CN103224558A - 一种艾塞那肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种艾塞那肽的制备方法。该方法以氨基树脂为原料，先将氨基树脂脱保护，再用逐一偶联的方式依次连接有Fmoc保护的氨基酸，获得侧链全保护基的艾塞那肽[3-39]肽-树脂，再用同样的方法偶联R1-His(R2)-Gly-OH完成His-Gly两个氨基酸片段的连接。本发明方法用于大规模工业化制备艾塞那肽，产品纯度大于99.0%，艾塞那肽[D-His1]杂质、艾塞那肽[Des Gly2]杂质均小于0.1%。
Description
技术领域
本发明涉及一种工业化大规模制备艾塞那肽的方法，特别涉及采用固相合成法制备艾塞那肽，属于多肽合成技术领域。
背景技术
糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱疾病，高血糖主要是由于胰岛素分泌或作用的缺陷引起。全世界糖尿病患者已超过1.5亿，其中Ⅱ型糖尿病患者占90%以上。
艾塞那肽是一种治疗II型糖尿病的药物，由美国礼来公司开发，属于肠促胰岛素类似物，是肠促胰岛素类似物家族的第一个成员，可以模拟自然状态下分泌的人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)在体内的生理行为，与GLP-1的效果类似，可促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌，抑制不适当的葡萄糖依赖的胰高血糖素分泌，减慢胃排空，改善外周组织对胰岛素的敏感性，充分控制血糖。临床上主要用于治疗二甲双胍、磺酰脲类或二甲双胍和磺酰脲类联合应用不能很好控制血糖的II型糖尿病。
艾塞那肽是一个由39个氨基酸组成的多肽，具有如下结构：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。
目前艾塞那肽的制备工艺主要有三种：一种是利用基因重组技术获得艾塞那肽的全序列，参见CN1635117A、CN1693459A中公开的方法。
第二种是采用液相合成艾塞那肽，或者固相和液相结合制备艾塞那肽，比如WO2006119388先用固相法合成艾塞那肽类似物，再在液相中合成艾塞那肽；CN101835794A公开了用固相化学法合成三个不同的肽中间片段，然后再用液相化学将另外的氨基酸物质添加至片段上；WO2011006644公开了用固相化学合成四个艾塞那肽片段，再将几个片段在液相中偶联得到艾塞那肽。
第三种方法是固相合成法。由于液相合成艾塞那肽步骤复杂，工艺控制点较多，副产物多，工艺不稳定，因此，艾塞那肽多采用第三种方法固相合成法来制备，比如US6902744、CN101538324、CN101357938中均公开了采用固相化学合成艾塞那肽的方法，用氨基树脂依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，先制备得到侧链保护的由三十九个氨基酸成链的艾塞那肽-树脂，然后将艾塞那肽分子从树脂上切割下来，再经过多次纯化制得艾塞那肽。由于艾塞那肽分子中第[1-2]肽片段为His-Gly，在固相化学法依次接入Fmoc-Gly以及Fmoc-His(Trt)过程，由于Gly和His这两个氨基酸的分子特性，导致产品中产生以下的杂质：艾塞那肽[D-His1]、艾塞那肽[Des Gly2]，这些杂质与艾塞那肽自身的极性非常相近，在纯化的过程中很难完全去除，产品收率无法得到有效的提高，导致产品纯度降低，影响产品的质量以及用药安全。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种采用固相合成法制备艾塞那肽的方法，可用于工业上大规模生产艾塞那肽。
术语说明：
氨基树脂：由含有氨基或酰胺基的单体与醛类(主要是甲醛)缩聚而得的热固性树脂。
侧链保护基团：指与氨基酸的侧链（即氨基酸通式H2N-C(R)(H)-COOH中的R基）偶联的化学部分，其有助于防止侧链的一部分与肽合成、加工等步骤中使用的化学物质反应。
缩合剂：能引起缩合反应的试剂，在多肽合成中，尤指能促进氨基与羧基偶联形成肽键的试剂。
活化助剂：在多肽缩合反应中，能够协助缩合剂更好的促进缩合反应的试剂，如：抑制缩合反应中消旋杂质的产生、催化加快反应速度等。
本发明的技术方案如下：
一种艾塞那肽的制备方法，包括步骤如下：
（1）以氨基树脂为原料，加入脱保护剂，脱除所述氨基树脂上的Fmoc保护基；
（2）将步骤（1）脱除Fmoc保护基的氨基树脂采用逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的氨基酸，所述的偶联是在活化助剂和缩合剂存在下进行的固相偶联反应，以茚三酮检测阴性为反应终点，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再与下一个Fmoc保护的氨基酸进行固相偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护艾塞那肽[3-39]肽-树脂：
Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-树脂；
所述的各Fmoc保护的氨基酸的用量与氨基树脂的用量的摩尔比为2～5:1；
（3）将步骤（2）制备的侧链全保护的艾塞那肽[3-39]肽-树脂与R1-His(R2)-Gly-OH二肽片段在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，接入[1-2]肽组氨酸和甘氨酸（His-Gly），得到侧链全保护艾塞那肽-树脂：
