CN103288923A - 醋酸胸腺五肽规模化制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽制备领域，特别涉及胸腺五肽规模化制备方法。采用如下步骤：获得Tyr-树脂；以氨基酸为第一原料，取Tyr-树脂经第一逐步偶联进行第一批次固相合成，获得第一肽片段-树脂，分别收集逐步偶联的反应液备用；以反应液为第二原料，取Tyr-树脂经第二逐步偶联进行第二批次固相合成，获得第二肽片段-树脂；补充氨基酸作为第三原料，取Tyr-树脂经第三逐步偶联进行第三批次固相合成，获得第三肽片段-树脂；合并第一肽片段-树脂、第二肽片段-树脂和第三肽片段-树脂，裂解，纯化即得。该方法的氨基酸利用率达到67.8%以上，显著提高了氨基酸利用率。
Description
技术领域
本发明涉及多肽制备领域，特别涉及醋酸胸腺五肽规模化制备方法。
背景技术
胸腺五肽是胸腺分泌物的一种，胸腺生成素Ⅱ的有效部分。胸腺生成素Ⅱ是从胸腺激素中分离出来的单一多肽化合物，由49个氨基酸组成，而其中由5个氨基酸组成的肽链片段，却有着与胸腺生成素II相同的全部生理功能，所以就把这个五肽片段称为胸腺五肽。
胸腺五肽由精氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、缬氨酸、酪氨酸五种氨基酸组成。其化学名称为N-〔N-〔N-〔NL-精氨酰-L-赖氨酰〕-L-α-天冬氨酰〕-L-缬氨酰〕-L-酪氨酸。分子式：C30H49N9O9。分子量：679.77。
胸腺五肽的作用之一是诱导T细胞分化。它可选择性地诱导Thy-1-的前胸腺细胞转化为Thy-1+的T细胞。其T细胞分化作用由胞内cAMP水平升高介导。胸腺五肽的另一基本作用是对成熟外周血T细胞的特异受体结合，使胞内cAMP水平上升，从而诱发一系列胞内反应，这也是它免疫调节功能的基础。在正常机体状态下胸腺五肽显现免疫刺激作用，能显著增高脾淋巴细胞的E玫瑰花结形成率及转化率，对免疫应答的初次或再次反应的不同阶段都有增强作用，能增多IgM类型和IgG或IgA类型的抗体形成细胞。胸腺五肽还可增强巨噬细胞的吞噬功能，增加多形核嗜中性白细胞的酶和吞噬功能，升高循环抗体含量，增强红细胞免疫功能。胸腺五肽能活化CD4和CD8阳性细胞，使专一的Tc细胞寿命维持更长时间，同时也可活化Th细胞，诱导Ts细胞的功能。胸腺五肽的抗感染力和治疗作用与它增进TC细胞活性相关。在抗感染免疫中适量胸腺五肽可明显增加干扰素的产生。诱导和促进T细胞分化成熟；调节T淋巴细胞亚群比例使CD4/CD8趋于正常；增强巨噬细胞吞噬功能；增强红细胞免疫功能；提高自然杀伤细胞的活力；提高白介素-2的产生水平与受体表达水平；增强外周血单核细胞γ干扰素的产生；增强血清中SOD活性。可用于恶性肿瘤病人经放化疗后，免疫功能损伤者；乙型肝炎的治疗；重大外科手术及严重感染；自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎，红斑狼疮；Ⅱ型糖尿病、更年期综合征；年老体衰免疫功能低下者。
目前胸腺五肽的制备方法成本较高，特别是氨基酸和溶剂的利用率较低，尤其是液相法合成中溶剂使用量大，规模化生产对场地和人员的要求较高，难以实现工业化大生产。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种醋酸胸腺五肽规模化制备方法。该制备方法利用多批次固相合成，设计了合适套用规模，能够利用收集密闭保存的反应多余氨基酸，氨基酸利用率达到67.8%以上。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种醋酸胸腺五肽的规模化制备方法，包括如下步骤：
步骤1：获得Tyr-树脂；
步骤2：以氨基酸为第一原料，取Tyr-树脂经第一逐步偶联，逐步偶联Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Boc-Arg(Pbf)-OH，进行第一批次固相合成，获得第一肽片段-树脂，分别收集逐步偶联的反应液作为第一反应液，备用；
步骤3：以第一反应液为第二原料，取Tyr-树脂经第二逐步偶联，逐步偶联Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Boc-Arg(Pbf)-OH，进行第二批次固相合成，获得第二肽片段-树脂树脂，分别收集第二逐步偶联的反应液作为第二反应液，备用；
步骤4：取所述第二反应液并补充氨基酸作为第三原料，取Tyr-树脂经第三逐步偶联，逐步偶联Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Boc-Arg(Pbf)-OH，进行第三批次固相合成，获得第三肽片段-树脂；
步骤5：合并第一肽片段-树脂、第二肽片段-树脂和第三肽片段-树脂，裂解，纯化、成盐即得；
第一批次固相合成、第二批次固相合成与第三批次固相合成的物质的量的比为1:0.5～0.8:0.3～0.5。
作为优选，本发明提供的醋酸胸腺五肽的规模化制备方法中，步骤4中补充氨基酸的物质的量与第三批次固相合成的物质的量的比为1:1。
作为优选，本发明提供的醋酸胸腺五肽的规模化制备方法中，步骤1中第一原料的物质的量与第一批次固相合成的物质的量的比为2～5:1。
作为优选，本发明提供的醋酸胸腺五肽的规模化制备方法中，步骤1中偶联剂为HOBt和DIC。
作为优选，本发明提供的醋酸胸腺五肽的规模化制备方法中，步骤4中偶联剂为HOBt和DIC。
作为优选，本发明提供的醋酸胸腺五肽的规模化制备方法中，步骤5中裂解所用裂解试剂为TFA与H2O的混合物，其中TFA与H2O的体积比为95:5。
作为优选，本发明提供的醋酸胸腺五肽的规模化制备方法中，步骤5中纯化采用RP-HPLC方法进行纯化。
本发明提供的醋酸胸腺五肽的规模化制备方法采用如下步骤：获得Tyr-树脂；以氨基酸为第一原料，取Tyr-树脂经第一逐步偶联进行第一批次固相合成，获得第一肽片段-树脂，分别收集第一逐步偶联的反应液作为第一反应液，备用；以第一反应液为第二原料，取Tyr-树脂经第二逐步偶联进行第二批次固相合成，获得第二肽片段-树脂树脂，分别收集第二逐步偶联的反应液作为第二反应液，备用；取第二反应液并补充氨基酸作为第三原料，取Tyr-树脂经第三逐步偶联进行第三批次固相合成，获得第三肽片段-树脂；合并第一肽片段-树脂、第二肽片段-树脂和第三肽片段-树脂，裂解，纯化，转盐即得；第一批次固相合成、第二批次固相合成与第三批次固相合成的物质的量的比为1:0.5～0.8:0.3～0.5。本发明提供的醋酸胸腺五肽的制备方法条件比较温和，氨基酸可以重复套用，氨基酸利用率达到67.8%以上，较常规合成方法氨基酸利用率20～50%具有显著差异，显著提高了氨基酸利用率，达到节省成本的目的。
