CN106928342B - 一种乌拉立肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种乌拉立肽的制备方法。本发明根据乌拉立肽的肽序结构，采用特定的保护的丝氨酸二肽作为原料偶联到肽序中，由于形成了类似脯氨酸的环状结构，能有效的防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生。根据实验，本发明精肽收率可高达38.4％～41.1％，优于顺序逐个偶联方法(约15.2％)及片段合成方法(约23.2％)。同时，本发明精肽的纯度为99.3％。在保证了纯度的同时保证了收率。

Description

一种乌拉立肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种乌拉立肽的制备方法。
背景技术
乌拉立肽是32个氨基酸残基组成的促尿钠排泄环肽，其结构如式I：
Figure BDA0000899008000000011
乌拉立肽最初是在1988年由Schulz-Knappe等从尿液中分离得到的一种属于心房钠尿肽(atrialnatriureticpeptide，ANP)家族的肾利钠肽。内源性乌拉立肽在肾远端肾小管细胞合成，由管腔后分泌，在内部髓集合管与下游利钠肽A型受体结合，能够调节肾脏钠和谁的排泄，因此，乌拉立肽有舒张血管和利钠利尿的作用，并且以证实乌拉立肽能够降低肾脏对尿液的重吸收。
国外对乌拉立肽的研究已进入二期临床，结果表明，乌拉立肽能够降低心脏充盈压力和改善呼吸困难，且对DHF患者的肾脏功能没有明显的不良影响，可见，乌拉立肽在治疗DHF中有广阔前景。
目前一种比较流行的合成乌拉立肽的方法是固相逐步合成(SPPS)法，该方法具有操作简单、设备要求低等特点。但是因为乌拉立肽由32个氨基酸组成，固相逐步合成法的产品收率低，肽段容易卷曲，反应位点不易暴露，得到的乌拉立肽粗肽纯度低，杂质繁杂，致使产品纯化困难，不易得到高纯度的乌拉立肽，总收率低。
另外，对于解决偶联困难的氨基酸的问题，片段合成法是一种常用的手段。片段合成法是先将偶联困难的序列制备成全保护肽，将其作为一个整体直接偶联到指定肽树脂上，从而可以跳过偶联困难的氨基酸，避免逐个氨基酸偶联产生的缺损等副反应，能够获得纯度相对高的粗肽产品。但片段合成法采用了常规的树脂外，还需使用大量价格较昂贵的2-CTC树脂制备片段肽树脂，且2-CTC树脂酸敏感性高，偶联时肽容易脱落，从而导致制备的片段收率不高，操作步骤相对繁琐。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种乌拉立肽的制备方法，本发明提供的制备方法收率高，产品纯度高。
本发明提供的乌拉立肽的制备方法，包括：
步骤1：固相合成Fmoc-Tyr-树脂；
步骤2：根据乌拉立肽的肽序在所述Fmoc-Tyr-树脂上偶联氨基酸或二肽，制得乌拉立肽树脂；所述二肽选自-Asn-Ser、-Gln-Ser、-Ser-Ser或-Arg-Ser中的任一种或多种；
步骤3：乌拉立肽树脂经裂解获得乌拉立肽线性粗肽；
步骤4：乌拉立肽线性粗肽经环化制得乌拉立肽。
本发明提供的方法将乌拉立肽肽序中第4～5位(-Asn-Ser，记为二肽A)、第10～11位(-Gln-Ser，记为二肽B)、第23～24位(-Ser-Ser，记为二肽C)、第28～29位(-Arg-Ser，记为二肽D)的氨基酸以二肽为原料进行偶联，选用的二肽原料为二肽A～D中任一种或多种，不采用二肽为原料的位点则采用单个氨基酸为原料进行偶联。该方法能够有效防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生。
在本发明的实施例中，偶联-Asn-Ser采用Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH；偶联-Gln-Ser采用Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH；偶联-Ser-Ser采用Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH；偶联-Arg-Ser采用Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH。
其中，Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH的结构如式II-a；
Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH的结构如式II-b；
Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH的结构如式II-c；
Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH的结构如式II-d。
Figure BDA0000899008000000021
Figure BDA0000899008000000031
在本发明中，Fmoc-Tyr-树脂的树脂为Wang Resin树脂。
其中，Tyr的保护基为tBu。
作为优选，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的替代度为0.25mmol/g～0.35mmol/g。优选的，替代度为0.30mmol/g。
在本发明的实施例中，偶联的偶联剂为HOBt与DIC的混合物；其中HOBt与DIC的摩尔比为1:1。
在本发明中，所述偶联的步骤包括：脱除Fmoc保护后，以DCM和DMF的混合液为溶剂，与偶联剂混合后进行偶联反应。
作为优选，脱除保护的树脂与待偶联氨基酸的摩尔比为1:3。
重复偶联的步骤直至合成整个肽链。
在本发明中，偶联反应的条件为室温反应2h。所述室温为10℃～30℃。
作为优选，如偶联反应不完全则继续偶联反应1h。
在本发明中，偶联反应结束后以甲醇收缩，树脂真空干燥过夜。
在本发明的实施例中，裂解的裂解剂为TFA、苯甲硫醚、苯酚、水和EDT的混合物；其中，TFA、苯甲硫醚、苯酚、水和EDT的体积比为77：5：5：5：8。
在本发明中，裂解的步骤包括：将乌拉立肽树脂与裂解液混合，室温反应2.5h后，以TFA洗涤树脂、以无水乙醚沉淀，获得乌拉立肽线性粗肽。
作为优选，无水乙醚沉淀的温度为0～4℃。
作为优选，乌拉立肽树脂与裂解液的质量-体积比为1:15。
在本发明中，将乌拉立肽线性粗肽溶解于环化体系中，使肽序中的二硫键成环，得到乌拉立肽粗肽溶液。
在本发明的实施例中，环化的试剂为双氧水溶液。
作为优选，环化试剂为体积分数为30％的双氧水溶液。
作为优选，乌拉立肽线性粗肽与环化试剂的质量比为9.7:1。
