CN103665115A - 环十肽化合物gg-110824的化学制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药学领域，涉及环十肽化合物GG-110824的化学制备方法。所述环十肽化合物GG-110824由十个α-L-氨基酸首尾顺次连接而成，其具有式（Ⅰ）的结构，表示为cyclo（Gly-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Pro-Ile-Gly-Leu）。本发明中所述GG-110824的制备方法为，以Wang树脂为固相载体、HATU/HOAt为缩合剂、N，N-二甲基甲酰胺为溶剂的固相合成直链肽前体与液相合环的化学制备方法；所述GG-110824由反应产物通过色谱分离得到，制备产物结构通过单晶X-射线衍射进行确证。本制备方法的步骤简单、产率高，具有很高的实用价值。

Description

环十肽化合物GG-110824的化学制备方法

技术领域

本发明属于化学领域，涉及肽类化合物GG-110824的化学制备方法，具体涉及环十肽化合物GG-110824的化学制备方法。

背景技术

现有技术公开了经典结构的环肽类化合物是由氨基酸构成的肽链通过酰胺键首尾连接而成，并常用于制备药物。在组成结构上，环肽类成分与普通(直链)肽类具有结构的高度相似性，但环肽类化合物因其主体结构中氨基酸残基连接成环，与直链肽结构不同，以致药物性质不同：首先，环肽类化合物分子中的游离羧基和氨基等亲水基团消失，使得其水溶性大大减小，在溶剂中的极性降低，化合物的脂溶性增强；第二，游离氨基和羧基的消失，使得该类环肽化合物对体内氨肽酶和羧肽酶的敏感性明显降低，在生物体内的稳定性增加；第三，直链肽成环后，减少了肽链运动的自由度，因而环状多肽在溶液中具有相对稳定和明确的构象，与受体契合的可能性明显提高。通常，环肽的代谢稳定性和生物利用度高于直链，因此，环肽类化合物作为药物，与直链肽和其他有机小分子药物相比具有其结构和性质的独特性。

现有技术中，环肽合成的第一步是合成直链肽前体。目前链状肽的合成方法主要有固相和液相两种肽合成方法，其中，液相方法在每步缩合反应后均需对产品进行纯化和鉴定以获得高纯度的目标产物，但要消耗大量的劳动力和时间来换取该种优势；固相肽合成(Solid PhasePeptide Synthesis，SPPS)则是近几十年来迅猛发展的一种方法。1963年，美国化学家Merrifield教授就已经在肽合成史上第一次利用固相合成方法合成了四肽化合物（Leu-Ala-Gly-Val），此后，由于固相肽合成技术独特的优势，大量具有重要生物活性的多肽、激素及蛋白质被陆续合成，大大促进了生命科学研究的深入发展。

目前，固相法已成为实验室多肽合成的首选方法，其基本原理如下：用保护基保护氨基酸的氨基端后，将保护氨基酸连接到固态树脂上，脱去保护基，再将下一个保护氨基酸与第一个氨基酸残基的游离氨基形成肽键，最后脱去保护而再连接下一个氨基酸，如此循环使肽链不断延长直到完成，再用切割试剂将肽链从树脂上分离下来。基于上述原理，使得SPPS具有以下优势使其成为越来越广泛的肽合成方法：（1）不溶性载体键合的聚合物只要通过简单的反复过滤-淋洗-再过滤即可从可溶性的杂质中分离出来，完全免除了传统液相直链合成中的重结晶、蒸馏、萃取、柱层析或者薄层层析等繁重复杂的纯化方法；此外，所有反应可在一个容器中进行，因而避免了反应中间体转移的手续和损失，且所有的操作包括聚合链的增长可实现自动化；（2）反应物料及试剂可大大过量，以促使反应完全，从而获得接近100%的高转化率；（3）SPPS依靠固相载体对分子的固定作用和对反应底物一端功能基的保护避免了反应底物分子之间的成键，并可确保含多功能基的分子只发生单一功能基反应。

目前，直链肽的合成已趋自动化和商业化，但环状肽的合成还存在着一定的难度，问题在于直链肽的合环这一关键步聚。所述环状肽的合环方式分为首尾相连、侧链之间相连、侧链与端基相连，二硫桥键相连或其他方式相连；其中，肽链首尾相连成环的合成难度更大，因为环肽的前体直链肽的肽键具有很强的p键特征，分子更倾向于形成反式构象，呈舒展状态，造成首尾成环的羧基和氨基在空间上距离较远，不利于发生分子内的肽键缩合，更有利于分子间的缩合反应，环肽合成中产率低成为制约因素；另一方面，由于每一个肽链的氨基酸残基不同，或顺序不同，使得每一个环肽合环条件都具有其特殊性，因此，对于有活性的环肽化合物，尚不能用商业化或自动化方法方便地得到，且首尾相连的环状肽的合成还存在有一定的挑战性。

