CN113330021A - 肽沉淀方法 - Google Patents

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Abstract

提供了合成肽的方法。该方法包括促进肽过滤的特定沉淀步骤。

Description

肽沉淀方法
提供了合成肽的方法。该方法包括促进肽过滤的特定沉淀步骤。
肽，无论是在溶液中或在固相上，通常都是通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合从C到N末端合成。然而，合成肽的肽和氨基酸倾向于具有反应性侧链官能团。因此，在合成肽时，重要的是确保相应的氨基选择性地与羧基反应，而不会在此类侧链官能团上发生任何副反应，因为从实用的角度来看这可能会严重损害收率或甚至会破坏被合成的产物。为了最小化此类副反应，因此常规做法是适当地掩蔽反应物的反应性侧基和末端以帮助确保所需的反应发生。
由于相应的氨基保护基(临时保护基)在合成期间被多次去除，因此它们的去除必须在温和的条件下进行。同时，氨基酸和肽反应物的反应性侧链基团，包括树脂结合的肽材料以及要加到生长链中的额外材料，通常在整个合成过程中都被侧链保护基掩盖(永久性保护基)并且仅在合成过程的最后一步被去除。
众所周知的临时保护基是叔丁氧基羰基(Boc)和9-芴甲氧基羰基(Fmoc)，它们可以被弱酸或弱碱裂解。
然而，任选地在清除剂和溶剂存在的情况下，永久性保护基的裂解以及从树脂的裂解通常受强酸或强碱的影响。在裂解后，必须从裂解溶液中回收肽。
回收肽的典型方法包括使用酸/盐化学。例如，肽可以在盐水溶液(例如氯化钠)中沉淀，并且然后可以收集固体(例如，通过真空过滤)、洗涤和干燥固体。然而，这些方法存在商业规模生产的问题，包括高杂质水平。其他回收方法包括通过加入溶剂例如特别是醚溶剂来沉淀肽，然后通过过滤收集沉淀的肽。
然而，用醚溶剂沉淀通常会导致肽沉淀物堵塞过滤装置(例如，当沉淀物太细时)和/或发粘/粘稠，并且因此也会使过滤复杂化或甚至阻止过滤(例如，当沉淀物是胶状时)。
因此，对于肽的大规模生产，此类问题会极大地影响肽合成方案的可行性。因此，持续需要能够以大批量生产具有商业价值的肽材料的肽合成方法。在合成后回收肽材料，例如通过沉淀和后续的过滤，是其中需要进一步改进的合成的一个方面，因为常规方法通常仍然需要大量的过滤时间，这继而显著影响生产成本。
现已令人惊奇地发现，根据本发明的方法制备的肽沉淀物可以比根据本领域标准方法沉淀的肽沉淀物过滤得快得多。因此，根据本发明的方法可以有利地用于提供用于合成和回收肽的改进的商业规模方法。
因此，在第一个实施方式中，本发明涉及一种获得完全脱保护的肽的方法，所述方法包括以下连续步骤：
a.)合成具有至少一个酸不稳定保护基的肽中间体
b.)使用包含酸和任选的清除剂和/或非质子溶剂的裂解试剂去除所述保护基以形成裂解的肽溶液(I)，然后
c.)向裂解的肽溶液(I)提供溶剂以形成裂解的肽溶液(II)，所述溶剂选自氯仿、二氯甲烷或式(I)的酯溶剂
Figure BDA0003168425620000021
其中R1和R2彼此独立地为直链或支链C1-C10烷基或C3-C6环烷基，然后
d.)以足以从裂解的肽溶液(II)中沉淀肽的量提供沉淀剂，所述沉淀剂选自至少一种醚溶剂和至少一种烃溶剂及其混合物，以及
e.)收集肽。
另一方面，本发明提供了一种用于沉淀肽的方法，所述方法包括以下连续步骤：(a)提供基本上由具有至少一个酸不稳定保护基的肽中间体和由酸和任选的清除剂和/或溶剂构成的裂解试剂组成的组合物，然后(b)向组合物提供溶剂以获得裂解的肽溶液(II)，所述溶剂选自氯仿、二氯甲烷或如上定义的式(I)的酯溶剂，然后(c)向裂解的肽溶液(II)提供沉淀剂，所述沉淀剂选自醚溶剂和烃溶剂及其混合物，然后d.)收集肽。
根据本发明使用的术语“基本上由……组成”是指所列成分的总量理想地总计为100重量％。然而，不排除可能存在少量杂质或添加剂，条件是此类杂质或添加剂的总量优选小于3重量％，更优选小于2重量％，最优选小于1重量％。
在步骤b.)中，加入选自氯仿、二氯甲烷或式(I)的酯溶剂的有机溶剂可导致肽的初始沉淀。然而，调节溶剂的量，使得在这种沉淀的情况下肽再次重新溶解以形成裂解的肽溶液。有机溶剂的量可以由本领域技术人员容易地调节并且可以根据肽序列和在稀释/再溶解步骤b.)中应用的温度略微变化。
优选地，步骤b.)在环境温度下进行，即在18至25℃范围内的温度下进行。
与在实施例中说明的省略稀释/再溶解步骤的现有分离技术相比，将步骤b.)并入裂解肽的分离步骤提供显著减少的过滤时间。
