CN1733796A

CN1733796A - 胸腺五肽合成工艺方法

Info

Publication number: CN1733796A
Application number: CN 200510060558
Authority: CN
Inventors: 叶善明; 施傅涛; 俞通泰; 翁士乔
Original assignee: NINGBO HORMONE PRODUCT CO Ltd
Current assignee: NINGBO HORMONE PRODUCT CO Ltd
Priority date: 2005-08-30
Filing date: 2005-08-30
Publication date: 2006-02-15

Abstract

本发明公开了一种胸腺五肽合成工艺方法，属于生物化学领域中多肽技术领域，其以Fmoc－Tyr(tBu)－Wang resin为起始原料，然后用保护氨基酸Fmoc－Val－OH、Fmoc－Asp(otBu)－OH、Fmoc－Lys(Boc)－OH依次接二肽、三肽和四肽，其特征在于其后以保护氨基酸Boc－Arg－OH·HCl接五肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得胸腺五肽粗品。该方法不仅保证了合成的效率，又简化了工艺、大大降低了成本。

Description

胸腺五肽合成工艺方法

技术领域

本发明涉及生物化学领域中多肽的合成方法，具体说是涉及胸腺五肽合成工艺方法。

背景技术

胸腺激素是由胸腺所分泌的一族多肽类蛋白质激素。这类激素在个体发育和免疫系统功能调节方面起着至关重要的作用。胸腺生成素(Thymopoientin)是由胸腺上皮细胞分泌的激素之一，1974年由Goldsfein G从牛胸腺中分离并确定其一级结构，1979年Goldsfein G通过固相合成胸腺生成素的片段，证明其主要活性中心为胸腺五肽，其结构为精氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸(Tyr-Val-Asp-Lys-Arg)。

多肽合成法分液相合成法与固相合成法。在液相合成法中，每次接肽以后都需要对产物分离纯化或结晶以便除去未反应的原料和副产物(如中国专利申请03134355.4公开的“一种胸腺五肽液相合成法”中所描述)，这个步骤相当费时间而且麻烦，因操作带来的损失往往也很大。固相合成法是以液相合成法为基础的，由于在液相合成法中最普遍采用的是以羧基活化的方式进行接肽，因此在固相合成法中也采用过量的活化羧基组分以促使缩合反应接近于完全，而过量的羧基组分和副产物可以通过过滤和洗涤的方法很容易地除去。这样既克服了液相合成法的费时和烦琐，又降低了由操作带来的损失，具有方便、快捷、操作简单、产率高的优势。在国内外，Fmoc固相合成法已被广泛用于各种性能多肽的合成，具有反应条件温和、副反应少及产率高等优点。现有的技术认为固相合成法必须全部采用Fmoc保护AA(氨基酸)或Boc保护AA，事实上也确实全部采用同一保护基保护的AA为原料，但Fmoc固相合成法中所采用的原料Fmoc-Arg(Pdf)-OH的价格非常昂贵，直接导致胸腺五肽产品的价格也居高不下，因而很有必要对现有的Fmoc固相合成法加以研究改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种固相合成胸腺五肽的新工艺方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该胸腺五肽合成工艺方法，其以Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin为起始原料，然后用保护氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH依次接二肽、三肽和四肽，其特征在于其后以保护氨基酸Boc-Arg-OH·HCl接五肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得胸腺五肽粗品。

所述切肽的步骤如下：以所述起始原料Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin为10克计，用80～150ml裂解试剂充分裂解合成好的五肽中间体，去掉Boc基及侧链保护基，同时把五肽从树脂resin中裂解下来；所述的裂解试剂的体积组成为：三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巯基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶4.5～6.0∶5∶2.2～3.0∶3.5～5.5。

所述后处理步骤如下：先过滤收集滤液，然后用三氟醋酸搅拌洗涤滤渣，再过滤，合并滤液，将滤液于40～50℃条件下蒸发浓缩，往浓缩物中加入无水乙醚至沉淀充分，过滤收集沉淀，用无水乙醚充分洗涤沉淀，干燥所得沉淀即得胸腺五肽粗品。

