CN103163235B - 固相合成胸腺肽α1的16肽阶段的缺失肽及检测方法 - Google Patents
固相合成胸腺肽α1的16肽阶段的缺失肽及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了检测固相合成胸腺肽α1的16肽阶段是否含有缺失肽的方法，包括：将固相合成胸腺肽α1的16肽采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在5.11min、7.27min、16.35min、17.02min、17.93min、19.16min、19.79min、20.75min或24.97min时分别出现峰面积为9.86％、4.09％、2.73％、1.84％、7.26％、2.69％、0.58％、0.43％或2.14％的离子流峰；说明固相合成胸腺肽α1的16肽合成阶段中含有缺失肽。本发明可有效保障和控制胸腺肽α1的质量。
Description
技术领域
本发明涉及固相合成胸腺肽α1中的缺失肽及检测方法，尤其涉及固相合成胸腺肽α1的16肽阶段的缺失肽及检测方法，属于固相合成胸腺肽α1领域。
背景技术
胸腺肽α1是从胸腺素组分5(TF-5)中分离出的一种活性多肽，由28个氨基酸残基组成，分子量为3108.37。在TF-5中，胸腺肽α1的含量为0.6％，是人体胸腺激素的重要活性组分。例如胸腺肽α1可调节T淋巴细胞发育、分化和成熟。此外，胸腺肽α1能修复受损的T淋巴细胞。虽然从TF-5中分离的胸腺肽α1无明显毒副反应，但由人工固相合成的市售胸腺肽α1可因不纯而造成不良反应。
目前，人工固相合成胸腺肽α1的操作规程千篇一律，几乎没有优化空间。市售的保护氨基酸和相关试剂的纯度也足以支持人工固相合成高纯度胸腺肽α1。在操作规程不出差错的前提下，人工固相合成的胸腺肽α1是否纯，取决于它含的缺失肽的状况。
与小分子药物不同，多肽的生物活性非常强。在人工固相合成的胸腺肽α1中，即使存在微量的缺失肽也可造成严重的毒副作用。控制人工固相合成的胸腺肽α1的质量的关键是控制缺失肽。目前国内外既没有披露人工固相合成的胸腺肽α1中的缺失肽状况，也没有公开测定人工固相合成的胸腺肽α1中的缺失肽的方法。这种状态不适应胸腺肽α1的临床地位。为了改善这种状况，保障胸腺肽α1的临床用药安全性，形成了本发明。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种能够准确、灵敏的检测固相合成胸腺肽α1的16肽阶段是否含有缺失肽的方法；
本发明的另一个目的是提供固相合成胸腺肽α1的16肽阶段的缺失肽谱；
本发明的目的之三是将固相合成胸腺肽α1的16肽阶段的缺失肽谱应用于胸腺肽α1固相合成中的质量控制。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种检测固相合成胸腺肽α1的16肽阶段是否含有缺失肽的方法，包括以下步骤：将固相合成胸腺肽α1过程中的16肽样品采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在5.11min时出现峰面积为9.86％的离子流峰、在7.27min时出现峰面积为4.09％的离子流峰、在16.35min时出现峰面积为2.73％的离子流峰、在17.02min时出现峰面积为1.84％的离子流峰、在17.93min时出现峰面积为7.26％的离子流峰、在19.16min时出现峰面积为2.69％的离子流峰、在19.79min时出现峰面积为0.58％的离子流峰、在20.75min时出现峰面积为0.43％的离子流峰或在24.97min时出现峰面积为2.14％的离子流峰；则说明固相合成胸腺肽α1的16肽阶段中含有缺失肽。
本发明所述的胸腺肽α1的16肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
所述的梯度洗脱优选为用0.1％甲酸/乙腈梯度洗脱，流速为0.4ml/min，梯度为：0-5min，0.1％甲酸/乙腈＝97/3；5-30min，0.1％甲酸/乙腈＝75/25。
本发明方法中LC/MS联用仪中的LC采用Agilent 1200自动进样，Waters XterraRP18分析柱的规格为5μm，3.0×150mm；LC/MS联用仪中的MS采用Bruker SolatixFT-ICR-MS，离子流检测器。
本发明进一步提供了固相合成胸腺肽α1的16肽阶段的缺失肽，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.7、SEQ ID No.8SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示；
本发明所提供的缺失肽作为胸腺肽α1固相合成过程中的质量控制物，应用于提高固相合成胸腺肽α1的质量或纯度。
本发明方法可以准确、灵敏的鉴别出固相合成胸腺肽α1的11肽阶段是否含有缺失肽或非肽杂质，可以有效地保障和控制胸腺肽α1的质量，在制备高纯度固相合成胸腺肽α1中有重要应用价值。
附图说明
图1胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的离子流。
图2胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱。
图3胸腺肽α1的十六肽片段缺失肽Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱。
图4胸腺肽α1的十六肽片段的缺失肽Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱.