如本文所用，术语“具有至少一个酸不稳定保护基的肽中间体”是指包含至少一个酸不稳定保护基的肽。根据本发明的肽中间体因此可以被完全受保护，即所有侧链反应性基团以及合适的末端氨基酸包括酸不稳定保护基(包括N以及C末端保护基)。然而，在其他方面，本发明也可用于回收其中仅所有侧链反应性基团或仅末端氨基酸包括酸不稳定保护基的肽。在固相合成的情况下，树脂本身也可能是酸不稳定的，并且因此被认为是酸不稳定保护基。然而，优选地，根据本发明的肽中间体包含至少一个酸不稳定侧链保护基。
酸不稳定(侧链)保护基是指这样的化学部分，该化学部分与肽，例如优选与有助于防止不希望的副反应(例如防止侧链的一部分与肽合成、加工等步骤中使用的化学品反应)的氨基酸的侧链(即氨基酸通式H2N-C(R)(H)-COOH中的R基团)偶联并且任选在清除剂的存在下可以用酸去除。合适的酸不稳定(侧链)保护基的选择可取决于多种因素，例如所进行的合成类型、肽将经受的加工以及所需的中间产物或最终产物。酸不稳定(侧链)保护基也取决于氨基酸本身的性质。通常，选择酸不稳定(侧链)保护基，其在合成期间α-氨基的脱保护过程中不被去除。因此，α-氨基保护基和侧链保护基通常不同。
根据本发明的合适的酸不稳定(侧链)保护基的实例包括但不限于叔丁基(tBu)、三苯甲基(trityl，trt)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、2-氯三苯甲基(2-ClTrt)、1-环丙基-1-甲基乙基(Dmcp)、四氢吡喃基、叔丁氧基羰基(BOC)、甲氧基三甲基苯磺酰基-(Mtr-)、2,2,5,7,8-五甲基-色满-6-磺酰基-(Pmc-)、2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基-(Pbf-)、金刚氧基羰基、黄嘌呤基(Xan)、苄基、3-乙基3-戊基、5丁基5-壬基和叔丁酯、苄氧基羰基(Z)、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)和叔戊氧基羰基(Aoc)。
在本发明所有实施方式中，优选的酸不稳定侧链保护基包括酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸和天冬氨酸残基的t-Bu基团；组氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸残基的trt基团；赖氨酸、DAB和色氨酸氨基酸残基的Boc基团，精氨酸氨基酸残基的Mtr-、Pmc-、Bis-Boc或Pbf-基团。
裂解试剂中的合适的酸是能够使酸不稳定侧链保护基完全脱保护的所有酸。合适酸的选择取决于所使用的各个酸不稳定保护基并且可以被本领域技术人员容易地选择。示例性的酸包括羧酸例如甲酸、乙酸和三氟乙酸，磺酸例如甲磺酸(MSA)、三氟甲磺酸(triflic acid)、苯磺酸和对甲苯磺酸，溴化氢，三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(TMSOTf)，三甲基溴化甲硅烷(TMSBr)及其混合物。然而，在本发明的所有实施方式中，在步骤b.)中使用乙酸、三氟乙酸和甲磺酸及其混合物作为酸是优选的。最优选的是使用三氟乙酸和/或甲磺酸。
相对于肽中间体中存在的酸不稳定保护基的数量，裂解试剂中酸的总量优选在0.1至1000摩尔当量，更优选10至500摩尔当量，甚至更优选20至400摩尔当量，最优选25至250摩尔当量的范围内选择。
根据本发明的裂解试剂中使用的合适清除剂是肽合成中常用的所有清除剂，例如苯酚类，例如苯甲醚、苯酚；三烷基硅烷(更优选C1-4-三烷基硅烷)，例如三甲基硅烷、三乙基硅烷或三异丙基硅烷；硫醇例如脂族硫醇(烷基硫醇)，例如乙二硫醇、十二烷硫醇或芳族硫醇，例如苯硫醚和苯硫酚和水及其混合物。然而，在本发明的所有实施方式中，优选使用三异丙基硅烷、十二烷硫醇和水及其混合物。
相对于肽中间体中存在的酸不稳定保护基的数量，裂解试剂中清除剂的总量优选在0.1至500摩尔当量，更优选1至100摩尔当量，甚至更优选2至50摩尔当量，最优选3至40摩尔当量的范围内选择。
在优选的实施方式中，根据本发明的裂解试剂必须包含清除剂，甚至更优选裂解试剂包含选自水、三乙基硅烷、三异丙基硅烷或十二烷硫醇的清除剂，最优选选自水或十二烷硫醇。
在根据本发明的所有实施方式中，裂解试剂中使用的合适的非质子溶剂包括液体芳族烃(即芳族烃，其在环境温度(即20℃)下为液体)或C1-6-卤代烷烃，例如特别是C1-6-氟和/或氯代烷烃，例如氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、1,1-二氟乙烷及其混合物。然而，在本发明的所有实施方式中，优选使用甲苯或二氯甲烷。优选地，当清除剂不与单独的酸形成一个单相时，例如在三异丙基硅烷或十二烷硫醇的情况下，非质子溶剂仅包含在裂解试剂中。最优选，当清除剂是三异丙基硅烷时，必须存在非质子溶剂。