R1-His(R2)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-树脂，其中，R1-His(R2)-Gly对应的结构为：
R1、R2为侧链保护基团，各自独立的选自Fmoc、Boc、Trt；
当侧链保护基团R1和/或R2为Fmoc时，所得侧链全保护艾塞那肽-树脂用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再进行下一步骤；
（4）上述步骤（3）制备的侧链全保护艾塞那肽-树脂经酸解剂裂解除去树脂和保护基团，经沉淀，得到艾塞那肽粗品。
进一步地，本发明的方法还包括步骤(5)艾塞那肽粗品的纯化：将上述步骤（4）得到的艾塞那肽粗品经反相高效液相色谱纯化，冻干得到艾塞那肽纯品。
本发明中，所用到的脱保护剂均为哌啶，优选应用形式为含20%哌啶的DMF溶液。
上述步骤（2）中所述的Fmoc保护的氨基酸，各种氨基酸分别以下列形式应用：Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH。
上述方法中，步骤（2）所述的逐一偶联的方式是：脱除Fmoc保护基的氨基树脂与一个Fmoc保护氨基酸在活化助剂、缩合剂作用下进行固相偶联反应，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，所得产物再与下一个Fmoc保护氨基酸进行固相偶联反应，再脱除Fmoc保护基；重复该固相偶联反应-脱除Fmoc保护基的循环操作，按
Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser序列倒序逐一依次连接Fmoc保护的氨基酸。每一步的固相偶联反应都以茚三酮检测阴性为反应终点。
上述方法中，步骤（1）所述的氨基树脂选自Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂、Sieber Amide树脂或Rink Amide AM树脂。均为市购产品。
根据本发明优选的，步骤（1）所述的氨基树脂的荷载量为0.3～1.5mmol/g，进一步优选的，所述的氨基树脂的荷载量为0.3～0.8mmol/g。
根据本发明优选的，所述的脱保护剂为含20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液（v/v=4:1体积比）；氨基树脂与脱保护剂的摩尔体积比为1:10～50，单位：mol/L；进一步优选氨基树脂与脱保护剂的摩尔体积比=1:20～40mol/L；脱保护反应时间为20～60min，优选30～40min。
根据本发明优选的，步骤（2）所述的缩合剂选自N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、N,N-二环己基碳二亚胺（DCC），六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBOP）、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）或O-苯并三氮唑-N,N,N’,N-四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU）；优选为N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）；缩合剂的用量与氨基树脂中氨基的摩尔比为2～6:1。
根据本发明优选的，步骤（2）所述的活化助剂选自1-羟基苯并三唑（HOBt）、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑（HOAt）；优选为1-羟基苯并三唑（HOBt）；活化助剂与氨基树脂中氨基的摩尔比为2～6:1。
根据本发明优选的，步骤（2）所述的固相偶联反应时间为30～150min，优选60～120min。以茚三酮检测阴性为反应终点。
本发明步骤（3）所述的固相偶联反应与步骤（2）的反应条件完全相同，所用的活化助剂和缩合剂与步骤（2）相同，活化助剂和缩合剂的用量也与步骤（2）相同。
根据本发明优选的，步骤（3）中所述的R1-His(R2)-Gly-OH的用量与侧链全保护的艾塞那肽[3-39]肽-树脂的用量的摩尔比为2～5:1；进一步优选3:1摩尔比。
根据本发明优选的，步骤（2）中活化助剂和缩合剂以下列形式应用：将活化助剂和缩合剂与Fmoc保护氨基酸一起溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF），加入反应器。
根据本发明优选的，步骤（3）中活化助剂和缩合剂以下列形式应用：将活化助剂和缩合剂与R1-His(R2)-Gly-OH一起溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF），加入反应器。
根据本发明优选的，步骤（4）所述的酸解剂为三氟乙酸（TFA）、1,2-乙二硫醇（EDT）、水、苯酚组成的混合物，三氟乙酸：1,2-乙二硫醇：水：苯酚=85～90：2～5：2～5：2～5体积比。
根据本发明优选的，步骤（4）所述的酸解剂的用量与侧链全保护艾塞那肽-树脂之比为5～20ml/g，优选8～15ml/g，更优选的，酸解剂：侧链全保护艾塞那肽-树脂=10：1ml/g。
根据本发明优选的，步骤（4）所述的裂解反应时间为1～5h，优选为1.5～3.5h。
本发明步骤（3）中所述的二肽片段R1-His(R2)-Gly-OH通过本发明提供的以下优选方法制备获得。
