CN105531284B - 细胞穿透肽和包含其的缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种来源于端粒酶的细胞穿透肽、所述细胞穿透肽与抗癌剂的缀合物以及包含所述缀合物的组合物。可以通过使用根据本发明的细胞穿透肽提供用于转运癌症特异性抗癌剂的有效方法。更具体地，通过制备其中组合了所述细胞穿透肽和抗癌剂的本发明的缀合物，可以减少传统抗癌剂的使用浓度并且可以提供癌症特异性，因此可以获得在治疗过程中减少副作用的效果。

Description

细胞穿透肽和包含其的缀合物
技术领域
本发明涉及来源于人类端粒酶逆转录酶(hTERT)的细胞穿透肽、所述细胞穿透肽的缀合物、活性成分以及包含所述缀合物的组合物。
背景技术
尽管低分子量物质、核酸、蛋白质、纳米颗粒等在分子水平作为治疗物质具有极大的潜能，但因为其不能穿透组织和细胞膜而使它们的使用受到限制。递送这样的物质到细胞的系统的发展已经成为过去二十年研究的活跃领域。将物质转运至细胞内成为分子治疗方法方面的话题。低分子量物质、核酸或者纳米颗粒通过某些试剂、电穿孔或者热休克转运进细胞内。但是，很难找到合适的方法不破坏蛋白的活性和完整性而将蛋白递送进入细胞内。在十九世纪八十年代，在进行关于HIV的细胞穿透能力的研究中，发现由特定的11个氨基酸组成的HIV-TAT蛋白在向细胞内的转运过程中发挥重要作用。因此，从十九世纪九十年代开始，寻找将蛋白转运至细胞内的正确方法的研究成为研究的热点领域。
端粒已知是在染色体末端发现的遗传物质的重复序列，其防止染色体损伤或合并到其它的染色体。端粒的长度在每次细胞分裂时缩短，并且在一定次数的细胞分裂后，端粒长度极度缩短以致细胞停止分裂并且死亡。另一方面，已知端粒的延长会延长细胞寿命。例如，癌细胞制造一种称为端粒酶的酶，其阻止端粒的缩短，因此导致癌细胞的繁殖。
STAT3抑制剂通过包括凋亡、抑制血管生成和阻断免疫逃逸的复杂的抗肿瘤机制来调节肿瘤。据报道，作为STAT3抑制剂药物的NSC74859在施用时具有剂量依赖性副作用。所以，需要通过施用低剂量的该药物来抑制肿瘤的方法。
紫杉醇用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌或胃癌，据报道紫杉醇具有剂量依赖性副作用，即通过骨髓抑制而减少白细胞、红细胞和血小板。所以，需要通过施用低剂量紫杉醇来更有效地治疗癌症的方法。
发明内容
技术问题
对于食物、药物和健康补充剂，将在体内具有高吸收需求的活性成分转运进入细胞是非常重要的，如蛋白质、核酸、肽、脂质、糖脂、矿物质、葡萄糖、纳米颗粒、生物制品、造影剂、药物和化学化合物。
例如就抗癌药物而言，其以超过有效剂量施用以激活抗癌效果，并且据报道已知的抗癌药物对于高剂量施用具有副作用，包括通过抑制骨髓而减少白细胞、红细胞、血小板和正常细胞凋亡。所以，需要通过施用低剂量药物来抑制癌症的方法。
本发明的目的是提供一种在细胞内具有高传导性的细胞穿透肽及包括其的缀合物。
本发明的另一个目的是提供一种作为细胞穿透肽和抗癌药物的组合的缀合物，以及包含该缀合物作为转运靶标特异性抗癌药物的有效手段的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种作为细胞穿透肽和STAT3抑制剂的组合的缀合物，以及包含该缀合物作为转运STAT3抑制剂的有效手段的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种作为细胞穿透肽和紫杉醇的组合的缀合物，以及包含该缀合物作为转运紫杉醇的有效手段的药物组合物。
问题的解决方案
根据本发明的实施方式，作为来源于端粒酶的细胞穿透载体肽(cellpenetrating carrier peptide)，可以提供下述细胞穿透载体肽：其中所述肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，所述肽具有与上述序列大于80％同源性的氨基酸序列，或者所述肽包含上述肽的片段。
根据本发明实施方式中的细胞穿透载体肽，所述片段可由3个以上氨基酸组成。
根据本发明的另一个实施方式，作为细胞穿透载体肽和活性成分的缀合物，提供包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的细胞穿透载体肽，具有与上述序列大于80％同源性的氨基酸序列，或者包含上述序列的片段的肽。
根据本发明的另一个实施方式，提供了选自由以下物质组成的组的活性成分：蛋白质、核酸、肽、脂质、糖脂、矿物质、葡萄糖、纳米微粒、生物制品、造影剂、药物和化学化合物。
根据本发明的另一个实施方式的缀合物，所述活性成分可以是细胞因子、抗体、抗体片段、治疗性酶、可溶性受体或配体。
根据本发明的另一个实施方式的缀合物，所述活性成分可以用于治疗或预防疾病。
根据本发明的另一个实施方式，可提供用于治疗和预防疾病的方法，该方法包括将根据本发明的缀合物施用于需要其的个体。
根据本发明的另一个实施方式，可提供根据本发明的缀合物用于治疗和预防疾病的应用。
根据本发明的另一个实施方式，可提供用于治疗和预防疾病的根据本发明的缀合物。
根据本发明的另一个实施方式的缀合物，所述疾病可选自由以下疾病组成的组：皮肤病、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝细胞癌、表皮样癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、皮肤表皮样癌、月经过多、子宫内膜异位症、子宫腺肌病、子宫肌瘤、女性或男性不育、儿童性早熟、良性前列腺增生、由表皮细胞增殖引起的皮肤病，由T淋巴细胞引起的炎症及以上病症的组合。