如果存在，选择裂解试剂中的非质子溶剂的量，使得待脱保护的肽在10℃至40℃，优选0℃至30℃，甚至更优选地10至25°范围内选择的温度下溶解于其中。优选地，如果存在，裂解试剂中的非质子溶剂的量选择在0.25至10ml/g肽中间体的范围内，更优选地在0.5至5ml/g肽中间体的范围内，最优选地在0.75至1.5ml/g肽中间体的范围内。如果没有另外说明，术语肽中间体总是指完全受保护的肽。
裂解试剂的总量适当地选择在0.5至50ml/g肽中间体的范围内，更优选在1至50ml/g肽中间体的范围内，最优选在2.5至20ml/g肽中间体的范围内(其中术语肽中间体是指完全受保护的肽)。
在根据本发明的所有实施方式中，合适的式(I)的酯溶剂包括直链或支链的C1-C10烷基乙酸酯、丙酸酯、异丙酸酯、丁酸酯等。根据本发明优选的酯溶剂是直链或支链的C1-C4烷基乙酸酯，例如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯和乙酸叔丁酯，直链或支链的C1-C4丙酸烷基酯，例如丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丙酯、丙酸正丁酯、丙酸叔丁酯以及C1-C4烷基丁酸酯，例如丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸丙酯、丁酸异丙酯和丁酸叔丁酯。然而，在本发明的所有实施方式中，优选使用乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯和乙酸二异丙酯及其混合物。
选自二氯甲烷、氯仿或式(I)的酯溶剂的有机溶剂的总量可以根据各自的肽中间体而变化并且可以被本领域技术人员容易地调节。如果加入有机溶剂后肽中间体先沉淀，则选择有机溶剂的量以使肽重新溶解。优选地，在本发明的所有实施方式中，有机溶剂的量选自0.5至100ml/g肽中间体的范围内，更优选1至50ml/g肽中间体的范围内，最优选5至35ml/g肽中间体的范围内(其中术语肽中间体是指完全受保护的肽)。其他合适的范围包括10至30ml/g肽中间体或15至30ml/g肽中间体。
在根据本发明的所有实施方式中，作为沉淀剂的合适的醚溶剂包括环戊基甲基醚、二丁基醚、二乙基醚、二异丙基醚、乙基叔丁基醚、甲基叔丁基醚及其混合物。在本发明的所有实施方式中，优选使用二乙基醚和甲基叔丁基醚及其混合物。
根据本发明作为沉淀剂的合适的烃溶剂包括戊烷、己烷、庚烷和石油醚及其混合物。在本发明的所有实施方式中，优选使用石油醚和己烷及其混合物。
如果使用醚和烃溶剂的混合物作为沉淀剂，沉淀剂中烃溶剂的总量基于所用醚溶剂不应超过35体积％。然而，在根据本发明的特别有利的实施方式中，仅使用醚溶剂作为沉淀剂，因为这导致特别有利的结果。
向裂解的肽溶液(II)提供一定量的沉淀剂，所述量足以在-10℃至40℃，优选0℃至30℃，甚至更优选10至25℃的范围内并且可以被本领域技术人员容易地调节的温度下从溶液中沉淀肽。优选地，选择沉淀剂的量以提供改进的肽沉淀物纯度。在一些实施方式中，以每体积裂解的肽溶液(II)至少约0.25体积或0.25至8体积范围内的量提供沉淀剂。在替代实施方式中，以每体积裂解的肽溶液(II)0.5至5体积范围内的量提供沉淀剂。
在本发明的一个有利的实施方式中，裂解试剂基本上由具有本文给出的所有定义和偏好的酸，最优选三氟乙酸，最优选95％三氟乙酸组成。
在本发明的另一个有利的实施方式中，裂解试剂基本上由至少一种具有本文给出的所有定义和偏好的酸，最优选三氟乙酸和/或MSA、十二烷硫醇和甲苯组成。
沉淀物可以通过本领域技术人员已知的方法例如通过过滤或离心来收集。优选通过过滤收集沉淀，甚至更优选通过用玻璃料(烧结玻璃)收集过滤。
本文所述的方法特别适用于改进肽的大规模合成的方面。在优选的实施方式中，本发明的方法可以提供诸如减少加工(合成)时间、改进产物产率以及改进产物纯度的改进。
本发明的方法可用于合成任何合适长度和/或序列的肽。应当理解，本发明的肽可以通过本领域众所周知的技术，例如通过固相合成或在溶液中合成或制备。例如，参见Creighton，1983，蛋白质：结构和分子原理，W.H.Freeman和Co.,NY，或M.Bodanszky，肽合成原理，1984，Springer Science&Business Media，以及本文引用的参考文献。
