CN112778402B - 一种利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法 - Google Patents

一种利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法，将活化后的Z‑Gly‑OH、缩合试剂和Tag‑NH2同时泵入第一微结构反应器中进行缩合反应，反应产物经碳酸钠水溶液洗涤后分层，有机层泵入柱加氢设备进行脱Z保护的反应，反应液随后依次与Z‑Leu‑OH、Z‑Pro‑OH重复上述反应，然后与Fmoc‑Cys(Trt)‑OH进行缩合，洗涤、静置分层，有机层泵入脱保护设备进行脱Fmoc保护的反应，反应液经稀盐酸水溶液洗涤，保留有机层，随后依次与Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、Fmoc‑Gln(Trt)‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH、Fmoc‑Cys(Trt)‑OH重复上述反应，所得产物裂解得到粗肽，纯化后进行氧化合成二硫键，最后纯化后冷冻干燥即得。

Description

一种利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，具体涉及一种利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法。
背景技术
在肽化学的早期发展阶段，肽合成反应一般都是在液相中进行的。遗憾的是，液相合成多肽很费力，并且需要具备在选择保护基和缩合方法上的策略和战略以及解决溶解性问题等诸多方面的知识。固相多肽合成方法自1963年由Merrifield提出以来，由于合成方便、迅速，成为多肽合成的首选方法。多肽固相合成虽然操作简单、合成周期短，但是氨基酸、偶联试剂以及溶剂的消耗量大于液相合成。此外，固相合成反应为非均相体系，难于监测和分析反映进程，并受实验误差的干扰；增长中的肽链聚集现象增加了合成的难度。
连续流微通道反应是近年来发展起来的绿色有机合成方法。微反应器的两大特征即比表面积大及连续操作方式，使得我们对反应工艺的精确控制成为可能。相对于传统的间歇反应工艺，微反应器具有高速混合、高效传热、反应物停留时间窄、重复性好、几乎无放大效应、便于实时监测反应进程、在线化学品量少从而达到高安全性能等优势。目前，连续流微通道反应器在有机小分子的合成中取得了很多应用，但应用于多肽合成的案例还很少见。
缩宫素可使乳腺腺泡周围的肌上皮样细胞收缩，促使具有泌乳功能的乳腺排乳。对子宫有较强的促进收缩作用，但以妊娠子宫较为敏感。其氨基酸序列结构为H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2，其结构式如式一所示。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种缩宫素的连续流微通道反应方法，该方法原料和溶剂消耗少，成本低，操作方便，便于在线监测反应进程，可适合大规模生产。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法，包括如下步骤：
(1)将活化后的Z-Gly-OH、缩合试剂和有机溶剂三者形成的混合液，碳端保护基Tag-NH2与有机溶剂二者形成的混合液，分别同时泵入微通道模块化反应装置中的第一微结构反应器中进行氨基酸之间的缩合反应；然后将第一微结构反应器流出液，与碳酸钠水溶液分别同时泵入到微通道模块化反应装置中的第二微结构反应器中进行洗涤，洗涤后的流出液在静置分液装置中静置分层，保留有机层；随后将有机层泵入柱加氢设备进行脱Z保护的反应，保留柱加氢设备中流出的反应液I；
(2)将活化后的Z-Leu-OH替换步骤(1)中的Z-Gly-OH，将步骤(1)得到的反应液I替换步骤(1)中Tag-NH2与有机溶剂形成的混合液，进行步骤(1)相同的反应和处理过程，得到反应液II；
(3)将活化后的Z-Pro-OH替换步骤(1)中的Z-Gly-OH，将步骤(2)得到的反应液II替换步骤(1)中Tag-NH2与有机溶剂形成的混合液，进行步骤(1)相同的反应和处理过程，得到反应液III；
(4)将活化后的Fmoc-Cys(Trt)-OH替换步骤(1)中的Z-Gly-OH，将步骤(3)得到的反应液III替换步骤(1)中Tag-NH2与有机溶剂形成的混合液，进行步骤(1)相同的缩合反应、洗涤、静置分层，保留有机层；随后将有机层泵入脱保护设备进行脱Fmoc保护的反应，保留脱保护设备中流出的反应液，与稀盐酸水溶液分别同时泵入到微通道模块化反应装置中的第三微结构反应器中进行洗涤，洗涤后的流出液在静置分液装置中静置分层，保留有机层反应液IV；
