CN110078798B - 一种利用微通道模块化反应装置合成亮丙瑞林的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用微通道模块化反应装置合成亮丙瑞林的方法,其具体步骤如下:将活化的Z‑Pro‑OH和乙胺水溶液分别用计量泵通入第一微结构反应器反应,继而通过第二微结构反应器水洗萃取除杂,收集有机相得到Z‑Pro‑NHEt;将Z‑Pro‑NHEt用计量泵通入柱加氢设备,得到H‑Pro‑NHEt。重复以上操作,依肽序分别将剩余氨基酸接入,得到H‑Pyr‑His(Trt)‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Leu‑Leu‑Arg(Pg)‑Pro‑NHEt。最后脱除侧链保护基,经液相色谱纯化制备得到亮丙瑞林。该方法氨基酸原料、偶联试剂及有机溶剂消耗大大减少,成本大大降低,三废排放量少,工艺绿色环保,产率高,可适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域,具体涉及一种利用微通道模块化反应装置合成亮丙瑞林的方法。
背景技术
在肽化学的早期发展阶段,肽合成反应一般都是在液相中进行的。遗憾的是,液相合成多肽很费力,并且需要具备在选择保护基和缩合方法上的策略和战略以及解决溶解性问题等诸多方面的知识。固相多肽合成方法自1963年由Merrifield提出以来,由于合成方便、迅速,成为多肽合成的首选方法。多肽固相合成虽然操作简单、合成周期短,但是氨基酸、偶联试剂以及溶剂的消耗量大于液相合成。此外,固相合成反应为非均相体系,难于监测和分析反映进程,并受实验误差的干扰;增长中的肽链聚集现象增加了合成的难度。
连续流微通道反应是近年来发展起来的绿色有机合成方法。微反应器的两大特征即比表面积大及连续操作方式,使得我们对反应工艺的精确控制成为可能。相对于传统的间歇反应工艺,微反应器具有高速混合、高效传热、反应物停留时间窄、重复性好、几乎无放大效应、便于实时监测反应进程、在线化学品量少从而达到高安全性能等优势。目前,连续流微通道反应器在有机小分子的合成中取得了很多应用,但应用于多肽合成的案例还很少见。
亮丙瑞林最早是由日本武田公司研发生产,有很好的特异性,可用于治疗前列腺癌以及子宫膜异位症。2016年,四种瑞林类多肽药物的全球销售额达到34.27亿美元,亮丙瑞林独占其中的60%,销售额是20.65亿美元。2019年临床验证结果显示,亮丙瑞林对治疗肯尼迪病也有很好的疗效。其氨基酸序列结构为H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt,其结构式如式一所示。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种亮丙瑞林的连续流微通道反应方法,该方法原料和溶剂消耗少,成本低,操作方便,便于在线监测反应进程,可适合大规模生产。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种利用微通道模块化反应装置合成亮丙瑞林的方法,包括以下步骤:
(1)将活化后的Z-Pro-OH、缩合试剂和有机溶剂三者形成的混合液,与乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,分别同时泵入微通道模块化反应装置中的第一微结构反应器中进行氨基酸之间的缩合反应,30~70℃(优选30℃)下停留时间1~15min(优选10min);将第一微结构反应器流出液,与碳酸钠水溶液分别同时泵入到微通道模块化反应装置中的第二微结构反应器中进行洗涤,将缩合反应中多余的活化试剂以及氨基酸在这一步通过水洗的方式除去,30~70℃(优选70℃)下停留时间8~12min(优选10min),洗涤后的流出液在静置分液装置中静置分层,保留有机层;将有机层泵入柱加氢设备中进行脱Z保护的反应,30~50℃(优选40℃)下,氢气压力0.3Mpa~0.6Mpa(优选0.55MPa),用HPLC监测脱Z保护的程度,保留柱加氢设备中流出的反应液I;
(2)将活化后的Z-Arg(Pg)-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(1)得到的反应液I替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程(即反应时间,反应温度、物料比要求和步骤(1)相同),得到反应液II;
