggcacattgccacaggaacatattgtacaaaaaatcaaactgtgttttaggaaacttcctgtaaacaggcctattgattggaaagtatgtcaacgaattgtggggctattggggtttgccgccccttttacgcaatgtggatatcctgctctaatgcctttatatgcatgtatacaagcaaaacaggcttttactttctcgccaacttacaaggcctttctaagtaaacagtatctgaacctttacccagttgctcggcaacggcctggtctgtgccaagtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcttggcgatcggccatcagcgcatgcgtgggacctttctgtctcctctgccgatccatactgcggaactcctagcagcttgttttgctcgcagcaggtctggggcaaaactcatcgggactgacaattctgtcgtactttcccgcaagtatacatcatttccatggctgctagggtgtgctgccaactggatcctgcgcgggacgtcctttgtttacgtcccgtcggcgctgaatcccgcggacgacccctcgcggggtcgcttggggctctaccgcccgcttctccgcctgttctaccgaccgaccacggggcgcacctctctttacgcggactccccgtctgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcccaccggaacttgcccaaggtcttgcataagaggactcttggactttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaatgagtgggaggagttgggggaggagtttaggttaaaggtctttgtactaggaggctgtaggcataaattggtgtgttcaccagcaccatgcaactttttcacctctgcctaatcatctcatgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtggctttggggcatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgcct(SEQ ID NO.7)
本发明所提供的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法中，所述包括HBV全基因组的多核苷酸序列的克隆载体通常是一种复制型重组质粒，这些质粒区别于普通的表达载体，其载体本身不搭配具有强启动子以及利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。将HBV全基因组构至于克隆载体上，使得HBV在肝细胞内的基因表达仅依赖自身启动子，而非载体启动的因素，使得该方法所建立的HBV小鼠模型将不依赖于载体(常用如慢病毒载体AAV/Adv等)，可适用于研究HBV慢性化的病毒动力学和免疫机制的研究。合适的构建上述克隆载体的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，可以在载体的多克隆位点引入HBV全基因组的多核苷酸序列。再例如，可以采用pUC18、pUC19等载体以构建上述克隆载体。
本发明所提供的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法中，所使用的小鼠可以是各种适用于构建小鼠动物模型的小鼠。例如，所使用的小鼠可以选自BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠等。再例如，所使用的小鼠的鼠龄通常可以是6-8周、6～6.5周、6.5～7周、7～7.5周、或7.5～8周。
本发明所提供的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法中，本领域技术人员可选用合适的方法将包括1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列的克隆载体导入小鼠肝脏。例如，可以通过尾静脉高压注射将克隆载体导入小鼠肝脏。尾静脉高压注射HBV复制子构建动物模型是本领域公知的一种简单、方便的动物模型构建途径，合适的尾静脉注射方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，尾静脉高压注射中，克隆载体的导入量可以为0.5～1ug。
本发明所提供的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法中，构建获得的乙型肝炎病毒小鼠模型通常为慢性乙型肝炎病毒小鼠模型。现有一般的HBV小鼠模型体内的抗原表达如S抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)分别会在第14天左右和第28天左右到达阴性结果，即基本无法检测到抗原的表达水平，S抗原的抗体(HBsAb)第14天开始出现阳性表达(检测值≥0.01mIU/L、≥0.02mIU/L、≥0.05mIU/L、≥0.10mIU/L、≥0.20mIU/L、≥0.40mIU/L、≥0.60mIU/L、≥0.80mIU/L、≥1.00mIU/L、≥2.00mIU/L、或≥3.00mIU/L)，第28天HBsAb水平进一步升高，这是一个正常的急性HBV-小鼠的表现，也与小鼠不是人类乙型肝炎病毒HBV天然宿主的预期结果相一致。本发明构建获得的乙型肝炎病毒小鼠模型中，可以具有稳定、持续的S抗原表达和e抗原表达，在导入克隆载体以后，S抗原和/或e抗原表达阳性可以≥14天、≥28天、≥35天、≥42天、≥84天、或≥112天，所述S抗原表达阳性具体指检测值可以≥0.05IU/mL、≥0.10IU/mL、≥0.20IU/mL、≥0.40mIU/L、≥0.60mIU/L、≥0.80mIU/L、≥1.00IU/mL、或≥2.00IU/mL，所述e抗原表达阳性具体指检测值可以≥1.000S/CO、≥3.000S/CO、≥5.000S/CO、≥10.000S/CO、≥20.000S/CO、≥30.000S/CO、≥50.000S/CO、或≥100.000S/CO。且在导入克隆载体以后，在33天以内、或42天、84天以内、或112天以内S抗原和/或e抗原的阳性率可以达到100％。此外，构建获得的乙型肝炎病毒小鼠模型中无HBsAb抗体产生，所述无HBsAb抗体产生具体可以是HBsAb抗体阴性(即基本无法检测到抗原的表达水平)≥14天、≥28天、≥35天、≥42天、≥84天、或≥112天，由于机体HBsAb阳性为慢性乙肝治愈金标准，所以无HBsAb抗体产生进一步验证了慢性乙型肝炎病毒小鼠模型的成功构建。
由于目前慢性乙肝依然很难完全治愈，所以相关领域的临床与基础的相关研究依然是医学热点。本发明所提供的乙型肝炎病毒小鼠模型是一种切实的慢性乙型肝炎病毒小鼠模型，可以用于HBV相关的免疫学研究、治疗药物的评价、诊疗策略的验证及病毒动力学的研究等，相比使用黑猩猩等的天价费用，小鼠模型是一个更现实且相对合适的实验室适用动物模型，具有良好的产业化前景。
下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
