KR102638286B1 - 항바이러스 활성 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 항바이러스용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드를 포함하여 바이러스 관련 질병 및 바이러스에 의한 병리학적 증상의 치료 및 예방에 효과적인 항바이러스 및 바이러스 관련 질병의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 펩티드는 바이러스의 RNA 복제를 억제하여 바이러스관련 질병을 치료하는 효과를 나타내어, 항바이러스 및 바이러스 관련 질병의 예방 및 치료방법을 제공할 수 있다.

Description

항바이러스 활성 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
본 명세서는 항바이러스 활성 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드를 포함하며 바이러스의 자기 복제 및 활성을 억제하여 바이러스로 인한 질병을 치료하는데 효과적인 바이러스성 질병의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
항바이러스 활성은 바이러스 단백질 또는 그 일부를 직접 인식하여 공격하는 방법, 바이러스의 라이프 사이클의 각 단계를 저해하는 방법, 면역을 증진시키는 방법 등으로 나뉠 수 있다. 바이러스의 라이프 사이클의 각 단계를 저해하는 방법은 각 단계에 따라 여러 가지로 분류될 수 있다. 예컨대, 숙주 세포로의 유입 전 단계를 저해하는 바이러스제로서, 바이러스가 세포에 유입되는 단계를 방해하는 유입-저해제(entry-inhibitor) 또는 유입-블로킹제(entry-blocking agent), 또는 바이러스의 침투(penetration) 및 탈각(uncoating) 블로킹제가 가능하다. 또한, 바이러스가 숙주 세포 내로 유입된 후에 숙주 세포 내에서 바이러스 복제를 하는 단계에서의 항바이러스 활성이 가능한데, 그 예로서, 바이러스의 RNA 또는 DNA의 빌딩 블록과 유사하지만 RNA, DNA 복제 효소를 불활성화시키는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유사체를 통해, 바이러스의 복제를 억제하는 방법이 있다. 대표적으로 역전사효소 저해제를 들 수 있다. 그 다음 단계로서, 합성된 바이러스의 DNA를 자르기 위한 인테그레이즈(integrase) 효소를 억제하거나, 바이러스의 전사, 번역, 번역 후 변형, 또는 그 후의 타겟팅을 억제하는 방법이 있다. 그 외에도, 바이러스의 프로테아제 (protease)를 저해하거나, 바이러스의 어셈블리 단계를 차단하거나, 최종 단계인 숙주세포로부터 바이러스의 방출 단계(release phase)를 블로킹하는 방법이 가능하다. 위와 같은, 바이러스에 대한 직접적인 작용이 아닌, 바이러스에 의한 다양한 증상들을 완화시키는 약제도 가능하다. 예컨대, 바이러스에 의해 유발된 염증을 완화시키는 항염제, 바이러스에 의해 유발된 고열을 낮추는 해열제 등이 가능하지만, 이는 바이러스에 대한 근본적인 치료제로 볼 수는 없다.　　　
바이러스는 세균보다 크기가 작은 전염성 병원체이다. 유전물질인 RNA 또는 DNA와 그 유전물질을 둘러싸고 있는 단백질로 구성된다. 스스로 물질대사를 할 수 없기 때문에, 자신의 DNA나 RNA를 숙주 세포 안에 침투시킨 뒤 침투당한 세포의 소기관들을 이용하여 자신의 유전물질을 복제하고, 자기 자신과 같은 바이러스들을 생산한다. 이 과정에서 숙주 세포가 손상 되거나 파괴되어 숙주에 질병을 일으키기도 한다.
1989년 처음으로 규명된 C형 간염 바이러스 (Hepatitis C Virus, 이하 HCV)는 플라비비리데 (Flaviviridae)에 속하며 약 9.5kb 유전자 (genome) 사이즈를 갖는 단일 양성 가닥 RNA 바이러스이다. 초기 감염 시 증상이 없고 약 55~85% 의 환자에서 만성 간염 (chronic hepatitis) 으로 진행되며, 이 중 약 5~10%의 환자는 간경변증 (liver cirrhosis) 으로 진행하고 이어 간암으로 진행된다.
HCV는 그 유전자 염기서열의 차이에 따라 크게 6개의 유전자형으로 분류되며, 치료에 대한 반응 등 임상적 차이점이 보고되고 있다. 지역에 따라 HCV 유전자형 분포의 차이가 알려져 있으며, 국내에서는 1b 및 2a가 주종일 것이라는 일부 보고가 있었으나 충분한 자료가 있는 것은 아니다. HCV는 감염 후 타 바이러스에 비해 돌연변이율이 높아, 가닥수가 6가지나 되며 단일 가닥 내에도 수많은 유사종 (quasi-species)을 만든다. 이러한 성질로 HCV는 단일 치료제는 내성을 유발하리라 예상되어 여러 치료제의 복합치료가 필요한 실정이다. 따라서 HCV에 의한 간질환 예방 및 치료할 수 있는 보다 안정적이고 효과적인 연구 및 치료제 개발이 시급한 실정이다.
HCV는 바이러스 감염 후 자기 자신의 유전체를 기질로 하여 3,030 개의 아미노산으로 이루어진 하나의 복합 단백질을 만든다. 특히 HCV가 복제하는 데에 있어, 5' 비번역부위 (untranslated region, UTR) 과 3'UTR 이 매우 중요한 역할을 할 것으로 알려져 있다. 5'UTR 의 경우 HCV 가닥에서 매우 보존되어 있는 내부 리보솜 유입점 (internal ribosome entry site, IRES)를 갖고 있어 캡-비의존적으로 (cap-independent) 번역 과정이 일어난다. 감염 후 먼저 생성된 복합 단백질은 숙주와 바이러스의 프로테아제에 의해 가공되어, C, E1, E2 등의 구조 단백질과 NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B 등과 같은 바이러스 증식에 필요한 조절 단백질들로 만들어지게 된다.
항HCV 제제로서 최근까지 활발히 개발이 진행되고 있는 것은 주로 HCV를 타겟으로 한 저해제로서 NS3 프로테아제와 NS5B 폴리머라제 (polymerase)이다. 이러한 바이러스 특이적인 효소를 타겟으로 2003년에 뵈링거-잉겔하임 (Boehringer-Ingelheim)의 NS3 프로테아제를 타겟으로 한 약물의 임상 1상 실험 결과가 네이쳐지에 보고되면서 알려졌다. 그러나 NS3는 그 구조상 약물 침투가 어려워 기본 구조를 바탕으로 한 약물 디자인에 어려움을 겪고 있는 반면 NS5B는 전형적인 폴리머라제 구조인 엄지-손바닥-손가락 (thumb-palm-finger)의 모양을 하고 있으며, 활성부위 외에도 비-뉴클레오시드 억제제 (non-nucleoside inhibitor)를 디자인 할 수 있는 가능성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 최근 들어 HCV를 타겟으로 하는 치료법 개발이 아닌 숙주를 타겟으로 하는 치료제 개발이 진행되고 있다.
또한, B형 간염 바이러스 (Hepatitis B Virus, 이하 HBV) 감염은 크게 무증상 감염, 만성 감염, 간경변, 간세포 암으로 이행하는 다양한 임상 경과를 보이며, 만성 질환 이환율 및 사망률을 증가시킨다. HBV 보균자는 전 세계적으로 약 3억 5천 만명이 분포하고 있을 정도로 HBV 유래 간질환은 인류 건강에 위협적인 질환으로, 전체 간세포암 (Hepatocellular Carcinoma, HCC) 발생 원인의 53%를 차지하고 있는 HBV는 HCV 및 다른 원인과 함께 간세포암 유발의 주요 인자이다.
HBV는 3종의 엔빌롭 (envelope) 단백질을 생성하고, 이들은 모두 pre-S/S 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)에서 코딩된다. HBV 거대 표면 단백질 (large surface proteins, LHBs)의 역할은 명확히 규명되지는 않았다.
기존의 표준 간암 및 항바이러스 치료법으로는, 간경변증이 없거나 잔존 간기능이 충분한 경우 간절제술이 우선적으로 고려되고 있으며 간기능 장애가 동반된 경우 간이식이 일차 치료로 고려되지만 간세포암 환자 대부분이 문맥압 항진증, 간기능 저하, 다발성 종양, 문맥침습, 고령 등의 이유로 시술이 어렵다. 비수술적 치료법으로는 고주파열 치료술과 에탄올 주입술이 주로 사용되고 있으나 종양의 크기가 큰 경우 치료성공률이 낮다.
이와 같이 주로 수술 및 열치료 등에 의존하고 있으며 항암화학요법의 치료율이 매우 낮아 대체약물의 개발이 시급하다. 국내의 경우 특히 HBV 유래 간세포암이 많아 B형 바이러스 유래 만성간염의 선제적 치료가 요구되며 B형 간염을 동반한 간세포암의 경우 간염치료가 선제적 혹은 동시에 진행되는 경우 간암 치료성공률이 증가한다. 특히 만성간염 및 간경화로 인해 간세포암이 발생한 경우 간세포암 치료 이후에도 이로 인한 재발이 매우 높으며 이러한 만성적 염증의 치료가 동시에 이루어져야 하며, 국내에 배타적으로 존재하는 HBV 유전자 C형에 의한 간암의 발생 및 진행에 특화된 만성간염 및 간세포암에 대한 치료전략이 요구된다. 이에따라, 기존에는 인터페론 및 라미부딘이 항바이러스제로써 만성 B형간염 치료제로 사용되었으나 부작용 및 낮은 반응성을 나타내었고, 최근 아데포비르 (Adefovir), 테노포비르 (Tenofovir) 등이 개발되어 바이러스의 증식을 억제하여 간손상을 늦추는 약물로 사용되고 있다. 이러한 약물들은 바이러스의 증식을 억제하여 간손상을 늦추는 효과는 가지고 있지만 완전히 바이러스를 제거하거나 간염을 치료하지는 못한다. 따라서, 지속적인 처방이 필요하여 내성이 나타나게 되고, 약물 본연의 특성에 의해 간독성과 신독성을 나타낸다. 현재 임상적으로 사용 중인 유일한 간암 표적 치료제인 소라페닙 (sorafenib)은 제한적인 치료 범위와 면밀한 치료추이 관찰이 요구되는 한계를 지니고 있기에, 새로운 간암 표적 치료제의 개발에 관한 연구가 전 세계적으로 진행 중이다. 대다수의 개발 중인 물질은 다중 키나제 저해제인 소라페닙에서 유래된 키나제 저해제, 또는 간암 진행에 필수적인 혈관생성을 저해하는 혈관신생억제제 (angiogenic inhibitor)이다. HCC 환자의 66%에서 과발현되는 것이 알려진 표피세포성장인자 수용체 (epidermal growth factor receptor) 저해제는 임상 2상 시험결과 유의할 만한 결과를 얻지 못하였다. 혈관 신생억제를 목표로 개발된 저분자 티로신 키나제 저해제인 브리바닙 (brivanib) 및 단일 클론 항체인 라뮤시루맙 (ramucirumab) 등은 임상 2상에서 좋은 결과를 얻지 못하였다. HCC 환자의 40-50%에서 mTOR 신호 전달체계의 이상이 보고된 바, 에베로리무스 (everolimus)를 비롯한 mTOR 저해체가 소라페닙 불응성 환자를 대상으로 진행된 임상 3상 시험에 진입하였으나, 플라시보 (placebo)에 비해 의미 있는 효과가 있음을 입증하지 못하였다. 새로운 치료 전략으로 c-MET, MEK 저해 저분자 물질을 이용한 HCC 치료제 개발도 시도되고 있다.
현재 개발이 진행 중인 대다수의 신규 치료물질들은 임상시험 초기 단계 진입 수준이며, 임상이 마무리되어가는 약물들의 경우 1차 약물로 쓰일 수 없거나, 기존의 소라페닙과 병용하여 사용하여야만 유의미한 효과를 나타낸다. 따라서, 개발이 진행 중인 이들 기존 약물과는 다른 기전으로 작동하며 간암 환자에서 유의미한 효과가 있음과 동시에 간염의 진행을 억제하는 신규약물의 개발은 관련 간질환 치료에 혁신적인 발전을 도모할 수 있게 하리라 기대된다.
기존의 약물들은 전신적 항암요법에서 대부분의 항암제가 간세포암 (HCC) 치료효능을 나타내는데 실패하였고, 소라페닙의 경우만이 약 2달 정도의 생존기간 연장 효과를 보였다. 이러한 소라페닙의 경우도, 1차 치료로는 고려되지 않고 있다. 따라서, 기존 제품을 대체하고 치료 불응 환자에 사용될 수 있는 HCC에 특화된 전문 항암제 개발이 요구되고 있다.
한편, 사람 면역결핍 바이러스 (Human Immunodeficiency Virus, 이하 HIV)는 레트로바이러스 (retroviridae) 과 (family) 렌티바이러스 (Lentivirus) 속 (genus)에 속하는 바이러스이다. 렌티바이러스는 다양한 생물종에 감염될 수 있고, 긴 잠복기를 가진 만성 질환을 일으키는 원인체라는 특징이 있다.
HIV의 생활사는 크게 숙주 세포에 침입하는 단계, 그리고 세포 내에서 복제와 전사를 하는 단계, 바이러스가 재조합하는 단계와 마지막으로 바이러스가 합성되고 세포 외부로 분비되는 단계로 나눌 수 있다. 이러한 HIV의 증식 과정 도중에 어느 한 단계를 차단하면 HIV를 억제할 수 있다.
현재 치료제로 개발되어 환자에게 사용하고 있는 약제는 복합 억제제 (fusion inhibitors), RNA에서 DNA로 바꾸는 역전사효소 억제제 (reverse transcriptase inhibitors), 프로테아제에 의해서 단백질이 절단되는 과정을 차단하는 약물인 프로테아제 억제제 (protease inhibitors)로 구성되어 있다.
항HIV 치료의 목표는 HIV를 강력하게 억제하여 증식하지 못하는 상태로 만들고 이러한 상태를 가능하면 오랜 기간 동안 유지함으로써 환자의 면역능을 회복시켜서 HIV 감염증으로 발생하는 이환율과 사망률을 줄이는 것이다. 그러나, 항HIV 치료를 중단하면 HIV가 다시 나타나고 면역능도 다시 떨어지기 때문에 한번 치료를 시작하면 도중에 중단할 수 없다는 것이 현재 사용되고 있는 항HIV 치료의 한계이다. 항HIV 치료를 적어도 수 년 간, 만일 완치법이 개발되지 않으면 수 십 년간 계속해야 할지도 모른다는 문제점은 환자에게 경제적인 부담은 물론이고 약물을 장기간 투여하는데 따르는 부작용을 감수해야 함을 의미하는데, 특히 약물 부작용은 현재 알려진 부작용뿐 아니라 사용 기간이 늘어나면서 장차 알려질 부작용이 있을 수 있음을 고려해야 하는 실정이다. 또한, 오랜 기간 약물을 제대로 복용하는 일이 쉽지 않기에 HIV가 약제 내성을 획득하여 치료가 어렵게 된다는 것도 현재 항HIV 약제가 가진 큰 문제라고 할 수 있다. 그러므로 기존 치료제의 여러 가지 단점들을 극복하고 HIV 바이러스 자체에 억제 효과를 가지면서 면역 세포의 활성을 증강시킬 수 있는 새로운 개념의 치료제를 개발할 필요가 있다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은 효과적이면서 동시에 부작용이 없는 항바이러스 및 바이러스성 질병의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 일측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편일 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 바이러스의 복제를 억제하여 대상 바이러스를 억제하는 것을 더 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 바이러스의 복제는 HSP90을 매개로 하는 것을 더 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 바이러스는 HCV, HBV 또는 HIV를 포함하는 것을 더 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일측면에 따르면, 약학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 조성물을 바이러스성 질병에 걸렸거나 바이러스에 의한 병리학적 증상을 보이는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 질병의 예방 및 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일측면에 따르면, 상기 바이러스성 질병의 예방 및 치료방법을 포함하는 바이러스성 질병의 예방 및 치료방법이 기재된 지시서를 포함하는 바이러스성 질병의 예방 및 치료용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 항바이러스용 조성물의 제조에 이용하는 용도가 제공된다.
본 발명의 일측면에 따른 항바이러스용 조성물의 제조 용도에 있어서, 상기 조성물은 바이러스의 RNA 복제를 억제하여 대상 바이러스를 억제하는 것을 더 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 항바이러스용 조성물의 제조 용도에 있어서, 상기 바이러스는 HCV, HBV 또는 HIV를 포함하는 것을 더 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 바이러스성 질병의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 일측면에 따른 바이러스성 질병의 예방 및 치료용 조성물의 제조 용도에 있어서, 상기 조성물은 바이러스의 RNA 복제를 억제하여 대상 바이러스를 억제하는 것을 더 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 바이러스성 질병의 예방 및 치료용 조성물의 제조 용도에 있어서, 상기 바이러스는 HCV, HBV 또는 HIV를 포함하는 것을 더 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 서열번호의 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열과 80%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 펩티드 또는 단편인 펩티드는 항 바이러스 억제 효능을 가져, 바이러스성 질병의 치료 또는 예방법을 제공한다.
도 1은 JFH-1 세포주에서, 비히클 (vehicle), 기존의 항산화제들(NAC (20 mM), PDTC (100 μM), 비타민 E (10 μM))과 농도를 달리한 PEP1과 함께 각각 2 시간 동안 배양하고, ROS의 생성 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 JFH-1 세포주를 비히클, PEP1, NAC (20 mM), PDTC (100 μM) 및 비타민 E (10 μM)로 2 시간 동안 처리한 후, HSP90, p-p-38, p38, p-JNK, JNK, p-ERK, ERK, 및 GAPDH에 특이적인 항체로 면역 블롯 분석을 한 사진이다.
도 3은 JFH-1 세포주에 대조항체 (isotype), 항HSP70 항체, 항HSP90 항체를 처리한 것에 PEP1을 투여하였을 때 대조군 (DMSO, vehicle)을 처리한 것과 대비하여 ROS 생성 비율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 JFH-1 세포주에 대조항체 (isotype), 항HSP70 항체, 항HSP90 항체를 처리한 것에 항산화제인 PDTC를 투여하였을 때 대조군 (DMSO, vehicle)을 처리한 것과 대비하여 ROS 생성 비율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 JFH-1 세포주에 대조군 (DMSO, vehicle), HSP70 억제제인 KNK (10 μM), HSP90 억제제인 17AAG (1 μM)를 처리한 것에 PEP1를 투여하였을 때 대조군 (PBS)과 대비하여 ROS 생성 비율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 JFH-1 세포주에 대조군 (DMSO, vehicle), HSP70 억제제인 KNK (10 μM), HSP90 억제제인 17AAG (1 μM)를 처리한 것에 항산화제인 PDTC를 투여하였을 때 대조군 (PBS)과 대비하여 ROS 생성 비율을 나타낸 그래프이다.
