TW202102234A - 抑制b型肝炎病毒蛋白質之產生的醫藥組成物及篩選方法 - Google Patents

抑制b型肝炎病毒蛋白質之產生的醫藥組成物及篩選方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202102234A
TW202102234A TW109110161A TW109110161A TW202102234A TW 202102234 A TW202102234 A TW 202102234A TW 109110161 A TW109110161 A TW 109110161A TW 109110161 A TW109110161 A TW 109110161A TW 202102234 A TW202102234 A TW 202102234A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
sequence
hepatitis
virus
rna
hbv
Prior art date
Application number
TW109110161A
Other languages
English (en)
Inventor
田中靖人
羽場亮太
嶋根和毅
河野貴紀
Original Assignee
日商富士軟片股份有限公司
公立大學法人名古屋市立大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商富士軟片股份有限公司, 公立大學法人名古屋市立大學 filed Critical 日商富士軟片股份有限公司
Publication of TW202102234A publication Critical patent/TW202102234A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/12—Applications; Uses in screening processes in functional genomics, i.e. for the determination of gene function
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

本發明的課題在於提供一種作為新型抗B型肝炎病毒劑有用的醫藥組成物及篩選方法。依據本發明，則可提供一種醫藥組成物，其係抑制B型肝炎病毒蛋白質之產生的醫藥組成物，其特徵在於：抑制會與選自相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子I區域序列之B型肝炎病毒RNA序列、及相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子II區域序列之B型肝炎病毒RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白的表現或功能。

Description

抑制B型肝炎病毒蛋白質之產生的醫藥組成物及篩選方法
本發明係關於一種具有抗B型肝炎病毒活性之醫藥組成物及篩選抑制B型肝炎病毒蛋白質之產生的物質之方法。
B型肝炎病毒(hepatitis B virus、HBV)係屬於肝炎病毒屬之病毒，且為直徑約42nm的球狀DNA病毒。病毒本身為包含外被(套膜、envelope)、不完全雙鏈的DNA、DNA聚合酶及反轉錄酶等之由直徑27nm的芯(核心、core)組成之DNA病毒，被稱為Dane粒子。形成雙重結構，外側由HBs抗原(B型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen)、HBsAg)組成，內側由HBc抗原(B型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen)、HBcAg)及基因DNA組成(非專利文獻1)。 HBs抗原係除了Dane粒子以外，會以中空粒子、小型球形粒子或桿狀粒子的形式存在。 HBV的基因組DNA中，係有pre-S/S基因區域、P基因區域、X基因區域、pre-C/C基因區域該4種開放譯讀區(open reading frame、ORF)、3個啟動子及2個強化子(Enhancer、Enh)區域。X基因區域的核心啟動子(core promoter)、C基因區域的前核心區(precore region)，係參與HBe抗原(B型肝炎套膜抗原(hepatitis B envelope antigen)、HBeAg)構成蛋白的產生，藉由該區域的點突變而變得不產生HBe抗原構成蛋白，成為HBe抗原陰性。 又，2個強化子區域被稱為強化子I(Enhancer I、EnhI)及強化子II(Enhancer II、EnhII)，任一者皆能夠使3個所有的啟動子活性增大(專利文獻1)。 HBV若侵襲肝細胞，則不完全環狀雙股DNA被併入肝細胞的核內，並被轉化為完全閉鎖雙股DNA(covalenty closed circular DNA、cccDNA)。在HBV的慢性感染狀態下，cccDNA在每一個肝細胞中為5～50個，並且以微型染色體的形式存在。從肝細胞核內的cccDNA有4種RNA被轉錄，而為結構蛋白之HBs抗原、HBc抗原及HBe抗原、X蛋白質以及包含反轉錄酶之聚合酶係自該等被轉譯。RNA之一作為前基因體RNA(pregenomic RNA)而被併入核心粒子中，藉由反轉錄酶的作用而合成負股DNA，接著合成正股DNA，成為不完全環狀雙股DNA。進而，被包裹於由HBs抗原形成之套膜中，成為病毒粒子(Dane粒子)而被釋放到血中。包含藉由RNA而被轉譯之HBs抗原、HBc抗原及p22cr抗原的中空粒子(沒有DNA之核的粒子)或會通過肝細胞膜之HBe抗原等，係不同於Dane粒子的血中釋放路徑，而被大量釋放且分泌到血中。該作用被認為是HBV感染中之躲避宿主免疫機構的攻擊之作用。HBe抗原、HBc抗原及p22cr抗原，係能夠以HBcr抗原(B型肝炎病毒核心相關抗原(hepatitis B core-related antigen)、HBcrAg)來測量，被使用作為病毒複製的標記(非專利文獻1)。
B型肝炎係因感染HBV而發病之病毒性肝炎之一，被認為感染人數在全世界約為2億4000萬人。如上所述，若感染HBV，則Dane粒子會被釋放到血中，並且病毒蛋白質會以不同於Dane粒子的釋放路徑而病毒蛋白質被大量分泌到血中。在病毒蛋白質中，尤其HBs抗原係被指摘有妨礙由為宿主之人類的免疫機構所致之感染細胞的排除之可能性(非專利文獻2、3)。故被認為對於B型肝炎的治療，重要的是減少Dane粒子，亦即阻礙病毒的增殖，並且減少以HBs抗原為首的病毒蛋白質。 於B型肝炎的第一選擇藥中，係使用恩替卡韋(Entecavir)或泰諾福韋(Tenofovir)等核酸類似物。核酸類似物製劑，係藉由抑制HBV聚合酶蛋白的活性、抑制不完全環狀雙股DNA的產生，而能夠減少血中的Dane粒子，亦即阻礙病毒的增殖。然而，由於核酸類似物製劑無法使HBs抗原減少，而難以實現由宿主免疫機構所致之感染細胞的排除。因此，期望開發能夠實現減少HBs抗原的醫藥品。 近年來，藉由RNA干擾(RNAi)的原理而與HBV RNA結合，且將其分解之雙股RNA(dsRNA)的研究開發正在進行中。有報告該等雙股RNA在HBV感染細胞等中使HBs抗原減少(非專利文獻4)。雙股RNA在其性質上，為了與HBV RNA結合且發揮效果，而必須與HBV RNA具有高的序列一致性。然而，由於HBV中有8種基因型存在、RNA的序列會因基因突變等而產生變化等，而有與HBV RNA結合之雙股RNA的效果並無法期待之例的顧慮。實際上有報告：分析了從B型肝炎患者採取之HBV之結果，在同一患者中有基因序列不同之複數個選殖株存在、有雙股RNA對於HBV RNA的效果減弱之選殖株存在(非專利文獻5)。因此，必須有能夠藉由新的作用機制而實現HBs抗原的減少之醫藥品的開發。
HBV不具有為了從本身的基因轉錄RNA所需的分子群組及為了從RNA產生病毒蛋白質所需的分子群組。因此，於HBV的增殖或病毒蛋白質的產生，就一定要利用已感染之人類肝細胞所具有之分子群組。於是，開始關注以HBV所利用之人類蛋白質為標的且抑制HBV的增殖或病毒蛋白質之產生的新的手法。 例如，進行以下嘗試：使用會與HBV基因組DNA中的強化子I結合之核酸分子，而控制從HBV基因組DNA往HBV RNA的轉錄，且調節HBV的複製(專利文獻2)。又，進行以下嘗試：藉由控制作用於HBV基因組DNA中的強化子區域之轉錄因子的表現，而控制往HBV RNA的轉錄，且控制HBV的增殖(專利文獻3～5)。 然而，尚未充分闡明作為宿主之人類的哪個因子係對於HBV的增殖或病毒蛋白質的產生為必要、藉由控制該等而會得到何種抗HBV效果。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2005-059138號小冊子 [專利文獻2]美國專利申請公開第2003/0148985A1號說明書 [專利文獻3]日本特表2018-526332號公報 [專利文獻4]日本特表2007-520461號公報 [專利文獻5]日本特表2005-532052號公報
[非專利文獻1]田中等、Modern Media、54卷、12號、347～352頁、2008年 [非專利文獻2]Brouw等、Immunology、126卷、280～289頁、2008年 [非專利文獻3]Vanlandschoot等、Journal of General Virology、83卷、1281～1289頁、2002年 [非專利文獻4]Wooddell等、Molecular Therapy、21卷、5號、973～985頁、2013年 [非專利文獻5]Wu等、Gastroenterology、128卷、708～716頁、2005年
[發明之概要] [發明欲解決之課題]
本發明的課題在於提供一種新穎的醫藥組成物，其係以作為宿主因子之人類蛋白質為標的，且具有抗B型肝炎病毒(HBV)活性。又，本發明的課題在於提供一種醫藥組成物，其係以人類蛋白質為標的，且抑制HBV蛋白質之產生。另外，本發明的課題在於提供一種篩選方法，其係篩選以宿主因子為標的且抑制HBV蛋白質之產生的物質。 [用以解決課題之手段]
本發明人等對上述課題進行了深入研究之結果，發現抑制會與相當於B型肝炎病毒基因組DNA(HBV基因組DNA)上的強化子I(Enhancer I、EnhI)區域序列及強化子II(Enhancer II、EnhII)區域序列之B型肝炎病毒RNA(HBV RNA)序列中的至少1個區域結合之人類蛋白質的醫藥組成物，係具有HBV蛋白質的產生抑制能力，從而完成了本發明。