根据本发明的另一个实施方式的缀合物，所述活性成分可以是抗癌药物。
根据本发明的另一个实施方式的缀合物，所述抗癌药物可以是STAT3抑制剂。
根据本发明的另一个实施方式的缀合物，所述抗癌药物可以是紫杉醇(paclitaxel)。
根据本发明的另一个实施方式的缀合物，所述载体肽和活性成分可以通过共价键、非共价键或接头介导连接。
根据本发明的另一个实施方式，提供了包含所述缀合物的药物组合物。
根据本发明的另一个实施方式的药物组合物，所述药物组合物可用于治疗或预防疾病。
根据本发明的另一个实施方式，提供了一种方法，其中所述方法包括给需要治疗或预防疾病的个体施用包含根据本发明的缀合物的药物组合物的步骤。特别是，所述方法可用于抗癌治疗或预防癌症。
根据本发明的另一个实施方式，可提供包含根据本发明的缀合物的药物组合物用于治疗或预防疾病的应用。特别是，所述应用可以用于抗癌治疗或预防癌症。
根据本发明的另一个实施方式，可提供用于治疗或预防疾病的包含根据本发明的缀合物的药物组合物。特别是，所述药物组合物可用于抗癌治疗或预防癌症。
根据本发明的另一个实施方式，所述药物组合物可用于治疗或预防选自由以下疾病组成的组的疾病：皮肤病、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝细胞癌、表皮样癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、皮肤表皮样癌、月经过多、子宫内膜异位症、子宫腺肌病、子宫肌瘤、女性或男性不育、儿童性早熟、良性前列腺增生、由表皮细胞增殖引起的皮肤病、由T淋巴细胞引起的炎症以及以上病症的组合。
根据本发明的另一个实施方式，所述药物组合物可用于抗癌治疗或预防癌症。
根据本发明的另一个实施方式，提供将药物转运至细胞内的试剂盒，其中所述试剂盒包含含有缀合物的组合物和说明书，所述缀合物是活性成分和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的细胞穿透载体肽、与上述序列具有大于80％同源性的肽或者包含上述肽的片段的肽的缀合物，且所述说明书公开了组合物的剂量、施用路径、施用次数和适应症中的一种或多种。
根据本发明的另一个实施方式，可提供将活性成分转运至细胞内的系统，作为将活性成分转运至细胞内的系统，其中所述系统包括根据本发明的实施方式的缀合物，其中所述缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列、与上述序列具有大于80％同源性的氨基酸序列或包含上述序列的片段的肽，其中所述肽具有细胞穿透性以使活性成分被转运至细胞内。
根据本发明的另一个实施方式，作为通过细胞穿透载体肽将活性成分转运至细胞内的方法，可以提供用于将活性成分转运至细胞内的方法，其中所述方法包括向有需要者施用根据本发明的另一个实施方式的缀合物的步骤，其中所述肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列、与上述序列具有大于80％同源性的氨基酸序列或包含上述序列的片段的肽，其中所述肽也具有细胞穿透性以使活性成分被转运至细胞内。
根据本发明的另一个实施方式，所述方法可将活性成分局部转运到细胞中的线粒体。
根据本发明的另一个实施方式，提供编码根据本发明的一个实施方式的肽的多核苷酸。
根据本发明的另一个实施方式，提供包含根据本发明的另一个实施方式的多核苷酸的载体。
根据本发明的另一个实施方式，提供包含根据本发明的另一个实施方式的载体的转化细胞。
根据本发明的另一个实施方式，使用根据权利要求1或权利要求2所述的细胞穿透载体肽，以使活性成分转运进入细胞。
根据本发明的另一个实施方式，可提供用于治疗或预防疾病的方法，其中所述方法包含向有需要者施用根据本发明的一个实施方式的缀合物，其中所述细胞穿透载体肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列、与上述序列具有大于80％同源性的氨基酸序列或上述序列的片段的肽，其中所述肽具有细胞穿透性以使得活性成分被转运进入细胞，其中所述疾病选自由以下疾病组成的组：皮肤病、炎性疾病、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝细胞癌、表皮样癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、皮肤表皮样癌、月经过多、子宫内膜异位症、子宫腺肌病、子宫肌瘤、女性或男性不育、儿童性早熟、良性前列腺增生、由表皮细胞增殖引起的皮肤病、由T淋巴细胞引起的炎症及以上病症的组合。
发明应用
通过使用根据本发明的细胞穿透肽，可提供递送癌症特异性抗癌药物的有效方式。具体地，通过制造根据本发明的细胞穿透载体肽的缀合物和抗癌药物，可使已知抗癌药物的有效剂量降低，并且还可使由癌症特异性效果引起的副作用降低。
附图描述
图1表示根据本发明的肽和已知抗癌药物的缀合的抗癌机制的图表。
图2表示施用根据本发明的肽的缀合物和造影剂(FITC)后细胞内的运输的图。
图3表示仅施用各个浓度的根据本发明的肽之后，癌细胞和正常细胞的凋亡能力的图。
图4表示仅施用各个浓度的作为STAT3抑制剂的NSC74859之后，癌细胞和正常细胞的凋亡能力的图。
图5表示施用各个浓度的根据本发明的肽和NSC74859的缀合物之后，癌细胞和正常细胞的凋亡能力的图。
图6表示仅施用各个浓度的已知抗癌药物紫杉醇之后，癌细胞和正常细胞的凋亡能力的图。
图7表示施用各个浓度的根据本发明的肽和紫杉醇的缀合物之后，癌细胞和正常细胞的凋亡能力的图。
具体实施方式
