CN109400681A - 环肽gg-8-6及其合成方法和在制备治疗肝癌药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属化学和医药技术领域，涉及新的环九肽化合物GG‑8‑6及其在制备抗肝癌药物中的应用。本发明涉及的化合物GG‑8‑6结构式如式(I)所示，经体外细胞毒活性测试和体内动物实验验证，GG‑8‑6具有抗肝癌作用，可进一步制备抗肝癌药物。

Description

环肽GG-8-6及其合成方法和在制备治疗肝癌药物中的用途

技术领域

本发明属化学和医药技术领域，涉及环肽GG-8-6及其合成方法和在制备抗肝癌药物中的应用。

背景技术

据资料显示，近年来癌症发病率呈上升趋势，已成为严重威胁人类生命和健康的多发病和常见病。在全球范围内，肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第六大常见癌症，是导致癌症死亡的第二大病因。在中国，肝癌的死亡率仅次于肺癌，具有病死率高、预后差的特点。临床实践显示，肿瘤细胞对多种化疗药物产生的交叉耐药性造成了肝癌化疗失败的主要障碍，因此，开发新型抗肿瘤化合物具有重要意义。

多肽作为药物与大多数小分子药物相比，具有高亲和性、高靶向性、低毒性的特点；而与化疗抗体相比，由于体积小，它们具有良好的组织渗透性因此相对于传统化疗药物具有非遗传毒性，基因型特异性，辅助治疗等优势。目前，已发现的一系列新型天然抗肿瘤多肽，具有良好的抗肿瘤活性，如，可诱导肿瘤细胞坏死的蜂毒肽，诱导肿瘤细胞凋亡的牛乳铁蛋白肽、阻断癌细胞功能的缓激肽、具有免疫调节作用的胞壁酰二肽(MDP)等，其中，诱导肿瘤凋亡的多肽化合物是抗肿瘤治疗剂的主要候选分子。

然而，研究显示，多肽在体内不稳定，易酶解，半衰期短，使得在临床上的应用受阻。因此提高多肽在体内的稳定性，减少和改善生物降解，增加药物与受体的选择性和亲和力，将为有价值的药物。环肽，是线型肽的环合形式，结构中不存在游离的氨基和羧基，使得它们对体内氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低，同时，环状多肽在溶液中具有相对稳定和明确的构象，与受体契合的可能性更大。另有研究表明，环肽的代谢稳定性和生物利用度高于直链肽，因此，环肽作为药物，具有相对于线型肽稳定性更好，抗酶解能力更强，与受体结合的空间三维结构更易识别等药效学和药代动力学优势，如三肽RGD的环合形式西仑吉肽，显示出与非环肽相比更高的抗癌活性，目前已完成临床试验。此外，还有天然来源的环肽类化合物放线菌素以及合成的Exherin(Adh-1)等抗肿瘤活性环肽。值得关注的是，目前一些天然环肽如Dendroamide A和Hapalosin还发现具有抗多药耐药肿瘤细胞活性。因此，研究开发环肽化合物作为抗肿瘤药物具有很大实用价值。

本申请的前期研究以植物中分离到肿瘤细胞毒活性环肽化合物哥纳香乙素(Goniocyclocin B)为先导化合物，化学合成了与哥纳香乙素环肽具有氨基酸组成相同但连接顺序不同的系列环肽化合物，其制备方法申请了中国发明专利(201410050535.X)；抗肿瘤体外实验研究上述环肽化合物对肝癌SMMC-7721细胞IC₅₀为5.53±0.36μM，与先导化合物活性相当。

基于现有技术的基础，本申请的发明人拟提供新的环肽GG-8-6及其合成方法和在制备抗肝癌药物中的应用。

与本发明相关的现有技术有，

[1]Bernard W.Stewart and Christopher P.Wild.World Cancer Report 2014[R].France：International Agency for Research on Cancer，2014：28.

[2]国家癌症中心.中国肿瘤登记工作报告2014[R].中国：卫生计生委疾病预防控制局，2014：15.