环化的步骤为：以水为溶剂将乌拉立肽线性粗肽溶解，以体积分数为30％双氧水溶液为环化剂，调节pH值为7.5，进行环化反应，调节pH值为3淬灭，制得乌拉立肽粗肽溶液。
具体的环化步骤为：将乌拉立肽线性粗肽溶解于水中(质量-体积比为1:10)，再缓慢滴入体积分数为30％双氧水溶液(乌拉立肽线性粗肽与双氧水溶液的质量比为9.7：1)，用醋酸和氨水调节pH值为7.5，搅拌反应3h，加冰乙酸调节pH值为3淬灭，得到乌拉立肽粗肽溶液。所述冰乙酸的温度为0℃～4℃。
在本发明的实施例中，步骤4后还包括纯化、转盐的步骤，所述纯化采用反相色谱法。
具体的，纯化的色谱采用NOVASEP RP-HPLC系统，检测波长220nm，色谱柱为反相C18柱，流动相A相为体积分数为0.1％的TFA水溶液，流动相B相为乙腈。洗脱梯度为B％：10％～20％，20min；20％～40％，10min；40％～10％，20min。纯化后经转盐色谱，转盐。
具体的转盐为转化为醋酸盐，盐酸盐，枸橼酸盐，磷酸盐，三氟乙酸盐，钠盐，钾盐或铵盐。
在一些实施例中，同时引入二肽A、二肽B、二肽C和二肽D，制备乌拉立肽。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSIME，ME Pro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽A制备乌拉立肽。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSIME，ME Pro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽B，制备乌拉立肽。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽A和二肽B，制备乌拉立肽。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽A、二肽B和二肽C，制备乌拉立肽。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽B和二肽C，制备乌拉立肽。
偶联具体为，依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽A和二肽C，制备乌拉立肽。
偶联具体为，依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH。
本发明根据乌拉立肽的肽序结构，采用特定的保护的丝氨酸二肽作为原料偶联到肽序中，由于形成了类似脯氨酸的环状结构，能有效的防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生。根据实验，本发明精肽收率可高达38.4％～41.1％，优于顺序逐个偶联方法(约15.2％)及片段合成方法(约23.2％)。同时，本发明精肽的纯度为99.3％。在保证了纯度的同时保证了收率。
附图说明
图1示实施例4制得产品的质谱图；
图2示实施例4制得产品的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种乌拉立肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，各材料的名称及缩写如表1：
表1各材料的名称及缩写
缩写及英文 含义
Fmoc 9-芴甲氧羰基
2-CTC 2-Chlorotrityl Chloride Resin
DIPCDI N,N-二异丙基碳二亚胺
TFA 三氟乙酸
EDT 1,2-乙二硫醇
HOAT 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
HOBT 1-羟基苯并三唑
DCM 二氯甲烷
DMF N,N二甲基甲酰胺
RP-HPLC 反相高效液相
TFE 三氟乙醇
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本实施例采用同时引入二肽A、二肽B、二肽C和二肽D，进行制备乌拉立肽。
1.1替代度约为0.3mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的制备
称取替代度为0.6mmol/g的Wang树脂1000g(600mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取110.3g(240mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、38.9g(288mmol)HOBt、36.3g(288mmol)DIC、2.93g(24mmol)DMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入189.8g(2400mmol)吡啶和245.04g(2400mmol)乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin，检测替代度为0.302mmol/g。
1.2乌拉立肽肽树脂的制备
称1.1制备的替代度为0.302mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin 331.1g(100mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将195g(300mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH，48.6g(360mmol)HOBt，45.4g(360mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到乌拉立肽肽树脂，称重为765.6g。
1.3乌拉立肽线性粗肽的制备
将1.2制备得到的765.6g乌拉立肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT＝77：5：5：5：8(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即乌拉立肽线性粗肽369.2g。线性粗肽重量收率为105.3％，HPLC纯度为52.6％。
1.4乌拉立肽粗肽的制备
将1.3制备的369.2g乌拉立肽线性粗肽溶解于3.692L的水溶液中，再缓慢滴入38g(300mmol)的30％双氧水溶液，并用醋酸和氨水调节pH＝7.5，搅拌反应3hrs，加冰乙酸调节pH＝3淬灭，即得到乌拉立肽粗肽溶液，HPLC纯度51.2％。
1.5乌拉立肽精肽的制备
取1.4制备得到的乌拉立肽粗肽溶液，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽142.2g，HPLC纯度99.4％，精肽收率40.6％。