实施例中所使用的野生克隆株信息如下：B6(NCBI：KR152339.1)，以ctccaccact为3215bp序列的起始位点的前十个位置，具体序列参见SEQ ID NO.2。慢性化克隆株B6-PLUS(3215bp)的具体序列参见SEQ ID NO.1，具体信息参加图1。
克隆载体的构建：
分别将B6和B6-PLUS所对应的1.3倍体HBV全基因组(4206bp长度的核苷酸序列)通过全基因合成技术直接合成，PCR扩增序列同时加入HindIII(AAGCTT)和EcoRI(GAATTC)两个酶切位点，将双酶切后的pUC18载体(L08752，载体大小2686bp)和1.3倍体HBV全基因组序列T4酶连接，提供连接产物，即为重组克隆载体。
将连接产物与感受态细胞冰孵育，42℃热休克转化后，加入无氨苄抗生素的细菌培养基并以200rpm转速摇动培养1h，将全部菌液沉淀后并重悬后，涂于有氨苄抗性的细菌培养板上并37℃生长过夜，挑多个单克隆加入有氨苄抗性的细菌培养液，200rpm转速摇动培养；待菌液浑浊后，质粒可随细菌迅速增殖而大量扩增。离心收集细菌沉淀，然后使用内毒素的试剂裂解细菌，分离、抽提重组克隆质粒，质粒A260/A280比值大于1.8，A260/A230比值大于2.0。测序鉴定所抽提重组克隆质粒的全序列，确定序列无误。
实施例2
乙型肝炎病毒小鼠模型的构建：
取SPF级雄性BALB/c小鼠，6-8周龄，备用。将10μg重组克隆质粒(实施例1制备获得)溶于PBS(磷酸缓冲盐溶液)，总体积为2ml并抽吸在注射器内，保证注射器内无空气，备用。将鼠尾完全浸泡在50℃水浴中5秒使鼠尾静脉充分充盈(鼠尾有4条静脉)；将小鼠固定好，尾巴拉直绷紧。然后注射器针头相对于鼠尾30°左右进针，针头无阻碍感地完全进入鼠尾静脉，2ml的液体5到8秒内完全注射干净，即高压注射成功，具体操作方法参见图3。
静脉采血对小鼠的HBsAg和HBsAb的表达水平进行检测，充分挤压暴露小鼠眼球，运用静脉采血针扎破小鼠眼眶下静脉进行采血，并进行HBsAg、HBsAb、HBeAg和HBV DNA的检测。
B6-PLUS、B6构建获得的小鼠模型的HBsAg检测结果分别如图4(a)和图4(b)所示。由图4可知，由B6-PLUS构建获得的小鼠模型HBsAg的表达水平虽然在7天后有所下降，但是依然可以维持在一定的表达水平，在注射克隆质粒33天后、42天、84天后、112天后后各小鼠依然可以检测到HBsAg，表现为HBsAg阳性。由B6构建获得的小鼠模型在注射克隆质粒7天以后HBsAg的表达水平明显下降，14天后已经基本无法检测到HBsAg的表达水平。两个实验组的HBsAg阳性率曲线比较示意图具体如图8所示。
B6-PLUS、B6构建获得的小鼠模型的HBsAb检测结果分别如图5(a)和图5(b)所示。由图5可知，由B6-PLUS构建获得的小鼠模型HBsAb表达为持续阴性，由B6构建获得的小鼠模型在14天后开始表现为HBsAb表达阳性。
B6-PLUS、B6构建获得的小鼠模型的HBeAg检测结果分别如图6(a)和图6(b)所示。由图6可知，由B6-PLUS构建获得的小鼠模型均持续维持有一定的HBeAg的表达水平，在84天后、112天后，依然有100％以上的小鼠可以检测到HBeAg，表现为HBeAg阳性。由B6构建获得的小鼠模型在注射克隆质粒28天后已经基本无法检测到HBeAg的表达水平。两个实验组的HBeAg阳性率曲线比较示意图具体如图9所示。
B6-PLUS、B6构建获得的小鼠模型的HBV DNA检测结果分别如图7(a)和图7(b)所示。通过Taq-man探针法检测血清内的HBV DNA载量，检测值下限为500IU/ml。注射B6的小鼠血清HBV DNA在7天后很快被清除，至4周时DNA检测值均为阴性，接近cut-off值；而B6-PLUS注射后的小鼠血清HBV DNA在12w.p.i内基本维持在1X105IU/ml。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 林君玉
<120> 一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3215
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctccaccact ttccaccaaa ctctgcaaga tcccagagtc agggccctgt attttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtgagccc tgctctgaat actgtctctg ccatatcgtc 120
aatcttatcg aagactgggg accctgtacc gaacatggag aacatcgcat caggactcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaaaaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta ggggaaacac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc aaatctccag tcactcacca acctgttgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctctgca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcatcaacta ccagcaccgg accatgcaaa acctgcacaa ctcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg taccaaacct acggacggaa actgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt atgccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
cacaaaacaa aacgatgggg atattccctg aacttcatgg gatatgtaat tgggagttgg 900
ggcacattgc cacaggaaca tattgtacaa aaaatcaaac tgtgttttag gaaacttcct 960
gtaaacaggc ctattgattg gaaagtatgt caacgaattg tggggctatt ggggtttgcc 1020
gcccctttta cgcaatgtgg atatcctgct ctaatgcctt tatatgcatg tatacaagca 1080
aaacaggctt ttactttctc gccaacttac aaggcctttc taagtaaaca gtatctgaac 1140
ctttacccag ttgctcggca acggcctggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggttggg gcttggcgat cggccatcag cgcatgcgtg ggacctttct gtctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagcagct tgttttgctc gcagcaggtc tggggcaaaa 1320
ctcatcggga ctgacaattc tgtcgtactt tcccgcaagt atacatcatt tccatggctg 1380
ctagggtgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctcgcggggt cgcttggggc tctaccgccc gcttctccgc 1500
ctgttctacc gaccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggactcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccggaacttg cccaaggtct tgcataagag gactcttgga ctttcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttaatgag tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtgt 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980
tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacgg cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100
cctagccacc tgggtgggaa gtaatttgga agatccatca tccagggaat tagtagtcag 2160
ctatgtcaac gttaatatgg gcataaaaat cagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tctcactttt gggagagaaa ctgttcttga atatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctcct gcgtatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgaagaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtattcctt 2460
ggacacataa ggtgggaaac tttacggggc tttattcttc tactgtacct tgctttaatc 2520
ctaaagggca aactccttct tttcctgata ttcatttgca agaggacatt gttgatagat 2580
gtaagcaatt tgtggggccc cttacagtaa atgaaaacag gagactcaaa ttaattatgc 2640
ctgctagatt ttatcccaat gttactaaat atttgccctt agataaaggg atcaaaccgt 2700
attatccaga gcatgtagtt gatcattact tccagacaag acattattta cacactcttt 2760
ggaaggcggg tattttatat aaaagagagt ccacacgtag cgcctcattt tgcgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagat ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgaaaaggc 2880
atggggacaa atctttctgt ccccaatccc ctgggattct tccccgatca tcagttggac 2940
cctgcattca aagccaactc agaaaatcca gattgggacc tcaacccgca caaggacaac 3000
tggccggacg ccaacaaggt gggagtggga gcattcgggc cagggttcac ccctccccat 3060
gggggactgt tggggtggag ccctcaggct cagggcctac tcacaactgt gccaacagcg 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaaggcagc ctactccctt atctccacct 3180
ctaagggaca ctcatcctca ggccgtgcag tggaa 3215
<210> 2
<211> 3215
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctccaccact ttccaccaaa ctctgcaaga tcccagagtc agggccctgt attttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtgagccc tgctcagaat actgtctctg ccatatcgtc 120
aatcttatcg aagactgggg accctgtacc gaacatggag aacatcgcat caggactcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaaaaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta ggggaaacac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc aaatctccag tcactcacca acctgttgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctctgca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcatcaacta ccagcaccgg accatgcaaa acctgcacaa ctcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg taccaaacct acggacggaa actgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt atgccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
cacaaaacaa aaagatgggg atattccctg aacttcatgg gatatgtaat tgggagttgg 900
ggcacattgc cacaggaaca tattgtacaa aaaatcaaaa tgtgttttag gaaacttcct 960
gtaaacaggc ctattgattg gaaagtatgt caacgaattg tggggctttt ggggtttgcc 1020
gcccctttca cgcaatgtgg atatcctgct ttaatgcctt tatatgcatg tatacaagca 1080
aaacaggctt ttactttctc gccaacttac aaggcctttc taagtaaaca gtatctgaac 1140
