CN110615836A - 一种利拉鲁肽的固相合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及利拉鲁肽的制备方法。包括以下步骤：采用固相多肽合成法制备全保护多肽片段I‑IV，按照利拉鲁肽的序列顺序从C端开始依次耦合相应的保护氨基酸和全保护多肽片段得到全保护利拉鲁肽肽树脂，再用裂解液酸解全保护利拉鲁肽肽树脂得利拉鲁肽粗品，最后纯化得利拉鲁肽精制品。本发明解决了困难氨基酸难耦合的难题，有效避免与利拉鲁肽极性相近杂质的产生，降低了利拉鲁肽合成和纯化难度，提高了利拉鲁肽的纯度和收率，利于工业化生产。

Description

一种利拉鲁肽的固相合成方法
技术领域
本发明属于医药合成领域，具体涉及一种利拉鲁肽的固相合成方法。
背景技术
利拉鲁肽，英文名liraglutide，是一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，序列为H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-ɑ-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH，
分子式：C172H265N43O51，作为一种皮下注射制剂，能起到良好的降低血糖作用，能够通过降低2型糖尿病患者的空腹及餐后血糖而改善血糖控制，同时能够降低患者体重。
目前利拉鲁肽的合成方法如专利CN103087181、专利CN 102286092、专利CN103145828、文献J.Med.Chem.2000,43,1664-1669、文献Chin.J.Org.Chem.2016,36,218-221和文献Chinese Journal of Pharmaceuticals 2013,44(2),121-124是利用Fmoc策略固相法依次连接合成利拉鲁肽直链多肽，然后脱去Lys支链保护基，修饰Lys支链氨基得到利拉鲁肽肽树脂。该方法依次合成利拉鲁肽直链时，容易产生与利拉鲁肽极性相近的残缺肽，导致纯化困难。再者，此方法在利拉鲁肽直链合成完毕再修饰Lys支链氨基，由于Lys支链的高空间位阻，容易导致反应不完全或过反应，产生缺陷肽，总收率较低，同时杂质较多，纯化困难。
专利CN102875665、专利CN104045705和专利CN103864918采用固相片段缩合的方法合成，固相片段缩合投入的每个片段都是1.5～3.5倍过量，严重浪费肽片段，合成成本很高；同时由于固相片段缩合的树脂取代值限制，物料通量降低，浪费溶剂，产生大量废液。
专利CN103275208和专利CN103304659首先合成多肽片段，再按照利拉鲁肽的氨基酸序列逐步偶联剩余氨基酸制得利拉鲁肽肽树脂，修饰Lys支链氨基是在利拉鲁肽肽树脂上进行，易导致反应不完全或过反应，产生缺陷肽，总收率较低，同时杂质较多，纯化困难，且专利CN103304659合成的多肽片段序列过长，还存在溶解困难、难以耦合的问题。
专利CN104650219采用液相片段缩合的方法合成全保护利拉鲁肽直链多肽，然后在液相反应体系中经历四步反应得到全保护利拉鲁肽粗品，后处理繁琐，不利于工业化生产，并且Lys支链氨基的修饰在全保护利拉鲁肽直链多肽上进行，空间位阻大、溶解度低、反应困难，容易产生缺陷肽，造成物料浪费。
专利CN103980358首先通过液相合成片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH，然后采用固相合成法逐个耦合氨基酸制备利拉鲁肽，无需在利拉鲁肽直链上修饰Lys支链氨基。但该方法容易产生与利拉鲁肽极性相近的残缺肽，导致纯化困难，单一杂质含量高。
其他专利公开了基因重组生产利拉鲁肽，然而基因表达有着工作量大、三废严重、技术难度大、生产成本高等缺点。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种利拉鲁肽固相合成新方法。本合成方法工艺简单，先将困难氨基酸合成全保护多肽片段，制得的全保护多肽片段纯度高，无需纯化直接参与全保护利拉鲁肽的合成，该方法解决了某些氨基酸难耦合的问题，避免了与利拉鲁肽极性相近杂质的产生，有效降低了合成和纯化难度，提高了粗品的纯度和收率，总收率42.4％，最大单杂含量0.09％。