在2013年7月12日提交的韩国专利申请10-2013-0082265号和在2013年12月27日提交的韩国专利申请10-2013-0165071号以各种目的作为参考包括在本说明书中。此外，本申请要求作为参考包括在本说明书中的所述韩国专利申请10-2013-0082265号和10-2013-0165071号的优先权。
因为本发明可适用于多种应用领域和进行多种变化，接下来对本发明进行更详细的描述。然而，这并不意味着限定了实际应用的形式；应该理解，主旨在于包括所有的变化形式、等同形式或替代形式中的概念和技术程度。在本发明的描述中，如果任何关于现有技术的详细描述被认为会破坏本发明的基本原则，则忽略该描述。
蛋白质、核酸、肽或病毒等具有较大的用作治疗物质的潜能。但是，因为它们分子水平的尺寸而不能穿透组织和细胞膜，使其使用受到限制。尽管分子的尺寸很小，单因为所述分子的结构或特征而令其不能穿透脂双层。因此，已尝试通过使用电穿孔、热休克等来将蛋白质、核酸、肽或病毒转运至细胞内。但是，很难在既不破坏细胞膜又保持上述分子的活性状态的情况下将其转运。由于来源于人类免疫缺陷病毒(Human Immuno-deficiencyVirus，HIV)的反式激活转录激活因子(Trans-Activating Transcriptional activator，TAT)据显示起到作为可以将巨大的活性物质转运至细胞内的细胞穿透肽的作用，已进行了许多相关研究。特别是，对于能将诸如蛋白质、核酸、肽或病毒等巨大分子转运至细胞内而不引起毒性的物质进行了研究，这类物质不同于在细胞内引起毒性的TAT蛋白。因此，由于本发明人发现来源于端粒酶的肽具有卓越的作为细胞穿透肽的效力而没有明显的毒性，因此完成了本发明。
在最近兴起的抗癌治疗，为了替代在治疗中降低病人生活质量的已知的抗癌药物，正在努力寻找癌症特异性靶分子，其仅提高癌细胞的生长而不提高正常细胞，并且癌症靶向治疗剂如格列卫、易瑞沙等已开发并用于实际的临床试验。
因此，尽管已在持续努力地开发癌症特异性分子靶药物，已知的非癌症特异性分子如5-FU、顺铂、多柔比星、多西他赛等仍在本领域广泛使用，所以对于向癌症特异性递送那些非癌症特异性药物的开发可以作为发展靶向分子治疗的另一种方法。
在这些情况下，通过将细胞毒性药物附着到更多地吸附于癌细胞而非正常细胞的物质，将抗体与癌症特异性抗原组合，或者开发当抗癌药物在癌症特异性条件反应时使其暴露的纳米胶囊，可以获得用于向癌症特异性递送抗癌药物的方法。
通过使用根据本发明的细胞穿透肽，提供了癌症特异性抗癌药物的有效递送。特别是，通过制造根据本发明的细胞穿透肽和抗癌药物的缀合物，可以在治疗中获得更低的副作用，因为可以以低剂量的已知抗癌药物实现癌症特异性效果。
STAT3抑制剂显示出通过如凋亡、抑制血管生成及阻断免疫逃逸等复杂的抗肿瘤机制调节肿瘤的效果。化学药物NSC7485(STAT3抑制剂之一)对于以下病症具有优异效果：由TGF-β信号紊乱导致的癌症，诸如肝细胞癌、表皮样癌、非小细胞肺癌(NSCLC)等；由表皮细胞增殖引起的皮肤疾病，并且对与T淋巴细胞相关的炎症具有抗炎作用。
紫杉醇为抗癌药，称为“紫杉烷”、“抗微管剂”、“植物生物碱”等，其由短叶红豆杉产生。紫杉醇通过对细胞周期的特异性选择在不同的细胞分裂期攻击癌细胞。该药物被用来治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、皮肤表皮样癌，其通过抑制分离和微管的分离步骤来抑制癌细胞，微管为细胞分裂过程中自主复制的细胞器。
本发明说明书中描述的肽为下表1中SEQ ID NO:1的“PEP 98”。在本发明的实施例中，检验了与来源于端粒酶的pep1(由16个氨基酸组成)相比的pep98的活性。SEQ ID NO:3列出人类端粒酶蛋白全长序列。在本发明的说明书中，术语“pep”此处指具有SEQ ID NO:1的肽、或包含与上述序列具有大于80％同源性的氨基酸序列的肽、或上述肽的片段。
【表1】
Figure BDA0000939626730000071
Figure BDA0000939626730000081
本发明的实施方式提供多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、包含与上述序列具有大于80％同源性的氨基酸序列的肽、或上述肽的片段。通过使用上述多核苷酸，可以制造大量的肽。例如，通过将包含编码所述肽的多核苷酸的载体插入宿主细胞内，可以制造大量的肽。
此处公开的肽可包括包含大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％氨基酸序列同一性的肽。另外，本发明公开的肽包括包含SEQID NO:1或其片段的肽，以及具有多于1个经改变/取代的氨基酸、多于2个经改变/取代的氨基酸、多于3个经改变/取代的氨基酸、多于4个经改变/取代的氨基酸、多于5个经改变/取代的氨基酸、多于6个经改变/取代的氨基酸、或多于7个经改变/取代的氨基酸的肽。
在本发明的一个实施方式中，氨基酸的变化包括肽的物理和化学性质的修饰。例如，可以进行氨基酸修饰以提高肽的热稳定性，改变底物特异性，及改变最优pH。
在本发明的一个示例性实施方式中，SEQ ID NO 1的肽、作为SEQ ID NO:1的肽的片段的肽，或与所述肽具有80％以上的序列同一性的肽包含来源于端粒酶、特别是人(智人)端粒酶的肽。
本文中的术语“氨基酸”不仅包括天然组成肽的22种标准氨基酸，也可以是D-异构体和修饰的氨基酸。因此，在本发明的具体的实施方式中，此处的肽包括具有D型氨基酸的肽。另一方面，肽可包括非标准氨基酸，诸如那些被翻译后修饰的氨基酸。翻译后修饰的实例包括磷酸化、糖基化、酰基化(包括乙酰化、豆蔻酰化、棕榈酰化)、烷基化、羧基化、羟基化、糖化、生物素化、泛素化、化学性质的修饰(例如β-消除脱酰胺化、脱酰胺化)和结构修饰(例如二硫键的形成)。同时，氨基酸的变化包括由于在用于形成肽缀合物的采用交联剂的结合过程中的化学反应而发生的氨基酸变化，如氨基、羧基和侧链的变化。