目前，合成首尾相连的环肽的经典方法是在稀溶液（10-3-10-4M）中，用活泼酯法或叠氮法将带有保护基的的线性前体肽选择性地活化并合环；使用DCC、DMAP等通用有机缩合剂，产率通常为10-30%，且反应时间通常为几天，产物的立体结构不容易得到保证，目标产物往往失去天然化合物所具有的生物活性。

近年氮杂苯骈唑类包括HATU、TBTU和HBTU等化合物新型有机缩合剂的使用，为肽合成方法的研究提供了很大的帮助；但迄今为止，尚未见有关环十肽化合物GG-110824的化学制备方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供环十肽化合物GG-110824的化学制备方法。

本发明中，所述的环十肽化合物GG-110824为环状肽，由十个α-L-氨基酸首尾顺次连接而成，肽链顺序为：环-(Gly-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Pro-Ile-Gly-Leu)；其中，所述氨基酸为甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、脯氨酸(Pro)、异亮氨酸(Ile)；

其结构分子式为C₄₅H₇₈N₁₀O₁₀，分子量为974，具有式（Ⅰ）的结构，

式（Ⅰ）；

本发明提供了环十肽化合物GG-110824的化学制备方法，其包括固相合成直链肽、液相合环、固相柱色谱分离和重结晶四部分，步骤为，由Wang树脂以Fomc保护的氨基酸为料固相化学合成方法制备直链肽，由直链肽首尾相连合环，制成单环肽化合物；其中，所述直链肽的合环，在HOAt/HATU和NMM(氮甲基吗琳)存在下于溶液中完成。

具体而言，本发明的环十肽化合物GG-110824的化学制备方法，其特征在于，其包括步骤：

（1）以Wang树脂为固相载体，HATU/HOAt为缩合剂，氮甲基吗啉作为碱，N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，按氨基酸顺序依次实现酰胺键的构建，固相合成直链肽前体；然后以HATU/HOAt为缩合剂，氮甲基吗啉作碱，在N，N-二甲基甲酰胺为溶剂的高稀释溶液中实现液相合环，制得环十肽化合物GG-110824；

（2）所得GG-110824产物用柱色谱技术进行分离，色谱条件为：硅胶正相柱色谱分离与多次LH-20凝胶柱色谱分离；

所述GG-110824纯化产物用高效液相色谱仪器检测，洗脱条件：A：B=70%：30%，其中A为含1‰TFA的MeOH；B为含1‰TFA的H₂O；产物分子量为974，分子式为cyclo-(Gly-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Pro-Ile-Gly-Leu)。

(3)本发明中，进行了环十肽化合物GG-110824X-射线单晶衍射确证结构：

纯化后的GG-110824以色谱纯甲醇为溶剂培养单晶，用X-射线衍射仪进行单晶衍射确定结构；

所述GG-110824晶体呈无色透明块状，衍射实验用晶体大小为0.15×0.18×0.27mm，属单斜晶系，空间群为P21，晶胞参数：a=11.4966(2)，b=18.52866(2)，

α=γ=90.00°,β=95.03(3)°，晶胞体积

晶胞内不对称单位数Z=2；

采用Bruker SMART APEX-II衍射仪收集衍射强度数据，CuKα辐射，石墨单色器，单导管直径ф=0.50mm，晶体与CCD探测器距离d=60.3mm，管压40kV，管流30mA，扫描方式：ω扫描，收集总衍射点数为26100个，独立衍射点数为9572个，观察点数(F|2≥2σ|F|2)为9312个；

采用直接法(Shelxs97)解析晶体结构，获得全部70个非氢原子位置，使用最小二乘法修正结构参数和判别原子种类，用几何计算法和差值Fourier法获得全部氢原子位置，最终可靠因子为R₁=0.0590，wR₂=0.1668(w=1/σ|F|2)，S=1.053；确定1个不对称单位内化学计量式为C₄₉H₈₆N₁₀O₁₀·H₂O，计算分子量为992，计算晶体密度1.161g/cm³；该晶体结构为环十肽化合物GG-110824(分子量为974)含一个分子的结晶水(分子量为18)。

本发明的制备方法克服了现有技术的制备方法中反应时间长、产物的立体结构不易得到保证、目标产物往往失去天然化合物具有的生物活性等缺陷，具有制备步骤简单、产率高的优点，有很高的实用价值。