(3)将活化后的Z-Leu-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(2)得到的有反应液II替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程(即反应时间,反应温度、物料比要求和步骤(1)相同),得到反应液III;
(4)将活化后的Z-D-Leu-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(3)得到的反应液III替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程(即反应时间,反应温度、物料比要求和步骤(1)相同),得到反应液IV;
(5)将活化后的Z-Tyr(tBu)-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(4)得到的反应液IV替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程(即反应时间,反应温度、物料比要求和步骤(1)相同),得到反应液V;
(6)将活化后的Z-Ser(tBu)-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(5)得到的反应液V替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程(即反应时间,反应温度、物料比要求和步骤(1)相同),得到反应液VI;
(7)将活化后的Z-Trp(Boc)-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(6)得到的反应液VI替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程(即反应时间,反应温度、物料比要求和步骤(1)相同),得到反应液VII;
(8)将活化后的Z-His(Trt)-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(7)得到的反应液VII替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程(即反应时间,反应温度、物料比要求和步骤(1)相同),得到反应液VIII;
(9)将活化后的Z-Pyr-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(8)得到的反应液VIII替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程(即反应时间,反应温度、物料比要求和步骤(1)相同),得到H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pg)-Pro-NHEt;;
(10)将步骤(9)得到的带侧链保护的亮丙瑞林H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pg)-Pro-NHEt进行裂解得到粗肽,并将粗肽经液相色谱进行制备纯化,得到纯度99%的亮丙瑞林。
具体地,所述的微通道模块化反应装置包括第一原料储料罐、第二原料储料罐、第三原料储料罐、第四原料储料罐、第五原料储料罐、第一微结构反应器、第二微结构反应器、柱加氢设备、第一冷热一体机、第二冷热一体机、第一温度显示器、第二温度显示器、柱温箱以及静置分液装置;
其中,
第一原料储料罐和第二原料储料罐分别通过设置有计量泵的管道与第一微结构反应器串联,第一微结构反应器由第一冷热一体机控制温度并且由第一温度显示器显示温度;
第一微结构反应器出料口和第三原料储料罐分别通过管道与第二微结构反应器串联,第三原料储料罐与第二微结构反应器的连接管道上设置有计量泵,第二微结构反应器由第二冷热一体机控制温度并且由第二温度显示器显示温度;
第二微结构反应器出料口连接有静置分液装置,静置分液装置与第四原料储料罐相连;
第四原料储料罐通过设置有计量泵的管道柱加氢设备串联,温度通过柱温箱控制;
柱加氢设备出料口与第五原料储料罐相连;
反应物料和产物通过精确且低脉动的计量泵实现输入和输出。
第一微结构反应器持液量优选为80ml,第二微结构反应器持液量优选为120ml。