在根据本发明的有利方面，根据本发明的方法用于回收掺入一个或多个氨基酸的约2至约20，或约2至约15，或约3至12个残基，或一个或多个氨基酸的约3至约6个残基的肽。一种或多种其他单体、寡聚成分和/或聚合成分的残基可任选地掺入肽中。也可能存在非肽键。这些非肽键可以在氨基酸残基之间、在氨基酸和非氨基酸残基之间或在两个非氨基酸残基之间。这些替代的非肽键可以通过利用本领域技术人员熟知的反应形成，并且可以包括但不限于亚氨基、酯、酰肼、氨基脲、偶氮键等。
衍生肽的氨基酸可以是天然存在的氨基酸残基、非天然氨基酸残基或其组合。二十个常见的天然存在的氨基酸残基如下：A(Ala，丙氨酸)，R(Arg，精氨酸)；N(Asn，天冬酰胺)；D(Asp，天冬氨酸)；C(Cys，半胱氨酸)；Q(Gin，谷氨酰胺)，E(Glu，谷氨酸)；G(Gly，甘氨酸)；H(His，组氨酸)；I(Ile，异亮氨酸)；L(Leu，亮氨酸)；K(Lys，赖氨酸)；M(Met，蛋氨酸)；F(Phe，苯丙氨酸)；P(Pro，脯氨酸)；S(Ser，丝氨酸)；T(Thr，苏氨酸)；W(Trp，色氨酸)；Y(Tyr，酪氨酸)；和V(Val，缬氨酸)。天然存在的稀有氨基酸也被考虑并且包括例如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸。
非天然氨基酸包括具有与天然存在的氨基酸相似的结构和反应性的有机化合物，并且包括但不限于例如D-氨基酸、β-氨基酸、ω-氨基酸(例如3-氨基丙酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸(DAB)、4-氨基丁酸等)、γ氨基酸、环状氨基酸类似物、炔丙基甘氨酸衍生物、2-氨基-4-氰基丁酸衍生物。
根据本发明的肽可以在末端α-氨基被亲脂性部分取代，该亲脂性部分经由酯、酰胺、N-烷基、N-烯基、磺酰基、氨基甲酸酯、脲键连接到肽。特别地，被亲脂部分取代的肽是指其N-酰基衍生物，例如最特别地是指其N-棕榈酰基、N-肉豆蔻酰基、N-硬脂酰基、N-苯甲酰基、N-乙酰基或N-十四烷基氨基羰基衍生物。本发明所有实施方式中特别优选的肽衍生物是其N-苯甲酰基或N-十四烷基氨基羰基衍生物。
涉及沉淀肽的本发明的方法可以整合到任何肽合成程序，例如固相合成、液相合成、混合合成或重组合成中。
当利用固相肽合成(SPPS)时，在利用本文所述的本发明的方法之前，可以从固体支持物(例如树脂)上裂解合成的肽。或者，合成的肽可以在使用根据本发明的裂解试剂去除保护基的同时从固体支持物上裂解下来。
允许从树脂上裂解肽以及去除保护基的裂解试剂是本领域技术人员公知的。例如，0.5％至1％三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷或甲苯溶液或0.5％至1％TFA的二氯甲烷和甲苯溶液的组合可用于从树脂上裂解肽，而无需去除保护基。或者，HBr的乙酸溶液(HOAc)、50％TFA的二氯甲烷溶液或具有5％水的95％TFA或其他存在的清除剂可用于裂解肽并同时去除保护基。选择用于裂解的特定裂解试剂、溶剂和时间将取决于被裂解的特定肽和待去除的保护基。这些参数在相关领域的技术范围内。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，肽中间体是具有本文给出的所有定义和偏好的包含至少一个Mtr-、Pmc-或Pbf-侧链保护的精氨酸和/或至少一个Boc侧链保护的赖氨酸和/或2,3-二氨基丙酸和/或2,4-二氨基丁酸(Dab)的肽中间体。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，肽中间体是包含至少一个Mtr-、Pmc-或Pbf-侧链保护的精氨酸和至少一个携带富电子芳族侧链的氨基酸的肽中间体(I)。
此类肽中间体(I)中优选的富电子侧链是“芳族C1-C6烷基”和/或“杂芳基C1-C6烷基”。
如本文所用，术语“芳基C1-C6烷基”是指-C1-C6烷基-芳基(即被芳基取代的C1-C6烷基，即连接点是烷基)，其中术语“芳基”是指含有5至15个碳原子并含有单个芳环或稠合在一起、直接连接或间接连接的多个芳环(使得不同的芳环结合到共同基团，例如亚甲基或亚乙基)的芳族取代基。根据本发明的特别有利的芳基含有6至12个碳原子，所述碳原子含有单个芳环或稠合在一起或直接连接的多个芳环。本发明所有实施方式中最优选的芳基残基是苯基、萘基和联苯基。在本发明的所有实施方式中特别有利的芳基C1-C6烷基是芳基C1-C2烷基，例如特别是苯基(甲基)乙基或萘基(甲基)乙基。
术语“杂芳基C1-C6烷基”是指-C1-C6烷基-杂芳基(即被杂芳基取代的C1-C6烷基，即连接点是烷基)，其中术语“杂芳基”是指含有一个或多个杂原子，即N、O或S的5-、6-或7-元芳环；这些杂芳环可以与其他芳族系统稠合。特别优选的杂芳环包括咪唑、吲哚、吡啶和喹啉。