(5)将活化后的Fmoc-Asn(Trt)-OH替换步骤(4)中的Fmoc-Cys(Trt)-OH，将得到的反应液IV替换步骤(4)中的反应液III，进行步骤(4)相同的反应和处理过程，得到反应液V；
(6)将活化后的Fmoc-Gln(Trt)-OH替换步骤(4)中的Fmoc-Cys(Trt)-OH，将得到的反应液V替换步骤(4)中的反应液III，进行步骤(4)相同的反应和处理过程，得到反应液VI；
(7)将活化后的Fmoc-Ile-OH替换步骤(4)中的Fmoc-Cys(Trt)-OH，将得到的反应液VI替换步骤(4)中的反应液III，进行步骤(4)相同的反应和处理过程，得到反应液VII；
(8)将活化后的Fmoc-Tyr(tBu)-OH替换步骤(4)中的Fmoc-Cys(Trt)-OH，将得到的反应液VII替换步骤(4)中的反应液III，进行步骤(4)相同的反应和处理过程，得到反应液VIII；
(9)将活化后的Fmoc-Cys(Trt)-OH替换步骤(4)中的Fmoc-Cys(Trt)-OH，将得到的反应液VIII替换步骤(4)中的反应液III，进行步骤(4)相同的反应和处理过程，得到H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NHTag；
(10)将步骤(9)得到的H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu
-Gly-NHTag进行裂解得到粗肽，并将粗肽经液相色谱进行纯化，得到缩宫素九肽H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2；
(11)将步骤(10)得到的缩宫素九肽H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2进行氧化合成二硫键，经纯化后冷冻干燥即得。
具体地，各步骤中使用的有机溶剂相同，均选自乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯乙烷中的一种或几种的混合物；各步骤中使用的缩合试剂相同，均选自HOBt、DMAP、EDC·HCl、DIC、DCC、PyBop、CDI、HATU中的一种或几种的混合物；所述的碳酸钠水溶液的浓度为10wt％；所述的稀盐酸水溶液浓度为5wt％。
步骤(1)中，所述的Z-Gly-OH和缩合试剂的反应摩尔比为1:1.2；Z-Gly-OH与Tag-NH2的反应摩尔比控制为1:1.05，步骤(2)和步骤(3)中所采用的替换原料按照步骤(1)相同的摩尔比进行反应。
步骤(4)中，所述的Fmoc-Cys(Trt)-OH和缩合试剂的反应摩尔比为1:1.2；Fmoc-Cys(Trt)-OH与反应液III的摩尔比控制为1.1:1；步骤(5)～(9)中所采用的替换原料按照步骤(4)相同的摩尔比进行反应。
优选地，步骤(1)中，活化后的Z-Gly-OH、缩合试剂和有机溶剂三者形成的混合液泵入第一微结构反应器的流速，与Tag-NH2与有机溶剂二者形成的混合液泵入第一微结构反应器的流速相同，均为2～8ml/min；在第一微结构反应器中的反应温度为30～70℃，反应停留时间为1～15min；碳酸钠水溶液泵入第二微结构反应器的流速为2～8ml/min；有机层泵入柱加氢设备的流速是5～15ml/min；步骤(2)和步骤(3)采用步骤(1)相同的反应条件。
优选地，步骤(4)中，活化后的Fmoc-Cys(Trt)-OH、缩合试剂和有机溶剂三者形成的混合液泵入第一微结构反应器的流速，与反应液III泵入第一微结构反应器的流速相同，均为2～8ml/min；碳酸钠水溶液泵入第二微结构反应器的流速为2～8ml/min；有机层泵入脱保护设备中的流速为5～15ml/min；稀盐酸水溶液泵入到第三微结构反应器中的流速为2～8ml/min；第一微结构反应器中反应温度为30～70℃，反应停留时间为1～15min；第二微结构反应器中反应温度为30～70℃，反应停留时间为8～12min；第三微结构反应器中反应温度为30～70℃，反应停留时间为8～12min；步骤(5)～步骤(9)采用步骤(4)相同的反应条件。
具体地，各步骤中，活化后的Z-Gly-OH、活化后的Z-Leu-OH、活化后的Z-Pro-OH、活化后的Fmoc-Cys(Trt)-OH、活化后的Fmoc-Asn(Trt)-OH、活化后的Fmoc-Gln(Trt)-OH、活化后的Fmoc-Ile-OH、活化后的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、活化后Fmoc-Cys(Trt)-OH，是分别将Z-Gly-OH、Z-Leu-OH、Z-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH分别在有机溶剂中活化30min得到，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯乙烷中的任意一种或几种的混合物。
