CN102775471A

CN102775471A - 固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法

Info

Publication number: CN102775471A
Application number: CN2012102738726A
Authority: CN
Inventors: 徐红岩; 沈永刚
Original assignee: Binhai Gl Peptide Co Ltd; Shanghai GL peptide Ltd; Glbetter Biochemical (shanghai) Co Ltd
Current assignee: Binhai Gl Peptide Co Ltd; Shanghai GL peptide Ltd; Glbetter Biochemical (shanghai) Co Ltd
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2032-08-03
Also published as: CN102775471B

Abstract

本发明涉及八肽胆囊收缩素的制备方法，尤其涉及固相法和液相法相结合合成八肽胆囊收缩素的方法。主要解决现有合成方法存在中间产物分离麻烦、制备周期长且反应中容易产生副产物、成本高、产率较低等技术问题。技术方案为：合成方法包括以下步骤：1）液相法合成L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺；2）固相法合成八肽胆囊收缩素全保护片段；3）弱酸切割全保护片段；4)液相缩合全保护片段和二肽片段得到全保护八肽胆囊收缩素；5）切割：将全保护八肽胆囊收缩素加入切割液切割，然后加入冰乙醚沉淀得到八肽胆囊收缩素粗品；6）粗品通过高相液相色谱纯化，制备，旋蒸，冻干得到八肽胆囊收缩素精品。本发明用于八肽胆囊收缩素的制备。

Description

固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法

技术领域

本发明涉及八肽胆囊收缩素（辛卡利特包括醋酸盐、三氟乙酸盐）的制备方法，尤其涉及固相法和液相法相结合合成八肽胆囊收缩素的方法。

背景技术

八肽胆囊收缩素，也称：辛卡利特，英文名：Sincalide

结构式：H-ASP-TYR(SO3H)-MET-GLY-TRP-MET-ASP-PHE-NH2

Figure 2012102738726100002DEST_PATH_IMAGE001

分子式及分子量：C49H62N10O16S3； 1143.27

性质：又称缩胆促胰素，肠促胰酶素，胆囊收缩素，胰酶分泌素。猪上部十二指肠黏膜提取而得的单链多肽激素。由33个氨基酸组成。一种消化道激素，刺激胰腺外分泌腺分泌和生长，也在饱感，痛觉及神经传导等方面具有作用。由十二指肠、空肠、回肠的M[I]细胞分泌。

辛卡利特是一种八肽胆囊收缩素（CCK），具有整个胆囊收缩素的全部生物活性，且活性要比一般的强2-10倍。胰腺功能不足的病人和胃素瘤患者血浆CCK浓度增高，此外，CCK还参与中枢神经系统的发病。近年来合成的辛卡利特被广泛应用于诊断胆囊和胰腺的功能。辛卡利特的制备方法分为酶法和化学法两种。

1.酶解法

酶解法合成是嗜热菌蛋白酶，以木瓜蛋白酶和ａ-胰凝乳蛋白酶等酶系多酶联用，采用片段缩合的方法合成辛卡利特，其中一些氨基酸原料的制备以多肽保护剂的脱除任然需要化学法辅助才能完成。此类方法主要参见以下文献：美国国家科学院进展 Kullmann W. Protease-catalyzed peptide synthesis of the carboxy-terminal octapeptide of Cholecystokinin. Proc Natl Acad Sci USA, 1982,79:2840; 世界药物化学专利Chem.Pharm.Bull.1988,36:3915; 捷克斯洛伐克化学期刊Collection Czechoslvak Chem. Commum.1988,53:1086等。酶解法存在的主要问题是：单纯的酶解法不能完成辛卡利特的合成，需要联用化学方法才可以合成出目的产物;酶解法涉及酶制剂种类比较多（如木瓜蛋白酶，嗜热菌蛋白酶和ａ-胰凝乳蛋白酶），且酶制剂价格昂贵，不易得；酶解法生产属于液相合成范畴，中间产物分离困难，而且制备周期长。因而目前辛卡利特的生产已经不在使用酶解法，取而代之的是用化学合成的方法。