本文公开的肽可为从天然来源被鉴定和分离出的野生型肽。另一方面，当与SEQID NO:1或其片段比较时，本文公开的肽可以为人工变体，其包含一个或多个氨基酸取代、删除和/或插入。野生型多肽(不仅人工变体)的氨基酸变换包括不会显著影响活性的蛋白的折叠和/或氨基酸的保守取代。保守取代的实例可在以下的组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。通常不改变特定活性的氨基酸取代是本领域已知的。最常发生的变换为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，及其反向变换。保守取代的其他实例显示在下表2中：
【表2】
Figure BDA0000939626730000091
Figure BDA0000939626730000101
通过在下述功效中选择进行显著不同的取代来进行肽的生物性质的显著转化：(a)在取代区域保持多肽骨架的结构(如片状或螺旋状的三维结构)的功效，(b)在靶标区域保持分子的电荷或疏水性的功效，或(c)保持侧链的体积的功效。天然残基通过一般侧链性质分为以下几组：
(1)疏水性:正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水性:cys，ser，thr；
(3)酸性:asp，glu；
(4)碱性:asn，gin，his，lys，arg；
(5)影响链取向的残基:gly，pro；及
(6)芳香族:trp，tyr，phe。
非保守取代可以通过将上述类组的成员交换为不同类组的成员来进行。与保持合适的肽三维结构无关的任何半胱氨酸残基通常可以被取代为丝氨酸，以此增加分子的氧化稳定性和避免不合适的交联。相反，可以通过对肽添加半胱氨酸键获得稳定性的提高。
另一种类型的肽的氨基酸变体为那些具有改变的肽糖基化模式的肽。此处的术语“变化”意味着删除在肽中存在的至少一个碳水化合物残基和/或添加至少一个在肽中不存在的糖基化残基。
肽的糖基化通常为N连接或者O连接。此处的术语“N连接”指碳水化合物残基与天冬酰胺残基的侧链相连。作为三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除了脯氨酸的任何氨基酸)为用于以酶促方式将糖残基连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中存在这样的三肽序列中之一时，创立了潜在的糖基化位点。“O连接糖基化”意味着将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一个连接至羟基氨基酸。所述羟基氨基酸最典型为丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列以包含上述的三肽序列(对N连接糖基化位点而言)，可方便地进行多肽的糖基化位点的添加。所述变化可以通过将来自丝氨酸或苏氨酸的至少一个残基添加至第一抗体序列或通过用这些残基进行取代来进行(对O连接糖基化位点而言)。
在本发明的一个实施方式中，提供了肽和待转运的活性成分的缀合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述肽是上述肽的片段，或所述肽具有与上述肽大于80％同源性。在本发明的一个实施方式中，活性成分可以选自蛋白质、核酸、肽、脂质、糖脂、矿物质、糖、造影物、药物和化学化合物中的至少一种。在本发明的一个实施方式中，活性成分可以是肽。在本发明的一个实施方式中，活性成分可以是细胞因子、抗体、抗体片段、治疗酶、可溶性受体或配体。
在本发明目前的描述中，本文公开的“细胞穿透肽”指可以在体外和/或体内将载物转运到细胞内的肽。本文公开的“载物(cargo)”包含所有的通过与细胞穿透肽缀合而可以转运进入细胞内的物质，例如，所述所有物质为意图增加细胞穿透效能的那些物质，特别是药物，更特别是不能通过一般路径转运进入细胞内的物质，更特别是蛋白质、核酸、肽、矿物质、糖(如葡萄糖)、纳米颗粒、生物制剂、病毒、造影剂或其他化学化合物，但不限于这些。
本文公开的“药物”为广义概念，包括待转运用于缓解、预防、治疗或诊断疾病、伤口或特定症状的物质。
本文公开的“载体肽(carrier peptide)”为可以通过与活性成分缀合来将活性成分转运至到靶向位点的肽。
在本发明的一个实施方式中，作为载物的蛋白质或肽包含一种或多种激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白质(或肽)、抗体和疫苗，但不限于它们。在本发明的一个实施方式中，核酸可以是自然的或人工的DNA或RNA分子，其为单链或双链。核酸分子可以是一种或多种同类型的核酸(例如，具有相同的核苷酸序列)或不同类型的核酸。核酸分子包含一种或多种DNA、cDNA、诱饵DNA、RNA、siRNA、miRNA、shRNA、stRNA、snoRNA、snRNA、PNA、反义寡聚体、质粒和其它修饰的核酸，但不限于它们。在本发明的一个实施方式中，病毒包含整个病毒或病毒核心(其包含病毒核酸)。在本发明的一个实施方式中，化学物质为广泛指代，其包含可以充当药物的天然或合成的物质。
在本发明的一个实施方式中，通过细胞穿透肽转运至细胞内的药物可包含一种或多种药物转运体，诸如脂质体、微泡、纳米颗粒、磁性颗粒或量子点。