ctttacccag ttgctcggca acggcctggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggttggg gcttggccat cggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt gtctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagcaggtc tggggcaaaa 1320
ctcatcggga ctgacaattc tgtcgtgctt tcccgcaagt atacatcatt tccatggctg 1380
ctagggtgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctcccggggt cgcttggggc tctaccgccc gcttctccgc 1500
ctgttgtacc gaccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggactcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccggaacttg cccaaggtct tgcataagag gactcttgga ctttcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttaatgag tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtgt 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980
tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacgg cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100
cctagccacc tgggtgggaa gtaatttgga agatccagca tccagggaat tagtagtcag 2160
ctatgtcaac gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt gggagagaaa ctgttcttga atatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctcct gcgtatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgaagaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtattcctt 2460
ggacacataa ggtgggaaac tttacggggc tttattcttc tacggtacct tgctttaatc 2520
ctaaatggca aactccttct tttcctgaca ttcatttgca agaggacatt gttgatagat 2580
gtaagcaatt tgtggggccc cttacagtaa atgaaaacag gagactcaaa ttaattatgc 2640
ctgctaggtt ttatcccaat gttactaaat atttgccctt agataaaggg atcaaaccgt 2700
attatccaga gcatgtagtt aatcattact tccagacaag acattattta cacactcttt 2760
ggaaggcggg tatcttatat aaaagagagt ccacacgtag cgcctcattt tgcgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagat ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgaaaaggc 2880
atggggacaa atctttctgt ccccaatccc ctgggattct tccccgatca tcagttggac 2940
cctgcattca aagccaactc agaaaatcca gattgggacc tcaacccgca caaggacaac 3000
tggccggacg ccaacaaggt gggagtggga gcattcgggc cagggttcac ccctccccat 3060
gggggactgt tggggtggag ccctcaggct cagggcatac tcacaactgt gccagcagct 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaaggcagc ctactccctt atctccacct 3180
ctaagggaca ctcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 3
<211> 404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctattgatt ggaaagtatg tcaacgaatt gtggggctat tggggtttgc cgcccctttt 60
acgcaatgtg gatatcctgc tctaatgcct ttatatgcat gtatacaagc aaaacaggct 120
tttactttct cgccaactta caaggccttt ctaagtaaac agtatctgaa cctttaccca 180
gttgctcggc aacggcctgg tctgtgccaa gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg 240
ggcttggcga tcggccatca gcgcatgcgt gggacctttc tgtctcctct gccgatccat 300
actgcggaac tcctagcagc ttgttttgct cgcagcaggt ctggggcaaa actcatcggg 360
actgacaatt ctgtcgtact ttcccgcaag tatacatcat ttcc 404
<210> 4
<211> 253
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgcccaccg gaacttgccc aaggtcttgc ataagaggac tcttggactt tcagcaatgt 60
caacgaccga ccttgaggca tacttcaaag actgtgtgtt taatgagtgg gaggagttgg 120
gggaggagat taggttaaag gtctttgtac taggaggctg taggcataaa ttggtgtgtt 180
caccagcacc atgcaacttt ttcacctctg cctaatcatc tcatgttcat gtcctactgt 240
tcaagcctcc aag 253
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttatccagag catgtagttg atcattactt ccagacaaga cattatttac acactctttg 60
gaaggcgggt attttatata aaagagagtc cacacgtagc gcctcatttt gcgggtcacc 120
<210> 6
