CN103214568B - 一种固相制备促胰液素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种固相制备促胰液素的方法，包括以下步骤：1)选择合适的固相载体；2)按照固相合成方法，逐个偶联氨基酸；3)裂解，得到粗肽；4)粗肽经纯化得到促胰液素，其中固相合成采用Fmoc-策略，并在固相合成中以假脯氨酸代替肽链中的部分丝氨酸。本发明提供了一种操作简单、杂质少、易纯化、收率高、有利于实现产业化的固相制备促胰液素的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种固相制备多肽药物的方法，特别涉及一种固相制备促胰液素的方法，属于药物化学领域。
背景技术
促胰液素(英文名Secretin)是由位于十二指肠和空肠上段粘膜中的S细胞分泌，由27个氨基酸组成的具有螺旋结构的碱性多肽，具有调节胰腺外分泌、抑制胃酸分泌和胃运动等多种生理功能，其肽序为H-His-Ser-
1Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gl8 16n-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2，也简写为HSDGTFTSELSRLRDSA
24RLQRLLQGLV-NH2，其结构式如下：
现有技术secretin的逐步偶联的合成，采用全液相合成(JACS，1967,6753，采用全液相合成的缺点在于合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。采用该方法，secretin的逐步偶联的合成总收率小于10%。
Helv.Chim.Acta1976,1112,Int.J.Peptide Protein Res,1977,63)，固相采用Boc-策略(Int.J.Peptide Protein Res,1977,63)合成secretin，固相Boc-策略中，反复地用酸来脱保护，这种处理带来了以下问题：如在肽与树脂的接头处，当每次用50%TFA脱Boc基时，有约1.4%的肽从树脂上脱落，合成的肽越大，这样的丢失越严重;此外，酸催化会引起侧链的一些副反应，Boc合成法尤其不适于合成含有色氨酸等对酸不稳定的肽类。
现有技术(JACS,1968,4711;Chem.Ber.1972,2508;Chem.Ber.1974,215)公开了一种片段偶联法制备secretin，由于secretin结构中既有多个疏水性的Leu、Val，又有亲水性的Lys、His和Arg等，使片断的溶解性很差，进而在片断合成以及各片断偶联的过程中需要大量溶剂，且由于反应液浓度较稀，使反应不够完全。
另外，还有一种合成方法(US4755591)采用高氯酸保护的Arg，能改善片断的溶解性，其先采用Z策略合成片断，然后再脱除Z保护基后用高氯酸处理得到高氯酸保护Arg的片断。由于上高氯酸前和上高氯酸后的片断均需纯化，故增加了合成和纯化的工作量。
上述现有技术虽能用于secretin的合成，但是收率较低，其中，secretin的液相逐步偶联的合成总收率小于10%；固相Boc-策略合成总收率小于20%；采用高氯酸保护Arg的合成策略其合成总收率小于30%。因此，为提高secretin的合成收率，降低生产成本，提高该品的产业化生产和广泛应用，需进一步研究新的高收率合成方法。
发明内容
本发明采用固相Fmoc策略进行合成，为了解决合成中的溶解性问题和肽链在合成中的折叠问题，使用假脯氨酸代替肽链中的部分丝氨酸进行合成，有效地提高了促胰液素的收率和纯度，更易于产业化。
本发明所述一种固相制备促胰液素的方法，包括以下步骤：
1)选择合适的固相载体；
2)按照固相合成方法，逐个偶联氨基酸；
3)裂解，得到粗肽；
4)粗肽经纯化得到Secretin。
步骤1)中所述的固相载体为Rink Amide树脂、Rink Amide-AM树脂或Rink Amide-MBHA树脂等氨基树脂，树脂替代度为0.1-0.6mmol/g，优选0.1-0.4，更优选0.15-0.25。
所选择该树脂为氨基树脂，用于C端为酰胺的secretin的合成，易于合成氨基酸及其片段的搭载。
树脂的替代度由发明人通过大量的实验筛选得出，当替代度高于0.6mmol/g，偶联肽链较长后会降低偶联效果；而替代度低于0.6mmol/g，消耗树脂增多进而使成本上升。
步骤2)所述的固相合成方法是Fmoc固相多肽合成方法，依促胰液素肽序从Val端逐个偶联氨基酸，其中，选择假脯氨酸代替16位和8位Ser，或者假脯氨酸仅代替16位的Ser。
步骤2)中选用的偶联剂为DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一。
进一步地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比例计为DIPCDI:A=1.3:1.2，DIPEA:A:B=2.0:1.2:1.0。
步骤3)中所述的裂解，裂解试剂TFA+TA+TIS+EDT+H2O，TFA：TA：TIS：EDT：H2O体积比(V:V)为80～90:0～2:0～3:0～5:0～5。
该裂解试剂中四种捕获剂TA、TIS、EDT和H2O的用途分别为：
TA：针对Met的氧化与EDT共用，此外，加速Arg侧链保护基团pbf的脱去；
TIS：减少非芳香性氨基酸在裂解中出现副反应
EDT：针对tBu是最好的捕获剂
H2O：针对tBu、Boc、Trt和pbf的捕获剂。
所选择裂解剂能针对各Secretin的氨基酸组成进行裂解，提高裂解效率和裂解效果。
步骤4)所述的纯化为粗品过反相高压液相纯化、冻干得到产品。
其中，所述步骤2)依促胰液素肽序从Val端逐个偶联氨基酸的进一步详述是指，首先，Fmoc-Val-OH与树脂在偶联剂下偶联得到Fmoc-Val-树脂，在脱保护溶剂下脱除Fmoc；与Fmoc-Leu-OH在偶联剂作用下偶联得到Fmoc-Leu-Val-树脂，在脱保护溶剂下脱除Fmoc；与Fmoc-Gly-OH在偶联剂作用下偶联得到Fmoc-Gly-Leu-Val-树脂，在脱保护溶剂下脱除Fmoc；与Fmoc-Gln-OH在偶联剂作用下偶联得到Fmoc-Gln-Gly-Leu-Val-树脂；然后，按照上述方法及下列氨基酸顺序依次偶联:
(1)Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH；
或者(2)Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。
本发明的发明关键点及有益效果在于：
1、固相Fmoc-策略合成Secretin，在碱性条件下可以迅速脱除，可以在较短时间内反应完全，而且其反应条件温和，易于Secretin的产业化合成。
2、Secretin固相合成中假脯氨酸代替肽链中的部分丝氨酸，一方面假脯氨酸的刚性结构会减少肽链偶联过程中的β-折叠，进而提高反应效率；另一方面假脯氨酸可以减少Ser的消旋。但假脯氨酸价格昂贵，发明人通过大量的实验筛选和验证发现，只选择假脯氨酸代替合适位点的Ser，如16位和8位Ser，尤其是Ser16，既节约了生产成本，又对改善β-折叠有较明显的效果，提高产品的收率和纯度。
3、本发明制备方法制得的Secretin的HPLC纯度大于99%，总收率大于50%，相对于现有技术，收率有大幅的提高，有利于该品的产业化应用。
具体实施方式
实施例1：Fmoc-Val-Rink Amide树脂的制备
称取替代度为0.3mmol/g的Rink Amide树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取1.02g(3mmol)Fmoc-Val-OH和0.49g(3.6mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入0.62mL(3.9mmol)DIPCDI活化3min后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，DMF洗涤3次，加入21mL乙酐和17.5mL吡啶封闭2h。用DMF洗涤6次，用甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Val-Rink Amide树脂，检测替代度为0.1mmol/g。
实施例2：Fmoc-Val-Rink Amide树脂的制备
称取替代度为0.3mmol/g的Rink Amide树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取1.70g(5mmol)Fmoc-Val-OH和0.82g(6mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入0.97mL(6.5mmol)DIPCDI活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，DMF洗涤3次，加入21mL乙酐和17.5mL吡啶封闭2h。用DMF洗涤6次，用甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Val-Rink Amide树脂，检测替代度为0.15mmol/g。
实施例3：Fmoc-Val-Rink Amide树脂的制备
称取替代度为0.5mmol/g的Rink Amide树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取4.1g(12mmol)Fmoc-Val-OH和1.95g(14.4mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入2.5mL(15.6mmol)DIPCDI活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，DMF洗涤3次，加入21mL乙酐和17.5mL吡啶封闭2h。用DMF洗涤6次，用甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Val-Rink Amide树脂，检测替代度为0.4mmol/g。
实施例4：Fmoc-Val-Rink Amide树脂的制备
称取替代度为0.7mmol/g的Rink Amide树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取6.8g(20mmol)Fmoc-Val-OH和3.3g(24mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入3.9mL(26mmol)DIPCDI活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，DMF洗涤3次，加入42mL乙酐和35mL吡啶封闭2h。用DMF洗涤6次，用甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Val-Rink Amide树脂，检测替代度为0.6mmol/g。
实施例5：Fmoc-Val-Rink Amide-MBHA树脂的制备
称取替代度为0.3mmol/g的Rink Amide-MBHA树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取3.4g(10mmol)Fmoc-Val-OH和1.6g(12mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入2mL(13mmol)DIPCDI活化3min后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，DMF洗涤3次，加入21mL乙酐和17.5mL吡啶封闭2h。用DMF洗涤6次，用甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Val-Rink Amide树脂，检测替代度为0.25mmol/g。
