ES2650337T3 - Péptidos derivados de eEF2 para el tratamiento o prevención de cánceres - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres en un sujeto positivo para HLA-A*0201, en donde dicha composición farmacéutica comprende un péptido eEF2 que consiste en una secuencia de aminoácidos compuesta por aminoácidos contiguos derivados de una proteína eEF2, en donde la secuencia de aminoácidos se selecciona entre: (a) Leu Ile Leu Asp Pro Ile Phe Lys Val (SEQ ID NO:14); y (b) la secuencia de aminoácidos Leu Ile Leu Asp Pro Ile Phe Lys Val (SEQ ID NO:14) que tiene una sustitución del aminoácido Ile en la posición 2 por Leu o Met, y/o una sustitución del aminoácido Val en la posición 9 por Leu.
Description
esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer ductal pancreático, glioblastoma y linfoma maligno. En particular, se inhiben preferentemente el adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de estómago, cáncer de colon y linfoma maligno.
5 El ARNip desvelado en el presente documento es un ARNip bicatenario que contiene una cadena codificante y una cadena antisentido que se dirige a una secuencia de nucleótidos de un ARNm transcrito a partir de un gen de eEF2 humano. La secuencia de nucleótidos diana del ARNip puede ser una secuencia parcial de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1. El ARNip preferentemente es un ARNip bicatenario que consiste en la cadena codificante (SEQ ID NO:2) y la cadena antisentido (SEQ ID NO:3) que tiene las secuencias de ARN mostradas a continuación:
Cadena codificante de ARNip (SEQ ID NO:2); 5'-CAUGGGCAACAUCAUGAUCGAUCCUGUCCU-3'
Cadena antisentido de ARNip (SEQ ID NO:3); 5'-AGGACAGGAUCGAUCAUGAUGUUGCCCAUG-3'.
15 Aunque las secuencias de ARN preferidas de los ARNip son las secuencias anteriores mostradas en las SEQ ID NO:2 y 3, estas secuencias pueden tener una adición, deleción o sustitución de una, dos o tres bases. Además, estas secuencias pueden tener una sustitución, deleción, adición y/o inserción de 1 a 3, preferentemente de 1 o 2 bases y, más preferentemente, de una base. Las condiciones de hibridación, en este caso, son las condiciones existentes en un cuerpo vivo en caso de que se use el ARNip mediante su administración en un cuerpo vivo, y condiciones moderadamente rigurosas o muy rigurosas en caso de que se use el ARNip in vitro como reactivo. Estas condiciones incluyen, por ejemplo, unas condiciones de hibridación de NaCl 400 mM, PIPES pH 6,4 40 mM, EDTA 1 mM, a una temperatura de 50°C a 70°C durante un periodo de 12 a 16 horas. Además, la secuencia de la cadena codificante del ARNip tiene una homología de secuencia del 90% o mayor, preferentemente del 95% o mayor y, más preferentemente, del 95, 96, 97, 98 o 99% o mayor con una secuencia diana.
25 Además, el ARNip desvelado en el presente documento puede tener la adición de una secuencia saliente en el extremo 5’ o 3’. A este respecto, la secuencia saliente se refiere a una secuencia que sobresale añadida al extremo 5’ o 3’ de una secuencia bicatenaria que consiste en cadenas codificantes y antisentido emparejadas para aumentar la estabilidad del ARNip bicatenario. La secuencia saliente incluye, por ejemplo, una secuencia tal como AG, UA, AUG, UUG y AAGCUU desde el lado 5’, y puede usarse cualquier secuencia. En el ARNip bicatenario, preferentemente se añade UU al extremo 3’ de cadenas codificantes y antisentido. Además, el ARNip bicatenario anterior puede formar un ARNhc mediante la unión de dos ARNip a través de una secuencia de bucle.
El ARNip bicatenario puede prepararse por un método convencional para los expertos en la materia. Por ejemplo,
35 puede sintetizarse in vitro química o enzimáticamente, o sintetizarse in vivo. Preferentemente se usa un método de síntesis química. Después de sintetizar cada cadena por dicho método de síntesis, las cadenas pueden emparejarse en condiciones de emparejamiento convencionales. Cuando se usan, las cadenas pueden purificarse convenientemente cuando sea necesario. Además, el ARNip bicatenario puede prepararse en forma de un vector de expresión de ARNip que expresa las secuencias de ARN anteriores del ARNip (SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3). En este caso, por ejemplo, para la preparación, puede usarse el vector de expresión de ARNt-ARNhc, piGENE tRNA Pur (Clontech, Palo Alto, CA). No hay una limitación particular sobre la longitud del ARNip y, como ejemplo de un ARNip preferido, puede proporcionarse un ARNip de 15 a 50 unidades, como ejemplo más preferido, un ARNip de 20 a 40 unidades y, como ejemplo aún más preferido, un ARNip de 25 a 35 unidades (por ejemplo, 30 unidades). Por tanto, como ejemplo de un ARNip preferido, puede proporcionarse un ARNip bicatenario que puede hibridar con
45 la secuencia: 5’-CAUGGGCAACAUCAUGAUCGAUCCUGUCCU-3’ del ARNm de eEF2 y que tiene de 15 a 50 unidades, preferentemente de 20 a 40 unidades, más preferentemente de 25 a 35 unidades (por ejemplo, 30 unidades) de longitud de cada ARNip.
En general, se sabe que un ARNip se une a un ARNm de un gen diana en células en las que se introduce el ARNip e inhibe la expresión del ARNm. Por consiguiente, el ARNip bicatenario desvelado en el presente documento tiene la función de inhibir la expresión de un gen de eEF2, siendo capaz de esta manera de inhibir la proliferación celular en el sujeto en el que se introduce el ARNip. Los métodos para introducir o administrar el ARNip pueden ser los conocidos por los expertos en la materia tales como un método de fosfato cálcico usando un reactivo de transfección, un método de liposomas, un método sin liposomas, electroporación y un método de partículas
55 magnéticas. Como alternativa, puede adoptarse un método en el que el ARNip se integra en un vector de expresión de ARNip convencional y el vector se introduce por un método conocido como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, se introduce un vector de expresión de ARNip que expresa las secuencias de ARN anteriores del ARNip (SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3) por un método conocido. Además, el ARNip puede administrarse en forma de una composición farmacéutica como se describe más adelante.