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggacctcaac ccgcacaagg acaactggcc ggacgccaac aaggtgggag tgggagcatt 60
cgggccaggg ttcacccctc cccatggggg actgttgggg tggagccctc aggctcaggg 120
cctactcaca actgtgccaa cagcgcctcc tcctgcctcc accaatcggc agtcaggaag 180
gcagcctact cccttatctc cacctctaag ggacactcat cctcaggcc 229
<210> 7
<211> 4206
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctattgatt ggaaagtatg tcaacgaatt gtggggctat tggggtttgc cgcccctttt 60
acgcaatgtg gatatcctgc tctaatgcct ttatatgcat gtatacaagc aaaacaggct 120
tttactttct cgccaactta caaggccttt ctaagtaaac agtatctgaa cctttaccca 180
gttgctcggc aacggcctgg tctgtgccaa gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg 240
ggcttggcga tcggccatca gcgcatgcgt gggacctttc tgtctcctct gccgatccat 300
actgcggaac tcctagcagc ttgttttgct cgcagcaggt ctggggcaaa actcatcggg 360
actgacaatt ctgtcgtact ttcccgcaag tatacatcat ttccatggct gctagggtgt 420
gctgccaact ggatcctgcg cgggacgtcc tttgtttacg tcccgtcggc gctgaatccc 480
gcggacgacc cctcgcgggg tcgcttgggg ctctaccgcc cgcttctccg cctgttctac 540
cgaccgacca cggggcgcac ctctctttac gcggactccc cgtctgtgcc ttctcatctg 600
ccggaccgtg tgcacttcgc ttcacctctg cacgtcgcat ggagaccacc gtgaacgccc 660
accggaactt gcccaaggtc ttgcataaga ggactcttgg actttcagca atgtcaacga 720
ccgaccttga ggcatacttc aaagactgtg tgtttaatga gtgggaggag ttgggggagg 780
agtttaggtt aaaggtcttt gtactaggag gctgtaggca taaattggtg tgttcaccag 840
caccatgcaa ctttttcacc tctgcctaat catctcatgt tcatgtccta ctgttcaagc 900
ctccaagctg tgccttgggt ggctttgggg catggacatt gacccgtata aagaatttgg 960
agcttctgtg gagttactct cttttttgcc ttctgacttc tttccttcta ttcgagatct 1020
cctcgacacc gcctctgctc tgtatcggga ggccttagag tctccggaac attgttcacc 1080
tcaccatacg gcactcaggc aagctattct gtgttggggt gagttgatga acctagccac 1140
ctgggtggga agtaatttgg aagatccatc atccagggaa ttagtagtca gctatgtcaa 1200
cgttaatatg ggcataaaaa tcagacaact attgtggttt cacatttcct gtctcacttt 1260
tgggagagaa actgttcttg aatatttggt gtcttttgga gtgtggattc gcactcctcc 1320
tgcgtataga ccaccaaatg cccctatctt atcaacactt ccggaaacta ctgttgttag 1380
acgaagaggc aggtccccta gaagaagaac tccctcgcct cgcagacgaa ggtctcaatc 1440
gccgcgtcgc agaagatctc aatctcggga atctcaatgt tagtattcct tggacacata 1500
aggtgggaaa ctttacgggg ctttattctt ctactgtacc ttgctttaat cctaaagggc 1560
aaactccttc ttttcctgat attcatttgc aagaggacat tgttgataga tgtaagcaat 1620
ttgtggggcc ccttacagta aatgaaaaca ggagactcaa attaattatg cctgctagat 1680
tttatcccaa tgttactaaa tatttgccct tagataaagg gatcaaaccg tattatccag 1740
agcatgtagt tgatcattac ttccagacaa gacattattt acacactctt tggaaggcgg 1800
gtattttata taaaagagag tccacacgta gcgcctcatt ttgcgggtca ccatattctt 1860
gggaacaaga tctacagcat gggaggttgg tcttccaaac ctcgaaaagg catggggaca 1920
aatctttctg tccccaatcc cctgggattc ttccccgatc atcagttgga ccctgcattc 1980
aaagccaact cagaaaatcc agattgggac ctcaacccgc acaaggacaa ctggccggac 2040
gccaacaagg tgggagtggg agcattcggg ccagggttca cccctcccca tgggggactg 2100
ttggggtgga gccctcaggc tcagggccta ctcacaactg tgccaacagc gcctcctcct 2160
gcctccacca atcggcagtc aggaaggcag cctactccct tatctccacc tctaagggac 2220
actcatcctc aggccgtgca gtggaactcc accactttcc accaaactct gcaagatccc 2280
agagtcaggg ccctgtattt tcctgctggt ggctccagtt caggaacagt gagccctgct 2340
ctgaatactg tctctgccat atcgtcaatc ttatcgaaga ctggggaccc tgtaccgaac 2400
atggagaaca tcgcatcagg actcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 2460