步骤(1)中,所述的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯乙烷中的任意一种或几种任意比例的混合物,优选乙酸乙酯;所述的缩合试剂为HOBt、DMAP、EDC·HCl、DIC、DCC、PyBop、CDI或HATU中的任意一种或几种的组合,优选的HOBt与EDC·HCl按摩尔比0.5-2:1的组合,最佳摩尔比为1:1;所述的碳酸钠水溶液,其碳酸钠浓度优选为10wt%。
步骤(1)中,Z-Pro-OH、缩合试剂的摩尔比优选为1:1.2;Z-Pro-OH与乙胺的摩尔比控制为1.2:1。
步骤(1)中,活化后的Z-Pro-OH、缩合试剂和有机溶剂形成的混合液泵入第一微结构反应器的流速,与乙胺水溶液和有机溶剂形成的混合液泵入第一微结构反应器的流速相同,分别为2~8ml/min;碳酸钠水溶液泵入第二微结构反应器的流速为2~8ml/min;反应液泵入柱加氢设备的流速是5~15ml/min。
其中,各步骤中所述的活化后的Z-Pro-OH、活化后的Z-Arg(Pg)-OH、活化后的Z-Leu-OH、活化后的Z-D-Leu-OH、活化后的Z-Tyr(tBu)-OH、活化后的Z-Ser(tBu)-OH、活化后的Z-Trp(Boc)-OH、活化后的Z-His(Trt)-OH、活化后Z-Pyr-OH,是将Z-Pro-OH、Z-Arg(Pg)-OH、Z-Leu-OH、Z-D-Leu-OH、Z-Tyr(tBu)-OH、Z-Ser(tBu)-OH、Z-Trp(Boc)-OH、Z-His(Trt)-OH、Z-Pyr-OH分别在有机溶剂中活化30min得到,所述的有机溶剂是乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯乙烷中的任意一种或几种任意比例的混合物,优选乙酸乙酯。
步骤(2)中,所述的Arg的胍基保护基可以是Pbf、Mbs、(Boc)2以及Mtr中的任意一种。
步骤(2)~(9)时,保证活化后的带保护基的单个氨基酸微过量即可,优选活化后的带保护基的单个氨基酸与反应液已缩合形成的肽链的摩尔比为1.2:1。
步骤(10)中,裂解条件依据Pg的选择而决定,Pg为Pbf以及Mbs保护基时,裂解条件是TFA/TIS/H2O=96%:2%:2%(v/v/v);Pg为(Boc)2以及Mtr保护基时,裂解条件是TFA/苯甲醚/苯甲硫醚/H2O=91%:3%:3%:3%(v/v/v/v);裂解结束后,加入乙醚沉降出亮丙瑞林粗肽,乙醚与裂解液的体积比为6比1。上述裂解方式皆为本领域技术人员公知的技术手段。
步骤(10)中,并将粗肽经液相色谱进行制备纯化,色谱条件为,流动相分别选用A为0.1%v/v AcOH/H2O和B为0.1%v/vAcOH/MeCN,制备柱选用C18,20mmID×250mm,设置制备梯度为0min-5min-45min的时间对应B%含量为5%-10%-45%,B%含量的增长过程为线性增长。
有益效果:
(1)本发明使传热、传质效率提高,缩短了偶联反应时间;
(2)本发明属于多肽液相合成在连续流中的应用,与传统固相相比氨基酸、偶联试剂以及溶剂的消耗量大大减少,降低了成本;
(3)本发明是采用连续流设备来进行多肽合成,通过调节流速、温度来提高偶联效率,操作简单,重复率高,适合于大规模生产;
(4)本发明是采用连续流设备来进行多肽合成,摒弃了传统的釜式反应,减少了生产所需的空间,得到的亮丙瑞林纯度达到99%。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明,本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为本发明实施例所用的微通道模块化反应装置合成亮丙瑞林的结构示意图。
图2为实施例1亮丙瑞林纯化后的液相谱图。
图3为实施例1亮丙瑞林的Mass谱图。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。
说明书附图所绘示的结构、比例、大小等,均仅用以配合说明书所揭示的内容,以供熟悉此技术的人士了解与阅读,并非用以限定本发明可实施的限定条件,故不具技术上的实质意义,任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整,在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下,均应仍落在本发明所揭示的技术内容所能涵盖的范围内。同时,本说明书中所引用的如“上”、“下”、“前”、“后”、“中间”等用语,亦仅为便于叙述的明了,而非用以限定本发明可实施的范围,其相对关系的改变或调整,在无实质变更技术内容下,当亦视为本发明可实施的范畴。