实施例2
本实施例仅引入二肽A，进行制备乌拉立肽。
2.1乌拉立肽肽树脂的制备
称取按照实施例1方法制备的替代度为0.302mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin 331.1g(100mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将195g(300mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH，48.6g(360mmol)HOBt，45.4g(360mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到乌拉立肽肽树脂，称重为752.6g。
2.2乌拉立肽线性粗肽的制备
将2.1制备得到的752.6g乌拉立肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT＝77：5：5：5：8(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即乌拉立肽线性粗肽361.2g。线性粗肽重量收率为103.1％，HPLC纯度为50.1％。
2.3乌拉立肽粗肽的制备
将2.2制备的361.2g乌拉立肽线性粗肽溶解于3.612L的水溶液中，再缓慢滴入38g(300mmol)的30％双氧水溶，并用醋酸和氨水调节pH＝7.5，搅拌反应3hrs，加冰乙酸调节pH＝3淬灭，即得到乌拉立肽粗肽溶液，HPLC纯度49.6％。
2.4乌拉立肽精肽的制备
取2.3制备得到的乌拉立肽粗肽溶液，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽134.5g，HPLC纯度99.2％，精肽收率38.4％。
实施例3
本实施例仅引入二肽B，进行制备乌拉立肽。
3.1乌拉立肽肽树脂的制备
称取按照实施例1方法制备的替代度为0.302mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin 331.1g(100mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将195g(300mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH，48.6g(360mmol)HOBt，45.4g(360mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到乌拉立肽肽树脂，称重为749.2g。
3.2乌拉立肽线性粗肽的制备
将3.1制备得到的749.2g乌拉立肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT＝77：5：5：5：8(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即乌拉立肽线性粗肽358.3g。线性粗肽重量收率为102.9％，HPLC纯度为50.3％。
3.3乌拉立肽粗肽的制备
将3.2制备的358.3g乌拉立肽线性粗肽溶解于3.583L的水溶液中，再缓慢滴入38g(300mmol)的30％双氧水溶，并用醋酸和氨水调节pH＝7.5，搅拌反应3hrs，加冰乙酸调节pH＝3淬灭，即得到乌拉立肽粗肽溶液，HPLC纯度50.1％。
3.4乌拉立肽精肽的制备
取3.3制备得到的乌拉立肽粗肽溶液，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽136.2g，HPLC纯度99.2％，精肽收率38.9％。
实施例4
本实施例仅引入二肽A和二肽B，进行制备乌拉立肽。
4.1乌拉立肽肽树脂的制备
称取按照实施例1方法制备的替代度为0.302mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin 331.1g(100mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将195g(300mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH，48.6g(360mmol)HOBt，45.4g(360mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到乌拉立肽肽树脂，称重为757.3g。
4.2乌拉立肽线性粗肽的制备
将7.1制备得到的757.3g乌拉立肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT＝77：5：5：5：8(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即乌拉立肽线性粗肽367.5g。线性粗肽重量收率为104.9％，HPLC纯度为51.3％。
4.3乌拉立肽粗肽的制备
将4.2制备的367.5g乌拉立肽线性粗肽溶解于3.675L的水溶液中，再缓慢滴入38g(300mmol)的30％双氧水溶，并用醋酸和氨水调节pH＝7.5，搅拌反应3hrs，加冰乙酸调节pH＝3淬灭，即得到乌拉立肽粗肽溶液，HPLC纯度51.1％。
4.4乌拉立肽精肽的制备
取4.3制备得到的乌拉立肽粗肽溶液，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽141.1g，HPLC纯度99.3％，精肽收率40.3％。
实施例5
本实施例仅引入二肽A、二肽B和二肽C进行制备乌拉立肽。
4.1乌拉立肽肽树脂的制备
称取按照实施例1方法制备的替代度为0.302mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin 331.1g(100mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将195g(300mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH，48.6g(360mmol)HOBt，45.4g(360mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到乌拉立肽肽树脂，称重为761.2g。
5.2乌拉立肽线性粗肽的制备
将5.1制备得到的761.2g乌拉立肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT＝77：5：5：5：8(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即乌拉立肽线性粗肽369.7g。线性粗肽重量收率为105.5％，HPLC纯度为51.7％。