亦即本發明提供以下。 ＜1＞一種醫藥組成物，其係抑制B型肝炎病毒蛋白質(HBV蛋白質)的產生，前述醫藥組成物的特徵在於， 抑制會與選自相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)I區域序列之HBV RNA序列、及相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)II區域序列之HBV RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白的表現或功能。 ＜2＞如＜1＞所述之醫藥組成物，其中 相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)I區域序列之HBV RNA序列為與序列識別號1具有80%以上的序列一致性之序列，相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)II區域序列之HBV RNA序列為與序列識別號2具有80%以上的序列一致性之序列。 ＜3＞如＜1＞或＜2＞所述之醫藥組成物，其中 相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)I區域序列之HBV RNA序列為與序列識別號1具有90%以上的序列一致性之序列，相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)II區域序列之HBV RNA序列為與序列識別號2具有90%以上的序列一致性之序列。 ＜4＞如＜1＞至＜3＞之任一項所述之醫藥組成物，其中 HBV蛋白質為HBs抗原蛋白質。 ＜5＞如＜1＞至＜4＞之任一項所述之醫藥組成物，其進一步降低HBV基因組DNA的表現量。 ＜6＞如＜1＞至＜5＞之任一項所述之醫藥組成物，其進一步降低完全雙股DNA(cccDNA)的表現量。 ＜7＞如＜1＞至＜6＞之任一項所述之醫藥組成物，其中 RNA結合蛋白為選自RBFOX1、ELAVL2、MBNL1、RBMX、SRSF9、SRSF10、SNRPA、ELAVL1、PUM2、YTHDC1、SRSF1、KHDRBS3及EIF4B之至少1個蛋白質。 ＜8＞一種篩選方法，其係篩選抑制HBV蛋白質之產生的物質之方法，其特徵為： 鑑定抑制會與選自相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)I區域序列之HBV RNA序列、及相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)II區域序列之HBV RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白的表現或功能之物質。 ＜9＞如＜8＞所述之篩選方法，其中 相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)I區域序列之HBV RNA序列為與序列識別號1具有80%以上的序列一致性之序列，相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)II區域序列之HBV RNA序列為與序列識別號2具有80%以上的序列一致性之序列。 ＜10＞如＜8＞或＜9＞所述之篩選方法，其中 HBV蛋白質為HBs抗原蛋白質。 ＜11＞一種方法，其係篩選抑制B型肝炎病毒(HBV)蛋白質之產生的物質，前述方法包括： (a)鑑定會與選自相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)I區域序列之HBV RNA序列、及相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)II區域序列之HBV RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白之步驟； (b)使會抑制所鑑定之RNA結合蛋白的功能或活性之被驗物質、或會使相同蛋白質的表現量降低之被驗物質，與感染HBV之細胞或會表現HBV之細胞接觸之步驟； (c)測量感染HBV之細胞或會表現HBV之細胞中的HBV蛋白質的產生能力之步驟；及 (d)選擇具有抑制(c)的HBV蛋白質之產生的活性之物質之步驟。 ＜12＞如＜11＞所述之方法，其中 (a)包括使用RNA結合蛋白序列資料庫之步驟。 ＜13＞如＜11＞所述之方法，其中 (b)的被驗物質為抗體、肽、蛋白質、非肽類(nonpeptidic)化合物、合成化合物、反義核酸、雙股RNA、腺相關病毒(adeno-associated virus)載體或CRISPR-Cas載體系。 ＜14＞如＜11＞所述之方法，其中 (c)包括測量感染HBV之細胞或會表現HBV之細胞的培養上清液中的HBV蛋白質之步驟。 ＜15＞如＜11＞所述之方法，其中 (d)的物質為抗體、肽、蛋白質、非肽類化合物、合成化合物、反義核酸、雙股RNA、腺相關病毒載體或CRISPR-Cas載體系。
又，本發明提供以下。 ＜a＞一種處理方法，其包括將＜1＞至＜7＞之任一項所述之醫藥組成物對感染HBV或患有與HBV感染相關之疾病之對象進行投予之步驟。 ＜b＞如＜a＞所述之處理方法，其中 與HBV感染相關之疾病，係B型肝炎、或因該等所引起之肝硬化或因該等所引起之肝癌。 ＜c＞一種與HBV感染相關之疾病的處理用套組，其包括： ＜1＞至＜7＞之任一項所述之醫藥組成物；及 記載有與HBV感染相關之疾病的處理方法之說明書。 ＜d＞如＜c＞所述之與HBV感染相關之疾病的處理用套組，其中 與前述HBV感染相關之疾病的處理方法，係包含將前述醫藥組成物對感染HBV或患有與HBV感染相關之疾病之對象進行投予之步驟。 ＜e＞一種物質，其係用以於抑制B型肝炎病毒蛋白質(HBV蛋白質)的產生之處理中使用，且抑制會與選自相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)I區域序列之HBV RNA序列、及相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)II區域序列之HBV RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白的表現或功能。 ＜f＞一種物質的使用，係用於製造抑制B型肝炎病毒蛋白質(HBV蛋白質)之產生的醫藥組成物，而該物質係抑制會與選自相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)I區域序列之HBV RNA序列、及相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)II區域序列之HBV RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白的表現或功能。 [發明之效果]
本發明的醫藥組成物係具有優異之抗HBV活性，且有用於作為抗HBV劑。又，本發明的篩選方法係有用於抑制HBV蛋白質之產生的物質的篩選。
以下，對本發明進行詳細說明。 本說明書中，只要沒有特別說明，各用語具有以下含義。
所謂預防，係意指發病的抑制、發病危險的降低或發病的延遲等。 所謂治療，係意指成為對象之疾病或狀態的改善或進行的阻礙等。 所謂處置，係意指對於各種疾病之預防或治療等。 所謂有效量，係意指治療有效量或預防有效量等。 所謂治療有效量，係指足以對於所感染之對象中的HBV感染的穩定化、HBV感染的降低或HBV感染的根除為充分之量。又，所謂預防有效量，係指對於具有感染之危險之對象中的HBV感染的預防為充分之量。 所謂對象，係意指包含人類之哺乳動物。
＜B型肝炎病毒(HBV)＞ B型肝炎病毒(HBV)係意指具有使B型肝炎發病之能力之病毒。HBV藉由來自於基因突變之鹼基序列的差異，而目前被分類成A型～H型的8個基因型(genotype)。作為成為本發明的醫藥組成物中的預防或治療的對象之HBV，係包含所有的基因型。 本發明中，作為與HBV感染相關之疾病，可舉出B型肝炎，可舉出急性肝炎、慢性肝炎及猛爆性肝炎。又，只要是藉由對因包含人類之生體的HBV的感染而引起之疾病，則亦包含肝硬化、肝線維化、肝細胞癌等肝癌。
＜B型肝炎病毒蛋白質(HBV蛋白質)＞ B型肝炎病毒蛋白質(HBV蛋白質)為構成HBV之蛋白質，可舉出HBs抗原、HBc抗原、HBe抗原等。 本發明中，HBV蛋白質並無特別限定，但較佳為HBs抗原。
＜相當於HBV基因組DNA上的EnhI區域序列及EnhII區域序列之HBV RNA序列＞ 已知在HBV基因組DNA上具有2個強化子區域(EnhI及EnhII)，且EnhI及EnhII係促進從HBV基因組DNA向HBV RNA的轉錄。 本發明中，所謂相當於HBV基因組DNA上的EnhI區域序列及EnhII區域序列之HBV RNA序列，係意指HBV RNA序列之中，相當於位在編碼HBV蛋白質之RNA的3’非轉譯區域(以下亦稱為3’UTR)內之HBV基因組DNA上的EnhI之區域的鹼基序列、或相當於位在編碼HBV蛋白質之RNA的3’UTR內之HBV基因組DNA上的EnhII之區域的鹼基序列。 本發明中，所謂相當於HBV基因組DNA上的EnhI區域序列及EnhII區域序列之HBV RNA序列，係較佳為於HBV RNA序列之中，相當於位在編碼HBs抗原之RNA的3’UTR內之HBV基因組DNA上的EnhI之區域的鹼基序列、或相當於位在編碼HBs抗原之RNA的3’UTR內之HBV基因組DNA上的EnhII之區域的鹼基序列。
本發明中，相當於HBV基因組DNA上的EnhI區域序列之HBV RNA序列，係可舉出與序列識別號1具有80%以上的序列一致性之序列，相當於HBV基因組DNA上的EnhII區域序列之HBV RNA序列，係可舉出與序列識別號2具有80%以上的序列一致性之序列。 上述HBV RNA係編碼HBV蛋白質之RNA，較佳為編碼HBs抗原之RNA。 上述HBV RNA序列，係可舉出例如序列識別號1或序列識別號2的序列。上述序列係較佳為與序列識別號1或序列識別號2的序列而具有80%以上的序列一致性，更佳為具有85%，進一步較佳為具有90%、更進一步較佳為具有95%，更進一步較佳為具有98%，特佳為具有100%的序列一致性。
序列識別號1：
Figure 02_image001
Figure 02_image003
序列識別號2：
Figure 02_image005
＜RNA結合蛋白＞ 已知RNA結合蛋白(RNA binding protein)係序列特異性地與特定的標的RNA結合，且在RNA剪接、多腺苷酸化、加帽(capping)、修飾、輸送、局部化、轉譯、代謝轉換等、轉錄後及轉錄後的蛋白質表現中控制各種的細胞功能(Ray等、Nature、499卷、11號、2013年)。 本發明中，推測RNA結合蛋白係藉由與HBV RNA上的特定的序列結合，而控制HBV蛋白質的表現(產生)。 上述HBV RNA係較佳為編碼HBs抗原之RNA。 上述HBV RNA上的特定的序列，係可舉出例如序列識別號1或序列識別號2的序列。上述序列，係較佳為相對於序列識別號1或序列識別號2的序列而具有80%以上的序列一致性，更佳為具有85%，進一步較佳為具有90%，更進一步較佳為具有95%、更進一步較佳為具有98%，特佳為具有100%的序列一致性。