实施例6：Fmoc-Val-Rink Amide-MBHA树脂的制备
称取替代度为0.6mmol/g的Rink Amide-MBHA树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取6.8g(20mmol)Fmoc-Val-OH和3.2g(24mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入4mL(26mmol)DIPCDI活化3min后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，DMF洗涤3次，加入21mL乙酐和17.5mL吡啶封闭2h。用DMF洗涤6次，用甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Val-Rink Amide树脂，检测替代度为0.5mmol/g。
实施例7：Fmoc-Val-Rink Amide-AM树脂的制备
称取替代度为0.3mmol/g的Rink Amide-AM树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取1.2g(3.5mmol)Fmoc-Val-OH和0.57g(4.2mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入0.7mL(4.6mmol)DIPCDI活化3min后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，DMF洗涤3次，加入21mL乙酐和17.5mL吡啶封闭2h。用DMF洗涤6次，用甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Val-Rink Amide树脂，检测替代度为0.18mmol/g。
实施例8：Fmoc-Val-Rink Amide-AM树脂的制备
称取替代度为0.3mmol/g的Rink Amide-AM树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取3.4g(10mmol)Fmoc-Val-OH和1.6g(12mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入2mL(13mmol)DIPCDI活化3min后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，DMF洗涤3次，加入21mL乙酐和17.5mL吡啶封闭2h。用DMF洗涤6次，用甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Val-Rink Amide树脂，检测替代度为0.21mmol/g。
实施例9：Fmoc-Val-Rink Amide-AM树脂的制备
称取替代度为0.3mmol/g的Rink Amide-AM树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取3.7g(11mmol)Fmoc-Val-OH和1.7g(13mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入2.2mL(14mmol)DIPCDI活化3min后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，DMF洗涤3次，加入21mL乙酐和17.5mL吡啶封闭2h。用DMF洗涤6次，用甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Val-Rink Amide树脂，检测替代度为0.23mmol/g。
实施例10：全保护肽树脂的制备
称取替代度为0.15mmol/g的Fmoc-Val-Rink Amide树脂16.67克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20%哌啶/DMF(V/V)溶液5+7分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.5g(10mmol)Fmoc-L-Leu-OH，1.6g(12mmol)HOBt，用25mL DMF溶解，冰水浴下加入2mL(13mmol)DIPCDI活化3分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时，下同)。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF(V/V)溶液5+7分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.0g(10mmol)Fmoc-Gly-OH，1.6g(12mmol)HOBt，用25mLDMF溶解，冰水浴下加入2mL(13mmol)DIPCDI活化3分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，偶联结束，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF(V/V)溶液5+7分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，用甲醇收缩抽干，得到全保护肽树脂27.63克，树脂增重10.96，树脂增重率91.2%。
实施例11：全保护肽树脂的制备