在本发明的一个实施方式中，载物可以直接与所述肽结合。在本发明的另一个实施方式中，载物可以通过多种类型的键结合所述肽，如共价键或非共价键。例如，在一个实施方式中，载物可以被结合至肽的N端或者C端。例如，载物可以通过二硫键或共价键键合至所述肽。共价键是载物可以键合至谷氨酸(E)的N端的α-氨基或赖氨酸(K)残基的C端的氨基的键。同时，肽和载物可以通过非共价键结合，其可使肽或载物以胶囊形式封装另一者。
在本发明的另一个实施方式中，肽可以通过接头(linker)结合载物。例如，在谷氨酸N端的α氨基或赖氨酸残基C端的氨基引入例如Hynic(6-肼基吡啶-3-羧酸)接头等接头后，可通过将载物结合到接头而将载物与肽结合。
本文公开的载体肽为包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、或与上述序列具有大于80％同源性的氨基酸序列的肽、或者上述肽的片段，其可以以1:1的摩尔比例与载物结合，但它可以以不是1:1的摩尔比例结合。例如，CPP和载物的摩尔比例可以大于2:1，特别是大于2:1、大于3:1、大于4:1、大于5:1、大于6:1、大于7:1、大于8:1、大于9:1或大于10:1。这意味着许多载体肽分子可以与一个载物分子结合。上述许多载体肽分子可以以连续或平行方式结合。“连续结合”指载体肽和载物分子在末端氨基酸处结合。“平行结合”指它们可以在除了末端氨基酸之外的位点处结合。另一方面，载体肽和载物的摩尔比例可大于1:2。其意味着一个载体肽分子可以结合许多载物分子。例如载体肽和载物的摩尔比例可以为1:2，特别是大于1:2、大于1:3、大于1:4、大于1:5、大于1:6、大于1:7、大于1:8、大于1:9或大于1:10。
在本发明的一个实施方式中，提供使用肽作为药物递送载体来转运多于一个活性成分，其中所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或所述肽是上述肽的片段，或所述肽具有大于80％的与上述肽的氨基酸序列同源性。
在本发明的一个实施方式中，提供递送药物至受试者的方法，其包含施用包含药物和肽的组合物的步骤；其中所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或所述肽是上述肽的片段，或所述肽具有大于80％的与上述肽的氨基酸序列同源性。
在本发明的一个实施方式中，提供了包含组合物和说明书的用于将药物递送到受试者的细胞内的试剂盒，其中所述组合物包含本发明的肽和用于递送的药物的缀合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或所述肽是上述肽的片段，或所述肽具有大于80％的与上述肽的氨基酸序列同源性，其中所述说明书包括施用剂量、施用路径、施用频率及组合物的适应症中的至少一种。
在本发明的一个实施方式中，提供了具有将活性成分递送至细胞内的良好活性的药物组合物，该药物组合物包含肽与活性成分的缀合物，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或所述肽是上述肽的片段，或所述肽具有大于80％的与上述肽的氨基酸序列同源性。
在本发明的一个实施方式中，所述组合物包含0.1μg/mg至1mg/mg、特别是1μg/mg至0.5mg/mg、更特别是10μg/mg至0.1mg/mg的肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列、包含与上述序列具有至少80％同源性的氨基酸序列的肽、或上述序列的片段中的至少一种。当所述肽包含在上述范围内，组合物的安全性和稳定性均可被满足，且所述范围在成本效益方面是合适的。
在本发明的一个实施方式中，所述组合物可具有包含人、狗、鸡、猪、牛、绵羊、豚鼠和猴的所有动物的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物可通过口服、直肠、经皮、静脉内、肌内、腹膜内、骨髓内、硬膜外或皮下途径施用。
口服施用的形式可以为但不限于：片剂、丸剂、软胶囊或硬胶囊、颗粒、粉末、溶液或乳液。非口服施用的形式可以为但不限于：注射剂、滴剂、洗剂、软膏、凝胶、乳膏、悬浮液、乳剂、栓剂、贴剂或喷雾。
在本发明的一个实施方式中，在必要时，所述药物组合物可包含添加剂，如稀释剂、辅料、润滑剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、分散剂、表面活性剂、染色剂、芳香剂或甜味剂。在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物可通过本领域的传统工业方法制造。
在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物的活性成分的剂量可根据患者的年龄、性别、体重、病理学和状态、施用路径或处方者的判断而改变。根据所述因素的剂量可在本领域技术人员的水平内确定，且每日剂量例如可为但不限于：0.1μg/kg/天至1g/kg/天，特别是1μg/kg/天至10mg/kg/天，更特别是10μg/kg/天至1mg/kg/天，更特别是50μg/kg/天至100μg/kg/天。在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物可以但不限于每天1至3次施用。
本文使用的术语旨在用于描述实施方式，但不限制本发明。在术语前面没有数字并非限制数量，而是表明可以使用多于一个该术语的事物。术语“包含”、“具有”、“包括”、“含有”应该理解为开放式(即“包括但不限于”)。
数值作为范围被提及的原因仅是因为以范围描述比个体的数字来描述方便。除非另外提出，每个个体的数值可被理解为分别描述并被整合到说明书中。所有范围的阈值都包括在内并且可以独立地组合。
