CN102875657B - 一种制备端粒酶多肽疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，包括以下步骤：1)由Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和固相合成树脂为起始原料，反应得到Fmoc-L-Lys(Boc)-树脂；2)将Fmoc-L-Lys(Boc)-树脂采用Fmoc固相合成方法按GV1001的多肽序列顺序逐一偶联得到侧链基团保护的GV1001-树脂；3）采用裂解试剂裂解侧链基团保护的GV1001-树脂，加入沉淀试剂沉淀得到粗肽；粗肽经过纯化、冻干得到端粒酶多肽疫苗GV1001。本发明采用的制备端粒酶多肽疫苗GV1001的工艺方法具有实际的工业化应用前景和可观的经济实用价值。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域，尤其是涉及一种制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法。
背景技术
恶性肿瘤是一种威胁人类生命健康的常见病。目前的手术治疗、放射治疗、药物治疗等方法对一些恶性肿瘤的治疗效果不显著，治后副作用大。研究证实，端粒酶的激活、端粒长度的调节与肿瘤形成有密切的关系，在肿瘤治疗过程中具有高度的特异性。近年来对端粒酶表达与肿瘤形成和发展之间的关系有很多报道，以端粒酶为靶点的肿瘤治疗已经取得良好的进展。
1999年，世界专利WO00/02581公开了一系列包括GV1001在内的来自端粒酶的抗原多肽。GV1001分子结构式为：L-谷氨酰-L-丙氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-苏氨酰-L-丝氨酰-L-精氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-苯丙氨酰-L-异亮氨酰-L-脯氨酰-L-赖氨酸。GV1001是一种人工合成的端粒酶多肽疫苗，最初由丹麦Pharmexa公司研发，已证实可用于治疗胰腺癌、非小细胞性肺癌和肝细胞性肝癌，目前上述研究分别进入III期临床、II期临床和II期临床，在欧洲和美国均获得治疗胰腺癌的孤儿药地位。GV1001是目前唯一一种进入临床研究的基于端粒酶的HLA（人白细胞相关抗原）-II型多肽疫苗，能同时激活CD4+和CD8+响应。该多肽的结合域能结合多种基于端粒酶的HLA-II型分子和细胞毒T淋巴细胞表位。一些研究结果表明GV1001相关表位能自然的进行免疫原性反应。
目前国内外还没有关于GV1001合成工艺方法的详细报道，中国专利CN100376290C提出以固相合成、酶促裂解、重组表达等方法制备，列出了连续流固相肽合成法合成该多肽，采用五氟苯基酯、TBTU或DIC活化，清除剂采用95% TFA，但专利中仅仅简单介绍了一种通用的固相多肽合成方法，未提供详细的技术过程，未列出产品纯度、产率等重要数据。本专利首次详细批露该多肽的固相合成方法及相应的产品信息，优选采用TFA用量更小的切割试剂，对环境更为友好，该方法能用于工业化生产制备。
发明内容
本发明的目的在于提供一条适当的Fmoc固相合成法合成端粒酶多肽疫苗GV1001的路线，有利于工业化生产，成本低、操作方便、对环境影响小、收率高。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1) 由Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和固相合成树脂为起始原料，反应得到Fmoc-L-Lys(Boc)-树脂；
2) 将Fmoc-L-Lys(Boc)-树脂采用Fmoc固相合成方法按端粒酶多肽疫苗GV1001的多肽序列逐一偶联得到含侧链保护基团的GV1001-树脂；
3) 裂解含侧链保护基团的GV1001-树脂，纯化、冻干得到端粒酶多肽疫苗GV1001。
其中：所述固相合成树脂包括但不限于CTC树脂、WANG树脂或HMPA树脂。
所述固相合成树脂担载量为0.1 mmol/g-1.6 mmol/g，优选树脂担载量为0.5 mmol/g-1.0 mmol/g。
其中，所述的步骤1为：Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和CTC树脂在有机碱的作用下，在反应溶剂中生成Fmoc-L-Lys(Boc)-CTC树脂；所述的有机碱包括TMP、NMM或DIPEA；所述的反应溶剂包括NMP和/或DMF。