附图说明
图1示实施例6制备的胸腺五肽粗肽的HPLC谱图；
图2示实施例6制备的胸腺五肽精肽的HPLC谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种醋酸胸腺五肽规模化制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的醋酸胸腺五肽规模化制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂的合成
称取王树脂25g，替代度为1.20mmol/g,加入到反应柱中。加入DMF，溶胀30min。抽干。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH27.6g，HOBt8.9g，加入80mL DMF，冰水浴下加入10.3mLDIC，活化3分钟，加入到反应柱中，在加入0.7gDMAP，室温反应2小时，抽掉反应液，DMF洗涤树脂3次，加入预配好的含有70mL醋酸酐和60mL吡啶封闭液封闭2小时，抽调封闭液，DMF洗涤6次，甲醇收缩，抽干得到Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂26.8g，测得替代度为1.08mmol/g。
实施例2：Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂的合成
称取王树脂50g，替代度为0.6mmol/g,加入到反应柱中。加入DMF，溶胀30min。抽干。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH27.6g，HOBt8.9g，加入80mL DMF，冰水浴下加入10.3mLDIC，活化3分钟，加入到反应柱中，在加入0.7gDMAP，室温反应2小时，抽掉反应液，DMF洗涤树脂3次，加入预配好的含有70mL醋酸酐和60mL吡啶封闭液封闭2小时，抽调封闭液，DMF洗涤6次，甲醇收缩，抽干得到Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂51.7g，测得替代度为0.52mmol/g。
实施例3：第一批次固相合成
称取替代度为1.08mmol/g Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂92.6g（100mmol），加入到反应柱中。加入DMF，溶胀30min。抽干。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取101.8g Fmoc-Val-OH（300mmol）和44.6g HOBt（330mmol）用600mL DMF溶解，冰水浴下加入51.3mL DIC（330mmol）活化3分钟后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽掉反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Val-OH反应液，备用。
称取123.6g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（300mmol）和44.6g HOBt（330mmol）用600mL DMF溶解，冰水浴下加入51.3mL DIC（330mmol）活化3分钟后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽掉反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Asp(OtBu)-OH反应液，备用。
称取140.6g Fmoc-Lys(Boc)-OH（300mmol）和44.6g HOBt（330mmol）用600mL DMF溶解，冰水浴下加入51.3mL DIC（330mmol）活化3分钟后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽掉反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Lys(Boc)-OH反应液，备用。
称取158g Boc-Arg(Pbf)-OH（300mmol）和44.6g HOBt（330mmol）用600mL DMF溶解，冰水浴下加入51.3mL DIC（330mmol）活化3分钟后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽掉反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次，二氯甲烷洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到第一肽片段-树脂178.2g，树脂增重率为95.8%。偶联反应后，收集Boc-Arg(Pbf)-OH反应液，备用。
实施例4：第二批次固相合成
称取替代度为1.08mmol/g Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂55.6g（60mmol），加入到反应柱中。加入DMF，溶胀30min。抽干。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液120mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
将实施例3得到的Fmoc-Val-OH反应液，冰水浴3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Val-OH反应液，备用。
将实施例3得到的Fmoc-Asp(OtBu)-OH反应液，冰水浴3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Asp(OtBu)-OH反应液，备用。
将实施例3得到的Fmoc-Lys(Boc)-OH反应液，冰水浴3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Lys(Boc)-OH反应液，备用。