除非另外提出或语境中明显矛盾，本文提出的所有方法均以适当的顺序进行。除非其被包含在权利要求中，使用“任何一个实施方式”和“所有实施方式”或者示例性语言(例如，“诸如”、“如”)是用来更清楚地描述本发明，而不是限制本发明的范围。本文中除了权利要求以外的任何语言均不应该被解释为本发明的必要条件。除非另外限定，此处使用的科技术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意义。
本发明优选的实施方式包括发明人所知的本发明的最佳实施方式。优选实施方式的变化形式在本领域技术人员阅读上述说明后可变得显而易见。本发明发明人希望本领域技术人员可以充分利用所述变化形式，并且本发明可以以除了本文所列出以外的其它方式进行实施。因此，本发明在专利法允许的情况下包括权利要求中所陈述的本发明的关键点的等同形式、改造形式和变化形式。另外，在上述成分的任何组合内的所有可能的变化形式都包括在本发明之内，除非另有明确声明或与上下文相悖。虽然已通过示例性实施方式描述并展示了本发明，本领域技术人员可以清楚知晓，在不脱离本发明的主旨和后文权利要求所限定的范围的情况下，可以进行形式和细节方面的各种变化。
在下文中，将通过实施例和测试例详细描述本公开。但是，下列的实施例和测试例仅以说明为目的，并且对于领域普通技术人员显而易见，本公开的范围不受所述实施例和测试例所限制。
在下列实施例中，通过制造具有SEQ ID NO:1所公开的序列的肽(PEP98)和所述肽和抗癌药物的缀合物来验证癌症特异性递送效果。
I.肽的制备
实施例1：PEP98和PEP1肽的合成
SEQ ID NO:1(PEP98)的肽和用于比较的PEP1的肽根据固相肽合成的传统已知方法合成。
更具体地，利用ASP48S(Peptron,Inc.,Daejeon ROK)，通过Fmoc固相肽合成(SPPS)从C端偶联每个氨基酸来合成所述肽。如下使用其第一个氨基酸在C端连接到树脂的那些肽:
(NH2-Leu-2-氯三苯甲基树脂)
用以合成肽的所有氨基酸在N端通过Fmoc保护，所述氨基酸残基通过能溶解在酸中的Trt、Boc、t-Bu(t-丁酯)、Pbf(2,2,4,6,7-五甲基二氢-苯并呋喃-5-磺酰基)保护。实例包括以下：
Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH。
作为偶联试剂，使用了HBTU[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯]/HOBt[N-羟基苯并三唑]/NMM[4-甲基吗啉]。
使用在20％DMF中的哌啶溶液以移除Fmoc。为了从残基上移除保护基或者将合成的肽从树脂上分离，使用了切割混合物[TFA(三氟乙酸)/TIS(三异丙基硅烷)/H2O＝92.5/2.5/2.5]。
每个肽的合成通过使用固相支架以结合至具有氨基酸保护基的起始氨基酸，分别使对应的氨基酸反应，用溶剂冲洗和脱保护，并重复此过程。
在从树脂释放之上，合成的肽通过HPLC纯化，通过质谱验证，冻干，通过MS来验证合成，然后冻干。
PEP 1的具体合成过程可以如下：
1)偶联
用NH2-Leu-2-氯三苯甲基树脂保护的氨基酸(8当量)与融化于DMF中的偶联试剂HBTU(8当量)/HOBt(8当量)/NMM(16当量)一起混合，并在室温(RT)温育2小时。温育后，反应混合物依次用DMF、MeOH和DMF冲洗。
2)Fmoc去保护
添加在20％DMF中的哌啶溶液并在RT温育5分钟，进行2次，然后依次用DMF、MeOH和DMF冲洗。
3)通过重复上述的反应1)和2)来制造肽的基本框架，NH2-N(Trt)-R(Pbf)-G-F-K(Boc)-A-G-R(Pbf)-N(Trt)-M-R(Pbf)-R(Pbf)-K(Boc)-L-F-G-V-L-R(Boc)-L-2-氯三苯甲基树脂。
4)切割:向完成合成的肽添加切割混合物，以此从树脂上切下肽。
5)将预冷的乙醚添加至获得的混合物中，然后离心以使收集的肽沉淀。
6)在通过Prep-HPLC纯化后，通过LC/MS确认分子量，并且冻干以制造成粉末形式。
所述制备方法基于PEP98，而PEP1通过与PEP98相同的方法制备。
II.细胞穿透肽的细胞内运输
实施例2:PEP98的细胞内运输的分析
(1)细胞系培养
为了分析细胞内运输，使用了韩国头颈癌细胞(SNU-1041，SNU-1076)、由MDAnderson癌症中心发现的头颈癌细胞(OSC19，HN5)和正常细胞DPSC(牙髓干细胞)。
通过将每个细胞接种在具有RPMI-1640或DMEM培养基、10％FBS和抗菌-抗真菌抗生素的100cm2培养皿中于培养箱(37℃，5％CO2)中培养。通过检测生长速度和细胞条件，每2-5天传代细胞，使细胞保持良好的状态。
(2)通过流式细胞术分析在头颈瘤细胞中的细胞内运输
在提前用制备的癌细胞在6孔板以60％-70％水平培养24小时后，分别用FITC(10μM)、pep1-FITC(10μM)、FITC-TAT(10μM)处理，2.5小时后去除培养基，用盐水冲洗，通过胰酶-EDTA酶分离细胞，制得每管106个细胞/ml，细胞用FACS分析。
在检查结果后，在PEP98或PEP1与FITC的綴合物的情形中，表现出比仅用FITC得到提高的细胞穿透性。
同时，对于表现出更低的细胞穿透性的诸如HN5和OSC19等头颈癌细胞，确认了pep98-FITC的细胞穿透性比对照组和pep1-FITC高100倍至200倍。
同时，对于表现出pep 1高细胞穿透性的诸如SNU-1041(用41标记)和SNU-1076(用76标记)等头颈癌细胞，pep98-FITC表现出与pep1-FITC相同的细胞穿透性(见图2)。
所述结果表明，结合pep98的缀合物总是表现出高细胞穿透性，pep98的细胞穿透性可透过缀合物起作用，并且可以通过其和作为活性成分的抗癌药物缀合而找到减少抗癌治疗副作用和增加抗癌治疗的功效的方法。