以下实施例所适用的微通道模块化反应装置如图1所示,包括第一原料储料罐、第二原料储料罐、第三原料储料罐、第四原料储料罐、第五原料储料罐、第一微结构反应器、第二微结构反应器、柱加氢设备、第一冷热一体机、第二冷热一体机、第一温度显示器、第二温度显示器、柱温箱以及静置分液装置;
其中,所述的微通道模块化反应装置包括第一原料储料罐、第二原料储料罐、第三原料储料罐、第四原料储料罐、第五原料储料罐、第一微结构反应器、第二微结构反应器、柱加氢设备、第一冷热一体机、第二冷热一体机、第一温度显示器、第二温度显示器、柱温箱以及静置分液装置;
其中,第一原料储料罐和第二原料储料罐分别通过设置有计量泵的管道与第一微结构反应器串联,第一微结构反应器由第一冷热一体机控制温度并且由第一温度显示器显示温度;
第一微结构反应器出料口和第三原料储料罐分别通过管道与第二微结构反应器串联,第三原料储料罐与第二微结构反应器的连接管道上设置有计量泵,第二微结构反应器由第二冷热一体机控制温度并且由第二温度显示器显示温度;
第二微结构反应器出料口连接有静置分液装置,静置分液装置与第四原料储料罐相连;
第四原料储料罐通过设置有计量泵的管道柱加氢设备串联,温度通过柱温箱控制;
柱加氢设备出料口与第五原料储料罐相连;
反应物料和产物通过精确且低脉动的计量泵实现输入和输出。
其中,物料1、物料2、物料3、物料4以及物料5分别对应第一原料储料罐、第二原料储料罐、第三原料储料罐、第四原料储料罐以及第五原料储料罐。
第一微结构反应器持液量80ml,第二微结构反应器持液量120ml。
微反应器型号SiliconCarbideMicroreactor,购自于山东金德新材料有限公司。
柱加氢设备是规格20mm ID*250mm的空心制备柱填入16g5%钯碳,并在制备柱中注入氢气。
冷热一体机型号VCO-HL30,购自于昆山纬亿塑胶机械有限公司。
柱温箱型号G1316A,购自于安捷伦有限公司。
泵的型号MP2002C,购自于上海三为科学仪器有限公司。
温度显示器与微反应器一同购自与山东金德新材料有限公司。
本发明采用的部分缩略语相对应的化学名称如下:
Z:苄氧羰基
Pro:脯氨酸
Arg:精氨酸
Pg:保护基
Boc:叔丁氧碳基
Leu:亮氨酸
D-Leu:D构型亮氨酸
Tyr:酪氨酸
tBu:叔丁基
Na2CO3:碳酸钠
HPLC:高效液相色谱
Ser:丝氨酸
Trp:色氨酸
His:组氨酸
Trt:三苯甲基
Pyr:焦谷氨酸
DMF:N,N-二甲基甲酰胺
EDC.HCl:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐
DIC:N,N’-二异丙基碳二亚胺
DCC:N,N’-二环己基碳二亚胺
PyBop:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
CDI:N,N'-羰基二咪唑
HATU:2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐
Pbf:2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃
Mbs:对甲氧苯磺基
Mtr:2,3,6-三甲基-4-甲氧苯磺酰基
TFA:三氟乙酸
TIS:三异丙基硅烷
H2O:水
AcOH:醋酸
MeCN:乙腈
DMAP:4-二甲氨基吡啶。
实施例1
a.Z-Pro-NHEt的制备过程
配制物料1:将Z-Pro-OH(5g,20.06mmol)、EDC.HCl(4.61g,24.07mmol)以及HOBt(3.25g,24.07mmol)溶于250ml乙酸乙酯中,Z-Pro-OH的浓度为0.08024mmol/ml;
配制物料2:将乙胺水溶液65%~70%(1.158g,16.72mmol)溶于250ml乙酸乙酯中,乙胺的浓度为0.06688mmol/ml。物料1与物料2的进料流速通过计量泵来调节,流速相等为4ml/min。缩合反应在第一微结构反应器中进行,反应时间10min,温度30℃,得到Z-Pro-NHEt。
b.Z-Pro-NHEt洗涤的过程
物料3:10wt%Na2CO3水溶液。
物料3的进料流速为4ml/min,通过计量泵来调节,在第二微结构反应器中进行洗涤,洗涤10min,用分液漏斗在出料口接液,静置分层,用HPLC监测有机相是否洗涤除杂干净,若还有杂质可再洗涤一轮。
c.Z-Pro-NHEt脱Z保护的过程