所述的步骤1也可以采用：Fmoc-L-Lys(Boc)-OH在催化剂和偶联剂存在下，在反应溶剂中和WANG树脂或HMPA树脂生成Fmoc-L-Lys(Boc)-WANG树脂或Fmoc-L-Lys(Boc)-HMPA树脂；所述的催化剂为DMAP，所述的偶联剂包括DCC、DIC、DBC、DCC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/有机碱、HBTU/HOBt/有机碱、TBTU/HOBt/有机碱或PyBOP/HOBt/有机碱；所述的反应溶剂包括NMP和/或DMF；所述的有机碱包括TMP、NMM或DIPEA。
所述的步骤2中，Fmoc-L-Lys(Boc)-树脂经过重复的脱保护及与各Fmoc保护氨基酸在反应溶剂中在偶联剂和有机碱的作用下偶联，生成侧链基团保护的GV1001-树脂；所述的偶联剂包括DCC/HOBt、DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/有机碱、HBTU/HOBt/有机碱、HATU/HOAt/有机碱或TBTU/HOBt/有机碱；所述的有机碱包括TMP、NMM或DIPEA；所述的反应溶剂包括NMP和/或DMF。Fmoc保护氨基酸依次为：Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH。
所述步骤3中，裂解含侧链保护基团的GV1001-树脂采用的裂解试剂为：TFA/H2O、TFA/H2O/TIS、TFA/thioanisole/anisole/EDT或TFA/thioanisole/H2O/phenol/EDT；优选体积比为90/5/3/2的TFA/thioanisole/anisole/EDT，或体积比为82.5/5/5/5/2.5的TFA/thioanisole/H2O/phenol/EDT。
更具体的，本发明所述的制备方法优选包括如下步骤：
所述的步骤1：将CTC树脂置于反应器中，经NMP和/或DMF洗涤溶胀；在相当于CTC树脂担载量0.5-2倍量的Fmoc-L-Lys(Boc)-OH中加入体积为足以溶解上述溶质的NMP和/或DMF，完全溶解后再加入相当于Fmoc-L-Lys(Boc)-OH用量4倍量的DIPEA，混合后一起投至反应器中反应0.5-10h，反应结束后产物经甲醇、NMP和/或DMF洗涤得Fmoc-L-Lys(Boc)-CTC树脂。
或所述的步骤1为：将WANG树脂或HMPA树脂置于反应器中，经NMP和/或DMF洗涤溶胀；在相当于WANG树脂或HMPA树脂担载量1.5-10倍量的Fmoc-L-Lys(Boc)-OH中加入相当于WANG树脂或HMPA树脂担载量1.5-10倍量的偶联剂，并加入体积为足以溶解上述溶质的NMP和/或DMF，完全溶解后加入反应器；并将相当于WANG树脂或HMPA树脂担载量0.01-0.2倍量的DMAP加至反应器中反应1-20h；所述的偶联剂包括DCC、DIC、DBC、DCC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/有机碱、HBTU/HOBt/有机碱、TBTU/HOBt/有机碱或PyBOP/HOBt/有机碱；所述的有机碱为TMP、NMM或DIPEA；反应结束后产物经甲醇、NMP和/或DMF洗涤得Fmoc-L-Lys(Boc)-WANG树脂或Fmoc-L-Lys(Boc)-HMPA树脂。
所述的步骤2为：将体积比1:4的哌啶NMP溶液加至Fmoc-L-Lys(Boc)-树脂中进行脱保护反应；产物经甲醇、NMP和/或DMF洗涤后加入混合均匀的相当于树脂用量1.5-10倍量的Fmoc-L-Pro-OH、足以溶剂各种溶质的反应溶剂及相当于树脂用量1.5-10倍量的偶联剂，反应1-10 h；反应结束后经甲醇、NMP和/或DMF洗涤产物；以其他Fmoc保护氨基酸取代Fmoc-L-Pro-OH重复进行上述操作最后得到侧链基团保护的GV1001-树脂；所述其他Fmoc保护氨基酸依次为：Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH；所述的偶联剂包括DCC/HOBt、DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/有机碱、HBTU/HOBt/有机碱、HATU/HOAt/有机碱或TBTU/HOBt/有机碱；所述的有机碱包括TMP、NMM或DIPEA；所述的反应溶剂包括NMP和/或DMF。