芳基或杂芳基残基可以彼此独立地未被取代或被一个或多个取代基取代。在本发明的所有实施方式中，此类取代基优选选自卤素、羟基、硝基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和C1-C6烷酰氧基。更优选地，在本发明的所有实施方式中，芳基或杂芳基残基彼此独立地未被取代或被一个或两个选自F、Cl、羟基、氰基、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基和C1-C3烷酰氧基的取代基取代，例如特别是未取代或被一个或两个选自F或羟基的取代基取代。最优选地，在本发明的所有实施方式中，芳基和杂芳基残基未被取代或被F、羟基或硝基取代。
在所有肽中间体(I)中，特别有利的芳基C1-C6烷基是芳基C1-C2烷基，其优选未被取代或被一个或两个选自氟(F)、羟基(OH)或硝基(NO2)的取代基取代。在本发明的所有实施方式中，最优选的芳基C1-C6烷基是苯基(甲基)乙基、4-羟基苯基(甲基)乙基、3-硝基-4-羟基苯基(甲基)乙基或萘基(甲基)乙基例如特别是苯基甲基、4-羟基苯基(甲基)乙基、3-硝基-4-羟基苯基甲基或1-萘甲基或2-萘甲基。
在所有肽中间体(I)中，最优选的杂芳基C1-C6烷基是优选未被取代或被一个或两个选自F(氟)、羟基(OH)或硝基(NO2)的取代基取代的杂芳基C1-C2烷基，例如(1H-吲哚-3-基)(甲基)乙基、(1H-咪唑-4-基)(甲基)乙基、(吡啶-2-基)(甲基)乙基、(吡啶-3-基)(甲基)乙基、(喹啉-2-基)(甲基)乙基和(喹啉-3-基)(甲基)乙基。在本发明的所有实施方式中最优选的是(1H-吲哚-3-基)(亚甲基)亚乙基或(1H-咪唑-4-基)(亚甲基)亚乙基。
在所有肽中间体(I)中，最优选的带有富电子芳香侧链的氨基酸选自D/L-组氨酸、D/L-色氨酸、6-氟-色氨酸、5-羟-色氨酸、D/L-苯丙氨酸、D/L-酪氨酸、D/L-m-硝基酪氨酸、D/L-O-乙基-酪氨酸、D/L-3-(2-萘基)-丙氨酸。特别有利的带有富电子芳族侧链的氨基酸选自D/L-组氨酸、D/L-苯丙氨酸、D/L-酪氨酸和D/L-色氨酸以及O-C1-C6-烷基化的D/L-酪氨酸；m/p-Cl/Br/l-D/L-苯丙氨酸；和4/-5-/6-/7-OH/F/Cl/Br/甲基-D/L-色氨酸。本发明所有实施方式中最优选的富电子侧链是D/L-组氨酸、D/L-色氨酸、D/L-酪氨酸、D/L-色氨酸、5-羟D/L-色氨酸和6-氟D/L-色氨酸。众所周知，术语D/L包括相应的D-氨基酸、L-氨基酸及其混合物。
在本发明的所有实施方式中，最优选地，包含受Mtr-、Pmc-或Pbf-侧链保护的精氨酸的肽中间体(I)还含有至少一种选自D/L-组氨酸、D/L-色氨酸、酪氨酸、D/L-6-氟-色氨酸和D/L-5-羟-色氨酸的带有富电子芳香侧链的氨基酸。
甚至更优选地，肽中间体(I)是二肽至六肽，即二肽、三肽、四肽、五肽或六肽。
在进一步优选的实施方式中，Mtr-、Pmc-或Pbf-侧链保护的精氨酸和肽中间体(I)中至少一个携带富电子芳族侧链的氨基酸被至多3个氨基酸，优选由至多两个氨基酸，更优选至多一个氨基酸隔开。然而，在本发明的所有实施方式中，富电子氨基酸最优选与Mtr-、Pmc-或Pbf-侧链保护的精氨酸直接相邻。
甚至更优选地，在本发明的所有实施方式中，肽中间体(I)是包含至少一个Pbf保护的精氨酸部分和至少一个选自酪氨酸、组氨酸(优选地Trt保护的)和/或色氨酸的氨基酸部分的肽中间体，其中组氨酸、酪氨酸或色氨酸部分优选是至多两个，更优选至多一个，例如特别是直接与受保护的精氨酸部分相邻。特别优选的酪氨酸、组氨酸和/或色氨酸氨基酸是组氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-羟基色氨酸和6-氟色氨酸及其混合物。众所周知，如上所述，Pbf-保护的精氨酸部分以及氨基酸部分可以是L-或D-构型或是两种构型的混合物(在肽内)。
根据本发明特别优选的肽中间体(I)或肽中间体(II)是Boc-Trp-Arg(Pbf)-OH、Ac-Arg(Pbf)-His(Trt)-Phe-OH、TFA*H-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-OH、Boc-rac-6FTrp-GIy-Arg(Pbf)-GIu(OtBu)-OH、Boc-Tyr(Et)-Arg(Pbf)-AIa-Phe-OH、Ac-5-(OH)Trp-AIa-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Leu-Phe-OH、Boc-Arg(Mtr)-Tyr(tBu)-Phe-OH、Boc-2NaI-Leu-Arg(Pbf)-Phe-OH、Ac-Arg(Pbf)-Met-m(NO2)Tyr-Pro-OH和Bz-GIy-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-D-Trp-N(Pr)2。