도 7는 JFH-1 세포주를 PEP1 및 DMSO와 함께 배양하거나, PDTC 농도를 증가시켜 2 시간 동안 배양한 후, ROS의 생성 비율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 Huh7.5 세포주에서, ROS의 일종인 과산화수소를 처리하였을 때, HSP90의 발현 농도 (ng/ml)를 대조군 (PBS) 처리시와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 JFH-1 세포주에서, 항산화제 PDTC를 처리하였을 때, HSP90의 발현 농도 (ng/ml)를 ELISA를 사용하여 대조군 (PBS) 처리시와 비교하여 나타낸 그래프이다(에러 바는 평균의 표준 에러 (SEM)을 나타낸다. 비히클 대조구와 비교하여, *P < 0.05이고, **P < 0.01이다. P 값은 독립표본 양측 검정 t-시험에 기초하여 얻었고 결과는 2번 내지 5번의 독립적 실험의 대표값이다).
도 10은 JFH-1 세포주에서, FITC(fluorescein isothiocyanate)-컨쥬게이트된 PEP1 (FITC-PEP1)과 함께 2 시간 동안, MbCD (5 mM)를 배양 후, 세포를 유세포 분석기를 통하여 분석하여 측정한 그래프이고, 결과는 3번의 독립적 실험의 대표값이다.
도 11은 JFH-1 세포주에서, FITC-컨쥬게이트된 PEP1 (FITC-PEP1)과 함께 2 시간 동안, 항LRP1 항체와 배양 후, 세포를 유세포 분석기를 통하여 분석하여 측정한 그래프이고, 결과는 3번의 독립적 실험의 대표값이다.
도 12는 JFH-1 세포주에서, FITC-컨쥬게이트된 PEP1 (FITC-PEP1)과 함께 2 시간 동안, LRP1 siRNA(200 nM)과 배양 후, 세포를 유세포 분석기를 통하여 분석하여 측정한 그래프이고, 결과는 3번의 독립적 실험의 대표값이다.
도 13은 JFH-1 세포주에서, FITC-컨쥬게이트된 PEP1 (FITC-PEP1)과 함께 2 시간 동안, PDTC와 배양 후, 세포를 유세포 분석기를 통하여 분석하여 측정한 그래프이고, 결과는 3번의 독립적 실험의 대표값이다.
도 14는 JFH-1 세포주에서, FITC-컨쥬게이트된 PEP1 (FITC-PEP1)과 함께 2 시간 동안, H2O2와 배양 후, 세포를 유세포 분석기를 통하여 분석하여 측정한 그래프이고, 결과는 3번의 독립적 실험의 대표값이다.
도 15는 JFH-1 세포주를 PEP1 (10 μM), PDTC (100 μM) 또는 PBS에서 2 시간 동안 처리하기 전에, 스크램블 siRNA 또는 LRP1 siRNA로 트랜스펙션하고, DCF-DA 방법을 사용하여 ROS 생성을 측정한 그래프이다(에러 바는 SEM을 나타낸다. 스크램블드 대조구와 비교하여, **P < 0.01이다. P 값은 독립표본 양측 검정 t-시험에 기초하여 얻었고 결과는 3번의 독립적 실험의 대표값이다).
도 16은 JFH-1 세포주를 PEP1, NAC (20 mM), PDTC (100 μM) 및 비타민 E (10 μM)로 48 시간 동안 배양하였을 때, HCV의 NS2의 전사량을 정량적 PCR로 측정하여, 시험관내 (in vitro)에서 PEP1의 항HCV 활성을 측정한 결과이다.
도 17은 JFH-1 세포주를 PEP1 (10 μM)이 존재하는 상황에서 항HSP70 항체, 항HSP90 항체, 또는 대조 (isotype) 항체와 함께 2 시간 동안 배양한 후, NS2의 전사량을 측정한 결과이다.
도 18은 JFH-1 세포주를 스크램블 siRNA 또는 LRP1 siRNA로 18 시간 동안 트랜스펙션시킨 후, PEP1 (10 μM) 또는 PBS로 2 시간 동안 처리한 결과이다(에러 바는 평균의 SEM을 나타낸다. 비히클 또는 PBS 대조구와 비교하여, *P < 0.05이고, **P < 0.01이고, ***P < 0.001 이다. P 값은 독립표본 양측 검정 t-시험에 기초하여 얻었고, 결과는 3번 또는 4번의 독립적 실험의 대표값이다).
도 19는 JFH-1 세포주에서 PEP1이 HCV RNA의 복제에 관여하는 FKBP8과 이에 결합하는 HSP90의 상호작용을 억제한다는 것을 나타낸 것이다(결과는 2번의 독립적 실험의 대표값이다).
도 20은 만성 HCV 감염 환자의 간 조직에서 HSP90 (적색)의 면역형광 염색으로서, 핵은 DAPI (청색)으로 대조염색 (counterstain)하였고, 자가면역 간염 (AIH) 환자 또는 B형 간염 환자로부터 얻은 간 조직을 대조구로 사용한 것이다.
도 21은 JFH-1 세포를 PEP1 (10 μM) 또는 PBS로 2 시간 동안 배양하고, HSP90으로 염색한 것이며, 결과는 2번의 독립적 실험의 대표값이다.
도 22는 PEP1의 세포 생존성에 대한 영향을 나타낸 것으로, MT-4, IG5 및 ACH-2 세포에 PEP1 농도를 증가시켜 5일간 처리하고 MTT 어세이를 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 HIV-1 바이러스 생산에 대한 PEP1의 영향을 나타낸 것으로, HIV-1에 감염된 MT-4 세포들을, 증가되는 농도별 PEP1로 처리한 결과를 나타낸 것이다(상층액에서 바이러스성 입자 (viral particle)의 양은 p24 ELISA로 측정하였다).
도 24는 eGFP의 발현에 대한 PEP1의 영향을 나타낸 것으로(eGFP는 HIV-1 Nef와 같이 발현함), HIV-4로 감염된 MT-4세포들을, 증가되는 농도별 PEP1로 처리하고, eGFP의 발현은 형광 현미경으로 모니터한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 HIV-1 바이러스성 입자 생산의 억제를 나타낸 것으로, HIV-1로 감염된 MT-4 세포들을, 농도를 단계별로 증가시킨 AZT 또는 PEP1로 처리하여 상층액의 바이러스성 유전물질 (viral genomes)의 레벨을 RT-qPCR을 이용하여 측정한 것이다.
도 26은 PEP1의 HIV-1 감염-관련 세포 사멸로부터 세포의 보호 효과를 나타낸 것으로, MT-4 세포들 (1x104개)은 HIV-1 바이러스 (4x105 CCID50)로 감염된 것이고, AZT로 5일간 처리되었으며, 세포 활성 (viability)은 p24 ELISA로 측정한 것이다. (데이터는 평균 (means) ± SD (표준편차)로 대표 표기되었다).
도 27은 PEP1의 HIV-1 감염-관련 세포 사멸로부터 세포의 보호 효과를 나타낸 것으로, MT-4 세포들 (1x104개)은 HIV-1 바이러스 (4x105 CCID50)로 감염된 것이고, PEP1으로 5일간 처리되었으며, 세포 활성 (viability)은 p24 ELISA로 측정한 것이다(데이터는 평균 (means) ± SD (평균에러)로 대표 표기되었다).
도 28은 추가 시간 (Time-of-addition) 어세이로서, PEP1을 포함한 지명된 항-HIV-1 약물들을 HIV-1에 감염된 MT-4세포들에 감염후 각기 다른 시간대 (time point) 별로 처리한 것으로, HIV-1 복제는 HIV-1 감염 5일 후 p24 ELISA 로 평가한 것을 나타낸다.
도 29는 추가 시간 (Time-of-addition) 어세이에서 얻은 대표적인 eGFP 이미지를 나타낸다.
도 30는 PEP1의 HIV-1 바이러스성 mRNA 합성 억제를 나타낸 것으로, MT-4세포들은 HIV-1에 의해 감염되었고 비히클 또는 항바이러스 약물들은 표시된 시간대에 처리되었으며, 바이러스성 mRNA는 RT-qPCR에 의해 측정된 것이다(데이터는 평균 (means) ± SD (평균에러)로 대표 표기되었다. *은 DMSO대비 p<0.05 인것을, ***은 p<0.001인 것을 나타낸다).
도 31은 AZT 또는 PEP1 처리로 HIV-LTR-루시퍼라제 활성에 대한 HIV-1 감염의 효과를 5배 정도 감소시킨 것을 나타내는 것이다.
도 32는 PEP1에 의한 Tat-의존 HIV-1 전사의 억제를 나타내는 사진이다.
도 33은 PEP1에 의한 HIV-1의 잠복기 이후 재활성화에 대한 억제 효과를 나타내는 것이다.
도 34는 PEP1에 의한 HIV-1의 잠복기 이후 재활성화에 대한 억제 효과를 나타내는 것이다.
도 35는 PEP1이 항-HIV-1활성을 나타낼 때 HSP90의 중요한 역할을 나타내는 것이다.
도 36은 도 35에서 얻은 대표적인 eGFP 이미지를 나타낸 것이다.
도 37은 PEP1이 항-HIV-1활성을 나타낼 때 HSP90의 중요한 역할을 나타내는 것이다.
도 38는 MT-4 세포들을 NF-κB 반딧불 루시퍼라제 및 CMV-프로모터 레닐라 (renilla) 루시퍼라제 리포터 플라스미드로 감염시킨 후, 그 뒤 HIV-1 (1x106 CCID50)으로 감염시킨 뒤, 지명된 화합물들로 24시간 동안 처리한 다음 이중 (dual)-루시퍼라제 어세이를 실시한 결과를 나타낸다(데이터는 평균 (means) ± SD (표준편차)로 대표 표기되었다. ***은 DMSO 대비 p<0.001인 것을 나타낸다).
도 39는 MT-4 세포들을 HIV-1로 감염시키고, DMSO, AZT 또는 PEP1을 도 38에서 언급한대로 처리한 뒤 감염시킨 후 24 시간 뒤에, 핵분획 (nuclear fraction)을 추출한 다음 EMSA 어세이 (electrophoretic mobility shift assay)를 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 40는 NF-κB 및 AP-2 경쟁 올리고머들이 정확성을 확인하기 위하여 사용된 것을 나타낸 것이다.
도 41은 ACH-2 세포들을 TNF-α (30ng/ml) 또는 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) (50 nM)을 사용하여 한 시간 동안 자극하였으며, DMSO, AZT 또는 PEP1을 24 시간 후 처리한 다음, 세포들을 항p65 NF-κB 항체 및 알렉사-형광 594-컨쥬게이트된 2차 항체로 투과시킨 뒤 간략한 DAPI 핵 염색 후 공초첨 현미경으로 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 42는 MT-4 세포들을 NF-κB 반딧불 루시퍼라제 및 CMV-프로모터 레닐라 (renilla) 루시퍼라제 리포터 플라스미드로 감염시킨 뒤, 세포들을 지명된 항체들 (10 ng/ml) 또는 17-AAG (1μM)로 HIV-감염 전에 1시간 동안 처리하고 HIV-감염 후 세포들을 DMSO, AZT 또는 PEP1로 24 시간 처리하였으며, 이중-루시퍼라제 어세이를 실시한 결과를 나타낸 것이다(데이터는 평균 (means) ± SD (평균 에러)로 대표 표기되었다. ***은 DMSO 대비 p<0.001인 것을 나타낸다.
도 43은 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 여러 가지 사람 간암 세포주에서 PEP1 에 의한 HBsAg 합성능을 비교한 것이다.
도 44a는 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 HepG2 세포주에서 PEP1 펩티드에 의한 Virion 형성능을 비교한 것이다.
도 44b는 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 Huh7 세포주에서 PEP1 펩티드에 의한 Virion 형성능을 비교한 것이다.
도 44c는 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 Huh7.5 세포주에서 PEP1 펩티드에 의한 Virion 형성능을 비교한 것이다.
도 45는 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 HepG2 세포주에서 PEP1 펩티드의 농도에 따른 HBsAg 합성능을 비교한 것이다.
도 46은 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 HepG2 세포주에서 PEP1 펩티드의 농도에 따른 virion 합성능을 비교한 것이다.
도 47은 PEP1 펩티드가 HNF4α의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 것이다.
도 48은 PEP1 펩티드가 IL-6 에 미치는 영향을 나타내는 것이다.
도 49는 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1이 HBsAg 합성능과 virion 에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 50은 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드가 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯으로 나타낸 것이다.
도 51a는 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드가 면역 세포(림포사이트 CD8) 분포에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 51b는 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드가 면역 세포(림포사이트 CD4) 분포에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 51c는 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드가 면역 세포(림포사이트 B cell) 분포에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 51d는 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드가 면역 세포(림포사이트 NK1.1) 분포에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 51e는 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드가 면역 세포(myeloid dendritic cells, myeloid DC) 분포에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 51f는 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드가 면역 세포(대식세포) 분포에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 51g는 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드가 면역 세포(호중구) 분포에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 51h는 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드가 면역 세포(단핵구) 분포에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 52a는 PEP1 펩티드가 면역 세포(림포사이트 CD4)와 INFγ 활성화 간에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 52b는 PEP1 펩티드가 면역 세포(림포사이트 CD4)와 INFγ 활성화 간에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 52c는 PEP1 펩티드가 면역 세포(림포사이트 CD8)와 INFγ 활성화 간에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 52d는 PEP1 펩티드가 면역 세포(림포사이트 CD8)와 INFγ 활성화 간에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 52e는 PEP1 펩티드가 면역 세포(NK1.1)와 INFγ 활성화 간에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 52f는 PEP1 펩티드가 면역 세포(NK1.1)와 INFγ 활성화 간에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 52g는 PEP1 펩티드가 면역 세포(NK1.1)와 INFγ 활성화 간에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 53은 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드가 대식세포(macrophage)의 분화에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 54는 전체 HBV 야생주 유전체의 형질 주입 세포에서 HSP90 차단(blocking)에 의한 PEP1 펩티드의 항바이러스 효과를 확인한 것이다.
본 발명은 일측면에 있어서, 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 일측면에 따른 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 일측면에 따른 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
텔로미어 (telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전 물질로서, 해당 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지한다고 알려져 있다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어의 길이는 조금씩 짧아지는데, 일정한 횟수 이상의 세포 분열이 있게 되면 텔로미어는 매우 짧아지고, 그 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 반면 텔로미어를 길게 하면 세포의 수명이 연장된다고 알려져 있으며, 그 예로 암세포에서는 텔로머라제 (telomerase)라는 효소가 과발현되어 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문에, 암세포가 죽지 않고 계속 증식할 수 있다고 알려져 있다. 본 발명자들은 텔로머라제로부터 유래되는 펩티드가 항바이러스 및 바이러스 관련 질병의 예방 및 치료에 효과적임을 확인하고 본 명세서를 완성하게 되었다.
HSP90 단백질은 분자 샤페론 (molecular chaperone)의 하나로 세포 성장, 분화, 생존에 관련된 다양한 단백질들의 안정화 및 활성, 특히 스트레스 환경 하에서 항상성을 담당한다. HSP90은 “세포내 HSP90 (intracellular HSP90)”으로 불리는 iHSP90으로 세포 내에 존재할 뿐만 아니라 “세포외 HSP90 (extracellular HSP90)”으로 불리는 eHSP90으로 세포외에도 존재한다. 흥미롭게도, 배출된 HSP90 및 세포 표면 HSP90이 암 세포에서 관찰되었으며, 이들 세포외 HSP90 (eHSP90) 단백질은 암 성장 및 혈관신생 (angiogenesis)를 촉진한다. 암 세포가 아닌 세포들도 다양한 환경 조건, 예를 들어, 열, 저산소, 굶주림 및 사이토카인 존재 하에서 eHSP90을 생성한다. eHSP90은 iHSP90과는 다른 기능을 하며, 다양한 세포 표면 단백질들과 상호작용하여 세포 시그널링 경로를 조절할 수 있다.
본 발명자들은, HSP90이 암, 경화증 및 바이러스 감염과 같은 다수의 병리학적 증상과 연관되어 있음을 확인하였다. HSP90과 결합할 수 있는 분자에는 암화, 침습성 및 전이와 연관된 다수의 단백질들을 포함하는 것을 확인하였고, 따라서, HSP90은 암 치료제로서 유력한 타켓이 될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 일측면에서 PEP1 펩티드로 알려진 hTERT 유래의 16mer 펩티드 (611-EARPALLTSRLRFIPK-626, 서열번호 1)가 단백질 항상성에 중요한 역할을 하는 HSP90과 상호작용하고, 세포 시그널을 조절함으로써 항바이러스 효과를 나타냄을 확인한 것이다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 항바이러스 효과는 바이러스의 복제 억제, 전사 억제, 재활성화 억제, 항원 발현 억제, 및 비리온(Virion) 형성 억제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 의하여 바이러스를 억제하는 것일 수 있다.
본 발명은 일측면에서 텔로머라제 (telomerase)의 역전사 효소 (reverse transcriptase) 유래의 펩티드 백신을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 일측면에서, 인간 텔로머라제 역전사 효소 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT) 유래의 아미노산 펩티드 백신을 제공한다. 보다 구체적으로는 본 발명은 일측면에서, hTERT 유래의 16개 아미노산 펩티드로 GV1001®로 알려진 펩티드 PEP1을 항 바이러스 백신으로 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 펩티드 (이하 PEP1)는 인간 텔로머라제 유래의 합성 펩티드로 다양한 생물학적 역할을 할 수 있음을 확인하였다.