所述的步骤3为：向含侧链保护基团的GV1001-树脂中加入体积比为82.5/5/5/5/2.5的TFA/thioanisole/H2O/phenol/EDT的裂解试剂，冰浴反应0.1-1 h后，室温下继续搅拌反应1-10 h，然后抽滤。抽滤后将裂解试剂滤液利用旋转蒸发和/或N2气吹至无TFA溢出，加入沉淀试剂静置；离心分离沉淀的粗肽，粗肽经纯化、冻干得端粒酶多肽疫苗GV1001。
该步骤中，对含侧链保护基团的GV1001-树脂进行裂解、沉淀得到的粗肽，其沉淀试剂包括:乙醚、环己烷、石油醚、乙醚/石油醚（体积比为1:10-10:1）、乙醚/环己烷（体积比为1:10-10:1），优选乙醚或体积比为1:1的乙醚/石油醚，更优选冰乙醚。
所述端粒酶多肽疫苗GV1001是通过对含侧链保护基团的GV1001-树脂进行裂解，得到的粗肽经过高效液相色谱纯化、冻干得到。
此外，本发明中，缩略语的解释如下：
NMM：N-甲基吗啡啉。
DIC：N,N'-二异丙基碳二酰亚胺。
DCC：N,N'-二环己基碳二酰亚胺。
DBC：2,6-二氯苯甲酰氯。
HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐。
TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐。
HOBt：1-羟基苯并三氮唑。
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。
HOAt：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑。
DMAP：4-二甲氨基吡啶。
DMF：二甲基甲酰胺。
NMP：1-甲基-吡咯烷酮。
DCM：二氯甲烷。
TFA：三氟乙酸。
DIPEA：N,N-二异丙基乙基胺。
TMP：2,4,6-三甲基吡啶。
TIS：三异丙基硅烷。
Thioanisole：甲基苯基硫醚。
Anisole：苯甲醚。
EDT：1，2-乙二硫醇。
Phenol：苯酚。
h为时间单位:小时。
CTC树脂：
WANG树脂：
。
HMPA树脂：。
采用上述技术方案，本发明能够制备得到一种纯度84%的端粒酶多肽疫苗GV1001，此外，本发明制备采用了Fmoc固相合成方法，该方法首次批露了该多肽的合成方法，产物纯度达到84%，合成收率81%。具有广泛的应用前景和可观的经济实用价值。适宜工业化推广应用。
附图说明
图1 本发明实施例1所述制备方法反应路线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，由于篇幅所限，此处只列举了最具代表性的实施方式，虽然本发明所涉及的各反应条件及其具体参数未一一体现在具体实施方式中，但本领域技术人员依然可以预见，说明书中给出的各反应条件均能够实现本发明。
实施例1
如图1所示，本发明要求保护的制备方法包括如下步骤：
步骤一、
1、将10g担载量为0.6 mmol/g的CTC树脂置于反应器中，加入NMP洗涤两次，随后采用NMP溶胀1h。
2、称取2.81g Fmoc-L-Lys(Boc)-OH，加入50 ml NMP溶解，完全溶解后加入4.18 ml DIPEA，混合均匀后加入反应器中开始反应。
4、反应6h，结束反应。用NMP进行洗涤3次，DCM洗涤2次，甲醇洗涤2次，直接用于下一步氨基酸偶联。
步骤二、
1 、将体积比1:4的哌啶NMP溶液加至Fmoc-L-Lys(Boc)-CTC树脂中，进行脱保护反应，反应后产物用NMP进行洗涤3次，甲醇洗涤2次，DCM洗涤2次。
2、称取6.07 g Fmoc-Pro-OH，2.43g HOBt、6.83g HBTU，加入54ml NMP溶解，完全溶解后加入6.27ml DIPEA，混合均匀后加入反应器中开始反应。
3、反应4h结束反应。
4、反应结束，NMP进行洗涤3次，甲醇洗涤2次，DCM洗涤2次。
5、重复步骤二的1-4，按GV1001的多肽序列,以其他Fmoc保护氨基酸取代Fmoc-L-Pro-OH，逐个偶联氨基酸，依次完成Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH的偶联。
步骤三、
1、按TFA/thioanisole/H2O/phenol/EDT体积比为82.5/5/5/5/2.5配制裂解试剂，放置于4摄氏度冷藏保存。
2、称取抽干的10g含侧链保护基团的GV1001-CTC树脂至另一反应器中，加入50ml裂解试剂，冰浴反应0.5h后，室温下继续搅拌反应2h。