将洗涤后的Z-Pro-NHEt(物料4)通过计量泵调节流速分别为10ml/min,氢气压力0.55Mpa,反应液完全流过加氢柱的时间由反应液的体积决定,HPLC监测,脱除Z得到H-Pro-NHEt(物料5)。
d.通过微通道模块化反应装置
类似于a~c处理方式依次偶联上Z-Arg(Boc)2-OH、Z-Leu-OH、Z-D-Leu-OH、Z-Tyr(tBu)-OH、Z-Ser(tBu)-OH、Z-Trp(Boc)-OH、Z-His(Trt)-OH以及Z-Pyr-OH,每偶联一个氨基酸之后都要进行洗涤以及脱保护的过程。配制Z-Arg(Boc)2-OH、Z-Leu-OH、Z-D-Leu-OH、Z-Tyr(tBu)-OH、Z-Ser(tBu)-OH、Z-Trp(Boc)-OH、Z-His(Trt)-OH以及Z-Pyr-OH的活化液的浓度均是0.08024mmol/ml,溶剂乙酸乙酯均控制在250ml,得到23.8g的H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Boc)2-Pro-NHEt,收率76.8%。
e.H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Boc)2-Pro-NHEt的裂解过程
裂解条件为TFA/苯甲醚/苯甲硫醚/H2O=91%:3%:3%:3%(v/v/v/v),配制250ml裂解液,反应时间3h。反应结束后,加入乙醚至沉降出亮丙瑞林粗肽,并抽滤,乙醚与裂解液的体积比为6比1。
f.亮丙瑞林制备纯化的过程
色谱条件为,流动相分别选用A为0.1%v/v AcOH/H2O和B为0.1%v/vAcOH/MeCN,制备柱选用C18,20mmID×250mm,设置制备梯度为0min-5min-45min的时间对应B%含量为5%-10%-45%,B%含量的增长过程为线性增长。本实施例亮丙瑞林纯化后的液相谱图件图2,亮丙瑞林的Mass谱图见图3。
本实施例亮丙瑞林纯化后总收率48.1%,纯度99%。亮丙瑞林的分子量MW=1208,[MW+H]+=1209,[MW+Na]+=1231,[MW+K]+=1247,[MW+2H]2+=605,[MW+Na+H]2+=616,[MW+K+H]2+=624。
实施例2
a.Z-Pro-NHEt的制备过程
配制物料1:将Z-Pro-OH(3g,12mmol)、EDC.HCl(2.76g,14.4mmol)以及HOBt(1.95g,14.4mmol)溶于250ml乙酸乙酯中,Z-Pro-OH的浓度为0.048mmol/ml;
配制物料2:将乙胺水溶液65%~70%(0.692g,10mmol)溶于250ml乙酸乙酯中,乙胺的浓度为0.04mmol/ml。物料1与物料2的进料流速通过计量泵来调节,流速相等为4ml/min。缩合反应在第一微结构反应器中进行,反应时间10min,温度30℃,得到Z-Pro-NHEt。
b.Z-Pro-NHEt洗涤的过程
物料3:10wt%Na2CO3水溶液。
物料3的进料流速为4ml/min,通过计量泵来调节,在第二微结构反应器中进行洗涤,洗涤10min,用分液漏斗在出料口接液,静置分层,用HPLC监测有机相是否洗涤除杂干净,若还有杂质可再洗涤一轮。
c.Z-Pro-NHEt脱Z保护的过程
将洗涤后的Z-Pro-NHEt(物料4)通过计量泵调节流速分别为10ml/min,氢气压力0.55Mpa,反应液完全流过加氢柱的时间由反应液的体积决定,HPLC监测,脱除Z得到H-ProNHEt(物料5)。
d.通过微通道模块化反应装置
类似于a~c处理方式依次偶联上Z-Arg(Pbf)-OH、Z-Leu-OH、Z-D-Leu-OH、Z-Tyr(tBu)-OH、Z-Ser(tBu)-OH、Z-Trp(Boc)-OH、Z-His(Trt)-OH以及Z-Pyr-OH,每偶联一个氨基酸之后都要进行洗涤以及脱保护的过程。配制Z-Arg(Boc)2-OH、Z-Leu-OH、Z-D-Leu-OH、Z-Tyr(tBu)-OH、Z-Ser(tBu)-OH、Z-Trp(Boc)-OH、Z-His(Trt)-OH以及Z-Pyr-OH的活化液的浓度均是0.048mmol/ml,溶剂乙酸乙酯均控制在250ml,得到10.8g的H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-NHEt,收率68.8%。
e.H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-NHEt的裂解过程