发明人在现有技术基础上加以改进，克服了现有技术中存在的困难氨基酸难耦合、易产生极性相近残缺肽、纯化困难、杂质含量高等技术问题。本发明的发明构思是这样的：(1)基于非极性氨基酸Gly结构特点，即R基只有一个氢原子。在多肽合成中-Gly或+Gly的残缺肽极性与目标肽极性相似，将加大纯化难度，本发明将Gly与相邻的氨基酸形成全保护多肽片段I、全保护多肽片段IV，分别将全保护多肽片段I、全保护多肽片段IV作为一个整体参与全保护利拉鲁肽直链的耦合。(2)基于在利拉鲁肽直链上修饰Lys支链难耦合的问题，本发明采用市售的Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH作为原料分别与Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH耦合形成全保护多肽片段III，全保护多肽片段III再参与全保护利拉鲁肽的合成，该方法延长了全保护多肽片段III两端氨基、羧基与Lys支链的距离，降低了空间位阻的影响。(3)基于目前固相合成法逐个氨基酸耦合制备全保护利拉鲁肽中个别困难氨基酸难耦合的问题，本发明将难耦合氨基酸[Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH]与相邻氨基酸(FmocAla-OH)耦合获得全保护多肽片段II，全保护多肽片段II再参与全保护利拉鲁肽直链的耦合。
基于此，本发明经过大量的试验后，优化的具体方案如下：
一种利拉鲁肽的固相合成方法，包括以下步骤：
步骤1、在树脂载体A上采用固相合成法制备全保护多肽片段I肽树脂、全保护多肽片段II肽树脂、全保护多肽片段III肽树脂、全保护多肽片段IV肽树脂；
步骤2、用裂解液分别酸解全保护多肽片段I肽树脂、全保护多肽片段II肽树脂、全保护多肽片段III肽树脂、全保护多肽片段IV肽树脂得到全保护多肽片段I、全保护多肽片段II、全保护多肽片段III、全保护多肽片段IV；
步骤3、在树脂载体B上通过固相合成法按照利拉鲁肽的序列顺序从C端开始依次耦合相应的保护氨基酸和全保护多肽片段，制备全保护利拉鲁肽肽树脂：
Boc-His(Trt)-I-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-II-III-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-IV-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
步骤4、用裂解液酸解全保护利拉鲁肽肽树脂，得利拉鲁肽粗品，即His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Nα-PAL-γ-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
步骤5、利拉鲁肽粗品纯化得利拉鲁肽精制品。
优选地，所述利拉鲁肽的固相合成方法，步骤1中全保护多肽片段I为Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH，全保护多肽片段II为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-OH，全保护多肽片段III为Fmoc-Ala-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-Glu(OtBu)-OH，全保护多肽片段IV为Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-OH；采用的树脂载体A为2-氯三苯基甲基树脂。
所述利拉鲁肽的固相合成方法，步骤1中全保护片段合成采用常规多肽固相合成法，耦合试剂选自HOBt/DIC、HOAt/DIC、HOBT/HBTU/DIEA、HOAt/HBTU/DIEA、HOBT/TBTU/DIEA和HOAt/TBTU/DIEA中的任意一组，反应溶剂选自DCM、DMF、NMP和他们的任意组合。脱除Fmoc使用DBLK溶液，DBLK溶液由体积比为1：4的哌啶和DMF组成。Kaiser检测法判断反应终点。
优选地，所述利拉鲁肽的固相合成方法，步骤2中酸解全保护多肽片段肽树脂的裂解液为含体积分数1.5％～3.0％TFA的DCM溶液；以质量体积比计(m:v；g:ml)，全保护片段肽肽树脂：裂解液为1：6～8。裂解次数为2～3次，每次裂解5min，裂解完毕抽滤，滤液以同等体积的吡啶/二氯甲烷溶液中和(吡啶的体积含量同TFA的体积含量)，收集滤液，25℃～35℃减压蒸除溶剂，向剩余馏分中加入冰水析出沉淀，静置，抽滤，干燥得全保护多肽片段。
优选地，所述利拉鲁肽的固相合成方法，步骤3中树脂载体B选自2-氯三苯基甲基树脂或wang树脂。采用常规多肽固相合成法，按照利拉鲁肽的序列顺序从C端开始依次耦合相应的保护氨基酸和全保护多肽片段，制备全保护利拉鲁肽肽树脂，其中全保护多肽片段与肽链耦合的方法同保护氨基酸与肽链耦合方法，耦合试剂选自HOBt/DIC、HOAt/DIC、HOBT/HBTU/DIEA、HOAt/HBTU/DIEA、HOBT/TBTU/DIEA和HOAt/TBTU/DIEA中的任意一组，反应溶剂选自DCM、DMF、NMP和他们的任意组合。脱除Fmoc使用DBLK溶液，DBLK溶液由体积比为1：4的哌啶和DMF组成。Kaiser检测法判断反应终点。