根据本发明优选的，步骤（3）所述的二肽片段R1-His(R2)-Gly-OH的制备步骤如下：
将起始原料R1-His(R2)-OH、甘氨酸甲酯按照摩尔比1:1的比例溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，加入与起始原料R1-His(R2)-OH等摩尔的缩合剂、活化助剂，搅拌反应10～30h，加入水和有机溶剂萃取，依次用饱和碳酸氢钠溶液、柠檬酸水溶液、饱和食盐水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得R1-His(R2)-Gly-OMe；将R1-His(R2)-Gly-OMe用四氢呋喃/水（v/v=3:1体积比）混合溶液溶解，冰浴下加入1M的LiOH水溶液，反应完毕后加入0.5M的盐酸水溶液，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化得二肽片段R1-His(R2)-Gly-OH；其中R1、R2的定义如上式I所述。
根据本发明优选的，步骤(4)艾塞那肽粗品的纯化方法，高效液相色谱柱参数为：色谱填料为10μm的反相C18固定相，色谱柱直径为50毫米、长度为250毫米，步骤如下：
①称取艾塞那肽粗品加入至乙酸水溶液中，微孔滤膜过滤，滤液用高效液相色谱柱纯化，流动相为0.1%三氟乙酸水溶液-0.1%三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱，循环纯化，合并主峰溶液减压浓缩，蒸除乙腈，得艾塞那肽三氟乙酸盐溶液；
②取艾塞那肽三氟乙酸盐溶液，用高效液相色谱法进行换盐，流动相为0.5%乙酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，循环上样，收集主峰溶液减压浓缩，蒸除乙腈，得到艾塞那肽醋酸盐水溶液，冷冻干燥得艾塞那肽纯品，产品纯度≥99.5%，艾塞那肽[D-His1]杂质、艾塞那肽[Des Gly2]杂质含量均小于0.1%。
本发明步骤（4）所述的沉淀一般选用冰乙醚试剂，按现有技术进行即可。
本发明的方法中，氨基树脂与氨基酸连接时，氨基树脂脱除保护基团后先和一个氨基酸偶联，脱除Fmoc保护基，再和下一个Fmoc保护的氨基酸偶联，再脱除Fmoc保护基，再与下一个Fmoc保护的氨基酸偶联；重复此步骤可以得到侧链全保护艾塞那肽[3-39]肽-树脂。再后续连接His和Gly时，如果二肽片段保护基中有Fmoc，则需要脱除Fmoc，如果没有的话则不需要脱除保护剂的步骤即可直接进入下一步酸解剂裂解反应；在制备艾塞那肽粗品时用酸解剂裂解脱除掉除Fmoc外的tBu、Trt、Boc、Pbf等保护基即可。裂解过程除脱去树脂外，还会同时脱去除氨基酸上的其余保护基团（tBu、Trt、Boc、Pbf等）。
本发明使用了保护基团R1和R2保护二肽片段R1-His(R2)-Gly-OH，一步引入组氨酸（His）和甘氨酸（Gly）两个氨基酸从而避免了艾塞那肽[D-His1]、艾塞那肽[Des Gly2]两杂质的产生，提高了产品的收率和纯度，反应效率高，有利于实现规模化的固相化学合成工艺。
本发明方法采用一次性固相接入保护的二肽片段R1-His(R2)-Gly-0H制备艾塞那肽，使得最终产品的纯度大于99.0%，可达99.5%左右，艾塞那肽[D-His1]、艾塞那肽[Des Gly2]两个杂质的含量均小于0.1%。与现有技术相比，本发明工艺具有操作简单、条件温和等特点，适于大规模工业化制备艾塞那肽。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但是，应当理解，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。在本文中，除非另外说明，其中：(i)温度以摄氏度(℃)表示，操作在室温环境下进行。(ii)含量及收率“%”均为质量百分比。(iii)纯度%均为高效液相色谱纯度HPLC。
本发明中所采用的氨基树脂（Rink Amide MBHA树脂、Sieber Amide树脂）、Fmoc保护氨基酸原料均购自吉尔生化有限公司。
以下实施例1-5涉及二肽片段R1-His(R2)-Gly-OH的制备，实施例6-11涉及侧链全保护艾塞那肽[3-39]树脂的制备，实施例12-13涉及艾塞那肽粗品的制备，实施例14涉及艾塞那肽粗品的纯化。除非另外说明，所用原料及试剂均为市购产品。
实施例1、Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的制备
称取Fmoc-His(Trt)-OH（61.9g，100mmol）、甘氨酸甲酯（8.9g，100mmol）加入500ml N,N-二甲基甲酰胺，搅拌10分钟溶解后加入1-羟基苯并三唑（HOBt）（13.5g，100mmol）、N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）（12.4ml，100mmol），室温搅拌反应18小时，加纯化水500ml，加入二氯甲烷500ml萃取，依次用饱和碳酸氢钠溶液、柠檬酸水溶液、饱和食盐水洗涤有机相，然后用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得
Fmoc-His(Trt)-Gly-OMe64.5g，收率为93.5%。
取Fmoc-His(Trt)-Gly-OMe（50.0g，72mmol）用四氢呋喃/水（3:1）混合溶液500ml溶解，冰浴下加入1M LiOH水溶液200ml，加毕搅拌反应15分钟，反应完毕后加入0.5M盐酸水溶液400ml，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化制得目标产物45.2g，收率为93.0%，纯度为98.7%。MS m/z:677(M+1)。