将实施例3得到的Boc-Arg(Pbf)-OH反应液，冰水浴3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次，二氯甲烷洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到第二肽片段-树脂102.3g，增重率为91.7%。偶联反应后，收集Boc-Arg(Pbf)-OH反应液，备用。
实施例5：第三批次固相合成
称取替代度为1.08mmol/g Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂46.3g（50mmol），加入到反应柱中。加入DMF，溶胀30min。抽干。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液120mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取17.1g Fmoc-Val-OH（50mmol）和7.43g HOBt（55mmol），加入实施例4得到的Fmoc-Val-OH反应液，补加DIC8.5mL，冰水浴活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取21.3g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（50mmol）和7.43g HOBt（55mmol），加入实施例4得到的Fmoc-Asp(OtBu)-OH反应液，补加DIC8.5mL，冰水浴活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取23.4g Fmoc-Lys(Boc)-OH（50mmol）和7.43g HOBt（55mmol），加入实施例4得到的Fmoc-Lys(Boc)-OH反应液，补加DIC8.5mL，冰水浴活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取26.3g Boc-Arg(Pbf)-OH（50mmol）和7.43g HOBt（55mmol），加入实施例4得到的Boc-Arg(Pbf)-OH反应液，补加DIC8.5mL，，冰水浴活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次，二氯甲烷洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到第三肽片段-树脂86.5g，增重率为93.1%。
实施例6：醋酸胸腺五肽的制备
将实施例3第一批次固相合成的第一肽片段-树脂、实施例4第二批次固相合成的第二肽片段-树脂、实施例5第三批次固相合成的第三肽片段-树脂合并得到367g加入到5L圆底烧瓶中，加入预配好的裂解液（TFA：H2O=95：5）3670mL，室温反应2.5小时，滤掉树脂，树脂用200mLTFA洗涤，滤液合并，加入到4L冰乙醚中析出白色沉淀，离心，乙醚洗涤固体，真空干燥，得到胸腺五肽粗肽143.6g，粗肽收率103.7%，HPLC纯度96.2%，如图1所示。
所得粗肽经过HPLC纯化，转盐，冻干，得到醋酸胸腺五肽79.2g，总收率57.2%，如图2所示。
实施例7：第一批次固相合成
称取替代度为1.08mmol/g Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂92.6g（100mmol），加入到反应柱中。加入DMF，溶胀30min。抽干。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取169.7g Fmoc-Val-OH（500mmol）和74.3g HOBt（550mmol）用600mL DMF溶解，冰水浴下加入85.6mL DIC（550mmol）活化3分钟后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽掉反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Val-OH反应液，备用。
称取206.3g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（500mmol）和74.3g HOBt（550mmol）用600mL DMF溶解，冰水浴下加入85.6mL DIC（550mmol）活化3分钟后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽掉反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Asp(OtBu)-OH反应液，备用。
称取234.5g Fmoc-Lys(Boc)-OH（500mmol）和74.3g HOBt（550mmol）用700mL DMF溶解，冰水浴下加入85.6mL DIC（550mmol）活化3分钟后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽掉反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Lys(Boc)-OH反应液，备用。
称取312.9g Boc-Arg(Pbf)-OH（500mmol）和74.3g HOBt（550mmol）用900mL DMF溶解，冰水浴下加入85.6mL DIC（550mmol）活化3分钟后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽掉反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次，二氯甲烷洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到第一肽片段-树脂182.3g，树脂增重率为98.0%。偶联反应后，收集Boc-Arg(Pbf)-OH反应液，备用。
实施例8：第二批次固相合成
称取替代度为1.08mmol/g Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂74.1g（80mmol），加入到反应柱中。加入DMF，溶胀30min。抽干。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
将实施例7得到的Fmoc-Val-OH反应液，冰水浴3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Val-OH反应液，备用。将实施例8得到的Fmoc-Asp(OtBu)-OH反应液，冰水浴3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Asp(OtBu)-OH反应液，备用。