本發明中，RNA結合蛋白係較佳為識別上述序列上的4～9鹼基並進行結合者，可舉出例如RBFOX1(RNA結合蛋白，fox-1同源基因(fox-1 homolog))、ELAVL2(ELAV樣RNA結合蛋白2(ELAV like RNA binding protein 2))、MBNL1(盲肌樣白1(muscleblind-like Protein 1))、RBMX(RNA結合模體蛋白(RNA-binding motif protein),，X染色體)、SRSF9(富含絲胺酸精胺酸剪接因子9(serine and arginine rich splicing factor 9))、SRSF10(富含絲胺酸精胺酸剪接因子10)、SNRPA(小型細胞核核糖核蛋白多肽A(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A))、ELAVL1(ELAV樣RNA結合蛋白1)、PUM2(pumilio同源基因2(pumilio homolog 2))、YTHDC1(含YTH結構域蛋白1(YTH domain containing protein 1))、SRSF1(富含絲胺酸精胺酸剪接因子1)、KHDRBS3(含KH RNA結合結構域(KH RNA binding domain)，訊息傳導相關蛋白3(signal transduction associated protein 3))或EIF4B(真核轉譯起始因子4B (eukaryotic translation initiation factor 4B))等。 本發明的RNA結合蛋白，係較佳為選自RBFOX1、ELAVL2、MBNL1、RBMX、SRSF9、SRSF10、SNRPA、ELAVL1、PUM2、YTHDC1、SRSF1、KHDRBS3及EIF4B之至少1個蛋白質。
＜醫藥組成物＞ 本發明的醫藥組成物為「物質」、具體而言為包含「抑制HBV蛋白質之產生的物質」及藥學上所允許之載體之醫藥組成物。 本發明的醫藥組成物，係作為抑制HBV蛋白質之產生的物質，而包含抑制會與選自相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)I區域序列之HBV RNA序列、及相當於HBV基因組DNA上的強化子(Enh)II區域序列之HBV RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白的表現或功能之物質。
本發明的醫藥組成物係較佳為抑制HBV蛋白質之產生的物質，更佳為抑制HBs抗原之產生的物質。
作為「物質」，可舉出抗體、肽、蛋白質、非肽類化合物、合成化合物、反義核酸、雙股RNA、腺相關病毒載體、CRISPR-Cas載體系等。
「反義核酸」係包含與編碼某蛋白質之「正義(sense)」核酸，例如雙股cDNA分子的編碼股、mRNA序列或基因的編碼股的鹼基序列為互補或者實質上互補的鹼基序列或其一部分之核酸，其藉由與作為標的之鹼基序列形成特異性且穩定之雙鏈而鍵結，而具有抑制蛋白質合成之功能。 「RNAi核酸」係包含藉由短小干擾RNA(siRNA)、短髮夾RNA(shRNA)或RNA干擾(RNAi)而干擾或抑制標的基因的表現之核酸，但是並不限定於該等。 「雙股RNA」係包含藉由短小干擾RNA(siRNA)、短髮夾RNA(shRNA)或RNA干擾(RNAi)而干擾或抑制標的基因的表現之核酸，但是並不限定於該等。 「RNA干擾劑」係透過RNA干擾而干擾或抑制標的基因的表現之核酸。 RNA干擾係使用雙股RNA(dsRNA)而將包含與dsRNA相同之序列的mRNA分解之轉錄後標的基因緘默化技術(Sharp等、Science、287卷，2431～2432頁、2000年；Zamore等、Cell、101卷、25～33頁、2000年；Tuschl等、Genes & Development、13卷、3191～3197、1999年)。在核糖核酸內切酶切斷長的dsRNA，且產生為更短的21或22核苷酸長度之被稱為短小干擾RNA(siRNA)的RNA之情況下產生。此siRNA係媒介標的mRNA的分解。用以合成RNAi的套組，係例如能夠從New England Biolabs及Ambion以商業取得。於一個態樣中，可使用用以使用於反義RNA的上述化學中的一個以上。 作為本發明的醫藥組成物中所包含之物質，較佳為反義核酸或雙股RNA，更佳為雙股RNA。 又，雙股RNA的情況下，RNA干擾劑為特佳。
「腺相關病毒」為屬於小病毒科之包含約4700鹼基的單股DNA病毒，沒有套膜而具有直徑20～30nm之正二十面體結構的蛋白殼，細胞膜亦識別為普遍成分之硫酸乙醯肝素蛋白聚醣而感染，因此宿主範圍廣。 在腺相關病毒的基因組內，能夠插入任意基因、核酸。所以，可藉由使經進行基因改造之腺相關病毒感染作為標的之細胞來導入目標之基因、核酸，因此腺相關病毒能夠作為導入基因的載體而使用。另外，「腺相關病毒載體」由於沒有病原性，且於最後分化之非分裂細胞亦能夠進行基因導入，因此期待應用於基因治療中。 已知腺相關病毒因血清型的差異而對組織及細胞的感染指向性不同(小澤等、Drug Delivery System、22卷、6號、643～650頁、2007年)。 作為本發明的醫藥組成物中所包含之物質，係較佳為腺相關病毒5型、腺相關病毒7型、腺相關病毒8型或腺相關病毒9型，更佳為腺相關病毒8型。
「CRISPR-Cas系」係將真細菌或古細菌所具有的後天性免疫而被發現之常間回文重複序列叢集關聯蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(常間回文重複序列叢集)/CRISPR-associated protein(CRISPR/Cas))系統轉用於基因組編集之系統(Jinek等、Science、337卷、816～821頁、2012年)。具體而言，上述細菌之被稱為CRISPR區域的基因組區域中，重複複數個併入了經片斷化之外來DNA(20bp)的卡匣，各卡匣中係併入了不同之外來DNA。 各卡匣，係被認為是外來生物(例如，噬菌體等)的DNA在被併入了細胞內之情況下藉由將其片斷化而組合至CRISPR區域而產生。 各卡匣係編碼CRISPR RNA(crRNA)。crRNA組合至具有原間隔(protospacer)序列、及與後述之trans-crRNA(tracrRNA)互補的序列。原間隔序列為20核苷酸長度，並且具有與作為標的之DNA序列互補的序列。原間隔序列並無需具有與標的序列為100%的互補性，在5’末端至6核苷酸的區域中允許錯誤配對。crRNA係透過互補部分而與另行轉錄之trans-crRNA(tracrRNA)形成複合體。crRNA與tracrRNA的複合體，係與Cas9核酸內切酶形成進一步的複合體。crRNA中的原間隔部分係與外來DNA互補地進行雜種形成，且藉此而將Cas9核酸內切酶引導到外來DNA的標的序列。外來DNA係在標的序列的部位藉由Cas9核酸內切酶被切斷，而CRISPR-Cas9系統防禦外來DNA而保護宿主。 如此地，CRISPR-Cas9系統係藉由真細菌或古細菌對新的外來DNA之後天性免疫而發揮功能，且因此而被發現者，但是可藉由設計包含外來DNA之原間隔，而能夠序列依賴性地切斷哺乳動物的基因組、或藉此而編輯哺乳動物的基因組。 所謂「CRISPR-Cas載體系」，係指包含crRNA、tracrRNA序列或兼具備crRNA及tracrRNA的功能之導引RNA(gRNA)、及Cas基因序列而成之載體系。目前主要使用之系統係來自於釀膿鏈球菌(S.pyogenes)之第2種CRISPR-Cas9系統，但是並不限定於此。
又，藥學上能夠允許之載體可舉出賦形劑、稀釋劑、增量劑、崩散劑、穩定劑、保存劑、緩衝劑、乳化劑、芳香劑、著色劑、甜味劑、增黏劑、矯味劑、助溶劑或其他添加劑等。藉由使用該等載體的一個以上，能夠製備片劑、膠囊劑、粉末劑、糖漿、顆粒劑、丸劑、懸浮劑、乳劑、粉劑、栓劑、點眼劑、滴鼻劑、滴耳劑、黏附劑、軟膏劑、注射劑、液劑、錠劑或酏劑等形態的醫藥組成物。 該等醫藥組成物能夠經口或非經口地進行投予。作為用於非經口投予的其他形態，係包含外用液劑、用於腸溶內投予的栓劑等，而該等包含1個或其以上的活性物質，且藉由常規方法配製。 又，本發明的醫藥組成物的投予量及投予次數，能夠依據患者的性別、體重、年齡、重症度及症狀等而適當選擇。通常，對於成人，係藉由經口或非經口(例如，注射、靜脈滴注及對直腸部位的投予等)投予，而每日將0.01～1000mg/kg分成1次至數次進行投予即可。
本發明的醫藥組成物係較佳為進一步降低HBV DNA的表現量。
本發明的醫藥組成物係較佳為進一步降低完全雙股DNA(cccDNA)的表現量。
本發明的醫藥組成物，係作為用以抑制會與相當於HBV基因組DNA上的EnhI區域序列之HBV RNA序列、及相當於HBV基因組DNA上的EnhII區域序列之HBV RNA序列中的至少1個序列結合之RNA結合蛋白的表現或功能之醫藥品而有用，或阻礙並抑制與上述RNA結合蛋白相關之疾病的發病或進行，作為用以治療或預防上述疾病之醫藥品而有用。
＜篩選方法＞ 本發明的篩選方法，係有用於作為篩選抑制HBV蛋白質之產生的物質之方法。
本發明的篩選方法係篩選抑制HBV蛋白質之產生的物質之方法，其有用於作為特徵為以下之篩選方法：鑑定抑制會與選自相當於HBV基因組DNA上的強化子I區域序列之HBV RNA序列、及相當於HBV基因組DNA上的強化子II區域序列之HBV RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白的表現或功能之物質。 本發明的篩選方法係較佳為：相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子I區域序列之HBV RNA序列為與序列識別號1具有80%以上的序列一致性之序列，且相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子II區域序列之HBV RNA序列為與序列識別號2具有80%以上的序列一致性之序列。 又，本發明的篩選方法又較佳為：鑑定抑制HBs抗原之產生的物質來作為B型肝炎病毒蛋白質。
作為本發明的篩選方法，可舉出包含以下步驟之方法： (a)鑑定會與選自相當於HBV基因組DNA上的EnhI區域序列之HBV RNA序列、及相當於HBV基因組DNA上的EnhII區域序列之HBV RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白之步驟； (b)使會抑制所鑑定之RNA結合蛋白的功能或活性之被驗物質、或會使相同蛋白質的表現量降低之被驗物質，與感染HBV之細胞或會表現HBV之細胞接觸之步驟； (c)測量感染HBV之細胞或會表現HBV之細胞中的HBV蛋白質的產生能力之步驟；及 (d)選擇具有抑制(c)的HBV蛋白質之產生的活性之物質之步驟。
(a)鑑定會與選自相當於HBV基因組DNA上的EnhI區域序列之HBV RNA序列、及相當於HBV基因組DNA上的EnhII區域序列之HBV RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白之步驟 例如，可舉出利用如RNA結合蛋白資料庫(RNA-Binding Protein DataBase)、RBPDB的公共RNA結合蛋白序列資料庫。作為所利用之公共RNA結合蛋白序列資料庫，並無特別限定。可藉由對RBPDB或等同於此之資料庫輸入相當於HBV基因組DNA上的EnhI區域序列或EnhII區域序列之HBV RNA序列，而取出與該等區域序列結合之RNA結合蛋白。 又，可舉出例如進行使用了來自於HepG2.2.15細胞之細胞萃取液和具有在試驗管內轉錄之相當於HBV 基因組DNA上的EnhI區域序列或EnhII區域序列之序列之RNA的沉澱試驗(pull down assay)，且藉由質量分析裝置特定所得到之結合蛋白之方法或等同於該等之方法。
本發明的篩選方法，係較佳為(a)包含使用RNA結合蛋白序列資料庫之步驟的方法。 又，作為其他態樣，而較佳為(a)包含進行使用了具有相當於HBV基因組DNA上的EnhI區域序列或EnhII區域序列之序列之RNA的沉澱試驗之步驟的方法。
