CN102286091B

CN102286091B - 胸腺肽α1的固相合成工艺

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Publication number: CN102286091B
Application number: CN 201110186259
Authority: CN
Inventors: 齐岩; 葛存慧; 李郑武; 王孝文; 李会成; 陈玉军; 张海涛; 高晶; 曹翊婕; 徐岩; 王丽娜
Original assignee: HARBIN PHARMACEUTICAL GROUP TECHNOLOGY CENTER; BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd HAYAO GROUP
Current assignee: HARBIN PHARMACEUTICAL GROUP TECHNOLOGY CENTER; BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd HAYAO GROUP
Priority date: 2011-07-05
Filing date: 2011-07-05
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2031-07-05
Also published as: CN102286091A

Abstract

本发明涉及胸腺肽α1的固相合成工艺，该工艺步骤如下：(1)NH₂-Asn(Trt)-CTC树脂的制备；(2)AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的合成；(3)Ac-AA^(1-27)-Asn²⁸(Trt)-CTC树脂的制备；(4)用裂解剂制备胸腺肽α1粗肽；(5)胸腺肽α1粗肽的纯化。

Description

胸腺肽α1的固相合成工艺

技术领域

本发明涉及多肽的合成和纯化方法，尤其涉及胸腺肽α1的固相合成工艺。

背景技术

1977年，被称为“胸腺之父”的Allen Goldstein博士从胸腺肽第5组分中提取出其中最具免疫活性的成分：胸腺肽α1。胸腺肽α1是一种生物反应调节剂(BRM)，由28个氨基酸残基构成，氨基酸序列如下：

N-乙酰化-L-丝氨酰-L-天冬氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-L-天冬氨酰-L-苏氨酰-L-丝氨酰-L-丝氨酰-L-谷氨酰-L-异亮氨酰-L-苏氨酰-L-苏氨酰-L-赖氨酰-L-天冬氨酰-L-亮氨酰-L-赖氨酰-L-谷氨酰-L-赖氨酰-L-赖氨酰-L-谷氨酰-L-缬氨酰-L-缬氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰-L-天冬酰胺。

N末端被乙酰化，分子量为3108。主要存在于胸腺中，在脾、肺、肾、脑等其他组织中也有低水平存在。胸腺肽α1是一种免疫调节因子，在T淋巴细胞成熟和免疫功能方面有很大的作用，这些作用包括：诱导分化的特异标志；促进干扰素γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)及其受体表达；增强细胞在外源因子刺激时的生长；启动T淋巴细胞的成熟、刺激分泌干扰素及各种淋巴介素，以及增强自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性；促使骨髓产生的干细胞成长为能够特异识别抗原的功能T细胞，增加各种淋巴因子如α、β干扰素的分泌，从而有增强细胞免疫功能的作用。作为天然胸腺激肽的主要组分α1大致含量在整个胸腺肽组成中约占1％左右。胸腺肽α1与胸腺肽各单一组分间，或与胸腺肽整体比较，生物活性均为最高，其活性相当于胸腺肽的2000倍，相当于胸腺五肽的10到1000倍。

胸腺肽α1最早由意大利塞生公司(Sciclone)在1997年开发上市，药品名“日达仙”(Zadaxin)。作为一种细胞免疫剂增强剂，胸腺肽α1受到医学界越来越多的重视。它对慢性乙型肝炎、重型病毒性肝炎、肿瘤、流行性乙型脑炎等疾病的治疗效果明显，副作用少，具有较高的临床研究价值和应用前景。在临床上主要用于：①治疗慢性乙型肝炎；②在肿瘤治疗中的应用；③治疗重症肝炎；④治疗流行性乙型脑炎；⑤治疗外科感染性疾病。