2. 化学合成法

化学合成法可以用固相合成多肽序列在上磺酸化，可采用液相缩合片段，然后上磺酸化的方式，或者合成磺酸化多肽序列后切割脱除肽链保护基团的方法。此类方法主要参见以下文献：药物化学杂志（Journal of Medicinal Chemistry）,1970,13(3):349-352; Pept.: Struct. Funct., Proc. Am. Pept. Symp., 9th. 1985, 241-244; 多肽蛋白研究国际杂志（International Journal of Peptide ＆ Protein Research）, 1991, 38(6): 555-561; 生物化学杂志， 1991， 7（4）：436-440；中国药物化学杂志。 1993，(1):39-41; 多肽蛋白研究国际杂志（International Journal of Peptide ＆ Protein Research），1994,43(2):190-200。当前化学法中存在的主要问题是：合成后再磺酸化的方法属于液相合成范畴，操作步骤多，中间产物分离麻烦，制备周期长，且反应中容易产生副产物导致辛卡利特产率大大下降；一般的固相合成，原料选择特殊，成本价格高，还有正常的TFA切割氨基树脂，对多肽链上的磺酸脂键不稳定，容易断裂，导致部分分解，产率和纯度也有一定的下降。

发明内容

本发明的目的是提供一种固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，主要解决现有合成方法存在中间产物分离麻烦、制备周期长且反应中容易产生副产物、成本高、产率较低等技术问题。

本发明技术方案如下：固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其具体包含以下步骤：

1）.液相法合成H-Asp(otbu)-Phe-NH₂：将Boc-Phe-OH用有机溶剂溶解，然后C端酰胺化得到Boc-Phe-NH₂,再和Fmco-Asp(otbu)-OH加激活试剂反应，反应得到Fmoc-Asp(otbu)-Phe-NH₂,然后用哌啶脱Fmoc,萃取，旋蒸，结晶得到H-Asp(otbu)-Phe-NH₂，纯度98%以上。

2）.固相法合成八肽胆囊收缩素全保护片段树脂：将Fmoc-Met-OH用有机溶剂溶解加到CTC Resin中，再加有机碱，室温反应2-3小时，完毕后，用甲醇封闭，用布氏漏斗过滤氨基酸树脂，再用DMF、DCM、甲醇依次洗涤收缩。把做完的树脂放倒固相反应器中，溶胀，然后加脱保护液脱保护（Fmoc），然后洗涤，加入片段的第二个具有Fmoc保护基团的氨基酸和激活试剂反应，控温22℃-32℃反应1-2个小时, 凯撒试验检测，反应完全后，脱Fmoc保护，依次往下偶联，最后得到八肽胆囊收缩素全保护片段树脂：Boc-Asp(otbu)-Tyr(SO₃H)-Met-Gly-Trp-Met-CTC Resin。

3）.弱酸切割全保护片段：往Boc-Asp(otbu)-Tyr(SO₃H)-Met-Gly-Trp-Met-CTC Resin中加入适量的弱酸切割液，室温切割，得到八肽胆囊收缩素全保护片段。

4) .液相缩合全保护片段和二肽片段得到全保护八肽胆囊收缩素：Boc-Asp(otbu)-Tyr(SO₃H)-Met-Gly-Trp-Met-OH与之前的H-Asp(otbu)-Phe-NH₂，再加HOBt以及NMM和DIEA中的一种，冰浴下搅拌，加入缩合剂，反应后撤掉冰浴，室温搅拌过夜反应（16-24小时）后得到全保护八肽胆囊收缩素。

5）.切割：将全保护八肽胆囊收缩素加入切割液低温切割，然后加入冰乙醚沉淀得到八肽胆囊收缩素粗品。

6）．粗品通过高相液相色谱纯化，制备，旋蒸，冻干得到八肽胆囊收缩素精品：采用C18类型的反相分离设备纯化八肽胆囊收缩素粗品。

步骤1）溶剂为THF(四氢呋喃)，C端酰胺化反应是用NMM(N-甲基吗啡啉)作为有机碱，然后滴加氯甲酸乙脂作为羧基活化试剂，然后加氨水即可反应得到。所述的激活试剂为DIC和HOBT的混合试剂。

步骤2）所述CTC Resin，是二氯三苯基树脂，属于一种弱酸就能被切割的选择性树脂，用替代度在：0.9-1.2mmol/g,所用的有机溶剂为二氯甲烷，并需要脱水处理，所用的有机碱为DIEA。物质的量投料比为：Fmoc-Met-OH: CTC Resin: DIEA=0.6:1:2.5；最后制得Fmoc-Met-CTC Resin 的替代度在：0.65-0.80mmol/g。