实施例2、Fmoc-His(Boc)-Gly-OH的制备
称取Fmoc-L-His(Boc)-OH（33g，50mmol）、甘氨酸甲酯（4.5g，50mmol）加入300mlN,N-二甲基甲酰胺，搅拌10分钟溶解后加入1-羟基苯并三唑（HOBt）（6.8g，50mmol）、N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）（6.2ml，50mmol），室温搅拌反应18小时，加水300ml，加入二氯甲烷萃取，依次用饱和碳酸氢钠溶液、柠檬酸水溶液、饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得Fmoc-His(Boc)-Gly-OMe32.5g，收率为87.8%。
取Fmoc-His(Boc)-Gly-OMe（29.4g，40mmol）用四氢呋喃/水（3:1）混合溶液400ml溶解，冰浴下加入1M LiOH水溶液140ml，加毕搅拌反应15分钟，反应完毕后加入0.5M盐酸水溶液280ml，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化制得目标产物26.1g，收率为91.9%，纯度为98.5%。MS m/z:717(M+1)。
实施例3、Fmoc-His(Fmoc)-Gly-OH的制备
称取Fmoc-His(Fmoc)-OH（60.0g，100mmol）、甘氨酸甲酯（8.9g，100mmol）加入500ml N,N-二甲基甲酰胺，搅拌10分钟溶解后加入1-羟基苯并三唑（HOBt）（13.5g，100mmol）、N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）（12.4ml，100mmol），室温搅拌反应18小时，加水500ml，二氯甲烷萃取，依次用饱和碳酸氢钠溶液、柠檬酸水溶液、饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得Fmoc-His(Fmoc)-Gly-OMe64.0g，收率为95.5%。
取Fmoc-His(Fmoc)-Gly-OMe（53.6g，80mmol）用四氢呋喃/水（3:1）混合溶液500ml溶解，冰浴下加入1M LiOH水溶液200ml，加毕搅拌反应15分钟，反应完毕后加入0.5M盐酸水溶液400ml，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化制得目标产物46.4g，收率为88.5%，纯度为98.3%。MS m/z:657(M+1)。
实施例4、Boc-His(Boc)-Gly-OH的制备
称取Boc-His(Boc)-OH（35.5g，100mmol）、甘氨酸甲酯（8.9g，100mmol）加入500mlN,N-二甲基甲酰胺，搅拌10分钟溶解后加入1-羟基苯并三唑（HOBt）（13.5g，100mmol）、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）（38.0g，100mmol），室温搅拌反应18小时，加水500ml，乙酸乙酯萃取，依次用饱和碳酸氢钠溶液、柠檬酸水溶液、饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得Boc-His(Boc)-Gly-OMe40.1g，收率为94.1%。
取Boc-His(Boc)-Gly-OMe（21.3g，50mmol）用四氢呋喃/水（3:1）混合溶液350ml溶解，冰浴下加入1M LiOH水溶液150ml，加毕搅拌反应15分钟，反应完毕后加入0.5M盐酸水溶液300ml，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化制得目标产物19.4g，收率为94.2%，纯度为98.9%。MS m/z:413(M+1)。
实施例5、Boc-His(Trt)-Gly-OH的制备
称取Boc-His(Trt)-OH（99.4g，200mmol）、甘氨酸甲酯（17.8g，200mmol）加入1000ml N,N-二甲基甲酰胺，搅拌10分钟溶解后加入1-羟基苯并三唑（HOBt）（27.0g，200mmol）、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）（76.0g，200mmol），室温搅拌反应，TLC检测，反应结束后加水500ml，乙酸乙酯萃取，依次用饱和碳酸氢钠溶液、柠檬酸水溶液、饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得Boc-His(Trt)-Gly-OMe108.2g，收率为95.3%。
取Boc-His(Trt)-Gly-OMe（100.0g，176mmol）用四氢呋喃/水（3:1）混合溶液1150ml溶解，冰浴下加入1M LiOH水溶液500ml，加毕搅拌反应15分钟，反应完毕后加入0.5M盐酸水溶液1000ml，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化制得目标产物89.4g，收率为91.7%，纯度为99.2%。MS m/z:555(M+1)。
实施例6、侧链全保护艾塞那肽[3-39]树脂的制备
