CN116284206A - 一种树脂材料的洗涤方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种树脂材料的洗涤方法，涉及多肽纯化技术领域。该洗涤方法有效提高了现有多肽固相合成洗涤过程中洗涤效率低的问题；有效改善了溶剂使用量大、合成废液多、洗涤过程时间长等问题，且降低了因洗涤不完全而导致的副反应发生，在多肽药物的绿色合成，成本控制、质量控制等方面有较广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于多肽纯化技术领域，具体涉及一种树脂材料的洗涤方法。
背景技术
在多肽固相合成领域，最大的溶剂使用及废液产生环节为肽树脂的洗涤环节，此环节的溶剂使用量占整个肽树脂合成砌块的90%以上；目前肽树脂的洗涤方式为搅拌洗涤：使用一定量的DMF与肽树脂进行混匀后再抽滤，并进行多次洗涤，直至将肽树脂中残留的反应物洗涤至一定的限度后结束。该洗涤方式溶剂使用量大，洗涤效果一般。
多肽固相合成的载体一般为聚苯乙烯树脂，树脂在常用溶剂中有较好的溶胀属性，因此树脂在溶胀后，树脂球内有一定的溶剂残留。常规的洗涤方式为搅拌洗涤，通过多次混匀后抽滤，不断的降低肽树脂中反应残留物的比例，因此该方法的洗涤效果跟洗涤溶剂的使用量及洗涤次数有关。据研究发现，常规的搅拌洗涤方式每次的洗涤效率在60%左右，洗涤效率比较低，需使用大量的溶剂经过多次洗涤，才能达到所需的洗涤终点。
因此，开发一种新的肽树脂洗涤方式，提高洗涤效率，来减少洗涤溶剂的使用量，从而减少废液、控制生产成本，非常有必要。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种新的肽树脂洗涤方式，以解决现有多肽固相合成技术中溶剂使用量大、合成废液多的问题；为多肽药物工业化生产成本控制、减少污染提供了一个好的解决方式。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种树脂材料的洗涤方法，包括：
偶联洗涤：常规固相合成中对偶联结束后的肽树脂采用洗涤溶剂进行淋洗，抽滤；
和/或，
去保护洗涤：常规固相合成中去保护结束后的肽树脂先采用洗涤溶剂进行淋洗，再采用特殊溶剂进行搅拌洗涤；
上述特殊溶剂包含缩合剂和有机溶剂；
上述缩合剂包含HOBt、HOAt、Oxyma或HOOBt。
根据本发明的一个具体实施方式，上述有机溶剂包含DMF。
根据本发明的一个具体实施方式，上述淋洗包括：洗涤溶剂沿反应器壁或搅拌桨加入肽树脂中，加完后不进行搅拌混匀，直接真空抽滤处理。
根据本发明的一个具体实施方式，上述洗涤溶剂包含DMF。
根据本发明的一个具体实施方式，上述淋洗次数为2-10次。
根据本发明的一个具体实施方式，上述偶联结束后的肽树脂与单次淋洗时的洗涤溶剂的质量体积比为：1g:3-10mL。
根据本发明的一个具体实施方式，上述去保护结束后的肽树脂与单次淋洗时的洗涤溶剂的质量体积比为：1g:2-8mL。
根据本发明的一个具体实施方式，上述搅拌洗涤包括：在去保护结束后的肽树脂中加入浓度为3-6g/L的特殊溶剂，搅拌使固液混合均匀，真空抽滤。
根据本发明的一个具体实施方式，上述去保护结束后的肽树脂与特殊溶剂的质量体积比为：1g:2-8mL。
本发明提供的淋洗方法是将洗涤溶剂加入待洗涤的肽树脂层上表面，不进行混匀，直接真空抽滤，该方法的原理是每次都有干净的溶剂通过树脂层，将树脂中的残留物不停的置换出来，如此洗涤效率高，洗涤所需的溶剂量少，操作方便，且缩短了整个洗涤过程的时间。
本发明在去保护洗涤最后一遍时使用特殊洗涤溶剂进行洗涤，可以有效的避免因哌啶的残留而引入杂质的风险。其原因可能在于，由于去保护洗涤至终点后，仍然有少量的哌啶存在，而哌啶具有很强的亲核能力，很低浓度的哌啶都能对Fmoc有脱除能力，并且哌啶的残留会增加引入杂质的风险；而HOBt、HOAt、Oxyma等具有弱酸性，能与哌啶结合，有效的降低哌啶对Fmoc的脱除能力，且这些物质一般为下一步偶联反应的反应试剂，不存在引入其他副反应的风险。
根据本发明的一个具体实施方式，上述缩合剂还包括离子液体；上述离子液体包括1,3-丙烷磺内酯、N-甲基咪唑以及黄胺酸反应产物。
本发明还公开了一种离子液体的制备方法，包括：将1,3-丙烷磺内酯溶于1,2-二氯乙烷中，然后加入N-甲基咪唑，搅拌反应，制得中间体a，在中间体a中加入黄胺酸，然后加入去离子水，搅拌反应，洗涤干燥，制得离子液体。