Se desvela una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de cánceres, que comprende el ARNip bicatenario anterior como un principio activo. La composición farmacéutica puede contener un fármaco anticanceroso conocido como un principio activo, además del ARNip bicatenario anterior.
65 La composición farmacéutica puede contener un ARNip como principio activo en forma de un vector en el que está integrado el ARNip. Por ejemplo, el ARNip puede estar contenido en forma de un ARNip clonado en un vector de
7
5’-gcc tggccgagga catcgatgaa agcgtgg cttcctgtca cctcgcc tttatcgatg tcctcggcca ggc-3’ (SEQ ID NO:20); 5’-actcaac cataacactt gataccattt gtt cttcctgtca aag aaacggcatc aagtgttatg gttgagt-3’ (SEQ ID NO:22); 3’-cgg accggctcct gtagctactt tcgcacc gaaggacagt ggagcgg aaatagctac aggagccggt ccg-5’ (SEQ ID NO:21); o 3’-tgagttg gtattgtgaa ctatggtaaa caa gaaggacagt ttc tttgccgtag ttcacaatac caactca-5’ (SEQ ID NO:23).
5 La secuencia de ADN o la secuencia de ARN anteriores pueden tener una adición, deleción o sustitución de 1, 2 o 3 bases. Como alternativa, la secuencia descrita en el presente documento puede tener una homología del 90% o mayor, preferentemente del 95% o mayor y, más preferentemente, del 95, 96, 97, 98 o 99% o mayor con la secuencia de ADN o secuencia de ARN anteriores. A este respecto, la homología, las condiciones de hibridación y la longitud del ARNip son como se han descrito anteriormente. Además, la secuencia de ADN o la secuencia de ARN anteriores pueden tener una adición, deleción, sustitución y/o inserción de 1, 2 o 3 bases.
El ARNhc o el ARNip desvelados en el presente documento pueden prepararse por un método convencional para los expertos en la materia. Por ejemplo, puede sintetizarse in vitro química o enzimáticamente, o sintetizarse in vivo.
15 Además, el ARNhc o ARNip pueden prepararse en forma de un vector de expresión de ARNhc o un vector de expresión de ARNip que contiene una secuencia de ADN como se ha mostrado en las SEQ ID NO:20 o 22 anteriores. En este caso, por ejemplo, para la preparación, puede usarse el vector de expresión de ARNt-ARNhc, piGENE tRNA Pur (Clontech, Palo Alto, CA).
Los métodos para introducir o administrar el ARNhc o ARNip desvelados en el presente documento pueden ser los conocidos por los expertos en la materia, tales como un método de fosfato cálcico usando un reactivo de transfección, un método de liposomas, un método sin liposomas, electroporación y un método de partículas magnéticas. Como alternativa, puede adoptarse un método en el que el ARN se integra en un vector de expresión de ARNip convencional y el vector se introduce por un método conocido como se ha descrito anteriormente. El ARNhc o
25 ARNip puede administrarse en forma de una composición farmacéutica como se describe más adelante.
Se desvela una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de cánceres, que comprende el ARNhc o ARNip anterior como un principio activo. La composición farmacéutica también puede contener un fármaco anticanceroso conocido.
La composición farmacéutica puede contener un ácido nucleico que codifica el ARNhc o ARNip descrito anteriormente (por ejemplo, un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO:20 o 22) como principio activo. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser uno en el que el ácido nucleico que contiene dicha secuencia de ADN está integrado en un vector de expresión de ARNhc o vector de expresión de ARNip
35 disponibles en el mercado. Por tanto, en el presente documento se desvela un ácido nucleico que codifica el ARNhc descrito anteriormente y un vector que contiene el ácido nucleico.
La composición farmacéutica desvelada en el presente documento puede contener vehículos y aditivos convencionales farmacéuticamente aceptables. La forma de dosificación de la composición farmacéutica puede ser la administración oral o la administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, administración intradérmica, administración subcutánea, administración intramuscular, administración intranasal o administración oral). Además, la cantidad eficaz del ARNhc o ARNip administrada a través de la composición farmacéutica puede determinarse dependiendo de condiciones de los sujetos tales como, por ejemplo, peso, edad, sexo y estado de salud de los sujetos, así como cantidad de alimento, frecuencia de administración, método de administración,
45 cantidad de excreción y gravedad de la enfermedad.
En otro aspecto, se desvela un método para el tratamiento o prevención de cánceres, que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica anterior a un sujeto. Los cánceres a tratar o prevenir pueden ser cualquier cáncer siempre que exprese una proteína eEF2 e incluyen, por ejemplo, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer de células escamosas de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer ductal pancreático, glioblastoma y linfoma maligno.
En otro aspecto adicional, se desvela el uso del ARNhc o ARNip anteriores para la producción de un producto 55 farmacéutico para el tratamiento o prevención de cánceres.
En un aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un péptido que contiene aminoácidos contiguos derivados de una proteína eEF2. Son ejemplos del péptido, péptidos que contienen una secuencia de aminoácidos como la descrita más adelante o péptidos que consisten en la secuencia de aminoácidos descrita más adelante. Preferentemente, estos péptidos tienen capacidad de unión a una molécula de HLA. Además, estos péptidos preferentemente inducen una actividad citotóxica. Además, estos péptidos son péptidos eEF2 restringidos para HLAA*0201. Además, estos péptidos preferentemente tienen una longitud de 9 a 30 aminoácidos. Además, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de cánceres, que comprende estos péptidos, y el uso de estos péptidos para la producción de un producto farmacéutico para el
65 tratamiento o prevención de cánceres.
9
anteriores. A este respecto, sin embargo, es esencial que todos los péptidos anteriores conserven la capacidad de unión a la molécula de HLA-A*0206. En la presente memoria descriptiva, un péptido que conserva la capacidad de unión a HLA-A*0206 se denomina péptido eEF2 restringido para HLA-A*0206. Además, el péptido eEF2 restringido para HLA-A*0206 puede tener una acción que aumenta la actividad del interferón-γ. Además,
5 los péptidos anteriores pueden usarse para un sujeto distinto del sujeto positivo para HLA-A*0206. Por consiguiente, en el presente documento se desvela un péptido que contiene una cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores y una composición farmacéutica que contiene el péptido.