称取Rink Amide MBHA树脂25.0g（荷载量0.4mmol/g,10mmol）加入固相反应器中，加入含20%哌啶的DMF溶液300ml，室温搅拌反应30min，反应完毕后抽滤，树脂用300ml DMF重复洗涤6次，将Fmoc-Ser(tBu)-OH（MW：383.4,30mmol）10.8g、1-羟基苯并三唑（HOBt）（MW：135.1,30mmol）3.9g、N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）(MW:126.2,30mmol)3.6ml溶于DMF，加入固相反应器内，室温反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上步骤，逐一依次与相应的Fmoc保护氨基酸偶联，各Fmoc保护氨基酸的用量与前述Fmoc-Ser(tBu)-OH相同；依次连接的Fmoc保护氨基酸为：
Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH）、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH）、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，制得侧链全保护艾塞那肽[3-39]肽-树脂，其结构如下：
Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA树脂。
实施例7、侧链全保护艾塞那肽[3-39]树脂的制备
称取Rink Amide AM树脂50.0g（荷载量：0.4mmol/g,20mmol）加入反应器中，用20%哌啶/DMF600ml脱除Fmoc保护基团，反应完毕后抽滤，树脂用DMF重复洗涤6次，每次600ml；将Fmoc-Ser(tBu)-OH（MW：383.4,50mmol）19.2g、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑（HOAt）（MW：136.1,50mmol）6.8g、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）(MW:380.2,50mmol)19.0g溶于DMF，加入固相反应器内，反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上步骤，逐一依次与相应的Fmoc保护氨基酸偶联（逐一依次连接的氨基酸同实施例6），制得侧链全保护艾塞那肽[3-39]肽-树脂，其结构如下：
Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide AM树脂。
实施例8、侧链全保护艾塞那肽[3-39]树脂的制备
称取Sieber Amide树脂30g（荷载量：0.5mmol/g,15mmol）加入反应器中，用20%哌啶/DMF溶液450ml脱除Fmoc保护基团，反应完毕后抽滤，用DMF洗涤6次，每次用450ml；将Fmoc-Ser(tBu)-OH（MW：383.4,45mmol）17.3g、1-羟基苯并三唑（HOBt）（MW：135.1,45mmol）6.08g、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）(MW:379.2,45mmol)17.05g溶于DMF，加入固相反应器内，反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上步骤，依次与相应的Fmoc保护氨基酸偶联（逐一依次连接的氨基酸同实施例6），制得侧链全保护艾塞那肽[3-39]肽-树脂，其结构如下：
Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Sieber Amide树脂。
实施例9、侧链全保护艾塞那肽-树脂的制备
将实施例6制备的侧链全保护艾塞那肽[3-39]肽-树脂（10mmol），加入20%哌啶/DMF溶液300ml脱除Fmoc保护基团，室温搅拌反应45min，反应完毕后抽滤，用DMF重复洗涤6次，每次用DMF300ml，将脱保护后的艾塞那肽[3-39]肽-树脂、Fmoc-His(Trt)-Gly-OH（MW：676.3,30mmol）20.3g、1-羟基苯并三唑（HOBt）（MW：135.1,30mmol）4.1g、N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）(MW:126.0,30mmol)4.72ml溶于DMF中，加入固相反应器内，反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，用20%哌啶/DMF脱除Fmoc保护，制得侧链全保护艾塞那肽-树脂，其结构如下：
H-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA树脂。
实施例10、侧链全保护艾塞那肽-树脂的制备
将实施例7制备的侧链全保护艾塞那肽[3-39]肽-树脂（10mmol）,加入20%哌啶/DMF溶液300ml脱除Fmoc保护基团,室温搅拌反应45min,反应完毕后抽滤,用DMF重复洗涤树脂6次,每次用DMF300ml,将脱保护后的艾塞那肽[3-39]肽-树脂、
Fmoc-His(Fmoc)-Gly-OH（MW：656.2,30mmol）19.7g、1-羟基苯并三唑（HOBt）（MW：135.1,30mmol）4.1g、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）(MW:379.2,30mmol)11.3g溶于DMF，加入固相反应器内，反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，用20%哌啶/DMF脱除Fmoc保护，制得侧链全保护艾塞那肽-树脂，其结构如下：