裂解条件为TFA/TIS/H2O=96%:2%:2%(v/v/v),配制110ml的裂解液,反应时间3h。反应结束后,加入乙醚沉降出亮丙瑞林粗肽并抽滤,乙醚与裂解液的体积比为6比1。
f.亮丙瑞林制备纯化的过程
色谱条件为,流动相分别选用A为0.1%v/v AcOH/H2O和B为0.1%v/vAcOH/MeCN,制备柱选用C18,20mmID×250mm,设置制备梯度为0min-5min-45min的时间对应B%含量为5%-10%-45%,B%含量的增长过程为线性增长。
本实施例亮丙瑞林纯化后总收率40.7%,纯度99%。亮丙瑞林的分子量MW=1208,[MW+H]+=1209,[MW+Na]+=1231,[MW+K]+=1247,[MW+2H]2+=605,[MW+Na+H]2+=616,[MW+K+H]2+=624。
本发明提供了一种利用微通道模块化反应装置合成亮丙瑞林的方法的思路及方法,具体实现该技术方案的方法和途径很多,以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (4)
1.一种利用微通道模块化反应装置合成亮丙瑞林的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将活化后的Z-Pro-OH、缩合试剂和有机溶剂三者形成的混合液,与乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,分别同时泵入微通道模块化反应装置中的第一微结构反应器中进行氨基酸之间的缩合反应,30~70°C下停留时间1~15min;将第一微结构反应器流出液,与碳酸钠水溶液分别同时泵入到微通道模块化反应装置中的第二微结构反应器中进行洗涤,30~70°C下停留时间8~12min,洗涤后的流出液在静置分液装置中静置分层,保留有机层;将有机层泵入柱加氢设备进行脱Z保护的反应,30~50°C下,氢气压力0.3Mpa~0.6Mpa,保留柱加氢设备中流出的反应液I;
(2)将活化后的Z-Arg(Pg)-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(1)得到的反应液I替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程,得到反应液II;
(3)将活化后的Z-Leu-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(2)得到的反应液II替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程,得到反应液III;
(4)将活化后的Z-D-Leu-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(3)得到的反应液III替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程,得到反应液IV;
(5)将活化后的Z-Tyr(tBu)-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(4)得到的反应液IV替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程,得到反应液V;
(6)将活化后的Z-Ser(tBu)-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(5)得到的反应液V替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程,得到反应液VI;
(7)将活化后的Z-Trp(Boc)-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(6)得到的反应液VI替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程,得到反应液VII;
(8)将活化后的Z-His(Trt)-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(7)得到的反应液VII替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程,得到反应液VIII;