称取替代度为0.25mmol/g的Fmoc-Val-Rink Amide-MBHA树脂10.0克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20%哌啶/DMF(V/V)溶液5+7分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.5g(10mmol)Fmoc-L-Leu-OH，1.6g(12mmol)HOBt，用25mLDMF溶解，冰水浴下加入2mL(13mmol)DIPCDI活化3分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时，下同)。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF(V/V)溶液5+7分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.0g(10mmol)Fmoc-Gly-OH，1.6g(12mmol)HOBt，用25mLDMF溶解，冰水浴下加入2mL(13mmol)DIPCDI活化3分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，偶联结束，树脂收缩抽干，得到全保护肽树脂20.80克，树脂增重10.80，树脂增重率89.6%。
实施例12：全保护肽树脂的制备
称取替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Val-Rink Amide-AM树脂12.53克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20%哌啶/DMF(V/V)溶液5+7分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.5g(10mmol)Fmoc-L-Leu-OH，1.6g(12mmol)HOBt，用25mLDMF溶解，冰水浴下加入2mL(13mmol)DIPCDI活化3分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时，下同)。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF(V/V)溶液5+7分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.0g(10mmol)Fmoc-Gly-OH，1.6g(12mmol)HOBt，用25mLDMF溶解，冰水浴下加入2mL(13mmol)DIPCDI活化3分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，偶联结束，树脂收缩抽干，得到全保护肽树脂23.80克，树脂增重11.27，树脂增重率93.8%。
实施例13(对比例)：全保护肽树脂的制备
称取替代度为0.15mmol/g的Fmoc-Val-Rink Amide树脂16.67克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20%哌啶/DMF(V/V)溶液5+7分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.5g(10mmol)Fmoc-L-Leu-OH，1.6g(12mmol)HOBt，用25mLDMF溶解，冰水浴下加入2mL(13mmol)DIPCDI活化3分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时，下同)。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF(V/V)溶液5+7分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.0g(10mmol)Fmoc-Gly-OH，1.6g(12mmol)HOBt，用25mLDMF溶解，冰水浴下加入2mL(13mmol)DIPCDI活化3分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，偶联结束，树脂收缩抽干，得到全保护肽树脂24.76克，树脂增重8.09，树脂增重率67.3%。
实施例14：粗肽的制备
将实施例10得到的全保护肽树脂27.63克加入到500mL单口瓶中，加入预先配制好的TFA：PhSMe：TIS：EDT：H2O=80:5:5:5:5(V:V)300mL，室温反应2.5小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入3000mL冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到粗肽10.36克，HPLC纯度81.6%，收率94.5%。
实施例15：粗肽的制备
将实施例11得到的全保护肽树脂20.80克加入到500mL单口瓶中，加入预先配制好的TFA：PhSMe：TIS：EDT：H2O=80:5:5:5:5(V:V)200mL，室温反应2.5小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入2000mL冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到粗肽10.31克，HPLC纯度80.3%，收率95.5%。
实施例16：粗肽的制备
将实施例12得到的全保护肽树脂23.80克加入到500mL单口瓶中，加入预先配制好的TFA：PhSMe：TIS：EDT：H2O=80:5:5:5:5(V:V)250mL，室温反应2.5小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入2500mL冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到粗肽10.74克，HPLC纯度82.8%，收率95.3%。
实施例17(对比例)：粗肽的制备