Bz-GIy-His-D-Phe-Arg(Pbf)-D-Trp-NPr2、Bz-GIy-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-D-Trp(Boc)-NPr2。最优选的肽中间体(I)或(II)是Bz-GIy-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-NPr2。
在本发明的另一个特别优选的实施方式中，肽中间体是肽中间体(III)，所述肽中间体(III)在至少一个Boc侧链旁边包含受保护的赖氨酸和/或2,3-二氨基丙酸和/或2,4-二氨基丁酸(Dab)和/或至少一种缬氨酸或亮氨酸或异亮氨酸。甚至更优选地，所述肽中间体(III)是仅由Boc侧链保护的溶素或2,4-二氨基丁酸和缬氨酸组成的肽中间体(IV)。
甚至更优选地，肽中间体(III)和肽中间体(IV)是二肽至六肽，即二肽、三肽、四肽、五肽或六肽。
本发明最优选的肽中间体(III)和肽中间体(IV)是TDAC-Dab(Boc)-Val-Dab(Boc)-OH、TDAC-Dab(Boc)-Val-Dab(Boc)-O-树脂和Ac-Lys(Boc)-VaI-Lys(Boc)-Val-Lys(Boc)-Val-OH。
参考以下非限制性实施例进一步说明本发明，其中除非另有说明，所有百分比均按总重量计。
实施例
缩写
Ac 乙酰基
Arg 精氨酸
Boc 叔丁氧基羰基
Bz 苯甲酰基
DCM 二氯甲烷
D-Phe D-苯丙氨酸
EtOAc 乙酸乙酯
EtOPr 丙酸乙酯
Et2O 二乙基醚
Gly 甘氨酸
iPropOAc 乙酸异丙酯
min 分钟
MSA 甲磺酸
MTBE 甲基叔丁基醚
Pbf 2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基
PrOAc 乙酸丙酯
TFA 三氟乙酸
Trp 色氨酸
Trt 三苯甲基
Val 缬氨酸
标准(参考)方法：
将表1和2中列出的相应受保护肽(800mg)置于烧瓶中。然后将裂解试剂(Ref 1:0.8ml甲苯、387μL十二烷硫醇、245μL MSA和4.15ml 100％TFA；Ref 2和3：5.0ml 95％TFA)加入肽并将所得反应混合物搅拌1小时以形成裂解的肽溶液(I)。
然后，将裂解的肽溶液(I)转移到43ml MTBE上，导致裂解的肽沉淀。将所得肽悬浮液在环境温度下搅拌约15min。然后将肽悬浮液转移到G4孔径玻璃料中。标记液位并对玻璃料施加300毫巴的减压。在液位下降到2cm(从玻璃料顶部测量)后，记录过滤时间，直到从玻璃料中除去所有液体。
根据本发明的方法：
将各个受保护的肽(800mg)置于烧瓶中。然后向肽中加入裂解试剂(I-1至I-10：0.8ml甲苯、387μl十二烷硫醇、245μl甲磺酸和4.15ml 100％TFA；I-11和I-1：5.0ml 95％TFA)，将所得反应混合物搅拌1小时以形成裂解的肽溶液(I)。然后，将裂解的肽溶液(I)转移到表1和2中列出的有机溶液上(在I-5、I-6、I-7、I-11、I-12、I-13的情况下，导致肽的最初沉淀，然后再次再溶解肽)。在环境温度(约20℃)下继续搅拌，产生裂解的肽溶液(II)(约15min)。然后，将沉淀剂加入裂解的肽溶液(II)中并将所得肽悬浮液再搅拌15min。然后将肽悬浮液转移到G4孔径玻璃料中。标记液位并对玻璃料施加300毫巴的减压。在液位下降到2cm(从玻璃料顶部测量)后，记录过滤时间，直到从玻璃料中除去所有液体。
表1：Bz-Gly-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-NPr2的脱保护
Figure BDA0003168425620000141
1有机溶剂[ml]
2沉淀剂[ml]
表2：TDAC-Dab(Boc)-Val-Dab(Boc)-OH(R-2&1-11&1-12)或Ac-Lys(Boc)-Val-Lys(Boc)-Val-Lys(Boc)-Val-OH(R-3和I-13)的脱保护
Figure BDA0003168425620000142
Figure BDA0003168425620000151
1有机溶剂[ml]
2沉淀剂[ml]

Claims (15)

1.一种获得完全脱保护的肽的方法，所述方法包括以下步骤
a.)合成具有至少一个酸不稳定保护基的肽中间体