优选地，步骤(1)中，所述的碳端保护基Tag-NH2为CH3-Tag或Si-Tag。
进一步地，步骤(10)中，裂解条件依据Tag-NH2的选择而决定，Tag-NH2为CH3-Tag保护基时，裂解条件是TFA：TIS：巯基丙酸＝95％：2.5％：2.5％；Tag为Si-Tag保护基时，裂解条件是TFA：DODT：TIS：H2O＝92.5％：2.5％：2.5％：2.5％(v/v/v/v)；裂解结束后，加入乙醚沉降出缩宫素粗肽，乙醚与裂解液的体积比为6:1；
将粗肽经液相色谱进行纯化的色谱条件为：流动相分别选用A为0.1％v/v AcOH/H2O和B为0.1％v/vAcOH/MeCN，制备柱选用C18，20mmID×250mm，设置制备梯度为0min-5min-45min的时间对应B％含量为5％-10％-45％，B％含量的增长过程为线性增长。
具体地，步骤(11)中，氧化合成二硫键采用0.5％的H2O2或者碘氧化进行二硫键的合成；纯化采用液相色谱进行纯化，色谱条件为：流动相分别选用A为0.1％v/v AcOH/H2O和B为0.1％v/vAcOH/MeCN，制备柱选用C18，20mmID×250mm，设置制备梯度为0min-5min-45min的时间对应B％含量5％-10％-45％，B％含量的增长过程为线性增长。
有益效果：
本发明通过微通道模块化反应装置合成缩宫素，使传热、传质效率提高，缩短了偶联反应时间；将多肽液相合成在连续流中的应用，与传统固相相比氨基酸、偶联试剂以及溶剂的消耗量大大减少，降低了成本；采用连续流设备来进行多肽合成，通过调节流速、温度来提高偶联效率，操作简单，重复率高，适合于大规模生产；本发明采用连续流设备来进行多肽合成，摒弃了传统的釜式反应，减少了生产所需的空间，得到的缩宫素纯度达到98.62％。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1是本发明合成缩宫素的流程示意图。
图2是实施例1制备的缩宫素纯化后的液相谱图。
图3是实施例1制备的缩宫素的Mass谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
说明书附图所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容所能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“前”、“后”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
以下实施例采用如图1所示的合成工艺制备缩宫素，合成的反应装置包括第一加料罐、第二加料罐、第三加料罐、第四加料罐、第五加料罐、第六加料罐、第七加料罐、第一微结构反应器、第二微结构反应器、第三微结构反应器、柱加氢设备、脱保护设备、第一冷热一体机、第二冷热一体机、第三冷热一体机、第一温度显示器、第二温度显示器、第三温度显示器、柱温箱以及静置分液装置。
其中，第一加料罐和第二加料罐分别通过设置有计量泵的管道与第一微结构反应器串联，第一微结构反应器由第一冷热一体机控制温度并且由第一温度显示器显示温度。
第一微结构反应器出料口和第三加料罐分别通过管道与第二微结构反应器串联，第三加料罐与第二微结构反应器的连接管道上设置有计量泵，第二微结构反应器由第二冷热一体机控制温度并且由第二温度显示器显示温度。
第二微结构反应器出料口连接有静置分液装置，静置分液装置与第四加料罐相连。
第四加料罐通过设置有计量泵的管道与柱加氢设备串联，温度通过柱温箱控制，氢气压力通过减压阀控制；以及第四加料罐通过设置有计量泵的管道与脱保护设备设备串联，温度通过柱温箱控制。
柱加氢设备出料口与第五加料罐相连，脱保护设备出料口与第六加料罐相连。
第六微结构反应器出料口和第七加料罐分别通过管道与第三微结构反应器串联，第三微结构反应器出料口连接有静置分液装置，静置分液装置与第二加料罐相连。
反应物料和产物通过精确且低脉动的计量泵实现输入和输出。
其中，物料1、物料2、物料3、物料4、物料5、物料6和物料7分别对应第一加料罐、第二加料罐、第三加料罐、第四加料罐、第五加料罐、第六加料罐以及第七加料罐。
第一微结构反应器持液量80ml，第二微结构反应器持液量120ml，第三微结构反应器持液量120ml。