본 발명자들은 PEP1은 열충격 단백질 (heat shock protein, HSP)와 상호작용하며 세포내 시그널링을 조절한다는 것을 밝혔다. 본 발명의 일측면에서 보여준 바와 같이, HSP90은 세포 내로 PEP1이 투과하는 것을 돕는다는 것을 확인하였고, PEP1이 세포외 HSP와 상호작용하고, 세포의 세포질 내로 투과할 수 있음을 확인하였다. 이러한 연구는 PEP1이 HSP을 통한 상호작용을 통해 세포내 시그널링 경로를 조절할 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명은 다른 측면에서 PEP1의 항산화 효능이 활성산소가 증가한 HCV 감염 세포에서 HCV의 복제를 저해하는 효과가 있음을 밝혔다. 구체적으로 본 발명은 일측면에서, HCV로 감염된 세포에서 활성산소가 증가하며, 증가된 활성산소가 HSP90의 분비능을 증가시키고, HSP90에 결합한 PEP1의 세포 침투능이 향상되어 세포 내에서 HCV 복제 증식을 억제할 수 있음을 밝혔다. 본 발명은 일측면에서 PEP1이 HSP90을 통해 나타내는 다양한 생물학적 활성을 통해, HCV 복제 증식을 억제할 수 있는 신규한 약물을 제공한다.
본 발명은 다른 측면에서 펩티드를 기반으로 하는, 기존의 항레트로바이러스제에 대한 HIV 내성 및 약제 부작용을 극복할 수 있는 새로운 형태의 항 HIV 치료제를 제공한다. 감염된 세포는 세포 사멸 기전의 자극을 받아 스스로 세포사가 일어나는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 PEP1이 HIV 바이러스 자체에 대해 항바이러스 효과를 나타내 HIV 증식을 억제하며, HIV가 감염된 세포주에 대한 세포 사멸을 방지하는 것을 확인하였다. 본 발명은 일측면에서 세포의 상태를 정상적으로 유지시켜 주며 HIV 세포 독성이나 세포 사멸을 최소화하는 것을 확인하였다.
본 발명은 또 다른 측면에서 펩티드를 기반으로 하는, 기존의 바이러스성 B형 간염 약제들의 간독성 및 지속적인 복용시 나타나는 신독성 등의 약제 부작용을 극복할 수 있는 새로운 형태의 항HBV 치료제를 제공한다. 본 발명자들은 PEP1을 통한 STAT3 시그널링 경로의 억제, 직접적 세포 독성, IL-6 생성억제를 통한 항암효능 및 간염억제 효능의 복합작용으로부터, 항바이러스 억제에 의한 신규한 HCC 치료 물질을 제공한다.
본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1의 펩티드, 서열번호 1의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제, 구체적으로 인간 (Homo sapiens) 텔로머라제에서 유래한 펩티드를 포함한다.
본 발명은 다른 측면에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 그 단편인 항바이러스용 펩티드일 수 있다.
본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 펩티드는 표지물질과 컨쥬게이트된 형태로 상기 조성물에 포함될 수 있다. 다른 측면에 따르면, 상기 표지물질은 형광물질 또는 조영물질일 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서 상기 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate)일 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.
본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일측면에서 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서 펩티드는 번역 후 변형 (post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화 (phosphorylation), 당화 (glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화 (acetylation), 미리스토일화 (myristoylation) 및 팔미토일화 (palmitoylation)를 포함), 알킬화 (alkylation), 카르복실화 (carboxylation), 히드록실화 (hydroxylation), 당화반응 (glycation), 비오티닐화 (biotinylation), 유비퀴티닐화 (ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화 (예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화 (예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제 (crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.
본 명세서에 개시된 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열번호 1의 단편들인 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서 뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩 (folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산 (아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산 (글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산 (글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산 (루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산 (글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 다른 예는 다음 표와 같다.
원래 아미노산 예시적인 잔기 치환 바람직한 잔기 치환
Ala (A) val; leu; ile Val
Arg (R) lys; gln; asn Lys
Asn (N) gln; his; asp, lys; arg Gln
Asp (D) glu; asn Glu
Cys (C) ser; ala Ser
Gln (Q) asn; glu Asn
Glu (E) asp; gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) asn; gln; lys; arg Arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucine Leu
Leu (L) norleucine; ile ; val; met; ala; phe Ile
Lys (K) arg; gln; asn Arg
Met (M) leu; phe; ile Leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) tyr; phe Tyr
Tyr (Y) trp; phe ; thr; ser Phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine Leu
펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다. 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 펩티드에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다
펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.
펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
또한 본 발명의 일측면에 따른 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 세포 내 독성이 낮고, 생체 내 안정성이 높다는 장점을 가진다. 본 발명은 일측면에서, 서열번호 1은 텔로머라제 유래 펩티드로서 하기와 같이 16개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.
서열 번호 1에 기재된 펩티드는 아래 표 2과 같다. 아래 표 2의 "이름"은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 본 발명의 일측면에서, 서열 번호 2에 기재된 펩티드는 인간 텔로머라제의 전체 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 다른 일측면에서, 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 "합성 펩티드"를 포함한다. 서열번호 2는 전체 텔로머라제의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
Figure 112017124706697-pct00001
본 발명의 일측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 (comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 항바이러스 및 바이러스 억제 효능을 가지는 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 일측면에 따르면, 상기 조성물은 약학 조성물일 수 있다.
본 발명의 일측면에 의하면, 상기 바이러스는 DNA 바이러스, RNA 바이러스, 이중가닥DNA-역전사효소(double-stranded DNA Reverse Transcriptase, dsDNA-RT) 바이러스, 단일가닥 RNA-역전사효소(single-stranded RNA Reverse Transcriptase, ssRNA-RT) 바이러스, 또는 ssRNA 바이러스일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 바이러스는 플라비바이러스과(Flaviviridae) 레트로바이러스과(Retroviridae), 또는 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae)일 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에 의하면 상기 바이러스는 HCV, HIV, 또는 HBV일 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 항바이러스 및 바이러스 억제 효능을 가지는 약학 조성물은 일측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 (comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 0.01mg/mL 이상, 0.02mg/mL 이상, 0.05mg/mL 이상, 0.07mg/mL 이상, 0.1mg/mL 이상, 0.15mg/mL 이상, 0.2mg/mL 이상, 0.25mg/mL 이상, 0.3mg/mL 이상, 0.5mg/mL 이상, 0.7mg/mL 이상, 1mg/mL 이상, 2mg/mL 이상, 3mg/mL 이상, 5mg/mL 이상, 7mg/mL 이상, 10mg/mL 이상, 20mg/mL 이상, 30mg/mL 이상, 40mg/mL 이상, 50mg/mL 이상, 60mg/mL 이상, 70mg/mL 이상, 80mg/mL 이상, 또는 90mg/mL 이상이거나, 100mg/mL 이하, 90mg/mL 이하, 80mg/mL 이하, 70mg/mL 이하, 60mg/mL 이하, 50mg/mL 이하, 40mg/mL 이하, 30mg/mL 이하, 20mg/mL 이하, 10mg/mL 이하, 7mg/mL 이하, 5mg/mL 이하, 3mg/mL 이하, 2mg/mL 이하, 1mg/mL 이하, 0.7mg/mL 이하, 0.5mg/mL 이하, 0.3mg/mL 이하, 0.25mg/mL 이하, 0.2mg/mL 이하, 0.15mg/mL 이하, 0.1mg/mL 이하, 0.07mg/mL 이하, 0.05mg/mL 이하, 또는 0.02mg/mL 이하의 함량으로 포함할 수 있으나 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 상기 범위 또는 그 이하의 범위로 포함하는 경우 본 발명의 일측면에서 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 상기 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 (comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 0.0001 μM 이상, 0.001μM 이상, 0.002μM 이상, 0.005μM 이상, 0.007μM 이상, 0.01μM 이상, 0.02μM 이상, 0.05μM 이상, 0.07μM 이상, 0.09μM 이상, 0.1μM 이상, 0.2μM 이상, 0.25μM 이상, 0.3μM 이상, 0.35μM 이상, 0.4μM 이상, 0.45μM 이상, 0.5μM 이상, 0.55μM 이상, 0.6μM 이상, 0.65μM 이상, 0.7μM 이상, 0.75μM 이상, 0.8μM 이상, 0.85μM 이상, 0.9μM 이상, 0.95μM 이상, 1μM 이상, 2μM 이상, 3μM 이상, 5μM 이상, 7μM 이상, 10μM 이상, 30μM 이상, 50μM 이상, 또는 90μM 이상이거나, 100μM 이하, 90μM 이하, 50μM 이하, 30μM 이하, 10μM 이하, 9μM 이하, 7μM 이하, 5μM 이하, 3μM 이하, 2μM 이하, 1μM 이하, 0.95μM 이하, 0.9μM 이하, 0.85μM 이하, 0.8μM 이하, 0.75μM 이하, 0.7μM 이하, 0.65μM 이하, 0.6μM 이하, 0.55μM 이하, 0.5μM 이하, 0.45μM 이하, 0.4μM 이하, 0.35μM 이하, 0.3μM 이하, 0.25μM 이하, 0.2μM 이하, 0.1μM 이하, 0.09μM 이하, 0.07μM 이하, 0.05μM 이하, 0.02μM 이하, 0.01μM 이하, 0.007μM 이하, 0.005μM 이하, 0.002μM 이하, 0.001μM 이하, 또는 0.0005μM 이하의 농도로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.001μM 내지 10μM의 농도로 포함할 수 있으나, 농도에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 상기 범위 또는 그 이하의 범위로 포함하는 경우 본 발명의 일측면에서 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.
본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는 (comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 항바이러스 효능 및 바이러스 관련 질병의 예방 및 치료에 효능을 가지는 펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 0.01㎍/kg/일 이상, 0.1㎍/kg/일 이상, 1㎍/kg/일 이상, 0.0016 mg/kg/일 이상, 0.005 mg/kg/일 이상, 0.006 mg/kg/일 이상, 0.0093mg/kg/일 이상, 0.01 mg/kg/일 이상, 0.016 mg/kg/일 이상, 0.05 mg/kg/일 이상, 0.1 mg/kg/일 이상, 0.5 mg/kg/일 이상, 1 mg/kg/일 이상, 5 mg/kg/일 이상, 10 mg/kg/일 이상, 50 mg/kg/일 이상, 100 mg/kg/일 이상, 1 g/kg/일 이상, 5 g/kg/일 이상, 또는 9 g/kg/일 이상이거나, 10g/kg/일 이하, 9 g/kg/일 이하, 5 g/kg/일 이하, 1 g/kg/일 이하, 100 mg/kg/일 이하, 50 mg/kg/일 이하, 10 mg/kg/일 이하, 5 mg/kg/일 이하, 1 mg/kg/일 이하, 0.5 mg/kg/일 이하, 0.1 mg/kg/일 이하, 0.05 mg/kg/일 이하, 0.017mg/kg/일 이하, 0.01 mg/kg/일 이하, 0.0094mg/kg/일 이하, 0.007 mg/kg/일 이하, 0.005 mg/kg/일 이하, 0.0017 mg/kg/일 이하, 1㎍/kg/일 이하, 0.1㎍/kg/일 이하, 또는 0.05㎍/kg/일 이하일 수 있다. 예를 들어 0.01 ㎍/kg/일 내지 10 g/kg/일, 구체적으로는 0.1 ㎍/kg/일 내지 1 g/kg/일, 더 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 0.1 g/kg/일, 보다 더 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 10mg/kg/일, 바람직하게는 1 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 바람직하게는 0.005mg/kg 내지 0.05mg/kg, 가장 바람직하게는 0.01 mg/kg/일이 될 수 있으며, 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 성인(60kg)의 경우, 1일 투여 시 0.1mg 내지 1mg, 바람직하게는 0.4 mg 내지 0.6 mg의 투여, 특히 0.56mg의 투여가 바람직하다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는 (comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 항바이러스 바이러스 관련 질병의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 액제, 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
본 발명은 다른 측면에서, 상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 액제, 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형은 유효성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면에서, 상기 조성물을 바이러스성 질병에 걸렸거나 바이러스에 의한 병리학적 증상을 보이는 개체에 투여하는 것을 포함하는 바이러스성 질병의 개선, 예방 및 치료방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 상기 바이러스성 질병은 후천성면역결핍증, B형 간염, C형 간염, 이로 인한 간경변, 또는 이로 인한 간암일 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면에서, 상기 조성물; 및 바이러스성 질병의 예방 및 치료방법이 기재된 지시서를 포함하는 바이러스성 질병의 예방 및 치료용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 상기 바이러스성 질병의 예방 및 치료방법은 상기 항바이러스용 조성물을 바이러스성 질병에 걸렸거나 바이러스에 의한 병리학적 증상을 보이는 개체에 투여하는 것을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면에서, 상기 조성물의 제조에 이용하기 위한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 그 단편인 펩티드의 용도를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 명세서를 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다 (즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).
수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 그것이 아님이 명시되어 있지 않는, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.
본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명의 일측면을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 일측면의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 일측면에 따른 실시에 필수적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본 발명의 일측면에 따른 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은 일측면에서, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 일측면에서, 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 일측면에 따른 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명의 일측면에 따른 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 펩티드의 합성
서열번호 1의 펩티드 (이하 "PEP1"이라 함)를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S (Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법 (solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Ala-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin
펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호 (protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.
커플링 시약 (Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘 (piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일 (Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H2O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.
아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.
본 실시예에 사용된 펩티드에 대해 고성능 액체 크로마토그래피 결과, 모든 펩티드의 순도는 95% 이상이었다.
펩티드 PEP 1 제조에 관한 구체적인 과정을 설명하면 다음과 같다.
1) 커플링
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin 에 보호된 아미노산 (8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량)을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
2) Fmoc 탈보호
20%의 DMF 중의 피페리딘 (piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격 NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin)을 만들었다.
4) 절단(Cleavage): 합성이 완료된 펩티드 레진에 절단 칵테일 (Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩티드를 레진에서 분리하였다.
5) 얻어진 혼합물에 쿨링 디에틸 에테르를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침강시킨다.
6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 파우더로 제조하였다.
실시예 2 : HCV에 대한 PEP1의 효능 확인
세포주의 배양
본 발명의 일측면에 따른, PEP1의 HCV 항바이러스 효능 실시예에서 사용된 세포주인 Huh7.5 (human hepatocellular carcinoma)는 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하고 JFH-1 세포주는 Dr. Wakita (Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience, Tokyo, Japan)에게서 제공받은 HCV2a JFH-1 클론으로 Huh7.5 세포주에서 구축하였다. 모든 세포주는 10% FBS, 1% 항생제가 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 배양하였다.
시약 및 항체
본 발명의 일측면에 따른 실시예에서 사용된 시약은 NAC (N-acetylcysteine), PDTC (pyrolidine dithiocarbamate), 비타민 E, 과산화수소 (H2O2), MbCD (methyl-β-cyclodextrin), KNK-437 (KNK로서, HSP70의 억제제), 17AAG (17-N-Allylamino-17-demethoxy geldanamycin, HSP90의 억제제)이며, 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 칼바이오켐 (Calbiochem, Temecula, CA, USA)에서 구매하여 사용하였다.
본 발명의 일측면에 따른, 실시예에서 사용된 항체는 HSP70, HSP90, 대조 (isotype control) 항체이며, 산타크루즈 바이오 테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)에서 구매하여 사용하였다. 항LRP1 항체는 서모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA)에서 구매하여 사용하였다.
세포 내 활성산소 (ROS, Reactive Oxygen Species) 측정
JFH-1 세포주를 24웰 플레이트에 5x104 (cells/well)개의 세포를 주입 한 후 다음 날 다양한 실험 물질에 따라 세포 내 활성산소 생성을 측정하였다. 세포내 활성 측정은 DCF-DA (dichlorodihydrofluoresein diacetate, Invitrogen)를 이용하여 염색 후 형광 측정은 Infinte M2000 Tecan (Tecan Trading AG, Switzerland) 를 이용하여 485 nm (emission) / 535 nm (excitation)에서 활성 산소 생성 여부를 측정하였다. 모든 형광 단위는 임의 단위(arbitrary units)으로 표현하며 양성 대조군으로 과산화수소수 (H2O2, 2 mM)를 사용하였다. Huh7.5 세포에 대한 ROS 측정도 동일한 과정을 통하여 측정되었다.
면역 블롯 분석
세포는 단백질분해효소 억제제 칵테일 (proteinase inhibitors cocktail, Roche, Basel, Switzerland)과 인산화효소 억제제 (phosphatase inhibitor, Roche) 가 포함된 세포용해 용액 (lysis solution, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)을 사용하여 단백질을 획득하였다. 세포용해 후 용해되지 않는 잔해를 제거하기 위하여 4°C에서 10 분간 원심 분리 하였다. 50 μg의 단백질을 12% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에서 전기 영동 후 PVDF (polyvinylidene difluoride membrane, Millipore, Bedford, MA, USA) 로 전이하였다. 이동된 멤브레인은 HSP90, p38, p-p38 (Thr180/Tyr182), JNK, p-JNK (Thr183/Tyr185), ERK, p-ERK (Thr202/Tyr204), SOD (superoxide dismutase oxidase)로서 아연-구리 포함 효소 SOD (CuZn-SOD), 망간화-SOD (Mn-SOD), GAPDH (모두 Cell Signaling Technology 및 Santa Cruz Biotechnology 에서 구입) 에 대한 항체를 붙인 후 슈퍼시그날 웨스트 피코 케미루미네슨스 서브스트레이트 (SuperSignal West Pico Chemiluminescence Substrate) (Pierce, Rockford, USA)를 이용하여 형광 발색하여 ImageQuant™ LAS 4000 미니 바이오몰리큘라 이미저 (Mini Biomolecular Imager) (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden)으로 현상하였다. Multi Gauge V 3.0 (Fuji Film, Japan)을 이용하여, β-액틴(β-actin)을 보정값 (normalization)으로 사용하였으며, 농도계 (densitometry)로 정량적 분석을 실시하였다.
면역 침강 (immunoprecipitation)을 위해서, 400μg의 세포 용해물 (cell lysate)은 Protein A/G 플러스-아가로즈 비드 면역침강제 (Santa Cruz Biotechnology)로 2시간 동안 미리 세척 처리되고, 원심분리 후 비드들을 제거하였다. 이 상층액은 4μg의 관련 항체들 및 20μl의 비드들과 세포 용해 완충액과 4℃에서 하룻밤 배양되었다. 면역 침강은 항-HSP90(Cell Signaling Technology) 항체 및 FKBP8 (Thermo Fisher Scientific)의 면역 블로팅 분석을 위해 준비 되었다.