优选地，所述利拉鲁肽的固相合成方法，步骤4全保护利拉鲁肽肽树脂与裂解液的质量体积比为1：6～8。当树脂为2-氯三苯基甲基树脂时，酸解采用低-高酸两步裂解法，低酸裂解液为含3％～5％TFA的DCM溶液；裂解次数为2～3次，每次裂解10min，裂解完毕抽滤，收集滤液，25℃～35℃减压蒸除溶剂，再进行高酸裂解。高酸裂解液为TFA：H2O：TIS：DTT＝90：2.5：3.5：4(v:v:v:m，ml:ml:ml:g)的溶液，低温裂解1～3h，裂解完毕，收集滤液，25℃～35℃减压蒸除90％左右的溶剂，将剩余10％左右的馏分倒入冷乙醚中析出沉淀，过滤收集滤饼，将滤饼研磨并用无水乙醚洗涤3～6次。真空干燥得利拉鲁肽粗品。
优选地，所述利拉鲁肽的固相合成方法，步骤4中全保护利拉鲁肽肽树脂与裂解液的质量体积比为1：6～8(m:v，g:mL)。当树脂为wang树脂时，采用一步裂解法。裂解液是TFA：H2O：TIS：DTT＝90：2.5：3.5：4(v:v:v:m，ml:ml:ml:g)的溶液，低温裂解1～3h，裂解完毕，收集滤液，25℃～35℃减压蒸除90％左右的溶剂，将剩余10％左右的馏分倒入冷乙醚中析出沉淀，过滤收集滤饼，将滤饼研磨并用乙醚洗涤3～6次。真空干燥得利拉鲁肽粗品。
所述利拉鲁肽的固相合成方法，步骤5中利拉鲁肽粗品的一次纯化条件为：色谱柱：C18型半制备柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。流动相：A相：0.1％三氟乙酸—水溶液；B相：0.1％三氟醋酸-乙腈溶液，流速：60ml/min，梯度：30％B—70％B，检测波长：215nm。进样量为2g。利拉鲁肽粗品的二次除盐纯化条件为：流动相A相：纯化水；B相：乙腈溶液，检测波长：215nm，流速为70mL·min-1。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)先将Gly与相邻的氨基酸形成全保护多肽片段，再将全保护多肽片段作为一个整体参与全保护利拉鲁肽直链耦合，避免了-GLy或+Gly残缺肽的产生，降低了纯化难度。
(2)先将Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH作为一个整体分别与保护氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH耦合形成全保护多肽片段，此全保护多肽片段再参与全保护利拉鲁肽合成，避免了在全保护利拉鲁肽直链上修饰Lys支链氨基所产生的效率低，难度大，杂质多的问题。
(3)本合成方法工艺简单，先将困难氨基酸合成全保护多肽片段，再参与全保护利拉鲁肽合成，避免了残缺肽杂质的产生，提高了粗品的纯度和收率，有效降低了合成和纯化难度，利拉鲁肽精制品最大单杂低于0.1％，利于工业化生产。
具体实施方式
本发明公开了一种利拉鲁肽的固相合成方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的利拉鲁肽固相合成方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 Fmoc-Gly-CTC Resin的制备
称取20.0g替代度为0.85mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin加入到固相反应柱中，依次用DMF、DCM洗涤2次，DCM溶胀60min后抽干，将Fmoc-Gly-OH(10.1g，34mmol)溶解于DMF中，加入到装有树脂的反应柱中，再加入DIPEA(11.2ml，68mmol)，反应2小时后抽干，用DMF洗涤3次，加入含20ml MeOH的DCM溶液封闭1小时，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-CTC树脂。用紫外分光光度法测定计算树脂替代度为0.76mmol/g。
实施例2 Fmoc-Ala-CTC Resin的制备
称取20.0g替代度为0.85mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin加入到固相反应柱中，依次用DMF、DCM洗涤2次，DCM溶胀60min后抽干，将Fmoc-Ala-OH(10.6g，34mmol)溶解于NMP中，加入到装有树脂的反应柱中，再加入DIPEA(11.2ml，68mmol)，反应2小时后抽干，用DMF洗涤3次，加入含20ml MeOH的DCM溶液封闭1小时，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ala-CTC树脂。用紫外分光光度法测定计算树脂替代度为0.73mmol/g。
实施例3 Fmoc-Glu(OtBu)-CTC Resin的制备
称取20.0g替代度为0.85mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin加入到固相反应柱中，依次用DMF、DCM洗涤2次，DCM溶胀60min后抽干，将Fmoc-Glu(OtBu)-OH(14.5g，34mmol)溶解于DMF中，加入到装有树脂的反应柱中，再加入DIPEA(11.2ml，68mmol)，反应2小时后抽干，用DMF洗涤3次，加入含20ml MeOH的DCM溶液封闭1小时，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂。用紫外分光光度法测定计算树脂替代度为0.68mmol/g。