Tabla 1
- Número de péptido candidato
- Secuencia de aminoácidos Número de resto de iniciación (número de resto de aminoácido en la SEQ ID NO:1)
- 1
- LILDPIFKV (SEQ ID NO:14) 292
- 2
- RLMEPIYLV (SEQ ID NO:8) 739
- 3
- KLVEGLKRL (SEQ ID NO:9) 519
- 4
- YLNEIKDSV (SEQ ID NO:10) 671
- 5
- ILTDITKGV (SEQ ID NO:11) 661
- 6
- LMMYISKMV (SEQ ID NO:12) 394
- 7
- KLPRTFCQL (SEQ ID NO:13) 284
- 8
- GLHGWAFTL (SEQ ID NO:50) 217
- 9
- GLVGVDQFL (SEQ ID NO:51) 471
- 10
- WLPAGDALL (SEQ ID NO:52) 343
- 11
- VVVDCVSGV (SEQ ID NO:53) 127
- 12
- AIAERIKPV (SEQ ID NO:54) 146
- 13
- IMIDPVLGT (SEQ ID NO:55) 203
- 14
- RLAKSDPMV (SEQ ID NO:56) 526
- 15
- GLVSTGLKV (SEQ ID NO:57) 419
Tabla 2
- Número de péptido candidato
- Secuencia de aminoácidos Número de resto de iniciación (número de resto de aminoácido en la SEQ ID NO:1)
- 16
- LVGVDQFLA (SEQ ID NO: 58) 472
- 17
- KMDRALLEL (SEQ ID NO: 59) 159
- 18
- FVVKAYLPV (SEQ ID NO: 60) 782
- 19
- TILMMGRYV (SEQ ID NO: 61) 450
- 20
- NLIDSPGHV (SEQ ID NO: 62) 101
- 21
- ALDNFLDKL (SEQ ID NO: 63) 850
- 22
- CLYASVLTA (SEQ ID NO: 64) 728
- 23
- LLQMITIHL (SEQ ID NO: 65) 350
- 24
- QVAGTPMFV (SEQ ID NO: 66) 775
- 25
- VVAGFQWAT (SEQ ID NO: 67) 679
- 26
- LMMNKMDRA (SEQ ID NO: 68) 155
- 27
- NMRVMKFSV (SEQ ID NO: 69) 696
- 28
- NMRVMKFSV (SEQ ID NO: 70) 493
- 29
- AIMDKKANI (SEQ ID NO: 71) 11
- 30
- CVFDWQIL (SEQ ID NO: 72) 812
Tabla 3
- Número de péptido candidato
- Secuencia de aminoácidos Número de resto de iniciación (número de resto de aminoácido en la SEQ ID NO:1)
- 31
- GIPALDNFL (SEQ ID NO: 73) 847
- 32
- VLNRKRGHV (SEQ ID NO: 74) 762
- 33
- MMGRYVEPI (SEQ ID NO: 75) 453
11 Tabla 4
- Número de péptido candidato
- Secuencia de aminoácidos Número de resto de iniciación (número de resto de aminoácido en la SEQ ID NO:1)
- 34
- FLVKTGTIT (SEQ ID NO: 76) 478
- 35
- QVVGGIYGV (SEQ ID NO: 77) 754
- 36
- RVTDGALVV (SEQ ID NO: 78) 120
- 37
- FQWATKEGA (SEQ ID NO: 79) 683
- 38
- VAGTPMFVV (SEQ ID NO: 80) 776
- 39
- GLKEGIPAL (SEQ ID NO: 81) 843
- 40
- SVLTAQPRL (SEQ ID NO: 82) 732
- 41
- PMFVVKAYL (SEQ ID NO: 83) 780
- 42
- VMKFSVSPV (SEQ ID NO: 84) 496
- 43
- WAFTLKQFA (SEQ ID NO: 85) 221
- 44
- FEHAHNMRV (SEQ ID NO: 86) 488
- 45
- KQFAEMYVA (SEQ ID NO: 87) 226
- Número de péptido candidato
- Secuencia de aminoácidos Número de resto de iniciación (número de resto de aminoácido en la SEQ ID NO:1)
- 46
- RVFSGLVST (SEQ ID NO: 88) 415
- 47
- RIVENVNVI (SEQ ID NO: 89) 180
- 48
- MMNKMDRAL (SEQ ID NO: 90) 156
- 49
- EMYVAKFAA (SEQ ID NO: 91) 230
- 50
- FSVSPVVRV (SEQ ID NO: 92) 499
- 51
- ELYQTFQRI (SEQ ID NO: 93) 173
- 52
- SVVAGFQWA (SEQ ID NO: 94) 678
- 53
- IMNFKKEET (SEQ ID NO: 95) 304
- 54
- GALVVVDCV (SEQ ID NO: 96) 124
- 55
- KVEDMMKKL (SEQ ID NO: 97) 252
- 56
- RNMSVIAHV (SEQ ID NO: 98) 20
- 57
- KANIRNMSV (SEQ ID NO: 99) 16
- 58
- TVSEESNVL (SEQ ID NO: 100) 582
- 59
- GVCVQTETV (SEQ ID NO: 101) 134
- 60
- DITKGVQYL (SEQ ID NO: 102) 664
Tabla 5
- Número de péptido candidato
- Secuencia de aminoácidos Número de resto de iniciación (número de resto de aminoácido en la SEQ ID NO:1)
- 61
- AVMRRWLPA (SEQ ID NO: 103) 338
- 62
- FSSEVTAAL (SEQ ID NO: 104) 111
- 63
- KLWGDRYFD (SEQ ID NO: 105) 259
- 64
- LEPEELYQT (SEQ ID NO: 106) 169
- 65
- GVDQFLVKT (SEQ ID NO: 107) 474
- 66
- FTLKQFAEM (SEQ ID NO: 108) 223
- 67
- AEMYVAKFA (SEQ ID NO: 109) 229
- 68
- FTADLRSNT (SEQ ID NO: 110) 796
- 69
- MIDPVLGTV (SEQ ID NO: 111) 204
- 70
- YLPVNESFG (SEQ ID NO: 112) 787
- 71
- NPADLPKLV (SEQ ID NO: 113) 513
- 72
- GPAERAKKV (SEQ ID NO: 114) 245
12 Tabla 6
- Número de péptido candidato
- Secuencia de aminoácidos Número de resto de iniciación (número de resto de aminoácido en la SEQ ID NO:1)
- 73
- DLPKLVEGL (SEQ ID NO: 115) 516
- 74
- MVNFTVDQI (SEQ ID NO: 116) 1
- 75
- GGQAFPQCV (SEQ ID NO: 117) 805
- Número de péptido candidato
- Secuencia de aminoácidos Número de resto de iniciación (número de resto de aminoácido en la SEQ ID NO:1)
- 76
- VLTAQPRLM (SEQ ID NO: 118) 733
- 77
- SGLHGWAFT (SEQ ID NO: 119) 216
- 78
- ITIHLPSPV (SEQ ID NO: 120) 354
- 79
- KSTLTDSLV (SEQ ID NO: 121) 32
- 80
- GELHLEICL (SEQ ID NO: 122) 550
- 81
- CITIKSTAI (SEQ ID NO: 123) 67
- 82
- SEVTAALRV(SEQ ID NO: 124) 113
- 83
- FTVDQIRAI (SEQ ID NO: 125) 4
- 84
- AQPRLMEPI (SEQ ID NO: 126) 736
- 85
- YLAEKYEWD (SEQ ID NO: 127) 634
- 86
- KIWCFGPDG (SEQ ID NO: 128) 648
- 87
- GTVGFGSGL (SEQ ID NO: 129) 210
- 88
- VEIQCPEQV (SEQ ID NO: 130) 747
- 89
- KNPADLPKL (SEQ ID NO: 131) 512
- 90
- GVRFDVHDV (SEQ ID NO: 132) 699
Tabla 7
- Número de péptido candidato
- Secuencia de aminoácidos Número de resto de iniciación (número de resto de aminoácido en la SEQ ID NO:1)
- 91
- TTFEHAHNM (SEQ ID NO: 133) 486
- 92
- GNIVGLVGV (SEQ ID NO: 134) 467
- 93
- IIPTARRCL (SEQ ID NO: 135) 721
- 94
- PLMMYISKM (SEQ ID NO: 136) 393
- 95
- GQLGPAERA (SEQ ID NO: 137) 242
- 96
- LKQFAEMYV (SEQ ID NO: 138) 225