所述接肽(包括接二肽、三肽、四肽及五肽)的步骤如下：

a、脱帽：以六氢吡啶/DMF溶液为脱帽剂，脱去Fmoc保护基，然后以DMF溶液充分洗涤，洗干净副产物；

b、接肽：将用于接肽的保护氨基酸溶于DMF中，加入TBTU及HOBT，摇匀，再加入N-甲基吗啡啉的DMF溶液作为接肽液，摇匀并充分反应；

c、洗涤：以DMF溶液充分洗涤，洗干净副产物及过量的羧基组分。

所述TBTU的用量为：TBTU与所述Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin的质量比为5.0～5.5∶10。

所述HOBT的用量为：HOBT与所述Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin的质量比为2.0～2.5∶10。

所述N-甲基吗啡啉的DMF溶液的用量为：以所述起始原料Fmoc-Tyr(tBu)-Wangresin为10克计，N-甲基吗啡啉的DMF溶液的用量为12～18ml，浓度为0.8～1.2mmol/L。

所述六氢吡啶/DMF溶液的浓度为六氢吡啶占溶液体积的18～25％。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、用Boc-Arg-OH·HCl的接肽效果要略好于现有Fmoc固相合成法所采用的Fmoc-Arg(Pdf)-OH的接肽效果；

2、用Boc-Arg-OH·HCl代替Fmoc-Arg(Pdf)-OH后，Boc-Arg-OH·HCl的胍基采用质子保护，对接肽无影响；

3、Boc基在切肽过程中去除，而现有Fmoc固相合成法在切肽之前需先脱除Fmoc基，因而本发明方法相对于现有方法来说可省略去Fmoc基这一反应，简化了制备工艺。

4、本发明方法中采用的Boe-Arg-OH·HCl的价格远低于Fmoc-Arg(Pdf)-OH的价格，后者的价格为前者价格的5倍以上。因此用Boc-Arg-OH·HCl代替Fmoc-Arg(Pdf)-OH后，不仅保证了合成的效率，又简化了工艺、降低了成本。

5、接肽时添加HOBT后，虽然粗制品的重量未有明显增加，但粗制品的有效成分含量大幅提高，可从未添加时的37wt％提高到57wt％，效果非常明显。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例

1.试验方法

1.1原料和辅料规格标准(见表1)

表1

1.2设备及仪器

1.2.1恒温摇床

1.2.2SHB-3型循环水真空泵

1.2.3Waters高效液相色谱仪

1.3合成方法

1.3.1脱帽：将10g Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin放入灯泡瓶中，加入20V/V％六氢吡啶/DMF溶液，室温振摇灯泡瓶10分钟，脱去Fmoc保护基。

1.3.2洗涤：用100ml DMF溶液，室温振摇灯泡瓶2分钟，倒掉灯泡瓶内液体，重复洗涤三次，洗干净副产物。

1.3.3接肽：羧基组分(接肽用原料，即保护氨基酸)溶于DMF中，加入5.2gTBTU，2.3HOBT，摇匀，再加入15ml接肽液(1mmol/L N-甲基吗啡啉的DMF溶液)，加入至灯泡瓶中，摇匀，将灯泡瓶放入摇床振摇，反应1小时，完成接肽工作。

1.3.4洗涤：用100ml DMF溶液洗涤4次，洗干净副产物及过量羧基组分。再重复脱帽、洗涤、接肽和洗涤后逐个延长肽链至五肽。

1.3.5切肽：在合成好五肽中间体的灯泡瓶中加入100ml裂解试剂(三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巯基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶5∶5∶2.5∶5)，用玻璃磨口塞密闭，放入摇床振摇3小时，去掉侧链保护基，同时把五肽从树脂中裂解下来。