[3]Mader JS，and Hoskin DW.2006.Cationic antimicrobial peptides asnovel cytotoxic agents for cancer treatment.Expert Opin Investig Drugs 15，933-946.

[4]Rüegg C，et al.2006.Antiangiogenic peptides and proteins：fromexperimental tools to clinical drugs.Biochim Biophys Acta 1765，155-177.

[5]Janin YL.2003.Peptides with anticancer use or potential.AminoAcids 25，1-40.

[6]Kaplan N，et al.2007.Novel families of toxin-like peptides ininsects and mammals：a computational approach.J Mol Biol 369，553-566.

[7]Sujit KB and Tapas KM.2008.Targeting tumors with peptides fromnatural sources[J].Trends in Biotechnology 26(4)：210-217.

[8]Sharma SV.1993.Melittin-induced hyperactivation of phospholipaseA2 activity and calciuminflux in ras-transformed cells.Oncogene 8，939-947.

[9]Mader JS，et al.2007.Bovine lactoferricin causes apoptosis inJurkat T-leukemia cells by sequential permeabilization of the cell membraneand targeting of mitochondria.Exp Cell Res 313，2634-2650.

[10]Stewart JM，et al.2005.Combination cancer chemotherapy with onecompound：pluripotent bradykinin antagonists.Peptides 26，1288-1291.

[11]Kotani S，et al.1983.Muramyl dipeptides：prospect for cancertreatments and immunostimulation.Adv Exp Med Biol 166，117-158.

[12]Bhutia SK and Maiti TK.2008.Targeting tumors with peptides fromnatural sources.Trends in Biotechnology 26(4)：210-216.

[13]Saviano G，Benedetti E，Cozzolino R，et al.2004.Influence ofconformational flexibility on biological activity in cyclic astin analogues，JPept Sci 76(6)：477-484.

[14]Gutierrez-Rodriguez M，Martin-Martinez M，Garcia-Lopez MT，etal.2004.Synthesis，Conformational Analysis，and Cytotoxicity ofConformationally Constrained Aplidine and Tamandarin A AnaloguesIncorporating a Spirolactam Turn Mimetic.J Med Chem 47：5700-5712.

[15]Kazmaier U，Hebach C，Watzke A，et al.2005.A straightforwardapproach towards cyclicpeptides via ring-closing metathesis--scope andlimitations.Org Biomol Chem 3(1)：136-145.

[16]Hariharan S，et al.2007.Assessment of the biological andpharmacological effects of the avb3 and avb3 integrin receptor antagonist，cilengitide(EMD 121974)，in patients with advanced solid tumors.Ann.Oncol18，1400-1407.

[17]Erez N，et al.2004.Induction of apoptosis in cultured endothelialcells by a cadherin antagonist peptide：involvement of fibroblast growthfactor receptor-mediated signalling.Exp Cell Res 294，366-378.

[18]Ogino J，Moore RE，Patterson GML.1996.Dendroamides，New CyclicHexapeptides from a Blue-Green Alga.Multidrug-Resistance Reversing Activityof Dendroamide A.JNat Prod 6，581-586.

[19]Klemens Stratmann，David L，Burgoyne，E，et al.1994.Hapalosin，aCyanobacterial Cyclic Depsipeptide with Multidrug-Resistance ReversingActivity.J Org Chem 24，7719-7226.

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的基础，提供新的环肽GG-8-6及其合成方法和在制备抗肝癌药物中的应用。

本发明提供了新的环肽GG-8-6为环九肽环状肽，该环九肽进行了动物体内抗肿瘤试验，结果显示，该新的环肽GG-8-6化合物对肝癌细胞生长具有抑制作用，可用于制备抗肝癌药物

本发明的新的环肽GG-8-化合物：由九个α-L-氨基酸首尾顺次连接而成，肽链顺序为：环-(Val-Leu-Pro-Ile-Leu-Leu-Leu-Val-Leu)；其中，所述氨基酸为缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、脯氨酸(Pro)、异亮氨酸(Ile)；其结构分子式为C₅₁H₉₁N₉O₉，分子量为973；