图5胸腺肽α1的十六肽片段缺失肽Thr-Lys-Asp-Leu-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱。
图6胸腺肽α1的十六肽片段缺失肽Lys-Asp-Leu-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱。
图7胸腺肽α1的十六肽片段缺失肽Thr-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱.
图8胸腺肽α1的十六肽片段缺失肽Thr-Asp-Leu-Lys-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱。
图9胸腺肽α1的十六肽片段缺失肽Asp-Leu-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱。
图10胸腺肽α1的十六肽片段缺失肽Thr-Leu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱.
图11F3CCO-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱。
图12胸腺肽α1的十六肽片段缺失肽Thr-Asp-Leu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1固相合成胸腺肽α1
1.制备Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin
称取10g(3.1mmol)Wang Resin置于固相反应合成柱中。加入60ml DCM溶胀树脂10min，抽走DCM。用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽走溶剂。于磨口三角瓶中称取5.5g(9.3mmol)Fmoc-Asn(Trt)和1.38g(10.23mmol)HOBt，加入50ml DMF溶解。在冰水浴中冷却下加2.15ml(13.95mmol)DIC活化5min。将活化后的氨基酸加入用DMF洗好的树脂中，然后加入0.23g(1.86mmol)DMAP，用氮气吹气进行搅拌，室温反应2-4h。反应结束后用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽干溶剂。取少量树脂，用甲醇收缩三次，真空干燥至恒重，测替代值，如替代值达到预期，将树脂用乙酸酐封闭未反应的羟基，封闭反应2-4h后，用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽走溶剂。用甲醇收缩树脂三次，每次50ml，吹气5min，抽走溶剂，真空干燥至恒重，测替代值。如替代值达到预期。
2.Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin的溶胀和脱Fmoc
上面得到的Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin并置于固相反应合成柱中，加60mlDCM溶胀10min，然后抽走DCM。用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF，每次洗2min，共洗三次。用浓度为20％的piperidine的DMF溶液脱Fmoc，共脱两次，每次50ml，一次脱3min，另一次脱8min。然后用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗涤Asn(Trt)-Wang Resin，每次洗2min，共洗两次。抽走溶剂。树脂对茚三酮显黄色。
3.制备Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin
称取2.12g(4.98mmol)Fmoc-Glu(OtBu)和0.74g(5.5mmol)HOBt于干燥磨口三角瓶中，用50ml DMF溶解，溶液置冰浴冷却。加1.15ml(7.47mmol)DIC活化5min。然后将活化后的氨基酸加到上面得到的Asn(Trt)-Wang Resin中反应2h。抽走反应液。用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF，每次洗2min，共洗三次。树脂对茚三酮不显色。用浓度为20％的piperidine的DMF溶液脱Fmoc，共脱两次，每次50ml，第一次脱3min，第二次脱8min。然后用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗涤树脂，每次洗2min，共洗两次。抽走溶剂。树脂对茚三酮显黄色。
4.制备Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu-(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin
按照制备Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin的方法依次将1.55g(4.98mmol)Fmoc-Ala，2.12g(4.98mmol)Fmoc-Glu(OtBu)，2.12g(4.98mmol)Fmoc-Glu(OtBu)，2.53g (7.47mmol)Fmoc-Val，2.53g (7.47mmol)Fmoc-Val，3.17g(7.47 mmol)Fmoc-Glu(OtBu)，3.50g(7.47mmol)Fmoc-Lys(Boc)，4.67g(9.96mmol)Fmoc-Lys(Boc)，4.23g(9.96mmol)Fmoc-Glu(OtBu)，4.67g(9.96mmol)Fmoc-Lys(Boc)，3.52g(9.96mmol)Fmoc-Leu，4.09g(9.96mmol)Fmoc-Asp(OtBu)，4.67g(9.96mmol)Fmoc-Lys(Boc)，3.96g(9.96mmol)Fmoc-Thr(tBu)，3.96g(9.96mmol)Fmoc-Thr(tBu)，3.52g(9.96mmol)Fmoc-Ile，3.17g(7.47mmol)Fmoc-Glu(OtBu)，2.86g(7.47mmol)Fmoc-Ser(tBu)，2.86g(7.47mmol)Fmoc-Ser(tBu)，2.97g(7.47mmol)Fmoc-Thr(tBu)，3.07g(7.47mmol)Fmoc-Asp(OtBu)，2.53g(7.47mmol)Fmoc-Val，2.32g(7.47mmol)Fmoc-Ala，3.10g(9.96mmol)Fmoc-Ala，4.09g(9.96mmol)Fmoc-Asp(OtBu)和3.81g(9.96mmol)Fmoc-Ser(tBu)偶联到Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin上并脱Fmoc。
5.制备
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu-(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin
0℃下将1.18ml(12.45mmol)乙酸酐于干燥磨口三角瓶中与50ml DMF混合，然后加0.44ml(2.49mmol)DIPEA活化5min。将活化后的乙酸酐与Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys-(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu-(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-WangResin反应2h。抽走反应液。树脂用DMF洗涤4次，每次50ml DMF，每次洗2min。树脂用DCM洗涤2次，每次用50ml DCM，每次洗3min。抽走溶剂。树脂对茚三酮不显色。树脂用MeOH收缩3次，每次用50ml MeOH，每次收缩5min，抽干。得18.5g干燥肽树脂。低温保存。
6.从Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu-(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin切割胸腺肽α1
0℃下将18.5g干燥的肽树脂与180ml裂解液(TFA/TIS/H2O)反应0.5h，室温反应2.5h。反应结束后，用砂芯漏斗过滤分离树脂。树脂用少量TFA洗涤三次。合并的滤液用0℃的1800ml的乙醚沉淀出胸腺肽α1粗品。离心分离出胸腺肽α1粗品。胸腺肽α1粗品用0℃的乙醚洗涤粗肽三次，用N2吹走残余乙醚，置于真空干燥器干燥至恒重，得6.27g胸腺肽α1粗品，收率为81％，含量为68％。
试验例1
Fmoc-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu-(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin的缺失肽谱及其鉴定
取少量
Fmoc-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu-(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin不经纯化，按照标准方法切割并脱保护。得到的胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(SEQ ID No.1)在LC(Agilent 1200自动进样，Waters Xterra RP18分析柱，5μm，3.0×150mm)/MS(Bruker Solatix FT-ICR-MS，离子流检测器)联用仪上进行分析。用0.1％甲酸/乙腈梯度洗脱，洗脱梯度见表1。
表1胸腺肽α1的十六肽片段的洗脱梯度
| 洗脱时间(min) | 流速(ml/min) | 0.1％甲酸/乙腈 |
| 0 | 0.4 | 97/3 |
| 5 | 0.4 | 97/3 |
| 30 | 0.4 | 75/25 |
离子流谱见图1。图1由11个峰构成，它们分别出现在5.11min，7.27min，9.07min，16.35min，17.02min，17.93min，19.16min，19.79min，20.75min，21.46min和24.97min。它们的峰面积分别为9.86％，4.09％，63.08％，2.73％，1.84％，7.26％，2.69％，0.58％，0.43％，4.84％和2.14％。
出现在9.07min的峰的对应的质谱图见图2，该离子的质量为945.50839×2，是胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的理论质量数1887.97894加2H。
出现在5.11min的峰的对应的质谱图见图3，该离子的质量为880.48365×2，是胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn缺失Glu的理论质量数1758.93635加2H。
出现在7.27min的峰的对应的质谱图见图4，该离子的质量为894.98108×2，是胸腺肽α1十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn缺失Thr的理论质量数1786.93126加2H。