将实施例7得到的Fmoc-Lys(Boc)-OH反应液，冰水浴3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Lys(Boc)-OH反应液，备用。
将实施例7得到的Boc-Arg(Pbf)-OH反应液，冰水浴3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次，二氯甲烷洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到第二肽片段-树脂142.2g，增重率为96.3%。偶联反应后，收集Boc-Arg(Pbf)-OH反应液，备用。
实施例9：第三批次固相合成
称取替代度为1.08mmol/g Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂46.3g（50mmol），加入到反应柱中。加入DMF，溶胀30min。抽干。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取17.1g Fmoc-Val-OH（30mmol）和7.43g HOBt（55mmol），加入实施例8得到的Fmoc-Val-OH反应液，补加DIC8.5mL，冰水浴活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取21.3g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（50mmol）和7.43g HOBt（55mmol），加入实施例8得到的Fmoc-Asp(OtBu)-OH反应液，补加DIC8.5mL，冰水浴活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取23.4g Fmoc-Lys(Boc)-OH（50mmol）和7.43g HOBt（55mmol），加入实施例8得到的Fmoc-Lys(Boc)-OH反应液，补加DIC8.5mL，冰水浴活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取26.3g Boc-Arg(Pbf)-OH（50mmol）和7.43g HOBt（55mmol），加入实施例8得到的Boc-Arg(Pbf)-OH反应液，补加DIC8.5mL，，冰水浴活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次，二氯甲烷洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到第三肽片段-树脂86.5g，增重率为93.1%。
实施例10：醋酸胸腺五肽的制备
将实施例7第一批次固相合成的第一肽片段-树脂、实施例8第二批次固相合成的第二肽片段-树脂、实施例9第三批次固相合成的第三肽片段-树脂合并得到411g加入到5L圆底烧瓶中，加入预配好的裂解液（TFA：H2O=95：5）4110mL，室温反应2.5小时，滤掉树脂，树脂用200mLTFA洗涤，滤液合并，加入到4L冰乙醚中析出白色沉淀，离心，乙醚洗涤固体，真空干燥，得到胸腺五肽粗肽164.7g，粗肽收率105.3%，HPLC纯度96.1%。
所得粗肽经过HPLC纯化，转盐，冻干，得到醋酸胸腺五肽90.1g，总收率57.6%。
实施例11：第一批次固相合成
称取替代度为1.08mmol/g Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂92.6g（100mmol），加入到反应柱中。加入DMF，溶胀30min。抽干。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取67.9g Fmoc-Val-OH（200mmol）和29.7g HOBt（220mmol）用300mL DMF溶解，冰水浴下加入34.2mL DIC（220mmol）活化3分钟后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽掉反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Val-OH反应液，备用。
称取82.5g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（200mmol）和29.7g HOBt（220mmol）用300mL DMF溶解，冰水浴下加入34.2mL DIC（220mmol）活化3分钟后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽掉反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Asp(OtBu)-OH反应液，备用。
称取93.8g Fmoc-Lys(Boc)-OH（200mmol）和29.7g HOBt（220mmol）用300mL DMF溶解，冰水浴下加入34.2mL DIC（550mmol）活化3分钟后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽掉反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Lys(Boc)-OH反应液，备用。
称取125g Boc-Arg(Pbf)-OH（200mmol）和29.7g HOBt（550mmol）用600mL DMF溶解，冰水浴下加入34.2mL DIC（550mmol）活化3分钟后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽掉反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次，二氯甲烷洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到第一肽片段-树脂176.5g，树脂增重率为94.7%。偶联反应后，收集Boc-Arg(Pbf)-OH反应液，备用。
实施例12：第二批次固相合成