(9)将活化后的Z-Pyr-OH替换步骤(1)中的Z-Pro-OH,将步骤(8)得到的反应液VIII替换步骤(1)中所述的乙胺水溶液和有机溶剂二者形成的混合液,进行步骤(1)相同的反应和处理过程,得到H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pg)-Pro-NHEt;
(10)将步骤(9)得到的带侧链保护的亮丙瑞林H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pg)-Pro-NHEt进行裂解得到粗肽,并将粗肽经液相色谱进行制备纯化,得到亮丙瑞林;
所述的活化后的Z-Pro-OH、活化后的Z-Arg(Pg)-OH、活化后的Z-Leu-OH、活化后的Z-D-Leu-OH、活化后的Z-Tyr(tBu)-OH、活化后的Z-Ser(tBu)-OH、活化后的Z-Trp(Boc)-OH、活化后的Z-His(Trt)-OH、活化后Z-Pyr-OH,是将Z-Pro-OH、Z-Arg(Boc)2-OH、Z-Leu-OH、Z-D-Leu-OH、Z-Tyr(tBu)-OH、Z-Ser(tBu)-OH、Z-Trp(Boc)-OH、Z-His(Trt)-OH、Z-Pyr-OH分别在有机溶剂中活化30min得到;上述步骤中采用的有机溶剂相同,均选自乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯乙烷中的任意一种;所述的缩合试剂为HOBt、DMAP、EDC·HCl、DIC、DCC、PyBop、CDI或HATU中的任意一种或几种的组合;所述的碳酸钠水溶液,其碳酸钠浓度为10wt%;
具体地,步骤(1)中,Z-Pro-OH、缩合试剂的摩尔比为1:1.2;Z-Pro-OH与乙胺的摩尔比控制为1.2:1;
步骤(2)中,Arg的胍基保护基Pg是Pbf、Mbs、(Boc)2以及Mtr中的任意一种;裂解条件依据Pg的选择而决定,Pg为Pbf以及Mbs保护基时,裂解条件是TFA/TIS/H2O=96%:2%:2%(v/v/v);Pg为(Boc)2以及Mtr保护基时,裂解条件是TFA/苯甲醚/苯甲硫醚/H2O=91%:3%:3%:3%(v/v/v/v);裂解结束后,加入乙醚沉降出亮丙瑞林粗肽,乙醚与裂解液的体积比为6比1。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的微通道模块化反应装置包括第一原料储料罐、第二原料储料罐、第三原料储料罐、第四原料储料罐、第五原料储料罐、第一微结构反应器、第二微结构反应器、柱加氢设备、第一冷热一体机、第二冷热一体机、第一温度显示器、第二温度显示器、柱温箱以及静置分液装置;
其中,
第一原料储料罐和第二原料储料罐分别通过设置有计量泵的管道与第一微结构反应器串联,第一微结构反应器由第一冷热一体机控制温度并且由第一温度显示器显示温度;
第一微结构反应器出料口和第三原料储料罐分别通过管道与第二微结构反应器串联,第三原料储料罐与第二微结构反应器的连接管道上设置有计量泵,第二微结构反应器由第二冷热一体机控制温度并且由第二温度显示器显示温度;
第二微结构反应器出料口连接有静置分液装置,静置分液装置与第四原料储料罐相连;
第四原料储料罐通过设置有计量泵的管道与柱加氢设备串联,温度通过柱温箱控制,氢气压力通过减压阀控制;
柱加氢设备出料口与第五原料储料罐相连;
反应物料和产物通过精确且低脉动的计量泵实现输入和输出。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,活化后的Z-Pro-OH与缩合试剂和有机溶剂形成的混合液泵入第一微结构反应器的流速,与乙胺水溶液和有机溶剂形成的混合液泵入第一微结构反应器的流速相同,分别为2~8ml/min;碳酸钠水溶液泵入第二微结构反应器的流速为2~8ml/min;反应液泵入柱加氢设备的流速是5~15ml/min。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(10)中,所述粗肽经液相色谱进行制备纯化的色谱条件为:流动相分别选用A为0.1%v/v AcOH/H2O和B为0.1% v/vAcOH/MeCN,制备柱选用C18,20mmID×250mm,设置制备梯度为0min-5min-45min的时间对应B%含量为5%-10%-45%,B%含量的增长过程为线性增长。
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