(b)使會抑制所鑑定之RNA結合蛋白的功能或活性之被驗物質、或會使相同蛋白質的表現量降低之被驗物質，與感染HBV之細胞或會表現HBV之細胞接觸之步驟 作為感染HBV之細胞，可舉出例如感染HBV選殖株C_JPNAT(GenBank：AB246345.1)之人類初代培養肝細胞；或者為會強制表現牛磺膽酸鈉共轉運多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide(NTCP))之HepG2細胞，且感染HBV選殖株C_JPNAT(GenBank：AB246345.1)之細胞。關於上述HBV選殖株與細胞的組合，並無特別限定。 作為表現HBV之細胞，可舉出例如HepG2.2.15細胞或會強制表現包含使HBV選殖株C_JPNAT(GenBank：AB246345.1)的基因組序列延長1.24倍之序列而成之質體之HepG2細胞、Huh-7細胞、HepaRG細胞或人類初代培養肝細胞。關於上述HBV選殖株，並無特別限定。又，關於插入包含上述HBV選殖株的基因組序列而成之質體之來自於HBV基因組之序列的長度，係只要為HBV選殖株的基因組序列的1.24倍長度以上，則並無特別限定。
作為被驗物質，可舉出例如選自抗體、肽、蛋白質、非肽類化合物、合成化合物、反義核酸、雙股RNA、腺相關病毒載體、CRISPR-Cas載體系等之物質。 作為用於本發明的篩選方法之被驗物質，係較佳為反義核酸或雙股RNA，更佳為雙股RNA。 又，雙股RNA的情況，特佳為RNA干擾劑。
感染HBV之細胞或會表現HBV之細胞與被驗物質的接觸，係例如可藉由於培養培養基中添加測試物質且培養一定期間而實施。所添加之被驗物質的濃度，係依據物質的種類(溶解度、毒性等)而不同，但是例如在約0.1nmol/L～約100nmol/L的範圍內適當選擇。作為培養時間，可舉出例如約24小時～約120小時。
(c)測量感染HBV之細胞或會表現HBV之細胞中的HBV蛋白質的產生能力之步驟 作為測量HBV蛋白質的產生能力之步驟，可舉出測量感染HBV之細胞或者會表現HBV之細胞的培養上清液中的HBV蛋白質之方法。 例如，能夠使用所回收之培養上清液而藉由化學發光酶免疫測量法(CLEIA法)或酵素免疫測量法(ELISA法)等方法或等同於該等之方法，來測量HBV蛋白質。
(d)選擇具有抑制(c)的HBV蛋白質之產生的活性之物質之步驟 例如，可於(c)中使被驗物質作用，藉此選擇與陰性對照相比而將HBV蛋白質之產生抑制30%以上的物質，較佳為抑制50%以上的物質，進一步較佳為抑制70%以上的物質，更進一步較佳為抑制90%以上的物質。
＜醫藥組成物的用途＞ 本發明的醫藥組成物，係有用於HBV感染的治療或預防。
本發明的醫藥組成物，能夠抑制HBV蛋白質的產生，尤其能夠抑制HBs抗原的產生。又，能夠抑制HBV基因表現(HBV的DNA產生)。所以，本發明的醫藥組成物，係有用於HBV感染的治療或預防用。
本發明係關於一種用以抑制HBs抗原產生之本發明的醫藥組成物的使用。 本發明係關於一種用以抑制HBV的DNA產生之本發明的醫藥組成物的使用。 本發明係關於一種用以抑制HBV的基因表現之本發明的醫藥組成物的使用。
本發明係關於一種用以治療或預防HBV感染之本發明的醫藥組成物的使用。 與HBV感染有關之疾病中包括侵襲性肝纖維變性(aggressive hepatic fibrosis)、炎症及壞死，該等會發展為肝硬化、終末期肝疾病及肝細胞癌。
接著，舉出試驗例對本發明進行說明，但是本發明並不限定於該等。 [實施例]
[試驗例1] (使用了EnhI/EnhII區域缺損建構體之報導分析) PCR反應係在包含1×PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara公司製)、0.2μmol/L引子之反應液中進行。以HBV基因組DNA(GenBank：AB246345.1；以下亦稱為「基因型C」)為模板，將包含PreS2/S啟動子之區域410bp使用包含序列識別號3的鹼基序列之引子及包含序列識別號4的鹼基序列之引子的組合，而以將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃15秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到導入了KpnI及HindIII限制酶部位之增幅斷片。同樣地進行，而將包含編碼HBs抗原之基因的3’非轉譯區域(以下亦稱為「3’UTR」)的序列之區域1086bp使用包含序列識別號5的鹼基序列之引子及包含序列識別號6的鹼基序列之引子的組合，而以將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃15秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到導入了XbaI及SalI的限制酶部位之增幅斷片。以KpnI(Takara公司製)、HindIII(Takara公司製)的組合，或以XbaI(Takara公司製)、SalI(Takara公司製)的組合來處理各個斷片，得到插入pGL3(Promega公司製)的KpnI、HindIII的部位或XbaI、SalI的部位而連結之質體。以下，亦稱此質體為「PreS2/S-Luc-3’UTR」。另外，在後述之試驗例4中，為了界定基因型的差異，亦稱為「PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型C)」。以PreS2/S-Luc-3’UTR質體為模板，而使用含序列識別號7的鹼基序列之引子及包含序列識別號8的鹼基序列之引子的組合、以及包含序列識別號9的鹼基序列之引子及包含序列識別號10的鹼基序列之引子的組合，以將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃30秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到了用以製作EnhI區域缺損之質體之增幅斷片。使用In-Fusion HD選殖套組(Takara公司製)連結該等斷片，得到了PreS2/S-Luc-3’UTR質體中的EnhI區域缺損之質體。以下，亦稱此質體為「PreS2/S-Luc-3’UTR dEnhI」。以PreS2/S-Luc-3’UTR質體為模板，而使用包含序列識別號7的鹼基序列之引子及包含序列識別號11的鹼基序列之引子的組合、以及包含序列識別號10的鹼基序列之引子及包含序列識別號12的鹼基序列之引子的組合，以將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃30秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到了用以製作EnhII區域缺損之質體之增幅斷片。使用In-Fusion HD選殖套組(Takara公司製)連結該等斷片，得到了PreS2/S-Luc-3’UTR質體中的EnhII區域缺損之質體。以下，亦稱此質體為「PreS2/S-Luc-3’UTR dEnhII」。
[表1]
序列識別號 序列(5’→3’)
3 GTCAGGTACCCAAACAATCCAGATTGGGAC
4 TGACAAGCTTGTTCGGTGCAGGGTCC
5 TGACTCTAGAACCCTAATAAAACCAAACGT
6 TGACGTCGACTTTATACGGGTCAATGTCCA
7 CGCGGGGCATGACTATCGTC
8 AGGCATTAAGGCAGGATAGC
9 CCTGCCTTAATGCCTCCGATCCATACTGCG
10 GACGATAGTCATGCCCCGCG
11 GACCTGGTGGGCGTTCACGG
12 AACGCCCACCAGGTCACTAGGAGGCTGTAG
使用對肝生殖細胞瘤(hepatoblastoma)細胞株HepG2導入有HBV基因組之會持續產生病毒之細胞的HepG2.2.15細胞(Proc Natl Acad Sci USA 84卷 1005頁～1009頁 1987年)，而按以下的順序實施了報導分析。 作為細胞培養用培養基，而使用了以下。 DMEM/F-12、GlutaMAX(Invitrogen公司製)+5μg/mL胰島素(Wako公司製)+1%青黴素/鏈黴素(Sigma公司製)+10mmol/L HEPES(Sigma公司製)+50μmol/L氫皮質酮(Sigma公司製)+10%FBS(Equitech-Bio公司製)
將HepG2.2.15細胞懸浮於上述培養基中，以每1孔成為1×104 個細胞/100μL的方式接種於96孔微孔盤中，在5%CO2 恆溫箱中在37℃下進行培養24小時。以7.8μL的無血清培養基(ThermoFisher Scientific公司製)稀釋0.062μg的PreS2/S-Luc-3’UTR質體、PreS2/S-Luc-3’UTR dEnhI質體或PreS2/S-Luc-3’UTR dEnhII質體中的任一種及0.25ng的pRL-SV40質體(Promega公司製)、0.23μL的TransIT-X2轉染試劑(Mirus公司製)，在室溫下進行培養20分鐘。將此質體-TransIT-X2轉染試劑混合液8μL添加到已接種前述HepG2.2.15之孔中，進行培養24小時。接著，以前述細胞培養用培養基100μL/孔更換培養基，在5%CO2 恆溫箱中在37℃下進一步進行培養48小時。進行培養後，以雙螢光素酶報導分析系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega公司製)檢測了基於螢火蟲螢光素酶之發光及基於海腎螢光素酶(Renilla luciferase)之發光。將針對各孔計算了以海腎螢光素酶的發光量校正之螢火蟲螢光素酶的發光量之結果，呈示於圖1。又，將計算了各缺損質體添加孔中的螢光素酶的發光量相對於PreS2/S-Luc-3’UTR質體添加孔中的螢火蟲螢光素酶的發光量之相對值(%)之結果，呈示於圖1。
將HepG2.2.15細胞懸浮於上述培養基中，以每1孔成為2×105 個細胞/1000μL的方式接種於12孔微孔盤中，在5%CO2 恆溫箱中在37℃下進行培養24小時。以97μL的無血清培養基(ThermoFisher Scientific公司製)稀釋1μg的PreS2/S-Luc-3’UTR質體、PreS2/S-Luc-3’UTR dEnhI質體或PreS2/S-Luc-3’UTR dEnhII質體中的任一種及3μL的TransIT-X2轉染試劑(Mirus公司製)，在室溫下進行培養20分鐘。將該質體-TransIT-X2轉染試劑混合液100μL添加到已接種前述HepG2.2.15之孔中，進行培養24小時。接著，以前述細胞培養用培養基1000μL/孔更換培養基，在5%CO2 恆溫箱中在37℃下進而進行培養24小時。然後，廢棄培養上清液，用磷酸緩衝生理鹽水(1000μL/孔、FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製)清洗細胞，使用RNeasy迷你套組(Mini Kit)(Qiagen公司製)萃取總RNA。使用附gDNA Eraser之PrimeScript反轉錄試劑套組(Takara公司製)反轉錄1μg所萃取之總RNA，製作了cDNA。藉由所製作之cDNA來定量螢火蟲螢光素酶RNA的表現量，且將計算了各質體添加孔中的螢火蟲螢光素酶RNA的表現量相對於轉染PreS2/S-Luc-3’UTR質體之孔中的螢火蟲螢光素酶RNA的表現量之相對值(%)的結果呈示於圖2。