1.3.6后处理：取出灯泡瓶，用布氏漏斗过滤收集滤液；将漏斗内树脂用20ml的三氟醋酸搅拌洗涤，继续过滤；重复洗涤一次，合并滤液；将滤液放入旋转蒸发器浓缩瓶中，于45℃水浴条件下浓缩至10ml，取下浓缩瓶，将500ml无水乙醚加入漏斗中，搅拌洗涤沉淀，过滤；重复洗涤一次，收集沉淀，置表面皿中，真空干燥过夜即得胸腺五肽的粗制品。

2.试验结果

2.1添加HOBT时粗制品产率的影响

采用上述1.3合成方法，以Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin(以下简称resin)为起始原料，然后用保护氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boe)-OH及Boc-Arg-OH·HCl依次接二肽、三肽、四肽和接五肽，研究添加HOBT对反应的影响，试验结果见表2、表3：

表2未添加HOBT试验结果

表3添加HOBT试验结果

2.2不同接肽时间对粗制品的影响

采用上述1.3合成方法，在添加HOBT情况下，对1.3.3的接肽时间进行调整，分别采用0.5h、1.0h、2.0h、4.0h进行试验，试验结果见表4：

表4不同接肽时间试验结果

2.3Fmoc-Arg(Pdf)-OH与Boc-Arg-OH·HCl用于制备胸腺五肽的对比试验

采用上述1.3合成方法，在添加HOBT、接肽反应时间为1.0h情况下，进行合成试验，试验结果见表5、表6。

表5Boc-Arg-OH·HCl试验结果

表6Fmoc-Arg(Pdf)-OH试验结果

从以上试验结果可知：

(1)、从表2、表3试验结果来看，添加HOBT后，粗制品重量未有明显增加，但粗制品有效成分含量大幅提高，从未添加时的37wt％(平均)提高到57wt％，效果很明显。这是因为HOBT起催化剂作用，能活化羧基组分(接肽用原料，即保护氨基酸)，有效提高肽键的缩合率。

(2)、从表4的情况来看，接肽时间超过1小时后，对粗制品的重量和有效成分含量影响不大。

(3)、从表5、表6情况来看，用Boc-Arg-OH·HCl的接肽效果与现有Fmoc固相合成法所采用的Fmoc-Arg(Pdf)-OH的接肽效果基本相当，且前者要略好于后者。用Boc-Arg-OH·HCl代替Fmoc-Arg(Pdf)-OH后，Boc-Arg-OH·HCl的胍基采用质子保护，对接肽无影响；Boc基在切肽过程中去除，而现有Fmoc固相合成法在切肽之前需先脱除Fmoc基，因而本发明方法相对于现有方法来说可省略去Fmoc基这一步反应，简化了制备工艺。从生产成本上来分析，Fmoc-Arg(Pdf)-OH的价格相当于Boc-Arg-OH·HCl的价格的5倍以上。因此用Boc-Arg-OH·HCl代替Fmoc-Arg(Pdf)-OH后，不仅保证了合成的效率，又简化了工艺、降低了成本。

3.在前述试验的基础上，对Boc-Arg-OH·HCl的用量、裂解试剂的用量及组成、接肽时TBTU及HOBT的用量、N-甲基吗啡啉的DMF溶液的用量及浓度以及六氢吡啶/DMF溶液的浓度对试验结果的影响进行了研究，在不同条件下制备胸腺五肽粗品，各制备例如下(以下用量均以Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin用量为10g计)：

制备例1.

采用上述1.3合成方法，其中脱帽剂六氢吡啶/DMF溶液浓度为18V/V％，接肽时TBTU用量为5.0g，HOBT用量为2.0g，接肽液N-甲基吗啡啉的DMF溶液用量为12ml，浓度为1.2mmol/L，Boc-Arg-OH·HCl的摩尔用量为Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin摩尔用量的2倍，接肽反应时间为1h；切肽用裂解试剂用量为80ml，质量组成为：三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巯基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶6.0∶5∶3.0∶3.5。结果制得胸腺五肽粗品8.6g，有效成分含量为56.3％。

制备例2.