附图说明

图1为化合物GG-110824单晶衍射图。

图2为化合物GG-110824的高效液相检测色谱图。

具体实施方式

实施例1化学制备GG-110824

化学制备方法包括固相合成直链肽、液相合环、固相柱色谱分离和重结晶；

1、合成GG-110824直链前体

(1)取树脂：称取一定量Fmoc-Gly-Wang树脂，在DMF中溶胀两小时；

(2)脱除Fmoc保护基：在20%的piperidine/DMF溶液中氮气搅拌反应30min；再依次用等体积DMF反复洗涤5次，每次3min；

(3)茚三酮检测：取微量反应后树脂于试管中，加入2滴1%（体积分数,下同）的茚三酮/乙醇溶液，加热2-3分钟；树脂呈蓝紫色或紫红色，则表示脱保护成功，进行下步反应；若树脂不变色，则表示脱保护未成功，重复上述反应步骤（1）直到树脂显蓝紫或紫红色；

(4)形成肽键：向树脂中加入2倍量Fmoc-氨基酸、2倍量HOAt、2倍量HATU、10倍量NMM，在2倍总体积量DMF中搅拌2小时；缩合反应完成后反复用等体积DMF洗涤5次；接入的氨基酸依次为：Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH；

(5)茚三酮检测：方法同步骤(3)；若树脂褪去蓝紫色或紫红色，则表示缩合反应完全，可进行下一步反应；若树脂仍呈蓝紫色或紫红色，则表示仍然有未保护的氨基存在，即缩合未完全，须重复上述步骤(2)直到树脂褪去蓝紫色或紫红色；

(6)重复步骤(2)、(3)、(4)直至肽链完成；

(7)再重复一次步骤(2)、(3)，得到载有脱保护的直链肽的树脂；

(8)直链肽脱树脂:将洗涤干净的树脂再用乙醚洗涤3次，放置，使乙醚挥发完全；将接有直链肽的树脂在三氟乙酸/水/苯酚(40：4：1，体积比，10mL/g resin)中搅拌2小时；将树脂用过滤，并用上述混合溶剂洗涤3次，合并、收集滤液；

(9)将滤液置于离心管中，加入过量乙醚，搅拌后离心，弃上清液，保留沉淀，如此反复操作3次，将沉淀部分静置使乙醚挥发，即得直链肽粗品；

2、液相合环

将直链肽粗品用DMF稀释至10^-3mmol/mL，置于冰浴中充分溶解后加入3倍量HOAt、3倍量HATU、10倍量NMM，继续冰浴搅拌2小时，撤去冰浴，继续常温下搅拌48小时，减压蒸馏后得固体残余物；

3、柱色谱分离

将合环得到的固体残余物以300～400目硅胶为固定相，氯仿/甲醇(95:5)为流动相条件下进行柱色谱分离，将含有环肽的流分合并蒸干；将上述合并物经反复多次凝胶柱色谱分离，即得GG-110824纯净物；

4、重结晶

将所述GG-110824以少量甲醇充分溶解后静置数日，即得到GG-110824晶体。

Claims (5)

1.环十肽化合物GG-110824的化学制备方法，其特征在于，包括固相合成直链肽、液相合环、固相柱色谱分离和重结晶，步骤为，

（1）以Wang树脂为固相载体，HATU/HOAt为缩合剂，氮甲基吗啉作为碱，N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，按照氨基酸顺序依次实现酰胺键的构建，即固相合成直链肽前体；然后以HATU/HOAt为缩合剂，氮甲基吗啉作碱，在N，N-二甲基甲酰胺为溶剂的高稀释溶液中实现液相合环，制得环十肽化合物GG-110824；

（2）所述GG-110824产物采用柱色谱技术进行分离，色谱条件为：硅胶正相柱色谱分离与多次LH-20凝胶柱色谱分离；

所述GG-110824纯化产物用高效液相色谱仪器检测，洗脱条件：A：B=70%：30%，其中A为含1‰TFA的MeOH；B为含1‰TFA的H₂O；产物分子量为974，分子式为cyclo-(Gly-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Pro-Ile-Gly-Leu)。

2.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的环十肽化合物GG-110824为环状肽，结构分子式为C₄₅H₇₈N₁₀O₁₀，分子量为974，其具有式（Ⅰ）的结构，

式（Ⅰ）。

3.按权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述环十肽化合物GG-110824由十个α-L-氨基酸首尾顺次连接而成，肽链顺序为：环-(Gly-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Pro-Ile-Gly-Leu)。

4.按权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述α-L-氨基酸为甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸。

5.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述直链肽的合环，在HOAt/HATU和氮甲基吗琳存在下于溶液中完成。