藉由EnhI區域或EnhII區域的缺損，而來自於螢火蟲螢光素酶蛋白質之相對發光量減少了70%～80%左右(圖1)。因此上述現象被認為有起因由DNA序列中有EnhI區域或EnhII區域缺損所致之轉錄活性的減少(螢火蟲螢光素酶RNA表現量的減少)之可能性、或起因於由RNA序列中有相當於EnhI之區域或相當於EnhII之區域缺損所致之RNA的功能變化之可能性。於是，解析了螢火蟲螢光素酶RNA的相對表現量之結果，藉由EnhI區域或EnhII區域的缺損，螢火蟲螢光素酶RNA的相對表現量幾乎沒有變化(圖2)。由此可知，由EnhI區域或EnhII區域的缺損所致之相對發光量的減少，係起因於由RNA序列中有相當於EnhI之區域或相當於EnhII之區域缺損所致之RNA的功能變化。亦即可知：相當於HBV基因組DNA上的EnhI之區域或相當於HBV基因組DNA上的EnhII之區域，係在RNA上發揮功能，並且控制蛋白質的表現量。
[試驗例2] (RNA結合蛋白的電腦模擬(in silico)鑑定) 由於相當於EnhI之區域、相當於EnhII之區域在RNA上發揮功能，因此嘗試了與該等區域結合之RNA結合蛋白的鑑定。推定的RNA結合蛋白係藉由下述而進行了鑑定：對公共RNA結合蛋白序列資料庫(RNA結合蛋白資料庫、RBPDB)，輸入編碼HBs抗原之RNA的3’UTR內EnhI相當區域(GenBank：AB246345、由鹼基編號1060號～1260號組成之相當於EnhI區域之RNA序列、序列識別號1)或編碼HBs抗原之RNA的3’UTR內EnhII相當區域(GenBank：AB246345、由鹼基編號1638號～1771號組成之相當於EnhII區域之RNA序列、序列識別號2)，且執行結合蛋白預測程式。RBPDB係經累積從使用了人類、小鼠、果蠅等之活體外及活體內實驗所得到之與RNA結合蛋白及其結合序列有關之資訊而成的資料庫，可藉由輸入RNA的鹼基序列，而取出被推定為會與具有該序列之RNA結合的RNA結合蛋白(Nucleic Acids Res、39卷、D301頁～D308頁、2011)。
[表2] 與編碼HBs抗原之RNA上的EnhI相當區域、EnhII相當區域結合之蛋白質
蛋白質名稱 對EnhI相當區域之結合 對EnhII相當區域之結合
RBFOX1 有 無
ELAVL2 有 無
MBNL1 有 無
RBMX 有 無
SRSF9 無 有
SRSF10 無 有
SNRPA 無 有
ELAVL1 有 有
PUM2 有 有
YTHDC1 有 有
SRSF1 有 有
KHDRBS3 有 有
EIF4B 有 有
預測到：對於編碼HBs抗原之RNA上的EnhI相當區域及EnhII相當區域中的至少1個區域，有複數個RNA結合蛋白會進行結合。
[試驗例3] (抗HBV檢測) 使用對肝生殖細胞瘤(hepatoblastoma)細胞株HepG2導入有HBV基因組之會持續產生病毒之細胞的HepG2.2.15細胞(Proc Natl Acad Sci USA 84卷 1005頁～1009頁 1987年)，而按以下順序評價了由各分子的抑制所致之抗HBV效果。 作為細胞培養用培養基，而使用了以下。 DMEM/F-12、GlutaMAX(Invitrogen公司製)+5μg/mL胰島素(Wako公司製)+1%青黴素/鏈黴素(Sigma公司製)+10mmol/L HEPES(Sigma公司製)+50μmol/L氫皮質酮(Sigma公司製)+10%FBS(Equitech-Bio公司製)
(1)用於轉染之dsRNA係使用了下述之物(Dharmacon公司製)。SMARTpool：ON-TARGETplus RBFOX1 siRNA(L-013377-01)、SMARTpool：ON-TARGETplus ELAVL1 siRNA(L-003773-00)、SMARTpool：ON-TARGETplus ELAVL2 siRNA(L-019801-00)、SMARTpool：ON-TARGETplus MBNL1 siRNA(L-014136-00)、SMARTpool：ON-TARGETplus RBMX siRNA(L-011691-01)、SMARTpool：ON-TARGETplus PUM2 siRNA(L-014031-02)、SMARTpool：ON-TARGETplus YTHDC1 siRNA(L-015332-02)、SMARTpool：ON-TARGETplus SRSF1 siRNA(L-018672-01)、SMARTpool：ON-TARGETplus SRSF9 siRNA(L-019529-01)、SMARTpool：ON-TARGETplus SRSF10 siRNA(L-007278-00)、SMARTpool：ON-TARGETplus KHDRBS3 siRNA(L-012748-01)、SMARTpool：ON-TARGETplus EIF4B siRNA(L-020179-00)、SMARTpool：ON-TARGETplus SNRPA siRNA(L-019435-02)。又，使用on-taRgeTplus Non-targeting Control Pool(Dharmacon公司製)作為陰性對照dsRNA。
(2)將HepG2.2.15細胞懸浮於上述培養基，製備了2×105 個細胞/mL的HepG2.2.15細胞懸浮液。使用無核酸酶水 (not DEPC-Treated，非DEPC處理)(ThermoFisher Scientific公司製)稀釋dsRNA，製備了2.743～2000nmol/L、3倍稀釋系列的dsRNA溶液。以8.2μL的無血清培養基(ThermoFisher Scientific公司製)稀釋1.5μL的已製備之dsRNA溶液及0.3μL的Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher Scientific公司製)，在室溫下進行培養5分鐘。以細胞培養用培養基40μL稀釋該dsRNA-Lipofectamine RNAiMAX混合液10μL，製得50μL。將其與前述HepG2.2.15細胞懸浮液50μL混合，接種於96孔微孔盤中，在5%CO2 恆溫箱中在37℃下進行培養3天(dsRNA的最終濃度：0.91～30nmol/L、3倍稀釋系列)。接著，以前述細胞培養用培養基100μL/孔更換培養基，在5%CO2 恆溫箱中在37℃下進一步進行培養3天。然後，回收培養上清液並且使用CellTiter96 AQueous單溶液細胞增生檢測(Promega公司製)測量了細胞生存率。使用AlphaLISA B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)套組(Perkin Elmer公司製)測量了所回收之培養上清液中的HBs抗原量。又，以AL緩衝液(Qiagen公司製)及蛋白酶K(ThermoFisher Scientific公司製)的混合物處理所回收之培養上清液，藉由即時PCR法定量了所得到之溶液中的HBV的DNA(HBV DNA)。針對各標記，計算了各dsRNA添加孔相對於各濃度的陰性對照dsRNA添加孔之相對值(%)(圖3及圖4)。
藉由RBFOX1、SRSF10、ELAVL1、PUM2的減弱(knockdown)，而HBs抗原最多減少30%左右，藉由SRSF9、SNRPA、YTHDC1、SRSF1的減弱，而HBs抗原最多減少70～90%左右(圖3)。又，藉由PUM2、SRSF1的減弱，而HBV DNA最多減少40～50%左右，藉由YTHDC1的減弱，而HBV DNA最多減少80%左右。另一方面，該等基因的減弱並不影響細胞生存率(圖4)。由以上可知，藉由抑制會與編碼HBs抗原之RNA上的EnhI相當區域及EnhII相當區域結合之蛋白質，而可得到HBV蛋白質的產生抑制或HBV DNA表現量的降低等抗HBV效果。
[試驗例4] (使用了EnhI/EnhII區域缺損建構體之檢測、基因型的探討) PCR反應係在包含1×PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara公司製)、0.2μmol/L引子之反應液中進行。以HBV基因組DNA(GenBank：AF462041.1；以下亦稱為「基因型A」)為模板，而將包含編碼HBs抗原之基因的3’UTR的序列(以下亦稱為「3’UTR(基因型A)」)之區域1086bp，使用包含序列識別號13的鹼基序列之引子及包含序列識別號14的鹼基序列之引子的組合，以將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃10秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到導入了XbaI及SalI的限制酶部位之增幅斷片。以XbaI(Takara公司製)、SalI(Takara公司製)的組合處理該斷片，得到插入試驗例1中所製作之PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型C)的XbaI、SalI之部位而連結的質體。以下，亦稱此質體為「PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)」。以PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)質體為模板，使用包含序列識別號15的鹼基序列之引子及包含序列識別號10的鹼基序列之引子的組合、以及包含序列識別號7的鹼基序列之引子及包含序列識別號16的鹼基序列之引子的組合，已將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃30秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到用以製造EnhI區域缺損之質體之增幅斷片。使用In-Fusion HD選殖套組(Takara公司製)連結該等斷片，得到PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)質體中的EnhI區域缺損之質體。以下，亦稱此質體為「PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)dEnhI」。以PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)質體為模板，使用包含序列識別號17的鹼基序列之引子及包含序列識別號10的鹼基序列之引子的組合、以及包含序列識別號7的鹼基序列之引子及包含序列識別號18的鹼基序列之引子的組合，以將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃30秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到用以製作EnhII區域缺損之質體之增幅斷片。使用In-Fusion HD選殖套組(Takara公司製)連結該等斷片，得到PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)質體中的EnhII區域缺損之質體。以下，亦稱此質體為「PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)dEnhII」。