H-His-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide AM树脂。
实施例11、侧链全保护艾塞那肽-树脂的制备
将实施例8制备的侧链全保护艾塞那肽[3-39]肽-树脂（10mmol），加入20%哌啶/DMF溶液300ml脱除Fmoc保护基团，室温搅拌反应45min，反应完毕后抽滤，用DMF重复洗涤树脂6次，每次用DMF300ml，将脱保护后的艾塞那肽[3-39]肽-树脂、
Boc-His(Boc)-Gly-OH（MW：412.4,30mmol）12.4g、1-羟基苯并三唑（HOBt）（MW：135.1,30mmol）4.1g、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）(MW:379.2,30mmol)11.3g溶于DMF，加入固相反应器内，反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，制得侧链全保护艾塞那肽-树脂，其结构如下：
Boc-His(Boc)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Sieber Amide树脂。
实施例12、艾塞那肽粗品的制备
配制酸解剂200ml，其中三氟乙酸180ml，1,2-乙二硫醇5ml，水10ml，苯酚5g，预冷至0℃；
将实施例9制备的侧链全保护艾塞那肽-树脂20g加入到500ml圆底烧瓶中；加入配制的酸解剂进行裂解反应，裂解反应温度在20分钟内升至25℃，并在此温度下反应2小时，过滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液。在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入1.1L预冷却的乙醚内，出现白色沉淀，静置1小时后，抽滤，并用冰乙醚洗涤滤饼5次，真空干燥得到艾塞那肽粗品8.5g（也称粗肽）。粗肽收率92.1%。
实施例13、艾塞那肽粗品的制备
配制酸解剂400ml，其中三氟乙酸350ml，1,2-乙二硫醇15ml，水20ml，苯酚15g，预冷至0℃；
将实施例10制备的侧链全保护艾塞那肽-树脂40g加入到1000ml圆底烧瓶中；加入配制的酸解剂进行裂解反应，裂解反应温度在20分钟内升至25℃，并在此温度下反应2小时，过滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液。在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入2.2L预冷却的乙醚内，出现白色沉淀，静置1小时后，抽滤，并用冰乙醚洗涤滤饼5次，真空干燥得到艾塞那肽粗品（粗肽）16.5g。粗肽收率93.5%。
实施例14、艾塞那肽粗品的纯化
称取艾塞那肽粗品粉末，加入至重量浓度为10%乙酸水溶液内，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
高效液相色谱法进行纯化时的条件，色谱柱：以10um的十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子直径和长度为：50mm×250mm；流动相：0.1%TFA/水溶液-0.1%TFA/乙腈溶液；洗脱的流速60ml/min；采用梯度洗脱，循环进样方式上样。将上述处理的样品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得艾塞那肽三氟乙酸盐溶液。
将上述得到的艾塞那肽三氟乙酸盐溶液再采用高效液相色谱法进行换盐，色谱柱：以10um的十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子直径和长度为：50mm×250mm；流动相为0.5%乙酸水溶液-乙腈；洗脱的流速为60ml/min；采用梯度洗脱，循环进样方式上样。将艾塞那肽三幅乙酸溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得到艾塞那肽醋酸盐水溶液，冷冻干燥得产品0.94g，总收率11%，产品纯度为99.5%，艾塞那肽[D-His1]杂质、艾塞那肽[Des Gly2]杂质均小于0.1%。得艾塞那肽纯品。
Claims (10)
1.一种艾塞那肽的制备方法，包括步骤如下：
（1）以氨基树脂为原料，加入脱保护剂，脱除所述氨基树脂上的Fmoc保护基；
（2）将步骤（1）脱除Fmoc保护基的氨基树脂采用逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的氨基酸，所述的偶联是在活化助剂和缩合剂存在下进行的固相偶联反应，以茚三酮检测阴性为反应终点，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再与下一个Fmoc保护的氨基酸进行固相偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护艾塞那肽[3-39]肽-树脂：
Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-树脂；
所述的各Fmoc保护的氨基酸的用量与氨基树脂的用量的摩尔比为2～5:1；