本发明提供了上述环九肽化合物GG-8-6的化学制备方法(通过下式Scheme 1合成)，其包括固相合成直链肽、液相环合和柱色谱分离三部分，步骤为：由Wang树脂以Fmoc保护的氨基酸为原料，通过固相化学方法制备直链肽，由直链肽首尾相连合环，支撑单环肽化合物；其中，所述直链肽的合成在HOAt/HATU和NMM(氮甲基吗啉)存在下于溶液中完成。

本发明制得的环肽化合物GG-8-6的化学结构式如式(I)所示：

更具体的，本发明的环九肽化合物GG-8-6的化学制备方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)以Wang树脂为固相载体，HATU/HOAt为缩合剂，氮甲基吗琳作为碱，N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，按氨基酸顺序依次实现酰胺键的构建，合成直链肽前体；然后以HATU/HOAt为缩合剂，氮甲基吗啉作碱，在N，N-二甲基甲酰胺为溶剂的高稀释溶液中实现液相合环；

(2)所得合环产物用乙酸乙酯溶解，弃去不溶物，浓缩乙酸乙酯溶解部分，得到GG-8-6粗品；

(3)所得GG-8-6粗品用柱色谱技术进行分离，色谱条件为：硅胶正相色谱柱，二氯甲烷∶甲醇＝97∶3，经TLC点板，110℃盐酸水解，茚三酮检测，合并目标环肽，经75％乙腈/水反相柱进一步纯化，得到单体，总产率3％；

(4)所述GG-8-6纯化产物用高效液相色谱仪器检测，洗脱条件：A∶B＝75％∶25％，其中A为乙腈；B为水；产物分子量为973，分子式为cyclo-(Val-Leu-Pro-Ile-Leu-Leu-Leu-Val-Leu)；

(5)本发明中，对环九肽化合物GG-8-6进行结构鉴定，纯化后的GG-8-6通过HRMS和X-ray单晶衍射(铜靶)进行结构确证；

所述GG-8-6高分辨质谱(HRMS)中分子离子峰显示为[M+Na]⁺996.6836(计算值为996.6832)；

所述GG-8-6晶体呈无色透明块状，衍射实验用晶体大小为0.32mm×0.28mm×0.2mm，属单斜晶系，空间群为P2₁，晶胞参数： α＝90°，β＝91.1850(10)°，γ＝90°；晶胞体积晶胞内不对称单位数Z＝2；

采用Bruker SMART APEX-II衍射仪收集衍射强度数据，CuKα辐射，石墨单色器，单导管直径ф＝0.50mm，晶体与CCD探测器距离d＝60.3mm，管压40kV，管流30mA，扫描方式：ω扫描，收集总衍射点数为21760，独立衍射点数为8483个，观察点数(|F|2≥2σ|F|2)为8391个；

采用直接法(Shelxs97)解析晶体结构，获得全部70个非氢原子位置，使用最小二乘法修正结构参数和判别原子种类，用几何计算法和差值Fourier法获得全部氢原子位置，最终可靠因子为R₁＝0.0338，wR₂＝0.0877(w＝1/σ|F|2)，S＝1.047；确定1个不对称单位内化学计量式为C₅₁H₉₁N₉O₉·H₂O，计算分子量为992，计算晶体密度1.131g/cm³；这一晶体结构为环九肽化合物GG-8-6含一个分子的结晶水。

本发明的制备方法具有制备步骤简单、构型保持的优点，有较高的实用价值。

本发明进行了GG-8-6体外抗肝癌活性实验，其包括

(1)配制GG-8-6供试品溶液；

(2)MTT法测试GG-8-6对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用；

(3)细胞存活率(％)＝(OD给药组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100％，计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC₅₀)，评价GG-8-6对肝癌细胞SMMC-7721的抑制活性；