5.3乌拉立肽粗肽的制备
将5.2制备的369.7g乌拉立肽线性粗肽溶解于3.697L的水溶液中，再缓慢滴入38g(300mmol)的30％双氧水溶，并用醋酸和氨水调节pH＝7.4，搅拌反应3hrs，加冰乙酸调节pH＝3淬灭，即得到乌拉立肽粗肽溶液，HPLC纯度51.7％。
5.4乌拉立肽精肽的制备
取5.3制备得到的乌拉立肽粗肽溶液，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽143.9g，HPLC纯度99.3％，精肽收率41.1％。
实施例6
本实施例仅引入二肽B和二肽C进行制备乌拉立肽。
6.1乌拉立肽肽树脂的制备
称取按照实施例1方法制备的替代度为0.302mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin 331.1g(100mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将195g(300mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH，48.6g(360mmol)HOBt，45.4g(360mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到乌拉立肽肽树脂，称重为758.5g。
6.2乌拉立肽线性粗肽的制备
将6.1制备得到的758.5g乌拉立肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT＝77：5：5：5：8(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即乌拉立肽线性粗肽368.1g。线性粗肽重量收率为105.1％，HPLC纯度为50.7％。
6.3乌拉立肽粗肽的制备
将6.2制备的368.1g乌拉立肽线性粗肽溶解于3.681L的水溶液中，再缓慢滴入38g(300mmol)的30％双氧水溶，并用醋酸和氨水调节pH＝7.4，搅拌反应3hrs，加冰乙酸调节pH＝3淬灭，即得到乌拉立肽粗肽溶液，HPLC纯度50.1％。
6.4乌拉立肽精肽的制备
取6.3制备得到的乌拉立肽粗肽溶液，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽140.8g，HPLC纯度99.3％，精肽收率40.2％。
实施例7
本实施例仅引入二肽A和二肽C进行制备乌拉立肽。
7.1乌拉立肽肽树脂的制备
称取按照实施例1方法制备的替代度为0.302mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin 331.1g(100mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将195g(300mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH，48.6g(360mmol)HOBt，45.4g(360mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到乌拉立肽肽树脂，称重为759.2g。
7.2乌拉立肽线性粗肽的制备
将7.1制备得到的759.2g乌拉立肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT＝77：5：5：5：8(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即乌拉立肽线性粗肽369.3g。线性粗肽重量收率为105.4％，HPLC纯度为51.2％。
7.3乌拉立肽粗肽的制备
将7.2制备的369.3g乌拉立肽线性粗肽溶解于3.693L的水溶液中，再缓慢滴入38g(300mmol)的30％双氧水溶，并用醋酸和氨水调节pH＝7.5，搅拌反应3hrs，加冰乙酸调节pH＝3淬灭，即得到乌拉立肽粗肽溶液，HPLC纯度51.2％。
7.4乌拉立肽精肽的制备
取7.3制备得到的乌拉立肽粗肽溶液，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽141.5g，HPLC纯度99.3％，精肽收率40.4％。
对比例1
D1.1乌拉立肽肽树脂的制备
称取按照实施例1方法制备的替代度为0.302mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin 331.1g(100mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将195g(300mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH，48.6g(360mmol)HOBt，45.4g(360mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到乌拉立肽肽树脂，称重为728.2g。
D1.2乌拉立肽线性粗肽的制备
将D1.1制备得到的728.2g乌拉立肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT＝77：5：5：5：8(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即乌拉立肽线性粗肽352.8g。线性粗肽重量收率为100.7％，HPLC纯度为21.8％。
D1.3乌拉立肽粗肽的制备
将D1.2制备的352.8g乌拉立肽线性粗肽溶解于3.528L的水溶液中，再缓慢滴入38g(300mmol)的30％双氧水溶，并用醋酸和氨水调节pH＝7.5，搅拌反应3hrs，加冰乙酸调节pH＝3淬灭，即得到乌拉立肽粗肽溶液，HPLC纯度19.27％。
D1.4乌拉立肽精肽的制备
取D1.3制备得到的乌拉立肽粗肽溶液，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽53.23g，HPLC纯度99.1％，精肽收率15.2％。
对比例2
D2.1乌拉立肽(Gly20-Tyr32)区间肽树脂的制备