微反应器型号SiliconCarbideMicror乙酸乙酯ctor，购自于山东金德新材料有限公司。
柱加氢设备是规格20mm ID*250mm的空心制备柱填入16g5％钯碳，并在制备柱中注入氢气。
脱保护设备是规格20mm ID*250mm的空心制备柱填入30％的哌啶/DMF溶液(V/V)。
冷热一体机型号VCO-HL30，购自于昆山纬亿塑胶机械有限公司。
柱温箱型号G1316A，购自于安捷伦有限公司。
泵的型号MP2002C，购自于上海三为科学仪器有限公司。
温度显示器与微反应器一同购自与山东金德新材料有限公司。
本发明采用的部分缩略语相对应的化学名称如下：
Z：苄氧羰基
Fmoc：芴甲氧羰基
Gly：甘氨酸
Pg：保护基
Leu：亮氨酸
Pro：脯氨酸
Tyr：酪氨酸
tBu：叔丁基
Na2CO3：碳酸钠
HPLC：高效液相色谱
Ser：丝氨酸
Asn：天冬酰胺
Gln：谷氨酰胺
Ile：异亮氨酸
Trt：三苯甲基
Cys：半胱氨酸
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
EDC.HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐
DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺
DCC：N，N’-二环己基碳二亚胺
PyBop：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HATU：2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐
HOBt：1-羟基苯并三氮唑
tBu：正丁基
CH3-Tag：三甲基氯硅烷
Si-Tag：三异丙基氯硅烷
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
DODT:3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇
H2O:水
AcOH:醋酸
MeCN:乙腈
DMAP:4-二甲氨基吡啶。
实施例1
a.Z-Gly-NHTag的制备过程
配制物料1：将Z-Gly-OH(4.17g，20.0mmol)、EDC.HCl(4.37g，22.8mmol)以及HOBt(3.08g，22.8mmol)溶于250ml乙酸乙酯中，Z-Pro-OH的浓度为0.08024mmol/ml；
配制物料2：将Tag-NH2(10g，19.05mmol)溶于250ml乙酸乙酯中，保护剂的浓度为0.0762mmol/ml。
物料1与物料2的进料流速通过计量泵来调节，流速相等为4ml/min。缩合反应在第一微结构反应器中进行，反应时间10min，温度30℃，得到Z-Gly-NHTag。
b.Z-Gly-NHTag洗涤的过程
物料3：10wt％Na2CO3水溶液。
物料3的进料流速为4ml/min，通过计量泵来调节，在第二微结构反应器中进行洗涤，洗涤10min，用分液漏斗在出料口接液，静置分层，用HPLC监测有机相是否洗涤除杂干净，若还有杂质可再洗涤一轮。
c.Z-Gly-NHTag脱Z保护的过程
将洗涤后的Z-Gly-NHTag(物料4)通过计量泵调节流速分别为10ml/min，氢气压力0.55Mpa，反应液完全流过加氢柱的时间由反应液的体积决定，HPLC监测，脱除Z得到H-Gly-NHTag(物料5)。
d.通过微通道模块化反应装置
类似于a～c处理方式依次偶联上Z-Leu-OH、Z-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH以及Fmoc-Cys(Trt)-OH，每偶联一个氨基酸之后都要进行洗涤以及脱保护的过程。配制Z-Leu-OH、Z-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH以及Fmoc-Cys(Trt)-OH的活化液的浓度均是0.0762mmol/ml，溶剂乙酸乙酯均控制在250ml，得到14.7g的H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2，收率72.99％。
e.H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2的裂解过程
裂解条件为TFA：TIS:DODT:H2O＝92.5％：2.5％：2.5％：2.5％(v/v/v/v)，配制250ml裂解液，反应时间3h。反应结束后，加入乙醚至沉降出缩宫素粗肽，并抽滤，乙醚与裂解液的体积比为6:1。
f.缩宫素制备纯化的过程