LRP1/CD91siRNA를 이용한 일시적 넉다운 (transient knockdown)
저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 1(LRP1)/CD91 (즉, LRP1)은 표피 및 피부 세포 이동을 촉진하는 단백질로, HSP에 대한 세포 수용체 중의 하나로 확인되었다. LRP1은 gp96, HSP90, HSP70 및 칼렉티쿨린의 수용체로 HSPs에 의해 샤페론되는 펩티드는 수용체에 결합하여 HSPs와 함께 항원 제시 세포로 들어간다. eHSP90과 결합하여 LRP1 복합체는 세포 내 이입 및 시그널링 수용체로서의 역할을 하는 것으로 제시된다. 이는 LRP1이 병리적 또는 스트레스 환경 하에서 eHSP의 역할에 영향을 미친다는 것을 제시한다. 본 발명의 일측면에 따른 펩티드 PEP1의 세포내 진입이 eHSP에 의존하고, eHSP가 그 수용체 LRP1에 의해 수용된다는 것이 알려졌다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩티드 PEP1의 산화적 스트레스 환경에서의 항산화 활성에서 LRP1이 중요하다는 것을 제시하였다. 본 발명의 발명자들은 LRP1이 본 발명의 펩티드의 세포내로 진입 및 JFH-1 세포에서 ROS 생성 억제에 중요하다는 것을 보였다. 이를 확인하기 위해 항체와 LRP1에 대한 siRNA (small interfering RNA)를 이용하여 LRP1의 활성을 억제하였다.
siRNA 표적 LRP1 와 대조용 (scrambled) siRNA 는 바이오니아 (Daejeon, Republic of Korea)에서 구입하였다. 모든 siRNA 는 JFH-1 또는 Huh7.5 세포주에 다양한 농도에 따라 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 주입하였다. 18시간 후, 세포로부터 RNA를 획득 한 후 qRT-PCR (quantitative reverse-transcription-polymerase chain reaction)를 수행하여 RNA 넉다운을 확인하였다.
HCV RNA의 정량적인 측정
HCV RNA 수준은 NS2 유전자에 대한 프라이머를 사용하여 정량적 PCR을 수행하여 측정하였다. 세포 배양액의 상층액에서 HCV RNA의 양을 측정하기 위하여, RNA는 QIAamp Viral RNA Mini 키트 (Qiagen)를 이용하여 세포 배양액 100μl에서 추출하였다. 추출된 RNA는 cDNA 합성에 사용되었으며, Transcript First Strand cDNA 합성 키트 (Roche Applied Science)을 이용하였다. PCR은 1x SYBR Green 믹스 (Qiagen)를 이용하였다. 실시간 PCR은 NS2 정방향 프라이머, 5'-CGACCAGTACCACCATCCTT-3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머, 5'-AGCACCTTACCCAGGCCTAT-3'(서열번호 4)를 Bioneer Co.에서 구입하여 사용하였다. 정량 PCR에는 7900HT Fast real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하였다.
유세포 (Flow cytometric) 분석
FITC(fluorescein isothiocyanate)-컨쥬게이트된 PEP1의 세포 내 침투를 확인하고자 세포주에 다양한 물질을 처리한 것에 FITC-컨쥬게이트된 PEP1을 두 시간 동안 추가로 처리한 후 FACS 분석을 하였다. LRP1의 넉다운을 위하여 세포에 siRNA를 주입하고 18 시간 후 PBS 로 씻어내고 FITC-컨쥬게이트된 PEP1을 두 시간 동안 처리한 후 세포에 붙어있는 펩티드는 Trypsin/EDTA (Invitrogen)를 처리하여 완벽하게 제거하고 FACS 완충용액 (PBS, 0.5% BSA)으로 씻어낸 후 BD FACSFortessa (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)로 분석하였다. 데이터 분석은 FlowJo software (version 9.7.7, TreeStar, Ashland, OR, USA)을 사용하였다.
ELISA를 이용한 HSP90 측정
Huh7.5 과 JFH-1 세포주에 산화유도제인 (H2O2, 2mM)와 항산화제인 PDTC (100 μM) 를 2시간 동안 처리하였다. 배양 상층액의 HSP90 (extra cellular HSP90, eHSP90)은 ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하였으며, 제조사의 지시서에 나온 과정을 따라 수행되었다.
간조직 및 JFH-1 세포의 면역 형광 염색 및 측정
인간의 간 생검 조직은 만성 HCV 또는 HBV를 보유한 환자 및 대조군으로 자가면역성 간염 환자 (AIH)에게서 채취하였으며, 순천향 대학 부천 병원 (2014-12-034)의 IRB (institutional review board) 및 서울대학교 병원 (1410-136-621)의 감독하에 수행되었다. 간세포 및 JFH-1 세포에서 HSP90의 발현을 측정하기 위해서, 간조직 또는 JFH-1 세포들은 항-HSP90 항체 (Cell Signaling Technology) 항체로 염색되었다. 시각화를 위해서 Alexa Fluor 594-컨쥬게이트된 항래빗 IgG (Invitrogen)를 사용하였다. 세포핵에 대한 카운터-염색을 위해 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 공초첨 현미경 시스템 A1 (Nikon, Minatoku, Tokyo, Japan) 및 NIS-Elements 4.20 Viewer (Nikon)를 사용하여 이미지 획득 및 처리를 수행하였다.
통계 분석
모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준에러 (SEM)으로 표현하며 통계적 비교는 GraphPad Prism, version 5.01 (GraphPad, La Jolla, CA, USA), 양측 스튜던트 티 테스트 (Student's t-test)로 수행되며 P 값이 0.05 이하일 때 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
실험 결과 분석
1) PEP1의 HCV RNA 복제 억제 효과
적절한 ROS의 레벨이 HCV, HBV, 및 HIV의 복제를 조절한다는 것은 널리 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 PEP1의 ROS를 억제하는 효과를 보이는 것이 바이러스 복제를 억제하는데에 효과를 보일 수도 있다는 가정을 세우고, JFH-1 세포에서 PEP1이 HCV RNA의 복제 억제 효과를 나타내는지를 알아보기 위한 실험을 하였다.
상기 실험과 분석 방법에서 언급한 방법에 따라, PEP1이 HCV RNA 중 하나인 NS2의 복제를 억제하는지 알아보기 위하여 NS2의 전사량을 측정하였다. JFH-1 세포에서, 대조군 (vehicle), PEP1 투여군, 기존 항산화제 (NAC, PDTC, 비타민 E) 투여군에서 NS2의 전사량을 측정한 결과, 대조군에 비하여 PEP1은 농도 의존적으로 10 μM 까지 NS2의 전사를 억제하는 것으로 나타났다. 대조적으로 기존 항산화제 NAC, PDTC, 비타민 E는 NS2의 전사를 전혀 억제하지 않는 것으로 나타났다 (도 16).
PEP1이 HSP90 의존적으로 ROS 활성 감소 효과를 보인 것을 근거로, HCV RNA의 복제 억제 효과도 HSP90과 관련이 있는지를 알아보기 위한 실험을 하였다. JFH-1 세포에서, 대조 항체군 (isotype), 항HSP70 처리군, 항HSP90 처리군으로 나누어 대조군 (PBS)과 비교시 PEP1의 NS2 전사량 억제 정도를 측정하였다. PEP1에 의한 HCV RNA 증식은 항HSP90 항체 처리시 증식이 억제 되지 않았다. 그러나, 항HSP70 항체 및 대조 항체군의 경우, 항체와 상관없이 PEP1에 의해 HCV RNA 증식이 억제되었다 (도 17). 추가로 HSP90의 수용체인 LRP1의 억제 유무에 따른 PEP1의 NS2 전사량 억제 정도를 측정하였다. LRP1 siRNA를 처리하여 LRP1이 발현이 넉다운되면, JFH-1 세포에서 HCV RNA 복제가 PEP1에 의해 감소되지 않았다 (도 18).
HSP90은 HCV RNA 복제를 위해 NS5A 및 FKBP8의 결합체 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이에 PEP1에 의한 HCV RNA 복제 억제가 복제 복합체 형성을 방해한 결과인지를 조사하였다. JFH-1 세포에 PEP1을 처리하여 HSP90과 FKBP8의 결합을 관찰하였다. 구체적으로, JFH-1 세포를 PEP1 (10 μM)으로 48 시간 동안 배양하였다. 이후 단백질을 항FKBP8 항체 또는 항HSP90 항체로 면역 침강 (immunoprecipitation)법을 실시하였다. HSP90 및 FKBP8의 내재적 (endogenous) 발현을 처리하지 않은 JFH-1 세포에서 측정하였다.
그 결과, 대조군에 비해 PEP1을 처리하였을 때, FKBP8에 의한 HSP90의 공동 침전을 감소시켰다 (도 19). JFH-1 세포에서, 세포 용해물, 대조군 (PBS), PEP1 처리군을 나누어 각각 항HSP90 및 항FKBP8 면역 침강 반응 후 항HSP90 및 항FKBP8 항체로 면역 블롯을 실시한 결과, 항HSP90 면역 침강 반응에서는 PEP1 처리군에서 FKBP8의 발현이 감소하였고, 항FKBP8 면역 침강 반응에서는 PEP1 처리군에서 HSP90의 발현이 감소한 것을 각각의 항체를 통한 면역 블롯으로 검출하였다 (도 19). 이러한 결과는 PEP1이 HCV RCV 복제 복합체 형성을 직접적으로 억제하며, PEP1이 FKBP8와 상호작용하는데 작용하는 HSP90의 주요 부위에 결합해서 작용한다는 것을 제시한다.
상기 실험 결과를 통하여, PEP1은 HSP90과 결합하는 특성을 가지므로 HSP90의 FKBP8에 대한 활성을 감소시키는 기전을 통하여 HCV RNA의 복제를 억제하는 효과를 가지는 것을 알 수 있다. 이는 PEP1이 HCV의 복제를 억제하고 항바이러스 효능을 나타낸다는 것으로도 말할 수 있다.
2) PEP1의 ROS 생성 억제
PEP1의 바이러스 감염 세포내에서 ROS 생성을 억제하는 효능을 알아보기 위하여, HCV 감염 세포주인 JFH-1 세포에 PEP1을 투여하였을 때, ROS의 생성이 억제되는지를 비교 실험하였다. JFH-1 세포주는 Huh7.5 세포를 HCV2a JFH-1 클론으로 감염시켜 생성된 것이다. HCV 비리온 합성으로 인해 JFH-1 세포주에서는 세포내 활성 산소량이 Huh7.5 세포주 (JFH-1의 모세포주)에서 보다 높게 조절되고 있다. 본 발명자들은 PEP1이 JFH-1 세포에서 ROS의 생성은 10μM까지 투여량 의존적인 방식으로 상당히 저해시킨다는 사실을 확인하였다. 1 및 10μM에서, PEP1의 항산화 활성 효과는 NAC, PDTC 및 비타민 E에 필적하였다 (도 1).
상기 실험과 분석 방법에서 언급한 방법에 따라, JFH-1 세포 및 Huh7.5 세포에서 ROS를 측정하였다. PEP1을 다양한 농도로 2 시간 동안 처리한 후, DCF-DA로 30분간 염색 후 형광을 측정하였다. 대조군으로 사람 간세포암 세포주 Huh7.5 와 JFH-1 세포주에 대표적인 항산화제로 알려진 NAC (2 Mm), PDTC (100μM), 비타민 E (10μM)을 처리하여 비교하였다. PEP1을 투여하지 않은 경우 JFH-1 세포주에서 세포내 활성 산소량이 Huh7.5 세포주보다 약 두 배 이상 증가되어 있다 (도 1). 이에 PEP1을 처리하였을 때 농도 의존적으로 활성 산소량이 감소한다. JFH-1 세포에서 PEP1을 농도별 (0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 μM)로 투여한 실험군 및 기존의 항산화제 (NAC, PDTC, 비타민 E)를 투여한 실험군과 대조군 (vehicle 투여)을 비교한 결과 PEP1은 농도 의존적으로 ROS 생성을 감소시켰으며, 기존의 항산화제들도 ROS 생성감소를 보였다 (도 1).
ROS는 MAPK 시그널링 경로의 활성을 유도할 수 있다고 알려져 있기 때문에, PEP1이 MAPK 시그널링 경로에 관련된 인자 (p38, JNK, ERK)들을 감소시키는지를 알아보는 실험을 수행하였다 (도 2). 상기 실험과 분석 방법에서 언급한 방법에 따라, JFH-1 세포 및 Huh7.5 세포에서 면역 블롯을 실시하였다. p38 및 JNK의 인산화는 PEP1 처리 후 JFH-1 세포에서 감소하였고, 이는 항산화제인 NAC, PDTC 및 비타민 E를 처리한 결과와 유사하다. 반면, ERK의 활성은 PEP1 및 비타민 E 처리 둘 다에 의해 증가하였다 (도 2).
아울러, JFH-1 세포 및 Huh7.5 세포에서 각 대조군 및 실험군들 모두 HSP90의 발현을 측정한 결과 모두 강하게 발현 하는 것으로 나타났다 (도 2).
상기 실험 결과를 통하여, PEP1을 투여하는 것으로 세포 내 ROS의 생성 감소 효과를 볼 수 있으며, 이는 JFH-1 세포 내에서 특이적 시그널링, 즉, 감소된 MAPK 시그널링을 통해 일어난다는 것을 알 수 있다.
도 1 내지 9는 PEP1이 JFH-1 세포에서의 활성 산소종 (ROS) 생성을 HSP90을 통해 억제한다는 것을 보여준다.
3) PEP1의 항산화 효과에서 eHSP90의 역할
본 발명자들은 HSP90이 PEP1의 항산화 효과의 매개일 것으로 가정하였다. 본 발명에서는 PEP1의 항산화 효과가 HSP90에 의한 것인지를 알아보기 위하여, HSP90의 활성 유무에 따른 PEP1의 ROS 생성 정도를 측정하는 실험을 하였다. 본 발명자들은 HSP90과의 상호작용을 두 가지 방법으로 억제하였다: HSP70에 대한 항체 및 HSP90에 대한 항체를 사용 또는 촉매 위치 (HSP90의 N-말단 중의 ATP-결합 포켓)를 차지하는 억제제 사용하였다. 상기 실험과 분석 방법에서 언급한 방법에 따라, JFH-1 세포에서 PEP1 투여군, 항산화제 PDTC 투여군과 대조군 (PBS)의 ROS 생성을 측정하여 비교하였다.
그 결과, 본 발명에서는 PEP1이 항HSP70 항체 존재 하에서는 JFH-1 세포 중에서 ROS 수준을 억제하지만, 항HSP90 항체 존재 하에서는 억제 효과가 관찰되지 않는다는 것을 보였다 (도 3). 대조군 항체 (isotype)에서는 PEP1에 의한 억제가 관찰되었다 (도 3). 또한, HSP90의 억제제인 17AAG는 JFH-1 세포에 처리하였을 때 활성산소 억제 효과를 보였으나, HSP70 억제제인 KNK에 의한 활성 산소의 변화는 관찰되지 않았다 (도 5). 대조 약물 PDTC는 HSP70 및 HSP90을 특정 항체로 블락하는 것과 무관하게 ROS의 생성을 억제하여, 모든 처리 조건에서 ROS 생성을 억제하였다 (도 4). 또한 PDTC는 KNK 및 17AAG 존재 하에서 모두 ROS 생성을 억제하였다 (도 6). 이는 PEP1이 상이한 기작을 통해서 ROS 생성을 저해한다는 것을 제시한다. 이러한 데이타는 eHSP90이 PEP1의 항산화 활성에서 중요한 매개체이며, PEP1이 HSP90에서 ROS 유도에 필수적인 촉매 위치에 작용한다는 것을 나타낸다.
17AAG를 처리했을 때 PEP1의 항산화활성 효과가 저하된다는 결과로부터, 본 발명자들은 PEP1이 세포 내 활성산소 농도가 너무 낮거나 활성산소가 정상범위에 있을 때에는 활성산소를 억제하지 않을 가능성을 조사하였다. 이는 항산화물질이 이미 존재하는 상황에서는 PEP1이 JFH-1 세포 중에서도 ROS의 생성을 억제하지 못할 가능성을 제시한다. 본 발명자들은 이러한 가설을 조사하기 위해서, 항산화제인 PDTC의 농도를 증가시키면서 세포를 처리하였다. 그 결과 PEP1의 항산화 활성이 점진적으로 감소한다는 것을 확인하였다 (도 7). 이는 JFH-1 세포에서 PDTC 처리를 통해 ROS 수준이 떨어졌기 때문일 것이며, 감소되거나 정상 수준의 ROS를 갖는 세포와 비교하여 산화적 스트레스 환경 하에 있는 세포에서는 PEP1이 항산화제로 선택적으로 작용한다는 것을 제시한다. PEP1의 이러한 특성은 산화적 수준에 맞춘 치료 약물의 개발에 기여할 것이다.
아울러, 본 발명에서는 활성산소에 의한 스트레스 상태에서 PEP1의 특이적 항산화 기능을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 기존 항산화제의 투여가 HSP90의 발현을 감소시키고, 이에 따라 PEP1이 기존 항산화제와 같이 투여될 때 항산화 효능이 감소하는지 여부를 확인하기 위한 실험을 하였다. PEP1의 항산화 활성은 eHSP90 의존적이므로, 본 발명의 실시예에서는 세포로부터 eHSP의 분비를 측정하였다. Huh7.5 세포에서 H2O2에 의한 자극은 대조구보다 훨씬 높은 수준으로 eHSP90 분비를 증가시켰다 (도 8). 반면, JFH-1 세포에 항산화 물질인 PDTC를 처리했을 때에는 대조구보다 낮은 수준의 eHSP90을 생성하였다 (도 9). 이러한 결과는 산화적 스트레스가 HSP90의 분비를 일으킨다는 점을 제시한다. 또한, PEP1이 산화적 스트레스 상태에 있는 세포에서 ROS 생성을 선택적으로 억제한다는 것을 제시한다.
도 1 내지 9는 PEP1이 JFH-1 세포에서의 활성 산소종 (ROS) 생성을 HSP90을 통해 억제한다는 것을 보여준다.
도 10 내지 15는 세포외 HSP90 및 LRP1이 PEP1에 의한 ROS 생성에 필수적이라는 것을 보여준다.