b.)使用包含酸和任选的清除剂和/或非质子溶剂的裂解试剂去除所述保护基以形成裂解的肽溶液(I)，然后
c.)向所述裂解的肽溶液(I)提供有机溶剂以形成裂解的肽溶液(II)，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷或式(I)的酯溶剂，
Figure FDA0003168425610000011
其中R1和R2彼此独立地为直链或支链的C1-C10烷基或C3-C6环烷基，然后
d.)提供一定量的沉淀剂以从所述裂解的肽溶液(II)中沉淀所述肽，所述沉淀剂选自至少一种醚溶剂和至少一种烃溶剂及其混合物；以及
e.)收集所述沉淀物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b.)中的酸选自甲酸、乙酸、三氟乙酸、磺酸、溴化氢、三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯、三甲基溴化甲硅烷及其混合物，优选选自乙酸、三氟乙酸和甲磺酸及其混合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，相对于所述肽中间体中存在的酸不稳定保护基的数量，所述酸的量在0.1至1000摩尔当量，更优选10至500摩尔当量，甚至更优选20至400摩尔当量的范围内选择。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述清除剂选自苯酚、三烷基硅烷、硫醇和水及其混合物，优选选自三异丙基硅烷、十二烷硫醇和水及其混合物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，相对于所述肽中间体中存在的酸不稳定保护基的数量，所述清除剂的量在0.1至500摩尔当量，更优选1至100摩尔当量，甚至更优选2至50摩尔当量的范围内选择。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述裂解试剂中的非质子溶剂选自液体芳族烃或C1-6卤代烷烃及其混合物。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述非质子溶剂的量在0.25至10ml/g肽中间体的范围内，更优选在0.5至5ml/g肽中间体的范围内，最优选在0.75至1.5ml/g肽中间体的范围内选择。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述裂解试剂的量在0.5至50ml/g肽中间体的范围内，更优选在1至50ml/g肽中间体的范围内，最优选在2.5至20ml/g肽中间体的范围内选择。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于步骤c.)中的所述有机溶剂的量在0.5至100ml/g肽中间体的范围内，更优选地在1至50ml/g肽中间体的范围内，最优选在5至35ml/g肽中间体的范围内选择。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，式(I)的酯溶剂选自乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯和乙酸二异丙酯及其混合物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤d.)中的醚溶剂选自环戊基甲基醚、二丁基醚、二乙基醚、二异丙基醚、乙基叔丁基醚、甲基叔丁基醚及其混合物，优选选自二乙基醚和甲基叔丁基醚及其混合物。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽掺入一个或多个氨基酸的2至20个、优选2至15个、更优选3至12个、最优选3至6个残基。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽在末端α-氨基被亲脂性部分取代，所述亲脂性部分选自乙酰基、苯甲酰基或十四烷基氨基羰基部分。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽中间体包含至少一种Mtr-、Pmc-或Pbf-侧链保护的精氨酸和/或至少一种Boc侧链保护的溶素、2,3-二氨基丙酸或2,4-二氨基丁酸。