[表3]
序列識別號 序列(5’→3’)
13 TAGTTCTAGAACCCTAACAAAACAAAAAGA
14 TAGTGTCGACTTTATAAGGGTCAATGTCCA
15 CCTGCCTTAATGCCTCCGATCCATACTGCG
16 AGGCATTAAGGCAGGATATC
17 AACGCCCATCAGATCATTAGGAGGCTGTAG
18 GATCTGATGGGCGTTCACGG
以HBV基因組DNA(序列識別號19、以下亦稱為「基因型B」)為模板，將包含編碼HBs抗原之基因的3’UTR的序列(以下亦稱為「3’UTR(基因型B)」)之區域1095bp使用包含序列識別號20的鹼基序列之引子及包含序列識別號21的鹼基序列之引子的組合，以將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃10秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到導入了XbaI及SalI的限制酶部位之增幅斷片。以XbaI(Takara公司製)、SalI(Takara公司製)的組合處理該斷片，得到插入試驗例1中所製作之PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型C)的XbaI、SalI的部位而連結之質體。以下，亦稱此質體為「PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)」。以PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)質體為模板，使用包含序列識別號22的鹼基序列之引子及包含序列識別號10的鹼基序列之引子的組合、以及包含序列識別號7的鹼基序列之引子及包含序列識別號23的鹼基序列之引子的組合，以將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃30秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到用以製作EnhI區域缺損之質體之增幅斷片。使用In-Fusion HD選殖套組(Takara公司製)連結該等斷片，得到PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)質體中的EnhI區域缺損之質體。以下，亦稱此質體為「PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)dEnhI」。以PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)質體為模板，使用包含序列識別號24的鹼基序列之引子及包含序列識別號10的鹼基序列之引子的組合、以及包含序列識別號7的鹼基序列之引子及包含序列識別號25的鹼基序列之引子的組合，以將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃30秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到用以製作EnhII區域缺損之質體之增幅斷片。使用In-Fusion HD選殖套組(Takara公司製)連結該等斷片，得到PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)質體中的EnhII區域缺損之質體。以下，亦稱此質體為「PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)dEnhII」。
[表4]
序列識別號 序列(5’→3’)
19  
Figure 02_image007
[表5]
序列識別號 序列(5’→3’)
20 TAGTTCTAGAACCCTCACAAAACAAAAAGA
21 TAGTGTCGACTTTATACGGGTCAATGTCCA
22 CCTGCTTTAATGCCTCCGATCCATACTGCG
23 AGGCATTAAAGCAGGATATC
24 AAGAGGACTCTTGGAAGGCTGTAGGCATAA
25 TCCAAGAGTCCTCTTATGCA
以HBV基因組DNA(GenBank：U95551.1；以下亦稱為「基因型D」)為模板，將包含編碼HBs抗原之基因的3’UTR的序列(以下亦稱為「3’UTR(基因型D)」)之區域1086bp使用包含序列識別號26的鹼基序列之引子及包含序列識別號27的鹼基序列之引子的組合，以將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃15秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到導入了XbaI及SalI的限制酶部位之增幅斷片。以XbaI(Takara公司製)、SalI(Takara公司製)的組合處理該斷片，得到插入試驗例1中所製作之PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型C)的XbaI、SalI的部位而連結之質體。以下，亦稱此質體為「PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)」。以PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)質體為模板，使用包含序列識別號28的鹼基序列之引子及包含序列識別號10的鹼基序列之引子的組合、以及包含序列識別號7的鹼基序列之引子及包含序列識別號29的鹼基序列之引子的組合，以將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃30秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到用以製作EnhI區域缺損之質體之增幅斷片。使用In-Fusion HD選殖套組(Takara公司製)連結該等斷片，得到PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)質體中的EnhI區域缺損之質體。以下，亦稱此質體為「PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)dEnhI」。以PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)質體為模板，使用包含序列識別號30的鹼基序列之引子及包含序列識別號10的鹼基序列之引子的組合、以及包含序列識別號7的鹼基序列之引子及包含序列識別號31的鹼基序列之引子的組合，以將98℃10秒鐘、58℃5秒鐘、72℃30秒鐘重複35次之條件進行PCR，藉此而得到用以製作EnhII區域缺損之質體之增幅斷片。使用In-Fusion HD選殖套組(Takara公司製)連結該等斷片，得到PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)質體中的EnhII區域缺損之質體。以下，亦稱此質體為「PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)dEnhII」。
[表6]
序列識別號 序列(5’→3’)
26 TAGTTCTAGAACCCTAACAAAACAAAGAGA
27 TAGTGTCGACTTTATAAGGGTCGATGTCCA
28 CCTGCGTTAATGCCCCCGATCCATACTGCG
29 GGGCATTAACGCAGGATAAC
30 ACGCCCACCGAATGTACTAGGAGGCTGTAG
31 ACATTCGGTGGGCGTTCACG
使用HepG2.2.15細胞，按以下順序實施了報導分析。 作為細胞培養用培養基，而使用了以下。 DMEM/F-12、GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific公司製)+5μg/mL胰島素(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製)+1%青黴素/鏈黴素(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製)+10mmol/L HEPES(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製)+50μmol/L氫皮質酮(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製)+10%FBS(Equitech-Bio公司製)
將HepG2.2.15細胞懸浮於上述培養基中，以每1孔成為1×104 個細胞/100μL的方式接種於96孔微孔盤中，在5%CO2 恆溫箱中在37℃下進行培養一晩。以7.8μL的無血清培養基(ThermoFisher Scientific公司製)稀釋64ng的各種質體(PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)dEnhI、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)dEnhII、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)dEnhI、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)dEnhII、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型C)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型C)dEnhI、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型C)dEnhII、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)dEnhI、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)dEnhII)中的任一種、及0.25ng的pRL-SV40質體(Promega公司製)、0.24μL的TransIT-X2轉染試劑(Mirus公司製)，在室溫下進行培養20分鐘。將該質體-TransIT-X2轉染試劑混合液8μL添加到已接種前述HepG2.2.15之孔中，進一步進行培養1天。接著，以前述細胞培養用培養基100μL/孔更換培養基，在5%CO2 恆溫箱中在37℃下進而進行培養24小時。進行培養後，用雙螢光素酶報導分析系統(Promega公司製)檢測了基於螢火蟲螢光素酶之發光及基於海腎螢光素酶之發光。針對各孔計算以海腎螢光素酶的發光量所校正之螢火蟲螢光素酶的發光量。然後，將計算了各基因型的缺損質體添加孔中的螢光素酶的發光量相對於PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型C)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)的各質體添加孔中的螢火蟲螢光素酶的發光量之相對值(%)之結果呈示於圖5。