3、反应结束，抽滤裂解试剂，向滤液中倒入1L的冰乙醚，静置6h。
4、离心分离沉淀的粗肽，沉淀用冰乙醚洗涤3次，用体积百分数为0.1%的TFA的水溶液溶解，冷冻后置于冷冻干燥机上干燥至恒重，得白色粗肽3.41g，纯度84%，合成收率81%。
实施例2
如图1所示，本发明要求保护的制备方法包括如下步骤：
步骤一、
1、将10g担载量为1.0 mmol/g的WANG树脂置于反应器中，加入NMP洗涤两次，随后采用NMP溶胀1h。
2、称取28.8g Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、加入80ml NMP溶解，量取4.67mL DIC反应2h后加入反应器中，加入62mg DMAP开始反应。
4、反应6h，结束反应，NMP洗涤三次，量取3.8ml乙酸酐、3.3ml吡啶混于70ml NMP中，加入反应器中反应2h，用NMP进行洗涤3次，DCM洗涤2次，甲醇洗涤2次，直接用于下一步氨基酸偶联。
步骤二、
1 、将体积比1:4的哌啶NMP溶液加至Fmoc-L-Lys(Boc)-WANG树脂中，进行脱保护反应，反应后用NMP进行洗涤3次，DCM洗涤2次，甲醇洗涤2次。
2、称取10.1g Fmoc-Pro-OH、4.05g HOBt、11.4g HBTU，加入80ml NMP溶解，完全溶解后加入10.5ml DIPEA，混合均匀后加入反应器中开始反应。
3、反应1h结束反应。
4、反应结束，NMP进行洗涤3次，甲醇洗涤2次，DCM洗涤2次。
5、重复步骤二的1-4，按GV1001的多肽序列,以其他Fmoc保护氨基酸取代Fmoc-L-Pro-OH，逐个偶联氨基酸，依次完成Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH的偶联。
步骤三、
1、按TFA/thioanisole/H2O/phenol/EDT体积比为82.5/5/5/5/2.5配制裂解试剂，放置于4摄氏度冷藏保存。
2、称取抽干的10g含侧链保护基团的GV1001-WANG树脂至另一反应器中，加入50ml裂解试剂，冰浴反应0.5h后，室温下继续搅拌反应10h。
3、反应结束，抽滤裂解试剂，向滤液中倒入300mL的冰乙醚，静置6h。
4、离心分离沉淀的粗肽，沉淀用冰乙醚洗涤3次，用体积百分数为0.1%的TFA的水溶液溶解，冷冻后置于冷冻干燥机上干燥至恒重，得白色粗肽3.44g，纯度83%，合成收率75%。
实施例3
与实施例2相比，区别点仅在于，本实施例中固相合成树脂为担载量为0.1 mmol/g的HMPA树脂。
步骤1中采用的偶联剂为DIC/HOBt；反应溶剂为NMP/DMF，DMAP用量为12.5mg，反应时间1 h。步骤2中采用的偶联剂为HOAt和HATU，有机碱为DIPEA，相应保护氨基酸及偶联剂的用量为树脂担载量1.5倍量，反应时间10 h。步骤3中，裂解试剂为体积比为90/5/3/2的TFA/thioanisole/anisole/EDT。
本实施例所得产物纯度为63%，合成收率48%。
实施例4
与实施例2相比，区别点仅在于，本实施例中固相合成树脂为担载量为1.6 mmol/g的HMPA树脂。
步骤1中采用的偶联剂为HBTU/HOBt；有机碱为DIPEA，反应溶剂为DMF，DMAP用量为250mg，反应时间20h。步骤2中采用的偶联剂为DIC/HOBt，采用的相应保护氨基酸及偶联剂的用量为树脂担载量10倍量，反应时间1 h。
本实施例所得产物纯度为57%，合成收率52%。
实施例5
与实施例2相比，区别点仅在于，本实施例中固相合成树脂为担载量为0.5 mmol/g的HMPA树脂。
步骤1中采用的偶联剂为DCC/HOBt；反应溶剂为NMP/DMF，反应时间4 h。步骤2中采用的偶联剂为DCC，有机碱为TMP，相应保护氨基酸及偶联剂的用量为树脂担载量2倍量，反应时间8h。步骤3中，裂解试剂为体积比为90/5/3/2的TFA/thioanisole/anisole/EDT。
本实施例所得产物纯度为51%，合成收率48%。
实施例6
与实施例2相比，区别点仅在于，本实施例中固相合成树脂为担载量为0.8 mmol/g的WANG树脂。
步骤1中采用的偶联剂为DCC；反应溶剂为NMP，反应时间10h。步骤2中采用的偶联剂为HOBt和PyBOP，有机碱为NMM，采用的相应保护氨基酸及偶联剂的用量为树脂担载量10倍量，反应时间3 h。
本实施例所得产物纯度为53%，合成收率56%。
实施例7
与实施例2相比，区别点仅在于，本实施例中固相合成树脂为担载量为0.8 mmol/g的HMPA树脂。