色谱条件为，流动相分别选用A为0.1％v/v AcOH/H2O和B为0.1％v/vAcOH/MeCN，制备柱选用C18，20mmID×250mm，设置制备梯度为0min-5min-45min的时间对应B％含量为5％-10％-45％，B％含量的增长过程为线性增长。
g.二硫键的氧化的过程
将f中的纯化后的缩宫素九肽，进行二硫键的氧化，采用0.5％的双氧水室温进行二硫键的氧化反应。经过纯化制备冷冻干燥后得到缩宫素。所述粗肽经液相色谱进行制备纯化的色谱条件为：流动相分别选用A为0.1％v/v AcOH/H2O和B为0.1％v/vAcOH/MeCN，制备柱选用C18，20mmID×250mm，设置制备梯度为0min-5min-45min的时间对应B％含量为5％-10％-45％，B％含量的增长过程为线性增长。
本实施例缩宫素纯化后的液相谱图件图2，缩宫素的Mass谱图见图3。
本实施例缩宫素纯化后总收率42.6％，纯度98.62％。缩宫素的分子量MW＝1007，[MW+H]+＝1008，[MW+Na]+＝1029，[MW+K]+＝1045，[MW+2H]2+＝505，[MW+Na+H]2+＝515，[MW+K+H]2+＝523。
实施例2
a.Z-Gly-NHTag的制备过程
配制物料1：将Z-Gly-OH(2.085g，10.0mmol)、EDC.HCl(2.19g，11.4mmol)以及HOBt(1.55g，11.4mmol)溶于250ml乙酸乙酯中，Z-Pro-OH的浓度为0.08024mmol/ml；
配制物料2：将Tag-NH2(5g，9.51mmol)溶于250ml乙酸乙酯中，保护剂的浓度为0.0381mmol/ml。
物料1与物料2的进料流速通过计量泵来调节，流速相等为4ml/min。缩合反应在第一微结构反应器中进行，反应时间10min，温度30℃，得到Z-Gly-NHTag。
b.Z-Gly-NHTag洗涤的过程
物料3：10wt％Na2CO3水溶液。
物料3的进料流速为4ml/min，通过计量泵来调节，在第二微结构反应器中进行洗涤，洗涤10min，用分液漏斗在出料口接液，静置分层，用HPLC监测有机相是否洗涤除杂干净，若还有杂质可再洗涤一轮。
c.Z-Gly-NHTag脱Z保护的过程
将洗涤后的Z-Gly-NHTag(物料4)通过计量泵调节流速分别为10ml/min，氢气压力0.55Mpa，反应液完全流过加氢柱的时间由反应液的体积决定，HPLC监测，脱除Z得到H-Gly-NHTag(物料5)。
d.通过微通道模块化反应装置
类似于a～c处理方式依次偶联上Z-Leu-OH、Z-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH以及Fmoc-Cys(Trt)-OH，每偶联一个氨基酸之后都要进行洗涤以及脱保护的过程。配制Z-Leu-OH、Z-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH以及Fmoc-Cys(Trt)-OH的活化液的浓度均是0.0381mmol/ml，溶剂乙酸乙酯均控制在250ml，得到6.7g的H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2，收率66.53％。
e.H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2的裂解过程
裂解条件为TFA：TIS：巯基丙酸＝95％：2.5％：2.5％(v/v/v/v)，配制250ml裂解液，反应时间3h。反应结束后，加入乙醚至沉降出缩宫素粗肽，并抽滤，乙醚与裂解液的体积比为6:1。
f.缩宫素制备纯化的过程
色谱条件为，流动相分别选用A为0.1％v/v AcOH/H2O和B为0.1％v/vAcOH/
MeCN，制备柱选用C18，20mmID×250mm，设置制备梯度为0min-5min-45min的时间对应B％含量为5％-10％-45％，B％含量的增长过程为线性增长。
g.二硫键的氧化的过程
将f中的纯化后的缩宫素九肽，进行二硫键的氧化，采用点碘氧化室温进行二硫键的氧化反应。经过纯化制备冷冻干燥后得到缩宫素。所述粗肽经液相色谱进行制备纯化的色谱条件为：流动相分别选用A为0.1％v/v AcOH/H2O和B为0.1％v/vAcOH/MeCN，制备柱选用C18，20mmID×250mm，设置制备梯度为0min-5min-45min的时间对应B％含量为5％-10％-45％，B％含量的增长过程为线性增长。
本实施例缩宫素纯化后总收率40.28％％，纯度97.86％。缩宫素的分子量MW＝1007，[MW+H]+＝1008，[MW+Na]+＝1029，[MW+K]+＝1045，[MW+2H]2+＝505，[MW+Na+H]2+＝515，[MW+K+H]2+＝523。