將HepG2.2.15細胞懸浮於上述培養基中，以每1孔成為1×105 個細胞/500μL的方式接種於24孔微孔盤中，在5%CO2 恆溫箱中在37℃下進行培養一晩。以50μL的無血清培養基(ThermoFisher Scientific公司製)稀釋500ng的各種質體(PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)dEnhI、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)dEnhII、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)dEnhI、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)dEnhII、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型C)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型C)dEnhI、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型C)dEnhII、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)dEnhI、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)dEnhII)中的任一種、及1.5μL的TransIT-X2轉染試劑(Mirus公司製)，在室溫下進行培養20分鐘。將該質體-TransIT-X2轉染試劑混合液52μL添加到已接種前述HepG2.2.15之孔中，進行培養一晩。接著，以前述細胞培養用培養基500μL/孔更換培養基，在5%CO2 恆溫箱中在37℃下進而進行培養1天。然後，廢棄培養上清液，用磷酸緩衝生理鹽水(1000μL/孔、FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製)清洗細胞，使用RNeasy 迷你套組(Qiagen公司製)萃取總RNA。使用附gDNA Eraser之PrimeScript反轉錄試劑套組(Takara公司製)反轉錄所萃取之總RNA，製作了cDNA。藉由所製作之cDNA來定量螢火蟲螢光素酶RNA的表現量，將計算了各基因型的缺損質體添加孔中的螢光素酶RNA表現量相對於PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型A)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型B)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型C)、PreS2/S-Luc-3’UTR(基因型D)的各質體添加孔中的螢火蟲螢光素酶RNA的表現量之相對值(%)的結果，呈示於圖5。
於基因型A中，藉由EnhI區域或EnhII區域的缺損，而來自於螢火蟲螢光素酶蛋白質之相對發光量減少了87%～90%(圖5)。另一方面，藉由EnhI區域或EnhII區域的缺損，而螢火蟲螢光素酶RNA的相對表現量減少了31～49%。 於基因型B中，藉由EnhI區域或EnhII區域的缺損，而來自於螢火蟲螢光素酶蛋白質之相對發光量減少了65%～80%。另一方面，藉由EnhI區域或EnhII區域的缺損，而螢火蟲螢光素酶RNA的相對表現量減少了39～43%。 於基因型C中，藉由EnhI區域或EnhII區域的缺損，而來自於螢火蟲螢光素酶蛋白質之相對發光量減少了74%～84%。另一方面，藉由EnhI區域或EnhII區域的缺損，而螢火蟲螢光素酶RNA的相對表現量減少了34～61%。 於基因型D中，藉由EnhI區域或EnhII區域的缺損，而來自於螢火蟲螢光素酶蛋白質之相對發光量減少了86%～91%。另一方面，藉由EnhI區域或EnhII區域的缺損，而螢火蟲螢光素酶RNA的相對表現量減少了51～52%。 以上的結果係任一者皆顯示EnhI區域及EnhII區域之對於從RNA轉譯到蛋白質之過程的貢獻。亦即可知：於HBV的複數個的基因型上共通地，相當於HBV基因組DNA上的EnhI之區域或相當於EnhII之區域，係在RNA上發揮功能，並且控制蛋白質的表現量。 [產業上利用之可能性]
本發明的醫藥組成物係顯示優異之抗HBV活性，且有用於作為抗B型肝炎病毒劑。
無。
圖1係呈示使用來自於基因型C之EnhI/EnhII區域缺損建構體(construct)之報導分析(reporter assay)中的螢火蟲螢光素酶的相對發光量(%)。 圖2係呈示使用來自於基因型C之EnhI/EnhII區域缺損建構體之報導分析中的螢火蟲螢光素酶RNA的相對表現量(%)。 圖3係針對HBs抗原(HBsAg)，呈示各dsRNA添加孔相對於各濃度的陰性對照dsRNA添加孔之相對值(%)。 圖4針對細胞生存率，呈示各dsRNA添加孔相對於各濃度的陰性對照dsRNA添加孔之相對值(%)。 圖5表示使用來自於各種基因型之EnhI/EnhII區域缺損建構體之報導分析中的螢火蟲螢光素酶RNA的相對表現量(%)及螢火蟲螢光素酶的相對發光量(%)。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
無。

Claims (15)

  1. 一種醫藥組成物，其係抑制B型肝炎病毒蛋白質之產生的醫藥組成物，其特徵為： 抑制會與選自相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子I區域序列之B型肝炎病毒RNA序列、及相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子II區域序列之B型肝炎病毒RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白的表現或功能。
  2. 如請求項1之醫藥組成物，其中相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子I區域序列之B型肝炎病毒RNA序列為與序列識別號1具有80%以上的序列一致性之序列，相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子II區域序列之B型肝炎病毒RNA序列為與序列識別號2具有80%以上的序列一致性之序列。
  3. 如請求項1或2之醫藥組成物，其中相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子I區域序列之B型肝炎病毒RNA序列為與序列識別號1具有90%以上的序列一致性之序列，相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子II區域序列之B型肝炎病毒RNA序列為與序列識別號2具有90%以上的序列一致性之序列。
  4. 如請求項1或2之醫藥組成物，其中B型肝炎病毒蛋白質為HBs抗原蛋白質。
  5. 如請求項1或2之醫藥組成物，其進一步降低B型肝炎病毒基因組DNA的表現量。
  6. 如請求項1或2之醫藥組成物，其進一步降低完全雙股DNA的表現量。
  7. 如請求項1或2之醫藥組成物，其中RNA結合蛋白為選自RBFOX1、ELAVL2、MBNL1、RBMX、SRSF9、SRSF10、SNRPA、ELAVL1、PUM2、YTHDC1、SRSF1、KHDRBS3及EIF4B之至少1個蛋白質。
  8. 一種篩選方法，其係篩選抑制B型肝炎病毒蛋白質之產生的物質之方法，其特徵為： 鑑定抑制會與選自相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子I區域序列之B型肝炎病毒RNA序列、及相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子II區域序列之B型肝炎病毒RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白的表現或功能之物質。
  9. 如請求項8之篩選方法，其中相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子I區域序列之B型肝炎病毒RNA序列為與序列識別號1具有80%以上的序列一致性之序列，相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子II區域序列之B型肝炎病毒RNA序列為與序列識別號2具有80%以上的序列一致性之序列。
  10. 如請求項8或9之篩選方法，其中B型肝炎病毒蛋白質為HBs抗原蛋白質。
  11. 一種方法，其係篩選抑制B型肝炎病毒蛋白質之產生的物質之方法，其包括： (a)鑑定會與選自相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子I區域序列之B型肝炎病毒RNA序列、及相當於B型肝炎病毒基因組DNA上的強化子II區域序列之B型肝炎病毒RNA序列之至少1個序列結合之RNA結合蛋白之步驟、 (b)使會抑制所鑑定之RNA結合蛋白的功能或活性之被驗物質、或會使相同蛋白質的表現量降低之被驗物質，與感染B型肝炎病毒之細胞或會表現B型肝炎病毒之細胞接觸之步驟； (c)測量感染B型肝炎病毒之細胞或會表現B型肝炎病毒之細胞中的B型肝炎病毒蛋白質的產生能力之步驟；及 (d)選擇具有抑制(c)的B型肝炎病毒蛋白質之產生的活性之物質之步驟。
  12. 如請求項11之方法，其中(a)包括使用RNA結合蛋白序列資料庫之步驟。
  13. 如請求項11之方法，其中(b)的被驗物質為抗體、肽、蛋白質、非肽類(nonpeptidic)化合物、合成化合物、反義核酸、雙股RNA、腺相關病毒(adeno-associated virus)載體或CRISPR-Cas載體系。
  14. 如請求項11之方法，其中(c)包括測量感染B型肝炎病毒之細胞或會表現B型肝炎病毒之細胞的培養上清液中的B型肝炎病毒蛋白質之步驟。
  15. 如請求項11之方法，其中(d)的物質為抗體、肽、蛋白質、非肽類化合物、合成化合物、反義核酸、雙股RNA、腺相關病毒載體或CRISPR-Cas載體系。
TW109110161A 2019-03-26 2020-03-26 抑制b型肝炎病毒蛋白質之產生的醫藥組成物及篩選方法 TW202102234A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019058788 2019-03-26
JP2019-058788 2019-03-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202102234A true TW202102234A (zh) 2021-01-16

Family