固相合成八肽胆囊收缩素片段肽树脂，所述的脱保护液为质量百分含量为20%的哌啶和N,N-二甲基甲酰胺，反应时间为5min+15min。

步骤2）所述：

固相法合成八肽胆囊收缩素全保护片段，所用到的是具有Fmoc保护基团的氨基酸，分别为：Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(SO₃H,Na)-OH、Boc-Asp(otbu)-OH,激活试剂可选择有：DIC/HOBT、HBTU/HOBT、TBTU/HOBT或PYBOP/HOBT混合试剂中的一种，偶联反应需加有机碱：N,N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啡啉。

步骤2）所述：

在固相法合成八肽胆囊收缩素全保护片段时，一次偶联反应完毕和脱Fmoc保护后，都需要用凯撒试验（Kaiser Test）检测，Kaiser Test为三种溶剂：A: 质量百分含量为5%茚三酮乙醇溶液、B：质量百分含量为80%的苯酚乙醇溶液、C：重蒸吡啶。

步骤3）所述：

切割全保护多肽用弱酸溶液为：质量百分含量为1%的TFA的二氯甲烷溶液或者醋酸:三氟乙醇:二氯甲烷体积比=2:2:6的混合液。

步骤4）所述：

全保护片段和二肽片段液相缩合用的缩合试剂为DCC。

步骤5）所述：

切割液：TFA:TIS:H₂O体积比=95:3:2，切割需要低温冰浴控制在0-10℃。

步骤6）所述：粗品经C18柱分离纯化的方法包括如下步骤：

将八肽胆囊收缩素粗品用水溶解，过滤，滤液经C18色谱柱纯化，流动相有两种：A：质量百分含量为0.1%TFA+质量百分含量为99.9%ACN；B：质量百分含量为0.1%TFA+质量百分含量为99.9%H₂O；梯度：25%~35%；流速为20ml/min，检测波长为220nm，然后转醋酸盐，悬蒸浓缩小体积冻干，获得成品。

本发明的有益效果是：与已有的技术相比，本发明的八肽胆囊收缩素合成工艺路线有以下特点：反应条件温和，环境污染小，反应操作简单，后处理容易，原料投入少，成本低，收率高，具备规模化生产能力，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，，质量稳定，生产成本低，极具市场竞争力，每步接肽收率可以达到95%以上。具有极为可观的经济实用价值和广泛的应用前景。从而解决了传统的酶解法和液相法，制备周期长，工序繁琐，酸解产生的副产物多等问题，同时也解决了一般固相合成的，原料特殊，生产成本昂贵的问题。切割采用TFA，避免使用氟化氢，大大减少了三废，有利于工业化生产。同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。

前述过程中所采用的原料缩写的中文释义列表如下：

序号	英文名	中文名
			1	DIC	N，N-二异丙基碳化二亚胺
2	HOBt	1-羟基-苯并-三氮唑
			3	DMF	二甲基甲酰胺
4	DCM	二氯甲烷
			5	TFA	三氟乙酸
6	TIS	三已丙基硅烷
			7	THF	四氢呋喃
8	ClCOOET	氯甲酸乙脂
			9	CTC Resin	二氯三苯基树脂
10	ACN	乙腈
			11	DIEA	N,N-二异丙基乙胺
12	AC	醋酸
			13	TFE	三氟乙醇
14	NMM	N-甲基吗啡啉
			15	PYBOP	六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
16	HBTU	苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
			17	TBTU	O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
18	DCC	二环己基碳二亚胺
			19	Boc-Phe-OH	N-(叔丁氧羰基)-L-苯基丙氨酸
20	Fmoc-Asp(otbu)-OH	芴甲氧羰基-天冬氨酸-4-叔丁脂
			21	Fmoc-Met-OH	N-(9芴甲氧羰基)-蛋氨酸
22	Fmoc-Trp-OH	N-(9芴甲氧羰基)-色氨酸
			23	Fmoc-Gly-OH	N-(9芴甲氧羰基)-甘氨酸
24	Fmoc-Tyr(SO₃H)-OH.Na	N-(9芴甲氧羰基)-酪氨酰磺酸钠盐