将实施例13得到的全保护肽树脂24.76克加入到500mL单口瓶中，加入预先配制好的TFA：PhSMe：TIS：EDT：H2O=80:5:5:5:5(V:V)250mL，室温反应2.5小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入2500mL冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到粗肽7.19克，HPLC纯度71.2%，收率88.9%。
实施例18：纯化制备Secretin
将实施例14所得10.36g粗肽用500mL去离子水溶解后，采用Waters2545RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，以0.1%TFA水溶液为A相，乙腈为B相进行纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%的精肽。馏分合并，旋转浓缩，冻干得到精肽6.45g，HPLC纯度99.0%，总收率51.2%。
实施例19：纯化制备Secretin
将实施例15所得10.31g粗肽用500mL去离子水溶解后，采用Waters2545RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，以0.1%TFA水溶液为A相，乙腈为B相进行纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%的精肽。馏分合并，旋转浓缩，冻干得到精肽6.41g，HPLC纯度99.1%，总收率50.9%。
实施例20：纯化制备Secretin
将实施例16所得10.74g粗肽用500mL去离子水溶解后，采用Waters2545RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，以0.1%TFA水溶液为A相，乙腈为B相进行纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%的精肽。馏分合并，旋转浓缩，冻干得到精肽6.93g，HPLC纯度99.0%，总收率55.0%。
实施例21(对比例)：纯化制备Secretin
将实施例17所得7.19g粗肽用400mL去离子水溶解后，采用Waters2545RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，以0.1%TFA水溶液为A相，乙腈为B相进行纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%的精肽。馏分合并，旋转浓缩，冻干得到精肽3.57g，HPLC纯度99.0%，总收率30%。
Claims (6)
1.一种固相制备促胰液素的方法，包括以下步骤：
1)选择合适的固相载体，所述的固相载体为Rink Amide树脂、RinkAmide-AM树脂或Rink Amide-MBHA树脂，树脂替代度为0.1-0.6mmol/g；
2)按照Fmoc固相多肽合成方法，依促胰液素肽序从Val端逐个偶联氨基酸，其中，选择假脯氨酸代替16位和8位Ser，或者假脯氨酸仅代替16位的Ser；所述偶联所用偶联剂为DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU中的一种，DIPCDI:A摩尔比为1.3:1.2，DIPEA:A:B摩尔比为2.0:1.2:1.0；
3)裂解，得到粗肽；
4)粗肽经纯化得到Secretin。
2.根据权利要求1所述的一种固相制备促胰液素的方法，其特征在于：所述的步骤1)中树脂替代度为0.1-0.4mmol/g。
3.根据权利要求1所述的一种固相制备促胰液素的方法，其特征在于：所述的步骤1)中树脂替代度为0.15-0.25mmol/g。
4.根据权利要求1至3任一权利要求所述的一种固相制备促胰液素的方法，其特征在于：步骤3)中裂解试剂为TFA+TA+TIS+EDT+H2O，TFA：TA：TIS：EDT：H2O体积比为80～90:0～2:0～3:0～5:0～5。
5.根据权利要求1至3任一权利要求所述的一种固相制备促胰液素的方法，其特征在于：依促胰液素肽序从Val端逐个偶联氨基酸是指，首先，Fmoc-Val-OH与树脂在偶联剂下偶联得到Fmoc-Val-树脂，在脱保护溶剂下脱除Fmoc；与Fmoc-Leu-OH在偶联剂作用下偶联得到Fmoc-Leu-Val-树脂，在脱保护溶剂下脱除Fmoc；与Fmoc-Gly-OH在偶联剂作用下偶联得到Fmoc-Gly-Leu-Val-树脂，在脱保护溶剂下脱除Fmoc；与Fmoc-Gln-OH在偶联剂作用下偶联得到Fmoc-Gln-Gly-Leu-Val-树脂；然后，按照上述方法及下列氨基酸顺序依次偶联:
(1)Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH；
或者(2)Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。
6.根据权利要求4所述的一种固相制备促胰液素的方法，其特征在于：依促胰液素肽序从Val端逐个偶联氨基酸是指，首先，Fmoc-Val-OH与树脂在偶联剂下偶联得到Fmoc-Val-树脂，在脱保护溶剂下脱除Fmoc；与Fmoc-Leu-OH在偶联剂作用下偶联得到Fmoc-Leu-Val-树脂，在脱保护溶剂下脱除Fmoc；与Fmoc-Gly-OH在偶联剂作用下偶联得到Fmoc-Gly-Leu-Val-树脂，在脱保护溶剂下脱除Fmoc；与Fmoc-Gln-OH在偶联剂作用下偶联得到Fmoc-Gln-Gly-Leu-Val-树脂；然后，按照上述方法及下列氨基酸顺序依次偶联:
(1)Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH；
或者(2)Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。
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