步骤1中采用的偶联剂为HOAt和HATU，有机碱为DIPEA，反应溶剂为NMP/DMF，DMAP用量为60 mg，反应时间10 h。步骤2中采用的偶联剂为HOBt和TBTU，有机碱为DIPEA，相应保护氨基酸及偶联剂的用量为树脂担载量5倍量，反应时间4 h。步骤3中，裂解试剂为体积比为90/5/3/2的TFA/thioanisole/anisole/EDT。
本实施例所得产物纯度为76%，合成收率78%。
实施例8
与实施例2相比，区别点仅在于，本实施例中固相合成树脂为担载量为1.2 mmol/g的WANG树脂。
步骤1中采用的偶联剂为DBC；有机碱为DIPEA，反应溶剂为DMF，反应时间6 h。步骤2中采用的偶联剂为DIC，采用的相应保护氨基酸及偶联剂的用量为树脂担载量5倍量，反应时间5 h。
本实施例所得产物纯度为61%，合成收率58%。
实施例9
与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例中固相合成树脂为担载量为0.1 mmol/g的CTC树脂。
步骤1中采用的Fmoc-Lys(Boc)-OH用量为5.62g，DIPEA用量为8.36 mL；反应溶剂为NMP/DMF，反应时间0.5 h。步骤2中采用的偶联剂为HOAt和HATU，有机碱为NMM，相应保护氨基酸及偶联剂的用量为树脂担载量1.5倍量，反应时间10 h。步骤3中，裂解试剂为体积比为90/5/3/2的TFA/thioanisole/anisole/EDT。
本实施例所得产物纯度为73%，合成收率58%。
实施例10
与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例中固相合成树脂为担载量为1.6 mmol/g的CTC树脂。
步骤1中采用的Fmoc-Lys(Boc)-OH用量为1.40g；DIPEA用量为2.09 mL；反应溶剂为DMF，反应时间10 h。步骤2中采用的偶联剂为TBTU/HOBt，有机碱为TMP，采用的相应保护氨基酸及偶联剂的用量为树脂担载量10倍量，反应时间1 h。
本实施例所得产物纯度为66%，合成收率52%。
实施例11
与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例中固相合成树脂为担载量为1.0 mmol/g的CTC树脂。
步骤1中采用的Fmoc-Lys(Boc)-OH用量为2.80g；DIPEA用量为4.18 mL；反应溶剂为DMF，反应时间8 h。步骤2中采用的偶联剂为PyBOP/HOBt，有机碱为TMP，采用的相应保护氨基酸及偶联剂的用量为树脂担载量5倍量，反应时间3 h。
本实施例所得产物纯度为76%，合成收率72%。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1. 一种制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，包括以下步骤:
1) 由Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和固相合成树脂为起始原料，反应得到Fmoc-L-Lys(Boc)-树脂；
2) 将体积比1:4的哌啶NMP溶液加至Fmoc-L-Lys(Boc)-树脂中进行脱保护反应，产物经甲醇、NMP和/或DMF洗涤后加入混合均匀的相当于树脂担载量1.5-10倍量的Fmoc-L-Pro-OH、足以完全溶解各溶质的反应溶剂及相当于树脂担载量1.5-10倍量的偶联剂，反应1-10 h；反应结束后经甲醇、NMP和/或DMF洗涤产物；以其他Fmoc保护氨基酸取代Fmoc-L-Pro-OH重复进行上述操作最后得到侧链基团保护的GV1001-树脂；所述其他Fmoc保护氨基酸依次为：Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH；所述的偶联剂包括DCC、DIC、DBC、DCC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/有机碱、HBTU/HOBt/有机碱、TBTU/HOBt/有机碱或PyBOP/HOBt/有机碱；所述的有机碱为TMP、NMM或DIPEA；