（3）将步骤（2）制备的侧链全保护的艾塞那肽[3-39]肽-树脂与R1-His(R2)-Gly-OH二肽片段在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，接入[1-2]肽组氨酸和甘氨酸（His-Gly），得到侧链全保护艾塞那肽-树脂：
R1-His(R2)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-树脂，其中，R1-His(R2)-Gly对应的结构为：
R1、R2为侧链保护基团，各自独立的选自Fmoc、Boc、Trt；
当侧链保护基团R1和/或R2为Fmoc时，所得侧链全保护艾塞那肽-树脂用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再进行下一步骤；
（4）上述步骤（3）制备的侧链全保护艾塞那肽-树脂经酸解剂裂解除去树脂和保护基团，经沉淀，得到艾塞那肽粗品。
2.如权利要求1所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的氨基树脂选自Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂、Sieber Amide树脂或Rink Amide AM树脂。
3.如权利要求1所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的氨基树脂的荷载量为0.3～1.5mmol/g，优选0.3～0.8mmol/g。
4.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于：步骤（2）及步骤（3）所述的缩合剂选自N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、N,N-二环己基碳二亚胺（DCC），六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBOP）、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）或O-苯并三氮唑-N,N,N’,N-四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU）；优选为N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）；缩合剂的用量与氨基树脂中氨基的摩尔比为2～6:1。
5.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于：步骤（2）及步骤（3）所述的活化助剂选自1-羟基苯并三唑（HOBt）、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑（HOAt）；优选为1-羟基苯并三唑（HOBt）；活化助剂与氨基树脂中氨基的摩尔比为2～6:1。
6.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于：步骤（2）所述的固相偶联反应时间为60～30min，优选60～120min。
7.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于：步骤（4）所述的酸解剂为三氟乙酸（TFA）、1,2-乙二硫醇（EDT）、水、苯酚组成的混合物，三氟乙酸：1,2-乙二硫醇：水：苯酚=85～90：2～5：2～5：2～5体积比；所述的酸解剂的用量与艾塞那肽-树脂之比为5～20ml/g；优选8～15ml/g，更优选10ml/g。
8.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于：步骤（4）所述的裂解反应时间为1～5h，优选为1.5～3.5h。
9.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于：步骤（3）所述的二肽片段R1-His(R2)-Gly-OH的制备步骤如下：
将起始原料R1-His(R2)-OH、甘氨酸甲酯按照摩尔比1:1的比例溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，加入与起始原料R1-His(R2)-OH等摩尔的缩合剂、活化助剂，搅拌反应10～30h，加入水和有机溶剂萃取，依次用饱和碳酸氢钠溶液、柠檬酸水溶液、饱和食盐水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得R1-His(R2)-Gly-OMe；将R1-His(R2)-Gly-OMe用四氢呋喃/水（v/v=3:1体积比）混合溶液溶解，冰浴下加入1M的LiOH水溶液，反应完毕后加入0.5M的盐酸水溶液，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化得二肽片段R1-His(R2)-Gly-OH；其中R1、R2的定义如式I所述。
10.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于：所述步骤（4）得到的艾塞那肽粗品经反相高效液相色谱纯化，冻干得到艾塞那肽纯品。
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| CN103224558B (zh) | 2015-08-12 |
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