本发明提供了一种离子液体的制备方法，该制备方法是采用1,3-丙烷磺内酯与N-甲基咪唑反应后，再与黄胺酸反应制得的离子液体，该离子液体对肽树脂中残留的哌啶具有良好的洗涤效果，原因可能是由于黄胺酸中的硝基、羟基等基团的存在增强了与哌啶的氢键结合能力，提升了离子液体对肽树脂中残留的哌啶的去除效果。
具体地，上述离子液体的制备方法，包括以下步骤：
将1,3-丙烷磺内酯溶于1,2-二氯乙烷中，然后缓慢加入N-甲基咪唑，室温条件下，搅拌反应1.5-3h，过滤，乙醚洗涤3-5次，减压蒸馏，制得中间体a，在中间体a中加入黄胺酸，然后加入去离子水，室温搅拌反应20-30h，乙醚洗涤3-5次，乙醇洗涤，在100-105℃真空干燥5-8h，制得离子液体。
根据本发明的一个具体实施方式，上述1,3-丙烷磺内酯与1,2-二氯乙烷的质量体积比为：1g:8-15mL。
根据本发明的一个具体实施方式，上述1,3-丙烷磺内酯与N-甲基咪唑的摩尔比为：1:0.8-1.3。
根据本发明的一个具体实施方式，上述中间体a与黄胺酸的摩尔比为：1:0.8-1.3。
根据本发明的一个具体实施方式，上述中间体a与去离子水的质量体积比为：1g:2-4mL。
本发明还公开了上述离子液体在多肽固相合成中肽树脂洗涤中的用途。
本发明的有益效果包括：
本发明获得了一种树脂材料的洗涤方法，本发明提供的多肽固相合成中肽树脂的洗涤方式，大大的降低了洗涤溶剂的使用量，降低了废液的产出量，且降低了因洗涤不完全而导致的副反应发生，在多肽药物的绿色合成，成本控制、质量控制等方面有较广泛的应用前景。
因此，本发明提供了一种树脂材料的洗涤方法，该洗涤方法大大的降低了洗涤溶剂的使用量，具有良好的洗涤效果。
附图说明
图1为胸腺五肽合成方法流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明确，以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细描述：
本发明实施例中所用到的英文缩写具有以下含义：
HOBt：1-羟基苯并三唑；
HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑；
Oxyma：氰基羟基亚氨基乙酸乙酯；
HOOBt：3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮；
DIC：二异丙基碳二亚胺；
DMF：N,N-二甲基甲酰胺；
Pip：哌啶；
Fmoc：芴甲氧羰基；
Tyr：酪氨酸；
tBu：叔丁基；
Val：缬氨酸；
Asp：天冬氨酸；
OtBu：叔丁氧基；
Lys：赖氨酸；
Boc：叔丁氧羰基；
Arg：精氨酸；
Pbf：（2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基）磺酰基；
TFA：三氟乙酸；
TIS：三异丙基硅烷。
实施例1：
一种胸腺五肽的合成方法，包括：
称取Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin（取代度0.64mmol/g）4.64g，用40mL DMF进行溶胀1h后加入40mL 20%Pip/DMF（v/v）进行去保护，去保护结束后使用20mL DMF进行淋洗，洗涤4次，最后加入20mL浓度为5g/L的HOBt/DMF，搅拌使固液混合均匀，真空抽滤，取树脂进行茚三酮检测显阳性。称取Fmoc-Val-OH氨基酸3.1g，HOBt 1.2g，DIC 1.4mL，加入反应器中进行反应，偶联1h后取样进行检测，结果显阴性；抽滤，使用20mL DMF进行淋洗，洗涤4次；
加入40mL 20%Pip/DMF（v/v）进行去保护，去保护结束后使用20mL DMF进行淋洗，洗涤4次，最后加入20mL浓度为5g/L的HOBt/DMF，搅拌使固液混合均匀，真空抽滤，取树脂进行茚三酮检测显阳性。称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH氨基酸3.7g，HOBt 1.2g，DIC 1.4mL，加入反应器中进行反应，偶联1h后取样进行检测，结果显阴性；抽滤，使用20mL DMF进行淋洗，洗涤4次；
加入40mL 20%Pip/DMF（v/v）进行去保护，去保护结束后使用20mL DMF进行淋洗，洗涤4次，最后加入20mL浓度为5g/L的HOBt/DMF，搅拌使固液混合均匀，真空抽滤，取树脂进行茚三酮检测显阳性。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH氨基酸4.2g，HOBt 1.2g，DIC 1.4mL，加入反应器中进行反应，偶联1h后取样进行检测，结果显阴性；抽滤，使用20mL DMF进行淋洗，洗涤4次；