4) PEP1에 의한 항산화 효과에서 LRP1의 역할
PEP1이 eHSP90에 결합하여 세포내로 유입되는 사실이 알려져 있으며, eHSP90가 세포 수용체인 LRP1에 수용된다는 것이 알려져 있다. LRP1은 gp96, HSP90, HSP70 및 칼레티쿨린의 공통적인 수용체이며, HSP에 의해 샤페론되는 펩티드들은 이들 수용체여 결합하여 HSP와 함께 항원 제시 세포로 들어간다. LRP1 복합체는 eHSP와 커플링되어 내포 및 시클링 수용체로 작용하고, LRP1이 병리적 또는 스트레스 상태에서 eHSP90의 작용에 영향을 준다는 것을 제시한다. 아울러, HSP90은 FK506-결합 단백질 패밀리 중 하나인 FKBP8와 C형 간염 비구조 단백질 (non-structural protein) 5A (NS5A) 함께 HCV RNA 복제 컴플렉스를 형성한다. 이러한 사실은 HSP90이 그 발현 또는 활성을 통해서 HCV RNA 복제를 조절할 수 있다는 사실을 제시한다. HSP90은 NOX 활성을 조절하여, 슈퍼 옥사이드 형성을 유도한다. 본 발명자들은 PEP1은 HSP90의 주요 위치에 결합하여 HSP90의 활성을 억제하는 방식을 통해, 선택적인 항산화 작용을 달성하고, 산화적 스트레스 상태에 있는 세포에서 다양한 생물학적 영향을 끼친다는 것을 밝혔다.
본 발명자들은 산화적 스트레스 상태에서 LRP1이 PEP1의 항산화 효과에 중요한 역할을 할 것이라 가정하였다. 본 발명자들은 LRP1이 부재할 때에는 PEP1이 세포 내로 유입되지 않고, JFH-1 세포에서 ROS 생성을 억제할 수 없을 것이라 가정하였다.
이러한 가정을 확인하기 위해서, 상기 실험과 분석 방법에서 언급한 방법에 따라, PEP1이 HSP90의 세포 수용체인 LRP1의 유무에 따라 세포 내로 유입되는 정도를 확인하였다. 구체적으로 LRP1에 대한 항체와 siRNA를 사용하여 LRP1 활성을 억제하고, FITC-컨쥬게이트된 PEP1을 사용하여 유세포 분석을 실시하였다.
도 10 내지 15는 세포외 HSP90 및 LRP1이 PEP1에 의한 ROS 생성에 필수적이라는 것을 보여준다.
먼저, 클라트린- 카베올린-, 그리고 클라트린/카베올레 독립적인 내포 (endocyto) 경로를 억제하는 리피드 래프트 (lipid raft) 형성 억제제인 MbCD로 사전 처리하였을 때, PEP1이 JFH-1 세포에 들어가지 못한다는 것을 확인하였다. 이전에 보고된 바와 같이, MbCD는 JFH-1 세포 중으로 FITC-PEP1이 들어가는 것을 억제하였으며, 이는 PBS 대조구와 비교하여 감소된 형광 강도로 입증된다. FITC-PEP1의 세포내 유입은 대조구와 비교해서, 항-LRP1 항체 뿐만 아니라 LRP1에 대한 siRNA (즉, LRP siRNA)에 의해서도 억제되었다 (도 11 및 12). 이는 LRP1이 PEP1의 eHSP90 의존적 전달에서 중요한 수용체라는 점을 제시한다.
또한, 산화적 스트레스가 PEP1의 침투능에 영향을 미치는지 확인하기 위해서, JFH-1 세포에 PDTC를 첨가하고, Huh7.5 세포에 H2O2 를 첨가하여, 다양한 산화적 수준을 생성하였다. 이들 처리 조건은 ROS 수준에 따라 eHSP 분비에 상이한 영향을 가져온다 (도 8 및 9). 본 발명자들이 가정한 바와 일치하게 PDTC 존재 하에서 JFH-1 세포 중으로 PEP1의 침투는 감소하였고, H2O2 존재 하에서 Huh7.5 세포에서 PEP1의 침투는 증가하였다 (도 13 내지 14). 이는 PEP1의 세포내 유입과 생물학적 활성이 세포내 ROS 수준에 의존하며, 그에 따라 eHSP 수준에 의존한다는 것을 나타낸다.
다음으로 JFH-1 세포에서 LRP1을 넉다운시키고 ROS 수준을 측정하여 상기 가설을 추가로 확인하였다. JFH-1 세포 중 PEP1의 항산화 활성은 LRP1 siRNA 존재 하에서 관찰되지 않았다 (도 15).
상기 실험 결과를 통하여, PEP1의 항산화 기작은 PDTC와 상이하며, PEP1은 HSP90의 수용체인 LRP1의 발현 유무에 따라 세포내 유입 정도가 달라지며, LRP1의 발현이 감소 또는 억제될 경우 세포내 유입이 감소하는 것을 알 수 있으며, 이는 PEP1이 HSP90에 의존적으로 세포 내로 유입되는 것을 확인하여 주는 것이라 할 수 있다.
5) HCV로 감염된 간조직에서 HSP90의 발현
세포가 아닌 장기 또는 조직에 HCV가 감염되었을 경우 HBV 또는 AIH (autoimmune hepatitis, 자가면역성 간염)에 감염된 경우와 달리 HSP90의 발현이 증가한다는 것을 확인하기 위한 조직 해부학적 실험을 하였다.
상기 실험 및 분석 방법에서 언급한 방법에 따라, HCV, HBV 및 AIH에 감염된 간조직에서 HSP90의 발현정도를 비교하였다. 그 결과 HBV 및 AIH의 경우에 비교하여 HCV에 감염된 경우에서 HSP90이 발현이 증가되었다 (회색 부분, 도 20). 흥미롭게도, PEP1은 JFH-1 세포 중에서 세포 내 HSP90을 감소시켰으며, 이는 아마도 감소된 ROS 수준에 따른 부수적인 결과인 것으로 생각된다 (도 9). 또한, HCV에 감염된 간 조직에서 대조군 (PBS) 과 PEP1 처리군을 비교하였을 때 HSP90이 PEP1 처리시 대조군에 비하여 낮게 발현된 것이 나타났다 (회색 부분, 도 21).
도 20 및 21은 HCV 감염된 간세포에서 HSP90이 다량 존재한다는 것을 보여준다.
상기 실험결과는 HCV 감염으로 인해 세포 내부에서 정상 세포보다 높은 수준의 활성산소가 유도되고, 축적된 활성산소로 인해 스트레스를 받은 세포에서 상대적으로 HSP90이 과발현되므로, PEP1이 산화적 스트레스 상태에 있는 HCV 감염된 세포의 치료제로서 역할을 할 것을 제시한다.
실시예 3 : HIV에 대한 PEP1의 효능 확인
바이러스 감염 시, 왕성한 바이러스 단백질 생성 또한 HSP 기능을 필요로 함을 확인하였고, HSP90 저해제에 의해 억제되는 바이러스 리스트가 계속 늘어나고 있음을 확인하였다. 인간 면역 결핍 바이러스-1(human immunodeficiency virus-1, HIV-1) 감염 또한 단핵구 세포에서 증가된 HSP90 발현을 나타낸다는 것을 알아냈다. HSP90은 바이러스의 라이프 사이클의 여러 단계에서 작용하여 HIV 복제에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났고, 급성으로 감염된 세포에서 HIV 바이러스 전사 및 복제에서 HSP90의 역할은 HSP90 저해제에 의해 억제되는 것으로 나타났다. 아울러, HSP90은 NF-κB 시그널링을 조절함으로써 잠복성 상태로부터 HIV 재활성을 조절하는 것을 확인하였다.
세포주의 배양
본 발명의 PEP1의 HIV 항바이러스 효능 실시예에서 사용된 세포주는 인간 T 세포 백혈병 세포주 MT-4, HIV-1에 잠복 감염된 ACH-2 세포주, Jurkat로부터 유래하였으며, 안정적으로 삽입된 HIV-LTR-루시퍼라제 (luciferase) 구조체를 포함하는 1G5 세포주였으며, 이들 세포주들을 NIH/AIDS 리서치 및 레퍼런스 시약 프로그램 (NIH, Bethesda, MD)로부터 얻었다. 293FT 세포는 라이프 테크놀로지 (Carlsbad, CA)로부터 구입하였다. MT-4 및 1G5 세포주는 글루타민 (2 mM), 10% 소태아혈청 (FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 중에서 유지하였다. ACH-2 세포는 2 mM 글루타민, 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신 및 5 mM HEPES가 보충된 RPMI 1640 중에서 배양하였다. 293FT 세포주는 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신, 6 mM L-글루타민, 1 mM 소디움 피루베이트 및 0.1 mM 비필수 아미노산을 함유한 Dulbecco 변형 Eagle 배지 (DMEM) 중에서 배양하였다.
시약 및 항체
항레트로 바이러스 약물로 T-20, 랄테그래비르 (Raltegravir), 플라보피리돌 (Flavopiridol) 및 리토나비르 (Ritonavir)를 내셔날 인스티튜트 오프 헬쓰 (NIH, Bethesda, MD, USA), AIDS 부서, NIH/AIDS 리서치 및 레퍼런스 시약 프로그램 (NIH, Bethesda, MD, USA)로부터 얻었으며, 지시된 대로 D-PBS, DMSO 또는 증류수에 용해시켰다. 아지도티미딘 (3-아지도-3-디옥시티미딘, AZT)는 시그마 알드리치 (St.Louis, MO)로부터 구입하였다. HSP90 (#4877S), 포스포-NF-κB (p65, #3033S), IκB (#4814S) 및 포스포-IκB (#2859S)를 셀 시그널링 (Cell Singaling, Danvers, MA)으로부터 얻었으며, 항p24 항체 (ab9071)을 앱캡 (Abcam, Cambridge, MA)으로부터 구입하였다. HSP70에 대한 항체 (sc32239), GFP에 대한 항체 (sc81045), GAPDH에 대한 항체 (sc25778) 및 NF-κB에 대한 항체 (p65, sc372)를 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz, Dallas, Texas)로부터 구입하였다.
플라스미드 및 바이러스
단일 바이시스트로닉 RNA (Cat No. 11371, Dr. Daniel Sauter 및 Dr. Frank Kirchhoff로부터 제공받음)으로부터 Nef와 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 를 함께 발현하는 pBR43IeG-rcmGB1nef 프로바이러스 HIV-1 플라스미드 및 Tat 단백질 (잔기 1-72)을 생산하는 pSV2tat72 플라스미드 (Cat. No. 294, Dr. Alan Frankei로부터 제공받음)을 내셔날 인스티튜트 오프 헬쓰, AIDS 부서, NIH/AIDS 리서치 및 레퍼런스 시약 프로그램 (NIH, Bethesda, MD)로부터 얻었다. HIV-1을 생산하기 위해, 리포펙타민 2000 시약 (Life Technologies)을 제조자 지시에 따라 사용하여 293FT 세포를 pBR_HIV-1_M_NL4-3_IRES_eGFP 벡터로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 48 시간 후, 바이러스를 함유한 배지를 수집하고, 짧게 원심분리 및 필터링 (0.45 μm) 하였다. 바이러스 역가를 p24 ELISA (ABL, city, MD)를 사용하여 측정하였다. 감염성 HIV-1의 증식을 위해서, MT-4 세포를 생성된 HIV-1 (MOI=0.5)를 사용하여 48 시간 동안 감염시켰다. 짧게 원심분리 (1,300 rpm, 3 min)한 후, 상층액을 필터링 (0.22 μm)하고 p24 ELISA를 사용하여 역가 측정하였다.
항-바이러스 효과 어세이
PEP1의 항HIV-1 효과를 측정하기 위해서, MT-4 세포를 사용하여 세포 기반의 항-바이러스 효과 어세이를 수행하였다. MT-4 세포 (4x105 세포)를 HIV-1 (4x105 CC ID50; 50% cell culture infective dose)로 1 시간 동안 감염시켰다. D-PBS로 두번 세척한 후, 감염된 세포에 PEP1 또는 항HIV-1 약물을 접종 처리하였다. 2일간 배양한 후, 세포를 수집하기 전에 형광 현미경을 사용하여 eGFP를 발현하는 MT-4 세포의 이미지를 얻었다. 수집된 상층액에서 남은 세포 잔여물을 제거하기 위해서 13,000 rpm에서 3분 동안 원심 분리하였고, 세포외 바이러스 양을 측정하기 위해서 역전사 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-qPCR)을 위해 p24 ELISA 또는 RNA 추출을 하였다. 한편, 세포 펠릿을 D-PBS로 두 번 세척하고 세포 생존 능력 (cell viability) 어세이에 사용하였다. PEP1의 항바이러스 작용에서 HSP90의 역할을 조사하기 위해서, MT-4 세포를 HIV로 1 시간 동안 감염시키고, 항HSP70 (10 ng), 항HSP90 (10 ng) (Cell Signaling, Danvers, MA) 또는 17-AAG (1 μM) (Calbiochem, Darmstadt, Germany)로 처리하였다. p24 ELISA를 사용하여 HIV-1 복제를 분석하였고, 형광 현미경을 사용하여 eGFP를 모니터링하였다. 또한, 세포 용해액을 항-GFP 항체를 사용하여 면역블롯팅하여 HIV-LTR-의존적 eGFP의 합성을 확인하였다.
세포 독성 어세이
MT-4, 1G5 또는 ACH-2 세포를 96웰 마이크로플레이트에서 1x104의 밀도로 접종하고, PEP1의 농도를 증가시켜 처리하여 5일 동안 배양하였다. 세포 생존 능력을 셀타이터96 어쿠어스 원 솔루션 (CellTiter96 Aqueous One Solution) 어세이 키트 (Promega, WI)를 사용하여 제조자 지시에 따라서 색측정법으로 측정하였다. HIV-1 유도된 세포 사멸로부터 PEP1이 세포 보호 능력을 부여한다는 것을 측정하기 위해서, MT-4 세포 (1x104)를 HIV-1 바이러스 (4x105 CC, ID50)로 5일 동안 PEP1과 함께, 또는 PEP1 없이 감염시키고, 세포 생존 능력을 측정하였다.
HIV-1 바이러스 생성의 측정
HIV-1 바이러스 역가를 측정하기 위해서, HIV-1 p24 항원 캡처 ELISA (p24 ELISA, ABL) 및 RT-qPCT 어세이를 수행하였다. ELISA를 제조사 지시에 따라 수행하였다. 세포 배양 상층액 및 펠렛으로부터 QIAamp 울트라센스 (Ultrasens) 바이러스 키트 (Quiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제조사 지시에 따라서 HIV-1 RNA 게놈을 정제하였다. HIV-1 RNA 수준을 HIV-1 gag에 특이적인 프라이머 페어를 사용하여 RT-qPCR을 사용하여 정량화하였다. 글리세르알데히드 포스페이트 디하이드로게나제 (GAPDH)를 표준화를 위한 대조 유전자로 사용하였다. 하기 프라이머 페어를 qPCR에 사용하였다: Gag, 5'-TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT-3' (sense, 서열번호 5) 및 5'-AGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3' (antisense, 서열번호 6); 및 GAPDH, 5'-AATCCCATCACCATCTTCCA-3' (sense, 서열번호 7) 및 5'-TGGACTCCACGACGTACTCA-3' (antisense, 서열번호 8). HIV 1형 게네시그 스탠다드 (Genesig Standard) 키트 (Primer design, Southampton, UK)를 사용하여 바이러스 역가를 측정하였다. 스탁 바이러스의 농도는 2x105 카피/μl이었다.
실험 결과 분석
1) PEP1에 의한 HIV-1 복제 억제
본 발명의 발명자들은 HSP90이 HIV-1 라이프 사이클에서 중요한 역할을 하고, PEP1이 HSP90과 상호작용한다는 점에 비추어, PEP1이 HIV-1에 대해서 항바이러스 활성을 억제할 수 있다는 가설을 세우고, 이 가설을 검증하였다. PEP1의 역할을 조사하기 전에, 먼저 PEP1의 비특이적 세포 독성이 HIV-1 복제에 영향을 미칠 가능성을 배제하기 위해서 PEP1의 세포 독성을 분석하였다.
도 22 내지 27은 PEP1에 의한 HIV-1 복제 억제를 보여주는 데이타이다. PEP1은 MT-4, 1G5 및 ACH-2 세포에 대해서 25 μM까지는 유의미한 세포 독성을 나타내지 않았다 (도 22). 먼저, PEP1의 항HIV-1 활성을 MT-4 세포에서의 HIV-1 복제에 대한 영향을 분석하여 측정하였다. MT-4 세포를 pBR_HIV-1-M-NL4-3_IRES_eGFP로부터 생성된 HIV-1로 감염시키고, 다양한 농도의 PEP1로 처리하였다. p24 ELISA에서 측정된 바와 같이, MT-4 세포 중 바이러스 입자의 생성은 투여량에 의존적인 방식으로 PEP1에 의해 상당히 저해되었으며, 평균 50% 저해 농도 (IC50) 값은 약 0.85 μM (도 23)이었다. 추가적으로, HIV-1의 활성화에 의존하는 eGFP의 생성 또한 PEP1으로 처리함에 따라 감소하였다. 이러한 결과는 PEP1의 항HIV-1 효과를 추가적으로 지지한다 (도 24). PEP1에 의한 바이러스 입자 생성의 억제는 생성된 바이러스 입자의 HIV-1 게놈 RNA 수준을 측정함으로써 추가적으로 확인되었다. PEP1은 투여량 의존적인 억제 효과를 나타내며, 5 μM PEP1은 바이러스 RNA 수준을 약 100배 정도 감소시킨다 (도 25).
HIV가 감염된 세포는 세포내 세포 사멸 기전에 의해 어팝토시스 (apoptosis)가 일어나는 것으로 알려져 있다. PEP1이 HIV의 복제 억제 효과와 함께 HIV가 감염된 세포 스스로 어팝토시스로 이르는 작용을 억제하는 효과가 있는지를 알아보기 위해 항세포 변성 효과 (anti-cytopathic effect) 어세이를 실시하였다. PEP1에 의한 HIV-1 복제의 억제와 일치하여, PEP1은 HIV-1 감염된 MT-4 세포에서 세포 보호 효과를 나타낸다. AZT 및 PEP1은 투여량 의존적인 방식으로 상당한 세포 보호 효과를 나타내었다 (도 26 및 27). AZT와 유사하게, 5μM PEP1은 HIV-1 매개된 세포 사멸로부터 거의 100% 세포 보호 작용을 나타낸다. 이러한 세포 보호 효과는 상층액 p24 수준이 감소하는 것과 반비례하는데, 이는 PEP1이 바이러스 복제를 억제함으로써 세포를 보호할 수 있다는 것을 제시한다.