采用上述1.3合成方法，其中脱帽剂六氢吡啶/DMF溶液浓度为25V/V％，接肽时TBTU用量为5.5g，HOBT用量为2.3g，接肽液N-甲基吗啡啉的DMF溶液用量为18ml，浓度为0.8mmol/L，Boc-Arg-OH·HCl的摩尔用量为Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin摩尔用量的2.5倍，接肽反应时间为75min；切肽用裂解试剂用量为150ml，质量组成为：三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巯基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶4.5∶5∶2.2∶5.5。结果制得胸腺五肽粗品9.3g，有效成分含量为51.8％。

制备例3.

采用上述1.3合成方法，其中脱帽剂六氢吡啶/DMF溶液浓度为22V/V％，接肽时TBTU用量为5.3g，HOBT用量为2.5g，接肽液N-甲基吗啡啉的DMF溶液用量为16ml，浓度为1.0mmol/L，Boc-Arg-OH·HCl的摩尔用量为Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin摩尔用量的1.8倍，接肽反应时间为1h；切肽用裂解试剂用量为120ml，质量组成为：三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巯基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶5.5∶5∶2.5∶4.5。结果制得胸腺五肽粗品8.3g，有效成分含量为61.3％。

制备例4.

采用上述1.3合成方法，其中脱帽剂六氢吡啶/DMF溶液浓度为20V/V％，接肽时TBTU用量为5.2g，HOBT用量为2.2g，接肽液N-甲基吗啡啉的DMF溶液用量为15ml，浓度为1.0mmol/L，Boc-Arg-OH·HCl的摩尔用量为Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin摩尔用量的2.0倍，接肽反应时间为1h；切肽用裂解试剂用量为100ml，质量组成为：三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巯基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶5.0∶5∶2.5∶4.0。结果制得胸腺五肽粗品8.7g，有效成分含量为57.6％。

Claims

1、一种胸腺五肽合成工艺方法，其以Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin为起始原料，然后用保护氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH依次接二肽、三肽和四肽，其特征在于其后以保护氨基酸Boc-Arg-OH·HCl接五肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得胸腺五肽粗品。

2、根据权利要求1所述的胸腺五肽合成工艺方法，其特征在于所述切肽的步骤如下：以所述起始原料Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin为10克计，用80～150ml裂解试剂充分裂解合成好的五肽中间体，去掉Boc基及侧链保护基，同时把五肽从树脂resin中裂解下来；所述的裂解试剂的体积组成为：三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巯基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶4.5～6.0∶5∶2.2～3.0∶3.5～5.5。

3、根据权利要求1所述的胸腺五肽合成工艺方法，其特征在于所述后处理步骤如下：先过滤收集滤液，然后用三氟醋酸搅拌洗涤滤渣，再过滤，合并滤液，将滤液于40～50℃条件下蒸发浓缩，往浓缩物中加入无水乙醚至沉淀充分，过滤收集沉淀，用无水乙醚充分洗涤沉淀，干燥所得沉淀即得胸腺五肽粗品。

4、根据权利要求1或2或3所述的胸腺五肽合成工艺方法，其特征在于所述接肽的步骤如下：

5、根据权利要求4所述的胸腺五肽合成工艺方法，其特征在于所述TBTU的用量为：TBTU与所述Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin的质量比为5.0～5.5∶10。

6、根据权利要求4所述的胸腺五肽合成工艺方法，其特征在于所述HOBT的用量为：HOBT与所述Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin的质量比为2.0～2.5∶10。

7、根据权利要求4所述的胸腺五肽合成工艺方法，其特征在于所述N-甲基吗啡啉的DMF溶液的用量为：以所述起始原料Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin为10克计，N-甲基吗啡啉的DMF溶液的用量为12～18ml，浓度为0.8～1.2mmol/L。

8、根据权利要求4所述的胸腺五肽合成工艺方法，其特征在于所述六氢吡啶/DMF溶液的浓度为六氢吡啶占溶液体积的18～25％。