加入40mL 20%Pip/DMF（v/v）进行去保护，去保护结束后使用25mL DMF进行淋洗，洗涤4次，最后加入25mL浓度为5g/L的HOBt/DMF，搅拌使固液混合均匀，真空抽滤，取树脂进行茚三酮检测显阳性。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH氨基酸5.9g，HOBt 1.2g，DIC 1.4mL，加入反应器中进行反应，偶联1h后取样进行检测，结果显阴性；抽滤，使用25mL DMF进行淋洗，洗涤4次；
加入40mL 20%Pip/DMF（v/v）进行去保护，去保护结束后使用25mL DMF进行淋洗，洗涤4次，最后加入25mL浓度为5g/L的HOBt/DMF，搅拌使固液混合均匀，真空抽滤，取树脂进行茚三酮检测显阳性。使用甲基叔丁基醚洗涤3次后抽干得到胸腺五肽树脂7.10g，肽树脂收率119.3%；
使用切割液（切割液包含TFA、TIS、H2O，TFA、TIS与H2O三者的体积比为90:5:5）70mL加入上述肽树脂中，切割2.5h后抽滤，收集滤液，用700mL甲基叔丁基醚沉降、离心、洗涤、干燥，最终得到2.48g胸腺五肽粗肽，经HPLC检测，所得粗肽纯度为96.4%；胸腺五肽的合成方法流程图如图1所示。
实施例2：
一种胸腺五肽的合成方法与实施例1的区别：采用HOAt/DMF替代HOBt/DMF。
实施例3：
一种胸腺五肽的合成方法与实施例1的区别：采用Oxyma/DMF替代HOBt/DMF。
实施例4：
一种胸腺五肽的合成方法与实施例1的区别：采用HOOBt/DMF替代HOBt/DMF。
实施例5：
一种胸腺五肽的合成方法与实施例1的区别：采用离子液体/DMF替代HOBt/DMF。
离子液体的制备方法，包括以下步骤：
将1,3-丙烷磺内酯溶于1,2-二氯乙烷中，然后缓慢加入N-甲基咪唑，室温条件下，搅拌反应2h，过滤，乙醚洗涤3次，减压蒸馏，制得中间体a，在中间体a中加入黄胺酸，然后加入去离子水，室温搅拌反应20h，乙醚洗涤3次，乙醇洗涤，在100℃真空干燥8h，制得离子液体；其中，1,3-丙烷磺内酯与1,2-二氯乙烷的质量体积比为：1g:8mL；1,3-丙烷磺内酯与N-甲基咪唑的摩尔比为：1:0.8；中间体a与黄胺酸的摩尔比为：1:0.8；中间体a与去离子水的质量体积比为：1g:2mL。
离子液体的氢谱如下：1H NMR（500MHz，CDCl3）：3.69（s，3H，N-CH 3），7.37（d，1H，N=CH），6.99（t，1H，CH3-N-CH=CH），7.04（t，1H，CH3-N-CH=CH），3.98（m，2H，N-CH 2），2.25（m，2H，CH2-CH 2-CH2），2.96（m，2H，CH2-CH2-CH 2），7.71-8.45（4H，Ar-H）。HRMS(ESI)：C17H18N4O11S2，m/z[M+H]+，518.04。
实施例6：
一种胸腺五肽的合成方法与实施例1的区别：采用离子液体/DMF替代HOBt/DMF。
离子液体的制备方法与实施例5的区别：采用现有技术中的对甲苯磺酸替代黄胺酸。
实施例7：
哌啶残留量测试
采用离子色谱法检测树脂中哌啶的残留量；离子色谱的测试条件为：抑制器的电流为50mA；柱温为30℃，浓度为20mmol/L的氢氧化钾溶液作为淋洗剂，流速为1mL/min，检测器材为电导检测器。
表1 哌啶残留量测量结果
对实施例1-实施例6最后得到的去保护洗涤的树脂进行上述测试，结果如表1所示。由表1可知，实施例5与实施例6相比，哌啶残留量明显下降，说明采用黄胺酸制备的离子液体具有良好的哌啶去除效果。
实施例8：
一种胸腺五肽的合成方法与实施例1的区别：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的使用量为15.63g，并对每一次偶联结束后的肽树脂进行淋洗，采用淋洗剂DMF沿反应器壁加入树脂中，加完后不进行搅拌混匀直接真空抽滤，单次淋洗剂用量为120mL。
实施例9：
一种胸腺五肽的合成方法与实施例1的区别：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的使用量为15.63g，并对每一次偶联结束后的肽树脂采用搅拌洗涤替代淋洗，在每一次偶联结束后的肽树脂中加入DMF溶剂洗涤，搅拌混匀后，再进行真空抽滤，单次DMF洗涤剂用量为120mL。