2) PEP1에 의한 HIV-1 전사 억제
HIV-1 게놈으로부터 eGFP 생성이 Nef와 같은 조절 하에 있다는 점을 고려할 때, PEP1에 의한 HIV-1 감염된 세포에서 eGFP 발현의 감소는 PEP1에 의한 HIV-1 전사의 억제를 나타낸다 (도 30). PEP1에 의한 HIV-1 억제 기작을 보다 조사하기 위해, PEP1과 아울러 복제 차단 단계가 알려진 기존 항-HIV 약물들을 사용하여 추가 시간 (TOA) 어세이를 실시하였다. 대조구 항HIV 약물들은 그 특성이 잘 알려져 있으며, 각 약물들의 HIV 증식 단계에서의 억제는 다음과 같이 일어난다: AZT는 역전사 활성을 억제하며, 3 내지 4 시간 사이에 HIV 증식을 억제한다; 랄테그래비르 (raltegravir)는 HIV DNA가 숙주 DNA 게놈으로 삽입되도록 하는 인터그라제 (integrase) 활성을 억제하며, 6 내지 8 시간 사이에 HIV 증식을 억제한다; 리토나비르 (ritonavir)는 프로테아제의 활성을 저해하여 gal-pol 폴리펩티드의 전구체를 프로세싱할 수 없도록 만들어, 비감염성 미성숙 HIV 입자가 생성되도록 하며, 15 시간까지 HIV 증식을 억제한다; T-20은 바이러스와 세포 막의 융합을 저해하여 HIV 바이러스가 세포 내로 들어가는 것을 간섭하며, 추가 24 시간 배양을 처리하여 치료제가 아닌 대조 약물인 DMSO보다 1/3 적은 양의 HIV 증식이 일어난다.
도 28 내지 30은 PEP1에 의한 HIV-1 복제 억제를 전사레벨 (transcriptional level)에서 관찰한 사진이다. TOA 어세이에서 각 약물의 결과는 HIV 복제의 억제가 각 약물에 의해 타켓된 복제 단계에 상응하는 시간대에서 잘 나타나며, PEP1에 의한 HIV 억제는 HIV 감염된 MT-4 세포를 PEP1으로 처리한 후 11 내지 13 시간 사이에 일어남을 보여준다 (도 28). eGFP 발현의 분석은 PEP1의 저해 활성이 감염 후 12 시간 동안 처리하였을 때 약화된다는 것을 확인하였다 (도 29). TOA 전형적인 결과에 따르면, 삽입된 HIV 게놈으로부터 HIV 바이러스의 전사는 감염 후 11 내지 13 시간 사이에 일어난다. 이러한 결과는 HIV로 감염된 MT-4 세포에서 PEP1의 작용 방식은 예측한 바와 같이 전사 활성을 억제하여 HIV 증식을 억제하는 방식이라는 것을 제시한다. 본 발명자들의 가설은 바이러스 mRNA 수준의 분석을 통해 추가적으로 지지되었다. 감염 후 세포를 PEP1으로 9 시간 동안 처리하였을 때, PEP1은 HIV-1 바이러스 mRNA의 생성을 효과적으로 억제하였으나, 감염 후 13 시간 후에 처리되었을 때에는 바이러스 mRNA를 감소시키는 능력을 상실하였다 (도 30). 동시에 하우스키핑 호스트 GAPDH mRNA 합성에서 유의미한 변화는 없었으며, 이는 PEP1이 HIV-1 바이러스 전사를 선택적으로 조절한다는 점을 제시한다.
상기 실험 결과 및 알려진 HIV 시간대 별 증식 단계를 통하여 PEP1이 증식 억제를 보이는 시간대인 11 내지 13 시간대는 HIV가 세포주의 핵 내로 DNA를 주입시킨 후 (integration) 세포 내 전사 인자를 이용하여 증식을 시작하는 단계로 후기 (late phase)의 초기 단계에 해당한다는 것을 알 수 있었다. 이는 PEP1이 HIV 의 증식에 필요한 여러 단계의 생활사 중에서 세포 내 핵으로 전사되는 시기에 바이러스를 억제하는 것을 나타내며, PEP1이 항HIV 억제제로서 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
3) PEP1에 의한 Tat 의존적 HIV-1 전사 억제
HIV-1 전이활성화 (transactivation) 단백질 (Tat)은 tat-전이활성 반응성 영역 (TAR)과의 상호작용을 통해 HIV-1 전사를 극적으로 향상시키는 조절 단백질이다. PEP1이 HIV-1 전사를 선택적으로 조절하는 점을 고려하여, 본 발명의 발명자들은 PEP1이 HIV-1 Tat 전이활성에 영향을 미치는지를 시험하였다. 본 발명에서는 Jurkat 파생 세포주로서, 안정적으로 삽입된 HIV-LTR-루시퍼라제 구조체를 함유하고 있는 1G5를 이용하였다. 1G5를 HIV-1로 감염시키거나, 또는 AZT 또는 PEP1 존재 하에서 tat-레트로바이러스 벡터 (pSV2tat72)로 형질 전환시킨 후에, 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
HIV-LTR-루시퍼라제 구조(construct)가 주입되어 있는 1G5 세포에 HIV-1로 감염시킨 뒤 DMSO, AZT 또는 PEP1로 후처리 하였다. 감염시킨후 4일 뒤, 세포 용해액 (lysate) HIV-LTR의 전이활성 (transactivation)을 분석하기 위한 루시퍼라제 어세이를 실시하였다. HIV-1으로 감염시킨 1G5 세포는 루시퍼라제 활성에서 급격한 증가를 나타냈다 (도 31). AZT 또는 PEP1 처리는 HIV-LTR-루시퍼라제 활성에 대한 HIV-1 감염의 효과를 5배 정도 감소시켰다 (도 31).
1G5 세포들을 Tat 플라스미드로 감염시켰다. 감염시킨 후 12 시간 뒤, 세포들은 앞서 말한대로 비히클 (DMSO), AZT 또는 PEP1로 처리되었다. 감염시킨 후 4일 뒤, HIV-LTR의 전사활성은 루시퍼라제 어세이를 통해 분석되었다. 데이터는 평균 (means) ± SD (표준편차)로 대표 표기되었다. ***은 p<0.001인 것을 나타낸다(도 32). 도 31의 결과와 일관되게, Tat의 이소성 (ectopic) 발현에 의해 유도되는 HIV-LTR 루시퍼라제 활성의 활성화를 PEP1가 억제하였다 (도 32). 그러나, AZT는 이러한 실험 세팅에서 HIV-LTR 루시퍼라제 활성을 억제하지 않았다. 이러한 결과는 PEP1이 HIV-1 감염 중 tat의 전이활성화 기능을 조절하고, 그로 인해 HIV-1의 복제를 억제한다는 것을 나타낸다.
4) PEP1에 의한 잠복기로부터 HIV-1의 재활성화 억제
HIV 복제는 고활성 항레트로바이러스 치료법 (HAART, highly active antiretroviral therapy)에 의해 탐지가능한 수준 이하로 성공적으로 억제될 수 있지만, HIV는 휴지 상태 기억 (resting memory) CD4+ T-세포와 같이 잠복기 감염 세포 안에 머무를 수 있다.
Tat는 여러 종류의 연관된 단백질들과의 상호작용을 통해 재활성화를 조절하도록하는 분자 스위치로 작동한다.
PEP1이 Tat 의존적 전사 활성을 조절한다는 점에 비추어, HIV-1 재활성화에서의 PEP1의 역할을 조사하였다. HIV-1 DNA의 단일 카피를 갖고 있는 인간 T 세포주인 ACH-2 세포를 비히클, AZT 또는 PEP1과 함께 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 처리하였다. 즉 ACH-2세포, 즉 HIV-1의 잠복성 상태 (latently)로 감염된 세포들을 PMA (50nM)로 자극하여 HIV-1의 재활성화를 1시간 동안 유도하였다. 그 다음 세포들은 DMSO, AZT, 또는 PEP1로 24시간 동안 처리되었다. 상층액에서 바이러스성 입자들의 생성 레벨은 p24 ELISA로 측정되었다. 그 결과, PMA 처리는 상층액 p24 수준을 상당히 증가시켰으며, PEP1은 이러한 효과를 거의 소멸시켰다 (도 33, 데이터는 평균 (means) ± SD (표준편차)로 대표 표기되었다. ***은 DMSO대비 p<0.001인 것을 나타낸다).
ACH-2 세포들은 PMA로 처리된 뒤 도 33에서처럼 농도를 단계별로 증가시킨 AZT 또는 PEP1로 처리되었다. 생성되는 바이러스성 입자들은 바이러스성 유전 RNA들의 양을 RT-qPCR을 사용하여 측정하였다. 그 결과, AZT는 PMA의 효과를 변화시키지 않았다. 이러한 결과는 PEP1이 PMA-유도된 HIV-1 재활성화를 억제하고, 바이러스 입자의 생성을 억제한다는 것을 제시한다. 비슷하게, HIV-1 바이러스 RNA 게놈 수준 또한 PMA-처리된 세포 유래의 상층액 중에서 PEP1을 처리하였을 때, 투여량 의존적인 방식으로 상당히 감소하였다 (도 34, 데이터는 평균 (means) ± SD (표준편차)로 대표 표기되었다. ***은 DMSO대비 p<0.001인 것을 나타낸다).
5) PEP1의 HSP90 의존적 항HIV-1 활성
PEP1은 HSP90 및 HSP70과의 상호작용을 하는 것으로 제시되었다. PEP1과 HSPs의 상호작용은 HIF-1α-VEGF 시그널링 축의 저해를 가져오며, 이는 PEP1이 HSPs와의 상호작용을 통해서 세포내 시그널링 경로를 조절할 수 있다는 것을 나타낸다. 본 발명의 발명자들은 PEP1이 HSPs와의 상호작용을 통해서 HIV-1 복제를 조절할 수 있는지 조사하였다. 놀랍게도, MT-4 세포 중 PEP1 매개된 HIV-1 생성의 억제는 항HSP90 중성화 항체를 처리하였을 때 완전히 복구되었다.
반면, AZT 매개된 억제는 전혀 영향을 받지 않았다 (도 35). 즉, MT-4세포들은 HIV-1로 1시간 동안 감염처리 후, 항GAPDH, 항HSP70, 항HSP90 항체 또는 17AAG로 1시간 동안 처리되었고 후속으로 DMSO, AZT 또는 PEP1로 처리 되었다. 감염 수시간 후, HIV-1 입자들의 생성은 p24 ELISA로 측정되었다. 그 결과, 항HSP70-중성화 항체 처리는 부분적 복구를 가져왔으며, 항GAPDH 항체의 아이소타입 (isotype) 조절은 유의미한 효과가 없었다. 이는 PEP1의 항HIV 역할이 주로 HSP90과의 상호작용을 통해 일어난다는 것을 제시한다 (도 35).
또한, HSP 억제제인 17-AAG 또한 PEP1의 효과를 완전히 소멸시켰으며, 이는 PEP1의 항HIV 활성이 HSP90을 통해 일어난다는 것을 확인하였다 (도 35). 또한, PEP1에 의한 HIV-1 전사활성에 의존하는 eGFP 발현의 억제는 항HSP90 항체에 의해 복귀되었다.
MT-4세포들은 HIV에 감염되었으며, 항GAPDH, 항HSP90 항체로 처리되었다. 세포들은 DMSO, AZT 또는 PEP1로 24시간동안 앞서 기술한대로 처리되었다. eGFP의 발현을 시험하기 위하여 세포를 터트려 면역블로팅을 통해 분석하였다. 그 결과, AZT의 영향은 받지 않았다 (도 36 및 37). 이러한 결과는 PEP1이 HSP90과의 상호작용을 통해서 HIV-1 전사 활성을 조절할 수 있다는 것을 나타낸다.
6) PEP1의 기저 NF-κB 전사 활성 억제
NF-κB는 HIV-LTR 내에 있는 NF-κB 결합 위치와 상호작용하여 HIV 전사를 촉발하고, TAT-매개된 LTR 전위 활성화를 증가시킨다. 아울러, Tat는 NF-κB를 직접적으로 활성화시킬 수 있다. 최근에, 세포외 HSP90이 NF-κB를 포함하여, 다수의 세포내 시그널링 경로를 조절할 수 있음을 보여주는 연구가 있었다. PEP1의 항HIV 효과가 항HSP90-차단 항체에 의해 소멸된다는 것은 PEP1의 항HIV 기능에서 세포외 HSP90의 관여 가능성을 제시하기 때문에, 본 발명의 발명자들은 PEP1이 HSP90 관련된 방식으로 NF-κB 활성을 조절하여 HIV-1 전사 활성을 조절하는지를 시험하였다. PEP1로 처리하면 MT-4 세포에서의 HIV-1 감염 여부와 관계없이 기저 NF-κB 활성을 극적으로 감소시켰다 (도 38). 반면에, AZT는 MT-4 세포 중에서 NF-κB 활성에 유의미한 영향을 나타내지 않았다. AZT는 HIV-1로 감염된 MT-4 세포 중에서 중간 정도의 억제 효과를 나타냈는데, 이는 아마도 낮은 HIV 복제 수준 때문일 것이다 (도 38). PEP1의 기저 NF-κB 활성에 대한 억제 효과는 EMSA로 추가적으로 확인하였다 (도 39). PEP1 처리된 세포는 p65 NF-κB 활성화의 명백한 감소를 나타내었다 (도 39). 이는 핵 내에서 NF-κB DNA 결합의 기저 수준을 억제한다는 것을 나타낸다. 또한 PEP1 처리는 NF-κB (p65) 인산화 감소를 가져오며, 이는 PEP1이 NF-κB 세포질 활성화와 이후의 핵 내 전이를 억제한다는 것을 나타낸다 (도 40). HIV-1으로 잠복 감염된 ACH-2 세포로부터도 유사한 결과를 얻었다 (도 40). 가정했던 바와 같이, PEP1에 의한 처리는 DMSO 처리된 대조 세포와 비교하여, PMA 처리된 ACH-2 세포에서 NF-kB(p65)의 핵 내로의 이동을 감소시켰다 (도 41). 본 발명에서 PEP1의 항HIV 효과가 HSP90에 의존한다는 것을 보였기 때문에, 본 발명자들은 NF-κB 억제 효과가 HSP90에 의존적인지 시험하였다. 항HIV 활성 데이타와 일관되게, PEP1의 NF-κB 억제 효과는 HSP90 블라킹 항체 또는 HSP 억제제를 처리하였을 때 완전히 소멸되었다. 반면, 항GAPDH 항체로 처리하였을 때는 의미있는 효과가 없었다 (도 42).
종합하여, 본 발명자들은 PEP1이 NF-κB 활성의 기저 수준을 억제하여, HIV-LTR 전이활성을 억제한다는 것을 보였다. 결과는 HSP90이 이러한 활성에 관여한다는 것을 제시한다. 이전 연구에서 세포내 HSP90이 NF-κB을 직접적으로 조절하여, HIV 재활성화에서 중요한 역할을 한다는 것을 보였다. 본 발명에서 보여준 항HSP90 항체에 의한 PEP1 효과의 무효화는 PEP1의 항바이러스 효과가 HSP90에 의한, NF-κB 시그널링과 HIV-LTR 활성화를 통해 이루어짐을 제시한다
고활성 항레트로바이러스 치료법 (HAART)에 의해 HIV 복제가 성공적으로 억제될 수 있지만, 현재의 치료법들은 잠복기 감염된 HIV-1을 근절시키지 못하고 있다. 바이러스의 재활성화는 치료법이 실패하는 주요 원인이다. PEP1은 다수의 임상 시험을 통해 그 안정성이 이미 입증된 바 있다. 따라서, PEP1의 항-HIV 효과는 HIV 재활성 억제를 위한 효과적인 치료법을 제공할 수 있다.
실시예 4: HBV에 대한 PEP1의 효능 확인
간암의 표적 치료제 개발을 위해 EGFR 티로신 키나제, c-MET 키나제 뿐만 아니라, IL-6/JAK/STAT, Ras/ERK, Wnt 등의 다양한 시그널링 경로를 표적 후보군으로 연구하였다. 이 중, IL-6/JAK/STAT 시그널링 경로의 경우, 다양한 연구 결과를 통해 염증과 암화과정을 함께 제어할 수 있어, HBV 유래 질환 및 HCC 치료에 효율적인 표적이 될 수 있음을 확인하였다. 72.4%의 간세포암 조직에서 STAT3의 비정상적 활성화가 관찰되었으며 STAT3 저해가 간암세포주의 성장 및 동물모델에서의 성장억제를 유도함을 확인하였다. STAT 시그널링 저해 목적으로, 현재 임상 시험에 진입해있거나 사용 중인 약물들은 거의 대부분 키나제 저해제들이며, STAT3를 직접 저해하는 약물들은 일부가 전임상 단계에 진입하였지만, 표적 자체의 약물성 (druggability) 및 화합물들의 표적에 대한 선택성이 부족하여 이에 대해 추가적인 연구를 실시하였다. 특히 JAK2를 저해하여 STAT3 신호전달을 차단하는 것과 관련하여, 간세포암 대상으로 임상 시험이 진행 중인 JAK 저해 화합물은 전무하다. 또한, 이러한 단일 단계를 억제하는 화합물의 경우 내성 발생확률이 매우 높다. 따라서, 본 발명자들은 JAK2/STAT3 시그널링 경로의 여러 단계에서 저해 활성을 보이며, 시그널링 경로 전반을 저해할 수 있는 신규 화합물의 개발을 위해 연구하였다.