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽中间体选自Bz-Gly-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-D-Trp-N(Pr)2、Bz-Gly-His-D-Phe-Arg(Pbf)-D-Trp-N(Pr)2、Bz-Gly-His-D-Phe-Arg(Boc)2-D-Trp-N(Pr)2、Bz-Gly-His(Trt)-D-Phe-Arg(Boc)2-D-Trp-N(Pr)2、TDAC-Dab(Boc)-Val-Dab(Boc)-OH、TDAC-Dab(Boc)-Val-Dab(Boc)-OtBu、TDAC-Dab(Boc)-Val-Dab(Boc)-O-树脂、Ac-Lys(Boc)-Val-Lys(Boc)-Val-Lys(Boc)-Val-OH。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114907562A (zh) * 2022-01-29 2022-08-16 华东理工大学 β-内酰胺单体的合成及聚合方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4337672A1 (en) * 2021-05-10 2024-03-20 DSM IP Assets B.V. Purification of specific tripeptide by use of ethers

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005063793A1 (en) * 2003-12-31 2005-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Process and systems for recovery of peptides
WO2012171984A1 (en) * 2011-06-16 2012-12-20 Lonza Ltd A process for extraction of peptides and its application in liquid phase peptide synthesis
CN103224558A (zh) * 2013-04-03 2013-07-31 齐鲁制药有限公司 一种艾塞那肽的制备方法
CN104017064A (zh) * 2014-06-13 2014-09-03 杭州诺泰制药技术有限公司 一种制备特立帕肽的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005063799A2 (en) 2003-12-31 2005-07-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Peptide synthesis and deprotection with co-solvent
KR101996700B1 (ko) 2011-12-23 2019-07-04 입센 메뉴팩츄링 아일랜드 리미티드 치료 펩티드의 합성 방법
CN102875649B (zh) 2012-09-26 2014-04-16 深圳翰宇药业股份有限公司 一种制备特拉匹韦及其中间体的方法及所述中间体

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005063793A1 (en) * 2003-12-31 2005-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Process and systems for recovery of peptides
WO2012171984A1 (en) * 2011-06-16 2012-12-20 Lonza Ltd A process for extraction of peptides and its application in liquid phase peptide synthesis
CN103224558A (zh) * 2013-04-03 2013-07-31 齐鲁制药有限公司 一种艾塞那肽的制备方法
CN104017064A (zh) * 2014-06-13 2014-09-03 杭州诺泰制药技术有限公司 一种制备特立帕肽的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114907562A (zh) * 2022-01-29 2022-08-16 华东理工大学 β-内酰胺单体的合成及聚合方法
CN114907562B (zh) * 2022-01-29 2023-08-18 华东理工大学 β-内酰胺单体的合成及聚合方法

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