ID=72611522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109110161A TW202102234A (zh) 2019-03-26 2020-03-26 抑制b型肝炎病毒蛋白質之產生的醫藥組成物及篩選方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220042020A1 (zh)
EP (1) EP3949986A4 (zh)
JP (1) JP7455336B2 (zh)
CN (1) CN113645998A (zh)
TW (1) TW202102234A (zh)
WO (1) WO2020196737A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116249538A (zh) * 2020-09-30 2023-06-09 富士胶片株式会社 抑制乙型肝炎病毒蛋白质的产生的双链rna及药物组合物
CN112342237B (zh) * 2020-10-09 2023-02-28 林君玉 一种乙型肝炎病毒小鼠模型的构建方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2442092A1 (en) 2001-03-26 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication
WO2004003201A2 (en) 2002-07-01 2004-01-08 Pharmacia Corporation Antisense modulation of lrh1 expression
WO2004053162A1 (ja) * 2002-12-11 2004-06-24 Advanced Life Science Institute, Inc. Ｂ型肝炎ウイルスの薬物抵抗性を識別する方法
JP2007520461A (ja) 2003-12-16 2007-07-26 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 肝炎ウイルスの負荷を変えるための方法および化合物
CN100344330C (zh) * 2004-09-22 2007-10-24 广州拓谱基因技术有限公司 用于治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰rna制剂及制备方法
US9234200B2 (en) * 2011-12-15 2016-01-12 National University Of Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology Oligonucleotide, glucocorticoid sensitivity enhancer, pharmaceutical composition, and expression vector
WO2015133613A1 (ja) * 2014-03-07 2015-09-11 雅史 溝上 Ｂ型肝炎ウイルスレポーターベクター、ｂ型肝炎ウイルス様粒子及びそれを用いたｂ型肝炎治療薬のスクリーニング方法
WO2016040167A1 (en) * 2014-09-08 2016-03-17 Brandon Higgs Compositions and methods for detecting and treating small cell lung cancer
US20180117166A1 (en) * 2015-04-17 2018-05-03 Genisphere, Llc siRNA Inhibition Of Human Antigen R Expression For Treatment of Cancer
KR102638286B1 (ko) 2015-07-02 2024-02-20 주식회사 젬백스앤카엘 항바이러스 활성 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
GB201609597D0 (en) * 2016-06-01 2016-07-13 Univ Sheffield Therapy
WO2020196738A1 (ja) * 2019-03-26 2020-10-01 富士フイルム株式会社 Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する医薬組成物、ｂ型肝炎を処置するための医薬組成物およびスクリーニング方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP7455336B2 (ja) 2024-03-26
JPWO2020196737A1 (zh) 2020-10-01
EP3949986A1 (en) 2022-02-09
CN113645998A (zh) 2021-11-12
US20220042020A1 (en) 2022-02-10
EP3949986A4 (en) 2023-12-27
WO2020196737A1 (ja) 2020-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Majzoub et al. RACK1 controls IRES-mediated translation of viruses
Lin et al. Heterogeneous nuclear ribonuclear protein K interacts with the enterovirus 71 5′ untranslated region and participates in virus replication
He et al. Epigallocatechin gallate inhibits HBV DNA synthesis in a viral replication-inducible cell line
Wang et al. The gRNA-miRNA-gRNA ternary cassette combining CRISPR/Cas9 with RNAi approach strongly inhibits hepatitis B virus replication
Thi et al. ARB-1740, a RNA interference therapeutic for chronic hepatitis B infection
US20220042020A1 (en) Pharmaceutical composition that inhibits production of hepatitis b virus protein and screening method
Zhang et al. MicroRNA‐649 promotes HSV‐1 replication by directly targeting MALT1
US20220000903A1 (en) Pharmaceutical composition that inhibits production of hepatitis b virus protein, pharmaceutical composition for treating hepatitis b, and screening method
Kim et al. N6-methyladenosine modification of the 5′ epsilon structure of the HBV pregenome RNA regulates its encapsidation by the viral core protein
WO2022124342A1 (ja) がん治療のための剤、及び、その有効成分のスクリーニング方法
Rahman et al. A traditional Chinese medicine, maoto, suppresses hepatitis B virus production
Ren et al. Stable inhibition of hepatitis B virus expression and replication by expressed siRNA
EP3395363B1 (en) Compounds for use in treating hbv-and hcv-related conditions
JP6566368B2 (ja) Ｂ型肝炎ウイルス分泌阻害剤
JP2023058674A (ja) ウイルス感染及び活性抑制方法
Xu et al. FUSE binding protein FUBP3 is a potent regulator in Japanese encephalitis virus infection
Ren et al. Inhibition of multiple gene expression and virus replication of HBV by stable RNA interference in 2.2. 15 cells
Popescu et al. Sac1 phosphatidylinositol 4‐phosphate phosphatase is a novel host cell factor regulating hepatitis B virus particles assembly and release
Zhou et al. Establishment of a screening system for selection of siRNA target sites directed against hepatitis B virus surface gene
Wang et al. G-quadruplex in hepatitis B virus pregenomic RNA promotes its translation
Liao et al. The orf virus (ORFV) protein OV20. 0 interacts with the microprocessor complex subunit DGCR8 to regulate miRNA biogenesis and ORFV infection
JP7441174B2 (ja) Ｂ型肝炎ウイルスの複製阻害組成物
Rani et al. microRNA-22 displaces ITAFs from the 5'UTR and inhibit the translation of Coxsackievirus B3 RNA
Cai et al. Plerixafor and resatorvid inhibit hepatitis B virus in vitro by upregulating elongation factor Tu GTP-binding domain containing 2
Rani et al. MicroRNA-22-3p displaces critical host factors from the 5′ UTR and inhibits the translation of Coxsackievirus B3 RNA