其中，体外抗肝癌活性实验的细胞浓度为5×10⁴cell/mL；

体外抗肝癌活性实验结果表明，GG-8-6对人肝癌细胞SMMC-7721的半数抑制浓度(IC₅₀)为5.53μM，具有抗肝癌细胞活性。

本发明进行了GG-8-6体内抗肿瘤活性实验，其包括，

(1)建立荷人肝癌细胞SMMC-7721裸鼠模型；

(2)设立阳性对照顺铂组，测试GG-8-6对荷瘤裸鼠的瘤抑制作用。

(3)给药32天后，利用公式计算出抑瘤率：抑瘤率＝(1-(给药组平均肿瘤重量/溶剂组平均肿瘤重量))×100％；

其中，体内抗肝癌活性实验的GG-8-6剂量为8，16和40mg/kg，给药方式为腹腔给药；

体内抗肝癌活性实验的阳性药顺铂剂量为1mg/kg，给药方式为腹腔注射；

体内抗肝癌活性实验结果表明，GG-8-6能够显著抑制裸鼠体内肿瘤生长，有明显的体内抗肿瘤作用，GG-8-6剂量为40mg/kg时的抑瘤率达67.9％，并且给药终止时裸鼠体重无明显降低。

本发明进行了GG-8-6的急性毒性实验，其包括，

(1)设立5个剂量，最高剂量大于500mg/kg，并设置溶剂对照组；

(2)选取ICR小鼠进行测试，雌雄各半；

(3)配制GG-8-6供试液，给药组按照0.1mL/10g腹腔注射，对照组给予等量溶剂，给药过后进行行为反应的观察；

急性毒性实验结果表明，GG-8-6在剂量为640mg/kg时未造成ICR小鼠死亡，并且给药后继续观察30天，各组小鼠体重正常，行为活动也正常。

本发明提供了新的环肽GG-8-6，经体外抗肝癌活性实验和动物体内抗肿瘤试验，结果表明，该新的环肽GG-8-6化合物对肝癌细胞生长具有抑制作用，可用于制备抗肝癌药物

附图说明

图1. GG-8-6的绝对构型。

图2. GG-8-6对SMMC-7721细胞的抑制作用。

图3. GG-8-6对裸鼠移植瘤的抑制作用，

其中，A.各组肿瘤图；B.各组裸鼠体重变化曲线；C.各组肿瘤体积变化曲线；D.各组平均瘤重；E.各组抑瘤率(％)，Mean±SEM，*P＜0.05，*P＜0.01。

具体实施方式

现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下面实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1、合成环肽GG-8-6

1)合成直链肽

(1)取树脂：称取一定量Fmoc-Leu-Wang树脂，在DMF中溶胀30min；

(2)脱除Fmoc保护基：在20％的piperidine/DMF溶液中氮气搅拌反应30min；再依次用等体积DMF反复洗涤3次，每次3min；

(3)茚三酮检测：取微量反应后树脂于试管中，加入2滴5％(体积分数，下同)的茚三酮/乙醇溶液、1滴吡啶和1滴80％苯酚乙醇溶液，加热约1分钟；树脂呈蓝紫色或紫红色，则表示脱保护成功，进行下步反应；若树脂不变色，则表示脱保护未成功，重复上述反应步骤(2)直到树脂显蓝紫或紫红色；

(4)形成肽键：向树脂中加入3倍量Fmoc-氨基酸、3倍量HOAt、3倍量HATU、5倍量NMM，DMF(10mL/g resin)中搅2-3小时；缩合反应完成后反复用等体积DMF洗涤5次；接入的氨基酸依次为：Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Val-OH；

(5)茚三酮检测：方法同步骤(3)；若树脂褪去蓝紫色或紫红色，则表示缩合反应完全，可进行下一步反应；若树脂仍呈蓝紫色或紫红色，则表示仍然有未保护的氨基存在，即缩合未完全，须重复上述步骤(4)直到树脂褪去蓝紫色或紫红色；