- 97
- MGNIMIDPV (SEQ ID NO: 139) 200
- 98
- KVFDAIMNF (SEQ ID NO: 140) 299
- 99
- MEPIYLVEI (SEQ ID NO: 141) 741
5 El péptido usado en la presente invención procede de una proteína eEF2 y puede consistir en la secuencia de aminoácidos contiguos anterior o en una secuencia modificada de la misma, o contener dicha secuencia. En caso de que el péptido contenga la secuencia de aminoácidos anterior, no hay una limitación particular sobre la longitud del péptido y el péptido puede tener cualquier longitud. Son ejemplos preferidos del péptido que contiene la secuencia
10 de aminoácidos contiguos anterior, péptidos que tienen de 9 a 30 aminoácidos, preferentemente, péptidos que tienen de 9 a 15 aminoácidos y, más preferentemente, péptidos que tienen de 9 a 12 aminoácidos. Por tanto, el péptido usado en la presente invención puede ser, por ejemplo, el propio péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos anterior o una proteína eEF2 que contiene la secuencia de aminoácidos anterior o una parte de la misma. En un péptido usado en la presente invención, también pueden estar unidas una diversidad de sustancias a
15 un extremo N y/o un extremo C del péptido que contiene la secuencia de aminoácidos anterior. Por ejemplo, pueden estar unidos al péptido aminoácidos, péptidos y análogos de los mismos. En caso de que estas sustancias estén unidas al péptido de la presente invención, se tratan, por ejemplo, por una enzima presente en el cuerpo o mediante un proceso tal como un procesamiento intracelular, y finalmente se produce un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos anterior. El péptido se presenta en la superficie celular como un complejo con una molécula de HLA
20 A*0201, siendo capaz de producir, de esta manera, un efecto de inducción de linfocitos T citotóxicos (CTL). Estas sustancias pueden ser sustancias que regulan la solubilidad del péptido usado en la presente invención o que
13
mejoran la estabilidad del péptido (por ejemplo, efecto de resistencia a proteasas) o, por ejemplo, que liberan específicamente un péptido usado en la presente invención en un tejido u órgano determinado, o que tienen una acción potenciadora de la eficacia de captación de células presentadoras de antígeno. Además, estas sustancias pueden ser una sustancia que aumenta la capacidad de inducir los CTL, por ejemplo, un péptido auxiliar.
5 El péptido usado en la presente invención puede sintetizarse usando un método usado habitualmente en esta técnica o un método modificado del mismo. Dicho método sintético se describe, por ejemplo, en Peptide Synthesis, Interscience, Nueva York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., Nueva York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen Company Ltd., 1975; Basis and Experiment of Peptide Synthesis, Maruzen Company Ltd., 1985; Development of Medicine, Sequel, Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten Co., 1991.
Además, el péptido usado en la presente invención puede prepararse usando una técnica de ingeniería genética basándose en la información sobre una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido usado en la presente invención. Dicha técnica de ingeniería genética es bien conocida por los expertos en la materia.
15 La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de cánceres, que comprende el péptido eEF2 anterior. Como el gen de eEF2 tiene una alta expresión, por ejemplo, en adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer ductal pancreático, glioblastoma maligno, linfoma maligno y cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, la composición farmacéutica de la presente invención puede usarse para el tratamiento o prevención de cánceres que expresan el gen de eEF2. Cuando la composición farmacéutica de la presente invención se administra a un sujeto positivo para HLA-A*0201, se inducen CTL específicos para eEF2 por un péptido eEF2 restringido para HLA-A*0201 contenido en la composición farmacéutica, y dichos CTL reducen las células cancerosas en el sujeto.
25 La composición farmacéutica de la presente invención puede contener, por ejemplo, vehículos y excipientes, además del péptido eEF2 anterior como principio activo. Como el péptido eEF2 restringido para HLA-A*0201 contenido en la composición farmacéutica de la presente invención induce CTL específicos para eEF2, la composición farmacéutica de la presente invención puede contener un coadyuvante adecuado o puede administrarse junto con un coadyuvante adecuado para mejorar su eficacia de inducción. Son coadyuvantes preferidos, por ejemplo, un coadyuvante completo o incompleto de Freund e hidróxido de aluminio. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede contener un péptido conocido, por ejemplo, péptido WT1, como principio activo, además del péptido eEF2 anterior.