目前胸腺肽α1的合成与制备的方法主要有两种，基因工程方法和化学固相合成方法。专利CN02125267.X公布了一种利用生物工程技术将胸腺肽基因进行重组，在宿主细胞中表达重组基因获得胸腺肽融合体，再利用化学技术将融合体裂解和修饰的到胸腺肽α1的方法。专利CN200410077749.2采用的方法是将胸腺肽α1定向克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建融合表达质粒pTRX-Tα1，该质粒可以表达出硫氧还蛋白-胸腺肽α1融合蛋白，再经过一系列后处理和纯化可以得到胸腺肽α1。基因工程方法的缺点是表达量比较低，而且所需费用较高，很难实现产业化。《化学工业与工程》2001年18卷第6期《胸腺素α1的Fmoc固相合成法》描述了一种以王树脂为载体，用对称酸酐法和DCC-HOBt缩合法合成胸腺肽α1的方法。《化工学报》2004年第55卷第2期《胸腺素α1的DIC固相化学合成与鉴定》描述了一种以王树脂为载体，以DIC-HOBt为氨基酸激活试剂合成胸腺肽α1的方法。《南京工业大学学报》2004年第26卷第2期《固相合成胸腺素α1》中的合成方法也是采用王树脂为起始原料，但氨基酸激活试剂采用的是TBTU-HOBt。这几种化学固相合成方法采用的都是先进的Fmoc方法，并且均以王树脂为载体。不足之处是王树脂与Fmoc-Asn(Trt)-OH的结合比较困难，还存在切割的时候linker被切除连接在肽链上的副反应，会对收率有一定的影响。而且其方法中的氨基酸缩合剂TBTU-HOBt，DCC-HOBt，DIC-HOBt相对而言缩合效率不是很高，对于胸腺肽α1这种比较长的肽，空间结构影响较大，会对收率造成影响，导致成本升高，不利于工业化生产。

发明内容

本发明的目的是对现有的固相合成技术进行优化，解决胸腺肽α1合成工艺中存在的一些问题，提供一种收率更高、成本更低、有利于实现产业化的胸腺肽α1的固相合成工艺以及一种胸腺肽α1粗肽的纯化方法。

本发明提供一种胸腺肽α1的固相合成方法，该方法包括下列步骤：

(1)NH₂-Asn(Trt)-CTC树脂的制备；

(2)AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的合成；

(3)Ac-AA^(1-27)-Asn²⁸(Trt)-CTC树脂的制备；

(4)用裂解剂制备胸腺肽α1粗肽；

(5)胸腺肽α1粗肽的纯化。

上述步骤(2)固相合成中使用用氨基酸激活试剂：HATU和NMM。

上述步骤(3)中乙酸酐和吡啶的摩尔用量均为树脂取代摩尔数的20倍。

上述步骤(4)的裂解液，为三氟乙酸/二巯基乙醇/水的混合液，配制方法如下：三氟乙酸∶二巯基乙醇∶水＝90∶5∶5的体积配制，然后在-10℃的条件下预冷12小时。裂解切肽是在室温下反应2.5-3小时。

沉降粗肽时用的乙醚体积是裂解试剂的10倍，沉降完成后用离心的方法对粗肽进行洗涤浓缩。

上述步骤(5)纯化采用两次纯化，所用色谱柱用不同的反相C18填料。

优选的本发明的固相合成方法，包括下列步骤：

(1)NH₂-Asn(Trt)-CTC树脂的制备：Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂加入至反应器中，加入DMF，打开氮气自下而上柔和冲混液体和树脂，除去液体，然后向反应器中加入哌啶/DMF溶液进行反应，反应完毕抽去液体，用DMF洗涤，再加入哌啶/DMF溶液，搅拌反应后抽除，用DMF洗涤，洗去脱下的Fmoc保护基。

(2)AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的合成：取Fmoc-Glu(OtBu)-OH，HATU，溶于DMF中，加入冷却的NMM，激活后加入到反应器中反应，以茚三酮显色法检测为准，然后抽滤除去反应液，加入DMF洗涤，重复以上的操作步骤，按照胸腺肽α1氨基酸序列，把不同的氨基酸依次进行偶联直至最后Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联完毕，偶联完毕之后，再用哌啶/DMF脱去Fmoc保护，得到AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂。

(3)Ac-AA^(1-27)-Asn²⁸(Trt)-CTC树脂的制备：AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC，乙酸酐，吡啶，DMF混合均匀后加入至反应器中反应，抽滤除去溶液；依次加入DMF洗涤，DCM洗涤，MeOH洗涤，转出树脂，减压干燥，得到胸腺肽α1肽树脂。

(4)树脂肽裂解制备粗肽：裂解液，肽树脂冰浴下混合反应；然后过滤除去树脂，滤液加入到冰乙醚中沉降，分离制得胸腺肽α1粗肽。

(5)胸腺肽α1粗肽的纯化：以TFA溶液为流动相A，乙腈为流动相B；色谱系统采用反相C18，采用梯度洗脱，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶收集液纯度大于90％。峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于90％纯化液。合并所有含量在90％以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化。以磷酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B；色谱系统采用反相C18采用梯度洗脱，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于98.5％。峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于98.5％纯化液。合并所有含量在98.5％以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，进行下一步脱盐纯化。以注射用水为流动相A，乙腈为流动相B；色谱系统采用反相C18填料柱，取第二次纯化得到的目的肽，采用梯度洗脱，主峰出现时开始收集至无峰出现时结束。合并收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α1精制液用微孔滤膜精密过滤，冻干。