具体实施方式

实施例1 液相法合成：H-Asp(otbu)-Phe-NH₂

取265g Boc-Phe-OH倒入圆底烧瓶中，然后加300ml THF(四氢呋喃)把其溶解，加133ml NMM，低温，慢慢滴加114ml 的ClCOOET,并不断搅拌，滴完以后，抽离，把沉淀过滤出来，然后收集滤液，往滤液中滴加77ml 氨水，室温反应40min,加250ml水,蒸干THF，然后加250ml的乙酸乙酯萃取目的产物，萃取3次，然后把滤液旋干，加300ml TFA脱Boc,室温1小时，加1500ml 冰乙醚沉淀，过滤，正空干燥器中抽干得到固体：H-Phe-NH₂, 152g,把H-Phe-NH₂倒入圆底烧瓶中，加入379g Fmoc-Asp(otbu)-OH,然后用200ml DMF 溶解，加入17.3ml DIC，15g HOBT。室温，搅拌反应过夜反应，完毕后加250ml乙酸乙酯萃取,然后用石油醚洗涤，浓缩，蒸干，然后加质量百分浓度为20%的哌啶脱Fmoc,再用乙酸乙酯萃取，浓缩，蒸干得到：H-Asp(otbu)-Phe-NH₂, 281g 收率：90.6%，纯度：98.4%。

实施例2 制备Fmoc-Met-CTC Resin

将25gFmoc-Met-OH用用200ml的DCM溶解加到加到2000ml的固相反应器中，再加入50gCTC Resin，然后滴加60ml的DIEA，用氮气鼓吹反应2小时，完毕后，加500ml的甲醇封闭30分钟，用布氏漏斗过滤氨基酸树脂，再用DMF、DCM、甲醇依次洗涤收缩三次；

采用替代度为0.3mmol/g的CTC Resin作为原始树脂反应。得到Fmoc-Met-CTC Resin 检测替代度为0.2mmol/g，这样完成同样摩尔数生产过程消耗树脂，溶剂等量都大，不经济也不利于环保，不宜采用；采用替代度1.5mmol的CTC Resin进行反应，得到Fmoc-Met-CTC Resin 检测替代度为0.9 mmol/g，虽然完成同样摩尔数的生产过程消耗的树脂和溶剂会少，但是替代度高，空间位阻会大，影响每个氨基酸的偶联率，最终得到粗品的纯度也会下降25%左右，使得下游纯化收率也相应的下降45%。本实施例更为优先选用替代度为0.9mmol/g的CTC Resin，得到替代度为0.65mmol/g Fmoc-Met-CTC Resin。

实施例3制备Fmoc-Met-CTC Resin

选用替代度为1.0mmol/g的CTC Resin，反应需加有机碱N,N-二异丙基乙胺，其余与实施例2相同, 最后制得Fmoc-Met-CTC Resin 的替代度在：0.75mmol/g。

实施例4制备Fmoc-Met-CTC Resin

选用替代度为1.2mmol/g的CTC Resin，反应需加有机碱N,N-二异丙基乙胺，其余与实施例2相同, 最后制得Fmoc-Met-CTC Resin 的替代度在： 0.80mmol/g。

实施例5 固相法制备八肽胆囊收缩素全保护片段

取30g Fmoc-Met-CTC Resin,(0.65mmol/g,20mmol),加入到2L的固相玻璃反应器中，然后加DCM,浸泡树脂，溶胀0.5小时，然后抽干，DMF洗涤一次，然后加质量百分浓度为20%的哌啶的DMF溶液，脱Fmoc保护，5+15分钟各两次，中间用DMF洗涤一次，脱完保护后，用DMF洗涤6次，将17g Fmoc-Trp-OH (60mmol),22.8g HBTU(60mmol),8.1g HOBT(60mmol),加入到固相反应器中，然后用DMF溶解，再加入20ml DIEA(120mmol),温控22℃，氮气鼓吹反应1小时(反应终止以茚三酮检测无色透明为准)。重复上述步骤，依次完成,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Tyr(SO3H)-OH,Boc-Asp(otub)-OH,等剩余氨基酸的连接，连完最后一个氨基酸Boc-Asp(otub)-OH后，用DMF洗涤3遍，DCM洗涤3遍，甲醇洗涤3遍抽干收缩。然后放在真空干燥器中干燥过夜，第二天称八肽胆囊收缩素全保护片段树脂重量为：40.2g,(树脂增重率为：92.08%) ；

把40.2g全保护八肽胆囊收缩素片段树脂放到2L的圆底烧瓶中，配置切割液400ml（4ml的TFA,396ml的DCM），然后将切割液倒入到树脂中，室温搅拌反应2小时，然后用砂芯漏斗过滤树脂，用少量的DMC洗涤树脂，并合并收集滤液，然后滴加DIEA，调pH值到中性，然后悬蒸，真空干燥得到胶状固体全保护八肽胆囊收缩素片段19.6g（收率：92.9%）。

