CN102229649B - 一种机体保护多肽(bpc 157肽)的制备方法 - Google Patents

一种机体保护多肽(bpc 157肽)的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种合成机体保护多肽(BPC 157肽)的方法，包括以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂或王树脂中的任何一种为起始原料，用DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt中的一种为缩合剂进行接肽反应，获得保护机体保护多肽(BPC 157肽)树脂，其后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得BPC 157粗品，再经C18(或C8)柱分离纯化，冷冻干燥后，制得机体保护多肽(BPC 157肽)纯品。该方法可用微波辐射以加快反应速度，缩短多肽合成周期，降低生产成本。本发明的方法制备的机体保护多肽(BPC 157肽)，具有原辅材料来源方便，工艺稳定，接肽收率高，质量可控，收率高，纯度高，生产成本低，周期短，可规模化生产等诸多优点，完全满足机体保护多肽(BPC 157肽)的应用要求。

Description

一种机体保护多肽(BPC 157肽)的制备方法
技术领域
本发明属于肽工程领域，具体涉及机体保护多肽(BPC 157肽)的制备方法，尤其适用于放大生产。
背景技术
BPC 157(body protection compound)为胃液肽(gastric juice peptide)的片段，由15个氨基酸组成，分子量1419。氨基酸序列为Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Ala-Asp-Asp-Ala-Gly-Leu-Val(甘-谷-脯-脯-脯-甘-赖-脯-丙-天冬-天冬-丙-甘-亮-缬)。BPC 157具有细胞保护、抗溃疡和抗炎作用，其作用和细胞保护、NO系统、细胞迁移有关[1-6]。
发明内容
本发明的目的是提供一种固相合成BPC157肽的制备方法，为机体保护多肽(BPC 157肽)的应用提供原料保障。包括手工固相多肽合成法和微波自动固相多肽合成法，以适用于放大生产。
本发明提供的技术方案具体为一种BPC157肽的固相制备方法，包括以下步骤：
以三苯氯甲基树脂为合成树脂，包括4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂或王氏树脂，以以上树脂中的任何一种为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护的氨基酸，获的保护的BPC157肽树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团，用DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt中的一种为缩合剂进行接肽反应，得保护的BPC157肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得BPC157肽粗品，并经C18或C8色谱柱进行分离纯化，获得所需的BPC157肽纯品。
更具体地，按照本发明，依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护BPC157肽树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团的方法包括以下步骤：
(1)制备Fmoe-Val-树脂：
选用三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂或王氏树脂中任一种树脂，用N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10～60分钟，混合物中，树脂的重量体积浓度为5-20ml/g；然后在上述的树脂中，加入DIEA、DIC或DMAP、Fmoc-Val-OH，10～50℃反应0.5～5小时，再加入封闭试剂甲醇、苯甲酰氯或吡啶10～50℃反应0.2-3小时，树脂用异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺洗涤，获得Fmoc-Val-树脂；
DIEA或DMAP的摩尔数为树脂的2～20倍；
Fmoc-Val-OH的摩尔数为树脂的1～10倍：
反应溶液中，树脂的浓度为0.1～5ml/g；
(2)制备Fmoc-Leu-Val-树脂：
在步骤(1)的Fmoc-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Leu-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Leu-Val-树脂；
所说的脱帽试剂的组分和体积比为：PIP∶DMF＝1∶2-5，下同；
Fmoc-Leu-OH的摩尔数为树脂的1-5倍；
Fmoc-Val-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
TBTU/HBTU/BOP的摩尔数为树脂的2-5倍；
HOBT/HOAT摩尔数为树脂的2-5倍；
(3)制备Fmoc-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(2)的Fmoc-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Leu-Val-树脂；
Fmoc-Gly-OH摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(4)制备Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(3)的Fmoc-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Ala-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；
Fmoc-Ala-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
其余操作以及工艺条件同上；
(5)制备Fmoc-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(4)的Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Asp(otBu)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；
Fmoc-Asp(otBu)-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
其余操作以及工艺条件同上；
(6)制备Fmoc-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(5)的Fmoc-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Asp(otBu)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；
Fmoc-Asp(otBu)-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
其余操作以及工艺条件同上；
(7)制备Fmoc-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(6)的Fmoc-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Ala-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；
Fmoc-Ala-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
其余操作以及工艺条件同上；
(8)制备Fmoc-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(7)的Fmoc-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Pro-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；
Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
其余操作以及工艺条件同上；
(9)制备Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(8)的Fmoc-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用洗涤异丙醇3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；
Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
其余操作以及工艺条件同上；
(10)制备Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(9)的Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂树脂；
Fmoc-Gly-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
其余操作以及工艺条件同上；
(11)制备Fmoc-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(10)的Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Pro-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；
Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
其余操作以及工艺条件同上；
(12)制备Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(11)的Fmoc-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Pro-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；
Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
其余操作以及工艺条件同上；
(13)制备Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(12)的Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Pro-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；
Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
其余操作以及工艺条件同上；
(14)制备Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(13)的Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Glu(otBu)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；
Fmoc-Glu(otBu)-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
其余操作以及工艺条件同上；
(15)制备Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂：
在步骤(14)的Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；
Fmoc-Gly-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
其余操作以及工艺条件同上；
(16)制备Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂
在步骤(15)的Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0.5～3小时，抽干，用氮气吹干树脂成很干的颗粒，所得到的树脂为Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；
(17)把吹干的Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20～10℃的切肽试剂(TFA/EDT/H2O/Thio＝90-95/2-5/2-5/1-5，体积比)，10℃-50℃反应1-5小时，过滤除去树脂，加-20～10℃的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用乙醚洗涤1～6次，低温冷冻干燥10～24小时，获得BPC157肽粗品；
切肽试剂中，树脂的浓度为8-12ml/g
按照本发明，粗品经C18或C8色谱柱纯化的方法包括如下步骤：
流动相有两种：A：0.1％三氟乙酸加99.9％水；B：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈；梯度洗脱；流速为1-150ml/min；检测波长为：215～285nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品。
在本文中，如未特别指出，“常温”表示室温，即25℃。
尽管理论上有DIC/DMAP或DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt或HUTC/HOAt或TBTU/HOBt等试剂可以选择，而且理论上也没有重大区别。但是令人意想不到的是，尽管小试阶段各试剂效果差异不显著，但是进入中试阶段(即，实验放大)，我们发现，相对于其他试剂组合，用TBTU/HOBt反应粗品纯度较好，小试试验粗品纯度达到78％以上，而中试批量生产粗品纯度也能在基本不降低产率的条件下达到75％，经过纯化的成品，纯度大于98％，不低于95％的药用纯度要求。
本发明的有益效果是：本发明的BPC157肽固相合成制备方法具有以下特点：原辅材料来源方便，工艺稳定，收率高，质量可控，产品纯度高，生产周期短，成本低，可规模化生产。采用本发明方法制备的BPC157肽极具市场竞争力，其生产规模完全能够满足BPC157肽的应用需求，其质量完全能够达到BPC157肽的应用要求。
另外，在本发明的工艺中，采用温和的Fmoc路线，每步脱Fmoc仅用20％的PIP，每步缩合反应时间短，大大缩短了生产周期；采用合理封闭技术，提高粗肽产品的纯度；切割采用TFA，避免了常用的氟化氢，减少了生产中产生的三废，有利于工业化生产。
前述过程中所采用的原料中英文列表如下：
Figure BSA00000488655100091
具体实施方式
实施例11g级别王氏树脂(WangResin)的BPC157肽合成过程
(1)制备Fmoe-Val-WangResin
称取王氏树脂1g(吉尔生化(上海)有限公司；Loadding：1.0mmol/g)倒入反应柱中，加入大约10mlDMF，浸泡30分钟(常温)后用真空泵抽干，加入Fmoc-Val-OH 3.4g，DIC0.7ml，DMAP0.1g，DMF10ml，于常温反应2小时，再加入封闭试剂苯甲酰氯0.6ml，吡啶0.4ml，DCM10ml常温反应0.5小时，树脂用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Val-WangResin；
(2)制备Fmoc-Leu-Val-WangResin
在步骤(1)的Fmoe-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Leu-OH 0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Leu-Val-WangResin；
(3)制备Fmoc-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(2)的Fmoc-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Gly-OH0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Leu-Val-WangResin；