El método de administración de la composición farmacéutica de la presente invención puede seleccionarse
35 convenientemente dependiendo de condiciones tales como los tipos de enfermedades, el estado de los sujetos y los sitios diana. El método puede ser, por ejemplo, administración intradérmica, administración subcutánea, administración intramuscular, administración intravenosa, administración intranasal o administración oral. Además, el método puede ser una terapia de linfocitos o una terapia de DC (células dendríticas). La cantidad de péptido contenido en la composición farmacéutica de la presente invención, la forma de dosificación de la composición farmacéutica y el número de dosis pueden seleccionarse convenientemente dependiendo de condiciones tales como los tipos de enfermedades, el estado de los sujetos y los sitios diana. La cantidad de péptido administrado por dosis habitualmente es de 0,0001 mg a 1000 mg y, preferentemente, de 0,001 mg a 10.000 mg.
Además se desvela un método para el tratamiento o prevención de cánceres, que comprende administrar una
45 cantidad eficaz de la composición farmacéutica anterior a un sujeto positivo para HLA-A*2402 o un sujeto positivo para HLA-A*0201. Los cánceres a tratar o prevenir pueden ser cualquier cáncer e incluyen, por ejemplo, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de células escamosas de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer ductal pancreático, glioblastoma y linfoma maligno.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere al uso de un péptido eEF2 para la producción de la composición farmacéutica anterior.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un polinucleótido que codifica el péptido eEF2 anterior
55 (denominado también en lo sucesivo polinucleótido de eEF2). El polinucleótido de la presente invención puede ser un ADN o un ARN. La secuencia de bases del polinucleótido de la presente divulgación puede determinarse basándose en la secuencia de aminoácidos del péptido eEF2 anterior. El polinucleótido anterior puede prepararse, por ejemplo, por un método de síntesis de ADN o ARN y un método de PCR.
También se desvela un vector de expresión que contiene el polinucleótido anterior (también denominado en lo sucesivo vector de expresión de eEF2). Los tipos de vectores de expresión, secuencias contenidas además de la secuencia de polinucleótido anterior, pueden seleccionarse convenientemente dependiendo de los tipos de hospedadores en los que se introduce el vector de expresión y el objetivo de la introducción del vector de expresión. El vector de expresión puede administrarse a un sujeto para producir un péptido eEF2 en un cuerpo vivo y para
65 inducir CTL específicos para eEF2. Los CTL afectan a células tumorales de órganos hematopoyéticos y a células de tumores sólidos en un sujeto, permitiendo de esta manera el tratamiento o prevención de tumores de órganos
14
- NetMHC3.0
- Número de resto de iniciación
- Afinidad (nM) Nivel de unión Puntuación logarítmica
- 78
- 1958 0,299
- 412
- 2551 0,275
- 231
- 2665 0,271
- 729
- 2691 0,270
- 744
- 2829 0,265
- 73
- 3045 0,259
- 70
- 4080 0,232
- 644
- 4396 0,225
- 701
- 5322 0,207
- 759
- 6139 0,194
- 638
- 6593
- 602
- 6673
- 396
- 7134
- 284
- 7142
- 774
- 7954
- 736
- 8076
- 442
- 8141
- 290
- 8704
- 394
- 8917
- 300
- 8973
- 456
- 9299
- 227
- 9749
- 180
- 9862
- 578
- 9900
- 264
- 10704
- 491
- 11038
- 529
- 11225
- 293
- 12329
- 811
- 12728
- 299
- 12938
- Rankpep
- Número de resto de iniciación
- Puntuación
- 714
- 9,556
- 78
- 9,315
- 412
- 8,827
- 443
- 8,652
- 364
- 8,246
- 456
- 8,229
- 213
- 8,072
- 605
- 7,603
- 265
- 7,401
- 363
- 7,190
- 491
- 7,188
- 177
- 6,847
- 442
- 6,419
- 73
- 6,112
- 850
- 6,015
- 293
- 5,071
- 166
- 4,961
- 763
- 4,815
- 670
- 4,451
- 290
- 4,265
- 285
- 4,229
- 90
- 4,062
- 335
- 4,016
- 396
- 3,935
- 453
- 3,878
- 289
- 3,877
- 1
- 3,85
- 744
- 3,694
- 649
- 3,487
- 38
- 3,281
- SYFPEITHI
- Número de resto de iniciación
- Puntuación
- 512
- 15
- 516
- 15
- 594
- 15
- 73
- 14
- 252
- 14
- 284
- 14
- 328
- 14
- 343
- 14
- 434
- 14
- 442
- 14
- 456
- 14
- 491
- 14
- 509
- 14
- 537
- 14
- 657
- 14
- 62
- 13
- 70
- 13
- 92
- 13
- 95
- 13
- 111
- 13
- 180
- 13
- 191
- 13
- 201
- 13
- 228
- 13
- 258
- 13
- 277
- 13
- 293
- 13
- 296
- 13
- 299
- 13
- 307
- 13
El número de resto de iniciación es el número mostrado en la SEQ ID NO:1. Todos los péptidos eEF2 candidatos están compuestos por 9 restos de aminoácidos. Por ejemplo, un péptido que tiene el número de resto de iniciación de 786 es un péptido compuesto por 9 restos de aminoácido desde el resto A de la posición 786ª hasta el resto F de 5 la posición 794ª en la SEQ ID NO:1.
A continuación, se analizó exactamente la capacidad de unión a una molécula de HLA-A2402 por un ensayo de estabilización de MHC. En resumen, Se incubaron células T2-2402 (1 x 106 células), que recibieron la expresión forzada de una molécula de HLA-A*2402 humana, que no tenían capacidad de presentación de antígenos a una 10 molécula de HLA, en un medio RPMI1640 que contenía una concentración 10 µM de un péptido sintetizado y que no contenía suero a 27°C durante 16 horas y después se dejaron en reposo a 37°C durante 3 horas. Como la expresión de una molécula de HLA-A24 en la superficie celular se estabiliza por la unión de un péptido, se analizó la expresión de la molécula de HLA-A24 en una superficie celular después del tratamiento con cada péptido por citometría de flujo y se evaluó la capacidad de unión de cada péptido a la molécula de HLA-A2402. Como resultado, se descubrió
15 que los péptidos eEF2409-417 (SEQ ID NO:4), eEF2412-420 (SEQ ID NO:5), eEF2701-709 (SEQ ID NO:6) y eEF2786-794 (SEQ ID NO:7) muestran capacidad de unión a la molécula de HLA-A2402 (Tabla 11).