本发明胸腺肽α1的固相合成工艺已经纯化方法具有以下优点：

(1)本发明采用了Fmoc策略，此方法操作简便，反应条件更温和，副反应少，在合成过程中避免了剧毒、强腐蚀性的氟化氢，既提高了反应的选择性，又使操作简单、安全，更易实现自动化，并且大大减轻了环保压力。

(2)以Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂为合成其实原料，解决了王树脂与Fmoc-Asn(Trt)-OH结合困难，易发生副反应的难题，提高了反应收率，降低了生产成本，更适合于工业化生产。

(3)氨基酸激活试剂采用的是缩合效率更高的HATU，HATU可有效地促进有空间位阻的酰胺键的形成，对于胸腺肽α1这种较长的肽可以减少空间结构对反应的影响，进而提高收率。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的合成

称取替代度为0.60mmol/g的Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂66.7g(40mmol)，加入至反应器中，加入500ml DMF，打开氮气自下而上柔和冲混液体和树脂，搅拌溶胀30分钟后停止，抽滤除去液体。然后向反应器中加入20％的哌啶/DMF溶液(脱帽液)500ml，在氮气保护下搅拌反应5分钟，抽去液体，用500ml DMF洗涤2次。再加入500ml脱帽液，搅拌反应10分钟后抽除，用500ml DMF洗涤8次，洗去脱下的Fmoc保护基。称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH 68g，HATU 60.8g，溶于500ml DMF中，冰浴下加入冷却的NMM 26.5ml，激活10分钟后加入到反应器中，在15℃～25℃下反应2.5-3小时，以茚三酮显色法检测为准。然后抽滤除去反应液，加入400ml DMF洗涤3次。遵循多肽固相合成方法的一般规律，重复以上的操作步骤，按照胸腺肽α1氨基酸序列，依次把其余的26个氨基酸偶联至CTC树脂上，直至最后Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联完毕。然后用脱帽液脱去Fmoc保护，得到AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂。

实施例2：Ac-AA^(1-27)-Asn²⁸(Trt)-CTC树脂的制备

配制乙酰化溶液乙酸酐76ml，吡啶65ml，DMF1000ml，混合均匀后加入至反应器中，在氮气保护下反应24小时，然后后抽滤除去乙酰化溶液。依次加入1000mlDMF洗涤6次，1500ml DCM洗涤3次，1000ml MeOH洗涤3次，每次洗涤5分钟。转出树脂，减压干燥，得到胸腺肽α1肽树脂242.2g。

实施例3：树脂肽裂解制备粗肽

(1)配制三氟乙酸/二巯基乙醇/水＝90∶5∶5(v/v)裂解液2400ml，在-10℃下预冻12h。

(2)置242.2g肽树脂于圆底烧瓶中，冰浴下冷却，加入已经预冻好的裂解液2400ml，加入完成后撤除冰浴，室温下搅拌反应2.5小时。然后过滤除去树脂，滤液加入到10倍体积冰乙醚中。沉降5小时。4000转/分钟离心洗涤8次。转出沉淀，减压干燥，制得胸腺肽α1粗肽73.5g。

实施例4：胸腺肽α1粗肽的溶解

将73.5g粗肽研磨至粉末状，然后加入735ml纯水搅拌20分钟。滴加氨水将溶液pH值调至6.5-7.0之间，用纯水定容至4L，然后用0.45μm微孔滤膜过滤。滤液用1.0％TFA水溶液调pH值至2.0-2.5之间，再用0.45μm微孔滤膜过滤。

实施例5：胸腺肽α1粗肽的纯化

(1)一次纯化

以0.1％TFA溶液为流动相A，乙腈为流动相B；制备液相色谱系统采用10μm的反相C18(41.4×250mm)填料，紫外检测器设定220nm，调流速60ml/min，以5％的乙腈，平衡15分钟，进样。采用梯度洗脱：0～2min，5％～5％；2～42min，17％～23％；42～48min，50％～50％。出峰时间在37min左右。分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶收集液纯度大于90％。峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于90％纯化液。合并所有含量在90％以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化。