(4)制备Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(3)的Fmoc-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Ala-OH0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(5)制备Fmoc-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(4)的Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Asp(otBu)-OH1.2g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(6)制备Fmoc-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(5)的Fmoc-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Asp(otBu)-OH1.1g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(7)制备Fmoc-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(6)的Fmoc-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Ala-OH0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(8)制备Fmoc-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(7)的Fmoc-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Pro-OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(9)制备Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(8)的Fmoc-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH1.1g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(10)制备Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(9)的Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Gly-OH0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(11)制备Fmoc-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(10)的Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Pro-OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(12)制备Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(11)的Fmoc-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Pro-OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(13)制备Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(12)的Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Pro-OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(14)制备
Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(13)的Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Glu(otBu)-OH1.1g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(15)制备
Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(14)的
Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Gly-OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(16)制备Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(15)的
Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡1小时，抽干，用氮气吹干树脂成干燥的颗粒，所得到的树脂为：
Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(17)制备粗品
把吹干的Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷的切肽试剂(TFA9.5ml，H2O0.5ml)，常温反应1.5小时，过滤除去树脂，加冰乙醚500ml沉淀，3500转3分钟离心收集沉淀物，用乙醚洗涤3次，用纯水溶解后，低温冷冻干燥24小时，获得BPC157肽粗品1.23g，经HPLC测定纯度为78％。
(18)纯化
将步骤(17)的BPC157肽粗品1.23g溶于13ml水中，过滤，滤液上样于C18色谱柱(Kromasil-C18，20mm*250mm，汉邦科技色谱公司)，流动相为如下A、B液体的混合物：A：0.1％三氟乙酸加99.9％水；B：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈。从A液体占混合物比例100％开始梯度洗脱，期间B液体占混合物比例逐渐升高，直至占100％，流速为10ml/min，检测波长为：215nm。收集目标峰(用相同条件下以实验室级别生产的少量纯品做对照指示目标峰)的流出液，浓缩冻干，获得成品，共获得成品0.69g(MW：1419.6)，经HPLC测定纯度大于98％。
实施例2中试规模的BPC157肽合成过程
参照实施例1的具体过程，所不同的是所有试剂直接放大20倍，即称取王氏树脂20g(Loadding：1.0mmol/g)进行反应，也以实施例1的TBTU/HOBt反应，制备树脂-肽接合物，切割制备粗肽，共得粗品24g，HPLC检测纯度为75％。按实施例1中的纯化方法纯化粗肽，色谱柱可用C18色谱柱(Kromasil-C18，30mm*250mm，汉邦科技色谱公司)，分多次上样，分别收集目标峰的流出液，最后合并，浓缩冻干，得成品13.6g，HPLC测定纯度大于98％，表明该技术条件可以直接放大生产。
参考文献
1.薛晓畅，吴勇杰，高明堂，李文广，赵宁，王增禄，颜真，张英起.十五肽BPC157对小型猪皮肤切割伤的保护作用研究.中国新药杂志，2004，13(7)：602-605
2.李雅娟.BPC157可治疗溃疡性结肠炎.国外药讯，2005，12：17-17
3.SikiP JeloN.十五肽BPC 157减弱慢性苯丙胺诱导的行为障碍.中国药理学 报：英文版，2002，23(5)：412-422
4.Hrelec M，Klicek R，Brcic L，Brcic I，Cvjetko I，Seiwerth S，Sikiric P.Abdominal aorta anastomosis in rats and stable gastricpentadecapeptide BPC 157，prophylaxis and therapy.J Physiol Pharmacol.2009，60 Suppl 7：161-5.