ttgttgacaa aaatcctcac aataccacag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 2520
tttctagggg aaacacccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtcccaaat ctccagtcac 2580
tcaccaacct gttgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 2640
atcatcttcc tctgcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat 2700
caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcat caactaccag caccggacca 2760
tgcaaaacct gcacaactcc tgctcaagga acctctatgt ttccctcatg ttgctgtacc 2820
aaacctacgg acggaaactg cacctgtatt cccatcccat catcttgggc tttcgcaaaa 2880
tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt 2940
cagtggttcg tagggctttc ccccactgtc tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 3000
tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttatgc cgctgttacc aattttcttt 3060
tgtctttggg tatacattta aaccctcaca aaacaaaacg atggggatat tccctgaact 3120
tcatgggata tgtaattggg agttggggca cattgccaca ggaacatatt gtacaaaaaa 3180
tcaaactgtg ttttaggaaa cttcctgtaa acaggcctat tgattggaaa gtatgtcaac 3240
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tgcgtgggac ctttctgtct cctctgccga tccatactgc ggaactccta gcagcttgtt 3540
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ctctgcacgt cgcatggaga ccaccgtgaa cgcccaccgg aacttgccca aggtcttgca 3900
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ctgtgtgttt aatgagtggg aggagttggg ggaggagttt aggttaaagg tctttgtact 4020
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ctaatcatct catgttcatg tcctactgtt caagcctcca agctgtgcct tgggtggctt 4140
tggggcatgg acattgaccc gtataaagaa tttggagctt ctgtggagtt actctctttt 4200
ttgcct 4206

Claims (9)

1.一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，包括：将克隆载体导入小鼠肝脏以提供所述乙型肝炎病毒小鼠模型，所述克隆载体的多核苷酸序列包括HBV全基因组序列，所述HBV全基因组序列相对于野生型突变如下位点：A96T、A853C、A940C、T1008A、T1029C、T1051C、C1218G、A1242G、G1249C、C1287A、G1347A、C1464G、G1506C、G2138T、C2183A、T2224C、G2504T、T2526G、C2549T、G2648A、A2721G、C2774T、A3097C、G3115A、T3120G、A3205G，所述野生型的序列为SEQ ID NO.2所示的序列，所述HBV全基因组为1.3倍体HBV全基因组，所述小鼠选自BALB/c小鼠、或C57BL/6小鼠；所述小鼠的年龄为6-8周。
2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述HBV全基因组序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
3.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括HBV全基因组序列。
4.如权利要求3所述的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括第一增强子I/X蛋白启动子序列，所述第一增强子I/X蛋白启动子序列包括SEQ ID NO.3所示的序列；
和/或，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括第二增强子II/Core蛋白启动子序列，所述第二增强子II/Core蛋白启动子序列包括SEQ ID NO.4所示的序列；
和/或，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括第一S蛋白启动子序列，所述第一S蛋白启动子序列包括SEQ ID NO.5所示的序列；
和/或，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括第二S蛋白启动子序列，所述第二S蛋白启动子序列包括SEQ ID NO.6所示的序列；
和/或，所述1.3倍体HBV全基因组的多核苷酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列。
5.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述克隆载体选自pUC18、pUC19克隆载体。
6.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，其特征在于，通过尾静脉高压注射将克隆载体导入小鼠肝脏；
和/或，所述克隆载体的导入量为0.5～1ug/kg。
7.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述乙型肝炎病毒小鼠模型为慢性乙型肝炎病毒小鼠模型。
8.如权利要求7所述的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述乙型肝炎病毒小鼠模型的S抗原和e抗原表达阳性≥112天。
9.如权利要求7所述的乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述乙型肝炎病毒小鼠模型无HBsAb抗体产生。
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