Tabla 11
- Identificación de péptido eEF2 restringido para HLA-A2402
- Péptido eEF2
- Capacidad de unión a molécula de HLA-A2402
- eEF2409-417
- +
- eEF2412-420
- +
- eEF2701-709
- +
- eEF2786-794
- +
Determinación de Actividad de Interferón
5 Se incubaron células T junto con células T2 que expresaban moléculas de HLA-A*2402 sometidas a pulsos de péptidos eEF2 (péptidos eEF2409-417, eEF2412-420 y eEF2701-709) en presencia de brefeldin A (Sigma) a 37°C durante 5 horas. Tras el lavado con PBS, se tiñeron las moléculas de CD3 y CD8, que son antígenos de la superficie celular, por anticuerpos anti-CD3 conjugados con PerCP (BD Biosciences) anti-CD8 conjugados con PE (Caltag, Burlingame, CA) en hielo durante 15 minutos. Posteriormente, las células se fijaron usando Cytofix (BD Biosciences)
10 en hielo durante 20 minutos y el IFN-γ intracelular se hizo reaccionar con un anticuerpo anti-IFN-γ conjugado con FITC (BD Biosciences) en hielo durante 30 minutos. La frecuencia de células positivas para IFN-γ presentes en células T positivas para CD8 se analizó usando un citómetro de flujo. Como resultado, se descubrió que los péptidos eEF2409-417, eEF2412-420 y eEF2701-709 aumentan la actividad del interferón-γ y, por lo tanto, representan un péptido restringido para HLA-A*2402 (Fig. 30).
15 Afinidad de unión de péptidos EEF2 de tipo modificado a la molécula de HLA-A*2402
Además, se predijo como se ha descrito anteriormente la afinidad de unión de péptidos eEF2 de tipo modificado, en los que un aminoácido en la posición 2 (denominado también en lo sucesivo P2) y/o en la posición 9 (denominado
20 también en lo sucesivo P9) en las secuencias de aminoácidos de los péptidos eEF2786-794 (SEQ ID NO:7) y eEF2409417 (SEQ ID NO:4) entre los péptidos anteriores se había cambiado por otro aminoácido. (Tabla 12: Predicción de afinidad de unión de péptidos eEF2786-794 de tipo modificado (SEQ ID NO:25 y 26) a la molécula de HLA-A*2402)
Tabla 12
Péptido Nivel de Puntuación
Secuencia de aminoácidos Unión Puntuación
candidato unión logarítmica 786 AYLPVNESF 20 SB 0,721 14,930 AYLPVNESI (SEQ ID NO:
786 I 43 SB 0,652 15,164
25) AYLPVNESL (SEQ ID NO:
786 L 143 WB 0,541 14,547
25)
(Tabla 13: Predicción de afinidad de unión de péptidos eEF2409-417 de tipo modificado (SEQ ID NO:27 y 31) a la molécula de HLA-A*2402)
Tabla 13
- Péptido candidato
- Secuencia de aminoácidos Unión Nivel de unión Puntuación logarítmica Puntuación
- 409
- RFYAFGRVF 0,365 10,641
- Y
- 409 RFYAFGRVF(SEQ ID NO: 27) SB 0,641 15,653
- 409
- I RFYAFGRVI(SEQ ID NO: 28) 0,252 10,875
- Y
- 409 I RFYAFGRVI(SEQ ID NO: 29) WB 0,556 15,887
- 409
- L RFYAFGRVL(SEQ ID NO: 30) 0,164 10,258
- Y
- 409 L RFYAFGRVL(SEQ ID NO: 31) WB 0,434 15,270
Como el péptido eEF2786-794 (SEQ ID NO:7) tiene Y en P2 y F en P9 e Y y F son restos de anclaje, no se reconocía mejora de la afinidad de unión aunque el resto original se cambiara por otro resto (Tabla 12). Por otra parte, se reconoció una mejora notable de la afinidad de unión en el péptido eEF2409-417 (SEQ ID NO:4) cuando el resto en P2 se cambia por el resto de anclaje Y (Tabla 13).
Inducción de linfocitos T citolíticos específicos de EEF2
A partir de células mononucleares de sangre periférica obtenidas de un donante que tenía moléculas de HLAA*2402, se retiraron células Treg CD4+ CD25+ usando MicroBeads CD25 (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). 40 Posteriormente, se aislaron monocitos del donante usando el kit de aislamiento BD IMag CD14 (BD Bioscience) y se
- eEF2671-679 (SEQ ID NO:10)
- YLNEIKDSV 522,71 89,6
- eEF2661-669 (SEQ ID NO:11)
- ILTDITKGV 828,16 200,4
- eEF2394-402 (SEQ ID NO:12)
- LMMYISKMV 448,41 62,6
- eEF2284-292 (SEQ ID NO:13)
- KLPRTFCQL 448,82 62,8
Determinación de Actividad de Interferón
Se incubaron células T junto con células T2 que expresaban moléculas de HLA-A*0201 sometidas a pulsos de
5 péptidos eEF2 restringidos para HLA-A*0201 en presencia de brefeldin A (Sigma) a 37°C durante 5 horas. Tras el lavado con PBS, se tiñeron las moléculas de CD3 y CD8, que son antígenos de la superficie celular, por anticuerpos anti-CD3 conjugados con PerCP (BD Biosciences) anti-CD8 conjugados con PE (Caltag, Burlingame, CA) en hielo durante 15 minutos. Posteriormente, las células se fijaron usando Cytofix (BD Biosciences) en hielo durante 20 minutos y el IFN-γ intracelular se hizo reaccionar con un anticuerpo anti-IFN-γ conjugado con FITC (BD Biosciences)
10 en hielo durante 30 minutos. La frecuencia de células positivas para IFN-γ presentes en células T positivas para CD8 se analizó usando un citómetro de flujo. Se usó un péptido eEF2739-747 en la Fig. 11 y un péptido eEF2661-669 en la Fig. 12. Como resultado, se descubrió que los péptidos eEF2661-669 (SEQ ID NO:11) y eEF2739-747 (SEQ ID NO:8) aumentan la actividad del interferón-γ (Figs. 11 y 12).