III.抗癌药物和细胞穿透肽的缀合物的制备
实施例3:STAT3抑制剂(NSC 74859)和细胞穿透肽(pep98)的缀合物的制备
(1)偶联用pep98肽树脂基本框架的制备
对于偶联，用NH2-氨基-2-氯三苯甲基树脂保护的氨基酸(8当量)和偶联试剂HBTU(8当量)/HOBt(8当量)/NMM(16当量)在溶解到DMF中后添加到氨基酸，将溶液在室温活化2小时，然后依次用DMF、MeOH和DMF冲洗。
此后，为了将Fmoc脱保护，进行了添加在20％DMF中的哌啶溶液的步骤、在室温活化2次每次5分钟的步骤、和依次用DMF、MeOH和DMF冲洗的步骤。
通过重复上述步骤，制得肽pep98的基本框架(NH2-N(Trt)-R(Pbf)-G-F-K(Boc)-A-G-R(Pbf)-N(Trt)-M-R(Pbf)-R(Pbf)-K(Boc)-L-F-G-V-L-R(Boc)-L-2-氯三苯甲基树脂。
(2)与STAT3抑制剂(NSC74859)的偶联:
NSC 74859(Sigma Aldrich，目录号SML0330，4当量)和偶联试剂HBTU(4当量)/HOBt(4当量)/NMM(8当量)在溶解到DMF中后添加到pep98上；溶液在室温活化2小时；然后，依次用DMF、MeOH和DMF冲洗。
添加TFA/TIS/H2O＝95/2.5/2.5至合成完成的树脂，然后将所述肽从树脂上分离。
在用HPLC纯化后，所述肽被冻干并且通过MS确认。
实施例4:细胞穿透肽(pep98)和紫杉醇的缀合物的制备
(1)引入了马来酰亚胺的紫杉醇的合成
对于pep98和紫杉醇(Sigma-Aldrich Inc.，St Louis，美国)的缀合，将接头(4-马来酰亚胺基丁酸)引入紫杉醇，并将巯基反应性官能团引入紫杉醇。
将紫杉醇1g(1.17mmol，1当量)、4-马来酰亚胺基丁酸210mg(1.17mmol，1当量)、二甲基氨基吡啶(DMAP)140mg(2.34mmol，2当量)，二环己基碳二亚胺(DCC)480mg(1.17mmol，1当量)添加至100ml圆形烧瓶中，然后添加二氯甲烷50ml。所有的成分在室温搅拌反应。
反应通过TLC(薄层色谱法)检测，然后在反应结束后，添加50ml蒸馏水(DW)并进行后处理(Rf值＝0.43，己烷:乙酸乙酯＝1:1)。
在收集有机层和通过硫化镁去除水分后，所述有机层通过硅胶柱层析(己烷:乙酸乙酯＝1:1)分离。从硅胶柱层析获得的物质进行浓缩，获得引入有马来酰亚胺的紫杉醇。
(2)巯基修饰的pep 98(巯基乙酰基-Ahx-NRGFKAGRNMRRKLFGVLRL)的合成
SEQ ID NO:1(PEP98)的肽根据固相肽合成的传统已知方法合成。更具体地，利用ASP48S(Peptron,Inc.,Daejeon ROK)，通过Fmoc固相肽合成(SPPS)从C端偶联每个氨基酸来合成所述肽。如下使用其第一个氨基酸在C端连接到树脂的那些肽:
(NH2-Leu-2-氯三苯甲基树脂)
用以合成肽的所有氨基酸在N端通过Fmoc保护，所述氨基酸残基通过能溶解在酸中的Trt、Boc、t-Bu、Pbf等保护。实例包括以下：
Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ahx-OH(Ahx＝6-氨基己酸，Fmoc-Ahx-OH被用来合成肽)。
作为偶联试剂，使用了HBTU[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯]/HOBt[N-羟基苯并三唑]/NMM[4-甲基吗啉]。
使用在20％DMF中的哌啶溶液以移除Fmoc。为了从残基上移除保护基或者将合成的肽从树脂上分离，使用了切割混合物[TFA(三氟乙酸)/EDT(乙二硫醇)/TIS(三异丙基硅烷)/H2O＝92.5/2.5/2.5/2.5]。
每个肽的合成通过使用固相支架以结合至具有氨基酸保护基的起始氨基酸，分别使对应的氨基酸反应，用溶剂冲洗和脱保护，并重复此过程。
在从树脂释放之上，合成的肽通过HPLC纯化，通过质谱验证，冻干，通过MS来验证合成，然后冻干。
通过高效液相色谱发现所制备的肽的纯度为95％以上。
具体合成过程可以如下：
1)偶联
用NH2-Leu-2-氯三苯甲基树脂保护的氨基酸(8当量)与融化于DMF中的偶联试剂HBTU(8当量)/HOBt(8当量)/NMM(16当量)一起混合，并在室温(RT)温育2小时。温育后，反应混合物依次用DMF、MeOH和DMF冲洗。
2)Fmoc脱保护
添加在20％DMF中的哌啶溶液并在RT温育5分钟，进行2次，然后依次用DMF、MeOH和DMF冲洗。
3)通过重复上述的反应1)和2)来制造肽的基本框架，Trt-巯基乙酰基-Ahx-N(Trt)-R(Pbf)-G-F-K(Boc)-A-G-R(Pbf)-N(Trt)-M-R(Pbf)-R(Pbf)-K(Boc)-L-F-G-V-L-R(Boc)-L-2-氯三苯甲基树脂。
4)切割:向完成合成的肽添加切割混合物，以此从树脂上切下肽。
5)将预冷的乙醚添加至获得的混合物中，然后离心以使收集的肽沉淀。
6)在通过Prep-HPLC纯化后，通过LC/MS确认分子量，并且冻干以制造成粉末形式。
(3)引入有马来酰亚胺的紫杉醇和巯基修饰的pep98的缀合物的合成
1)将合成的引入有马来酰亚胺的紫杉醇100mg(98mol，1当量)溶解到1mlDMSO中。
2)将合成的100mg巯基修饰的pep98(48mol，2当量)溶解到1ml DMSO中，然后将该溶液至步骤1)制备的溶液中。
3)添加2-3滴DIPEA(二异丙基乙基胺)至上述溶液中，然后所述溶液涡旋反应5分钟。