实施例6 固相法制备八肽胆囊收缩素全保护片段

取40g Fmoc-Met-CTC Resin(0.75mmol/g,30mmol),依次偶联反应用的激活试剂为：PYBOP/HOBT的混合物，然后加有机碱：NMM,控温28℃反应1.5小时，全保护八肽胆囊收缩素片段树脂用500ml（100ml的AC,100ml的TFE,300ml的DCM）切割液切割。其余与实例5相同。最后得到胶状固体全保护八肽胆囊收缩素片段28.78g（收率：90.9%）。

实施例7 固相法制备八肽胆囊收缩素全保护片段

取37.5g Fmoc-Met-CTC Resin(0.80mmol/g,30mmol),依次偶联反应用的激活试剂为：TBTU/HOBT的混合物，然后加有机碱：NMM,控温25℃反应1.5小时，其余与实例5相同。最后得到胶状固体全保护八肽胆囊收缩素片段28.25g（收率：89.5%）。

实施例8 固相法制备八肽胆囊收缩素全保护片段

取25g Fmoc-Met-CTC Resin(0.80mmol/g,20mmol),依次偶联反应用的激活试剂为：DIC/HOBT的混合物，然后加有机碱：DIEA,控温32℃反应2小时，其余与实例5相同。最后得到胶状固体全保护八肽胆囊收缩素片段18.18g（收率：86.4%）。

实施例9 液相片段法制备八肽胆囊收缩素

取10.55克 Boc-Asp(otbu)-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-COOH，和3.10g H-Asp(otbu)-Phe-NH2，倒入圆底烧瓶，用DMF溶解，然后加入1.62g HOBT，冰浴搅拌下加入4.14ml有机碱：DIEA,搅拌15min后，加入2.47gDCC,反应20min后撤掉冰浴，室温搅拌过夜反应，然后加乙酸乙酯萃取，石油醚洗涤，浓缩，蒸干。然后加切割液150ml(TFA:TIS:H2O体积比=95:3:2)，冰浴温控0℃，搅拌反应2小时，然后加600ml冰乙醚沉淀，离心，乙醚洗涤，然后真空干燥器中抽干得到粗品辛卡利肽：11g,收率：80.6%，粗品八肽胆囊收缩素的纯度在：87.2%。

实施例10 液相片段法制备八肽胆囊收缩素

取8.445克 Boc-Asp(otbu)-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-COOH，和2.48g H-Asp(otbu)-Phe-NH₂，倒入圆底烧瓶，用DMF溶解，然后加入1.30g HOBT，冰浴搅拌下加入2.1ml有机碱：NMM搅拌15min后，加入2.00gDCC，反应20min后撤掉冰浴，室温搅拌过夜反应，然后加乙酸乙酯萃取，石油醚洗涤，浓缩，蒸干。然后加切割液120ml(TFA:TIS:H₂O体积比=95:3:2)，冰浴温控10℃，搅拌反应2小时，然后加450ml冰乙醚沉淀，离心，乙醚洗涤，然后真空干燥器中抽干得到粗品辛卡利肽：8.9g,收率：81.6%，粗品八肽胆囊收缩素的纯度在：88.2%。

实施例11 粗品经过高效液相色谱纯化得到八肽胆囊收缩素精品

将11g八肽胆囊收缩素粗品溶于水，用水相滤膜过滤粗品溶液，滤液经C18色谱柱（直径3厘米）制备纯化分离，纯化制备条件为：C18制备柱，检测波长220nm,流速20ml/min，流动相有两种：A：质量百分含量为0.1%TFA+质量百分含量为99.9%ACN；B：质量百分含量为0.1%TFA+质量百分含量为99.9%H₂O，制备收集样品峰合并后浓缩去ACN，最后分别用质量百分含量为2%的醋酸铵水溶液和质量百分含量为0.04%的醋酸水溶液转成醋酸盐形式，在旋蒸，浓缩，冻干得到精品八肽胆囊收缩素3.2g,纯度：98.52%。

Claims

1.固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是具体包含以下步骤：

1）.液相法合成L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺：将N-(叔丁氧羰基)-L-苯基丙氨酸用有机溶剂溶解，然后C端酰胺化得到N-(叔丁氧羰基)-L-苯丙酰胺,再和芴甲氧羰基-天冬氨酸-4-叔丁脂加激活试剂反应，反应得到 N-(9芴甲氧羰基) L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺,然后用哌啶脱芴甲氧羰基保护,萃取，旋蒸，结晶得到L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺；