15 Determinación de actividad citotóxica
A continuación, se realizó la evaluación de si los seis péptidos candidatos [eEF2739-747 (SEQ ID NO:8), eEF2519-527 (SEQ ID NO:9), eEF2671-679 (SEQ ID NO:10), eEF2661-669 (SEQ ID NO:11), eEF2394-402 (SEQ ID NO:12) y eEF2284-292 (SEQ ID NO:13), exceptuando eEF2292-300 (SEQ ID NO:14)] seleccionados como se ha descrito anteriormente tienen 20 actividad citotóxica. Los experimentos se realizaron más o menos del mismo modo que en el Ejemplo 3 anterior. Por tanto, se extrajo sangre de donantes sanos que tenían una molécula de HLA-A*0201, se separaron células mononucleares de sangre periférica y la primera estimulación se realizó usando los seis péptidos candidatos (estimulador: auto-PBMC). Posteriormente, la estimulación de péptidos el segundo día y posteriormente se realizó a intervalos de 8 a 13 días (estimulador: alo B-LCL 3 mg/ml). Además, se añadió IL-2 cada dos días después de la
25 segunda estimulación a una concentración final de 20 UI/ml. La citotoxicidad se midió 6 días después de la estimulación final de péptido. Como resultado, se observó un aumento de la actividad citotóxica en los 6 péptidos anteriores (Figs. 16 a 21). A partir del hecho anterior, se descubrió que los 6 péptidos anteriores [eEF2739-747 (SEQ ID NO:8), eEF2519-527 (SEQ ID NO:9), eEF2671-679 (SEQ ID NO:10), eEF2661-669 (SEQ ID NO:11), eEF2394-402 (SEQ ID NO:12) y eEF2284-292 (SEQ ID NO:13)] se unen a la molécula de HLA-A*0201 y tienen actividad citotóxica.
30 A continuación, se realizó un evaluación de si los 6 péptidos anteriores y el péptido eEF2292-300 (SEQ ID NO:14) pueden unirse a una molécula de HLA-A*0206 y producir interferón-γ. Los experimentos se realizaron del mismo modo que en el método anterior, con la excepción de que se usaron donantes que tenían la molécula de HLAA*0206. Como resultado, se descubrió que todos los péptidos ensayados aumentan la producción de interferón-γ
35 (Fig. 29).
Afinidad de unión de péptidos EEF2 de tipo modificado a la molécula de HLA-A*0201
A continuación, se predijo la afinidad de unión de péptidos eEF2 de tipo modificado, en los que se había cambiado
40 un aminoácido en posición 2 y/o posición 9 en los 6 péptidos anteriores (eEF2739-747, eEF2519-527, eEF2671-679, eEF2661-669, eEF2394-402 y eEF2284-292) así como en el péptido eEF2292-300 (SEQ ID NO:14) por otro aminoácido, usando un programa como se ha descrito anteriormente (Tablas 15 a 21).
Tabla 15 45 Predicción de afinidad de unión de péptido eEF2739-747 (SEQ ID NO:8) de tipo modificado (SEQ ID NO:32 a 34) a moléculas de HLA-A*0201 usando dos programas (NetMHC3.0 y ProPred) Péptido Secuencia de aminoácidos NetMHC3.0 ProPred
Nivel
Afinidad Puntuación Puntuación Puntuación
de
(nM) logarítmica real logarítmica
unión
- eEF2739-747
- RLMEPIYLV 3 SB 0,880 2426,739 7,7943
- eEF2739-747 2M
- RMMEPIYLV (SEQ ID NO:32) 3 SB 0,897 1752,645 7,4689
- eEF2739-747 9L
- RLMEPIYLL (SEQ ID NO:33) 4 SB 0,860 745,355 6,6139
- eEF2739-747 2M9L
- RMMEPIYLL (SEQ ID NO:34) 3 SB 0,877 538,312 6,2884
Tabla 16
Predicción de afinidad de unión de péptido eEF2519-527 (SEQ ID NO:9) de tipo modificado (SEQ ID NO:35 a 37) a moléculas de HLA-A*0201 usando dos programas (NetMHC3.0 y ProPred) Secuencia de
Péptido NetMHC3.0 ProPred
aminoácidos
Puntuación Puntuación Puntuación
Unión
Afinidad
logarítmica real logarítmica
(nM)
nivel
eEF2519-527 KLVEGLKRL 289 WB 0,476 705,066 6,5583 eEF2519-KMVEGLKRL (SEQ ID
201 WB 0,510 509,214 6,2329
5272M NO: 35) eEF2519-KLVEGLKRV (SEQ ID
178 WB 0,521 2295,564 7,7387
5279V NO: 36) eEF2519-KMVEGLKRV (SEQ ID
112 WB 0,563 1657,907 7,41335272M9V NO: 37)
Tabla 17 Predicción de afinidad de unión de péptido eEF2671-679 (SEQ ID NO:10) de tipo modificado (SEQ ID NO:38 a 40) a moléculas de HLA-A*0201 usando dos programas (NetMHC3.0 y ProPred)
Secuencia de
Péptido NetMHC3.0 ProPred
aminoácidos
Afinidad Nivel de Puntuación Puntuación Puntuación (nM) unión logarítmica real logarítmica
eEF2671-679 YLNEIKDSV 11 SB 0,778 642,758 6,4658 eEF2671-YMNEIKDSV (SEQ
10 SB 0,780 464,214 6,1403
6792M ID NO: 38) eEF2671-YLNEIKDSL (SEQ ID
20 SB 0,723 197,418 5,2853
6799L NO: 39) eEF2671-6792 YMNEIKDSL (SEQ ID
21 SB 0,718 142,580 4,9599M9L NO: 40)
Tabla 18 Predicción de afinidad de unión de péptido eEF2661-669 (SEQ ID NO:11) de tipo modificado (SEQ ID NO:41 a 43) a moléculas de HLA-A*0201 usando dos programas (NetMHC3.0 y ProPred)
Secuencia de
Péptido NetMHC3.0 ProPred
aminoácidos
Afinidad Nivel de Puntuación Puntuación Puntuación (nM) unión logarítmica real logarítmica
eEF2661-669 ILTDITKGV 46 SB 0,644 484,777 6,1837 eEF2661-IMTDITKGV (SEQ ID
44 SB 0,649 350,117 5,8583
6692M NO: 41) eEF2661-ILTDITKGL (SEQ ID
82 WB 0,592 148,896 5,0032
6699L NO: 42) eEF2661-IMTDITKGL (SEQ ID
88 WB 0,585 107,536 4,67786692M9L NO: 43)
Tabla 19 Predicción de afinidad de unión de péptido eEF2394-402 (SEQ ID NO:12) de tipo modificado (SEQ ID NO:44 a 46) a moléculas de HLA-A*0201 usando dos programas (NetMHC3.0 y ProPred)
Secuencia de
Péptido NetMHC3.0 ProPred
aminoácidos
eEF2394-402 eEF23944022L eEF23944029V eEF23944022L9L