5.Ilic S，Drmic D，Zarkovic K，Kolenc D，Coric M，Brcic L，Klicek R，Radic B，Sever M，Djuzel V，Ivica M，Boban Blagaic A，Zoricic Z，Anic T，Zoricic I，Djidic S，Romic Z，Seiwerth S，Sikiric  P.High hepatotoxicdose of paracetamol produces generalized convulsions and brain damage inrats.A counteraction with the stable gastric pentadecapeptide BPC 157(PL 14736).J Physiol Pharmacol.2010，61(2)：241-50.
6.Chang CH，Tsai  WC，Lin MS，Hsu YH，Pang JH.The promoting effect ofpentadecapeptide BPC 157 on tendon healing involves tendon outgrowth，cell survival，and cell migration.J Appl Physiol.2011，110(3)：774-80.Epub 2010 Oct 28.

Claims (1)

1.制备BPC157肽的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备Fmoe-Val-WangResin
称取王氏树脂1g；Loading：1.0mmol／g，倒入反应柱中，加入10mlDMF，常温浸泡30分钟后用真空泵抽干，加入Fmoc-Val-OH 3.4g，DIC0.7ml，DMAP0.1g，DMF10ml，于常温反应2小时，再加入封闭试剂苯甲酰氯0.6ml, 吡啶0.4ml, DCM10ml常温反应0.5小时，树脂用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Val-WangResin；   
    (2)制备Fmoc-Leu-Val-WangResin
    在步骤(1)的Fmoe-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Leu-OH 0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Leu-Val-WangResin；
   (3)制备Fmoc-Gly-Leu-Val-WangResin
    在步骤(2)的Fmoc-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Gly-OH0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Leu-Val-WangResin；
    (4)制备Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
   在步骤(3)的Fmoc-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Ala-OH0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
    (5)制备Fmoc-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
   在步骤(4)的Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Asp(otBu)-OH1.2g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
 (6)制备Fmoc-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(5)的Fmoc-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Asp(otBu)-OH1.1g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(7)制备Fmoc- Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(6)的Fmoc-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Ala-OH0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(8)制备Fmoc-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(7)的Fmoc-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Pro-OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(9)制备Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(8)的Fmoc-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Lys(Boc)-OH1.1g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(10)制备Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(9)的Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Gly-OH0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
 (11)制备Fmoc-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(10)的Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Pro-OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
 (12)制备Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(11)的Fmoc-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Pro-OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
 (13)制备Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(12)的Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Pro-OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(14)制备Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(13)的Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Glu(otBu)-OH1.1g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
 (15)制备Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(14)的Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Gly -OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(16) 制备Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin
在步骤(15)的Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡1小时，抽干，用氮气吹干树脂成干燥的颗粒，所得到的树脂为：Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin；
(17)制备粗品
把吹干的Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-WangResin倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷的切肽试剂，即TFA9.5ml，H2O0. 5ml，常温反应1.5小时，过滤除去树脂，加冰乙醚500ml沉淀，3500转3分钟离心收集沉淀物，用乙醚洗涤3次，用纯水溶解后，低温冷冻干燥24小时，获得BPC157肽粗品；
（18）纯化
将步骤（17）的BPC157肽粗品1.23g溶于13ml水中，过滤，滤液上样于C18色谱柱，即 Kromasil-C18，20mm *250mm，流动相为如下A、B液体的混合物：A：0.1%三氟乙酸加99.9%水；B：0.1%三氟乙酸加99.9%乙腈；从A液体占混合物比例100%开始梯度洗脱，期间B液体占混合物比例逐渐升高，直至占100%，流速为10ml／min，检测波长为： 215nm；用相同条件下以实验室级别生产的少量纯品做对照指示目标峰，收集目标峰的流出液，浓缩冻干，获得成品。
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