实施例4全保护多肽片段I肽树脂的制备
向实施例1中制得的Fmoc-Gly-CTC Resin中加入120ml 25％哌啶/DMF溶液脱保护(5+10min)，DMF洗涤6次，将Fmoc-Glu(OtBu)-OH(13.0g，30.4mmol)和HOBt(4.2g，31.0mmol)溶解于DMF中，冰浴15分钟，加入DIC(4.8ml，31.0mmol)活化5分钟后加入到固相反应柱中，固相反应柱拧盖置于恒温震荡器中，震荡反应3h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤6次，制得Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-CTC树脂。
向反应柱中加入120ml 25％哌啶/DMF溶液脱保护(5+10min)，DMF洗涤6次，将Fmoc-Ala-OH(9.5g，30.4mmol)和HOBt(4.2g，31.0mmol)溶解于DMF中，冰浴15分钟，加入DIC(4.8ml，31.0mmol)活化5分钟后加入到固相反应柱中，固相反应柱拧盖置于恒温震荡器中，震荡反应3h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤6次，制得Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-Gly-CTC树脂。
实施例5全保护多肽片段II肽树脂的制备
向实施例2中制得的Fmoc-Ala-CTC Resin中加入120ml 25％哌啶/DMF溶液脱保护(5+10min)，DMF洗涤6次，将Fmoc-Gln(Trt)-OH(17.8g，29.2mmol)和HOAt(4.0g，29.2mmol)溶解于DMF中，冰浴15分钟，加入DIC(4.5ml，29.2mmol)活化5分钟后加入到固相反应柱中，固相反应柱拧盖置于恒温震荡器中，震荡反应3h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤6次，制得Fmoc-Gln(Trt)-Ala-CTC树脂。
向反应柱中加入120ml 25％哌啶/DMF溶液脱保护(5+10min)，DMF洗涤6次，将Fmoc-Gly-OH(8.7g，29.2mmol)和HOBt(3.94g，29.2mmol)溶解于DMF中，冰浴15分钟，加入DIC(4.5ml，29.2mmol)活化5分钟后加入到固相反应柱中，固相反应柱拧盖置于恒温震荡器中，震荡反应3h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤6次，制得Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Ala-CTC树脂。
向反应柱中加入120ml 25％哌啶/DMF溶液脱保护(5+10min)，DMF洗涤6次，将Fmoc-Glu(OtBu)-OH(12.4g，29.2mmol)和HOBt(3.94g，29.2mmol)溶解于DMF中，冰浴15分钟，加入DIC(4.5ml，29.2mmol)活化5分钟后加入到固相反应柱中，固相反应柱拧盖置于恒温震荡器中，震荡反应3h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤6次，制得Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-CTC树脂。
实施例6全保护多肽片段III肽树脂的制备
向实施例3中制得的Fmoc-Glu(OtBu)-CTC Resin中加入120ml 25％哌啶/DMF溶液脱保护(5+10min)，DMF洗涤6次，将Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH(21.5g,27.2mmol)和HOBt(3.7g，27.2mmol)溶解于DMF中，冰浴15分钟，加入DIC(4.2ml，27.2mmol)活化5分钟后加入到固相反应柱中，固相反应柱拧盖置于恒温震荡器中，震荡反应3h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤6次，制得Fmoc--Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)--CTC树脂。