4)反应的终点通过Elman试剂检测，然后在黄色消失后，添加冷却的乙醚至混合物，复合物通过离心沉降。
5)在用Prep-HPLC纯化后，通过LC/MC确认，通过冻干制备粉末。
IV.抗癌药物和细胞穿透肽的缀合物的抗癌活性
实施例5:STAT3抑制剂(NSC 74859)和细胞穿透肽(pep98)的缀合物的抗癌活性的验认
(1)培养细胞系
使用与实施例2中描述的相同的细胞和细胞培养方法。
(2)验认抗癌活性
对于pep98、NSC 74859和NSC 74859-pep98的每个缀合物，测量癌细胞系和正常细胞系的剂量依赖性细胞凋亡。
通过预先接种在96孔板中以30％-40％提前24小时培养癌细胞和正常细胞后，用每种试剂处理，通过在24小时/48小时/72小时后显微镜分析预评估杀伤能力，通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴盐，一种黄色四唑)进行定量分析，72小时后测量其OD(光密度)值。
在仅用pep98处理的情况下，癌细胞的增殖没有表现出明显的降低，所以pep98本身不具有对癌细胞的细胞毒性活性(见图3)。
当仅以NSC 74859处理时，从50μM浓度开始在头颈细胞中杀伤癌细胞，在200μM浓度下几乎杀伤全部癌细胞。在正常细胞DPSC的情况下，NSC 74859在达100μM前都不杀伤细胞，但是在200μM浓度显示出细胞凋亡(见图4)。
相对而言，在pep98-NSC 74859情况下，在5μM浓度开始显示出细胞凋亡，然后在20μM浓度几乎全部癌细胞发生细胞凋亡。
同时，pep98-NSC 74859不杀伤正常细胞DPSC，虽然该綴合物在相同浓度杀伤几乎全部癌细胞(见图5)。
基于上述实施例的结果，证明NSC 74589-pep 98缀合物可以通过与pep 98结合被特异性引入癌细胞，NSC 74859的活性引起癌细胞凋亡，而与NSC 74859的缀合物可以在DPSC(正常细胞)情况下不引起正常细胞凋亡的浓度下完成癌细胞的凋亡，所以根据本发明的缀合物可以减少抗癌药物的副作用。
实施例5:紫杉醇和细胞穿透肽(pep98)的缀合物的抗癌活性的验证
(1)培养细胞系
使用与实施例2中描述的相同的细胞和细胞培养方法。
(2)验认抗癌活性
对于紫杉醇和紫杉醇-pep98缀合物，测量在癌细胞系中和正常细胞系中的剂量依赖性细胞凋亡。
在96孔板中制备各头颈瘤细胞系SNU-1041、SNU-1076、HN5、OSC-19后，在37℃温育箱中稳定处理24小时。其后，对紫杉醇(0μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM)和紫杉醇-pep98缀合物(0μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM)进行处理，进行MTT处理，在处理后3小时通过在570nm处测量光密度来监测细胞生长能力的变化。
在检查完结果后，在仅施用紫杉醇的情况下，在全部4种头颈瘤细胞系(SNU-1041、SNU-1076、HN5、OSC-19)中表现出在5μM-10μM浓度的癌细胞的凋亡(见图6)。
相反，在施用紫杉醇-pep98缀合物的情况下，在全部4种头颈瘤细胞系(SNU-1041、SNU-1076、HN5、OSC-19)中表现出在0.5μM浓度的癌细胞的凋亡(见图7)。
基于上述结果，可以特异性递送到癌细胞的紫杉醇-pep98缀合物的施用量小于仅施用紫杉醇的量。
所有的根据上述实施例的抗癌活性的验认结果表明，通过使用pep 98，小量的抗癌药物(例如STAT3抑制剂NSC 74859和紫杉醇)显示出抗癌有效性，而通过使用所述结果，可以实现抗癌药物的副作用的减少和增加的抗癌效率。
另外，可以预测，通过与pep 98缀合，小分子药物具有诸如NSC 74859等证明形式的小分子药物，例如靶向与炎症疾病相关的T淋巴细胞的抗炎药物、与表皮细胞增殖有关的皮肤疾病的药物、或如紫杉醇等从天然材料中提取的抗癌和抗炎药物，通过提高细胞穿透性而表现出更高的效率。
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Claims (5)

1.一种细胞穿透载体肽和活性成分的缀合物，其中所述肽为由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的肽，其中所述活性成分为用于治疗疾病的活性成分，且其中所述疾病为选自由以下疾病组成的组的疾病：胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、表皮样癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、皮肤表皮样癌以及以上病症的组合，其中所述活性成分是抗癌药物。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中所述抗癌药物为stat-3抑制剂。
3.如权利要求1所述的缀合物，其中所述抗癌药物为紫杉醇。
4.如权利要求1所述的缀合物，其中所述细胞穿透载体肽和所述活性成分通过共价键、非共价键或接头介导连接。
5.权利要求1至4中任一项所述的缀合物在制备用于治疗疾病的药物组合物中的应用，其中所述药物组合物用于治疗选自由以下疾病组成的组的疾病：胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、表皮样癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、皮肤表皮样癌以及以上病症的组合。
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