(6)重复步骤(2)、(3)、(4)、(5)直至肽链完成；

(7)再重复一次步骤(2)、(3)，得到载有脱保护的直链肽的树脂；

(8)直链肽脱树脂：将洗涤干净的树脂再用乙醚洗涤3次，放置，使乙醚挥发完全；将接有直链肽的树脂在三氟乙酸/水/苯酚/苯甲硫醚/乙二硫醇(40∶2∶2∶3∶1，体积比，10mL/g resin)中搅拌2.5小时；将树脂过滤；

(9)将滤液置于离心管中，加入过量乙醚，搅拌后离心，弃上清液，保留沉淀，

如此反复操作5次，将沉淀部分置干燥器中，使乙醚挥发，即得直链肽粗品；

2)液相合环

将直链肽粗品用DMF稀释至10^-3mol/L，置于冰浴中充分溶解后加入3倍量HOAt、3倍量HATU、10倍量NMM，继续冰浴搅拌2小时，撤去冰浴，继续常温下搅拌48小时，减压蒸馏后得反应产物；

3)预处理

将合环得到的产物用乙酸乙酯溶解(1mL/100mg固体)，弃去不溶物，浓缩乙酸乙酯溶解部分，旋蒸至干得产物粗品；

4)柱色谱分离

将产物粗品以300～400目硅胶为固定相，二氯甲烷/甲醇(97∶3)为流动相条件下经两次柱色谱分离，254nm检测，110℃ HCl水解，茚三酮显色，将含有环肽的流分合并蒸干近纯产品。近纯产品进一步经过反相柱色谱(75％乙腈/水)纯化，得到GG-8-6纯品，在流动相为75％乙腈/水，流速为1mL/min，210nm波长下进行液相检测，纯度大于98％，产率3％。

5)结构确证

将所述GG-8-6用甲醇溶解，经高分辨质谱(HRMS)检测，其[M+Na]⁺峰丰度为996.6836，与目标环肽相符。以甲醇为溶剂培养得到晶体，单晶衍射确证结构为GG-8-6(如图1，表1所示)。

表1. GG-8-6的单晶衍射数据

实施例2、GG-8-6体外抗肝癌活性实验

采用MTT法测定化合物的细胞毒作用。取对数生长期的细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养基配制成细胞悬液，于96孔培养板内接种，化合物每个浓度设置3个复孔。每孔100μl(含5000个肿瘤细胞)，置于37℃、5％CO₂温箱内。化合物作用一定时间后，每孔加入MTT溶液20μl，37℃孵育4小时。之后，弃去上清，加入150μL DMSO，利用酶标仪在490nm处检测OD值，实验结果重复三次；

细胞存活率(％)＝(OD给药组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100％，

结果显示，GG-8-6对人肝癌细胞SMMC-7721的半数抑制浓度(IC₅₀)为5.53μM，具有抗肝癌细胞活性(如图2所示)。

实施例3、GG-8-6体内抗肝癌活性实验

体外培养人SMMC-7721肝癌细胞，取对数生长期的细胞，用不含血清的DMEM培养基配制成细胞悬液，接种至若干只裸鼠前肢皮下，待饲养一段时间长出合适大小的肿瘤后处死裸鼠取出瘤子进行瘤细胞悬液制备，在无菌条件下取出瘤块，除去坏死组织，将数个瘤块混合，剪成小块儿，利用玻璃组织匀浆器研磨均匀，然后转移入无菌培养瓶，加适量无血清DMEM培养液得到细胞母液，进行计数，调整细胞浓度为1×10⁷/mL，将细胞置于冰块上；取50只裸鼠，雌性、15-18g，引入SPF级动物房给水给食适应3天，用1mL注射器抽吸，每次抽取前均将细胞混匀，每只裸鼠接种0.2mL，30min内完成整个操作，之后进行正常饲养，待观察到有瘤长出100mm³左右后，按照瘤大小同时参考小鼠体重因素挑出瘤子均一些(较接近的)，进行随机分成5组、每组6只，分别是溶剂组、CISPLATIN组(1.0mg/kg)、GG-8-6高剂量组(40.0mg/kg)、GG-8-6中剂量组(16.0mg/kg)、GG-8-6低剂量组(8.0mg/kg)，采取0.1mg/10g进行腹腔给药，每天一次，每两天称量裸鼠体重并利用游标卡尺测量肿瘤长径(a)和短径(b)，利用公式V＝0.5×a×b²计算出肿瘤体积，并做记录，给药32天后，结束给药，停药次日处死裸鼠，称量体重，然后解剖皮下瘤块、称重。根据肿瘤重量，按公式计算出抑瘤率：抑瘤率＝(1-(给药组平均肿瘤重量/溶剂组平均肿瘤重量))×100％，