Afinidad Nivel de Puntuación
Puntuación real Puntuación logarítmica
(nM) unión logarítmica
- LMMYISKMV
- 24 SB 0,704 315,959 5,7556
- LLMYISKMV (SEQ ID NO: 44) LMMYISKML (SEQ ID NO: 45) LLMYISKML (SEQ ID NO: 46)
- 44 83 139 SB WB WB 0,648 0,591 0,544 437,482 97,045 134,369 6,0810 4,5752 4,9006
Expresión forzada de EEF2 en líneas celulares de cáncer
5 Se establecieron clones celulares en los que se expresó un vector de expresión de eEF2 o un vector de expresión vacío en la línea celular de cáncer de estómago AZ-521. El vector de expresión eEF2 es un vector en el que se ha insertado una secuencia de nucleótidos de un gen eEF2 en un sitio de escisión por la enzima de restricción: EcoRI de pcDNA3.1 (+) (Invitrogen). Estas células se cultivaron sin sincronización y se calculó el tiempo de duplicación de las células mediante recuentos celulares después de 48 y 72 desde el comienzo del cultivo. Además, se fijaron 1 x
10 105 células con etanol al 80% y después se dejaron en reposo en PBS que contenía yoduro de propidio (PI, 5 µg/ml) y RNasaA (200 µg/ml) durante 30 minutos, y la distribución de cada fase del ciclo celular se analizó por citometría de flujo (Fig. 13, gráfico superior izquierdo). Como el tiempo de duplicación de las células corresponde a la duración del ciclo celular, el tiempo después se multiplicó por la distribución proporcional de cada fase del ciclo celular para calcular de tiempo de progresión de cada fase (Fig. 13, gráfico superior derecho y tabla inferior). Como resultado, se
15 observó que se reduce el recuento celular en una fase G2/M y el tiempo de progresión se acorta en células que tienen eEF2 expresado (Fig. 13). Esto sugiere que eEF2 acelera la progresión de la fase G2/M.
Se mezclaron 5 × 106 células de cada una de las líneas celulares de cáncer de estómago AZ-521 que tenía eEF2 de expresión forzada (2 clones) y AZ-521 que tenía un vector de expresión vacío de control (2 clones) establecidas 20 como se ha descrito anteriormente, con Matrigel (Becton Dickinson), y la mezcla se inyectó por vía subcutánea en las regiones abdominales izquierda y derecha de ratones desnudos para formar un tumor. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana y se observó durante 34 días. El volumen (mm3) del tumor se calculó por (eje menor)2 × (eje mayor)2/2. Se muestran los resultados de tres experimentos realizados por separado en cada clon (Fig. 14). Por los resultados, se demostró que el volumen del tumor aumenta de forma espectacular en los ratones inyectados con
25 células que tienen eEF2 de expresión forzada en comparación con un control. La Fig. 15 muestra un ejemplo típico. El tumor de la izquierda se causa por células AZ-521 que tienen un vector vacío expresado y el tumor de la derecha por células AZ-521 que tienen eEF2 de expresión forzada.
30 Identificación de Secuencia Diana de ARNhc que se dirige a EEF2
Para desarrollar un ARNhc (denominado en lo sucesivo shEF2) que pueda inhibir eficazmente la expresión de eEF2 mediante la dirección a eEF2 e inhibir el crecimiento de cánceres, se seleccionaron dos secuencias (denominadas
35 en lo sucesivo shEF-1918 y shEF-2804) que pueden ser dianas en una secuencia de eEF2.
Una secuencia diana en las posiciones 1918-1947 (posiciones 1918-1947 desde el extremo 5’ de una secuencia de ADN que codifica una proteína eEF2) en un gen eEF2: 5’-gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg-3’ (SEQ ID NO:18).
40 Una secuencia diana en las posiciones 2804-2833 (posiciones 2804-2833 desde el extremo 5’ de una secuencia de ADN que codifica una proteína eEF2) en un gen eEF2: 5’-actcaac cataacactt gatgccgttt ctt-3’ (SEQ ID NO:19).
Construcción de ARNhc
45 Para construir un ARNhc para las secuencias anteriores (SEQ ID NO:18 y 19), se sintetizaron químicamente una secuencia de ADN [shEF-1918 o shEF-2804 (cadena codificante)] que consiste en una secuencia codificante de una secuencia diana (30 bases) -una secuencia de bucle (10 bases) -una secuencia antisentido (30 bases), y su secuencia de ADN complementaria [shEF-1918 o shEF-2804 (cadena antisentido)] y después se hibridaron, y el producto se insertó en sitios de reconocimiento SacI y KpnI del vector de expresión ARNt-ARNhc, piGENE tRNA Pur
50 (Clontech, Palo Alto, CA). Dichas secuencias de ADN insertadas se muestran a continuación. A este respecto, se añadieron variaciones a una parte de una secuencia codificante de una secuencia diana de manera que se introduce eficazmente una cadena antisentido en RISC cuando se escinde un ARN que tiene una secuencia transcrita (como se muestra por subrayados en las siguientes secuencias).
55 shEF-1918 (cadena codificante):
5’-(gcc tggccgagga catcgatgaa agcgtgg) cttcctgtca (cctcgcc tttatcgatg tcctcggcca ggc)-3’ (SEQ ID NO:20)
shEF-1918 (cadena antisentido): 60 3’-(cgg accggctcct gtagctactt tcgcacc) gaaggacagt (ggagcgg aaatagctac aggagccggt ccg)-5’ (SEQ ID NO:21)
shEF-2804 (cadena codificante):
65 5’-(actcaac cataacactt gataccattt gtt) cttcctgtca (aag aaacggcatc aagtgttatg gttgagt)-3’ (SEQ ID NO:22)
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