向反应柱中加入120ml 25％哌啶/DMF溶液脱保护(5+10min)，DMF洗涤6次，将Fmoc-Ala-OH(8.5g，27.2mmol)和HOBt(3.7g，27.2mmol)溶解于DMF中，冰浴15分钟，加入DIC(4.2ml，27.2mmol)活化5分钟后加入到固相反应柱中，固相反应柱拧盖置于恒温震荡器中，震荡反应3h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤6次，制得Fmoc-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-CTC树脂。
实施例7全保护多肽片段IV肽树脂的制备
向以实施例1的方法制得的Fmoc-Gly-CTC Resin中加入120ml 25％哌啶/DMF溶液脱保护(5+10min)，DMF洗涤6次，将Fmoc-Arg(pbf)-OH(19.7g，30.4mmol)和HOBt(4.2g，31.0mmol)溶解于DMF中，冰浴15分钟，加入DIC(4.8ml，31.0mmol)活化5分钟后加入到固相反应柱中，固相反应柱拧盖置于恒温震荡器中，震荡反应3h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤6次，制得Fmoc-Arg(pbf)-Gly-CTC树脂。
向反应柱中加入120ml 25％哌啶/DMF溶液脱保护(5+10min)，DMF洗涤6次，将Fmoc-Val-OH(10.3g，30.4mmol)和HOBt(4.2g，31.0mmol)溶解于DMF中，冰浴15分钟，加入DIC(4.8ml，31.0mmol)活化5分钟后加入到固相反应柱中，固相反应柱拧盖置于恒温震荡器中，震荡反应3h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤6次，制得Fmoc-Val-Arg(pbf)-Gly-CTC树脂。
实施例8全保护多肽片段I的制备
将全保护多肽片段I肽树脂加入到210mL 1.5％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，收集滤液。再次将全保护多肽片段I肽树脂加入到210mL1.5％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，树脂用1.5％TFA/DCM淋洗2次，收集合并滤液，滤液用420mL 1.5％吡啶/二氯甲烷的溶液中和。真空下浓缩至约25mL，然后加入10mL乙醇，继续浓缩至残余液约10mL。加入200mL水搅拌10min，静置沉淀产物。过滤收集固体，35℃真空干燥得8.1g全保护多肽片段I。收率96.4％，HPLC纯度：98.3％。
实施例9全保护多肽片段II的制备
将全保护多肽片段II肽树脂加入到240mL 2.0％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，收集滤液。再次将全保护多肽片段II肽树脂加入到240mL 2.0％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，树脂用2％TFA/DCM淋洗2次，收集合并滤液，滤液用480mL 2.0％吡啶/二氯甲烷的溶液中和。真空下浓缩至约25mL，然后加入10mL乙醇，继续浓缩至残余液约10mL。加入200mL水搅拌10min，静置沉淀产物。过滤收集固体，35℃真空干燥得13.0g全保护多肽片段II。收率96％，HPLC纯度：97.8％。
实施例10全保护多肽片段III的制备
将全保护多肽片段III肽树脂加入到180mL2.5％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，收集滤液。再次将全保护多肽片段III肽树脂加入到180mL2.5％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，树脂用2.5％TFA/DCM淋洗2次，收集合并滤液，滤液用360mL 2.5％吡啶/二氯甲烷的溶液中和。真空下浓缩至约25mL，然后加入10mL乙醇，继续浓缩以去除残余DCM至残余液约10mL。加入200mL水搅拌10min，静置沉淀产物。过滤收集固体，35℃真空干燥得13.7g全保护多肽片段III。收率95.7％，HPLC纯度：97.5％。
实施例11全保护多肽片段IV的制备
将全保护多肽片段IV肽树脂加入到240mL3.0％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，收集滤液。再次将全保护多肽片段IV肽树脂加入到240mL 3.0％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，树脂用3.0％TFA/DCM淋洗2次，收集合并滤液，滤液用480mL 3.0％吡啶/二氯甲烷的溶液中和。真空下浓缩至约25mL，然后加入10mL乙醇，继续浓缩以去除残余DCM至残余液约10mL。加入200mL水搅拌10min，静置沉淀产物。过滤收集固体，35℃真空干燥得11.9g全保护多肽片段IV。收率97.5％，HPLC纯度：98.6％。