(2)二次纯化

以0.2％磷酸溶液(用氨水调pH至6.5)为流动相A，乙腈为流动相B；制备液相色谱系统采用5μm的反相C18(41.4×250mm)填料，紫外检测器设定220nm，调流速60ml/min，以5％的乙腈，平衡15分钟。取第一次纯化得到的目的肽收集液，进样。采用梯度洗脱：0～2min，5％～5％；2～32min，9％～15％；32～40min，40％～40％。出峰时间在25min左右。分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于98.5％。峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于98.5％纯化液。合并所有含量在98.5％以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化。

(3)脱盐

以注射用水为流动相A，乙腈为流动相B；准备制备液相色谱系统，采用10μm的反相C18(41.4×250mm)填料柱，紫外检测器设定220nm，调流速40ml/min，先以80％的乙腈，平衡10分钟，然后以2％的乙腈，平衡15分钟。取第二次纯化得到的目的肽收集液，进样。采用梯度洗脱：0～15min，5％～5％；15～65min，5％～40％。主峰出现时开始收集至无峰出现时结束。合并收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α1精制液660ml。

(4)冻干

取脱盐后的的胸腺肽α1精制液，用0.22μm微孔滤膜精密过滤，分装不锈钢盘冻干。制得胸腺肽α1纯品25.3g，产品总收率20.3％。

和现有技术比较：产品总收率达到20％以上，而现有制备方法得到的总收率为：10～15％。

和现有技术比较：经过二次纯化及脱盐冻干的产品纯度可以达到99％以上，大于用现有制备和纯化方法得到的胸腺肽α1的纯度(98％)。

本发明中，缩略语的解释如下：

Claims

1.一种胸腺肽α1的固相合成方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

（1）NH₂-Asn(Trt)-CTC树脂的制备：Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂加入至反应器中，加入DMF，打开氮气自下而上柔和冲混液体和树脂，除去液体，然后向反应器中加入哌啶/DMF溶液进行反应，反应完毕抽去液体，用DMF洗涤，再加入哌啶/DMF溶液，搅拌反应后抽除，用DMF洗涤，洗去脱下的Fmoc保护基，

（2）AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的合成：取Fmoc-Glu(OtBu)-OH，HATU，溶于DMF中，加入冷却的NMM，激活后加入到反应器中反应，以茚三酮显色法检测为准，然后抽滤除去反应液，加入DMF洗涤，按照胸腺肽α1氨基酸序列，重复以上的操作步骤，将其余26个氨基酸依次偶联到树脂上，然后用哌啶/DMF脱去Fmoc保护，得到AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂，

（3）Ac-AA^(1-27)-Asn²⁸(Trt)-CTC树脂的制备：AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC，乙酸酐，吡啶，DMF混合均匀后加入至反应器中反应，抽滤除去溶液；依次加入DMF洗涤，DCM洗涤，MeOH洗涤，转出树脂，减压干燥，得到胸腺肽α1肽树脂，

（4）裂解制备粗肽：裂解液，胸腺肽α1肽树脂冰浴下混合反应；然后过滤除去树脂，滤液加入到冰乙醚中沉降，分离制得胸腺肽α1粗肽，

其中，裂解剂是：三氟乙酸/二巯基乙醇/水，按照90:5:5的体积配制而成，在-10℃预冷12小时，

（5）胸腺肽α1粗肽的纯化：以TFA溶液为流动相A，乙腈为流动相B；色谱系统采用反相C18，采用梯度洗脱，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶收集液纯度大于90%，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于90%纯化液，合并所有含量在90%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化，以磷酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B；色谱系统采用反相C18采用梯度洗脱，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于98.5%，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于98.5%纯化液，合并所有含量在98.5%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，进行下一步脱盐纯化，以注射用水为流动相A，乙腈为流动相B；色谱系统采用反相C18填料柱，取第二次纯化得到的目的肽，采用梯度洗脱，主峰出现时开始收集至无峰出现时结束，合并收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α1精制液用微孔滤膜精密过滤，冻干。

2.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于：该方法包括下列步骤：

（1）AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的合成

称取替代度为0.60mmol/g的Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂66.7g，加入至反应器中，加入500ml DMF，打开氮气自下而上柔和冲混液体和树脂，搅拌溶胀30分钟后停止，抽滤除去液体，然后向反应器中加入20%的哌啶/DMF溶液500ml，在氮气保护下搅拌反应5分钟，抽去液体，用500ml DMF洗涤2次，再加入500ml20%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应10分钟后抽除，用500ml DMF洗涤8次，洗去脱下的Fmoc保护基，