如图3所示，与溶剂组相比，顺铂明显抑制肿瘤生长，抑瘤率为83.3％；GG-8-6能够抑制肿瘤生长，并且随着化合物给药量增加呈现一定的剂量依赖性，抑瘤率分别为26.1％、57.0％、67.9％(表2)。可见GG-8-6能够显著抑制裸鼠体内肿瘤生长，有明显的体内抗肿瘤作用。

表2. GG-8-6对裸鼠移植瘤的抑制作用

其中：Mean±SEM，SPSS 16.0软件，单因素方差分析；与空白组相比，

*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为非常显著性差异；n(x)中n指实验开始

时裸鼠数量，x指实验结束时存活的裸鼠数量。

实施例4GG-8-6急性毒性实验

实验设置5个剂量10mg/kg、40mg/kg、160mg/kg、320mg/kg和640mg/kg，并设置溶剂对照组，选取18-20g的ICR小鼠20只，每组4只(其中320mg/kg和640mg/kg各2只)，雌雄各半。GG-8-6先用少量DMSO配制成较高浓度的母液，然后加入无水乙醇-EL混合液(1∶1)，之后利用生理盐水稀释至工作液浓度，实验前禁食不禁水过夜，给药组按照0.1mL/10g腹腔注射，对照组给予等量溶剂，给药过后进行行为反应的观察；

试验观察结果：与溶剂对照组相比，在给药后2小时内，GG-8-6(10mg/kg和40mg/kg)组动物观察无明显异常；GG-8-6(160mg/kg)组4只小鼠明显自发活动减少，2小时后可见恢复；GG-8-6(320mg/kg)组可见小鼠精神不振，自主活动减少，微闭眼，步态不稳，2小时后逐渐恢复正常活动；GG-8-6(640mg/kg)组明显可见小鼠精神不振，自主活动减少，微闭眼，步态不稳，异常反应程度严重，2小时后逐渐恢复正常活动之后，所有组别经正常饲养一个月，小鼠体重正常、活动正常。

Claims (6)

1.式(I)所示的环肽GG-8-6，其特征是，所述环肽GG-8-6由L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸残基按一定顺序通过酰胺键连接构成环肽化合物，其结构式为cyclo-(Val-Leu-Pro-Ile-Leu-Leu-Leu-Val-Leu)，分子量为973，

2.按权利要求1所述的环肽GG-8-6的制备方法，其特征是，通过下式Scheme 1合成其包括固相合成直链肽、液相环合和柱色谱分离三部分：由Wang树脂以Fmoc保护的氨基酸为原料，通过固相化学方法制备直链肽，由直链肽首尾相连合环，支撑单环肽化合物；纯度大于98.0％；

其中，硅胶柱层析溶剂为二氯甲烷-甲醇(97∶3)，反相色谱条件为乙腈∶水＝75∶25；

3.权利要求1的环肽化合物GG-8-6在制备抗肝癌药物中的应用。

4.按权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的GG-8-6具有体外抗肝癌细胞的活性，其对肝癌细胞SMMC-7721的IC₅₀值为5.53μM。

5.按权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的GG-8-6抑制体内肿瘤生长。

6.按权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的GG-8-6抑制体内肿瘤生长其最低浓度为16mg/kg，最高浓度为40mg/kg。