称取按照实施例1的方法制备的替代度为0.302mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin 331.1g(100mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将195g(300mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH，48.6g(360mmol)HOBt，45.4g(360mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Gly-OH。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到乌拉立肽(Gly20-Tyr32)区间肽树脂，备用。
D2.2乌拉立肽全保护肽片段(Ser10-Ile19)的制备
称取替代度为0.75mmol/g的2-CTC树脂800g(600mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取552g(1200mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入233g(1800mmol)DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入500mL无水甲醇封闭30min。用DMF洗涤4次，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，顺次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶联。保留Fmoc基团。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到全保护肽片段(Ser10-Ile19)肽树脂，称重为2560g。
配制20％TFE/DCM的溶液，按照10ml/g的比例，将全保护肽片段(Ser10-Ile19)进行裂解反应2hrs。反应结束后过滤并将滤液浓缩至约原体积的1/3，得7.0L滤液，再将该滤液缓慢倾倒入70L的冰乙醚中，析出白色固体，经洗涤干燥后得全保护肽片段(Ser10-Ile19)称重为1180.3g，粗肽收率67.2％，HPLC纯度95.2％。
D2.3乌拉立肽全保护肽片段(Ser10-Ile19)的偶联
取100mmol 3.1制备的乌拉立肽(Gly20-Tyr32)区间肽树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。
将D2.2制备的720g(300mmol)全保护肽片段(Ser10-Ile19)，48.6g(360mmol)HOAt，45.4g(360mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。反应结束后，用DMF洗涤3次。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC，依次完成Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到乌拉立肽肽树脂，称重为753.2g。
D2.4乌拉立肽线性粗肽的制备
将D2.3制备得到的753.2g乌拉立肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT＝77：5：5：5：8(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即乌拉立肽线性粗肽368.7g。线性粗肽重量收率为105.1％，HPLC纯度为31.2％。
D2.5乌拉立肽粗肽的制备
将D2.4制备的368.7g乌拉立肽线性粗肽溶解于3.687L的水溶液中，再缓慢滴入38g(300mmol)的30％双氧水溶，并用醋酸和氨水调节pH＝7.4，搅拌反应3hrs，加冰乙酸调节pH＝3淬灭，即得到乌拉立肽粗肽溶液，HPLC纯度29.6％。
D2.6乌拉立肽精肽的制备
取D2.5制备得到的乌拉立肽粗肽溶液，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽81.2g，HPLC纯度99.2％，精肽收率23.2％。
对比例3
本实施例仅引入二肽A、二肽C和二肽D进行制备乌拉立肽。
D3.1乌拉立肽肽树脂的制备
称取按照实施例1方法制备的替代度为0.302mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin 331.1g(100mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将195g(300mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH，48.6g(360mmol)HOBt，45.4g(360mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到乌拉立肽肽树脂，称重为749.2g。
D3.2乌拉立肽线性粗肽的制备
将D3.1制备得到的749.2g乌拉立肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT＝77：5：5：5：8(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即乌拉立肽线性粗肽354.2g。线性粗肽重量收率为103.5％，HPLC纯度为50.12％。
D3.3乌拉立肽粗肽的制备
将D3.2制备的354.2g乌拉立肽线性粗肽溶解于3.542L的水溶液中，再缓慢滴入38g(300mmol)的30％双氧水溶，并用醋酸和氨水调节pH＝7.5，搅拌反应3hrs，加冰乙酸调节pH＝3淬灭，即得到乌拉立肽粗肽溶液，HPLC纯度49.59％。
D3.4乌拉立肽精肽的制备
取D3.3制备得到的乌拉立肽粗肽溶液，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽135.6g，HPLC纯度99.2％，精肽收率37.5％。
对比例4
本实施例仅引入二肽B、二肽C和二肽D进行制备乌拉立肽。
D4.1乌拉立肽肽树脂的制备
称取按照实施例1方法制备的替代度为0.302mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin 331.1g(100mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将195g(300mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH，48.6g(360mmol)HOBt，45.4g(360mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到乌拉立肽肽树脂，称重为747.2g。
D4.2乌拉立肽线性粗肽的制备