（2）AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的制备：

称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH 68g，HATU 60.8g，溶于500ml DMF中，冰浴下加入冷却的NMM 26.5ml，激活10分钟后加入到反应器中，在15℃～25℃下反应2.5-3小时，以茚三酮显色法检测为准，然后抽滤除去反应液，加入400ml DMF洗涤3次，遵循多肽固相合成方法的一般规律，重复以上的操作步骤，按照胸腺肽α1氨基酸序列，依次把其余的26个氨基酸偶联至CTC树脂上，直至最后Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联完毕，然后用20%的哌啶/DMF溶液脱去Fmoc保护，得到AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂，

（3）Ac-AA^(1-27)-Asn²⁸(Trt)-CTC树脂的制备

配制乙酰化溶液：乙酸酐76ml，吡啶65ml，DMF1000ml，混合均匀后加入至含有AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的反应器中，在氮气保护下反应24小时，然后抽滤除去乙酰化溶液，依次加入1000ml DMF洗涤6次，1500ml DCM洗涤3次，1000ml MeOH洗涤3次，每次洗涤5分钟，转出树脂，减压干燥，得到胸腺肽α1肽树脂242.2g，

（4）树脂肽裂解制备粗肽

配制三氟乙酸/二巯基乙醇/水=90:5:5（v/v）裂解液2400ml，在-10℃下预冻12h，将242.2g肽树脂于圆底烧瓶中，冰浴下冷却，加入已经预冻好的裂解液2400ml，加入完成后撤除冰浴，室温下搅拌反应2.5小时，然后过滤除去树脂，滤液加入到10倍体积冰乙醚中，沉降5小时，4000转/分钟离心洗涤8次，转出沉淀，减压干燥，制得胸腺肽α1粗肽73.5g，

其中，步骤（4）的裂解剂是：三氟乙酸/二巯基乙醇/水，按照90:5:5的体积配制而成，在-10℃预冷12小时，裂解切肽时将裂解液倒入预冷的乙醚中在室温下反应2.5-3小时，沉降粗肽时乙醚体积用量是裂解试剂的10倍，沉降完成后用离心的方法对粗肽进行洗涤浓缩，

（5）胸腺肽α1粗肽的溶解

将73.5g粗肽研磨至粉末状，然后加入735ml纯水搅拌20分钟，滴加氨水将溶液pH值调至6.5-7.0之间，用纯水定容至4L，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液用1.0%TFA水溶液调pH值至2.0-2.5之间，再用0.45μm微孔滤膜过滤，

（6）胸腺肽α1粗肽的纯化

一次纯化

以0.1%TFA溶液为流动相A，乙腈为流动相B；制备液相色谱系统采用10μm的反相C18填料，规格为41.4×250mm，紫外检测器设定220nm，调流速60ml/min，以5%的乙腈，平衡15分钟，进样，采用梯度洗脱：0~2min，5%~5%；2~42min，17%~23%；42~48min，50%~50%，出峰时间在37min左右，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶收集液纯度大于90%，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于90%纯化液，合并所有含量在90%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化，

二次纯化

以0.2%磷酸溶液为流动相A，用氨水调溶液pH至6.5；乙腈为流动相B；制备液相色谱系统采用5μm的反相C18填料，规格为：41.4×250mm，紫外检测器设定220nm，调流速60ml/min，以5%的乙腈，平衡15分钟，取第一次纯化得到的目的肽收集液，进样，采用梯度洗脱：0~2min，5%~5%；2~32min，9%~15%；32~40min，40%~40%，出峰时间在25min左右，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于98.5%，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于98.5%纯化液，合并所有含量在98.5%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，

脱盐

以注射用水为流动相A，乙腈为流动相B；准备制备液相色谱系统，采用10μm 的反相C18填料柱，规格为：41.4×250mm，紫外检测器设定220nm，调流速40ml/min，先以80%的乙腈，平衡10分钟，然后以2%的乙腈，平衡15分钟，取第二次纯化得到的目的肽收集液，进样，采用梯度洗脱：0~15min，5%~5%；15~65min，5%~40%，主峰出现时开始收集至无峰出现时结束，合并收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α1精制液660ml，

冻干

取脱盐后的的胸腺肽α1精制液，用0.22μm微孔滤膜精密过滤，分装不锈钢盘冻干，制得胸腺肽α1纯品25.3g。