称取替代度为1.08mmol/g Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂46.3g（50mmol），加入到反应柱中。加入DMF，溶胀30min。抽干。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
将实施例11得到的Fmoc-Val-OH反应液，冰水浴3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Val-OH反应液，备用。
将实施例11得到的Fmoc-Asp(OtBu)-OH反应液，冰水浴3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Asp(OtBu)-OH反应液，备用。
将实施例11得到的Fmoc-Lys(Boc)-OH反应液，冰水浴3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。偶联反应后，收集Fmoc-Lys(Boc)-OH反应液，备用。
将实施例11得到的Boc-Arg(Pbf)-OH反应液，冰水浴3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次，二氯甲烷洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到第二肽片段-树脂88.6g，增重率为95.3%。偶联反应后，收集Boc-Arg(Pbf)-OH反应液，备用。
实施例13：第三批次固相合成
称取替代度为1.08mmol/g Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂37.0g（40mmol），加入到反应柱中。加入DMF，溶胀30min。抽干。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液80mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取13.6g Fmoc-Val-OH（40mmol）和5.94g HOBt（44mmol），加入实施例12得到的Fmoc-Val-OH反应液，补加DIC6.84mL，冰水浴活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取16.5g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（40mmol）和5.94g HOBt（44mmol），加入实施例12得到的Fmoc-Asp(OtBu)-OH反应液，补加DIC6.84mL，冰水浴活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取18.8g Fmoc-Lys(Boc)-OH（30mmol）和5.94g HOBt（44mmol），加入实施例12得到的Fmoc-Lys(Boc)-OH反应液，补加DIC6.84mL，冰水浴活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，脱保护5和10分钟，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂有颜色。
称取25g Boc-Arg(Pbf)-OH（30mmol）和5.94g HOBt（44mmol），加入实施例12得到的Boc-Arg(Pbf)-OH反应液，补加DIC6.84mL，冰水浴活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1小时。下同），反应结束后，抽调反应液，密封备用；树脂用DMF洗涤树脂3次，二氯甲烷洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到第三肽片段-树脂69.3g，增重率为93.1%。
实施例14：醋酸胸腺五肽的制备
将实施例11第一批次固相合成的第一肽片段-树脂、实施例12第二批次固相合成的第二肽片段-树脂、实施例13第三批次固相合成的第三肽片段-树脂合并得到334.4g加入到5L圆底烧瓶中，加入预配好的裂解液（TFA：H2O=95：5）3340mL，室温反应2.5小时，滤掉树脂，树脂用200mL TFA洗涤，滤液合并，加入到4L冰乙醚中析出白色沉淀，离心，乙醚洗涤固体，真空干燥，得到胸腺五肽粗肽130.6g，粗肽收率101.2%，HPLC纯度96.1%。
所得粗肽经过HPLC纯化，转盐，冻干，得到醋酸胸腺五肽73.4g，总收率56.9%，。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种醋酸胸腺五肽的规模化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得Tyr-树脂；
步骤2：以氨基酸为第一原料，取所述Tyr-树脂经第一逐步偶联进行第一批次固相合成，获得第一肽片段-树脂，分别收集所述第一逐步偶联的反应液作为第一反应液，备用；
步骤3：以所述第一反应液为第二原料，取所述Tyr-树脂经第二逐步偶联进行第二批次固相合成，获得第二肽片段-树脂，分别收集所述第二逐步偶联的反应液作为第二反应液，备用；
步骤4：取所述第二反应液并补充氨基酸作为第三原料，取所述Tyr-树脂经第三逐步偶联进行第三批次固相合成，获得第三肽片段-树脂；
步骤5：合并所述第一肽片段-树脂、所述第二肽片段-树脂和所述第三肽片段-树脂，裂解，纯化、成盐即得；
所述第一批次固相合成、所述第二批次固相合成与所述第三批次固相合成的物质的量的比为1:0.5～0.8:0.3～0.5。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述补充氨基酸的物质的量与所述第三批次固相合成的物质的量的比为1:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述第一原料的物质的量与所述第一批次固相合成的物质的量的比为2～5:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述第一逐步偶联采用的偶联剂的物质的量与所述第一批次固相合成的物质的量的比为4.4～11.0:1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述第三逐步偶联采用的偶联剂的物质的量与所述第三批次固相合成的物质的量的比为22:10。
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