세포주의 배양
사람 유래 간세포암 Huh7 세포주(human hepatocellular carcinoma) (ATCC (American Type Culture Collection), Manassas, VA, USA), Huh7.5 세포주 그리고 HepG2 세포주(human hepatocellular carcinoma) (ATCC, Manassas, VA, USA)는 RPMI 1640 배지에 10% 소태아혈청 (Invitrogen, USA)과, 2 mmol/ml L-글루타민, 100 ug/ml 페니실린과 100 units/ml 스트렙토마이신을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
W4P를 포함한 전체 HBV 의 비리온 형성 억제능
본 발명자들은 간암이 성별 차이에 의한 발생빈도 차이가 나타남에 주목하여 관련 연구를 수행하였고 남성에서 특이적으로 발견되며 간경화 및 간암의 발생과 연관된 돌연변이 (W4P)를 세계 최초로 규명하였다. W4P는 신규한 Pre-S1 치환 W4P 돌연변이로서, 항원 단백질의 4번 (preS1으로부터 4번째) 아미노산을 코딩하는 유전자 코드가 야생형 TGG에서 돌연변이 CCG (밑줄은 돌연변이된 부분을 나타냄)로 변이된 결과 생긴 번역 산물로 4번째 아미노산이 트립토판 (W)에서 프롤린 (P)로 치환된 단백질을 말한다. 이러한 돌연변이는 남성에서 IL-6를 통해 JAK2-STAT3 신호전달체계를 조절함으로써 간암의 발생과 진행을 촉진하는 사실을 규명하였고 임상샘플에서도 높은 수준의 IL-6가 나타남을 확인하였다.
PEP1에 의한 W4P를 포함한 전체 HBV의 비리온 형성능을 관찰하기 위하여 100mm 디쉬에 huh7 세포 2x106개를 주입하여 정상 전체 HBV 와 W4P를 포함한 전체 HBV를 트랜스펙션 (transfection) 효율을 보정하기 위해 β-갈락토시다제 (galactosidase)를 포함하는 pCMV-β-gal 벡터를 코-트랜지언트 (co-transient) 트랜스펙션한 후 3일 동안 배양하면서 24시간마다 배지를 교체해 주면서 수프 (상층액, sup)을 모았다. 이를 분석하기 위하여 HBsAg(Hepatitis B surface antigen)와 HBeAg(Hepatitis B envelop Antigen)을 검출할 수 있는 일반화된 Bioelisa HBsAg 칼라 ELISA 키트 (BIOKIT S.A., Spain)와 HBeAg ELISA 키트(BIOKIT S.A., Spain)를 이용하여 제공된 실험 방법에 따라 ELISA 하였다. 모은 수프에서 100μl를 웰에 넣은 후 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 세척 용액 300μl씩 넣고 3번 세척하였다. 컨쥬게이트 희석 용액에 300μl씩 넣고 3번 세척하였다. 기질 (substrate) 용액에 TMB를 20μl/ml 넣은 후 96웰에 100μl씩 넣고 30분 동안 상온에서 빛을 차단하여 반응시켰다. 스탑 (Stop) 용액 100μl 넣어 주어 반응을 종결시켰다. ELISA 리더 (Beckman, USA)로 450nm로 흡광도를 읽었다. 보정에 사용되는 β-갈락톡시다제는 리포터 용해 완충용액 키트와 β-갈락톡시다제 효소 분석 시스템 (Promega, USA)에서 제공한 방법에 따라서 실험을 진행하여 ELISA 결과를 보정하였다.
W4P를 포함한 전체 HBV 의 비리온의 외피 항원 발현 억제능
PEP1에 의한 W4P를 포함한 전체 HBV의 외피 항원 발현능을 확인하기 위하여 100mm 디쉬에 huh7 세포 2x106을 주입하여 정상 전체 HBV와 W4P를 포함한 전체 HBV를 트랜지언트 트랜스펙션한 후 3일 동안 배지를 교체해 주면서 배양한 후 세포 펠릿을 모아 단백질을 추출하여 IP를 수행하였다. 단백질에 프로틴 A/G 플러스-아가로즈 면역침강제 (Santa Cruz Biotechnology, USA)를 20μl 넣어 4℃에서 두 시간 동안 프리-클리어링 (pre-clearing)한다. 프리-클리어된 용해액 400 ug의 단백질에 프로틴 A/G 플러스-아가로즈 면역침강제 (Santa Cruz Biotechnology, USA)를 20μl 넣고 4μg 1차 항체를 첨가하여 4℃에서 24시간 반응시켰다. 다음 날 2000rpm으로 원심 분리하고 세척한 후 다시 단백질 용해 용액 50μl로 풀어주었다. 1차 항체 preS1과 HBs 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 시행하였다.
W4P를 포함한 전체 HBV의 비리온의 증식 억제능
W4P를 포함한 전체 HBV의 비리온 증식능을 관찰하기 위하여 앞선 방법으로 24 시간마다 배지를 교체해 주면서 교체한 수프의 전체를 모아 비리온 DNA를 추출하여 Quantitech SYBR Green Master-Mix 키트 (Qiagen)으로 실시간 정량 PCR을 시행하였다. 전체 수프는 SW28 스윙 로터로 20,000rpm에서 2시간동안 초원심분리기로 바이러스를 침전시킨 후 침전된 바이러스 펠렛을 멸균된 DW 200μl로 풀어주었다. 비리온 DNA를 추출하기 위해 100μg/ml RNase A를 처리하고 용해 완충용액 (0.25% SDS, 0.25M Tris, 0.25M EDTA) 100μl를 첨가한 후 프로티나제 K를 500μg/ml을 넣어 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이후 페놀:클로로포름 추출 방법으로 추출하였다. 바이러스 증식능을 보기 위해 HBV 작은 표면적 부분을 표적으로 하는 실시간 PCR 프라이머를 SF-Real (5'-TTG ACA　AGA ATC CTC ACA ATA CC-3', 서열번호 9)과 SR-Real (5'-GGA GGT TGG GGA CTG CGA AT-3', 서열번호 10) 제작한다. 96well plate에 12.5μl IQ SYBR 그린 슈퍼믹스 (Biorad, California, USA), 1.25μl SF-Real 프라이머, 1.25μl SR-Real 프라이머, 9μl 멸균 증류수, 1μl cDNA를 넣었다. Exicycler™ 96 실시간 정량 역 블록 시스템 (Bioneer Co., Korea)를 이용하여 95℃에서 5분, 94℃에서 15초, 60℃에서 15초로 40 주기로 하였고 멜팅 커프 (melting curve) 분석을 위하여 95℃에서 0초, 53℃에서 30초 및 초당 0.1℃씩 조절하여 53℃에서 90℃까지 온도를 상승시켰다.
형질전환 마우스
HBV 형질전환 마우스는 모든 ORF(open reading frame)를 포함하는 HBV 염기서열의 1.1배를 마우스의 수정란에 미세주입법으로 주입하였다. 연구에 사용되는 HBV 염기서열은 pHY92-W4P 플라스미드를 이용하여 얻었다. pHY92-W4P 플라스미드는 마우스 수정란에 주입되기 전에 EcoRI에 의하여 절단하여 최종적으로 3.9kb 길이의 염기서열을 미세주입법에 사용하였다. 생성된 개체는 HBsAg 특정 서열을 이용한 PCR을 통하여 선별하였다. PCR-양성 개체는 혈청의 HBsAg와 HBeAg 농도에 따라 선별되어 최종적으로 PCR-양성, HBsAg-양성, HBeAg-양성 마우스를 연구에 사용하였다. 이 마우스는 C57BL/6 마우스와 역교배되어 이형의 HBV 형질전환 마우스를 생산한다. 자손중 높은 HBsAg-, HBeAg-양성 수치를 보이는 마우스에 대하여 서던(southern), 노던(northern) 혼성화를 실시하여 간세포의 HBV 복제 중간체와 전사를 확인하였다. 이중 높은 간세포의 HBV 복제 중간체와 전사를 보이는 HBV 형질전환 마우스를 PEP1에 의한 항바이러스 연구에 사용하였다.
유체 역학 (Hydrodynamic) 주입법을 이용한 동물 실험
C57/BL6 마우스에 전체 HBV W4P 유전체 DNA (1.8ml solution injected wittin 5s into 20g mice)를 주입한 후 다음 날부터 PEP1 (50 ug/kg)을 일주일에 2회 피하 주사하여 처리하였다. 혈액 샘플은 1, 3, 7, 10 그리고 14일, 2주간 획득하고 14일째 마취한 후 전혈을 획득하여 희생하였다. 혈액을 채취하여 혈청을 분리하고 간은 신속히 절개하여 균질화 (homogenize)하였다.
HBsAg 측정, HBV 역가 정량 및 웨스턴 블롯
HBV-형질전환 마우스의 HBsAg 수치는 HBsAg ELISA 키트 (BIOKIT, Germany)을 이용하여 측정하였다. HBV 역가를 정량하기 위하여 모든 DNA를 추출하여 실시간 PCR에 의하여 확인하였다. 웨스턴 블롯을 위해서 8 M 우레아와 같은 양의 단백질 용해액를 이용하여 세포를 용해하고 전기영동을 이용하여 분리하고 항체와 결합시켜 화학발광 탐지 ECL 키트 (Perkin Elmer, USA)를 이용하여 확인하였다.
RNA 추출 및 노던 블롯
REzol (PROtech Technologies, Taiwan)를 이용한 세포용해를 통하여 추출된 세포 RNA를 이소프로판올 침전을 이용하여 분리하였다. 얻어진 RNA는 RNase-free DNase I (Roche, Germany)를 37℃에서 30분간 처리하여 잔여 DNA 플라스미드를 제거하였다. 이후 페놀/클로르폼을 이용하여 추출하고, 에탄올 침전과 재현탁을 이용하여 RNA를 정제하였다. 노덧 블롯을 위해서 동일한 양의 RNA를 2% 포름알데히드 겔에 의한 전기영동을 통하여 분리하고, 멤브레인 (membrane)으로 이동하여 HBV 전체 염기에 상응하는 P32-표지된 HBV 전장 프로브에 염색하였다. 로딩 컨트롤로서 동일한 멤브레인에서 P32-표지된 GAPDH 프로브의 혼성화를 사용하였다.
HBV 코아 결합된 DNA의 분리 및 서던 블롯
마우스 간조직으로부터 HBV DNA를 추출하기 위하여 기존 과정에 따라 다음과 같은 방법을 사용한다. 세포를 용해하기 위하여 10-cm 디쉬 당 1.2 mL NET 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA, pH8.0, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 교반 배양을 실시하고, 원심분리 (13k rpm, 10분, 4℃)를 실시하여 핵을 제거하였다. 상층액은 6mM CaCl2에 의하여 조절하여 Micrococcal Nuclease (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sweden)를 37℃에서 30 분간 배양하여 세포질내 RNA 또는 잔여 DNA 플라스미드를 분해하였다. 이후 65℃에서 15 분간 EDTA 20mM을 사용하여 효소를 불활성화시켰다. 프로티나제 K (Sigma) 200 μg/ml와 SDS 0.5% 50℃에서 하룻동안 반응시켜 상층액의 단백질을 분해하고 HBV 코어 결합된 DNA를 추출하였다. HBV DNA는 페놀/클로르포름을 이용하여 추출하고, 에탄올 침전과 TE 완충용액 재현탁 (resuspension)을 이용하여 정제하였다. 서던 블롯을 위하여 정제된 HBV DNA 양의 1/5를 1.5% 전기영동을 실시하고, 멤브레인으로 이동하여 P32-표지된-HBV 전장 프로브를 이용하였다.
IL6, TNFα 사이토 카인 분석
PEP1을 처리한 형질전환 마우스와 유체 역학 주입 모델에서 획득한 마우스 혈청에서 IL6와 TNFα의 수준을 비교하기 위하여 R&D ELISA 키트를 이용하여 제공된 방식에 따라 수행하였다. ELISA 리더 (Beckman, USA)로 450nm 흡광도로 읽었다.
RNA 발현 분석
마우스 간 조직으로부터 획득한 RNA를 이용하여 염증관련 사이토카인인 IL6, IL1β, TNFα의 RNA 수준에서 비교 관찰하고 간 섬유화의 마커인 TGFβ, 콜라게나제 I 및 IV의 발현을 비교하며 면역세포 마커 4/80, CD68 과 케모카인 유인제 (chemokine attractant) 단백질과 그 수용체의 RNA 발현 정도를 실시간 PCR을 통하여 확인하였다. 대조군 RNA는 18S의 발현과 비교하였다.
자연형 및 전체 HBV W4P 유전체 주입 마우스의 비장내 면역세포 분석
형질전환 마우스의 비장을 분리한 후 비장내 면역세포들을 수확하고 세포 유동분석기를 사용하여 B세포, T세포 (CD8+, CD4 + CXCR5 + TFH 세포), NKT 세포등의 분포를 분석하였다. 비장세포들을 정제된 자연형 및 변이주 외피항원과 함께 배양하며 T세포의 증식을 티미딘 흡수 (thymidine uptake) 기법을 통하여 측정하였다. 동시에 PHA, 항CD3 항체등을 처리하고 T세포의 증식을 동일한 방법으로 측정하여 마이토젠 (mitogen) 처리 후의 T 세포 증식능을 연구하였다.
자연형 및 전체 HBV W4P 유전체 주입 마우스의 간 내 면역세포 분석
간문맥을 통하여 콜라게나제를 포함한 소화 (digestion) 용액을 사용하여 간 관류 (perfusion) 후 간을 균질화하고 소화 용액으로 세포들을 얻은 후 낮은 원심분리 (30 RCF/3분)를 통하여 간세포를 제거하고 차등 (gradient) 원심분리를 통하여 간내 면역세포들을 수확하였다. Fc-블록 후 항CD3, 항CD4, 항CD8, 항NK1.1, 항CD19, 항CD11b, 항CD11c등의 항체를 사용하여 유동 세포분석을 수행하여 간내 면역세포의 분포를 분석하였다.
T-세포 활성 분석
외피항원을 발현하는 P815 세포주를 제조하여 비장 및 간에서 얻어진 면역세포들을 5일간 활성화한 후, 외피항원을 발현하는 P815 세포를 타겟 세포로 사용하여 분리된 T세포의 세포독성 (cytotoxicity)을 분석하여 세포살 T세포의 활성화정도를 측정하였다. 또한 역시 비장과 간에서 얻어진 면역세포로부터 T세포를 T-세포 농축 칼럼 (R&D)을 사용하여 분리한 후 외피항원발현 P815 세포주와 함께 16시간 배양한 후 2형 인터페론 (Interferon-γ) ELISPOT 키트를 사용하여 특이적으로 감마인터페론을 생산하는 T세포를 측정하였다.
통계 처리
SPSS 12.0K 프로그램을 사용하여 각 범주간의 차이를 비교할 때는 피셔의 정확 검정 (Fisher's exact test)나 카이 스퀘어 테스트 (Chi-square test)를 사용한다. 연속변수에는 값이 정규분포를 따를 경우 스튜던트 티 테스트 (Student's t-test)를 사용하고, 그렇지 않을 경우에는 만-휘트니 유-테스트 (Mann-Whitney U-test)를 사용하여 분석하였다. P 값이 0.05 이하일 때 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
실험 결과 분석
1) 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 Huh7, Huh7.5, HepG2 세포주에서 PEP1 펩티드에 의한 HBsAg 합성 억제능 확인
HBV HBsAg 과 비리온 분비를 유도하는 본 연구실에서 확립한 전체 HBV W4P 유전체를 이용하여 여러 가지 사람 간세포암 세포주를 이용하여 PEP1 의 HBsAg 분비에 미치는 영향을 관찰하였다. Huh7, Huh7.5 그리고 HepG2 세포주에 전체 HBV W4P 유전체를 transient transfection 한 후 PEP1 10μM과 대표적인 항 바이러스제 라미뷰딘(ramivudine, 이하 3TC)를 10μM을 처리한 후 48시간 뒤에 펠렛(pellet) 과 수프(상층액, supernatant, sup)를 모아 ELISA를 수행하였다. 그 결과, HBsAg 의 수준이 세포내, 외에서 HepG2 세포주에서는 PEP1 에 의해 모두 억제 효과를 보였고 Huh7 세포주 에서는 세포 내에서는 억제 하였으나 세포 외에서는 차이가 없었던 반면 Huh7.5 세포주 에서는 세포 내, 외에 모두 효과가 없었다. HBV polymerase inhibitor 인 3TC 도 역시 대조군에 비해 억제 효과를 보이긴 했으나 PEP1 처리한 군과 비교해서는 큰 차이를 보이진 않았다. (도 43). 이러한 결과로 보아, PEP1 펩티드에 의해 대표적인 항 바이러스제 3TC 와 마찬가지로 HBV 의 HBsAg 합성에 있어 억제 효과가 있음을 입증하였다.(데이터의 SEM은 duplicate 로 3번 실험한 값임. * P < 0.05, ** P <0.01)
2) 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 Huh7, Huh7.5, HepG2 세포주에서 PEP1 펩티드에 의한 비리온(Virion) 형성 억제능 확인
PEP1 펩티드에 의해 HBsAg 분비능이 억제된 것을 관찰 한 후 sup에서 virion 형성능도 관찰하고자 앞선 방법으로 획득한 sup에서 PEG 6000을 이용하여 virion 을 모은 후 virus DNA prep kit(Intron, Korea)를 이용하여 HBV DNA를 획득하여 real-time PCR 로 정량화 하였다. 그 결과, sup 에 형성된 virion 의 수준이 HepG2 와 Huh7 세포주에서는 PEP1 에 의해 3TC 와 마찬가지로 모두 억제 효과를 보였으나 Huh7.5 세포주 에서는 virion 분비에 있어 영향을 보이지 않았다. HBV polymerase inhibitor 인 3TC도 역시 대조군에 비해 억제 효과를 보이긴 했으나 HBsAg 합성능과 마찬가지로 PEP1 처리한 군과 비교해서는 큰 차이를 보이진 않았다 (도 44a, 도 44b, 및 도 44c). 이러한 결과로 보아, PEP1 펩티드에 의해 대표적인 항 바이러스제 3TC 와 마찬가지로 HBV 의 virion 형성에 있어 억제 효과가 있음을 입증하였다.(데이터의 SEM 은 duplicate 로 3번 실험한 값임. * P < 0.05, ** P <0.01, *** P <0.001)
3) 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 HepG2 세포주에서 PEP1 펩티드의 농도에 따른 HBsAg 합성 억제능 확인
Huh7, Hu7.5, HepG2 세포주에서 PEP1 펩티드에 의해 HBsAg 합성 억제 효과를 관찰한 결과 가장 효과적인 HepG2 세포주를 이용하여 PEP1 농도에 따른 효과를 관찰하고자 HepG2 세포주에 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 후 PEP1 펩티드를 0.01, 0.1, 1, 10, 100μM 농도에 따라 처리한 후 48시간 뒤에 pellet 과 sup을 모아 ELISA를 수행하였다. 대조군으로 항바이러스제 3TC 도 같은 방법으로 처리하였다. 그 결과, PEP1 펩티드는 pellet에서 0.01μM 에서부터 억제 효과를 보이나 농도에 따라 다소 차이가 있으며 sup 에서는 10μM 농도까지 억제 효과를 보이다가 100μM에서는 전혀 효과가 없는 것으로 관찰 되었다. 반면, 3TC 는 pellet 과 sup 모두에서 농도에 따른 억제 효과를 관찰 할 수 있었다. 이러한 결과로 보아 PEP1 펩티드는 HBsAg 합성능에 pellet에서 농도 의존적인 효과를 보임을 확인하였다(도 45, 데이터의 SEM 은 duplicate 로 3번 실험한 값. * P < 0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
4) 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 HepG2 세포주에서 PEP1 펩티드의 농도에 따른 Virion 형성 억제능
앞선 실험 세포 sup에서 펩티드 농도에 따른 virion 형성능을 관찰하고자 sup에서 virion을 획득하여 real-time PCR을 수행하였다. 그 결과, PEP1 펩티드는 pellet에서 0.01μM 저 농도에서는 효과가 없는 반면 10μM 농도에서 약 48% 감소효과를 보였으나 100μM 고농도에서는 오히려 전혀 효과를 보이지 않았다. 반면, 3TC 는 virion 합성에서도 농도에 따른 억제 효과를 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로 보아 PEP1 펩티드는 virion 형성에 있어 10μM 농도까지 농도 의존적인 효과를 보임을 확인하였다(도 46, 데이터의 SEM 은 duplicate 로 3번 실험한 값. * P < 0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
5) PEP1 펩티드에 의한 HNF4α의 발현에 미치는 영향
Hepatocyte nuclear factor 4α는 HBV enhancer I 에 결합함으로써 HBV 합성하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 HepG2 세포주에 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 후 PEP1 10μM을 처리한 후 48시간 후에 pellet에서 단백질을 추출하여 Western blot을 수행하였다. 대조군으로 mock vector를 주입하여 비교하였다.