实施例12利拉鲁肽第一个氨基酸Fmoc-Gly-CTC树脂的制备
称取15.0g替代度为0.85mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin加入到固相反应柱中，依次用DMF、DCM洗涤2次，DCM溶胀60min后抽干，将Fmoc-Gly-OH(4.5g，15.3mmol)溶解于DMF中，加入到装有树脂的反应柱中，再加入DIPEA(5.3ml，32mmol)，反应1.5小时后抽干，用DMF洗涤3次，加入含20ml MeOH的DCM溶液封闭1小时，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-CTC树脂。用紫外分光光度法测定计算树脂替代度为0.38mmol/g。
实施例13利拉鲁肽第一个氨基酸Fmoc-Gly-wang树脂的制备
称取15g替代度为0.82mmol/g的Wang Resin加入到固相反应柱中，依次用DMF、DCM洗涤2次，DCM溶胀60min后抽干，将Fmoc-Gly-OH(4.4g，14.8mmol)和HOBt(2.0g，14.8mmol)溶解于DMF中，冰浴15min后加入DIC(2.3ml，25mmol)活化5min后加入反应柱，同时加入DMAP(0.2g，1.63mmol)，反应1.5小时后抽干反应液，依次用DMF、DCM各洗涤2次，，加入乙酸酐(9.4ml，100mmol)和DIEA(33ml，200mmol)的DCM溶液封闭1小时，抽滤封闭液，DMF洗涤树脂6次，DCM洗涤2次，MeOH收缩，干燥，得到Fmoc-Gly-Wang Resin，用紫外分光光度法测定计算树脂替代度为0.36mmol/g。
实施例14全保护利拉鲁肽肽树脂的制备
向含替代度为0.36mmol/g的Fmoc-Gly-wang树脂的反应柱中加入80ml 25％哌啶/DMF溶液脱保护(5+10min)，DMF洗涤6次，将Fmoc-Arg(pbf)-OH(7.0g，10.8mmol)、HOBt(1.46g，10.8mmol)和TBTU(3.47g，10.8mmol)溶解于DMF中，冰浴15分钟，加入DIEA(3.6ml，21.6mmol)活化5分钟后加入到固相反应柱中，固相反应柱拧盖置于恒温震荡器中，震荡反应3h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，依次用DMF、MeOH、DCM各洗涤2次，制得Fmoc-Arg(pbf)-Gly-wang树脂。
按上述方法依次连接全保护多肽片段IV、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、全保护多肽片段III、全保护多肽片段II、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、全保护多肽片段I、Boc-His(Trt)-OH。最后一个氨基酸Boc-His(Trt)-OH连接完毕后，抽干反应液，依次用DMF、DCM、MeOH、DMF、DCM、MeOH(2次)洗涤树脂。真空干燥后得42.8g全保护利拉鲁肽-wang树脂。
实施例15全保护利拉鲁肽肽树脂的制备
向含替代度为0.38mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的反应柱中加入80ml 25％哌啶/DMF溶液脱保护(5+10min)，DMF洗涤6次，将Fmoc-Arg(pbf)-OH(7.4g，11.4mmol)、HOBt(1.54g，11.4mmol)和HBTU(4.32g，11.4mmol)溶解于NMP中，冰浴15分钟，加入DIEA(3.8ml，22.8mmol)活化5分钟后加入到固相反应柱中，固相反应柱拧盖置于恒温震荡器中，震荡反应3h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，依次用DMF、MeOH、DCM各洗涤2次，制得Fmoc-Arg(pbf)-Gly-CTC树脂。
按上述方法依次连接全保护多肽片段IV、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、全保护多肽片段III、全保护多肽片段II、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、全保护多肽片段I、Boc-His(Trt)-OH。最后一个氨基酸Boc-His(Trt)-OH连接完毕后，抽干反应液，依次用DMF、DCM、MeOH、DMF、DCM、MeOH(2次)洗涤树脂。真空干燥后得45.3g全保护利拉鲁肽-CTC树脂。
实施例16利拉鲁肽粗品的制备
按照TFA:TIS:H2O:DTT＝90:2.5:3.5:4(v:v:v:m，ml:ml:ml:g)的比例配制高酸裂解液300ml，冰浴冷却至-5℃，边搅拌边加入实施例14制得的42.8g全保护利拉鲁肽-wang树脂。反应2小时后，过滤树脂，真空浓缩滤液至约25ml，缓慢倒入3L冰乙醚中析出沉淀，过滤，滤饼用乙醚洗涤5次。真空干燥滤饼，得到利拉鲁肽粗品18.7g，收率92.3％，HPLC纯度：88.1％。