实施例10：
偶联洗涤效果测试
收集每次偶联洗涤后的DMF溶液样品，取0.5mL收集的DMF洗涤溶液，加入0.5mL40%Pip/DMF（v/v）溶液反应0.5h后使用甲醇定容至50mL，使用紫外分光光度计进行检测，检测波长为301.0nm，树脂中残留的氨基酸通过Pip/DMF处理后等量转变成Fmoc-Pip，可通过UV吸收值对比洗涤效果；UV吸收值越小，氨基酸残留越少。
表2 偶联洗涤效果测试结果
对实施例8、实施例9中每次洗涤的DMF溶液进行上述测试，结果如表2所示。由表2可知，淋洗后的UV吸收值均明显小于搅拌洗涤，说明淋洗使得树脂中的氨基酸残留较少，洗涤效果较好。
实施例11：
一种胸腺五肽的合成方法与实施例1的区别：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的使用量为15.63g，并对每一次去保护结束后的肽树脂进行淋洗，采用淋洗剂DMF沿反应器壁加入树脂中，加完后不进行搅拌混匀直接真空抽滤，单次淋洗剂用量为120mL。
实施例12：
一种胸腺五肽的合成方法与实施例1的区别：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的使用量为15.63g，并对每一次去保护结束后的肽树脂采用搅拌洗涤替代淋洗，在每一次去保护结束后的肽树脂中加入DMF溶剂洗涤，搅拌混匀后，再进行真空抽滤，单次DMF洗涤剂用量为120mL。
实施例13：
去保护洗涤pH值测试
采用精密pH试纸检测pH值，并对每次洗涤液样品中的pH值检测；pH值越小，洗涤溶液中的哌啶残留越低。
表3 pH值检测结果
对实施例11、实施例12去保护结束后的肽树脂洗涤后的洗涤液进行上述测试，结果表3所示。由表3可知，淋洗得到的洗涤液pH值明显低于搅拌洗得到的洗涤液pH值；说明淋洗的洗涤溶液中的哌啶残留较低。
实施例14：
特殊溶剂对哌啶的去除效果测试
配制浓度为0.5wt%、0.1wt%的哌啶/DMF溶液及0.5wt%、0.1wt%的哌啶HOBt/DMF溶液（HOBt在DMF中的浓度为5g/L）。使用精密pH试纸检测pH值；使用配制好的哌啶溶液处理Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin 0.5h，然后对树脂进行茚三酮检测，结果如表4所示。
表4 pH值及茚三酮检测结果
从pH值及茚三酮的检测结果可以看出，HOBt/DMF更易与哌啶相结合，有利于树脂中哌啶的去除，进一步说明了本发明在去保护洗涤中采用的特殊溶剂作为洗涤溶剂时可增强洗涤溶剂对肽树脂的洗涤效果。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种树脂材料的洗涤方法，包括：
偶联洗涤：常规固相合成中对偶联结束后的肽树脂采用洗涤溶剂进行淋洗，抽滤；
和/或，
去保护洗涤：常规固相合成中去保护结束后的肽树脂先采用洗涤溶剂进行淋洗，再采用特殊溶剂进行搅拌洗涤；
所述特殊溶剂包含缩合剂和有机溶剂；
所述缩合剂包含HOBt、HOAt、Oxyma或HOOBt。
2.根据权利要求1所述的一种树脂材料的洗涤方法，其特征在于：所述淋洗包括：洗涤溶剂沿反应器壁或搅拌桨加入肽树脂中，加完后不进行搅拌混匀，直接真空抽滤处理。
3.根据权利要求1所述的一种树脂材料的洗涤方法，其特征在于：所述淋洗的次数为2-10次。
4.根据权利要求1所述的一种树脂材料的洗涤方法，其特征在于：所述洗涤溶剂包含DMF。
5.根据权利要求1所述的一种树脂材料的洗涤方法，其特征在于：所述搅拌洗涤包括：在去保护结束后的肽树脂中加入浓度为3-6g/L的特殊溶剂，搅拌使固液混合均匀，真空抽滤。
6.根据权利要求1所述的一种树脂材料的洗涤方法，其特征在于：所述有机溶剂包含DMF。
7.根据权利要求1所述的一种树脂材料的洗涤方法，其特征在于：所述缩合剂还包括离子液体；所述离子液体包括1,3-丙烷磺内酯、N-甲基咪唑以及黄胺酸反应产物。
8.根据权利要求7所述的一种树脂材料的洗涤方法，其特征在于：所述1,3-丙烷磺内酯与N-甲基咪唑的摩尔比为：1:0.8-1.3。
9.权利要求7-8中任一项所述离子液体在多肽固相合成中肽树脂洗涤中的用途。
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