그 결과, HBV 증식을 유도하는 전체 HBV W4P 유전체를 주입했을 때 증가된 HNF4α 의 발현이 관찰되었는데 이에 PEP1 펩티드에 의해 HNF4α 의 발현이 3TC 보다 더 효과적으로 감소함을 확인하였다. 이로써, PEP1 펩티드의 HBV 의 항 바이러스 효과는 transcription factor 인 HNF4α의 발현 조절에 의해 바이러스 증식을 억제함을 입증하였다 (도 47).
6) PEP1 펩티드에 의한 염증 관련 사이토카인에 미치는 영향
HBV 의 preS1 W4P 변이주는 염증 조절 사이토카인 IL-6 의 형성에도 밀접한 관련이 있다고 보고되어지고 있다. 따라서 IL-6 가 유도되어진 세포주에서 PEP1 에 의한 항 염증 효과를 관찰하고자 HepG2 와 Huh7 세포주에 전체 HBV W4P 유전체를 주입한 후 PEP1 10μM와 3TC 10μM를 각각 처리한 후 48시간 후에 배양 sup에서 IL-6 수준을 ELISA를 통해 관찰하였다. 그 결과, IL-6 증식을 유도하는 전체 HBV W4P 유전체를 주입했을 때 HepG2 세포주에서는 IL-6 수준이 전혀 검출이 되지 않을 정도로 낮은 수준으로 존재하였고 Huh7 세포주에서도 PEP1 에 의해 IL-6 의 억제 효과는 관찰되지 않았다. 3TC 처리 군도 마찬가지로 전혀 IL-6 사이토카인의 형성에는 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다 (도 48).
7) 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1의 HBsAg 합성능과 virion 에 미치는 영향
PEP1 펩티드에 의한 항바이러스 효과를 관찰하기 위하여 전체 HBV W4P 유전체를 주입하여 만든 형질전환 마우스를 이용하여 HBsAg 합성능을 관찰하였다. 마우스 꼬리 정맥으로 PEP1 펩티드를 50ug/kg 농도로 일주일에 2회씩 주입하였다. 대조군으로 3TC 500μg/kg을 PEP1 펩티드와 마찬가지로 주입하여 4주, 8주 후 마우스를 전혈 채혈하여 혈청에서 HBsAg 수준을 관찰하고자 HBs ELISA를 수행하였다. 또한 마우스 혈청으로부터 HBV virion DNA를 획득하여 real-time PCR을 수행하였다.
그 결과, HBsAg 의 혈청내 수준은 4주까지 처리하였을 때 PEP1 펩티드와 3TC 모두 감소 효과를 나타내지 않았으나 8주째 에서는 PEP1 펩티드에 의해 약 10% 정도 감소 효과를 보인 반면 3TC 는 효과가 없었다. 또한 virion 수준을 관찰하기 위하여 마우스 혈청에서 virion DNA를 획득한 후 real-time PCR을 수행 한 결과 4주째에는 HBsAg 과 마찬가지로 둘 다 virion 의 억제 효과는 관찰되지 않았으나 8주째에는 PEP1 펩티드는 약 50%, 3TC 는 약 52% 억제 효과를 보였다. 이로써 PEP1 이 전체 HBV W4P 변이주 유전체가 포함된 형질전환 마우스에서 형성되는 virion 을 형성 및 분비를 억제함을 확인하였다. (도 49).
8) 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드에 의한 단백질 발현에 미치는 영향
PEP1 펩티드에 의한 항바이러스 효과에 미치는 단백질 발현의 변화를 관찰하기 위하여 전체 HBV W4P 변이주 유전체를 주입하여 만든 형질전환 마우스를 이용하여 관찰하였다. 마우스 꼬리 정맥으로 PEP1 펩티드 50ug/kg 농도로 일주일에 2회씩 주입하였다. 대조군으로 3TC 500ug/kg을 PEP1 펩티드와 마찬가지로 주입하였다. 8주째 마우스에서 전혈 채혈하고, 마우스 간에서 단백질을 추출한 후 western blot을 수행하여 단백질의 발현을 관찰하였다.
그 결과, HBV 증식에 작용하는데 중요한 HBV의 역전사 효소의 활성과 밀접한 관련이 있는 Heat Shock Protein 90 (HSP 90) 와 HBV 에 의해 만성적으로 간염 되어있는 환자에서 활성이 증가되어 있는 superoxide dismutase (SOD) 의 발현에 있어서 PEP1 펩티드에 의한 영향은 관찰되지 않았으나 다양한 signal pathway에서 transcriptional activator 로 작용하는 HBx 로 인한 간세포암 진행과정에서 밀접한 관련이 있는 ras/raf-mitogen activated protein kinase (MAPK) 중 특히 extracellular signal - regulated protein kinase (ERK) 단백의 인산화는 PEP1 펩티드에 의해 발현이 억제되고 Jenus kinase/signal and transducer and activator transcription factor (JAK/STAT) 의 signal 중 JAK2 의 인산화 역시 PEP1 펩티드에 의해 조절됨을 확인하였다. 대조군인 3TC 역시 ERK와 JAK2 signal 의 인산화를 억제함을 확인할 수 있었다. 이로써 PEP1 펩티드는 HBV 의 증식을 조절하여 간세포암 진행 과정에서 중요한 역할을 하는 MAPK 와 JAK/STAT 의 시그널을 조절함으로써 HBV 에 의한 간세포암 진행을 억제할 수 있는 중요한 역할을 할 것으로 사료되었다 (도 50).
9) 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드에 의한 면역 세포 분포에 미치는 영향
PEP1 은 텔로머라제에서 유래하는 HLA Class II 결합 펩티드로 세포독성 T-세포와 보조 T-세포의 면역 반응 유발하는 16개의 아미노산 펩티드이다. 따라서, PEP1 펩티드에 의한 신장 면역 세포 분포의 변화를 관찰하기 위하여 전체 HBV W4P 변이주 유전체를 주입하여 만든 형질전환 마우스를 이용하여 4주째 마우스를 전혈 채혈하고, 마우스 신장을 획득하여 면역 세포를 분리 후 lymphocyte marker(B세포(CD19B), CD4, CD8, NK1.1세포)와 myeloid cell marker(DC(CD11c), macrophage(F4/80), neutrophil(Ly-6G), monocyte(Gr1))를 이용하여 extracellular cell surface 염색방법으로 염색한 후 FACS 분석을 하였다.
그 결과, PEP1 펩티드에 의해 lymphocyte 인 B 세포, CD4, CD8, NK1.1 세포 모두 유의적인 차이를 보이지 않았으며 myeloid 계열 세포인 DC, macrophage, neutrophil, monocyte 역시 세포 분포에 영향이 없는 것으로 확인하였다. 3TC 역시 PEP1 과 마찬가지로 전체 HBV W4P 형질전환 마우스의 면역 세포의 분포에 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다(도 51a 내지 도 51h).
10) 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드에 의한 Interferon γ(INFγ) 활성에 미치는 영향
바이러스에 대항하여 면역세포에서 호르몬과 비슷한 사이토카인인 INF을 분비한다. 이러한 INF에는 α, β, γ가 존재하며 이중 INFγ가 인체 내에서 B형 간염 바이러스를 억제하는데 중요한 것으로 알려져 있다. 따라서 PEP1 펩티드에 의한 면역 반응으로 INFγ의 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 전체 HBV W4P 변이주 유전체를 주입하여 만든 형질전환 마우스를 이용하여 PEP1 펩티드 50ug/kg 과 3TC 500ug/kg 농도로 일주일 2회씩 꼬리정맥으로 주입한 8주째 마우스를 전혈 채혈하고 마우스 신장을 획득하여 면역 세포를 분리 후 HBsAg을 처리하여 자극시켰다. 72시간 자극 후 Brefeldin A로 세포 내에 INFγ 사이토카인을 두게 한 후 intracellular 염색 방법으로 염색한 후 FACS 분석을 하였다.
그 결과, PEP1 펩티드에 의해서는 CD4, CD8 그리고 NK1.1 세포 모두 INFγ의 활성이 나타나지 않았으며 3TC 역시 약간의 증가를 보이긴 하였으나 유의적인 차이를 보이진 않았다 (도 52a 내지 도 52g).
11) 전체 HBV W4P 유전체 형질전환 마우스에서 PEP1 펩티드에 의한 대식세포(macrophage)의 분화에 미치는 영향
macrophage 의 M1 으로의 분화는 감염된 세포를 세포 사멸을 유도하여 항 바이러스 효과를 보이는 것으로 알려져 있다. 따라서 PEP1 펩티드가 macrophage 를 M1 으로 분화 시킬 수 있는 능력이 있는지 관찰하기 위하여 전체 HBV W4P 변이주 유전체를 주입하여 만든 형질전환 마우스를 이용하여 PBS, PEP1 펩티드 50ug/kg, 및 3TC 500ug/kg 를 각각 일주일에 2회씩 꼬리정맥으로 주입한 8주째 마우스를 전혈 채혈한 후 마우스 신장을 획득하여 면역 세포를 분리 후 macrophage (F4/80) 와 M1 marker 인 MHCII 를 이용하여 extracellular cell surface 염색방법으로 염색하였다. 이후 FACS 분석을 하였다.
그 결과, PEP1 펩티드에 myeloid 계열 세포 중 macrophage 의 분포는 유의적으로 늘어났으나 이 세포들이 M1 으로의 분화에 있어서는 PBS 군에 비해 증가하긴 하였으나 유의적이지 않았다. HBV polymerase inhibitor 인 3TC 는 세포 분포 및 분화 모두 차이를 보이지 않았다 (도 53).
12) 전체 HBV 야생주 유전체의 형질 주입 세포에서 HSP90의 blocking에 의한 PEP1 펩티드의 항바이러스 효과
PEP1은 HSP90을 매개로하여 셔틀(shuttle) 방식으로 세포 외부에서 내부로 세포막을 통과하는 것으로 알려져 있다. 이러한 기전을 근거로 HSP90의 활성을 차단하게 되면 세포 내에서 항바이러스 효과가 감소하는지 확인하기 위하여 본 연구에서는 HepG2 세포주에 전체 HBV 야생주 유전체를 일시적으로 형질 주입한 후, anti-GAPDH, anti-HSP(1 ug/ml, HSP90의 활성을 blocking)와 17-AAG (1 μM)을 1시간 동안 처리하고, 다시 PBS (0.5%), Entecavir(ETV, 30 nM), PEP1(5 μM)을 24시간 동안 처리한 후 상층액을 걷어서 PEG6000으로 바이러스를 precipitation하고 viral DNA를 추출하여 실시간 정량 PCR(real-time quantitative PCR)을 수행하여 항바이러스 효과를 관찰하였다. 모든 실험은 3회에 걸쳐서 독립적으로 진행되었으며, 통계학적인 유의성 검정은 one way ANOVA를 이용하여 Tukey’s Multiple Comparison Test를 통해서 실시하였다. ** p < 0.05는 PBS를 기준으로 비교하였고, ## p < 0.05는 None을 기준으로 비교하였다.
그 결과 아무것도 처리하지 않은 세포에 PEP1을 처리한 군에서는 PEP1에 의한 항바이러스 효과가 ETV 보다 통계적으로 유의하게 있었고, GAPDH를 blocking한 군에서도 마찬가지 결과를 보였으며 HSP90과 HSP90 inhibitor로 알려진 17-AAG를 처리한 군에서는 PEP1에 의한 항바이러스 효과가 통계적으로 유의하게 없어졌음을 확인하였다 (도 54). 반면 ETV의 항바이러스 효과는 아무것도 처리하지 않은 세포나 GAPDH, HSP90 혹은 17-AAG를 처리한 세포에서 모두 차이가 없는 것으로 확인되었다.
상기한 바와 같이, PEP1 펩티드에 의해 HBV 의 전사 과정에서 HBV enhancer 에 결합하여 enhacer의 활성을 증가시키는데 중요한 전사인자(transcription factor) 인 HNF4α 의 발현을 억제하여 HBV 의 HBsAg 과 virion 형성을 감소시키는 것을 확인하였다.
또한, PEP1는 간세포암 진행과정에서 중요한 ERK 와 JAK/STAT signal pathway 를 억제하여 HBV 증식을 억제함으로써 HBV 에 감염된 세포의 간세포암으로 진행을 막는데 중요한 역할을 함을 알 수 있다.
바이러스가 인체에 감염이 되면 이러한 바이러스에 대항하여 면역세포에서는 인터페론(INF)을 분비하는데, 특히 INFγ 는 인체 내에서 B형 간염 바이러스를 억제하는데 중요한 것으로 알려져 있어 HBV 감염 되었을 때의 면역 세포의 분포와 INFγ 분비 활성을 나타내는 면역 세포의 비율이 중요할 것이다. 본 발명의 PEP1 에 의해 전체 HBV W4P 변이주 유전체가 포함된 형질전환 마우스의 면역 세포 비율과 INFγ 사이토카인의 활성이 증가된 면역세포를 비교하였을 때 대조군인 PBS 처리 군과 차이가 없는 것으로 확인되었다. 이로써 HBV 에 감염된 인체에서는 PEP1 펩티드가 인체 내 면역 시스템을 조절하는 것 보다 ERK 나 JAK/STAT signal pathway 를 억제하거나 HBV enhancer 에 작용하는 transcription factor 인 HNFα 의 발현을 감소시킴으로서 HBV mRNA 의 합성을 억제하여 HBV 증식을 억제하는데 중요한 역할을 담당할 것으로 사료된다.
이와 같이 PEP1은 HBV에 대한 항바이러스 효과가 있음을 알 수 있으며, PEP1은 다수의 임상 시험을 통해 그 안정성이 이미 입증된 바 있다. 따라서, PEP1의 항HBV 효과는 간독성 및 신독성이 없는 안전하고 HBV 감염 질병 치료용 조성물 및 치료법을 제공할 수 있다.
상기 실시예들을 통하여 본 발명에 따른 펩티드인 PEP1 및 PEP1을 포함하는 조성물은 바이러스의 복제 억제효과 및 항바이러스 효과가 있음을 알 수 있었다. 이를 이용하여 바이러스 억제제 및 항바이러스 치료제의 개발 또는 바이러스 관련 질병의 예방 및 치료법을 제공한다.
<110> GEMVAX & KAEL CO., LTD. KIM, Sang Jae <120> A Peptide having anti-virus activity and the Composition Comprising the Same <130> OF16P109PCT <150> KR 10-2015-0094840 <151> 2015-07-02 <150> KR 10-2015-0115671 <151> 2015-08-17 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 1132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 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Claims (20)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 바이러스는 레트로바이러스과(Retroviridae family), 플라비바이러스과(Flaviviridae family), 또는 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae family)에 속하는 것인, 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 바이러스의 복제 억제, 전사 억제, 재활성화 억제, 항원 발현 억제, 및 비리온(Virion) 형성 억제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 의하여 바이러스를 억제하는 것인 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 HSP90을 매개로 하는 것인 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 바이러스는 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV), B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, HBV) 또는 인간면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)인 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 펩티드의 농도는 0.0001 내지 100 μM인 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 펩티드의 1일 투여량은 0.01㎍/kg/일 내지 10 g/kg/일인 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 표지물질과 컨쥬게이트된 형태로 포함되는 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질 또는 조영물질인 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 형광물질은 FITC인 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제1항, 제3항, 제4항, 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및
    바이러스성 질병의 예방 또는 치료방법이 기재된 지시서를 포함하는 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 키트로서,
    상기 바이러스는 레트로바이러스과(Retroviridae family), 플라비바이러스과(Flaviviridae family), 또는 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae family)에 속하는 것인, 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 바이러스성 질병의 예방 또는 치료방법은 상기 조성물을 바이러스성 질병에 걸렸거나 바이러스에 의한 병리학적 증상을 보이는 개체에 투여하는 것을 포함하는 바이러스성 질병의 예방 또는 치료방법인, 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 키트.
  20. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는 바이러스성 질병의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 바이러스는 레트로바이러스과(Retroviridae family), 플라비바이러스과(Flaviviridae family), 또는 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae family)에 속하는 것인, 바이러스성 질병의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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