3) 向含侧链保护基团的GV1001-树脂中加入体积比为90/5/3/2的TFA/thioanisole/anisole/EDT，或体积比为82.5/5/5/5/2.5的TFA/thioanisole/H2O/phenol/EDT的裂解试剂，冰浴反应0.1-1h后，室温下继续搅拌反应1-10h，然后抽滤，抽滤后将裂解试剂滤液利用旋转蒸发和/或N2气吹至无TFA溢出，加入沉淀试剂静置；离心分离沉淀的粗肽，粗肽经纯化、冻干得端粒酶多肽疫苗GV1001；
其中：所述固相合成树脂包括但不限于CTC树脂、WANG树脂或HMPA树脂；所述端粒酶多肽疫苗GV1001的序列为：H-L-Glu-L-Ala-L-Arg-L-Pro-L-Ala-L-Leu-L-Leu-L-Thr-L-Ser-L-Arg-L-Leu-L-Arg-L-Phe-L-Ile-L-Pro-L-Lys-OH。
2. 根据权利要求1所述制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，其特征在于：所述固相合成树脂的担载量为0.1 mmol/g-1.6 mmol/g。
3. 根据权利要求2所述制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，其特征在于：所述固相合成树脂的担载量为0.5 mmol/g-1.0 mmol/g。
4. 根据权利要求1所述制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，其特征在于：所述的步骤1中，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和CTC树脂在有机碱的作用下，在反应溶剂中生成Fmoc-L-Lys(Boc)-CTC树脂；所述的有机碱包括TMP、NMM或DIPEA；所述的反应溶剂包括NMP和/或DMF。
5. 根据权利要求1所述制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，其特征在于：所述的步骤1中，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH在催化剂和偶联剂存在下，在反应溶剂中和WANG树脂或HMPA树脂生成Fmoc-L-Lys(Boc)-WANG树脂或Fmoc-L-Lys(Boc)-HMPA树脂；所述的催化剂为DMAP，所述的偶联剂包括DCC、DIC、DBC、DCC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/有机碱、HBTU/HOBt/有机碱、TBTU/HOBt/有机碱或PyBOP/HOBt/有机碱；所述的反应溶剂包括NMP和/或DMF；所述的有机碱包括TMP、NMM或DIPEA。
6. 根据权利要求1或4所述制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，其特征在于：所述的步骤1为：将CTC树脂置于反应器中，经NMP和/或DMF洗涤溶胀；在相当于CTC树脂担载量0.5-2倍量的Fmoc-L-Lys(Boc)-OH中加入体积为足以溶解上述溶质的NMP和/或DMF，完全溶解后再加入相当于Fmoc-L-Lys(Boc)-OH用量4倍量的DIPEA，混合后一起投至反应器中反应0.5-10h，反应结束后产物经甲醇、NMP和/或DMF洗涤得Fmoc-L-Lys(Boc)-CTC树脂。
7. 根据权利要求1或5所述制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，其特征在于：所述的步骤1为：将WANG树脂或HMPA树脂置于反应器中，经NMP和/或DMF洗涤溶胀；在相当于WANG树脂或HMPA树脂担载量1.5-10倍量的Fmoc-L-Lys(Boc)-OH中加入相当于WANG树脂或HMPA树脂担载量1.5-10倍量的偶联剂，并加入体积为足以溶解上述溶质的NMP和/或DMF，完全溶解后加入反应器；并将相当于WANG树脂或HMPA树脂担载量0.01-0.2倍量的DMAP加至反应器中反应1-20h；所述的偶联剂包括DCC、DIC、DBC、DCC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/有机碱、HBTU/HOBt/有机碱、TBTU/HOBt/有机碱或PyBOP/HOBt/有机碱；所述的有机碱为TMP、NMM或DIPEA；反应结束后产物经甲醇、NMP和/或DMF洗涤得Fmoc-L-Lys(Boc)-WANG树脂或Fmoc-L-Lys(Boc)-HMPA树脂。
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