本发明提供了一种利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (9)

1.一种利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将活化后的Z-Gly-OH、缩合试剂和有机溶剂三者形成的混合液，碳端保护基Tag-NH2与有机溶剂二者形成的混合液，分别同时泵入微通道模块化反应装置中的第一微结构反应器中进行氨基酸之间的缩合反应；然后将第一微结构反应器流出液，与碳酸钠水溶液分别同时泵入到微通道模块化反应装置中的第二微结构反应器中进行洗涤，洗涤后的流出液在静置分液装置中静置分层，保留有机层；随后将有机层泵入柱加氢设备进行脱Z保护的反应，保留柱加氢设备中流出的反应液I；
（2）将活化后的Z-Leu-OH替换步骤（1）中的Z-Gly-OH，将步骤（1）得到的反应液I替换步骤（1）中Tag-NH2与有机溶剂形成的混合液，进行步骤（1）相同的反应和处理过程，得到反应液II；
（3）将活化后的Z-Pro-OH替换步骤（1）中的Z-Gly-OH，将步骤（2）得到的反应液II替换步骤（1）中Tag-NH2与有机溶剂形成的混合液，进行步骤（1）相同的反应和处理过程，得到反应液III；
（4）将活化后的Fmoc-Cys(Trt)-OH替换步骤（1）中的Z-Gly-OH，将步骤（3）得到的反应液III替换步骤（1）中Tag-NH2与有机溶剂形成的混合液，进行步骤（1）相同的缩合反应、洗涤、静置分层，保留有机层；随后将有机层泵入脱保护设备进行脱Fmoc保护的反应，保留脱保护设备中流出的反应液，与稀盐酸水溶液分别同时泵入到微通道模块化反应装置中的第三微结构反应器中进行洗涤，洗涤后的流出液在静置分液装置中静置分层，保留有机层反应液IV；
（5）将活化后的Fmoc-Asn(Trt)-OH替换步骤（4）中的Fmoc-Cys(Trt)-OH，将得到的反应液IV替换步骤（4）中的反应液III，进行步骤（4）相同的反应和处理过程，得到反应液V；
（6）将活化后的Fmoc-Gln(Trt)-OH替换步骤（4）中的Fmoc-Cys(Trt)-OH，将得到的反应液V替换步骤（4）中的反应液III，进行步骤（4）相同的反应和处理过程，得到反应液VI；
（7）将活化后的Fmoc-Ile-OH替换步骤（4）中的Fmoc-Cys(Trt)-OH，将得到的反应液VI替换步骤（4）中的反应液III，进行步骤（4）相同的反应和处理过程，得到反应液VII；
（8）将活化后的Fmoc-Tyr(tBu)-OH替换步骤（4）中的Fmoc-Cys(Trt)-OH，将得到的反应液VII替换步骤（4）中的反应液III，进行步骤（4）相同的反应和处理过程，得到反应液VIII；
（9）将活化后的Fmoc-Cys(Trt)-OH替换步骤（4）中的Fmoc-Cys(Trt)-OH，将得到的反应液VIII替换步骤（4）中的反应液III，进行步骤（4）相同的反应和处理过程，得到H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NHTag；
（10）将步骤（9）得到的H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu
-Gly-NHTag进行裂解得到粗肽，并将粗肽经液相色谱进行纯化，得到缩宫素九肽H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2；
（11）将步骤（10）得到的缩宫素九肽H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2进行氧化合成二硫键，经纯化后冷冻干燥即得；
所述的碳端保护基Tag-NH2为三甲基氯硅烷或三异丙基氯硅烷。
2.根据权利要求1所述的利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法，其特征在于，各步骤中使用的有机溶剂相同，均选自乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯乙烷中的一种或几种的混合物；各步骤中使用的缩合试剂相同，均选自HOBt、DMAP、EDC·HCl、DIC、DCC、PyBop、CDI、HATU中的一种或几种的混合物；所述的碳酸钠水溶液的浓度为10wt%；所述的稀盐酸水溶液浓度为5wt%。
3.根据权利要求1所述的利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的Z-Gly-OH和缩合试剂的反应摩尔比为1:1.2；Z-Gly-OH与Tag-NH2的反应摩尔比控制为1:1.05，步骤（2）和步骤（3）中所采用的替换原料按照步骤（1）相同的摩尔比进行反应。