2）.固相法合成八肽胆囊收缩素全保护片段：将N-(9芴甲氧羰基)-蛋氨酸用有机溶剂溶解加到二氯三苯基树脂中，再加有机碱，室温反应2-3小时，完毕后，用甲醇封闭，用布氏漏斗过滤氨基酸树脂，再用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇依次洗涤收缩，把做完的树脂放到固相反应器中，溶胀，然后加脱保护液脱保护，然后洗涤，加入片段的第二个具有芴甲氧羰基保护基团的氨基酸和激活试剂反应，控温反应1-2个小时, 凯撒试验检测，反应完全后，脱芴甲氧羰基保护，依次往下偶联，最后得到八肽胆囊收缩素全保护片段肽树脂；

3）.弱酸切割全保护片段：往八肽胆囊收缩素全保护片段肽树脂中加入适量的弱酸切割液，室温切割，得到八肽胆囊收缩素全保护片段；

4) .液相缩合全保护片段和二肽片段得到全保护八肽胆囊收缩素：八肽胆囊收缩素全保护片段与之前的L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺，再加1-羟基-苯并-三氮唑以及N-甲基吗啡啉和N,N-二异丙基乙胺中的一种，冰浴下搅拌，加入缩合剂，反应后撤掉冰浴，室温搅拌过夜后得到全保护八肽胆囊收缩素；

5）.切割：将全保护八肽胆囊收缩素加入切割液切割，然后加入冰乙醚沉淀得到八肽胆囊收缩素粗品；

2.根据权利要求1所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤1）所述的有机溶剂为四氢呋喃，激活试剂为N，N-二异丙基碳化二亚胺和1-羟基-苯并-三氮唑的混合试剂，所述的C端酰胺化是以N-甲基吗啡啉作为有机碱，然后滴加氯甲酸乙脂作为羧基活化试剂，加氨水反应。

3.根据权利要求1所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤2）所述二氯三苯基树脂替代度在：0.9-1.2mmol/g,所用的有机溶剂为二氯甲烷，所用的有机碱为N,N-二异丙基乙胺，投料比为：N-(9芴甲氧羰基)-蛋氨酸: 二氯三苯基树脂: N,N-二异丙基乙胺的体积比：0.6:1:2.5；所述的脱保护液为质量百分含量为20%的哌啶和N,N-二甲基甲酰胺。

4.根据权利要求1所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤2）脱保护反应时间为5min+15min。

5.根据权利要求1所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤2）所述具有芴甲氧羰基保护基团的氨基酸，分别为：N-(9芴甲氧羰基)-色氨酸、N-(9芴甲氧羰基)-甘氨酸、N-(9芴甲氧羰基)-蛋氨酸、N-(9芴甲氧羰基)-磺酸钠盐酪氨酸、芴甲氧羰基-天冬氨酸-4-叔丁脂,激活试剂选择：N，N-二异丙基碳化二亚胺/1-羟基-苯并-三氮唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基-苯并-三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸/1-羟基-苯并-三氮唑或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/1-羟基-苯并-三氮唑混合试剂中的一种，偶联反应中的有机碱为：N,N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啡啉。

6.根据权利要求1所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤2）一次偶联反应完毕和脱芴甲氧羰基保护后，都需要用凯撒试验检测，凯撒试验为三种溶剂：A: 质量百分含量为5%的茚三酮乙醇溶液、B：质量百分含量为80%的苯酚乙醇溶液、C：重蒸吡啶。

7.根据权利要求1所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤3）所述弱酸溶液为：质量百分含量为1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液或者醋酸:三氟乙醇:二氯甲烷体积比=2:2:6的混合液。

8.根据权利要求1所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤4）所述缩合试剂为二环己基碳二亚胺。

9.根据权利要求1所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤5）所述切割液：三氟乙酸: 三已丙基硅烷:H₂O体积比=95:3:2，切割需要冰浴控制在0-10℃。

10.根据权利要求1所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤6）具体为：

将八肽胆囊收缩素粗品溶于质量百分含量为25%的乙腈水溶液中，过滤，滤液经C18色谱柱纯化，流动相有两种：A：质量百分含量为0.1%的三氟乙酸+质量百分含量为99.9%的乙腈；B：质量百分含量为0.1%的三氟乙酸+质量百分含量为99.9%的H₂O；梯度：25%~35%；流速为110ml/min，检测波长为220nm，然后转醋酸盐，悬蒸浓缩小体积冻干，获得成品。