将D4.1制备得到的747.2g乌拉立肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT＝77：5：5：5：8(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即乌拉立肽线性粗肽350.1g。线性粗肽重量收率为102.5％，HPLC纯度为49.5％。
D4.3乌拉立肽粗肽的制备
将D4.2制备的350.1g乌拉立肽线性粗肽溶解于3.501L的水溶液中，再缓慢滴入38g(300mmol)的30％双氧水溶，并用醋酸和氨水调节pH＝7.5，搅拌反应3hrs，加冰乙酸调节pH＝3淬灭，即得到乌拉立肽粗肽溶液，HPLC纯度48.6％。
D4.4乌拉立肽精肽的制备
取D4.3制备得到的乌拉立肽粗肽溶液，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽134.9g，HPLC纯度99.1％，精肽收率37.2％。
实施例8
检测实施例1～7和对比例1～4制得的精肽。其中，对实施例5制得产品的质谱图如图1，色谱图如图2。其他各实施例制得产品的质谱图和色谱图与此相似。各实施例获得多肽纯度和收率如表2：
表2多肽纯度和收率
Figure BDA0000899008000000231
Figure BDA0000899008000000241
结果显示，引入二肽片段的技术方案无论从粗肽纯度、精肽纯度还是精肽收率上都高于对比例方案。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种乌拉立肽的制备方法，其特征在于，包括:
步骤1：固相合成Fmoc-Tyr-树脂；
步骤2：根据乌拉立肽的肽序在所述Fmoc-Tyr-树脂上偶联氨基酸或二肽，制得乌拉立肽树脂；
步骤3：所述乌拉立肽树脂经裂解获得乌拉立肽线性粗肽；
步骤4：所述乌拉立肽线性粗肽经环化制得乌拉立肽；
所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSIME，ME Pro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSIME，ME Pro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH；
或者，依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME，MEPro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH；
或者，依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSIME，ME Pro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH；
或者，依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH；
或者，依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSIME，ME Pro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSIME，ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH；
或者，依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(PSIME，ME Pro)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSIME，ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH；
或者，依次偶联：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(PSI ME，MEPro)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSIME，ME Pro)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、和Boc-Thr(tBu)-OH。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Tyr-树脂的树脂为Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin，替 代度为0.25mmol/g～0.35mmol/g。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联的偶联剂为HOBt与DIC的混合物；其中HOBt与DIC的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述裂解的裂解剂为TFA、苯甲硫醚、苯酚、水和EDT的混合物；其中，TFA、苯甲硫醚、苯酚、水和EDT的体积比为77：5：5：5：8。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述乌拉立肽树脂与裂解液的质量-体积比为1:15。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环化的试剂为双氧水溶液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述环化试剂为体积分数为30％的双氧水溶液；乌拉立肽线性粗肽与环化试剂的质量比为9.7:1。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环化的步骤为：以水为溶剂将乌拉立肽线性粗肽溶解，以体积分数为30％双氧水溶液为环化剂，调节pH值为7.5，进行环化反应，调节pH值为3淬灭，制得乌拉立肽粗肽溶液。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4后还包括纯化、转盐的步骤。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述纯化的色谱采用NOVASEP RP-HPLC系统，检测波长220nm，色谱柱为反相C18柱，流动相A相为体积分数为0.1％的TFA水溶液，流动相B相为乙腈，洗脱梯度为B％：10％～20％，20min；20％～40％，10min；40％～10％，20min。
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