4.根据权利要求1所述的利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的Fmoc-Cys(Trt)-OH和缩合试剂的反应摩尔比为1:1.2；Fmoc-Cys(Trt)-OH与反应液III的摩尔比控制为1.1:1；步骤（5）~（9）中所采用的替换原料按照步骤（4）相同的摩尔比进行反应。
5.根据权利要求1所述的利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法，其特征在于，步骤（1）中，活化后的Z-Gly-OH、缩合试剂和有机溶剂三者形成的混合液泵入第一微结构反应器的流速，与Tag-NH2与有机溶剂二者形成的混合液泵入第一微结构反应器的流速相同，均为2~8ml/min；在第一微结构反应器中的反应温度为30~70℃，反应停留时间为1~15min；碳酸钠水溶液泵入第二微结构反应器的流速为2~8ml/min；有机层泵入柱加氢设备的流速是5~15ml/min；步骤（2）和步骤（3）采用步骤（1）相同的反应条件。
6.根据权利要求1所述的利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法，其特征在于，步骤（4）中，活化后的Fmoc-Cys(Trt)-OH、缩合试剂和有机溶剂三者形成的混合液泵入第一微结构反应器的流速，与反应液III泵入第一微结构反应器的流速相同，均为2~8ml/min；碳酸钠水溶液泵入第二微结构反应器的流速为2~8ml/min；有机层泵入脱保护设备中的流速为5~15ml/min；稀盐酸水溶液泵入到第三微结构反应器中的流速为2~8ml/min；第一微结构反应器中反应温度为30~70℃，反应停留时间为1~15min；第二微结构反应器中反应温度为30~70℃，反应停留时间为8~12min；第三微结构反应器中反应温度为30~70℃，反应停留时间为8~12min；步骤（5）~步骤（9）采用步骤（4）相同的反应条件。
7.根据权利要求1所述的利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法，其特征在于，各步骤中，活化后的Z-Gly-OH、活化后的Z-Leu-OH、活化后的Z-Pro-OH、活化后的Fmoc-Cys(Trt)-OH、活化后的Fmoc-Asn(Trt)-OH、活化后的Fmoc-Gln(Trt)-OH、活化后的Fmoc-Ile-OH、活化后的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、活化后Fmoc-Cys(Trt)-OH，是分别将Z-Gly-OH、Z-Leu-OH、Z-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH分别在有机溶剂中活化30min得到，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯乙烷中的任意一种或几种的混合物。
8.根据权利要求7所述的利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法，其特征在于，步骤（10）中，裂解条件依据Tag-NH2的选择而决定，Tag-NH2为CH3-Tag保护基时，裂解条件是TFA：TIS：巯基丙酸=95%：2.5%：2.5%；Tag为Si-Tag保护基时，裂解条件是TFA：DODT：TIS：H2O=92.5%：2.5%：2.5%：2.5%（v/v/v/v）；裂解结束后，加入乙醚沉降出缩宫素粗肽，乙醚与裂解液的体积比为6:1；
将粗肽经液相色谱进行纯化的色谱条件为：流动相分别选用A为0.1%v/v AcOH/H2O和B为0.1% v/vAcOH/MeCN，制备柱选用C18，20mmID×250mm，设置制备梯度为0min-5min-45min的时间对应B%含量为5%-10%-45%，B%含量的增长过程为线性增长。
9.根据权利要求1所述的利用微通道模块化反应装置合成缩宫素的方法，其特征在于，步骤（11）中，氧化合成二硫键采用0.5%的H2O2或者碘氧化进行二硫键的合成；纯化采用液相色谱进行纯化，色谱条件为：流动相分别选用A为0.1%v/v AcOH/H2O和B为0.1% v/vAcOH/MeCN，制备柱选用C18，20mmID×250mm，设置制备梯度为0min-5min-45min的时间对应B%含量5%-10%-45%，B%含量的增长过程为线性增长。
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