实施例17利拉鲁肽粗品的制备
按照TFA:TIS:H2O:DTT＝90:2.5:3.5:4(v:v:v:m，ml:ml:ml:g)的比例配制高酸裂解液260ml，冰浴冷却至-5℃，边搅拌边加入全保护利拉鲁肽-wang树脂43.1g。反应2小时后，过滤树脂，真空浓缩滤液至约25ml，缓慢倒入3L冰乙醚中析出沉淀，过滤，滤饼用乙醚洗涤5次。真空干燥滤饼，得到利拉鲁肽粗品18.5g，收率91.4％，HPLC纯度：88.6％。
实施例18利拉鲁肽粗品的制备
按照TFA:TIS:H2O:DTT＝90:2.5:3.5:4(v:v:v:m，ml:ml:ml:g)的比例配制高酸裂解液340ml，冰浴冷却至-5℃，边搅拌边加入全保护利拉鲁肽-wang树脂42.3g。反应2小时后，过滤树脂，真空浓缩滤液至约25ml，缓慢倒入3L冰乙醚中析出沉淀，过滤，滤饼用乙醚洗涤5次。真空干燥滤饼，得到利拉鲁肽粗品17.8g，收率88.0％，HPLC纯度：88.9％。
实施例19利拉鲁肽粗品的制备
将实施例15制备的全保护利拉鲁肽肽树脂加入到320mL4％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，收集滤液。再次将全保护利拉鲁肽肽树脂加入到320mL4％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，树脂用4％TFA/DCM淋洗2次，收集合并滤液。真空浓缩至残余液约30mL。
按照TFA:TIS:H2O:DTT＝90:2.5:3.5:4(v:v:v:m，ml:ml:ml:g)的比例配制高酸裂解液360ml，冰浴冷却至-5℃，边搅拌边加入到低酸裂解残余液中，反应2小时，真空浓缩滤液至约25ml，倒入3L冰乙醚中析出沉淀，过滤，滤饼用乙醚洗涤5次。真空干燥滤饼，得到利拉鲁肽粗品20.1g，收率94.0％，HPLC纯度：88.7％。
实施例20利拉鲁肽粗品的制备
将46.2g全保护利拉鲁肽-CTC肽树脂加入到280mL3％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，收集滤液。再次将全保护利拉鲁肽肽树脂加入到280mL3％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，树脂用3％TFA/DCM淋洗2次，收集合并滤液。真空浓缩至残余液约30mL。
按照TFA:TIS:H2O:DTT＝90:2.5:3.5:4(v:v:v:m，ml:ml:ml:g)的比例配制高酸裂解液280ml，冰浴冷却至-5℃，边搅拌边加入到低酸裂解残余液中，反应2小时，真空浓缩滤液至约25ml，倒入3L冰乙醚中析出沉淀，过滤，滤饼用乙醚洗涤5次。真空干燥滤饼，得到利拉鲁肽粗品20.5g，收率96.3％，HPLC纯度：88.5％。
实施例21利拉鲁肽粗品的制备
将45.7全保护利拉鲁肽-CTC肽树脂加入到365mL5％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，收集滤液。再次将全保护利拉鲁肽肽树脂加入到320mL5％TFA/DCM中搅拌10min，抽滤，树脂用5％TFA/DCM淋洗2次，收集合并滤液。真空浓缩至残余液约30mL。
按照TFA:TIS:H2O:DTT＝90:2.5:3.5:4(v:v:v:m，ml:ml:ml:g)的比例配制高酸裂解液365ml，冰浴冷却至-5℃，边搅拌边加入到低酸裂解残余液中，反应2小时，真空浓缩滤液至约25ml，倒入3L冰乙醚中析出沉淀，过滤，滤饼用乙醚洗涤5次。真空干燥滤饼，得到利拉鲁肽粗品19.3g，收率90.4％，HPLC纯度：89.1％。
实施例22利拉鲁肽的分析和制备
将实施例17制备的利拉鲁肽粗品溶于10％乙酸/10％乙腈/80％水(V/V/V)溶液中，超声使样品完全溶解，用滤膜过滤，收集滤液，备用。
分析条件：色谱柱：资生堂CAPCELL PAK C18,5μm,4.6×150mm；流动相：A相：0.045％三氟乙酸-水溶液；B相0.036％三氟乙酸-乙腈溶液，检测波长为214nm；流速为1mL·min-1。
利拉鲁肽粗品的一次纯化条件为：色谱柱：C18型半制备柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。流动相：A相：0.1％三氟乙酸—水溶液；B相：0.1％三氟醋酸-乙腈溶液，流速：60ml/min，梯度：30％B—70％B，检测波长：215nm。进样量为1.5～2.5g。收集目标峰馏分，得到目标峰纯度大于95％的馏分，将收集到的馏分于水温低于35℃减压浓缩至馏分不再流出，得到一次纯化物料。