出现在16.35min的峰的对应的质谱图见图5，该离子的质量为880.95695×2，是胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn缺失Lys的理论质量数1759.88398加2H。
出现在17.02min的峰的对应的质谱图见图6，该离子的质量为830.43254×2，是胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn缺失Thr和Lys的理论质量数1658.83630加2H。
出现在17.93min的峰的对应的质谱图见图7，该离子的质量为881.45955×2，是胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn缺失Lys的理论质量数1759.88938加2H。
出现在19.16min的峰的对应的质谱图见图8，该离子的质量为816.43459×2，是胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn缺失Glu和Lys的理论质量数1630.84139加2H。
出现在19.79min的峰的对应的质谱图见图9，该离子的质量为793.92344×2，是胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn中一个OtBu保护基未脱除且缺失Thr和2个Lys的理论质量数1586.80393加2H。
出现在20.75min的峰的对应的质谱图见图10，该离子的质量为694.87158×2，是胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn缺失Glu，Asp和2个Lys的理论质量数1387.71948加2H。质量为851.43756×2的离子是胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn中一个OtBu保护基未脱除且缺失1个Asp和1个Lys的理论质量数1700.91963加2H。
出现在21.46min的峰的对应的质谱图见图11，该离子的质量为662.33254×3，是胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn被三氟乙酰化的理论质量数1983.96123加H。
出现在24.97min的峰的对应的质谱图见图12，该离子的质量为752.38587×2，是胸腺肽α1的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn缺失Glu和2个Lys的理论质量数1502.74642加2H。
Claims (4)
1.检测固相合成胸腺肽α1的16肽阶段时含缺失肽的方法，包括以下步骤：将固相合成胸腺肽α1时获得的16肽采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；分析获取的离子流谱，如果在5.11min出现峰面积为9.86％的离子流峰，或在7.27min出现峰面积为4.09％的离子流峰，或在16.35min出现峰面积为2.73％的离子流峰，或在17.02min出现峰面积为1.84％的离子流峰，或在17.93min出现峰面积为7.26％的离子流峰，或在19.16min出现峰面积为2.69％的离子流峰，或在19.79min出现峰面积为0.58％的离子流峰，或在20.75min出现峰面积为0.43％的离子流峰或者在24.97min出现峰面积为2.14％的离子流峰；说明固相合成胸腺肽α1的16肽阶段中含有缺失肽；所述的梯度洗脱为用0.1％甲酸/乙腈梯度洗脱，流速为0.4ml/min，梯度为:0-5min,0.1％甲酸/乙腈＝97/3；5-30min，0.1％甲酸/乙腈＝75/25；所述LC/MS联用仪中的LC采用Agilent1200自动进样,Waters Xterra RP18分析柱的规格为5μm,3.0×150mm；LC/MS联用仪中的MS采用Bruker Solatix FT-ICR-MS,离子流检测器；
所述的胸腺肽α1的16肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缺失肽的氨基酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示。
3.固相合成胸腺肽α1的16肽阶段中的缺失肽，其特征在于：其氨基酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示。
4.权利要求3所述的缺失肽作为质量控制物提高固相合成胸腺肽α1的质量或纯度中的应用。
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| Quantitative Analysis of Thymosin a1 in Human Serum by LC-MS/MS;Cynthia W. Tuthill 等;《AAPS PharmSciTech》;20000630;第1卷(第2期);第37-44页 * |
| 合成多肽药物的合成工艺中关键问题分析;王鹏 等;《中国新药杂志》;20100228;第19卷(第2期);第102-105页 * |
| 多肽固相合成中反相高效液相色谱的若干应用;董晓杰 等;《色谱》;19920331;第10卷(第3期);第160-162页 * |
| 王鹏 等.合成多肽药物的合成工艺中关键问题分析.《中国新药杂志》.2010,第19卷(第2期),第102-105页. |
| 董晓杰 等.多肽固相合成中反相高效液相色谱的若干应用.《色谱》.1992,第10卷(第3期),第160-162页. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103163235A (zh) | 2013-06-19 |
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