将一次纯化收集到的浓缩馏分进行二次除盐纯化，条件为：流动相A相：工艺用水；B相：乙腈溶液，检测波长：215nm，流速为30～60mL·min-1。收集目标馏分，将收集到的馏分于水温低于35℃减压浓缩至馏分不再流出，将剩余馏分冻干，得到利拉鲁肽精制品8.6g，总收率42.4％，HPLC纯度：99.8％，最大单杂：0.09％。

Claims (10)

1.一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、在树脂载体A上采用固相合成法制备全保护多肽片段I肽树脂、全保护多肽片段II肽树脂、全保护多肽片段III肽树脂、全保护多肽片段IV肽树脂；
步骤2、用裂解液分别酸解全保护多肽片段I肽树脂、全保护多肽片段II肽树脂、全保护多肽片段III肽树脂、全保护多肽片段IV肽树脂得到全保护多肽片段I、全保护多肽片段II、全保护多肽片段III、全保护多肽片段IV；
步骤3、在树脂载体B上通过固相合成法按照利拉鲁肽的序列顺序从C端开始依次耦合相应的保护氨基酸和全保护多肽片段，制备全保护利拉鲁肽肽树脂：
Boc-His(Trt)-I-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-II-III-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-IV-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
步骤4、用裂解液酸解全保护利拉鲁肽肽树脂，得利拉鲁肽粗品，即：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Nα-PAL-γ-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
步骤5、利拉鲁肽粗品纯化得利拉鲁肽精制品。
2.根据权利要求1所述利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：全保护多肽片段I为Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH，全保护多肽片段II为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-OH，全保护多肽片段III为Fmoc-Ala-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-Glu(OtBu)-OH，全保护多肽片段IV为Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-OH。
3.根据权利要求1所述利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：步骤1中树脂载体A为2-氯三苯基甲基树脂。
4.根据权利要求1所述利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：步骤2中裂解液为含体积分数1.5％～3.0％TFA的DCM溶液。
5.根据权利要求4所述利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：裂解完毕，以同等体积的吡啶/二氯甲烷溶液中和裂解液，其中吡啶的体积含量与裂解液中TFA的体积含量相同。
6.根据权利要求1所述利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：步骤2中全保护多肽片段肽树脂与裂解液的质量体积比为1：6～8，其中质量以g计，体积以mL计。
7.根据权利要求1所述利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：步骤3中树脂载体B选自2-氯三苯基甲基树脂或wang树脂。
8.根据权利要求1所述利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：步骤4中全保护利拉鲁肽肽树脂与裂解液的质量体积比为1：6～8，其中质量以g计，体积以mL计。
9.根据权利要求1所述利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：步骤4中当树脂载体B为2-氯三苯基甲基树脂时，酸解采用低-高酸两步裂解法，低酸裂解液为含3％～5％TFA的DCM溶液；以v:v:v:m计，高酸裂解液为TFA：H2O：TIS：DTT＝90：2.5：3.5：4的溶液，其中体积以mL计，质量以g计。
10.根据权利要求1所述利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：步骤4中当树脂载体B为wang树脂时，采用一步裂解法，以v:v:v:m计，裂解液为TFA：H2O：TIS：DTT＝90：2.5：3.5：4的溶液，其中体积以mL计，质量以g计。
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